JP6995375B2 - ｐＨ応答性ポリマー及び薬物送達システム - Google Patents

Description

本発明は、ｐＨ応答性ポリマー及び薬物送達システムに関する。本願は、２０１６年１２月１５日に、日本に出願された特願２０１６－２４３７４９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

従来、薬物等の体内動態を制御するためにポリマーが使用されている。これらのポリマーは、薬物等と正常組織及び血液成分との無作為な相互作用を抑制するステルス性を発揮することで薬物等の長期血中滞留性を可能とし、正常組織への毒性を抑制すると同時に腫瘍組織への集積を可能としている。このようなポリマーとしては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等が使用されてきた（例えば、非特許文献１を参照）。

Knop K., et al., Poly(ethylene glycol) in drug delivery: pros and cons as well as potential alterations. Angew. Chem. Int. Ed., 49, 6288-6208, 2010.

しかしながら、生体内でステルス性を示す従来のポリマーは、血液成分や正常組織との相互作用だけでなく、腫瘍組織との相互作用も抑制してしまう場合がある。その結果、標的部位である腫瘍組織への薬物等の集積や癌細胞への薬物等の取り込みが効率的でない場合がある。

そこで、本発明は、血液成分や正常組織に対してはステルス性を示し、腫瘍組織に対しては集積効率及び細胞への取り込み効率が向上したポリマーを提供することを目的とする。

本発明は、以下の態様を含む。
［１］７を超えるｐＨ環境下で電気的に中性でありｐＨ７以下でカチオン性に変化する基が結合した生体適合性ポリマーからなる、ｐＨ応答性ポリマー。
［２］７を超えるｐＨ環境下で電気的に中性でありｐＨ７以下でカチオン性に変化する前記基が、ｐＨ７．２～７．６の環境下で電気的に中性でありｐＨ６．０～６．６の環境下でカチオン性に変化する基である、［１］に記載のｐＨ応答性ポリマー。
［３］７を超えるｐＨ環境下で電気的に中性でありｐＨ７以下でカチオン性に変化する前記基が下記式（ａ）で表される基を含む、［１］又は［２］に記載のｐＨ応答性ポリマー。

［式（ａ）中、＊は結合手を表す。］
［４］７を超えるｐＨ環境下で電気的に中性でありｐＨ７以下でカチオン性に変化する前記基が、カルボキシル基、スルホ基又はホスホン基を含む、［１］～［３］のいずれかに記載のｐＨ応答性ポリマー。
［５］前記カルボキシル基を含む基が下記式（１）で表される基であり、前記スルホ基を含む基が下記式（２）で表される基であり、前記ホスホン基を含む基が下記式（３）で表される基である、［４］に記載のｐＨ応答性ポリマー。

［式（１）～（３）中、ｎは１～３の整数を表し、＊は結合手を表す。］
［６］前記生体適合性ポリマーが生体分解性である、［１］～［５］のいずれかに記載のｐＨ応答性ポリマー。
［７］前記生体適合性ポリマーが、ポリアミノ酸、ポリエステル、ポリヌクレオチド及び多糖類からなる群より選択される、［６］に記載のｐＨ応答性ポリマー。
［８］前記生体適合性ポリマーがポリアミノ酸である、［７］に記載のｐＨ応答性ポリマー。
［９］前記ポリアミノ酸がポリグルタミン酸又はポリアスパラギン酸である、［８］に記載のｐＨ応答性ポリマー。
［１０］下記式（ｂ）で表される繰り返し単位を含む、［９］に記載のｐＨ応答性ポリマー。

［１１］下記式（ｃ）で表される繰り返し単位を含む、［９］に記載のｐＨ応答性ポリマー。

［式（ｃ）中、ｎは２又は３の整数を表す。］
［１２］重量平均分子量が１，０００～２００，０００である、［１］～［１１］のいずれかに記載のｐＨ応答性ポリマー。
［１３］重量平均分子量が１０，０００～５０，０００である、［１２］に記載のｐＨ応答性ポリマー。
［１４］前記生体適合性ポリマー１モルあたり、７を超えるｐＨ環境下で電気的に中性でありｐＨ７以下でカチオン性に変化する前記基が４～８００モル結合した、［１］～［１３］のいずれかに記載のｐＨ応答性ポリマー。
［１５］薬物送達システム用である、［１］～［１４］のいずれかに記載のｐＨ応答性ポリマー。
［１６］薬物と、［１］～［１５］のいずれかに記載のｐＨ応答性ポリマーとが結合した、薬物送達システム。

本発明によれば、血液成分や正常組織に対してはステルス性を示し、腫瘍組織に対しては集積効率及び細胞への取り込み効率が向上したポリマーを提供することができる。

実験例１において、ポリマーの拡散係数を蛍光相関分光法により測定した結果を示すグラフである。 実験例２において、フローサイトメトリーによりポリマーの細胞への取り込みを測定した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｃ）は、実験例３における乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性試験の結果を示すグラフである。（ａ）はｐＨ７．４における試験結果であり、（ｂ）はｐＨ６．５における試験結果であり、（ｃ）はｐＨ５．５における試験結果である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例４における細胞毒性試験の結果を示すグラフである。（ａ）はｐＨ７．４における結果であり、（ｂ）はｐＨ６．７における結果である。 実験例５において、量子ドットの血中残存量を経時的に測定した結果を示すグラフである。 実験例５において、摘出した腫瘍組織中の量子ドットを定量した結果を示すグラフである。 実験例８において、ポリマーの拡散係数を蛍光相関分光法により測定した結果を示すグラフである。 実験例９において、フローサイトメトリーによりポリマーの細胞への取り込みを測定した結果を示すグラフである。 実験例１０において、ポリマーの拡散係数を蛍光相関分光法により測定した結果を示すグラフである。 実験例１１において、フローサイトメトリーによりポリマーの細胞への取り込みを測定した結果を示すグラフである。

［ｐＨ応答性ポリマー］
１実施形態において、本発明は、７を超えるｐＨ環境下で電気的に中性でありｐＨ７以下でカチオン性に変化する基が結合した生体適合性ポリマーからなる、ｐＨ応答性ポリマーを提供する。

生体内の血液成分や正常組織の周囲の環境は、ほぼ中性のｐＨ７．４に保たれている。これに対し、腫瘍組織の周囲の環境は、弱酸性のｐＨ条件（ｐＨ６．５程度又はそれ以下）である。実施例において後述するように、本実施形態のｐＨ応答性ポリマーは、７を超えるｐＨ環境下、例えば正常組織に相当するｐＨ環境下（ｐＨ７．４）では電気的に中性であり、血液成分や正常組織に対しステルス性を示す。一方、ｐＨ７以下、例えば、腫瘍組織の周囲の弱酸性環境に相当するｐＨ６．５程度又はそれ以下ではカチオン性を帯びる。このため、本実施形態のｐＨ応答性ポリマーは、細胞表面に存在するヘパリン等のアニオン性分子との相互作用を、正常組織では誘導しないが、癌組織では誘導することにより、効率的に癌細胞に取り込まれる。

したがって、本実施形態のｐＨ応答性ポリマーを用いることにより、腫瘍組織に効率よく薬物を送達し、正常組織への傷害を抑制することができる。このため、本実施形態のｐＨ応答性ポリマーは、特に、癌治療用の薬物送達システムを構築するのに有用である。すなわち、本実施形態のｐＨ応答性ポリマーは薬物送達システム用であるということができる。

本実施形態のｐＨ応答性ポリマーにおいて、７を超えるｐＨ環境下で電気的に中性でありｐＨ７以下でカチオン性に変化する前記基は、ｐＨ７．２～７．６の環境下で電気的に中性でありｐＨ６．０～６．６の環境下でカチオン性に変化する基であることが好ましい。

本実施形態のｐＨ応答性ポリマーにおいて、生体適合性ポリマーとは、生体に投与した場合に、強い炎症反応等の悪影響を及ぼしにくいポリマーを意味する。生体適合性ポリマーとしては、本発明の効果が得られる限り特に制限されず、例えば、ポリアミノ酸、ポリアクリルアミド、ポリエーテル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリヌクレオチド、多糖類等が挙げられ、ポリアミノ酸、ポリアクリルアミド、多糖類が好ましい。

生体適合性ポリマーは、一部にその合成過程で導入された任意の基を有していてもよい。このような基としては、例えば重合開始剤の一部等が挙げられる。生体適合性ポリマーは、ポリマー分子内の電荷の釣り合いが中性であるか、ほぼ中性であることが好ましい。

本実施形態のｐＨ応答性ポリマーにおいて、生体適合性ポリマーは生体分解性であることが好ましい。本明細書において、生体適合性ポリマーが生体分解性であるとは、生体適合性ポリマーの少なくとも一部が生体分解性であることを意味する。従来のポリマーは生体に投与した場合に生体内に蓄積することが問題となる場合があった。これに対し、生体分解性であるポリマーを用いることにより、生体内への蓄積を抑制することができ、副作用を低減させることができる。

生体分解性とは、生体内で吸収又は分解され得る性質を意味する。生体分解性である生体適合性ポリマーとしては、本発明の効果が得られる限り特に制限されず、例えば、ポリアミノ酸、ポリエステル、ポリヌクレオチド、多糖類等が挙げられ、ポリアミノ酸、多糖類が好ましく、ポリアミノ酸がより好ましい。ポリアミノ酸としては、ポリグルタミン酸又はポリアスパラギン酸が好ましい。

本実施形態のｐＨ応答性ポリマーは、７を超えるｐＨ環境下で電気的に中性でありｐＨ７以下でカチオン性に変化する基が結合していることにより、ｐＨ応答性を示すことができる。ｐＨ応答性とは、周囲のｐＨ環境に応答して電荷が変化する性質である。実施例において後述するように、本実施形態のｐＨ応答性ポリマーは、従来用いられてきたＰＥＧと比較して、より高いステルス性を発揮することができる。

本実施形態のｐＨ応答性ポリマーにおいて、７を超えるｐＨ環境下で電気的に中性でありｐＨ７以下でカチオン性に変化する基は、当該基の一部として、下記式（ａ）で表される基を含むことが好ましい。

［式（ａ）中、＊は結合手を表す。］

上記式（ａ）で表される基は、エチレンジアミン構造を有する基であるということもできる。後述するように、エチレンジアミン構造を有する基は、ｐＨ環境の変化に応じた電荷数の変化を示すことができる。

本実施形態のｐＨ応答性ポリマーにおいて、７を超えるｐＨ環境下で電気的に中性でありｐＨ７以下でカチオン性に変化する基は、当該基の一部として、例えば、下記式（４）で表されるカルボキシル基、下記式（５）で表されるスルホ基、下記式（６）で表されるホスホン基等のアニオン性基を含むことが好ましい。

本実施形態のｐＨ応答性ポリマーにおいて、７を超えるｐＨ環境下で電気的に中性でありｐＨ７以下でカチオン性に変化する基は下記式（１）、（２）又は（３）で表される構造であることが好ましい。

［式（１）～（３）中、ｎは１～３の整数を表し、＊は結合手を表す。］

上記式（１）で表される基は上記式（４）で表されるカルボキシル基を含む基の具体例である。また、上記式（２）で表される基は上記式（５）で表されるスルホ基を含む基の具体例である。また、上記式（３）で表される基は上記式（６）で表されるホスホン基を含む基の具体例である。

ここで、上述した式（１）で表される基において、ｎが２である基を例に、ｐＨ環境に応じた電荷数の変化について説明する。下記式（７）に、上述した式（１）で表される基において、ｎが２である基を示す。下記式（７）に示す基は、エチレンジアミン構造と、アニオン性基であるカルボキシル基とを有している。

エチレンジアミン構造は２つのｐＫａ（６．２と８．９）を有している。そして、上記式（７）の左側に示すように、正常組織に相当するｐＨ環境下（ｐＨ７．４）では、エチレンジアミン構造が有するカチオン電荷数は１である。

しかしながら、ｐＨが低下すると、上記式（７）の右側に示すように、エチレンジアミン構造が有するカチオン電荷数が２に変化する。

このため、エチレンジアミン構造とアニオン性基とを有する基は、正常組織に相当するｐＨ環境下（ｐＨ７．４）では電荷が釣り合って電気的に中性となり、ステルス性を発揮することができる。また、腫瘍組織の周囲の弱酸性環境に相当するｐＨ６．５程度又はそれ以下では、カチオン性を帯びることとなる。

その結果、エチレンジアミン構造とアニオン性基とを有する基が結合した生体適合性ポリマーは、血液成分や正常組織に対してはステルス性を示し、腫瘍組織に対しては高い集積効率及び細胞への高い取り込み効率を示すことができる。

実施例において後述するように、上記式（１）、（２）又は（３）で表される基を有するｐＨ応答性ポリマーは、血液成分や正常組織に対してはステルス性を示し、腫瘍組織に対しては高い集積効率及び細胞への高い取り込み効率を示すことができる。

本実施形態のｐＨ応答性ポリマーの重量平均分子量は１，０００～２００，０００であることが好ましく、例えば５，０００～１００，０００であってもよく、例えば１０，０００～５０，０００であってもよい。

ここで、ｐＨ応答性ポリマーの重量平均分子量としては、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）解析により測定した値を用いることができる。具体的には、ｐＨ応答性ポリマーを溶媒に溶かした後、細孔（ポア）が数多く存在する充てん剤を用いたカラム内に移動相溶液と共に通液し、カラム内で分子量の大小によって分離させ、それを示差屈折率計や紫外可視分光光度計、粘度計、光散乱検出器等を検出器として用いて検出する。ＳＥＣ専用装置が広く市販されており、標準ポリエチレングリコール換算によって測定することが一般的である。本明細書における重量平均分子量は、この標準ポリエチレングリコール換算によって測定されたものである。

本実施形態のｐＨ応答性ポリマーは、上述した生体適合性ポリマー１モルあたり、７を超えるｐＨ環境下で電気的に中性でありｐＨ７以下でカチオン性に変化する前記基が４～８００モル結合していることが好ましく、例えば２０～４００モルであってもよく、例えば４０～２００モルであってもよく、例えば６０～１３０モルであってもよい。

本実施形態のｐＨ応答性ポリマーの好適な具体例としては、生体適合性ポリマーがポリアミノ酸の場合は、ポリ－Ｌ－グルタミン酸やポリ－Ｌ－アスパラギン酸の側鎖に前記式（１）～（３）のいずれか一つが結合したポリマーが挙げられ、好ましくは下記式（Ａ１）で表されるポリマーが挙げられる。

［式（Ａ１）中、ｍは４～８００の整数を表し、ｎは１～３の整数を表し、Ｘは前記式（４）又は前記式（５）で表される基を表す。］

本実施形態のｐＨ応答性ポリマーは、下記式（ｂ）で表される繰り返し単位を含むものであってもよく、下記式（ｃ）で表される繰り返し単位を含むものであってもよい。

［式（ｃ）中、ｎは２又は３を表す。］

また、生体適合性ポリマーがポリアクリルアミドである場合、本実施形態のｐＨ応答性ポリマーの好適な具体例としては、下記式（Ａ２）で表されるポリマーが挙げられる。

［式（Ａ２）中、ｍは４～８００の整数を表し、ｎは１～３の整数を表し、Ｘは前記式（４）または前記式（５）で表される基を表す。］

更に、生体適合性ポリマーが多糖類である場合、本実施形態のｐＨ応答性ポリマーの好適な具体例としては、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、プルラン、キトサン、デキストラン又はシクロデキストリンの側鎖に前記式（１）～（３）のいずれか一つが結合したポリマーが挙げられ、好ましくは下記式（Ａ３）で表されるポリマーが挙げられる。

［式（Ａ３）中、ｍは４～５００を表し、Ｙは、ぞれぞれ独立に下記式（Ａ４）で表される基又は水素基を表し、少なくとも１つは下記式（Ａ４）で表される基である。］

［式（Ａ４）中、ｎは１～３の整数を表し、Ｘは前記式（４）又は前記式（５）で表される基を表し、＊は結合手を表す。］

続いて、ｐＨ応答性ポリマーの製造方法の好適な具体例を説明する。例えば、側鎖にカルボキシル基、又は保護基（例えば、ベンジル基、メチル基、エチル基等）で保護されたカルボキシル基を有する生体適合性ポリマーに対して、公知の縮合剤等を用いた縮合反応やアミノリシス反応によりジエチレントリアミンを導入してアミン体ポリマー合成し、得られたアミン体ポリマーに対してマイケル付加反応又は求核置換反応により、前記式（４）又は前記式（５）で表される基を含む基を導入することで本発明のｐＨ応答性ポリマーを得ることができる。

また、側鎖に、カルボキシル基、又は保護基で保護されたカルボキシル基を有しない生体適合性ポリマーの場合、クロロ酢酸、無水コハク酸、クロロギ酸－ｐ－ニトロフェニル等を用いた公知の方法により側鎖にカルボキシル基等を導入し、上記と同様の縮合反応やアミノリシス反応によりアミン体ポリマーを合成し、得られたアミン体ポリマーに対してマイケル付加反応又は求核置換反応を施すことにより、本実施形態のｐＨ応答性ポリマーを得ることができる。

側鎖にカルボキシル基、又は保護基で保護されたカルボキシル基を有する生体適合性ポリマーは、生体適合性ポリマーがポリアミノ酸である場合、アミン化合物を開始剤としたβ－ベンジル－Ｌ－グルタミン酸－Ｎ－カルボキシアンヒドリド（ＢＬＧ－ＮＣＡ）等のアミノ酸－Ｎ－カルボキシ無水物の開環重合等の公知の製造方法で製造することができる。あるいは、市販のポリアミノ酸を使用してもよい。

また、生体適合性ポリマーがポリアクリルアミドである場合、アクリル酸又はアクリル酸ベンジルを原料として、フリーラジカル重合又はリビングラジカル重合等の公知の製造方法により、側鎖にカルボキシル基、又は保護基で保護されたカルボキシル基を有する生体適合性ポリマーを製造することができる。

更に、生体適合性ポリマーが多糖である場合、側鎖にカルボキシル基を有する生体適合性ポリマーとして、市販のカルボキシメチルセルロースやヒアルロン酸等を使用することができる。

（生体適合性ポリマーにエチレンジアミン構造を有する基を導入させる方法の説明）
側鎖に保護基で保護されたカルボキシル基を有する生体適合性ポリマーの場合、当該ポリマーとジエチレントリアミンとの反応、あるいは当該ポリマーを脱保護することで得られたカルボン酸に対して、公知の縮合剤等を用いてジエチレントリアミンを導入することにより、エチレンジアミン構造を有する基が導入された生体適合性ポリマー（アミン体ポリマー）を得ることができる。

本反応は各種溶媒中で行うことができる。溶媒としては、当該ポリマーとジエチレントリアミンに対して反応性をもたない溶媒であれば特に限定されず、例えば、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、クロロホルム、ＤＭＦ、ＮＭＰ等の各種有機溶媒、及びそれら混合物が挙げられる。ポリマーの溶解性の観点からは、ＮＭＰ又はテトラヒドロフランが好ましい。溶媒の使用量は、当該ポリマーに対して質量比で通常１～１００倍、好ましくは３～５０倍、最も好ましくは５～３０倍量である。

本反応に用いるジエチレントリアミンの使用量は、当該ポリマーの保護基で保護されたカルボキシル基に対して、モル比で通常３０～１５０倍、好ましくは４０～１００倍、より好ましくは５０～８０倍である。ジエチレントリアミンの使用量が３０倍より少ない場合、ジエチレントリアミンによりポリマー間が架橋された構造体が生成する恐れがあり、１５０倍より多い場合、未反応のジエチレントリアミンを除去することが困難となる場合がある。

また、本反応には触媒を用いることが可能であり、例えば２－ヒドロキシピリジン、ピリジン、トリエチルアミン等の触媒を使用することができる。

本反応を行う場合の反応温度は使用する溶媒により異なるが、通常０～１００℃である。また反応時間は反応温度の条件により異なるが、通常１～４８時間程度が好ましい。本反応により得られたアミン体ポリマーは、そのまま未精製で用いられる他、カラムクロマトグラフィー等の処理により単離、精製を行うこともできる。

一方、側鎖にカルボキシル基を有する生体適合性ポリマーの場合、当該ポリマーとジエチレントリアミンを縮合剤の存在下で縮合反応させることにより、アミン体ポリマーを得ることができる。また、側鎖に保護基で保護されたカルボキシル基を有する生体適合性ポリマーの場合、公知の反応で保護基を脱保護し、側鎖にカルボキシル基を有する生体適合性ポリマーを得た後、同様に縮合反応させることにより、アミン体ポリマーを得ることができる。

本反応は各種溶媒中で反応を行うことができ、用いる溶媒としては当該ポリマー、ジエチレントリアミン、縮合剤に対して反応性をもたない溶媒であれば特に限定されず、例えば、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、クロロホルム、ＤＭＦ、ＮＭＰ等の各種有機溶媒、及びそれら混合物が挙げられる。ポリマーの溶解性の観点からはＮＭＰ又はテトラヒドロフランが好ましい。溶媒の使用量は、生体適合性ポリマーに対して質量比で通常１～１００倍、好ましくは３～５０倍、より好ましくは５～３０倍量である。

本反応に用いるジエチレントリアミンの使用量は、当該ポリマーのカルボキシル基に対して、モル比で通常３０～１５０倍、好ましくは４０～１００倍、より好ましくは５０～８０倍である。ジエチレントリアミンの使用量が３０倍より少ない場合、ジエチレントリアミンによりポリマー間が架橋された構造体が生成する恐れがあり、１５０倍より多い場合、未反応のジエチレントリアミンを除去することが困難となる場合がある。

本反応に用いる縮合剤としては、反応が進行するものであれば特に限定されず、例えば、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩等を用いることができる。

本反応を行う場合の反応温度は使用する溶媒により異なるが、通常１０～１００℃である。また反応時間は反応温度等の条件により異なるが、通常１～４８時間程度が好ましい。本反応により得られたアミン体ポリマーは、結晶化やカラムクロマトグラフィー等の処理により縮合剤を除去し、単離、精製することが好ましい。

（アミン体ポリマーに前記式（４）又は前記式（５）を含む基を導入する方法の説明）
マイケル付加反応や求核置換反応により、アミン体ポリマーに前記式（４）又は前記式（５）を含む基を導入することができる。

マイケル付加反応の場合は、アミン体ポリマーと、アクリル酸、ビニルスルホン酸、又はこれらのナトリウム塩若しくはカリウム塩とをｐＨ９～１０の水溶液中、マイケル付加反応させることで本実施形態のｐＨ応答性ポリマーを得ることができる。

マイケル付加反応に用いる、アクリル酸、ビニルスルホン酸、又はこれらのナトリウム塩若しくはカリウム塩の使用量は、アミン体ポリマーの側鎖の一級アミノ基に対して、モル比で通常３～３００倍である。

マイケル付加反応はｐＨ９～１０の水溶液中で行う。ｐＨの調整には通常、無機塩基を使用する。具体的には、例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム等を用いることができる。

マイケル付加反応を行う場合の反応温度は、通常０～８０℃である。また反応時間は反応温度等の条件により異なるが、通常５時間～２週間程度が好ましい。

本反応により得られたｐＨ応答性ポリマーは、そのまま未精製で用いてもよいし、カラムクロマトグラフィー等の処理により単離、精製してもよい。

求核置換反応の場合は、アミン体ポリマーと、４－ブロモブタン酸又は３－ブロモプロパンスルホン酸ナトリウムとを求核置換反応させることで本実施形態のｐＨ応答性ポリマーを得ることができる。

求核置換反応に用いる４－ブロモブタン酸又は３－ブロモプロパンスルホン酸ナトリウムの使用量は、アミン体ポリマーの側鎖の一級アミノ基に対して、モル比で通常３～３００倍である。

求核置換反応においては塩基触媒を用いてもよく、例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム等の無機塩基を用いることができる。

求核置換反応を行う場合の反応温度は、通常０～８０℃である。また反応時間は反応温度等の条件により異なるが、通常５時間～１週間程度が好ましい。

本反応により得られたｐＨ応答性ポリマーは、そのまま未精製で用いてもよいし、カラムクロマトグラフィー等の処理により単離、精製してもよい。

［薬物送達システム］
１実施形態において、本発明は、薬物と、上述したｐＨ応答性ポリマーとが結合した、薬物送達システムを提供する。

実施例において後述するように、本実施形態の薬物送達システムは、血液成分や正常組織に対してはステルス性を示し、腫瘍組織に対しては高い集積効率及び細胞への取り込み効率を示す。したがって、本実施形態の薬物送達システムを用いることにより、腫瘍組織に効率よく薬物を送達し、正常組織への傷害を抑制することができる。

本実施形態の薬物送達システムにおいて、薬物としては、特に制限されず、阻害性核酸、低分子医薬、タンパク質型医薬、標識物質等が挙げられる。

阻害性核酸としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等が挙げられる。

低分子医薬としては、分子量が概ね１０００以下である医薬が挙げられる。低分子医薬は、例えば、抗癌剤、造影剤等であってもよい。抗癌剤としては、例えば、パクリタクセル、ドキソルビシン、シスプラチン、ゲムシタビン等が挙げられる。

タンパク質型医薬としては、ハーセプチン、アバスチン、サイラムザ等の抗体医薬等が挙げられる。

標識物質としては、量子ドット、金ナノ粒子、磁性粒子、シリカナノ粒子等が挙げられる。

本実施形態の薬物送達システムの合成方法は特に制限されない。あるいは、薬物及びｐＨ応答性ポリマーにそれぞれ反応性の官能基を導入し、これらを反応させることにより、両者を結合させてもよい。あるいは、物理吸着又は反応性の官能基同士の結合を利用して、タンパク質型医薬である薬物をｐＨ応答性ポリマーで修飾してもよい。あるいは、物理吸着又は反応性の官能基同士の結合を利用して、薬物を封入したリポソームにｐＨ応答性ポリマーを結合させてもよい。あるいは、物理吸着又は反応性の官能基同士の結合を利用して、量子ドット、金ナノ粒子、磁性粒子、シリカナノ粒子等の表面を被覆してもよい。

また、薬物送達システムは、ブロック共重合体の合成と自己組織化による高分子ミセルを形成していてもよく、高分子ベシクルの形態であってもよい。

反応性の官能基の組み合わせとしては、特に限定されず、例えばアジド基とジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）の組み合わせ、スクシンイミド基とアミノ基の組み合わせ、チオール基とマレイミド基の組み合わせ、アジド基とアルキン基の組み合わせ、ビオチン基とストレプトアビジン基の組み合わせ等が挙げられる。また、反応性の官能基以外にも、例えばチオール基と金との配位結合による結合を利用してもよい。

これらの組み合わせのうちいずれか一方を薬物に導入し、他方をｐＨ応答性ポリマーに導入し、これらを反応させてもよい。あるいは、ｐＨ応答性ポリマーにこれらの反応性の官能基を導入し、それを用いて重合反応によりブロック共重合体としてもよい。あるいは、チオール基を有するｐＨ応答性ポリマーを調製し、これを金ナノ粒子表面に導入してもよい。

次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。

［実施例１、比較例１及び比較例２のポリマーの合成］
実施例１、比較例１及び比較例２のポリマーを合成した。

（ポリ（β－ベンジルＬ－グルタミン酸）の合成）
まず、ポリ（β－ベンジルＬ－グルタミン酸）（ＰＢＬＧ）を合成した。５．０ｇのＢＬＧ－Ｎ－カルボキシアンヒドリド（ＢＬＧ－ＮＣＡ）をアルゴン雰囲気下で２５ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、更に７５ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）を加えた。

得られた溶液に、３８．４ｍｇの１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミドを加え、アルゴン雰囲気下にて２日間、室温にて撹拌した。続いて、反応溶液を過剰量のジエチルエーテルに注ぐことで生成物を再沈殿させて回収し、減圧乾燥を経て４．０ｇの白色固体を得た（収率９５％）。

^１Ｈ ＮＭＲ解析により構造を確認し、ＰＢＬＧであることを確認した。

また、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）解析により分子量を算出し、平均重合度が１００であることが明らかとなった（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．２）。

（ＰＧｌｕ（ＥＤＡ）、ＰＧｌｕ（ＤＥＴ）及びＰＧｌｕ（ＤＰＴ）の合成）
ＰＢＬＧの側鎖のベンジル基に対するアミノリシス反応により、ＰＧｌｕ（ＥＤＡ）、ＰＧｌｕ（ＤＥＴ）及びＰＧｌｕ（ＤＰＴ）を合成した。

まず、１ｇのＰＢＬＧと２．７ｇの２－ヒドロキシピリジンを４５ｍＬのＮ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）に溶解した。得られた溶液に対し、１９ｇのエチレンジアミン（ＥＤＡ）を加え、反応溶液を０．３Ｍ塩酸による透析により中和し、続けて０．０１Ｍ塩酸に対して透析し、更に純水に対して透析した。透析処理を行った水溶液を凍結乾燥することにより生成物となる白色固体（ＰＧｌｕ（ＥＤＡ））を得た（０．８ｇ、収率８１％）。

同様に、ＰＢＬＧに対するジエチレントリアミン（ＤＥＴ）及びジプロピレンジアミン（ＤＰＴ）の反応により、それぞれＰＧｌｕ（ＤＥＴ）及びＰＧｌｕ（ＤＰＴ）を得た。得られたＰＧｌｕ（ＥＤＡ）、ＰＧｌｕ（ＤＥＴ）及びＰＧｌｕ（ＤＰＴ）は、それぞれ^１Ｈ ＮＭＲ解析により目的の構造であることを確認した。

（ＰＧｌｕ（ＥＤＡ－Ｃａｒ）、ＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｃａｒ）及びＰＧｌｕ（ＤＰＴ－Ｃａｒ）の合成）
ＰＧｌｕ（ＥＤＡ）、ＰＧｌｕ（ＤＥＴ）、ＰＧｌｕ（ＤＰＴ）の側鎖の一級アミンに対し、アクリル酸とのマイケル反応によりカルボキシル基を導入した。まず、１００ｍｇのＰＧｌｕ（ＥＤＡ）を３０ｍＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム水溶液に溶解し、８．５ｍＬのアクリル酸を加えた。５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いて、反応溶液のｐＨを９～１０に調整した後、室温にて１週間撹拌した。得られた反応溶液を０．０１Ｍ塩酸、続けて純水に対して透析処理し、凍結乾燥することにより、比較例１のポリマー（以下、「ＰＧｌｕ（ＥＤＡ－Ｃａｒ）」という場合がある。）を乳白色の固体として得た（９５ｍｇ、収率９５％）。

同様に、実施例１のポリマー（以下、「ＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｃａｒ）」という場合がある。）及び比較例２のポリマー（以下、「ＰＧｌｕ（ＤＰＴ－Ｃａｒ）」という場合がある。）を得た。実施例１、比較例１及び比較例２の各ポリマーは、それぞれ^１Ｈ ＮＭＲ解析により目的の構造であることを確認した。

実施例１のポリマーの化学式を下記式（８）に示す。実施例１のポリマーは、生体適合性ポリマーとしてポリグルタミン酸を有し、７を超えるｐＨ環境下で電気的に中性でありｐＨ７以下でカチオン性に変化する基として、エチレンジアミン構造を有する基が結合したポリマーであった。

［式（８）中、ｍの平均値は１００である。］

続いて、比較例１のポリマーの化学式を下記式（９）に示す。比較例１のポリマーは、生体適合性ポリマーとしてポリグルタミン酸を有し、１つの２級アミンを有するポリマーであり、正常組織に相当するｐＨ環境下（ｐＨ７．４）においても、腫瘍組織の周囲に相当するｐＨ環境下（ｐＨ６．５程度又はそれ以下）においても、電気的に中性を示すポリマーであった。

下記式（１０）に、比較例１のポリマーの２級アミン部分及びカルボキシル基部分の電荷を示す。下記式（１０）に示すように、比較例１のポリマーに導入された１つの２級アミンは、正常組織に相当するｐＨ環境下（ｐＨ７．４）においても、腫瘍組織の周囲に相当するｐＨ環境下（ｐＨ６．５程度又はそれ以下）においても、正電荷を１個有する。

［式（９）中、ｍの平均値は１００である。］

続いて、比較例２のポリマーの化学式を下記式（１１）に示す。比較例２のポリマーは、生体適合性ポリマーとしてポリグルタミン酸を有し、プロピレンジアミン構造を有するポリマーであり、正常組織に相当するｐＨ環境下（ｐＨ７．４）においても、腫瘍組織の周囲に相当するｐＨ環境下（ｐＨ６．５程度又はそれ以下）においても、カチオン性を帯びるポリマーであった。

下記式（１２）に、比較例２のポリマーのプロピレンジアミン構造部分及びカルボキシル基部分の電荷を示す。下記式（１２）に示すように、プロピレンジアミン構造は、正常組織に相当するｐＨ環境下（ｐＨ７．４）においても、腫瘍組織の周囲に相当するｐＨ環境下（ｐＨ６．５程度又はそれ以下）においても、正電荷を２個有する。

［式（１１）中、ｍの平均値は１００である。］

［実験例１］
（ポリマー及びアニオン性糖鎖の相互作用試験）
一般に、細胞膜の表面はアニオン性の糖鎖で覆われている。そこで、実施例１及び比較例１のポリマーと、アニオン性糖鎖とのｐＨ依存的な相互作用を検討した。アニオン性糖鎖としてへパリンを用いた。

まず、各ポリマーを、蛍光物質であるＣｙ３で標識した。続いて、３００ｎＭの各ポリマーと１００μｇ／ｍＬのへパリンとの混合溶液を調製し、様々なｐＨ条件下で蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を用いて各ポリマーの拡散係数を測定した（型式「ＬＳＭ７１０」、Ｃａｒｌ－Ｚｅｉｓｓ社）。ポリマーの拡散係数が低下したことは、へパリンとポリマーとが相互作用し、会合体を形成したことを示す。ｐＨ６．０、６．５、７．０のｐＨ条件はＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ）で作製し、ｐＨ７．４と８．０のｐＨ条件はＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ）で作製した。

図１は、ＦＣＳによる測定結果を示すグラフである。その結果、実施例１のポリマーは、正常組織の周囲の環境に相当するｐＨ条件（ｐＨ約７．４）ではへパリンとの相互作用を示さず、腫瘍の周囲の環境に相当する弱酸性条件（ｐＨ約６．５）ではへパリンとの会合体を形成（拡散係数が低下）したことが明らかとなった。これに対し、比較例１のポリマーは、ｐＨ条件を変化させてもへパリンとの相互作用が認められなかった。

この結果から、実施例１のポリマーは、正常組織の細胞とは相互作用せず、腫瘍組織の細胞の細胞膜には特異的に吸着し、細胞への取り込みが促進されることが示された。

［実験例２］
（ポリマーの細胞への取り込みの検討）
ヒト肺癌細胞であるＡ５４９に、様々なｐＨ条件下で実施例１及び比較例１のポリマーを接触させ、細胞に取り込まれるか否かを検討した。

まず、１ウェルあたり１００，０００個のＡ５４９細胞を６ウェルプレートに播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）入りのＲＰＭＩ培地中で一晩インキュベートした。続いて、培地をｐＨ７．４の緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ＦＢＳ）、ｐＨ６．５の緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ＦＢＳ）、又はｐＨ５．５の緩衝液（１０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ＦＢＳ）に交換した。

続いてＣｙ３標識した各ポリマーを終濃度５００ｎＭとなるように添加し、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、Ａ５４９細胞を、ＦＢＳを含まない緩衝液でリンス処理し、更にトリプシン処理を行って回収し、フローサイトメトリー（型式「Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ６－２Ｌ」、メルクミリポア社）で解析し、Ａ５４９細胞に取り込まれたＣｙ３の蛍光強度を測定した。

図２は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。その結果、比較例１のポリマーはｐＨ７．４～５．５の範囲内で細胞への取り込みに変化が認められなかった。これに対し、実施例１のポリマーは、ｐＨが６．５以下に低下すると細胞への取り込みが増大することが明らかとなった。

この結果から、正常組織の周囲の環境に相当するｐＨ条件（ｐＨ約７．４）では、実施例１のポリマーも比較例１のポリマーも、同程度の細胞への取り込みを示すことが明らかとなった。

一方、腫瘍の周囲の環境に相当する弱酸性条件（ｐＨ約６．５）以下のｐＨ条件では、比較例１のポリマーの細胞への取り込みには変化が認められなかったのに対し、実施例１のポリマーは細胞への取り込みが上昇したことが明らかとなった。

すなわち、実施例１のポリマーは、中性付近のｐＨ条件下で電気的に中性であることにより、正常組織の細胞への取り込みは抑制され、弱酸性以下のｐＨ条件下でｐＨ選択的にカチオン性を帯びることにより、腫瘍組織の細胞への取り込みが上昇したことが確認された。

［実験例３］
（細胞膜傷害試験）
カチオン性物質は、しばしば細胞膜と強く相互作用することにより細胞膜を破壊し、細胞毒性を示す場合がある。そこで、実施例１、比較例１及び比較例２のポリマーの細胞膜傷害試験を行った。具体的には、ヒト肺癌細胞であるＡ５４９に、様々なｐＨ条件下で各ポリマーを接触させ、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性試験を行った。

まず、１ウェルあたり１００，０００個のＡ５４９細胞を６ウェルプレートに播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）入りのＲＰＭＩ培地中で一晩インキュベートした。続いて、培地をｐＨ７．４の緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ＦＢＳ）、ｐＨ６．５の緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ＦＢＳ）、又はｐＨ５．５の緩衝液（１０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ＦＢＳ）に交換した。

続いて、各濃度の各ポリマーを添加し、３７℃で１．５時間インキュベートした。続いて、ＬＤＨアッセイキット（ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて細胞内から漏出したＬＤＨ量を測定し、細胞膜への傷害を定量化した。これは、ポリマーに細胞膜傷害性があり、細胞膜が傷害を受けた場合、細胞内のＬＤＨが細胞外に漏出することを利用したものである。細胞外のＬＤＨ活性を測定することにより、各ポリマーの細胞膜傷害性を評価することができる。

図３（ａ）～（ｃ）はＬＤＨ活性試験の結果を示すグラフである。図３（ａ）はｐＨ７．４における試験結果であり、図３（ｂ）はｐＨ６．５における試験結果であり、図３（ｃ）はｐＨ５．５における試験結果である。

その結果、実施例１及び比較例１のポリマーは、いずれのｐＨにおいても目立ったＬＤＨ活性を示さないことが明らかとなった。

この結果から、実施例１のポリマーは、弱酸性～酸性のｐＨに応答して細胞膜への吸着及び細胞内への取り込みを示すものの、細胞膜への傷害を起こすことはなく、生体適合性が高いポリマーであることが明らかとなった。

また、比較例１のポリマーの結果は、ｐＨ応答性を示さず、いずれのｐＨ条件においても細胞と相互作用せず、細胞内への取り込みもわずかであったという実験例１、２の結果と一致したものであった。

また、比較例２のポリマーは、ｐＨの低下に伴ってＬＤＨ活性が上昇したことが明らかとなった。この結果から、比較例２のポリマーは、酸性条件下において細胞傷害性を示すことが明らかとなった。

［実験例４］
（細胞毒性試験）
実施例１、比較例１及び比較例２のポリマーの細胞毒性試験を行った。具体的には、ヒト肺癌細胞であるＡ５４９の培地に、様々なｐＨ条件下で様々な濃度の各ポリマーを添加して１日間培養し、細胞生存率を測定した。

まず、１ウェルあたり５，０００個のＡ５４９細胞を９６ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳ入りのＲＰＭＩ培地中で一晩インキュベートした。続いて、培地を通常のＲＰＭＩ培地（ｐＨ７．４）及びｐＨを６．７に調整したＲＰＭＩ培地に交換し、様々な濃度の各ポリマーを添加して３７℃で１日間培養し、細胞生存率を測定した。細胞生存率の測定にはＣＣＫ－８キット（ＤＯＪＩＮＤＯ）を使用した。

図４（ａ）及び（ｂ）は、細胞毒性試験の結果を示すグラフである。図４（ａ）はｐＨ７．４における結果であり、図４（ｂ）はｐＨ６．７における結果である。その結果、いずれのポリマーも、ｐＨ、濃度によらず目立った細胞毒性を示さないことが明らかとなった。

［実験例５］
（血中滞留性試験及び腫瘍集積試験）
実施例１、比較例１及び比較例２のポリマーでコーティングしたナノ粒子を用いて、インビボにおける血中滞留性及び腫瘍への集積を検討した。

まず、ナノ粒子（薬物）のモデルである量子ドットを、実施例１、比較例１及び比較例２のポリマーでコーティングした。また、比較のために、従来用いられてきたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて同様に量子ドットをコーティングしたものも調製した。以下、実施例１のポリマーでコーティングした量子ドットを「実施例１の量子ドット」という場合がある。同様に、比較例１のポリマーでコーティングした量子ドットを「比較例１の量子ドット」といい、比較例２のポリマーでコーティングした量子ドットを「比較例２の量子ドット」という場合がある。

続いて、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、５週齢）の皮下にマウス大腸癌細胞株であるＣＴ２６細胞を移植し、マウス担癌モデルを作製した。腫瘍組織のサイズが５０～１００ｍｍ^３となった段階で、各量子ドット２００ｐｍｏｌずつをそれぞれ尾静脈投与した。その後、経時的に血液採取を行い、４８時間後にと殺して腫瘍組織を摘出した。

続いて、採取した各試料を９０％硝酸中１８０℃で処理した。得られた水溶液に含まれる量子ドット由来のカドミウム量をＩＣＰ－ＭＳ（型式「Ａｇｉｌｅｎｔ ７７００ ＩＣＰ－ＭＳ」、アジレントテクノロジーズ社）で測定することにより、各量子ドットの量をそれぞれ定量し、各量子ドットの血中滞留性及び腫瘍組織への集積性を評価した。

図５は、各量子ドットの血中残存量を経時的に測定した結果を示すグラフである。その結果、実施例１及び比較例１の量子ドットは、同等の血中滞留性を示したことが明らかとなった。この結果は、これらの量子ドットがインビボで同等のステルス性を有することを示す。

一方、比較例２の量子ドットは、実施例１及び比較例１の量子ドットと比較して、低い血中滞留性を示したことが明らかとなった。比較例２のポリマーは、弱塩基性～酸性のｐＨ条件においてカチオン性を帯びているため、血液中成分や正常組織と相互作用し、血液中からの消失が速いものと考えられる。

また、実施例１及び比較例１の量子ドットは、従来使用されてきたＰＥＧでコーティングした量子ドットと比較して、高い血中滞留性を示した。この結果は、実施例１及び比較例１のポリマーが、インビボでＰＥＧよりもすぐれたステルス性を有することを示す。

図６は、摘出した腫瘍組織中の各量子ドットの定量結果を示すグラフである。その結果、実施例１の量子ドット及び比較例１の量子ドットは、同等の血中滞留性を示すにもかかわらず、実施例１の量子ドットは、比較例１の量子ドットよりも高い腫瘍組織への集積性を有することが明らかとなった。この結果は、実施例１の量子ドット及び比較例１の量子ドットの血液中におけるステルス性は同等であるが、腫瘍組織の周囲の弱酸性環境下では、実施例１のポリマーがカチオン性に変化することにより、実施例１の量子ドットは、腫瘍組織の細胞との相互作用を増大させ、細胞取り込みを促進したことを示す。

また、比較例２の量子ドットの腫瘍組織への集積は比較例１の量子ドットと同様であった。更に、従来使用されてきたＰＥＧでコーティングした量子ドットの腫瘍組織への集積は、比較例１及び比較例２の腫瘍組織への集積量よりも顕著に低いものであった。

［実施例２のポリマーの合成］
実施例２のポリマーを合成した。実施例２のポリマーは、平均重合度７５のＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｃａｒ）であった。

（ポリ（β－ベンジルＬ－グルタミン酸）の合成）
まず、ポリ（β－ベンジルＬ－グルタミン酸）（ＰＢＬＧ）を合成した。５．０ｇのＢＬＧ－Ｎ－カルボキシアンヒドリド（ＢＬＧ－ＮＣＡ）をアルゴン雰囲気下で１０ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、更に４０ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）を加えた。

得られた溶液に、４０．０ｍｇの１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミドを加え、アルゴン雰囲気下にて一晩、室温にて撹拌した。続いて、反応溶液を過剰量のジエチルエーテルに注ぐことで生成物を再沈殿させて回収し、減圧乾燥を経て３．９ｇの白色固体を得た（収率７９％）。

^１Ｈ ＮＭＲ解析により構造を確認し、ＰＢＬＧであることを確認した。

また、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）解析により分子量を算出し、平均重合度が７５であることが明らかとなった（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．２）。

（ＰＧｌｕ（ＤＥＴ）の合成）
ＰＢＬＧの側鎖のベンジル基に対するアミノリシス反応により、ＰＧｌｕ（ＤＥＴ）を合成した。まず、６６０ｍｇのＰＢＬＧと１．４ｇの２－ヒドロキシピリジンを４８ｍＬのＮ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）に溶解した。得られた溶液に対し、１５．４ｇのジエチレントリアミン（ＤＥＴ）を加え、４日間室温で攪拌した。反応溶液を０．３Ｍ塩酸による透析により中和し、続けて０．０１Ｍ塩酸に対して透析し、更に純水に対して透析した。透析処理を行った水溶液を凍結乾燥することにより生成物となる白色固体（ＰＧｌｕ（ＤＥＴ））を得た（０．６４ｇ、収率９７％）。得られたＰＧｌｕ（ＤＥＴ）は、^１Ｈ ＮＭＲ解析により目的の構造であることを確認した。

（ＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｃａｒ）の合成）
ＰＧｌｕ（ＤＥＴ）の側鎖の一級アミンに対し、アクリル酸とのマイケル反応によりカルボキシル基を導入した。まず、２００ｍｇのＰＧｌｕ（ＤＥＴ）を６０ｍＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム水溶液に溶解し、２．２ｍＬのアクリル酸を加えた。５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いて、反応溶液のｐＨを９～１０に調整した後、室温にて１週間撹拌した。得られた反応溶液を０．０１Ｍ塩酸、続けて純水に対して透析処理し、凍結乾燥することにより、ＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｃａｒ）（以下、「実施例２のポリマー」という場合がある。）を乳白色の固体として得た（２１０ｍｇ、収率８２％）。^１Ｈ ＮＭＲ解析により目的の構造であることを確認した。

［実施例３のポリマーの合成］
実施例３のポリマーを合成した。実施例３のポリマーは、平均重合度１１２のＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｃａｒ）であった。

（ポリ（β－ベンジルＬ－グルタミン酸）の合成）
まず、ポリ（β－ベンジルＬ－グルタミン酸）（ＰＢＬＧ）を合成した。３．０ｇのＢＬＧ－Ｎ－カルボキシアンヒドリド（ＢＬＧ－ＮＣＡ）をアルゴン雰囲気下で６ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、更に２４ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）を加えた。

得られた溶液に、１９．１ｍｇの１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミドを加え、アルゴン雰囲気下にて２４時間、室温にて撹拌した。続いて、反応溶液を過剰量のジエチルエーテルに注ぐことで生成物を再沈殿させて回収し、減圧乾燥を経て２．２ｇの白色固体を得た（収率８５％）。

^１Ｈ ＮＭＲ解析により構造を確認し、ＰＢＬＧであることを確認した。

また、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）解析により分子量を算出し、平均重合度が１１２であることが明らかとなった（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．２）。

（ＰＧｌｕ（ＤＥＴ）の合成）
ＰＢＬＧの側鎖のベンジル基に対するアミノリシス反応により、ＰＧｌｕ（ＤＥＴ）を合成した。まず、５００ｍｇのＰＢＬＧと１．０ｇの２－ヒドロキシピリジンを１４ｍＬのＮ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）に溶解した。得られた溶液に対し、１２．４ｇのジエチレントリアミン（ＤＥＴ）を加え、４日間室温で攪拌した。反応溶液を０．３Ｍ塩酸による透析により中和し、続けて０．０１Ｍ塩酸に対して透析し、更に純水に対して透析した。透析処理を行った水溶液を凍結乾燥することにより生成物となる白色固体（ＰＧｌｕ（ＤＥＴ））を得た（０．４９ｇ、収率８６％）。得られたＰＧｌｕ（ＤＥＴ）は、^１Ｈ ＮＭＲ解析により目的の構造であることを確認した。

（ＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｃａｒ）の合成）
ＰＧｌｕ（ＤＥＴ）の側鎖の一級アミンに対し、アクリル酸とのマイケル反応によりカルボキシル基を導入した。まず、２００ｍｇのＰＧｌｕ（ＤＥＴ）を２５ｍＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム水溶液に溶解し、３．２ｍＬのアクリル酸を加えた。５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いて、反応溶液のｐＨを９～１０に調整した後、室温にて１週間撹拌した。得られた反応溶液を０．０１Ｍ塩酸、続けて純水に対して透析処理し、凍結乾燥することにより、ＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｃａｒ）（以下、「実施例３のポリマー」という場合がある。）を乳白色の固体として得た（２１３ｍｇ、収率８３％）。^１Ｈ ＮＭＲ解析により目的の構造であることを確認した。

［実施例４のポリマーの合成］
実施例４のポリマー（以下、「ＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｓｕｌ）」という場合がある。）を合成した。

（ＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｓｕｌ）の合成）
実施例３と同様にして合成したｐＧｌｕ（ＤＥＴ）（平均重合度１１２）の側鎖の一級アミンに対し、ビニルスルホン酸とのマイケル反応によりスルホ基を導入した。まず、２００ｍｇのＰＧｌｕ（ＤＥＴ）を２５ｍＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム水溶液に溶解し、６．１ｇのビニルスルホン酸ナトリウムを加えた。５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いて、反応溶液のｐＨを９～１０に調整した後、室温にて２週間撹拌した。得られた反応溶液を０．０１Ｍ塩酸、続けて純水に対して透析処理し、凍結乾燥することにより、ＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｓｕｌ）（以下、「実施例４のポリマー」という場合がある。）を淡橙色の固体として得た（２１３ｍｇ、収率７８％）。^１Ｈ ＮＭＲ解析により目的の構造であることを確認した。

実施例４のポリマーの化学式を下記式（１３）に示す。実施例４のポリマーは、生体適合性ポリマーとしてポリグルタミン酸を有し、７を超えるｐＨ環境下で電気的に中性でありｐＨ７以下でカチオン性に変化する基として、エチレンジアミン構造を有する基が結合したポリマーであった。

［式（１３）中、ｍの平均値は１１２である。］

［実験例６］
（実施例１のポリマーのｐＫａ測定）
実施例１のポリマーのｐＫａを測定した。上述したように、実施例１のポリマーは平均重合度１００のＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｃａｒ）であった。

５ｍｇのＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｃａｒ）を２ｍＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ ０．１Ｍ ＨＣｌに溶解し、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ０．０１Ｍ ＮａＯＨにて滴定試験を行った。滴定装置には、型式「ＣＯＭ－１７５０Ｍ」（平沼産業）を使用した。その結果、実施例１のポリマーは、４．３（カルボン酸由来）、６．０（エチレンジアミン由来）、８．８（エチレンジアミン由来）のｐＫａを有することが明らかとなった。

［実験例７］
（実施例４のポリマーのｐＫａ測定）
実施例４のポリマーのｐＫａを測定した。上述したように、実施例４のポリマーは平均重合度１１２のＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｓｕｌ）であった。

５ｍｇのＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｓｕｌ）を２ｍＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ ０．１Ｍ ＨＣｌに溶解し、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ０．０１Ｍ ＮａＯＨにて滴定試験を行った。滴定装置には、型式「ＣＯＭ－１７５０Ｍ」（平沼産業）を使用した。その結果、実施例４のポリマーは、６．４（エチレンジアミン由来）、８．９（エチレンジアミン由来）のｐＫａを有することが明らかとなった。

［実験例８］
（実施例３のポリマー及びアニオン性糖鎖の相互作用試験）
実験例１において上述したように、一般に、細胞膜の表面はアニオン性の糖鎖で覆われている。そこで、実施例３のポリマーと、アニオン性糖鎖とのｐＨ依存的な相互作用を検討した。アニオン性糖鎖としてへパリンを用いた。上述したように、実施例３のポリマーは平均重合度１１２のＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｃａｒ）であった。

まず、ＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｃａｒ）を、蛍光物質であるＣｙ３で標識した。続いて、２００ｎＭのポリマーと１００μｇ／ｍＬのへパリンとの混合溶液を調製し、様々なｐＨ条件下で蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を用いてポリマーの拡散係数を測定した（型式「ＬＳＭ７１０」、Ｃａｒｌ－Ｚｅｉｓｓ社）。ポリマーの拡散係数が低下したことは、へパリンとポリマーとが相互作用し、会合体を形成したことを示す。ｐＨ６．０、６．５、７．０のｐＨ条件はＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ）で作製し、ｐＨ７．４と８．０のｐＨ条件はＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ）で作製した。

図７は、ＦＣＳによる測定結果を示すグラフである。その結果、実施例３のポリマーは、正常組織の周囲の環境に相当するｐＨ条件（ｐＨ約７．４）ではへパリンとの相互作用を示さず、腫瘍の周囲の環境に相当する弱酸性条件（ｐＨ約６．５）ではへパリンとの会合体を形成（拡散係数が低下）したことが明らかとなった。

この結果から、実施例３のポリマーは、正常組織の細胞とは相互作用せず、腫瘍組織の細胞の細胞膜には特異的に吸着し、細胞への取り込みが促進されることが示された。

［実験例９］
（実施例３のポリマーの細胞への取り込みの検討）
マウス大腸がん細胞であるＣＴ２６に、様々なｐＨ条件下で実施例３のポリマーを接触させ、細胞に取り込まれるか否かを検討した。上述したように、実施例３のポリマーは平均重合度１１２のＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｃａｒ）であった。

まず、１ウェルあたり５０，０００個のＣＴ２６細胞を２４ウェルプレートに播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）入りのＤＭＥＭ培地で一晩インキュベートした。続いて、培地をｐＨ７．４の緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ＦＢＳ）、又はｐＨ６．５の緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ＦＢＳ）に交換した。

続いてＣｙ３標識したポリマーを終濃度１μＭとなるように添加し、３７℃で６時間インキュベートした。続いて、ＣＴ２６細胞を、ＦＢＳを含まない緩衝液でリンス処理し、更にトリプシン処理を行って回収し、フローサイトメトリー（型式「Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ６－２Ｌ」、メルクミリポア社）で解析し、ＣＴ２６細胞に取り込まれたＣｙ３の蛍光強度を測定した。

図８は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。その結果、実施例３のポリマーはｐＨ７．４に比較して、ｐＨが６．５での細胞への取り込みが増大することが確認された。

［実験例１０］
（実施例４のポリマー及びアニオン性糖鎖の相互作用試験）
実験例１において上述したように、一般に、細胞膜の表面はアニオン性の糖鎖で覆われている。そこで、実施例４のポリマーと、アニオン性糖鎖とのｐＨ依存的な相互作用を検討した。アニオン性糖鎖としてへパリンを用いた。上述したように、実施例４のポリマーは平均重合度１１２のＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｓｕｌ）であった。

まず、ＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｓｕｌ）を、蛍光物質であるＣｙ３で標識した。続いて、２００ｎＭのポリマーと１００μｇ／ｍＬのへパリンとの混合溶液を調製し、様々なｐＨ条件下で蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を用いてポリマーの拡散係数を測定した（型式「ＬＳＭ７１０」、Ｃａｒｌ－Ｚｅｉｓｓ社）。ポリマーの拡散係数が低下したことは、へパリンとポリマーとが相互作用し、会合体を形成したことを示す。ｐＨ６．０、６．５、７．０のｐＨ条件はＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ）で作製し、ｐＨ７．４と８．０のｐＨ条件はＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ）で作製した。

図９は、ＦＣＳによる測定結果を示すグラフである。その結果、実施例４のポリマーは、正常組織の周囲の環境に相当するｐＨ条件（ｐＨ約７．４）ではへパリンとの相互作用を示さず、腫瘍の周囲の環境に相当する弱酸性条件（ｐＨ約６．５）ではへパリンとの会合体を形成（拡散係数が低下）したことが明らかとなった。

この結果から、実施例４のポリマーは、正常組織の細胞に比較して、腫瘍組織の細胞の細胞膜に強く相互作用し、細胞への取り込みが促進されることが示された。

［実験例１１］
（実施例４のポリマーの細胞への取り込みの検討）
マウス大腸がん細胞であるＣＴ２６に、様々なｐＨ条件下で実施例４のポリマーを接触させ、細胞に取り込まれるか否かを検討した。上述したように、実施例４のポリマーは平均重合度１１２のＰＧｌｕ（ＤＥＴ－Ｓｕｌ）であった。

まず、１ウェルあたり５０，０００個のＣＴ２６細胞を２４ウェルプレートに播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）入りのＤＭＥＭ培地で一晩インキュベートした。続いて、培地をｐＨ７．４の緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ＦＢＳ）、又はｐＨ６．５の緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ＦＢＳ）に交換した。

続いてＣｙ３標識したポリマーを終濃度１μＭとなるように添加し、３７℃で６時間インキュベートした。続いて、ＣＴ２６細胞を、ＦＢＳを含まない緩衝液でリンス処理し、更にトリプシン処理を行って回収し、フローサイトメトリー（型式「Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ６－２Ｌ」、メルクミリポア社）で解析し、ＣＴ２６細胞に取り込まれたＣｙ３の蛍光強度を測定した。

図１０は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。その結果、実施例４のポリマーはｐＨ７．４に比較して、ｐＨが６．５での細胞への取り込みが増大することが確認された。

本発明によれば、血液成分や正常組織に対してはステルス性を示し、腫瘍組織に対しては集積効率及び細胞への取り込み効率が向上したポリマーを提供することができる。

Claims (13)

1. ｐＨ７．２～７．６の環境下で電気的に中性でありｐＨ６．０～６．６の環境下でカチオン性に変化する基が結合した生体適合性ポリマーからなり、
   ｐＨ７．２～７．６の環境下で電気的に中性でありｐＨ６．０～６．６の環境下でカチオン性に変化する前記基が、下記式（１）で表される基、下記式（２）で表される基、又は、下記式（３）で表される基を含む、ｐＨ応答性ポリマー。
   

   

   ［式（１）～（３）中、ｎは１～３の整数を表し、＊は結合手を表す。］
2. 前記式（１）で表される基、前記式（２）で表される基、又は前記式（３）で表される基が生体適合性ポリマーの側鎖に結合している、請求項１に記載のｐＨ応答性ポリマー。
3. 前記生体適合性ポリマーが生体分解性である、請求項１又は２に記載のｐＨ応答性ポリマー。
4. 前記生体適合性ポリマーが、ポリアミノ酸、ポリエステル、ポリヌクレオチド及び多糖類からなる群より選択される、請求項３に記載のｐＨ応答性ポリマー。
5. 前記生体適合性ポリマーがポリアミノ酸である、請求項４に記載のｐＨ応答性ポリマー。
6. 前記ポリアミノ酸がポリグルタミン酸又はポリアスパラギン酸である、請求項５に記載のｐＨ応答性ポリマー。
7. 下記式（ｂ）で表される繰り返し単位を含む、請求項６に記載のｐＨ応答性ポリマー。
   

   
8. 下記式（ｃ）で表される繰り返し単位を含む、請求項６に記載のｐＨ応答性ポリマー。
   

   

   ［式（ｃ）中、ｎは２又は３を表す。］
9. 重量平均分子量が１，０００～２００，０００である、請求項１～８のいずれか一項に記載のｐＨ応答性ポリマー。
10. 重量平均分子量が１０，０００～５０，０００である、請求項９に記載のｐＨ応答性ポリマー。
11. 前記生体適合性ポリマー１モルあたり、ｐＨ７．２～７．６の環境下で電気的に中性でありｐＨ６．０～６．６の環境下でカチオン性に変化する前記基が４～８００モル結合した、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｐＨ応答性ポリマー。
12. 薬物送達システム用である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のｐＨ応答性ポリマー。
13. 薬物と、請求項１～１２のいずれか一項に記載のｐＨ応答性ポリマーとが結合した、薬物送達システム。

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