JP7000998B2 - 分析用閾値生成装置及び分析用閾値生成方法 - Google Patents

Description

本発明は、分析用閾値生成装置及び分析用閾値生成方法に関する。詳細には、本発明は、抗原、抗体等の生体物質を分析するための分析用閾値生成装置及び分析用閾値生成方法に関する。

疾病に関連付けられた特定の抗原又は抗体をバイオマーカーとして検出することで、疾病の発見及び治療の効果等を定量的に分析する免疫検定法（immunoassay）が知られている。酵素により標識された抗原又は抗体を検出するＥＬＩＳＡ法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）は免疫検定法の一つであり、コスト等のメリットから広く普及している。

しかしながら、ＥＬＩＳＡ法は、前処理、抗原抗体反応、Ｂ／Ｆ（bond/free）分離、酵素反応等を合計した時間が数時間から１日程度であり、分析に長時間を要する。そこで、光ディスクに固定された抗体と試料中の抗原を結合させ、抗原に抗体が設けられた粒子をさらに結合させ、光ヘッドで走査することにより、光ディスク上に捕捉された粒子を短時間に計数する技術が提案されている（例えば、特許文献１参照）。また、光ディスクのトラッキング構造が形成される面に生体試料及び粒子を付着させ、光ピックアップで信号の変化を検出する技術が提案されている（例えば、特許文献２参照）。

特開平５－５７４１号公報 特表２００２－５３０７８６号公報

光ディスクからの反射信号に含まれるパルスを利用することにより、光ディスクに付着した粒子を計数することが可能である。この際、パルスにはノイズに起因するパルスも含まれるため、パルス振幅及びパルス幅などに所定の条件を設けることで、粒子に起因するパルスを選択的に計数し、粒子に結合した検出対象物質を計数することを行っている。

しかしながら、粒子に起因するパルスであると判定するための、パルス振幅及びパルス幅に関する条件が固定されたままだと、同じサンプルを分析してもばらつきが発生するために計数結果が変化してしまい、分析精度が低下するおそれがある。

本発明は、このような従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、粒子を計数する際の条件によらず検出対象物質を計数することが可能な分析用閾値生成装置及び分析用閾値生成方法を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明の態様に係る分析用閾値生成装置は、分析用基板に照射光を照射し、照射光による分析用基板からの反射光を受光して受光レベル信号を生成する光ピックアップを備える。分析用基板には、検出対象物質と検出対象物質に結合する粒子とが表面に固定されている。分析用閾値生成装置は、受光レベル信号に含まれるパルスのパルス幅について一対の閾値、またはパルスのパルス振幅について一対の閾値を生成する閾値演算部を備える。分析用閾値生成装置は、パルス幅がパルス幅についての一対の閾値の範囲内に存在するかを判定するか、またはパルス振幅がパルス振幅についての一対の閾値の範囲内に存在するかを判定するパルス判定部を備える。分析用閾値生成装置は、パルス判定部が生成された一対の閾値の範囲内に存在すると判定したパルスを計数し、計数したパルスの計数値を出力するパルス計数部を備える。分析用閾値生成装置は、閾値演算部が生成した一対の閾値と、パルス計数部が出力した計数値と、に基づいて、分析に用いる一対の閾値を生成する閾値補正部を備える。閾値演算部は、パルス計数部がパルスを計数するごとに、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成する。

本発明の態様に係る分析用閾値生成方法は、検出対象物質と検出対象物質に結合する粒子とが表面に固定された分析用基板に照射光を照射する照射ステップを含む。分析用閾値生成方法は、照射光による分析用基板からの反射光を受光して受光レベル信号を生成する信号生成ステップを含む。分析用閾値生成方法は、受光レベル信号に含まれるパルスが、パルス幅について設定された一対の閾値、またはパルスがパルス振幅について設定された一対の閾値の範囲内に存在するかを判定する判定ステップを含む。分析用閾値生成方法は、判定ステップにおいて、設定された一対の閾値の範囲内に存在すると判定されたパルスを計数し、計数したパルスの計数値を出力する計数値出力ステップを含む。分析用閾値生成方法は、計数値出力ステップにおいてパルスを計数するごとに、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成する第一閾値生成ステップを含む。分析用閾値生成方法は、生成された各一対の閾値と計数値出力ステップで出力された計数値とに基づいて、分析に用いる一対の閾値を生成する第二閾値生成ステップを含む。

本発明によれば、粒子を計数する際の条件によらず検出対象物質を計数することが可能な分析用閾値生成装置及び分析用閾値生成方法を提供することができる。

第１実施形態に係る分析用閾値生成装置を含む分析装置の構成を示すブロック図である。 反応領域を有する分析用基板の一例を示す上面図である。 反応領域のトラック領域に粒子が捕獲されている状態を拡大して示した上面図である。 検出対象物質が抗体と粒子とによってトラック領域の凹部にサンドイッチ捕獲されている状態を示す模式的な断面図である。 本実施形態に係るディスクドライブの一例を示す概略図である。 第１実施形態に係る分析用閾値生成方法の一例を示すフローチャートである。 本実施形態に係る計数テーブルの一例を示す図である。 ヒストグラムの最頻値に基づいて一対の閾値を演算する方法を説明する図である。 ヒストグラムの積分値に基づいて一対の閾値を演算する方法を説明する図である。 第２実施形態に係る分析用閾値生成装置の構成を示すブロック図である。 第２実施形態に係る分析用閾値生成方法の一例を示すフローチャートである。

以下、本実施形態に係る分析用閾値生成装置及び分析用閾値生成方法について説明する。なお、図面の寸法比率は説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。

［第１実施形態］
まず、第１実施形態に係る分析用閾値生成装置及び分析用閾値生成方法について詳細に説明する。

図１に示すように、本実施形態に係る分析用閾値生成装置１００は、パルス検出回路３０と、システム制御部４０と、を備える。この実施形態では、分析用閾値生成装置１００と、ディスクドライブ２０とを備えた分析装置２００を例として説明する。

ディスクドライブ２０では、分析用基板１０が再生される。分析用基板１０は、例えば、ブルーレイディスク（ＢＤ）、ＤＶＤ、コンパクトディスク（ＣＤ）等の光ディスクと同等の円板形状を有する。分析用基板１０は、例えば、一般的に光ディスクに用いられるポリカーボネート樹脂又はシクロオレフィンポリマー等の樹脂材料で形成されている。なお、分析用基板１０は、上記の光ディスクに限定されるものではなく、他の形態又は所定の規格に準拠した光ディスクを用いることもできる。

図２に示すように、分析用基板１０は、反応領域１１を有する。反応領域１１は、検出対象物質１３、粒子１４及び抗体１５などが固定された分析対象となる領域である（図４参照）。本実施形態では、分析用基板１０の中心部に位置決め孔１２が形成されており、分析用基板１０の中心Ｃａに対して同一円周Ｃｂ上に中心部がそれぞれ位置するように、８つの反応領域１１が等間隔に形成されている。ただし、反応領域１１の数又は形成位置はこれに限定されるものではない。

図３に示すように、分析用基板１０の表面には、凸部１０ａと凹部１０ｂとが半径方向に交互に配置されたトラック領域１０ｃが形成されている。凸部１０ａ及び凹部１０ｂは、分析用基板１０の内周部から外周部に向かってスパイラル状に形成されている。凸部１０ａは光ディスクのランドに相当する。凹部１０ｂは光ディスクのグルーブに相当する。凹部１０ｂの半径方向のピッチに相当するトラックピッチは例えば３２０ｎｍである。

図３及び図４に示すように、分析用基板１０の表面には、検出対象物質１３と検出対象物質１３に結合する粒子１４とが固定されている。分析用基板１０の表面には、検出対象物質１３と特異的に結合する抗体１５が固定されている。抗体１５は検出対象物質１３を認識して結合し、検出対象物質１３が分析用基板１０の表面に捕捉される。一方、粒子１４には検出対象物質１３を認識する抗体１６が複数設けられており、粒子１４は抗体１６を介して検出対象物質１３と結合し、サンドイッチ構造を形成している。

検出対象物質１３は、例えば疾病に関連付けられた特定のタンパク質などの抗原である。このような抗原を検出対象物質１３として用いることにより、疾病の発見などに役立てることができる。例えばエクソソームなどの検出対象物質１３は、モニタリング対象の疾患状態に応じ、体液内の濃度が変化するため、バイオマーカーとしての役割を果たすことができる。検出対象物質１３であるエクソソームの大きさは１００ｎｍ程度である。

粒子１４は、検出対象物質１３の標識となる。粒子１４としては、特に限定されないが、例えばポリマー粒子、金属粒子、シリカ粒子などの標識用ビーズなどが挙げられる。粒子１４は、内部にフェライト等の磁性材料を含む磁気ビーズなどであってもよい。粒子１４の大きさは２００ｎｍ程度である。

図５に示すように、ディスクドライブ２０は、ターンテーブル２１と、クランパ２２と、ターンテーブル駆動部２３と、ガイド軸２４と、光ピックアップ２５と、を備える分析用基板駆動装置である。ディスクドライブ２０は、周知の情報再生用ディスクドライブを用いることができる。

ターンテーブル２１上には、反応領域１１が形成された面が下向きになるように分析用基板１０が載置される。

クランパ２２は、ターンテーブル２１に対して離隔する方向及び接近する方向、すなわち、図５の上方向及び下方向に駆動される。分析用基板１０は、クランパ２２が下方向に駆動されると、クランパ２２とターンテーブル２１とによって、ターンテーブル２１上に保持される。具体的には、分析用基板１０の中心Ｃａがターンテーブル２１の回転軸Ｃ１上に位置するように保持される。

ターンテーブル駆動部２３は、ターンテーブル２１を分析用基板１０及びクランパ２２と共に、回転軸Ｃ１回りに回転駆動させる。ターンテーブル駆動部２３としてスピンドルモータを用いてもよい。ターンテーブル駆動部２３は、ドライブ制御部４４のターンテーブル駆動回路４４ａによって制御される。

ガイド軸２４は、分析用基板１０と平行に、かつ、分析用基板１０の半径方向に沿って配置されている。すなわち、ガイド軸２４は、ターンテーブル２１の回転軸Ｃ１に直交する方向に沿って配置されている。

光ピックアップ２５はガイド軸２４に支持されている。光ピックアップ２５は、ガイド軸２４に沿って、ターンテーブル２１の回転軸Ｃ１に直交する方向であり、分析用基板１０の半径方向に、かつ、分析用基板１０と並行に駆動される。光ピックアップ２５は、ドライブ制御部４４の光ピックアップ駆動回路４４ｂによって制御される。

光ピックアップ２５は対物レンズ２５ａを備えている。光ピックアップ２５は分析用基板１０に照射光２５ｂを照射する。照射光２５ｂは例えばレーザ光である。照射光２５ｂは対物レンズ２５ａによって分析用基板１０の表面に集光される。分析用基板１０を回転させた状態で光ピックアップ２５が分析用基板１０の半径方向に駆動されることにより、照射光２５ｂは凹部１０ｂに沿って走査される。

光ピックアップ２５は照射光２５ｂによる分析用基板１０からの反射光を受光して受光レベル信号ＪＳを生成する。図１に示すように、光ピックアップ２５は、受光レベル信号ＪＳをパルス検出回路３０のパルス情報抽出部３１へ出力する。

図１に示すように、パルス検出回路３０は、パルス情報抽出部３１と、パラメータ記憶部３２と、パルス判定部３３と、パルス計数部３４と、を備える。

パルス検出回路３０は、ディスクドライブ２０から出力された受光レベル信号ＪＳを取得し、粒子１４に起因するパルス信号の解析を行うことで検出対象物質１３の計数情報を取得する。パルス検出回路３０は、例えば専用回路基板などのハードウェアである。

パルス情報抽出部３１は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスからパルス情報を抽出する。パルス情報には、例えば、パルス幅及びパルス振幅などが含まれる。パルス情報抽出部３１は、パラメータ記憶部３２に記憶されている抽出パラメータの設定値を読み出し、抽出パラメータの設定値に基づいて受光レベル信号ＪＳに含まれるパルス情報を抽出してもよい。例えば、パルス情報としてパルス幅を抽出する場合、パルス幅を抽出するための抽出電圧Ｖ_ｔｈを抽出パラメータとし、抽出電圧Ｖ_ｔｈにおけるパルス幅をパルス情報として抽出してもよい。また、パルス情報としてパルス振幅を抽出する場合、パルスのピーク値などをパルス情報として抽出してもよい。抽出されたパルス情報は、パルス判定部３３に出力される。

パラメータ記憶部３２は、抽出パラメータと判定パラメータとを含むパルス関連パラメータの設定値を記憶する。判定パラメータは受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが粒子１４に起因するパルスか否かを判定するために用いられる。本実施形態において、判定パラメータの設定値は閾値である。判定パラメータとしては、例えば、パルス振幅の上限側の閾値電圧である振幅上限電圧Ｖ_Ｈ、パルス振幅の下限側の閾値電圧である振幅下限電圧Ｖ_Ｌ、パルス幅の上限側の閾値時間であるパルス幅上限時間Ｔ_Ｈ、パルス幅の下限側の閾値時間であるパルス幅下限時間Ｔ_Ｌなどが挙げられる。

パルス判定部３３は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが、パルス幅の方向またはパルス振幅の方向に設定された上限値及び下限値からなる一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定する。具体的には、パルス判定部３３は、パルス幅がパルス幅についての一対の閾値の範囲内に存在するかを判定するか、またはパルス振幅がパルス振幅についての一対の閾値の範囲内に存在するかを判定する。パルス判定部３３はパラメータ記憶部３２から判定パラメータの設定値を読み出し、パルス情報抽出部３１で抽出されたパルス情報が設定値の範囲内であった場合に、パルス判定部３３は粒子１４に起因したパルスと判定する。

判定に用いる一対の閾値は、パルス幅及びパルス振幅の少なくともいずれか一方であってもよい。例えば、パルス判定部３３は、抽出電圧Ｖ_ｔｈにおけるパルス幅がパルス幅下限時間Ｔ_Ｌ～パルス幅上限時間Ｔ_Ｈの範囲内である場合に、粒子１４に起因したパルスと判定する。また、パルス判定部３３は、パルス振幅が振幅下限電圧Ｖ_Ｌ～振幅上限電圧Ｖ_Ｈの範囲内である場合に、粒子１４に起因したパルスと判定する。パルス判定部３３は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが粒子１４に起因するパルスと判定した場合に、計数値がインクリメントされるようパルス計数部３４に検出信号を出力する。

パルス計数部３４は一対の閾値の範囲内に存在するパルスを計数して計数値を出力する。具体的には、パルス計数部３４は、検出信号をリアルタイムで取得し、粒子１４に起因するパルスを計数する。計数値はパルス計数部３４からシステム制御部４０の閾値演算部４１に出力されるが、ユーザが計数値を確認できるように計数値を表示部４５に出力してもよい。なお、後述するように、閾値演算部４１は、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を設定された変化分を単位として繰り返し変化させて、新たな一対の閾値を生成する。そして、パルス判定部３３がその生成された一対の閾値の範囲内に存在すると判定したパルスを計数し、変化分ごとのパルスの計数値を出力する。

図１に示すように、システム制御部４０は、閾値演算部４１と、パラメータ設定部４２と、測定制御部４３と、ドライブ制御部４４と、表示部４５と、閾値補正部４６と、を備える。

システム制御部４０は、ディスクドライブ２０及びパルス検出回路３０を制御し、計数値、判定パラメータに関する演算処理及び設定を実施する。システム制御部４０は、ソフトウェアプログラムがインストールされたコンピュータであってもよい。

閾値演算部４１は、後述する図６のフローチャートに示されるような補正測定及び本測定に関する処理を実行する。補正測定では、照射光２５ｂの強度及び分析用基板１０の反射特性の状態などに応じて一対の閾値を補正するための測定が実施される。本測定では、補正測定によって補正された一対の閾値で検出対象物質１３が実際に分析される。

閾値演算部４１は、ドライブ制御部４４に対し、光ピックアップ２５の移動及び分析用基板１０の回転などの補正測定に関する制御命令を出力する。

閾値演算部４１は、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を設定された変化分を単位として繰り返し変化させて、新たな一対の閾値を生成する。具体的には、閾値演算部４１は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスのパルス幅について一対の閾値、またはパルスのパルス振幅について一対の閾値を生成する。そして、閾値演算部４１は、パルス計数部３４がパルスを計数するごとに、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成する。閾値演算部４１は、例えば上限又は下限の閾値のみを設定された変化分を単位として繰り返し変化させて、新たな一対の閾値を生成してもよい。また、閾値演算部４１は、上限及び下限の閾値を設定された変化分を単位として繰り返し変化させて、新たな一対の閾値を生成してもよい。上限及び下限の閾値を変化させる場合は、上限と下限の間隔を一定に保ったまま両方の閾値を変化させてもよい。さらに、上限及び下限の閾値を変化させる変化量は必ずしも一定でなくてもよく、例えば所定の範囲においてその範囲外よりも変化量を小さく、または大きく設定してもよい。上述したように、パルス計数部３４は、閾値演算部４１が一対の閾値を生成するごとに、パルス判定部３３が一対の閾値の範囲内に存在すると判定したパルスを計数し、変化分ごとのパルスの計数値を出力する。

閾値補正部４６は、閾値演算部４１が生成した一対の閾値と、パルス計数部３４が出力した計数値と、に基づいて、分析に用いる一対の閾値を生成する。

後述するように、閾値補正部４６は、生成された各一対の閾値を階級とし、パルス計数部３４が出力した計数値を度数とした度数分布を生成してもよい。そして、閾値補正部４６は度数分布に基づいて、分析に用いる一対の閾値を生成してもよい。また、閾値補正部４６は度数分布が最頻値をとる階級の値に基づいて、分析に用いる一対の閾値を生成してもよい。度数分布はヒストグラムであってもよい。閾値補正部４６はヒストグラムの積分値に基づいて、分析に用いる一対の閾値を生成してもよい。

パラメータ設定部４２は、閾値補正部４６からの出力を受けて、設定すべきパラメータの値をパラメータ記憶部３２に記憶させる。

測定制御部４３は、補正測定及び本測定の実施を管理する。測定制御部４３は、ユーザによって補正測定又は本測定の実施の選択が可能な入力部を備えていてもよい。また、測定制御部４３は、入力部で選択された情報に基づいて、ドライブ制御部４４に計数の開始、中断及び終了などを命令したり、閾値演算部４１及び閾値補正部４６に演算処理を命令したりしてもよい。

ドライブ制御部４４は、測定制御部４３からの入力を受け、ディスクドライブ２０を制御する。ドライブ制御部４４は、例えば、ディスクドライブ２０において、分析用基板１０の測定開始位置及び測定終了位置のような測定位置などを制御することができる。ドライブ制御部４４は、例えば、ターンテーブル駆動回路４４ａ、光ピックアップ駆動回路４４ｂなどを備えていてもよい。

ターンテーブル駆動回路４４ａはターンテーブル駆動部２３を制御する。例えば、ターンテーブル駆動回路４４ａは、ターンテーブル２１が分析用基板１０及びクランパ２２と共に一定の線速度で回転するようにターンテーブル駆動部２３を制御する。

光ピックアップ駆動回路４４ｂは光ピックアップ２５の駆動を制御する。例えば光ピックアップ駆動回路４４ｂは、光ピックアップ２５をガイド軸２４に沿って移動させたり、光ピックアップ２５の対物レンズ２５ａを上下方向に移動させたりする。

ドライブ制御部４４は、補正測定時において、閾値演算部４１によって一対の閾値の少なくとも一方が変更されるごとに同じ位置を繰り返して測定するようディスクドライブ２０を制御する。例えば、ドライブ制御部４４は、光ピックアップ２５が測定開始位置及び測定終了位置などに移動するよう光ピックアップ２５を制御する。補正測定の時間を短くするため、補正測定の範囲は、本測定の範囲よりも狭いことが好ましい。具体的には、閾値演算部４１で変化させて得られた新たな一対の閾値の範囲内に存在するパルスを計数する領域は、分析に用いる一対の閾値で計数する領域よりも狭いことが好ましい。

測定開始位置及び測定終了位置は予め設定されていてもよく、補正測定時において所定の計数値が得られるように測定開始位置及び測定終了位置を決定してもよい。測定開始位置及び測定終了位置が予め設定されている場合、一対の閾値の少なくとも一方の閾値を変更しながら計数を繰り返すだけでよく、校正を簡略化することができるため好ましい。補正測定時において所定の計数値が得られるように測定開始位置及び測定終了位置を決定する場合、所定量以上の計数値で補正することができ、安定した補正を行うことができるため好ましい。この場合、閾値演算部４１を介してディスクドライブ２０の測定開始位置及び測定終了位置が制御される。ただし、本測定で測定される全測定対象領域を補正測定の対象とすると時間がかかるため、本測定の測定領域の中央付近であって、全測定対象領域よりも狭い範囲とすることが好ましい。

表示部４５は、補正測定又は本測定に関する情報をユーザに提示することができる。補正測定に関する情報としては、ユーザが次の処理を選択できるような補正測定の補正精度等の付加情報などが挙げられる。本測定に関する情報としては、本測定における計数値などが挙げられる。表示部４５としては、ユーザに補正測定又は本測定に関する情報を提示することができれば特に限定されないが、例えばディスプレイ等が挙げられる。

次に、図６に示すフローチャートを用いて本実施形態に係る分析用閾値生成方法における各工程を説明する。なお、本実施形態では、横軸を走査時間（走査位置）、縦軸を電圧とするグラフにおいて、粒子１４が存在する場合は下に凸のパルスが発生する系について説明する。具体的には、本実施形態では、便宜上、振幅下限電圧Ｖ_Ｌ，振幅上限電圧Ｖ_Ｈ及び抽出電圧Ｖ_ｔｈが電圧に比例する０～＋１００の範囲の整数である場合について説明する。本実施形態では、反射光を何も検出しない場合の信号レベルを１００、分析用基板１０上に粒子１４及び異物などが存在しない場合の信号レベルを基準電圧Ｖ_ｂａｓｅとし、粒子１４が存在する場合は基準電圧Ｖ_ｂａｓｅより小さい値をとる系について説明する。なお、基準電圧Ｖ_ｂａｓｅの値は、分析用基板１０の状態及び照射光２５ｂの強度などに依存する。

ただし、本実施形態はこのような態様に限定されない。例えば、受光レベル信号の信号強度（電圧値）をそのまま用いてもよく、振幅下限電圧Ｖ_Ｌ，振幅上限電圧Ｖ_Ｈ及び抽出電圧Ｖ_ｔｈは小数であってもよい。また、基準電圧Ｖ_ｂａｓｅを０としてもよく、パルスの極性を反転させて粒子１４が存在する場合に上に凸のパルスが発生する系であってもよい。

ステップＳ１では、補正測定を実施するか否かが選択される。閾値演算部４１は、補正測定を実施する場合（ＹＥＳ）にはステップＳ２に処理を進め、補正測定を実施しない場合（ＮＯ）にはステップＳ１０に処理を進める。光ピックアップ２５のレーザの経年変化などの長期的な変動のみを考慮する場合は、補正測定を毎回する必要はないため、本測定のみを実施するためにステップＳ１０に処理を進めてもよい。補正測定を実施するか否かは、ユーザがグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）などを介して選択してもよいし、使用期間又は使用回数などの情報に基づいて閾値演算部４１が判定してもよい。

ステップＳ２では、閾値演算部４１は、振幅下限電圧Ｖ_Ｌの値を０に設定するようパラメータ設定部４２を制御する。また、閾値演算部４１は、振幅上限電圧Ｖ_Ｈの値を、予め設定された値である初期値Ｖ_Ｈ０より十分大きな値であるＶ_ｍａｘに設定するようパラメータ設定部４２を制御する。なお、振幅下限電圧Ｖ_Ｌ及び振幅上限電圧Ｖ_Ｈに代えてパルス幅上限時間Ｔ_Ｈ及びパルス幅下限時間Ｔ_Ｌを用いる場合は、閾値演算部４１は、抽出電圧Ｖ_ｔｈの値を、予め設定された値である初期値Ｖ_ｔｈ０に設定するようパラメータ設定部４２を制御すればよい。そして、閾値演算部４１は、ステップＳ３に処理を進める。

ステップＳ３では、閾値演算部４１は、粒子１４を計数するようドライブ制御部４４を制御する。具体的には、閾値演算部４１は、光ピックアップ２５を補正測定用の測定開始位置から測定終了位置まで分析用基板１０の半径方向に移動させたり、分析用基板１０を一定の速度で回転させたりするようドライブ制御部４４を制御する。

粒子１４の計数は、パルス検出回路３０で実施される。光ピックアップ２５は、検出対象物質１３と検出対象物質１３に結合する粒子１４とが表面に固定された分析用基板１０に照射光２５ｂを照射する（照射ステップ）。そして、光ピックアップ２５は、照射光２５ｂによる分析用基板１０からの反射光を受光して受光レベル信号ＪＳを生成する（信号生成ステップ）。生成された受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスのパルス情報はパルス情報抽出部３１によって取得される。パルス判定部３３は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが、パルス幅について設定された一対の閾値、または受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスがパルス振幅について設定された一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定する（判定ステップ）。パルス判定部３３は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが一対の閾値の範囲内に存在すると判定した場合に、計数値がインクリメントされるようパルス計数部３４に検出信号を出力する。パルス計数部３４は、一対の閾値の範囲内に存在するパルスを計数して計数値を閾値演算部４１へ出力する。すなわち、パルス計数部３４は、判定ステップにおいて、設定された一対の閾値の範囲内に存在すると判定されたパルスを計数し、計数したパルスの計数値を出力する（計数値出力ステップ）。そして、ステップＳ４へ処理を進める。

ステップＳ４では、閾値演算部４１は、ステップＳ３の補正測定により得られた粒子１４の計数値を、設定された振幅下限電圧Ｖ_Ｌの値と関連付けて計数テーブルに記憶する。そして、ステップＳ５へ処理を進める。

ステップＳ５では、閾値演算部４１は、パラメータ記憶部３２に記憶された振幅下限電圧Ｖ_Ｌをインクリメントした値で再設定するようパラメータ設定部４２を制御する。例えば、閾値演算部４１は、設定された振幅下限電圧Ｖ_Ｌの値がＶ_Ｌｎの場合、Ｖ_Ｌｎをインクリメントしてパラメータ記憶部３２の振幅下限電圧Ｖ_ＬをＶ_Ｌｎ＋１＝Ｖ_Ｌｎ＋１（ｎは０以上Ｖ_ｍａｘ未満の整数）とするようパラメータ設定部４２に通知する。なお、本実施形態では、閾値演算部４１は、元々の振幅下限電圧Ｖ_Ｌに１を加えているが、加える数値は１でなくてもよい。そして、閾値演算部４１は、ステップＳ６へ処理を進める。

ステップＳ６では、閾値演算部４１は、振幅下限電圧Ｖ_Ｌの設定値がＶ_ｍａｘ以上となったか否かを判定する。閾値演算部４１は、振幅下限電圧Ｖ_Ｌの設定値がＶ_ｍａｘ未満の場合（ＮＯ）にはステップＳ３へ処理を進め、振幅下限電圧Ｖ_Ｌの設定値がＶ_ｍａｘ以上の場合（ＹＥＳ）にはステップＳ７へ処理を進める。

ステップＳ３～ステップＳ６により、閾値演算部４１は、計数値出力ステップにおいて、パルス計数部３４がパルスを計数するごとに、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成している（第一閾値生成ステップ）。具体的には、閾値演算部４１は、振幅下限電圧Ｖ_Ｌに１ずつ繰り返し加えて異なる一連の値、すなわち新たな一対の閾値に変化させ、複数の値の振幅下限電圧Ｖ_Ｌを得ている。ここで、振幅下限電圧Ｖ_Ｌの設定値が０～Ｖ_ｍａｘまで計数された場合、例えば図７に示すような計数テーブルが完成する。

図７の計数テーブルには、複数の値の閾値が左欄に記憶され、変化させて得られた一対の閾値ごとに計数された計数値が右欄に記憶されている。具体的には、計数テーブルには、振幅下限電圧Ｖ_Ｌの設定値Ｖ_ｎにそれぞれ関連づけられた計数値Count(v_n)が記憶されている。Ｖ_Ｌ＝０からＶ_Ｌ＝Ｖ_ｍａｘで設定された場合のそれぞれの計数値は、Count(0)からCount(v_max)として計数テーブルに記憶されている。なお、計数値Count(v_n)は、振幅下限電圧Ｖ_Ｌの設定値がＶ_ｎである場合の計数値を示している（ここでは、ｎは０～Ｖ_ｍａｘの整数）。

ステップＳ７では、パルス計数部３４は、パルス判定部３３が複数対の閾値における各一対の閾値の範囲内に存在すると判定したパルスを計数し、変化分ごとのパルスの計数値を出力している。本実施形態では、変化分ごとのパルスの計数値は、以下の数式（１）に示すように、dCount(v_n)で表される。

dCount(v_n)＝Count(v_n)－Count(v_n+1) （１）

閾値補正部４６は、各一対の閾値を階級とし、パルス計数部３４が出力した計数値を度数とした度数分布を生成している。本実施形態では、度数分布をヒストグラムとし、振幅下限電圧Ｖ_Ｌを階級及びdCount(v_n)を度数とし、Ｖ_Ｌ＝０からＶ_Ｌ＝Ｖ_ｍａｘまでグラフ化することにより、図８に示すようなヒストグラムが得られる。そして、閾値補正部４６は、ステップＳ８へ処理を進める。

ステップＳ８では、閾値補正部４６は、第一閾値生成ステップで生成された各一対の閾値と、計数値出力ステップで出力された計数値とに基づいて、分析に用いる一対の閾値を生成する（第二閾値生成ステップ）。閾値補正部４６は、度数分布に基づいて、分析に用いる一対の閾値を生成してもよい。本実施形態では、閾値補正部４６は、ヒストグラムに基づいて適切な振幅下限電圧Ｖ_Ｌ及び振幅上限電圧Ｖ_Ｈを生成する。

閾値補正部４６は度数分布が最頻値をとる階級の値に基づいて、分析に用いる一対の閾値を生成してもよい。図８では、度数分布がヒストグラムである例について説明している。ヒストグラムが最頻値をとる度数の値をdCount(v_lc)とした場合の階級の値を電圧Ｖ_Ｌｃとすると、電圧Ｖ_Ｌｃは粒子１４に起因したパルス信号の振幅の代表値であると考えられる。すなわち、電圧Ｖ_Ｌｃは、分析用基板１０に照射される光の強度並びに分析用基板１０及び粒子１４の反射特性などが考慮された信号の強度に略比例するパラメータと考えることができる。したがって、振幅下限電圧Ｖ_Ｌ及び振幅上限電圧Ｖ_Ｈは、得られた電圧Ｖ_Ｌｃに基づいて補正することができる。同様に、抽出電圧Ｖ_ｔｈも、得られた電圧Ｖ_Ｌｃに基づいて補正することができる。具体的には、出荷時における初期値から、以下の数式（２），数式（３）及び数式（４）に従って各パラメータの補正値を演算することができる。

Ｖ_Ｌａ＝Ｖ_Ｌｉ（Ｖ_Ｌｃｐ／Ｖ_Ｌｃｉ） （２）
Ｖ_Ｈａ＝Ｖ_Ｈｉ（Ｖ_Ｌｃｐ／Ｖ_Ｌｃｉ） （３）
Ｖ_ｔｈａ＝Ｖ_ｔｈｉ（Ｖ_Ｌｃｐ／Ｖ_Ｌｃｉ） （４）

なお、数式（２）、数式（３）及び数式（４）中、Ｖ_Ｌｉ，Ｖ_Ｈｉ，Ｖ_ｔｈｉ及びＶ_Ｌｃｉは、それぞれ、出荷時における振幅下限電圧Ｖ_Ｌ，振幅上限電圧Ｖ_Ｈ，抽出電圧Ｖ_ｔｈ及び電圧Ｖ_Ｌｃの初期値である。数式（２）、数式（３）及び数式（４）中、Ｖ_Ｌｃｐはヒストグラムから導き出された電圧Ｖ_Ｌｃの値である。数式（２）、数式（３）及び数式（４）中、Ｖ_Ｌａ，Ｖ_Ｈａ及びＶ_ｔｈａは、それぞれ、補正測定によって演算された振幅下限電圧Ｖ_Ｌ，振幅上限電圧Ｖ_Ｈ及び抽出電圧Ｖ_ｔｈの補正値である。

なお、例えば、照射光２５ｂを分析用基板１０への照射用の光と光強度測定用の光に分岐させ、光強度の測定値に応じてパルス判定条件を補正する方法も考えられる。しかしながら、この方法では、分析用基板１０や粒子１４の光学特性のばらつきを考慮することはできない。また、分析用基板１０に照射光２５ｂを照射する前に光強度を測定するための光学システム及び測定システムを構築する必要がある。そのため、ディスクドライブ２０に対するハードウェアの追加が必要となるため、構成の複雑化や高コスト化、及びディスクドライブ２０自体の選定自由度の低下につながるおそれもある。一方、本実施形態に係る分析用閾値生成装置１００及び分析用閾値生成方法によれば、分析用基板１０に照射される光の強度並びに分析用基板１０及び粒子１４の反射特性などを考慮した一対の閾値が生成され得る。

一方、図９に示すように、閾値補正部４６はヒストグラムの積分値に基づいて、分析に用いる一対の閾値を生成してもよい。具体的には、得られたヒストグラムにおいて、図９の網掛け部で示すように、全積分値（全面積）に対する上限側及び下限側の積分値（面積）がそれぞれ所定の割合以下となる度数をそれぞれ振幅下限電圧Ｖ_Ｌａ及び振幅上限電圧Ｖ_Ｈａと決定してもよい。この場合、ヒストグラムが正規分布でなく、電圧Ｖ_Ｌｃがヒストグラムの中心からずれている場合であっても、上記のように所定の割合に基づいて一対の閾値を補正することができるため、安定した本測定が可能となる。所定の割合は適宜定めることができるが、例えば５％～１０％としてもよい。

なお、抽出電圧Ｖ_ｔｈをパルス振幅の半値とする場合は、以下の数式（５）に従って各パラメータの補正値を演算してもよい。

Ｖ_ｔｈ＝（Ｖ_ｂａｓｅ－Ｖ_Ｌｃｐ）／２ （５）

上記数式（５）中、Ｖ_Ｌｃｐはヒストグラムにより得られた電圧Ｖ_Ｌｃの値であり、Ｖ_ｂａｓｅは上述した基準電圧の値である。

次に、ステップＳ９では、閾値補正部４６は、計数テーブルに基づいて生成した振幅上限電圧Ｖ_Ｈ及び振幅下限電圧Ｖ_Ｌを、分析に用いる一対の閾値として再設定するようパラメータ設定部４２を制御する。そして、閾値補正部４６は、ステップＳ１０へ処理を進める。

ステップＳ１０では、閾値補正部４６は、分析に用いる一対の閾値で本測定による粒子１４を計数するようドライブ制御部４４を制御する。具体的には、閾値補正部４６は、本測定用の測定開始位置から測定終了位置まで、光ピックアップ２５を分析用基板１０の半径方向に移動させたり、分析用基板１０を一定の速度で回転させたりするようドライブ制御部４４を制御する。

ドライブ制御部４４はディスクドライブ２０を制御し、本測定用に設定された測定開始位置から測定終了位置まで分析用基板１０を本測定し、パルス検出回路３０において粒子１４に起因するパルスを計数する。粒子１４の計数は、分析に用いる一対の閾値で計数することを除き、ステップＳ３と同様に、パルス検出回路３０で実施される。そして、閾値補正部４６は、ステップＳ１１へ処理を進める。

ステップＳ１１では、本測定での計数値が表示部４５に表示され、本測定が終了する。

上記実施形態では、一対の閾値のうちの一方の閾値を設定された変化分を単位として繰り返し変化させているが、一対の閾値のうちの両方の閾値を設定された変化分を単位として繰り返し変化させてもよい。例えば、ステップＳ２において、振幅下限電圧Ｖ_Ｌを０，振幅上限電圧Ｖ_Ｈを１とし、ステップＳ５でインクリメントしてＶ_ＬをＶ_Ｌｎ＋１＝Ｖ_Ｌｎ＋１，Ｖ_ＨをＶ_Ｌｎ＋１＋１＝Ｖ_Ｌｎ＋２とすることで、dCount(v_n)に相当する分布を直接求めてもよい。この場合、ステップＳ６における補正測定終了の条件は、Ｖ_Ｈの設定値がＶ_ｍａｘになった時などにしてもよい。

本実施形態では、振幅下限電圧Ｖ_Ｌ又は振幅上限電圧Ｖ_Ｈを変化させながら計数し、振幅下限電圧Ｖ_Ｌ及び振幅上限電圧Ｖ_Ｈを補正する方法を説明した。しかしながら、パルス波形を正規分布として考えれば、パルス振幅とパルス幅は比例する。そのため、振幅下限電圧Ｖ_Ｌをパルス幅下限時間Ｔ_Ｌに、振幅上限電圧Ｖ_Ｈをパルス幅上限時間Ｔ_Ｈに置き換えて、同様の測定をしても、同等の効果が得られる。

以上の通り、本実施形態に係る分析用閾値生成装置１００は、分析用基板１０に照射光２５ｂを照射し、照射光２５ｂによる分析用基板１０からの反射光を受光して受光レベル信号ＪＳを生成する光ピックアップ２５を備える。分析用基板１０には、検出対象物質１３と検出対象物質１３に結合する粒子１４とが表面に固定されている。分析用閾値生成装置１００は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスのパルス幅について一対の閾値、またはパルスのパルス振幅について一対の閾値を生成する閾値演算部４１を備える。分析用閾値生成装置１００は、パルス幅がパルス幅についての一対の閾値の範囲内に存在するかを判定するか、またはパルス振幅がパルス振幅についての一対の閾値の範囲内に存在するかを判定するパルス判定部３３を備える。分析用閾値生成装置１００は、パルス判定部３３が生成された一対の閾値の範囲内に存在すると判定したパルスを計数し、計数したパルスの計数値を出力するパルス計数部３４を備える。分析用閾値生成装置１００は、閾値演算部４１が生成した一対の閾値と、パルス計数部３４が出力した計数値と、に基づいて、分析に用いる一対の閾値を生成する閾値補正部４６を備える。閾値演算部４１は、パルス計数部３４がパルスを計数するごとに、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成する。

また、本実施形態に係る分析用閾値生成方法は、検出対象物質１３と検出対象物質１３に結合する粒子１４とが表面に固定された分析用基板１０に照射光２５ｂを照射する照射ステップを含む。分析用閾値生成方法は、照射光２５ｂによる分析用基板１０からの反射光を受光して受光レベル信号ＪＳを生成する信号生成ステップを含む。分析用閾値生成方法は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが、パルス幅について設定された一対の閾値、またはパルスがパルス振幅について設定された一対の閾値の範囲内に存在するかを判定する判定ステップを含む。分析用閾値生成方法は、判定ステップにおいて、設定された一対の閾値の範囲内に存在すると判定されたパルスを計数し、計数したパルスの計数値を出力する計数値出力ステップを含む。分析用閾値生成方法は、計数値出力ステップにおいてパルスを計数するごとに、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成する第一閾値生成ステップを含む。分析用閾値生成方法は、生成された各一対の閾値と計数値出力ステップで出力された計数値とに基づいて、分析に用いる一対の閾値を生成する第二閾値生成ステップを含む。

そのため、分析用閾値生成装置１００及び分析用閾値生成方法によれば、光ピックアップ２５から分析用基板１０への照射強度、並びに分析用基板１０及び粒子１４の反射特性が変動した場合であっても、判定パラメータを補正してパルスの検出を行うことができる。したがって、本実施形態に係る分析用閾値生成装置１００及び分析用閾値生成方法によれば、粒子を計数する際の条件によらず検出対象物質１３を計数することができる。

［第２実施形態］
次に、第２実施形態に係る分析用閾値生成装置１００及び分析用閾値生成方法について詳細に説明する。なお、第１実施形態と同一の構成には同一符号を付し、重複する説明は省略する。

図１０に示すように、本実施形態に係る分析用閾値生成装置１００では、パラメータ選択部４７をさらに備えている。

パラメータ選択部４７は、閾値補正部４６で生成された、分析に用いる一対の閾値を分析条件と関連付けて記憶する記憶部である。すなわち、閾値補正部４６は分析条件と関連付けて、分析に用いる一対の閾値を記憶部に記憶させている。また、分析に用いる一対の閾値は、補正された閾値とも言える。分析条件と関連づけて記憶された補正された一対の閾値は、例えばユーザが分析条件に応じて測定制御部４３などを介して選択することができる。パラメータ選択部４７は、測定制御部４３からの指示に基づいて、分析条件と対応した補正された一対の閾値をパラメータ設定部４２に出力し、パラメータ設定部４２を介してパラメータ記憶部３２に記憶させる。分析条件が同じ場合であれば、概ねヒストグラムの形状が同じであることを前提とすると、分析条件に応じてパルス関連パラメータを選択することにより、補正測定を本測定ごとに実施する必要がなくなる。

分析条件は、例えば、分析用基板１０及びディスクドライブ２０などに起因して変化する。分析用基板１０に起因する場合としては、例えば分析用基板１０の種類及び表面状態、分析用基板１０に粒子１４を固定する方法、粒子１４を固定するために用いた試薬、粒子１４の種類並びに粒子の製造ロットを変更した場合などが挙げられる。ディスクドライブ２０に起因する場合としては、例えばディスクドライブ２０の機種、ディスクドライブ２０の読み込み速度及びレーザーパワーの制御方法を変更した場合などが挙げられる。分析条件は、例えばディスクアッセイプロトコル１及びディスクアッセイプロトコル２などの名称で記憶されていてもよい。

次に、図１１に示すフローチャートを用いて本実施形態に係る分析用閾値生成方法における各工程を説明する。ステップＳ１～ステップＳ１１は、第１実施形態と同様であるため説明を省略する。

ステップＳ１２では、例えばユーザが、パラメータ選択部４７に記憶された補正された一対の閾値を選択するか否かを判定する。過去に同様の条件で補正測定されて補正された一対の閾値が記憶されている場合は、再度補正測定をせずに、例えばユーザなどがパラメータ選択部４７に記憶されている補正された一対の閾値を選択し（ＹＥＳ）、ステップＳ１０に処理を進める。一方、ユーザが新規の条件及び補正測定のやり直しを希望する場合などは、補正された一対の閾値を選択せず（ＮＯ）、ステップＳ２～ステップＳ８と同様の処理が実施され、ステップＳ１３に処理を進める。

ステップＳ１３では、ステップＳ２～ステップＳ８による補正測定で生成された補正された一対の閾値が、分析条件と関連づけてパラメータ選択部４７に記憶される。パラメータ選択部４７に補正された一対の閾値を記憶しておくことにより、同様の条件で測定する時に、記憶された補正された一対の閾値を選択するだけで、補正測定を実施しなくても、補正測定を実施したのと大凡同様の精度で、本測定を実施することができる。

そのため、本実施形態に係る分析用閾値生成装置１００及び分析用閾値生成方法によれば、分析条件が異なっていても、それぞれの分析条件に適した補正された一対の閾値を選択することができる。したがって、本実施形態に係る分析用閾値生成装置１００及び分析用閾値生成方法によれば、粒子を計数する際の条件によらず検出対象物質１３を計数することができる。

以上、実施例に沿って本実施形態の内容を説明したが、本実施形態はこれらの記載に限定されるものではなく、種々の変形及び改良が可能であることは、当業者には自明である。

１０ 分析用基板、
１３ 検出対象物質、
１４ 粒子、
２５ 光ピックアップ、
２５ｂ 照射光、
３３ パルス判定部、
３４ パルス計数部、
４１ 閾値演算部、
４６ 閾値補正部、
１００ 分析用閾値生成装置、
ＪＳ 受光レベル信号

Claims (5)

1. 検出対象物質と前記検出対象物質に結合する粒子とが表面に固定された分析用基板に照射光を照射し、前記照射光による前記分析用基板からの反射光を受光して受光レベル信号を生成する光ピックアップと、
   前記受光レベル信号に含まれるパルスのパルス幅について一対の閾値、または前記パルスのパルス振幅について一対の閾値を生成する閾値演算部と、
   前記パルス幅がパルス幅についての一対の閾値の範囲内に存在するかを判定するか、または前記パルス振幅がパルス振幅についての一対の閾値の範囲内に存在するかを判定するパルス判定部と、
   前記パルス判定部が前記生成された一対の閾値の範囲内に存在すると判定したパルスを計数し、前記計数したパルスの計数値を出力するパルス計数部と、
   前記閾値演算部が生成した一対の閾値と、前記パルス計数部が出力した計数値と、に基づいて、分析に用いる一対の閾値を生成する閾値補正部と、
   を備え、
   前記閾値演算部は、前記パルス計数部がパルスを計数するごとに、前記一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成し、
   前記閾値補正部は、前記生成された各一対の閾値を階級とし、前記パルス計数部が出力した前記計数値を度数とした度数分布に基づいて、前記分析に用いる一対の閾値を生成することを特徴とする分析用閾値生成装置。
2. 前記閾値補正部は、前記度数分布が最頻値をとる階級の値に基づいて、前記分析に用いる一対の閾値を生成する請求項１に記載の分析用閾値生成装置。
3. 前記度数分布はヒストグラムであり、前記閾値補正部は前記ヒストグラムの積分値に基づいて前記分析に用いる一対の閾値を生成する請求項１に記載の分析用閾値生成装置。
4. 前記閾値補正部は分析条件と関連付けて前記分析に用いる一対の閾値を記憶部に記憶させる請求項１～３のいずれか１項に記載の分析用閾値生成装置。
5. 検出対象物質と前記検出対象物質に結合する粒子とが表面に固定された分析用基板に照射光を照射する照射ステップと、
   前記照射光による前記分析用基板からの反射光を受光して受光レベル信号を生成する信号生成ステップと、
   前記受光レベル信号に含まれるパルスが、パルス幅について設定された一対の閾値、または前記パルスがパルス振幅について設定された一対の閾値の範囲内に存在するかを判定する判定ステップと、
   前記判定ステップにおいて、前記設定された一対の閾値の範囲内に存在すると判定されたパルスを計数し、前記計数したパルスの計数値を出力する計数値出力ステップと、
   前記計数値出力ステップにおいてパルスを計数するごとに、前記一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成する第一閾値生成ステップと、
   生成された各一対の閾値と前記計数値出力ステップで出力された計数値とに基づいて、分析に用いる一対の閾値を生成する第二閾値生成ステップと、
   を含み、
   前記第二閾値生成ステップにおいて、前記生成された各一対の閾値を階級とし、前記計数値出力ステップで出力された前記計数値を度数とした度数分布に基づいて、前記分析に用いる一対の閾値を生成する分析用閾値生成方法。

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