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JP7028802B2 - 短鎖型桿体由来錐体生存因子及び親水性ペプチド間の融合タンパク質 - Google Patents
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JP7028802B2 - 短鎖型桿体由来錐体生存因子及び親水性ペプチド間の融合タンパク質 - Google Patents

短鎖型桿体由来錐体生存因子及び親水性ペプチド間の融合タンパク質 Download PDF

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Description

配列表への参照
Ａｎｎｅｘ Ｃ／ＳＴ．２５テキストファイルの形態で電子的に提出された配列表と、付属ファイル参照番号ＷＯＣ－０１９ＰＣＴは、開示の一部である。
ＲｄＣＶＦは、網膜における桿体光受容器細胞によって特異的に発現されるチオレドキシン様タンパク質である（Leveillard et al. (2004) Nature Genetics 36:755～759及び補足情報）。２つの異なるＲｄＣＶＦ遺伝子がヒトで見出され、それらはＲｄＣＶＦ１及びＲｄＣＶＦ２と称される。両方のＲｄＣＶＦ遺伝子は、選択的スプライシングを介した２つの産物をコードしており、それぞれＲｄＣＶＦ－ｌｏｎｇ（ＲｄＣＶＦＬ）及びＲｄＣＶＦ－ｓｈｏｒｔ（ＲｄＣＶＦＳ）として知られる全長のタンパク質及びＣ末端転写後短縮タンパク質である。ヌクレオレドキシン（nucleoredoxin）様１遺伝子（Ｎｘｎｌ１）は、選択的スプライシング機構により、長鎖型と短鎖型ＲｄＣＶＦをコードする。Ｎｘｎｌ１ノックアウトは、マウスの桿体及び錐体の進行性喪失をもたらし、遺伝子レベルで、この遺伝子は、光受容器細胞が生存するためと、適切な網膜の生理機能を維持するために基本的に不可欠であることを示唆している。
ＲｄＣＶＦＳは、錐体生存を促進する分泌栄養因子として、そしてＲｄＣＶＦＬは、細胞内タンパク質と相互作用するレドックス活性酵素として記載されている（Leveillard et al. (2010) Sci Transl Med. 2(26):26ps16）。例えば、ｔａｕはＲｄＣＶＦ－Ｌに対する結合パートナーとして記載され、ｔａｕは専ら細胞内である（Fridlich et al. (2009) Molecular & Cellular Proteomics 8(6):1206～18）。
いくつかの網膜ジストロフィーに罹患した個体は、網膜ジストロフィーを有さない個体よりも低いレベルのＲｄＣＶＦタンパク質を眼に有することが見出された（ＰＣＴ公開国際公開第０２／０８１５１３号）。
異なる形態のＲｄＣＶＦタンパク質が錐体光受容器細胞の生存をインビトロ及びインビボで促進し得ることが実証されている。例えば、短鎖型ヒトＲｄＣＶＦ１（ＲｄＣＶＦ１Ｓ）タンパク質の眼内注射は、錐体細胞を変性から救済するだけでなく、遺伝性網膜変性の動物モデルにおいてそれらの機能を保持させた（Yang et al. (2009) Mol Therapy 17:787～795）。しかしながら、このタンパク質のインビボ錐体細胞保護効果の実証には、複数の眼内注射が必要であった。
網膜色素変性症（Retinitis pigmentosa；ＲＰ）は、進行性の桿体変性、その後の錐体の二次的な喪失を特徴とする網膜変性眼疾患である。ＲＰは、遺伝的失明の主要な原因であり、米国だけで約１０００００人の患者が発症し、年間約２０００人の新たな症例を有する。ＲＰは全ての民族に発症する。世界で１５０万人以上の人々がＲＰを発症している。残念なことに、患者にとって、ＲＰのための有効な療法又は承認された療法はない。したがって、ＲＰは依然として緊急の満たされていない医療上の必要性がある。
ＲＰは数年から数十年にわたる臨床経過を伴う慢性的な網膜変性疾患であるため、ＲｄＣＶＦを網膜に恒常的に発現させることによる遺伝子治療はＲＰ徴候に対して理想的である。網膜剥離などの急性の緊急な徴候では、タンパク質療法が有益であり得る。それは、組換えＲｄＣＶＦタンパク質を使用して、網膜が眼の後部、すなわち、網膜色素上皮及び脈絡膜層に再連結される前に、光受容器を死滅から保護することである。残念なことに、この分野の科学者は、ＲｄＣＶＦタンパク質、特に短鎖型ＲｄＣＶＦを効果的に発現及び分泌するためにかなりの困難に遭遇している。例えば、米国特許公開第２０１１００３４５４６号の段落［０００４］を参照されたい。
ＰＣＴ公開 国際公開第０２／０８１５１３号 米国特許公開第２０１１００３４５４６号
Leveillard et al. (2004) Nature Genetics 36:755～759 Leveillard et al. (2010) Sci Transl Med. 2(26):26ps16 Fridlich et al. (2009) Molecular & Cellular Proteomics 8(6):1206～18 Yang et al. (2009) Mol Therapy 17:787～795
本発明は、第１のＮ末端シグナルペプチド配列、シグナルペプチド配列のＣ末端にある第２のペプチド配列、及び第２のペプチド配列のＣ末端にある第３のペプチド配列を含む融合タンパク質であって、第２のペプチド配列及び第３のペプチド配列の一方がＲｄＣＶＦ－短鎖ペプチド配列であり、他方が親水性ペプチド配列である、融合タンパク質を提供する。翻訳後、シグナルペプチドは小胞体で切断され、シグナルペプチドを差し引いた第２のペプチド配列及び第３のペプチド配列を含む融合タンパク質が残る。したがって、本発明はまた、第２のペプチド配列及び第２のペプチド配列のＣ末端にある第３のペプチド配列を含む融合タンパク質であって、第２のペプチド配列及び第３のペプチド配列の一方がＲｄＣＶＦ－短鎖ペプチド配列であり、他方が親水性ペプチド配列である、融合タンパク質を提供する。本発明はまた、融合タンパク質をコードする核酸及び発現ベクター、核酸又は発現ベクターを含む細胞、並びに治療方法並びに融合タンパク質、核酸、及び発現ベクターの使用を提供する。本発明はまた、コードされた融合タンパク質の発現及び分泌を可能にする条件下で本発明の細胞を培養するステップ、並びに融合タンパク質を細胞培養物から単離するステップを含む、融合タンパク質を産生する方法を提供する。
図１Ａは、ヒト短鎖型桿体由来錐体生存因子のアミノ酸配列を示す図である。ヒト短鎖ＲｄＣＶＦのアミノ酸組成は高度に疎水性である。短鎖ＲｄＣＶＦでは３８．５％のアミノ酸が疎水性である。下線のアミノ酸は疎水性である。図１Ｂは、ヒト長鎖型桿体由来錐体生存因子のアミノ酸配列を示す図である。２５％のアミノ酸は、長鎖ＲｄＣＶＦのＣ末端で疎水性である（下線のアミノ酸は、長鎖型ＲｄＣＶＦのＣ末端で疎水性である）。 短鎖ＲｄＣＶＦと親水性ドメインとの融合タンパク質を示す図である。図２は、２つのヒト短鎖ＲｄＣＶＦ融合タンパク質の概略図を示す。ヒト短鎖ＲｄＣＶＦは、そのＮ末端又はＣ末端で親水性ドメインと融合する。融合タンパク質は、細胞からの分泌を促進するシグナルペプチドを有する。 ヒトアルブミンとヒト短鎖ＲｄＣＶＦとの間の新規な融合タンパク質の発現及び分泌を示す図である。図３は、ヒト短鎖ＲｄＣＶＦ及びヒトアルブミン融合タンパク質のウエスタンブロット分析を示す。レーン１：ＡＡＶ－ＧＦＰ、対照としてＧＦＰをコードするＡＡＶベクターで形質導入したヒト２９３細胞からの細胞培養液３０μＬ；レーン２：ＡＡＶ－ＡＬＢ－ＲｄＣＶＦＳ、短鎖ＲｄＣＶＦのＮ末端にヒトアルブミンと融合した短鎖型ヒトＲｄＣＶＦをコードするＡＡＶベクターで形質導入したヒト２９３細胞からの細胞培養液３０μＬ；レーン３：ＡＡＶ－ＲｄＣＶＦＳ－ＡＬＢ、短鎖ＲｄＣＶＦのＣ末端にヒトアルブミンと融合した短鎖型ヒトＲｄＣＶＦをコードするＡＡＶベクターで形質導入したヒト２９３細胞からの細胞培養液３０μＬ。左の数字はＫＤａでの分子量マーカーを示す。
配列表の簡単な説明
配列番号１：融合タンパク質のＮ末端でヒトアルブミンを有する、ヒトアルブミンと短鎖ＲｄＣＶＦとの融合タンパク質のアミノ酸配列（ＡＬＢ－ＲｄＣＶＦＳ）。
配列番号２：Ｎ末端にヒトアルブミンを融合したヒト短鎖ＲｄＣＶＦをコードするヌクレオチド配列（ＡＬＢ－ＲｄＣＶＦＳ）。
配列番号３：融合タンパク質のＣ末端でヒトアルブミンを有する、ヒトアルブミンと短鎖ＲｄＣＶＦとの融合タンパク質のアミノ酸配列（ＲｄＣＶＦＳ－ＡＬＢ）。ＲｄＣＶＦＳとヒトアルブミンとの間には４つのアミノ酸スペーサーが存在する。Ｎ末端からの最初の２１アミノ酸は、マウスＩｇｋ由来のシグナル配列である。シグナル配列とＲｄＣＶＦＳとの間に１４アミノ酸スペーサー（リンカー）が存在する。
配列番号４：Ｃ末端でヒトアルブミンと融合したヒト短鎖ＲｄＣＶＦをコードするヌクレオチド配列（ＲｄＣＶＦＳ－ＡＬＢ）。
配列番号５：ヒト短鎖型桿体由来錐体生存因子のアミノ酸配列。
配列番号６：ヒト長鎖型桿体由来錐体生存因子のアミノ酸配列。
発明の詳細な説明
理論に縛られることを望むものではないが、短鎖型ＲｄＣＶＦを発現及び分泌することの困難性は、その高い疎水性アミノ酸組成に起因する可能性がある。短鎖型及び長鎖型ヒトＲｄＣＶＦタンパク質の両方のアミノ酸組成を慎重に分析することにより、短鎖型ＲｄＣＶＦタンパク質が極めて疎水性であることが明らかになった（図１Ａ及び１Ｂ）。短鎖ＲｄＣＶＦの１０９のうちの４２アミノ酸（３８．５％）は、疎水性アミノ酸である。１ストレッチの６つの疎水性アミノ酸、１ストレッチの４つの疎水性アミノ酸、及び２ストレッチの３つの疎水性アミノ酸がそれぞれ存在する。疎水性アミノ酸組成が高い割合であると、疎水性－疎水性相互作用を介して脂質膜に付着する可能性がより高いので、短鎖ＲｄＣＶＦを哺乳動物細胞からインビトロ及びインビボで効率的に発現及び分泌することを非常に困難にする可能性が高い。興味深いことに、長鎖型ＲｄＣＶＦのＮ末端１０９アミノ酸は短鎖ＲｄＣＶＦ全体と同一であるが、長鎖ＲｄＣＶＦのＣ末端の１０３アミノ酸は疎水性ではなく、わずか２５％のアミノ酸が疎水性であるのみである（１０３のうち２６）。長鎖ＲｄＣＶＦのこのＣ末端における最も長い疎水性アミノ酸のストレッチの長さはわずか４アミノ酸である。３つの疎水性アミノ酸のストレッチはない。長鎖ＲｄＣＶＦのＣ末端における比較的親水性の性質は、長鎖ＲｄＣＶＦの全体的な疎水性を低下させるのに重要な役割を果たし得る。
本発明の融合タンパク質の一実施形態では、第２のペプチド配列はＲｄＣＶＦ－短鎖ペプチド配列であり、第３のペプチド配列は親水性ペプチド配列である。別の実施形態では、第２のペプチド配列は親水性ペプチド配列であり、第３のペプチド配列はＲｄＣＶＦ－短鎖ペプチド配列である。
この融合タンパク質を発現する細胞から融合タンパク質の分泌を促進するＮ末端シグナルペプチド配列が存在するはずである。哺乳動物細胞からのタンパク質の分泌を可能にする任意のシグナルペプチドが利用できる。さらなる実施形態では、シグナルペプチド配列は、Ｉｇｋシグナルペプチド配列及びアルブミンシグナルペプチド配列からなる群から選択される。より特定の実施形態では、ＩｇＫシグナルペプチド配列はマウスＩｇＫシグナルペプチド配列であり、アルブミンシグナルペプチド配列はヒトアルブミンシグナルペプチド配列である。
本発明の好ましい実施形態では、ＲｄＣＶＦ－短鎖ペプチド配列は、ヒトＲｄＣＶＦ－短鎖ペプチド配列である。適切なＲｄＣＶＦ－短鎖ペプチド配列の例には、ＲｄＣＶＦ１－短鎖ペプチド配列、ＲｄＣＶＦ２－短鎖ペプチド配列、及び例えば１又は２以上の保存的アミノ酸置換によって対応する野生型配列と異なるＲｄＣＶＦ－短鎖ペプチド配列が含まれる。
本発明によれば、親水性ペプチド配列を有さないＲｄＣＶＦ－短鎖ペプチド配列と比較して、融合タンパク質の疎水性指数を低下させるならば、任意の親水性ペプチド配列を利用することができる。本発明の一実施形態では、任意のシグナルペプチド配列を含む融合タンパク質は、存在する場合、マイナス０．２０より低い、より好ましくはマイナス０．３０より低い疎水性指数を有する。
好ましくは、親水性ペプチド配列は、ヒトにおいて免疫原性ではなく、ヒト網膜生理に又は正常な網膜機能に他の負の効果を示さず、短鎖ＲｄＣＶＦの生物学的機能に影響しない。親水性ペプチド配列は、親水性タンパク質、親水性タンパク質ドメイン、親水性オリゴペプチド、又は親水性ポリペプチドであり得る。１つ以上の親水性ドメインが、短鎖ＲｄＣＶＦを有する親水性融合パートナーとしての候補であり得る。本発明の一実施形態では、親水性ペプチド配列はアルブミン、例えばヒトアルブミンである。
本発明の融合タンパク質によれば、場合により、第１のペプチド配列と第２のペプチド配列との間、第２のペプチド配列と第３のペプチド配列との間、又はその両方に１又は２以上のアミノ酸のスペーサーが存在し得る。本発明の一実施形態では、第１のペプチド配列と第２のペプチド配列との間にスペーサーはなく、言い換えると、第１のペプチド配列は、単一のペプチド結合によって第２のペプチド配列に共有結合する。別の実施形態では、第１のペプチド配列と第２のペプチド配列との間にスペーサーが存在する。本発明の別の実施形態では、第２のペプチド配列と第３のペプチド配列との間にスペーサーはなく、言い換えると、第２のペプチド配列は、単一のペプチド結合によって第３のペプチド配列に共有結合する。別の実施形態では、第２のペプチド配列と第３のペプチド配列との間にスペーサーが存在する。原則的にスペーサーのサイズには制限はない。本発明の一実施形態では、第１及び第２のペプチド配列間のスペーサーは、２～１４個のアミノ酸を有する。別の実施形態では、第２及び第３のペプチド配列間のスペーサーは、２～１４個のアミノ酸、より具体的には２～４個のアミノ酸を有する。
本発明の融合タンパク質コード配列の一実施形態は、第３のペプチド配列コード配列のＣ末端にポリアデニル化シグナルがさらに含まれる。ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）は、任意のポリＡであり得る。
本発明の融合タンパク質の一実施形態では、第１のペプチド配列はヒトアルブミンシグナル配列であり、第２のペプチド配列はヒトアルブミンであり、第３のペプチド配列はＲｄＣＶＦ－短鎖配列である。より特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列（配列番号１）又は（配列番号１）のアミノ酸２５～７１７を有する。本発明の融合タンパク質の別の実施形態では、第１のペプチド配列はＩｇｋシグナル配列であり、第２のペプチド配列はＲｄＣＶＦ－短鎖配列であり、第３のペプチド配列はヒトアルブミンである。より特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列（配列番号３）又は（配列番号３）のアミノ酸２２～７３２を有する。
本発明の融合タンパク質の一実施形態では、シグナルペプチド配列、ＲｄＣＶＦ－短鎖ペプチド配列、及び親水性ペプチド配列の１つ、２つ、又は全てが、対応する野生型配列と異なる。より特定の実施形態では、その相違は、１又は２以上の保存的アミノ酸置換を含む。さらにより特定の実施形態では、アミノ酸置換は、１又は２以上の保存的アミノ酸置換に限定される。
本発明による融合タンパク質は、グリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい。一般に、グリコシル化は、タンパク質の安定性及び溶解性にとって有益である。一実施形態では、本発明による発現ベクターによって形質導入された細胞内で発現される融合タンパク質は、グリコシル化され、細胞から分泌された後にグリコシル化される。
一実施形態では、本発明の核酸はＤＮＡである。別の実施形態では、シグナルペプチド配列、ＲｄＣＶＦ－短鎖ペプチド配列及び親水性ペプチド配列の１、２又は全てのコード配列は、対応する野生型配列と比較して再コードされている。より特定の実施形態では、ＲｄＣＶＦ－短鎖ペプチド配列のコード配列が再コードされている。本発明の核酸は、第１及び第２のペプチド配列の間、第２及び第３のペプチド配列の間、又は他の場所のいずれかに、１又は２以上のイントロンを任意に含むことができる。本発明の一実施形態では、核酸は、配列（配列番号１）を有する融合タンパク質、例えば配列（配列番号２）を有する核酸をコードする。別の実施形態では、核酸は、配列（配列番号３）を有する融合タンパク質、例えば配列（配列番号４）を有する核酸をコードする。他の核酸配列は、遺伝暗号の縮重を考慮して容易に想定することができる。
本発明の一実施形態は、制御配列、例えばプロモーターに作動可能に連結された上に記載の核酸を含む発現ベクターである。ＲｄＣＶＦＳ融合タンパク質を駆動するプロモーターは、任意のプロモーターであってよく、ＣＭＶプロモーターに限定されない。プロモーターと融合タンパク質コード配列との間にイントロンが存在する場合、任意の適切でありかつ従来のイントロンを利用することができる。例えば、β－グロビンイントロンが適切である。
実験では、ヒトの短鎖ＲｄＣＶＦを親水性ドメインと融合させることによって、２つの融合タンパク質を作製した（概略図については図２を参照）。１つは、融合タンパク質のＮ末端にアルブミンシグナルペプチド（配列番号１）を有する、Ｎ末端でヒトアルブミンと融合したヒト短鎖ＲｄＣＶＦであった。この融合タンパク質を発現及び分泌する発現構築物は、ＡＡＶベクターとの関連で改変され、ｒＡＡＶ－ＡＬＢ－ＲｄＣＶＦＳと命名された。このベクターは、Ｎ末端でヒトアルブミンと融合しているコドン最適化された（再コードされた）ヒト短鎖ＲｄＣＶＦをコードした（配列番号２）。この融合タンパク質をＡＬＢ－ＲｄＣＶＦＳと名付けた。ヒトアルブミンシグナルペプチドのコード配列もまた、融合タンパク質コード配列の上流の融合タンパク質発現構築物に組み込まれた。発現構築物はさらに、ＣＭＶプロモーター及び融合タンパク質コード配列に連結されたイントロンを含んでいた。発現構築物は、融合タンパク質コード配列のＣ末端にポリアデニル化シグナルをさらに含んでいた。発現カセット全体をＡＡＶ発現プラスミドにクローニングし、プラスミドをＤＮＡ配列決定に供して発現構築物の整合性を確認した。
他の例示された融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端にマウスＩｇｋシグナルペプチドを有するＣ末端でヒトアルブミンと融合したヒト短鎖ＲｄＣＶＦであった（配列番号３）。この融合タンパク質を発現及び分泌する発現構築物は、ＡＡＶベクターとの関連で改変され、ｒＡＡＶ－ＲｄＣＶＦＳ－ＡＬＢと命名された。このベクターは、Ｃ末端でヒトアルブミンと融合しているコドン最適化された（再コードされた）ヒト短鎖ＲｄＣＶＦをコードした（配列番号４）。この融合タンパク質をＲｄＣＶＦＳ－ＡＬＢと名付けた。改変されたマウスＩｇｋシグナルペプチドのコード配列もまた、融合タンパク質コード配列の上流の融合タンパク質発現構築物に組み込まれた。発現構築物はさらに、ＣＭＶプロモーター及び融合タンパク質コード配列に連結されたイントロンを含んでいた。発現構築物は、融合タンパク質コード配列のＣ末端にポリアデニル化シグナルをさらに含んでいた。発現カセット全体をＡＡＶ発現プラスミドにクローニングし、プラスミドをＤＮＡ配列決定に供して発現構築物の整合性を確認した。
合計２０個の天然アミノ酸が存在する。それらのいくつかは疎水性であり、そのうちのいくつかは親水性である。アミノ酸の疎水性指数は、その側鎖の疎水性又は親水性を表す数である。数が大きければ大きいほど、アミノ酸はより疎水性である（表１）。最も疎水性のアミノ酸は、イソロイシン（４．５）及びバリン（４．２）である。最も親水性のものは、アルギニン（－４．５）及びリジン（－３．９）である。タンパク質の疎水性又は親水性の性質は、それがどのようなアミノ酸から成り立っているか、並びにどのような二次、三次及び四次構造から成り立っているかに依存しているが、タンパク質の疎水性指数はタンパク質の疎水性の予測値となり得る。
表１ アミノ酸の疎水性値
Ala: 1.800
Arg: -4.500
Asn: -3.500
Asp: -3.500
Cys: 2.500
Gln: -3.500
Glu: -3.500
Gly: -0.400
His: -3.200
Ile: 4.500
Leu: 3.800
Lys: -3.900
Met: 1.900
Phe: 2.800
Pro: -1.600
Ser: -0.800
Thr: -0.700
Trp: -0.900
Tyr: -1.300
Val: 4.200
公的に入手可能なＧＰＭＡＷプログラムを用いて、短鎖ＲｄＣＶＦ、及び２つの短鎖ＲｄＣＶＦ及びアルブミン融合タンパク質の疎水性指数を計算した。天然の短鎖型ヒトＲｄＣＶＦ（ＲｄＣＶＦＳ）の疎水性指数は－０．１２である。ヒトアルブミンをＲｄＣＶＦＳのＮ末端に融合させた後、得られた融合タンパク質であるＡＬＢ－ＲｄＣＶＦＳの疎水性指数は－０．１２から－０．３２（シグナルペプチドを含む）に減少し、疎水性指数は２６６．７％低下した。ヒトアルブミンをＲｄＣＶＦＳのＣ末端に融合させた後、得られた融合タンパク質であるＲｄＣＶＦＳ－ＡＬＢは、疎水性指数が－０．１２から－０．３３（シグナルペプチドを含む）から減少し、疎水性指数が２７５％低下した。疎水性指数の劇的な低下は、融合タンパク質の効率的な発現及び分泌に寄与し得る。
さらに、融合タンパク質コード配列をＡＡＶ－２発現構築物にクローニングしたところ、この新規な融合タンパク質が効率的に発現することがＲｄＣＶＦ特異的抗体を用いたウエスタンブロットによって明らかに示された（図３）。短鎖ＲｄＣＶＦの融合パートナーは、ヒトアルブミンに限定されない。任意の親水性タンパク質又は親水性タンパク質ドメイン又は親水性ペプチドを用いて、短鎖ＲｄＣＶＦを有する融合タンパク質を作製し、タンパク質の疎水性を低下させることができる。好ましい親水性ドメインはヒトに対して非免疫原性である。
本タンパク質は、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ベクター、レンチウイルスベクター、合成ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡ、ナノ粒子などのような遺伝子治療ベクターによってコードされ、送達され得る。或いは、融合タンパク質は、組換えタンパク質として網膜に送達される。親水性融合ドメインは、ヒト網膜生理学又は正常な網膜機能にいかなる悪影響を与えるべきではなく、短鎖ＲｄＣＶＦの生物学的機能に影響を及ぼすべきではない。潜在的に、２つ以上の親水性ドメインが、短鎖ＲｄＣＶＦとの親水性融合パートナーとしての候補であり得る。実施例では、ヒトアルブミンを親水性ドメインとして使用して、ヒト短鎖ＲｄＣＶＦの融合パートナーとして機能させた。
本発明は、（ｉ）本発明の融合タンパク質、核酸、発現ベクター又は細胞からなる群から選択される成分；（ii）薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。
本発明は、哺乳動物患者におけるそのような治療に適している状態を治療する方法を提供し、その治療は、有効量の本明細書に記載のタンパク質、核酸、ベクター、細胞、又は医薬組成物を患者に投与し、それにより患者の状態を治療するステップを含む。本発明の実施形態では、状態は、網膜ジストロフィー、シュタルガルト病（Stargardt's disease）、色素性網膜炎、萎縮型加齢性黄斑変性症（dry age-related macular degeneration；萎縮型ＡＭＤ（dry AMD））、地図状萎縮（萎縮型ＡＭＤの進行期）、滲出型加齢性黄斑変性症（wet age-related macular degeneration；滲出型ＡＭＤ（wet AMD））、高眼圧を伴う又は伴わない緑内障、糖尿病性網膜症、バルデ・ビードル（Bardet-Biedel）症候群、バッセン・コーンツヴァイク（Bassen-Kornzweig）症候群、ベスト病（Best disease）、コロイデマ（choroidema）、脳回転状萎縮症、先天性黒内障、レフサン（refsun）症候群、アッシャー（Usher）症候群、甲状腺関連眼疾患、グレーブ病（Grave's disease）、網膜色素上皮細胞に関連する疾患、前眼部疾患、水晶体疾患／白内障、眼杯障害、ブドウ膜炎、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病及び嗅覚疾患からなる群から選択される。任意の従来の投与経路、例えば、眼への注射、静脈内注射、又は他の全身投与を利用することができる。本発明の方法の一実施形態では、状態は眼の状態であり、投与は網膜下注射及び硝子体内注射からなる群から選択される。より特定の実施形態では、患者はヒト患者である。
本発明は、患者における眼の光受容器細胞を保護する方法であって、有効量の本発明の融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞、又は医薬組成物を患者の眼に投与し、それによって患者における眼の光受容器細胞を保護するステップを含む、方法を提供する。より特定の実施形態では、投与は、網膜下注射及び硝子体内注射からなる群から選択される。より特定の実施形態では、患者はヒト患者である。
本発明を以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は例示のみを目的として提供されるもので、本発明は決してこれらの実施例に限定されるべきではなく、むしろ本明細書で提供される教示の結果として明らかになる任意の及び全ての変形を包含すると解釈されるべきである。
本発明の特定の実施形態を説明のために本明細書に記載してきたが、添付の特許請求の範囲に説明される本発明から逸脱することなく、詳細について多数の変形が可能であることが当業者には理解されよう。
個々の刊行物、特許又は特許出願が、具体的かつ個別に参照により本明細書に組み込まれると示されているのと同程度に、本明細書に記載されている全ての刊行物、特許及び特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、前述の刊行物、特許及び特許出願のいずれかとともに出版された任意の補足的な情報もまた、参照により組み込まれる。例えば、いくつかの雑誌記事は、一般にオンラインで入手可能な補足情報と共に公開されている。
［実施例］
ヒト短鎖型桿体由来錐体生存因子及びアルブミン融合タンパク質をコードするｒＡＡＶベクターの作製
プラスミドクローニング
Ｎ末端でヒトアルブミンと融合しているコドン最適化されたヒト短鎖型ＲｄＣＶＦタンパク質のｃＤＮＡを、GENEART（登録商標）（フィー・フォー・サービスの会社）によって合成し、アデノ随伴ウイルスベクタープラスミドpAAV-MCS（Cell Biolabs社製、San Diego、CA）にクローニングし、プラスミドpAAV-ALB-RdCVFSを作製した。ヒトアルブミン由来のシグナルペプチドもまた、ＲｄＣＶＦ及びアルブミン融合タンパク質コード配列の上流に組み込まれた。
pAAV-ALB-RdCVFSプラスミドは、ＡＡＶ－ＩＴＲ間に以下の特徴を含む：
CMVプロモーター-β-グロビンイントロン-シグナル配列-アルブミン-短鎖RdCVF-ポリＡ
このＲｄＣＶＦ及びアルブミン融合タンパク質について得られたアミノ酸配列を配列番号１に示す。
Ｃ末端でヒトアルブミンとしているコドン最適化されたヒト短鎖型ＲｄＣＶＦタンパク質のｃＤＮＡを、GENEART（登録商標）（フィー・フォー・サービスの会社）によって合成し、アデノ随伴ウイルスベクタープラスミドpAAV-MCS（Cell Biolabs社製、San Diego、CA）にクローニングし、プラスミドpAAV-RdCVFS-ALBを作製した。マウスＩｇｋ由来のこのシグナルペプチドもまた、ＲｄＣＶＦ及びアルブミン融合タンパク質コード配列の上流に組み込まれた。
pAAV-RdCVFS-ALBプラスミドは、ＡＡＶ－ＩＴＲ間に以下の特徴を含む：
CMVプロモーター-β-グロビンイントロン-シグナル配列-短鎖RdCVF-アルブミン-ポリＡ
このＲｄＣＶＦ及びアルブミン融合タンパク質について得られたアミノ酸配列を配列番号３に示す。
組換えＡＡＶ－ＡＬＢ－ＲｄＣＶＦＳ及びＡＡＶ－ＲｄＣＶＦＳ－ＡＬＢベクターの産生及び精製
プラスミドpAAV-ALB-RdCVFS又はpAAV-RdCVFS-ALB、pHELPER（Cell BioLabs社製、カタログ番号340202）及びpRC2（Cell BioLabs社製、カタログ番号340201）をDH10Bコンピテントバクテリア細胞（Invitrogen社製、カタログ番号18297-010）に形質転換し、Qiagen EndoFree Plasmid Maxi Kit又はEndoFree Plasmid Mega Kitを製造者の指示に従って使用してスケールアップした。Beckman DU-600分光光度計を用いてプラスミド濃度を測定した。各々のプラスミドの同一性は、制限酵素切断及びＤＮＡ配列決定分析によって確認した。
ｒＡＡＶ－ＡＬＢ－ＲｄＣＶＦＳ又はｒＡＡＶ－ＲｄＣＶＦＳ－ＡＬＢベクターを産生するために、cDMEM（１０％ＦＢＳ、１％グルタミン、１％非必須アミノ酸、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したDMEM）中で１５ｃｍディッシュあたり細胞４００万個で２９３ＡＡＶ細胞（Cell BioLabs社製、カタログ番号AAV-100）を播種した。翌日、培養液を２５ｍＬの新鮮なcDMEMと交換した。２時間後、トランスフェクションを行った。水（５７．４ｍＬ）を１．３ｍｇのpHELPER、６５０μｇのpRC2、６５０μｇのpAAV-ALB-RdCVFS又はpAAV-RdCVFS-ALB及び８．１ｍＬの２Ｍ ＣａＣｌ２（水／プラスミド／ＣａＣｌ２混合物）と混合した。１２．５ｍＬ容量の2xHBS（Lonza社製、Sku:RR07005）を５本の５０ｍＬコニカルチューブの各々に移した。ボルテックスしながら、１２．５ｍＬの水／プラスミド／ＣａＣｌ２混合物を、2xHBSを含むコニカルチューブのそれぞれにゆっくりと加えた。５分間のインキュベーションの後、２．５ｍＬの懸濁液を、２９３ＡＡＶ細胞を含む細胞培養皿の各々に加えた。
翌日、ディッシュあたり２５ｍＬの新しいcDMEM培養液で培養液を交換した。２日後、細胞リフター（cell lifter）を用いて細胞を採取し、細胞／培養液混合物を２５０ｍＬコニカルチューブに移した。試料を３０００ｒｐｍで４℃、１５分間遠心分離し、上清を捨て、細胞ペレットを１１０ｍＬのDMEMに再懸濁させた。再懸濁した細胞試料を５０ｍＬコニカルチューブに分注し（３０ｍＬ）、エタノール／ドライアイスバス及び３７℃水浴を用いて凍結／解凍／凍結ステップを行った。材料をさらに処理するまで、チューブを－８０℃で保存した。同様のプロセスを用いてプラスミドpAAV-ALB-RdCVFSをプラスミドpAAV-GFP（Cell BioLabs社製、カタログ番号AAV-400）で置換したｒＡＡＶ－ＧＦＰ参照ベクターを産生した。
ｒＡＡＶ－ＡＬＢ－ＲｄＣＶＦＳベクターを精製するために、凍結／解凍／凍結ステップからのベクターを含む４つの５０ｍＬコニカルチューブを水浴中、３７℃で解凍した。４０μｌのBENZONASE（登録商標）（ヌクレアーゼ）（Sigma社製、カタログ番号E8263-25kU）を各チューブに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。チューブを３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を５００ｍＬビンに移した。６ミリリットルの１０％デオキシコール酸ナトリウム溶液（８２ｍＬの水中に８．２ｇ）を添加した。試料を短時間混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。５μｍフィルターを用いて懸濁液を濾過した。その後、０．８μｍフィルターを用いた別の濾過ステップを行った。ヘパリンアガロースカラム（８ｍＬ）（Sigma社製、カタログ番号H6508-25mL）を準備し、カラムを４８ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Invitrogen社製、カタログ番号10010-049）で平衡化した。フィルターした細胞溶解物をカラムに負荷し、カラムを４０ｍＬの洗浄緩衝液（２０ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ、９８０ｍＬのＰＢＳ）で洗浄した。１５ｍＬの溶出緩衝液（８０ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ、９２０ｍＬのＰＢＳ）を用いてベクターを溶出し、新しい５０ｍＬコニカルチューブに集めた。
遠心フィルターによりベクターを濃縮した。AMICON ULTRA-15遠心分離フィルターユニット（Millipore社製、カタログ番号UFC910024）をPBSで１回すすいで、溶出した試料を装置に加えた。Beckman Allegro 6KR遠心分離機で２２００ｒｐｍ、２２℃で、試料が１～２ｍＬの容量に濃縮されるまで遠心分離を行った。１５ｍＬ容量のPBSを添加し、試料容量が≦１ｍＬになるまで遠心分離を繰り返した。精製したベクターを回収し、フィルター壁を１００μＬのPBSですすいだ。試料を混合し、ベクターの３０μＬのアリコートを、使用するまで６００μＬのコニカルチューブ中に－８０℃で保存した。
このプロセスを繰り返して、ｒＡＡＶ－ＲｄＣＶＦＳ－ＡＬＢ及びｒＡＡＶ－ＧＦＰベクターを精製した。
ｒＡＡＶベクターによって媒介されるヒト短鎖ＲｄＣＶＦ及びヒトアルブミン融合タンパク質の発現及び分泌
４～２０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを用いたウエスタンブロット分析を用いて、標準技術を用いてＲｄＣＶＦ及びアルブミン融合タンパク質発現を検出した。対照として、５μＬ容量のMAGICMARK（商標）XPウエスタンタンパク質標準（Invitrogen社製、カタログ番号LC5602）を外側のウェルに添加した。タンパク質試料緩衝液と混合したｒＡＡＶベクター形質導入ヒト２９３細胞の各々からの細胞培養液３０μＬを各ウェルに添加した。染料がゲルの底に達するまでゲルを２００Ｖで流した。ウエスタンブロット分析は、Vector Laboratories社のVECTASTAIN（登録商標）ABC-Ampウエスタンブロット分析キットを用いて、製造会社の修正版の使用説明書に従って行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥをトランスファーバッファーで２０分間平衡化し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離したタンパク質をTrans Blot Semi-Dry Transfer Cellを用いて２０Ｖで４０分間、ニトロセルロース膜に転写した。転写が完了した後、室温（ＲＴ）で少なくとも２時間、又は４℃で終夜、ロッカープラットフォーム上で穏やかに撹拌しながら、２００ｍＬの１ｘカゼイン溶液中で膜をブロックした。４℃で終夜又は室温で１時間穏やかに撹拌しながら、１：２０００に希釈したウサギ抗ＲｄＣＶＦタンパク質特異的抗体（一次抗体、Covance社（Denver、PA）によって生成された）を含む５０ｍＬの１ｘカゼイン溶液とともに、膜をインキュベートした。３０ｍＬの１ｘカゼイン溶液で４回、穏やかに撹拌しながら室温で各々５分間、膜を洗浄した。膜を、１：１００００に希釈した３０ｍＬのビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（二次抗体）とともに、１ｘカゼイン溶液中で穏やかに撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。３０ｍＬの１ｘカゼイン溶液中で３回、穏やかに撹拌しながら室温で各々５分間、膜を洗浄した。１００μＬの試薬Ａ及び１００μＬの試薬Ｂを含む５０ｍＬの１ｘカゼイン中のVectastain ABC-AmPで４５分間、膜をインキュベートした。３０ｍＬの１ｘカゼイン溶液中で３回、室温で緩やかに撹拌しながら各々５分間、膜を洗浄した。
膜をTris、ｐＨ９．５中でインキュベートした。６ｍＬのDUOLOX Substrate（Vector Laboratories社製、カタログ番号SK 6605）を用いて化学発光シグナルを取得し、フィルムカセット中、１０秒から５分、KODAK BIOMAX MS Ｘ線フィルム（Kodak Carestream Health社製、カタログ番号8572786）に膜を曝露した後、KODAK Developer溶液（Kodak GBX社製、カタログ番号1900984）及びKODAK Fixer溶液を用いてフィルムを現像した。
図３に示すように、ｒＡＡＶ－ＡＬＢ－ＲｄＣＶＦＳ及びｒＡＡＶ－ＲｄＣＶＦＳ－ＡＬＢの両方の形質導入ヒト２９３細胞からの細胞培養液は、ウサギ抗ＲｄＣＶＦ抗体と特異的に反応する分子量およそ８０ＫＤａのバンドを含んでいた。このバンドは、ｒＡＡＶ－ＧＦＰ対照ベクター形質導入細胞からの細胞培養液では検出されなかった。このデータは、ｒＡＡＶ－ＡＬＢ－ＲｄＣＶＦＳ及びｒＡＡＶ－ＲｄＣＶＦＳ－ＡＬＢベクターの両方が、ヒト短鎖ＲｄＣＶＦ及びアルブミン融合タンパク質の発現及び分泌をヒト細胞において媒介することを示唆している。
ｒＡＡＶ－ＡＬＢ－ＲｄＣＶＦＳ又はｒＡＡＶ－ＲｄＣＶＦＳ－ＡＬＢベクターは、上に列挙した疾患を治療するための眼内投与に使用することができる。特には、網膜下注射又は硝子体内注射によってベクターを送達することができる。
要約
Ｎ末端でヒトアルブミン融合タンパク質コード配列と融合しているコドン最適化された（再コードされた）ヒト短鎖ＲｄＣＶＦをコードする組換えＡＡＶベクターは、ヒト細胞内での融合タンパク質の発現及びヒト細胞からの分泌を媒介することができた。Ｃ末端でヒトアルブミン融合タンパク質と融合しているコドン最適化されたヒト短鎖ＲｄＣＶＦをコードする組換えＡＡＶベクターは、ヒト細胞内での融合タンパク質の発現及びヒト細胞からの分泌を媒介することができた。

Claims (20)

  1. （ａ）第１のＮ末端シグナルペプチド配列、前記シグナルペプチド配列のＣ末端にある第２のペプチド配列、及び前記第２のペプチド配列のＣ末端にある第３のペプチド配列；又は（ｂ）第２のペプチド配列及び前記第２のペプチド配列のＣ末端にある第３のペプチド配列；を含む融合タンパク質であって、
    前記第１のペプチド配列が、Ｉｇｋシグナル配列であり、前記第２のペプチド配列がＲｄＣＶＦ－短鎖ペプチド配列であり、前記第３のペプチド配列がヒトアルブミンであり；かつ
    配列（配列番号３）又は（配列番号３）のアミノ酸２２～７３２を有する、前記融合タンパク質。
  2. 請求項１に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
  3. ＤＮＡである、請求項２に記載の核酸。
  4. 配列（配列番号３）を有する融合タンパク質をコードする、請求項２に記載の核酸。
  5. 配列（配列番号４）を有する、請求項４に記載の核酸。
  6. 制御配列に作動可能に連結された、請求項２～５のいずれかに記載の核酸を含む発現ベクター。
  7. 制御配列がプロモーターである、請求項６に記載の発現ベクター。
  8. プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項７に記載の発現ベクター。
  9. ベクターがプラスミドである、請求項６に記載の発現ベクター。
  10. ベクターがＡＡＶ発現プラスミドである、請求項９に記載の発現ベクター。
  11. ベクターがウイルスベクターである、請求項６に記載の発現ベクター。
  12. ウイルスベクターが、ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及び合成ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１１に記載の発現ベクター。
  13. 請求項２～５のいずれかに記載の核酸又は請求項６～１２のいずれかに記載の発現ベクターを含む細胞。
  14. （ｉ）請求項１に記載の融合タンパク質、請求項２～５のいずれかに記載の核酸、請求項６～１２のいずれかに記載の発現ベクター、及び、請求項１３に記載の細胞からなる群から選択される成分；及び（ii）薬学的に許容される担体；を含む医薬組成物。
  15. 哺乳動物患者における状態の治療剤であって、請求項１に記載の融合タンパク質、請求項２～５のいずれかに記載の核酸、請求項６～１２のいずれかに記載の発現ベクター、請求項１３に記載の細胞、又は請求項１４に記載の医薬組成物を含み、投与され、それにより前記患者における前記状態が治療され、
    前記状態が、網膜ジストロフィー、シュタルガルト病、色素性網膜炎、萎縮型加齢性黄斑変性症（萎縮型ＡＭＤ）、地図状萎縮（萎縮型ＡＭＤの進行期）、滲出型加齢性黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）、高眼圧を伴う又は伴わない緑内障、糖尿病性網膜症、バルデ・ビードル症候群、バッセン・コーンツヴァイク症候群、ベスト病、コロイデマ、脳回転状萎縮症、先天性黒内障、レフサン症候群、アッシャー症候群、甲状腺関連眼疾患、グレーブ病、網膜色素上皮細胞に関連する疾患、前眼部疾患、水晶体疾患／白内障、眼杯障害、ブドウ膜炎、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、及び嗅覚疾患からなる群から選択される、前記治療剤。
  16. 状態が眼の状態であり、投与が網膜下注射及び硝子体内注射からなる群から選択される、請求項１５に記載の剤。
  17. 患者における眼の光受容器細胞の保護剤であって、請求項１に記載の融合タンパク質、請求項２～５のいずれかに記載の核酸、請求項６～１２のいずれかに記載の発現ベクター、請求項１３に記載の細胞、又は請求項１４に記載の医薬組成物を含み、投与され、それにより前記患者における前記眼の光受容器細胞を保護する、前記保護剤。
  18. 投与が、網膜下注射及び硝子体内注射からなる群から選択される、請求項１７に記載の剤。
  19. 患者がヒト患者である、請求項１５～１８のいずれかに記載の剤。
  20. 請求項１に記載の融合タンパク質を産生する方法であって、コードされた前記融合タンパク質の発現及び分泌を可能にする条件下で請求項１３に記載の細胞を培養するステップであって、前記細胞が発現ベクターを含み、前記発現ベクターが配列（配列番号３）を有する融合タンパク質をコードする核酸を含み、前記核酸が制御配列に作動可能に連結されている、前記ステップ、並びに前記融合タンパク質を前記細胞培養物から単離するステップを含む、前記方法。
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