JP7032771B2

JP7032771B2 - Neuropilin function regulator

Info

Publication number: JP7032771B2
Application number: JP2021000976A
Authority: JP
Inventors: 克之向井; 靖剛臼杵; 靖之五十嵐; 具博田村; 貴士齊藤
Original assignee: Daicel Corp; Hokkaido University NUC; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: Daicel Corp; Hokkaido University NUC; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2021-01-06
Filing date: 2021-01-06
Publication date: 2022-03-09
Anticipated expiration: 2036-10-26
Also published as: JP2021054860A

Description

本発明は、ニューロピリンの機能調節に優れた薬剤に関する。具体的には、ニューロピリンに結合し、セマフォリン３Ａの機能の亢進又は抑制する目的で使用される薬剤に関する。 The present invention relates to a drug excellent in regulating the function of neuropilin. Specifically, it relates to a drug that binds to neuropilin and is used for the purpose of enhancing or suppressing the function of semaphorin 3A.

セマフォリンは、セマドメインという共通のアミノ酸配列をもち、構造の違いにより、７つのサブファミリーに分類されるタンパク質である。なかでも、セマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ３Ａ，Ｓｅｍａ３Ａ）は、これまで最もよく研究されており、生体内において、神経軸索ガイダンス、血管新生、免疫応答、骨代謝などの様々な生体機能に幅広く関与していることが知られている。 Semaphorin is a protein that has a common amino acid sequence called semaphorin and is classified into seven subfamilies according to the difference in structure. Among them, semaphorin 3A (Semaphorin3A, Sema3A) has been the most studied so far and is widely involved in various biological functions such as nerve axon guidance, angiogenesis, immune response, and bone metabolism in vivo. It is known that there is.

例えば、セマフォリン３Ａが存在すると神経細胞の軸索伸長が抑制されることが知られている。セマフォリン３Ａのそのような作用を利用して、例えば、皮膚組織でのそう痒を抑制する方法が提案されている（特許文献１）。また、セマフォリン３Ａが、骨吸収の阻害と骨形成の促進とを同時に行うことによって、強い骨保護作用を発揮することが知られている（特許文献２）。また、セマフォリン３Ａの活性を阻害することによって、軸索の伸長を促進し、損傷した骨髄の再生等を促進し得ることが知られている（特許文献３）。 For example, it is known that the presence of semaphorin 3A suppresses axonal elongation of nerve cells. A method for suppressing pruritus in skin tissue, for example, by utilizing such an action of semaphorin 3A has been proposed (Patent Document 1). Further, it is known that semaphorin 3A exerts a strong bone protective effect by simultaneously inhibiting bone resorption and promoting bone formation (Patent Document 2). Further, it is known that by inhibiting the activity of semaphorin 3A, the elongation of axons can be promoted and the regeneration of damaged bone marrow and the like can be promoted (Patent Document 3).

このようにセマフォリン３Ａは生体内において、種々の重要な役割を果たしており、生体内でのセマフォリン３Ａの機能の亢進又は抑制を調整することは重要である。例えば、特許文献４には、転写因子を利用したセマフォリン３Ａの発現を増強又は抑制する剤、及び特定の転写因子の阻害又は促進を指標として、セマフォリン３Ａの発現を増強又は抑制する化合物のスクリーニング方法が開示されている。 As described above, semaphorin 3A plays various important roles in the living body, and it is important to regulate the enhancement or suppression of the function of semaphorin 3A in the living body. For example, Patent Document 4 describes an agent that enhances or suppresses the expression of semaphorin 3A using a transcription factor, and a compound that enhances or suppresses the expression of semaphorin 3A by using the inhibition or promotion of a specific transcription factor as an index. The screening method is disclosed.

セマフォリン３Ａは、ニューロピリンを直接の受容体とする。ニューロピリンは、Ｔ細胞、樹状細胞、神経細胞、上皮細胞等、様々な細胞の表面に存在する膜貫通糖タンパク質であり、ニューロピリン１とニューロピリン２が知られている。ニューロピリンはプレキシンＡと複合体と形成し、セマフォリン３Ａの機能的な受容体を形成する。セマフォリン３Ａが前記複合体に結合することにより、細胞内情報伝達機構が活性化される。例えば、図１に、軸索の伸長の作用機序に関する、セマフォリン３Ａと神経成長因子（Ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）によるシグナル伝達経路を示した模式図を示す。 Semaphorin 3A makes neuropilin a direct receptor. Neuropilin is a transmembrane glycoprotein present on the surface of various cells such as T cells, dendritic cells, nerve cells, and epithelial cells, and neuropilin 1 and neuropilin 2 are known. Neuropilin forms a complex with plexin A to form a functional receptor for semaphorin 3A. Binding of semaphorin 3A to the complex activates the intracellular signaling mechanism. For example, FIG. 1 shows a schematic diagram showing a signal transduction pathway by semaphorin 3A and nerve growth factor (NGF) regarding the mechanism of action of axon elongation.

図１に示されるように、セマフォリン３Ａが、ニューロピリン１（Ｎｒｐ１）と結合した後、その複合体にプレキシンＡ（ＰｌｅｘＡ）が結合することにより、ＦｙｎによるＲａｃ１の活性化を介して、タンパク質ホスファターゼＰＰ２ＡによるＧＳＫ－３βの脱リン酸化が促される。そうすると、ＧＳＫ－３βが活性化され、ＣＲＭＰ２のリン酸化が促進される。その結果、ＣＲＭＰ２は不活性となり、軸索の伸長が抑制される。一方、神経成長因子（ＮＧＦ）が受容体ＴｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｋｉｎａｓｅＡ（ｔｒｋＡ）と結合することにより、ＡｋｔによるＧＳＫ－３βのリン酸化が促進される。それにより、ＧＳＫ－３βによるＣＲＭＰ２のリン酸化が抑制され、ＣＲＭＰ２の活性が高まり、軸索を伸長させる。このようにセマフォリン３Ａの受容体への結合と、神経成長因子の受容体ｔｒｋＡへの結合との作用のバランスにより、軸索の伸長が制御される。 As shown in FIG. 1, semaphorin 3A binds to neuropilin 1 (Nrp 1) and then plexin A (Plex A) binds to the complex, thereby mediated activation of Rac 1 by Fyn. , The dephosphorylation of GSK-3β by the protein phosphatase PP2A is promoted. Then, GSK-3β is activated and phosphorylation of CRMP2 is promoted. As a result, CRMP2 becomes inactive and axon elongation is suppressed. On the other hand, the binding of nerve growth factor (NGF) to the receptor Tropomyosin receptor kinase A (trk A) promotes phosphorylation of GSK-3β by Akt. As a result, phosphorylation of CRMP2 by GSK-3β is suppressed, the activity of CRMP2 is increased, and axons are elongated. Thus, axon elongation is controlled by the balance of action between the binding of semaphorin 3A to the receptor and the binding of nerve growth factor to the receptor trkA.

ニューロピリンは、セマフォリン３Ａの受容体であるので、セマフォリン３Ａの機能の
亢進又は抑制に深く関わる。そのため、ニューロピリンに結合してニューロピリンの機能を調節することにより、セマフォリン３Ａの機能の亢進又は抑制できる薬剤の開発は、セマフォリン３Ａが関与する疾患の治療又は予防に非常に有効である。しかしながら、ニューロピリンに結合し、セマフォリン３Ａのアゴニスト、アンタゴニストとして機能し得る薬剤は未だ十分に知られていない。 Since neuropilin is a receptor for semaphorin 3A, it is deeply involved in enhancing or suppressing the function of semaphorin 3A. Therefore, the development of a drug capable of enhancing or suppressing the function of semaphorin 3A by binding to neuropilin and regulating the function of semaphorin is very effective in the treatment or prevention of diseases associated with semaphorin 3A. .. However, a drug that binds to neuropilin and can function as an agonist or antagonist of semaphorin 3A is not yet fully known.

特開２００８－２９７２４３号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2008-297243 国際公開第２０１３／１２９６２０号パンフレットInternational Publication No. 2013/129620 Pamphlet 特開２０１１－４６７３４号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2011-46734 国際公開第２０１４／１７８４２７号パンフレットInternational Publication No. 2014/178427 Pamphlet

本発明は、上記現状に鑑みて、セマフォリン３Ａ受容体であるニューロピリンとの結合作用を有し、セマフォリン３Ａのアゴニスト及び／又はアンタゴニストとして機能し得るニューロピリン機能調節剤を提供することを課題とする。 In view of the above situation, the present invention provides a neuropilin function regulator having a binding action with semaphorin 3A receptor neuropilin and capable of functioning as an agonist and / or an antagonist of semaphorin 3A. Make it an issue.

本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を行ったところ、植物由来セラミドがニューロピリンと結合し得ることを見出した。また、植物由来セラミドがニューロピリンと結合して、軸索の伸長を抑制し得ることを見出した。更に、植物由来セラミドがニューロピリンに結合することにより、セマフォリン３Ａの機能を亢進したり、抑制したりし得ることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。 The present inventor conducted diligent research to solve the above-mentioned problems, and found that plant-derived ceramide can bind to neuropilin. We also found that plant-derived ceramides can bind to neuropilin and suppress axon elongation. Furthermore, they have found that the binding of plant-derived ceramide to neuropilin can enhance or suppress the function of semaphorin 3A. The present invention has been completed by further studies based on these findings.

即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．植物由来セラミドを含むニューロピリン機能調節剤。
項２．植物由来セラミドがコンニャク由来である、項１に記載のニューロピリン機能調節剤。
項３．セマフォリン３Ａのアンタゴニストとして使用される、項１又は２に記載のニューロピリン機能調節剤。
項４．セマフォリン３Ａのアゴニストとして使用される、項１又は２に記載のニューロピリン機能調節剤。 That is, the present invention provides the inventions of the following aspects.
Item 1. Neuropilin function regulator containing plant-derived ceramide.
Item 2. Item 2. The neuropilin function regulator according to Item 1, wherein the plant-derived ceramide is derived from konjac.
Item 3. Item 2. The neuropilin function regulator according to Item 1 or 2, which is used as an antagonist of semaphorin 3A.
Item 4. Item 2. The neuropilin function regulator according to Item 1 or 2, which is used as an agonist of semaphorin 3A.

本発明によれば、セマフォリン３Ａ受容体であるニューロピリンと結合し、セマフォリン３Ａの機能を亢進又は抑制し得るニューロピリン機能調節剤を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a neuropilin function regulator that binds to semaphorin 3A receptor neuropilin and can enhance or suppress the function of semaphorin 3A.

軸索の伸長と退縮の作用機序に関する、セマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）と神経成長因子（ＮＧＦ）によるシグナル伝達経路を示す模式図である。FIG. 6 is a schematic diagram showing a signal transduction pathway by semaphorin 3A (Sema3A) and nerve growth factor (NGF) regarding the mechanism of action of axon elongation and regression. 実験例１の実験の流れを示す図である。It is a figure which shows the flow of the experiment of Experimental Example 1. FIG. 実験例２の実験の流れを示す図である。It is a figure which shows the flow of the experiment of Experimental Example 2. 実験例３の実験の流れを示す図である。It is a figure which shows the flow of the experiment of Experimental Example 3. FIG. （Ａ）は、実験例１における、濃度の異なるＫ２５２ａと、ＮＧＦ、又はＮＧＦとｋＣｅｒを添加した場合の、神経突起伸長活性を示すグラフである。（Ｂ）は、実験例１において、濃度の異なるＫ２５２ａと、ＮＧＦとαＮｒｐ１、又はＮＧＦとαＮＲＰ１とｋＣｅｒを添加した場合の、神経突起伸長活性を示すグラフである。（Ｃ）は、培地へのｋＣｅｒの添加の有無と、１μｇ／ｍＬ又は５μｇ／ｍＬのαＮｒｐ１の添加の有無による、神経突起伸長活性を示すグラフである。(A) is a graph showing the neurite outgrowth activity when K252a having different concentrations and NGF, or NGF and kCer are added in Experimental Example 1. (B) is a graph showing neurite outgrowth activity when K252a having different concentrations and NGF and αNrp1 or NGF and αNRP1 and kCer are added in Experimental Example 1. (C) is a graph showing neurite outgrowth activity depending on the presence or absence of addition of kCer to the medium and the addition or absence of αNrp1 of 1 μg / mL or 5 μg / mL. （Ａ）は、実験例２における、ＣＲＭＰ２のリン酸化活性を示すグラフである。（Ｂ）は、実験例３におけるウエスタンブロット法による各標的蛋白質のバンドの様子を示す画像である。(A) is a graph showing the phosphorylation activity of CRMP2 in Experimental Example 2. (B) is an image showing the state of the band of each target protein by Western blotting in Experimental Example 3. 実験例４における濃度の異なるＳｅｍａ３ＡとｋＣｅｒの同時添加による神経突起伸長活性を示すグラフである。6 is a graph showing neurite outgrowth activity due to simultaneous addition of Sema3A and kCer having different concentrations in Experimental Example 4. 実験例４における濃度の異なるＳｅｍａ３ＡとｋＣｅｒの同時添加によるＣＲＭＰ２のリン酸化活性を示すグラフである。6 is a graph showing the phosphorylation activity of CRMP2 by simultaneous addition of Sema3A and kCer having different concentrations in Experimental Example 4. （Ａ）は、実験例５における蛍光画像である。（Ｂ）は、実験例５におけるＳｅｍａ３Ａ又は各セラミドの濃度に対するＰＣ１２細胞に結合した蛍光量を示すグラフである。(A) is a fluorescence image in Experimental Example 5. (B) is a graph showing the amount of fluorescence bound to PC12 cells with respect to the concentration of Sema3A or each ceramide in Experimental Example 5. 実験例６におけるバイオレイヤー干渉法により測定した分子間相互作用の値を示すグラフである。It is a graph which shows the value of the intermolecular interaction measured by the biolayer interferometry in Experimental Example 6. 実験例７におけるｋＣｅｒ、ＢＳＡ、ｋＧｌｃＣｅｒの昇温比熱変化を示すグラフである。6 is a graph showing the temperature change specific heat change of kCer, BSA, and kGlcCer in Experimental Example 7.

本発明のニューロピリン機能調節剤は、植物由来セラミドを含むことを特徴とする。以下、本発明のニューロピリン機能調節剤について詳述する。 The neuropilin function regulator of the present invention is characterized by containing a plant-derived ceramide. Hereinafter, the neuropilin function regulator of the present invention will be described in detail.

セラミド
本発明のニューロピリン機能調節剤は、植物由来セラミドを有効成分として含む。
セラミドは、スフィンゴイドに脂肪酸がアミド結合した構造を有する。
本発明において使用されるセラミドは、植物由来である。そのため、本発明のニューロピリン機能調節剤は安全性が高く、簡便に適用できる。本発明で使用されるセラミドの由来植物としては、具体的には、アーモンド、アオサ、アオノリ、アカザ、アカシア、アカネ、アカブドウ、アカマツ（松ヤニ、琥珀、コーパルを含む。以下マツ類については同じ）、アガリクス、アキノノゲシ、アケビ、アサガオ、アザレア、アジサイ、アシタバ、アズキ、アスパラガス、アセロラ、アセンヤク、アニス、アボガド、アマクサ、アマチャ、アマチャヅル、アマナツ、アマリリス、アルテア、アルニカ、アロエ、アンジェリカ、アンズ、アンコール、アンソッコウ、イグサ、イザヨイバラ、イチイ、イチジク、イチョウ、イヨカン、イランイラン、ウイキョウ、ウーロン茶、ウコン、ウスベニアオイ、ウツボグサ、ウド、ウメ、ウラジロガシ、温州ミカン、エイジツ、エシャロット、エゾウコギ、エニシダ、エノキタケ、エルダーフラワー、エンドウ、オーキッド、オウゴンカン、オオバコ、オオヒレアザミ、オオムギ、オケラ、オスマンサス、オトギリソウ、オドリコソウ、オニドコロ、オリーブ、オレガノ、オレンジ（オレンジピールを含む）、カーネーション、カカオ、カキ、カキドオシ、カクテルフルーツ、カッコン、カシワ、カタクリ、カボチャ、カミツレ、カムカム、カモミール、カラスウリ、カラマツ、カラマンダリン、カリン、ガルシニア、カルダモン、カワチバンカン、カンペイ、キイチゴ、キウイ、キキョウ、キャベツ（ケールを含む）、キャラウェイ、キュウリ、キヨミ、キンカン、ギンナン、グァバ、クコ、クズ、クチナシ、クミン、クランベリー、クルミ、グレープフルーツ、クレメンタイン、クローブ、クロマツ、クロマメ、クロレラ、ケツメイシ、ゲンノショウコ、コケモモ、コショウ、コスモス、ゴボウ、コムギ（小麦胚芽を含む）、ゴマ、コマツナ、コメ（米糠を含む）、コリアンダー、コンニャク（コンニャク芋）（こんにゃくトビ粉を含む）、コンブ、サーモンベリー、サイプレス、ザクロ、サツマ芋、サト芋、サトウキビ、サトウダイコン、サフラン、ザボン、サンザシ、サンショウ、シイタケ、シクラメン、シソ、シメジ、ジャガ芋、シャクヤク、ジャスミン、ジュズダマ、シュンギク、ショウガ、ショウブ、シラカシ、ジンチョウゲ、シンナモン、スイカ、スイトピー、スイートスプリング、スギナ、スターアニス、スターアップル、スダチ、ステビア、スモモ、セージ（サルビア）、セトカ、ゼニアオイ、セミノール、セロリ、センキュウ、センブリ、ソバ、ソラマメ、ダイコン、ダイズ（おからを含む）、ダイダイ、タイム、タケノコ、タマネギ、タラゴン、タロイモ、タンカン、タンゴール、タンジン、タンゼロ、タンポポ、チコリ、ツキミソウ、ツクシ、ツバキ、ツボクサ、ツメクサ、ツルクサ、ツルナ、ツワブキ、ディル、デコポン、テンジクアオイ（ゼラニウム）、トウガ、トウガラシ、トウキ、トウチュウカソウ、トウモロコシ、ドクダミ、トコン、トチュウ、トネリコ、ナガイモ、ナズナ、ナツミ、ナツミカン、ナツメグ、ナンテン、ニガウリ、ニガヨモギ、ニラ、ニンジン、ニンニク、ネギ、ノコギリソウ、ノコギリヤシ、ノビル、バーベナ、パーム、パイナップル、ハイビスカス、ハコベ、バジル、パセリ、ハダカムギ、ハッサク、ハッカ、ハトムギ、バナナ、バナバ、バニラ、パプリカ、ハマメリス、ハルカ、ハルミ、ハレヒメ、バンペイユ、ビート、ピーマン、ヒガンバナ、ヒシ、ヒジキ、ピスタチオ、ヒソップ（ヤナギハッカ）、ヒナギク、ヒナゲシ、ヒノキ、ヒバ、ヒマシ、ヒマワリ、ヒメノツキ、ヒュウガナツ、ビワ、ファレノプシス、フェネグリーク、フキノトウ、ブラックベリー、プラム、ブルーベリー（ビルベリーを含む）、プルーン、ブンタン、ヘチマ、ベニバナ、ベニマドンナ、ベラドンナ、ベルガモット、ホウセンカ、ホウレンソウ、ホオズキ、ボダイジュ、ボタン、ホップ、ホホバ、ポンカン、マイタケ、マオウ、マカ、マカデミアンナッツ、マーコット、マタタビ、マリーゴールド、マリヒメ、マンゴー、ミツバ、ミネオラ、ミモザ、ミョウガ、ミルラ、ムラサキ、メース、メリッサ、メリロート、メロン、メン（綿実油粕を含む）、モヤシ、ヤグルマソウ、ヤマ芋、ヤマユリ、ヤマヨモギ、ユーカリ、ユキノシタ、ユズ、ユリ、ヨクイニン、ヨメナ（アスター）、ヨモギ、ライム、ライムギ、ライラック、ラズベリー、ラッカセイ、ラッキョウ、リンゴ（アップルファイバーを含む）、リンドウ、レイコウ、レイシ、レタス、レモン、レンゲソウ、レンコン、ローズヒップ、ローズマリー、ローリエ、ワケギ、ワサビ（セイヨウワサビを含む）等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはコンニャク、サツマ芋、ジャガ芋、サト芋、ヤマ芋、ナガ芋等の芋類由来、更に好ましくはコンニャクが挙げられる。 Ceramide The neuropilin function regulator of the present invention contains plant-derived ceramide as an active ingredient.
Ceramide has a structure in which a fatty acid is amide-bonded to sphingoid.
The ceramide used in the present invention is of plant origin. Therefore, the neuropilin function regulator of the present invention is highly safe and can be easily applied. Specific examples of the plant from which the ceramide used in the present invention is derived include almonds, sea lettuce, green laver, red azalea, acacia, red vine, red grape, and red pine (including pine tar, amber, and copal. The same applies to pine species below). , Agarix, Akinonogeshi, Akebii, Asagao, Azalea, Ajisai, Ashitaba, Azuki, Asparagus, Acerola, Asenyaku, Anis, Avocado, Amaxa, Amacha, Amachazul, Amanatsu, Amariris, Artea, Arnica, Aloe, Angelica Ansokko, Igusa, Izayoibara, Ichii, Ichijiku, Ginkgo, Iyokan, Iran Iran, Uikyo, Woolong tea, Ukon, Usvenia oyster, Utsubogusa, Udo, Ume, Urajirogashi, Wenshu mikan, Agetsu, Esharot, Ezo , Orchid, Ogonkan, Oobako, Ohiraezami, Omugi, Okera, Ottomansus, Otogirisou, Odorikosou, Onidokoro, Olive, Oregano, Orange (including orange peel), Carnation, Cacao, Kaki, Kakidooshi, Cocktail fruit, Cucumber, Kashiwa , Pumpkin, Kamitsure, Kamukam, Chamomile, Karasuuri, Karamatsu, Karamandarin, Karin, Garsina, Cardamon, Kawachibankan, Kampei, Kistrawberry, Kiwi, Kikyo, Cabbage (including kale), Caraway, Cucumber, Kiyomi, Kinkan, Ginnan , Guava, Kuco, Kuzu, Kuchinashi, Kumin, Cranberry, Walnut, Grapefruit, Clementine, Clove, Black pine, Black bean, Chlorella, Ketsumeishi, Gennoshoco, Kokemomo, Kosho, Cosmos, Gobo, Wheat germ (including wheat germ), Sesame, Komatsuna , Rice (including rice bran), Copal, Konnaku (Konnyaku potato) (including konjac tobi powder), Comb, Salmon berry, Cypress, Pomegranate, Satsuma potato, Sato potato, Satoukibi, Satodaikon, Saffron, Zabon, Sanzashi, Sun Show, Shiitake, Cyclamen, Shiso, Shimeji, Jagaimo, Shakuyaku, Jasmine, Juzudama, Shungiku, Shoga, Shobu, Shirakashi, Jinchoge, Shinnamon, Watermelon, Suitopy, Sweetspring, Sugina, Staranis, Starapple, Sudachi, Stevia Pine, sage (salvia), setoka, green laver, seminol, sero Li, Senkyu, Senburi, Soba, Soramame, Bitter orange, Soybean (including Okara), Bitter orange, Thyme, Takenoko, Onion, Taragon, Taroimo, Tankan, Tangor, Tangor, Tangor, Tanpopo, Chicoli, Tsukimisou, Tsukushi, Tsubaki, Tsubokusa, Tsumekusa, Tsurukusa, Tsuruna, Tsuwabuki, Bitter, Dekopon, Tenjikuaoi (Geranium), Toga, Togarashi, Touki, Tochu Kasou, Corn, Dokudami, Tokon, Tochu, Toneriko, Nagaimo, Nazuna Nigauri, Nigayomogi, Nira, Carrot, Garlic, Negishi, Nokogiri Sou, Nokogiri Palm, Nobile, Barbena, Palm, Pineapple, Hyssop, Hakobe, Basil, Parsley, Hadakamugi, Hassaku, Hakka, Hatomugi, Banana, Banaba, Banilla Haruka, Harumi, Halehime, Pomelo, Beat, Peaman, Higanbana, Hishi, Hijiki, Pistachio, Hisop (Yanagihakka), Hyssop, Hinageshi, Hinoki, Hiba, Himashi, Sunflower, Himenotsuki, Hyuganatsu, Biwa, Phalaenopsis Berry, Plum, Blueberry (including bilberry), Prun, Buntan, Hechima, Benibana, Benimadonna, Belladonna, Bergamot, Hosenka, Hyssop, Hozuki, Bitter orange, Button, Hop, Hohoba, Ponkan, Maitake, Maou, Maka, Macademian Nuts, Marcot, Matatabi, Marigold, Marihime, Mango, Mitsuba, Mineola, Mimosa, Myoga, Mirula, Murasaki, Mace, Melissa, Melillot, Melon, Men (including cottonseed oil cake), Moyashi, Yagurumasou, Yamaimo, Yamayuri, Yamayomogi, Eucalyptus, Yukinoshita, Yuzu, Yuri, Yokuinin, Yomena (Aster), Yomogi, Lime, Limegi, Lilac, Raspberry, Raccasei, Rakkyo, Apple (including apple fiber), Lindow, Reiko, Reishi, Lettuce, Lemon, Rengesou , Renkon, rose hips, rosemary, laurier, wakegi, wasabi (including citron wasabi) and the like. Among these, konnyaku, sweet potato, potato, potato, yamaimo, Nagaimo and other potatoes are preferable, and konnyaku is more preferable.

本発明で使用されるセラミドにおいて、スフィンゴイド部分の構造については、特に限定されないが、具体的には、４－スフィンゲニン（スフィンゴシン）、４－ヒドロキシスフィンガニン（フィトスフィンゴシン）、４－ヒドロキシ－トランス－８－スフィンゲニン、４－ヒドロキシ－シス－８－スフィンゲニン、スフィンガニン、トランス－８－スフィンゲニン、シス－８－スフィンゲニン、トランス－４－スフィンゲニン、トランス－４，トランス－８－スフィンガジエニン、トランス－４，シス－８－スフィンガジエニン等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは、コンニャク由来のセラミドを構成しているスフィンゴイド、具体的にはトランス－４，シス－８－スフィンガジエニン、シス４－シス８－スフィンガジエニン、トランス４－トランス８－スフィンガジエニン、シス４－トランス８－スフィンガジエニン、４－ヒドロキシ－シス－８－スフィンゲニン、４－ヒドロシキ－トランス８－スフィンゲニンが挙げられる。 In the ceramide used in the present invention, the structure of the sphingoid moiety is not particularly limited, but specifically, 4-sphingosine (sphingosine), 4-hydroxysphingosine (phytosphingosine), 4-hydroxy-trans. -8-sphingosine, 4-hydroxy-cis-8-sphingosine, sphingosine, trans-8-sphingosine, cis-8-sphingosine, trans-4-sphingosine, trans-4, trans-8-sphingazine, trans- 4, cis-8-sphingosine and the like can be mentioned. Among these, preferably, sphingoids constituting ceramide derived from konjac, specifically, trans-4, cis-8-sphingadienine, cis4-cis8-sphingadienin, trans4- Examples thereof include trans 8-sphingadienine, cis 4-trans 8-sphingadienin, 4-hydroxy-cis-8-sphingenin, and 4-hydroshiki-trans 8-sphingenin.

本発明で使用されるセラミドにおいて、スフィンゴイド部分に結合している脂肪酸の炭素数については、特に制限されないが、２～３０、好ましくは１４～２６、更に好ましくは１８～２４が挙げられる。また、当該脂肪酸は、飽和脂肪酸、炭素－炭素二重結合及び／又は炭素－炭素三重結合を含む不飽和脂肪酸、並びにα－ヒドロキシ脂肪酸のいずれであってもよい。 In the ceramide used in the present invention, the number of carbon atoms of the fatty acid bonded to the sphingoid moiety is not particularly limited, and examples thereof include 2 to 30, preferably 14 to 26, and more preferably 18 to 24. Further, the fatty acid may be any of a saturated fatty acid, an unsaturated fatty acid containing a carbon-carbon double bond and / or a carbon-carbon triple bond, and an α-hydroxy fatty acid.

本発明で使用されるセラミドにおいて、スフィンゴイド部分に結合している脂肪酸として、具体的には、ヘキサデカン酸（Ｃ１６：０）、オクタデカン酸（Ｃ１８：０）、イコサン酸（Ｃ２０：０）、ヘネイコサン酸（Ｃ２１：０）、ドコサン酸（Ｃ２２：０）、トリコサン酸（Ｃ２３：０）、テトラドコサン酸（Ｃ２４：０）、ペンタコサン酸（Ｃ２５：０）、ヘキサドコサン酸（Ｃ２６：０）、ヘプタコサン酸（Ｃ２７：０）、オクタドコサン酸（２８：０）、シス－９－オクタデセン酸（Ｃ１８：１）等が挙げられる。なお、前記脂肪酸の括弧内に示す表記「ＣＸ：Ｙ」において、ＣＸは１分子当たりの炭素数を示し、Ｙは１分子当たりの不飽和結合の数を示し、例えば「Ｃ１６：０」とは炭素数１６且つ不飽和結合数が０の脂肪酸を表す。これらの脂肪酸の中でも、好ましくは、コンニャク由来のセラミドを構成している脂肪酸、具体的にはオクタデカン酸、ドコサン酸、イコサン酸が挙げられる。 In the ceramide used in the present invention, as the fatty acid bonded to the sphingoid moiety, specifically, hexadecanoic acid (C16: 0), octadecanoic acid (C18: 0), icosanoic acid (C20: 0), heneikosan Acid (C21: 0), docosanoic acid (C22: 0), tricosanoic acid (C23: 0), tetradocosanoic acid (C24: 0), pentacosanoic acid (C25: 0), hexadocosanoic acid (C26: 0), heptacosanoic acid (C26: 0) C27: 0), octadocosic acid (28: 0), cis-9-octadecenoic acid (C18: 1) and the like can be mentioned. In the notation "CX: Y" shown in parentheses of the fatty acid, CX indicates the number of carbon atoms per molecule, Y indicates the number of unsaturated bonds per molecule, and for example, "C16: 0". Represents a fatty acid having 16 carbon atoms and 0 unsaturated bonds. Among these fatty acids, preferably, fatty acids constituting ceramide derived from konjac, specifically, octadecanoic acid, docosanoic acid, and icosanoic acid can be mentioned.

セラミドは、前述する由来植物から公知の抽出方法によって得ることができる。また、セラミドは、スフィンゴ糖脂質の酵素処理物として得られたものであってもよい。また、セラミドは商業的に入手可能であり、市販品を使用してもよい。 Ceramide can be obtained from the above-mentioned derived plants by a known extraction method. Further, the ceramide may be obtained as an enzyme-treated product of glycosphingolipid. In addition, ceramides are commercially available, and commercially available products may be used.

前記スフィンゴ糖脂質の酵素処理物としては、前述の由来植物の抽出液、その濃縮液、又は前記濃縮液を精製処理した精製物の酵素処理物などが挙げられる。 Examples of the enzyme-treated product of glycosphingolipid include the above-mentioned extract of the derived plant, a concentrate thereof, and an enzyme-treated product of a purified product obtained by purifying the concentrate.

前記スフィンゴ糖脂質は、グルコシルセラミド又はラクトシルセラミド等の、セラミドの第１級アルコール性ヒドロキシ基に糖が結合した糖脂質である。スフィンゴ糖脂質としては、前述したセラミドが得られるのであれば、特に限定されず、セラミドに、グルコース、ガラクトース、又は糖鎖等、いずれの糖が結合したものであってもよい。スフィンゴ糖脂質は、前述する由来植物から公知の抽出方法によって得ることができる。また、スフィンゴ糖脂質は、商業的に入手可能であり、市販品を使用してもよい。 The glycosphingolipid is a glycolipid in which a sugar is bound to a primary alcoholic hydroxy group of ceramide, such as glucosylceramide or lactosylceramide. The glycosphingolipid is not particularly limited as long as the above-mentioned ceramide can be obtained, and any sugar such as glucose, galactose, or a sugar chain may be bound to the ceramide. Glycosphingolipids can be obtained from the above-mentioned derived plants by a known extraction method. In addition, glycosphingolipids are commercially available, and commercially available products may be used.

スフィンゴ糖脂質の酵素処理に使用する酵素としては、スフィンゴ糖脂質の糖鎖－セラミド間の結合を加水分解する酵素であれば特に限定されず、例えば、エンドグリコセラミダーゼ（ＥＧＣａｓｅ）が挙げられる。 The enzyme used for the enzymatic treatment of glycosphingolipid is not particularly limited as long as it is an enzyme that hydrolyzes the bond between the sugar chain and ceramide of glycosphingolipid, and examples thereof include endoglycoceramidase (EGCase).

ＥＧＣａｓｅは、等電点及び分子量が異なる３つの分子種（ＥＧＣａｓｅＩ、ＥＧＣａｓｅＩＩ、及びＥＧＣａｓｅＩＩＩ）が知られており、分子種に応じて基質特異性が異なることが知られている。使用するＥＧＣａｓｅの分子種は、基質となるスフィンゴ糖脂質の構造に応じて適宜設定すればよい。例えば、スフィンゴ糖脂質として、セレブロシド、特にコンニャク由来のスフィンゴ糖脂質の場合であれば、ＥＧＣａｓｅＩが好適に使用される。酵素処理の条件は、所望の酵素反応が行われるよう適宜選択するとよい。 Three molecular species (EGCase I, EGCase II, and EGCase III) having different isoelectric points and molecular weights are known for EGCase, and it is known that the substrate specificity differs depending on the molecular species. The molecular species of EGCase to be used may be appropriately set according to the structure of the glycosphingolipid as a substrate. For example, as the glycosphingolipid, cerebroside, particularly in the case of glycosphingolipid derived from konjac, EGCase I is preferably used. The conditions for the enzyme treatment may be appropriately selected so that the desired enzymatic reaction is carried out.

前記抽出液の濃縮方法としては、エバポレーターのような減圧濃縮装置を用いた公知の濃縮方法が挙げられる。また精製方法としては、アルカリ処理、溶媒分画、シリカゲルクトマトグラフィーなどの公知の精製方法が挙げられる。 Examples of the method for concentrating the extract include a known concentrating method using a vacuum concentrating device such as an evaporator. Examples of the purification method include known purification methods such as alkali treatment, solvent fractionation, and silica gel coutomography.

酵素処理後、酵素処理物そのままを用いてもよいし、酵素処理物を固液分離した残渣、固液分離した残渣を乾燥させたもの、反応物そのままを乾燥させたもの等を用いてもよい。また、酵素処理物を固液分離し、更に水を添加した後、再度固液分離することにより酵素処理物を洗浄して不純物を除去したものでもよい。 After the enzyme treatment, the enzyme-treated product as it is may be used, or the residue obtained by solid-liquid separation of the enzyme-treated product, the dried residue of the solid-liquid separation, the dried reaction product as it is, or the like may be used. .. Further, the enzyme-treated product may be separated into solid and liquid, water may be added, and then the enzyme-treated product may be separated again to wash the enzyme-treated product to remove impurities.

本発明のニューロピリン機能調節剤において、セラミドは、１種の構造又は由来のものを単独して使用してもよく、２種以上の構造又は由来のものを組み合わせて使用してもよい。 In the neuropilin function regulator of the present invention, the ceramide may be used alone or in combination of two or more kinds of structures or origins.

本発明のニューロピリン機能調節剤におけるセラミドの含有量としては、本発明の効果を奏するのであれば、特に限定されず、用途、剤型、投与形態等に応じて適宜調整することができる。 The content of ceramide in the neuropilin function regulator of the present invention is not particularly limited as long as it exhibits the effects of the present invention, and can be appropriately adjusted according to the intended use, dosage form, administration form and the like.

添加成分
本発明のニューロピリン機能調節剤は、前述した植物由来セラミド以外に、本発明の効
果を損なわない範囲で、剤型に応じて、他の添加成分を含有していてもよい。本発明のニューロピリン機能調節剤に含有され得る添加成分としては、例えば、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素、キレート剤などが挙げられる。これらの添加成分は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、これらの添加成分の含有量については、使用する添加成分の種類や本発明のニューロピリン機能調節剤の剤型等に応じて適宜設定される。 Additive component The neuropilin function regulator of the present invention may contain other additive components in addition to the above-mentioned plant-derived ceramide, depending on the dosage form, as long as the effects of the present invention are not impaired. Examples of the additive component that can be contained in the neuropyrin function regulator of the present invention include water, oils and fats, waxes, hydrocarbons, fatty acids, higher alcohols, esters, plant extract extracts, and water-soluble polymers. , Surfactants, metal soaps, alcohols, polyhydric alcohols, pH regulators, antioxidants, UV absorbers, preservatives, fragrances, powders, thickeners, pigments, chelating agents and the like. These additive components may be used alone or in combination of two or more. The content of these additive components is appropriately set according to the type of additive component used, the dosage form of the neuropilin function regulator of the present invention, and the like.

剤型・製剤形態・用途
本発明のニューロピリン機能調節剤の剤型については、特に限定されず、固体状、半固体状、又は液体状のいずれであってもよく、ニューロピリン機能調節剤の種類や用途に応じて適宜設定すればよい。 Dosage Form / Formulation Form / Use The dosage form of the neuropyrin function regulator of the present invention is not particularly limited and may be solid, semi-solid, or liquid, and the neuropilin function regulator may be used. It may be set appropriately according to the type and application.

本発明のニューロピリン機能調節剤の投与方法としては、特に限定されず、適用する疾患の種類に応じて適宜選択すればよく、全身投与であっても、局所投与であってもよい。具体的には、経口、経血管内（動脈内又は静脈内）、経皮、経腸、経肺、経鼻投与等が挙げられる。血管内投与には、血管内注射、持続点滴も含まれる。なかでも、投与が容易な点で、経皮投与、経口投与、経鼻投与、又は経直腸投与が好ましい。 The method for administering the neuropilin function regulator of the present invention is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the type of disease to be applied, and may be systemic administration or local administration. Specific examples thereof include oral, intravascular (intravenous or intravenous), transdermal, enteral, transpulmonary, and nasal administration. Intravenous administration also includes intravascular injection and continuous infusion. Of these, transdermal administration, oral administration, nasal administration, or transrectal administration is preferable because it is easy to administer.

本発明のニューロピリン機能調節剤の製剤形態については、特に限定されず、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、注射剤、点滴剤、坐剤等の任意の製剤形態を挙げることができ、投与形態に応じて適宜選択すればよい。例えば、本発明のニューロピリン機能調節剤の投与形態が経皮投与である場合は、経皮投与が可能であることを限度として特に制限されないが、具体的には、化粧料、外用医薬品などの皮膚外用剤が挙げられる。 The formulation form of the neuropyrin function regulator of the present invention is not particularly limited, and any formulation form such as tablets, capsules, granules, powders, syrups, injections, infusions, suppositories and the like can be mentioned. It can be selected as appropriate according to the administration form. For example, when the administration form of the neuropilin function regulator of the present invention is transdermal administration, there is no particular limitation as long as transdermal administration is possible, but specifically, cosmetics, external medicines, etc. Examples include external skin preparations.

例えば、本発明のニューロピリン機能調節剤を化粧料に使用する場合、本発明のニューロピリン機能調節剤を香粧学的に許容される基材や添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような化粧料の形態としては、特に限定されないが、具体的には、クリーム剤、乳液、化粧水（ローション）、パック、洗浄剤、メーキャップ化粧料、頭皮・毛髪用品、オイル、リップ、口紅、ファンデーション、アイライナー、頬紅、マスカラ、アイシャドー、マニキュア・ペディキュア（及び除去剤）、シャンプー、リンス、ヘアトリートメント、パーマネント剤、染毛料、ひげ剃り剤、石けん（ハンドソープ、ボディソープ、洗顔料）などが挙げられる。 For example, when the neuropyrin function adjusting agent of the present invention is used in cosmetics, the neuropyrin function adjusting agent of the present invention may be prepared in a desired form by combining it with a cosmetically acceptable base material or additive component. good. The form of such cosmetics is not particularly limited, but specifically, creams, milky lotions, lotions, packs, cleaning agents, makeup cosmetics, scalp / hair products, oils, lips, and lipsticks. , Foundation, eyeliner, cheek red, mascara, eye shadow, manicure / pedicure (and remover), shampoo, rinse, hair treatment, permanent agent, hair dye, shaving agent, soap (hand soap, body soap, soap) And so on.

また、本発明のニューロピリン機能調節剤を外用医薬品に使用する場合、本発明のニューロピリン機能調節剤を単独で、又は他の薬理活性成分、薬学的に許容される基剤や添加成分等と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような外用医薬品の形態としては、特に制限されないが、具体的には、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、噴霧剤、貼付剤、パップ剤、リニメント剤などの経皮投与製剤などが挙げられる。 In addition, when the neuropyrin function regulator of the present invention is used for an external drug, the neuropyrin function regulator of the present invention may be used alone or with other pharmacologically active ingredients, pharmaceutically acceptable bases and additive components, etc. It may be combined and prepared into a desired form. The form of such an external drug is not particularly limited, but specifically, a transdermal preparation such as a liquid, an ointment, a cream, a gel, a spray, a patch, a pap, or a liniment is used. Can be mentioned.

また、本発明のニューロピリン機能調節剤の製剤形態について、例えば、本発明のニューロピリン機能調節剤の投与形態が経口投与である場合は、経口投与が可能であることを限度として特に制限されないが、具体的には、飲食品及び内服用医薬品が挙げられる。 Further, the pharmaceutical form of the neuropilin function regulator of the present invention is not particularly limited as long as oral administration is possible, for example, when the dosage form of the neuropilin function regulator of the present invention is oral administration. Specific examples thereof include foods and drinks and oral medicines.

本発明のニューロピリン機能調節剤を飲食品の製剤形態にする場合、本発明のニューロピリン機能調節剤を、そのまま又は他の食品素材や添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような飲食品としては、一般の飲食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品等が挙げられる。これらの飲食品の形態として、特に制限されないが、具体的にはカプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤）、錠剤
、顆粒剤、粉剤、ゼリー剤、リポソーム製剤等のサプリメント；栄養ドリンク、果汁飲料、炭酸飲料、乳酸飲料等の飲料；団子、アイス、シャーベット、グミ、キャンディー等の嗜好品；等が例示される。これらの飲食品の中でも、好ましくはサプリメント、より好ましくはカプセル剤、リポソーム製剤が挙げられる。 When the neuropyrin function adjusting agent of the present invention is formed into a pharmaceutical product form, the neuropyrin function adjusting agent of the present invention may be prepared as it is or in combination with other food materials or additive components into a desired form. Examples of such foods and drinks include general foods and drinks, foods for specified health use, dietary supplements, functional foods, foods for the sick, and the like. The form of these foods and drinks is not particularly limited, but specifically, supplements such as capsules (soft capsules, hard capsules), tablets, granules, powders, jellies, and liposome preparations; nutritional drinks, fruit juice drinks, and carbonated drinks. Beverages such as beverages and lactic acid beverages; luxury products such as dumplings, ice cream, sherbets, gummy, and candy; and the like are exemplified. Among these foods and drinks, supplements are preferable, capsules and liposome preparations are more preferable.

本発明のニューロピリン機能調節剤を内服用医薬品の製剤形態にする場合、本発明のニューロピリン機能調節剤を、そのまま又は他の添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような内服用医薬品としては、具体的には、カプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤）、錠剤、顆粒剤、粉剤、ゼリー剤、シロップ剤、リポソーム製剤等が挙げられる。これらの内服用の医薬品の中でも、好ましくはリポソーム製剤が挙げられる。 When the neuropyrin function adjusting agent of the present invention is to be formed into a pharmaceutical product for internal use, the neuropilin function adjusting agent of the present invention may be prepared as it is or in combination with other additive components into a desired form. Specific examples of such an internal medicine include capsules (soft capsules, hard capsules), tablets, granules, powders, jellies, syrups, liposome preparations and the like. Among these medicines for internal use, a liposome preparation is preferable.

本発明のニューロピリン機能調節剤は、ニューロピリンと結合し得る。本発明のニューロピリン機能調節剤は、ニューロピリンに結合して、セマフォリン３Ａの機能を制御することができる。セマフォリン３Ａがニューロピリンに結合して複合体を形成し、前記複合体がプレキシンＡと結合するか否かで、セマフォリン３Ａの機能が発現されるか否かを制御すると考えられる。本発明のニューロピリン機能調節剤は、ニューロピリンに結合して、ある閾値まではセマフォリン３Ａの機能を亢進し、セマフォリン３Ａがある閾値を超えるとニューロピリンの機能を抑制することができる。すなわち、本発明のニューロピリン機能調節剤は、疾患部位において、セマフォリン３Ａが過剰に機能している場合は、その機能を抑制するように働き、一方、セマフォリン３Ａの機能が不十分な場合は、その機能を促進するように働いて、正常な機能を維持しようとする作用を有すると考えられる。本発明のニューロピリン機能調節剤は、セマフォリン３Ａの機能を亢進又は抑制することによって症状が改善される疾患の治療又は予防目的で使用することができる。このように、本発明のニューロピリン機能調節剤は、セマフォリン３Ａのアゴニスト又はアンタゴニストとして使用することができる。 The neuropilin function regulator of the present invention may bind to neuropilin. The neuropilin function regulator of the present invention can bind to neuropilin and control the function of semaphorin 3A. It is considered that semaphorin 3A binds to neuropilin to form a complex, and whether or not the complex binds to plexin A controls whether or not the function of semaphorin 3A is expressed. The neuropyrin function regulator of the present invention can bind to neuropilin and enhance the function of semaphorin 3A up to a certain threshold value, and suppress the function of semaphorin 3A when a certain threshold value is exceeded. That is, the neuropilin function regulator of the present invention acts to suppress the function of semaphorin 3A when it is excessively functioning at the diseased site, while the function of semaphorin 3A is insufficient. Is thought to have the effect of promoting its function and maintaining its normal function. The neuropilin function regulator of the present invention can be used for the purpose of treating or preventing a disease in which symptoms are improved by enhancing or suppressing the function of semaphorin 3A. As described above, the neuropilin function regulator of the present invention can be used as an agonist or antagonist of semaphorin 3A.

また、本発明のニューロピリン機能調節剤は、ニューロピリンが介在する複合体の形成を阻害する機能を有すると考えられるので、前述のセマフォリン３Ａの機能以外にも、ニューロピリンが関与する機能の制御に有用であると考えられる。例えば、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）は、ニューロピリンに結合して血管新生を亢進し得る。そのため、本発明のニューロピリン機能調節剤は、ＶＥＧＦによる血管新生機能の制御等にも有用であると考えられる。 Further, since the neuropilin function regulator of the present invention is considered to have a function of inhibiting the formation of a complex mediated by neuropilin, a function involving neuropilin other than the above-mentioned function of semaphorin 3A is considered. It is considered to be useful for control. For example, vascular endothelial growth factor (VEGF) can bind to neuropilin and promote angiogenesis. Therefore, it is considered that the neuropilin function regulator of the present invention is also useful for controlling angiogenic function by VEGF.

本発明のニューロピリン機能調節剤は、セマフォリン３Ａ受容体であるニューロピリンに結合し、セマフォリン３Ａの機能を亢進することができる。すなわち、本発明のニューロピリン機能調節剤は、セマフォリン３Ａのアゴニストとして機能し得る。本発明のニューロピリン機能調節剤は、セマフォリン３Ａの機能を亢進することによって症状が改善される疾患の治療又は予防用途に使用することができる。そのような疾患としては、接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、汗疱などのそう痒性皮膚疾患；骨粗鬆症、原発性副甲状腺機能亢進症、骨軟化症、くる病、骨形成不全症、軟骨無形成症、大理石骨病などの骨代謝低下による骨関連疾患；等が挙げられる。 The neuropilin function regulator of the present invention can bind to semaphorin 3A receptor neuropilin and enhance the function of semaphorin 3A. That is, the neuropilin function regulator of the present invention can function as an agonist of semaphorin 3A. The neuropilin function regulator of the present invention can be used for the treatment or prevention of diseases in which symptoms are improved by enhancing the function of semaphorin 3A. Such diseases include pruritic skin diseases such as contact dermatitis, atopic dermatitis, seborrheic dermatitis, and sweat blisters; osteoporosis, primary hyperthyroidism, bone softening, wrinkles, bones. Bone-related diseases due to decreased bone metabolism such as dysplasia, osteoporosis, and marble bone disease; and the like.

また、本発明のニューロピリン機能調節剤は、セマフォリン３Ａ受容体であるニューロピリンに結合し、セマフォリン３Ａの機能を抑制することができる。すなわち、本発明のニューロピリン機能調節剤は、セマフォリン３Ａのアンタゴニストとしても機能し得る。本発明のニューロピリン機能調節剤は、セマフォリン３Ａの機能を抑制することによって症状が改善される疾患の治療用途に使用することができる。そのような用途としては、骨髄損傷等、損傷した神経組織の再生、癌転移の抑制、癌血管の新生の抑制などの抗腫瘍等
が挙げられる。 In addition, the neuropilin function regulator of the present invention can bind to neuropilin, which is a semaphorin 3A receptor, and suppress the function of semaphorin 3A. That is, the neuropilin function regulator of the present invention can also function as an antagonist of semaphorin 3A. The neuropilin function regulator of the present invention can be used for the treatment of diseases in which symptoms are improved by suppressing the function of semaphorin 3A. Examples of such applications include antitumors such as regeneration of damaged nerve tissue such as bone marrow injury, suppression of cancer metastasis, and suppression of new cancer blood vessels.

本発明のニューロピリン機能調節剤の使用量としては、特に限定されず、製剤形態、用途、投与対象等に応じて適宜設定するとよい。 The amount of the neuropilin function regulator of the present invention to be used is not particularly limited, and may be appropriately set according to the pharmaceutical form, use, administration target, and the like.

以上のように、植物由来セラミドを含む本発明のニューロピリン機能調節剤は、植物由来セラミドがニューロピリンと結合して、セマフォリン３Ａの機能を亢進したり、又はセマフォリン３Ａの機能を抑制することができる。本発明のニューロピリン機能調節剤は、特にニューロピリン１に結合することが好ましく、ニューロピリン１の機能調節剤であることが好ましい。そのため、本発明のニューロピリン機能調節剤は、セマフォリン３Ａの機能を亢進又は抑制することにより、症状が改善される疾患の治療又は予防用途に使用することができる。具体的には、本発明のニューロピリン機能調節剤は、そう痒抑制、骨代謝改善、神経組織再生、抗腫瘍等に好適に適用することができる。本発明のニューロピリン機能調節剤は、特にセマフォリン３Ａのアンタゴニストとして機能することにより有効な疾患の治療用途に適用することができる。 As described above, in the neuropilin function regulator of the present invention containing plant-derived ceramide, the plant-derived ceramide binds to neuropilin to enhance the function of semaphorin 3A or suppress the function of semaphorin 3A. be able to. The neuropyrin function regulator of the present invention preferably binds to neuropilin 1 in particular, and is preferably a function regulator of neuropilin 1. Therefore, the neuropilin function regulator of the present invention can be used for the treatment or prevention of diseases in which symptoms are improved by enhancing or suppressing the function of semaphorin 3A. Specifically, the neuropilin function regulator of the present invention can be suitably applied to pruritus suppression, bone metabolism improvement, nervous tissue regeneration, antitumor and the like. The neuropilin function regulator of the present invention can be applied to a therapeutic application for an effective disease, particularly by functioning as an antagonist of semaphorin 3A.

次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定されるものではない。 Next, the present invention will be described in more detail by way of examples, but the present invention is not limited to these examples.

＜コンニャク由来セラミド（ｋＣｅｒ）の調製＞
コンニャク由来グルコシルセラミド（ｋＧｌｃＣｅｒ，ＮＳ１７０３０２Ｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ，ｆｒｏｍＫｏｎｊａｃ，純度≧９９％（ＴＬＣ），株式会社長良サイエンス）に、ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｑｕｉＭ－７５０株由来のエンドグリコセラミダーゼＩを用いて加水分解を行って、グルコースを遊離させ、精製して、コンニャク由来セラミド（ｋＣｅｒ）を得た。 <Preparation of ceramide (kCer) derived from konjac>
Hydrolyzed konjac-derived glucosylceramide (kGlcCer, NS170302 Glucocerebroside, from Konjac, purity ≥99% (TLC), Nagara Science Co., Ltd.) using endoglycocceramide I derived from Rhodococcus equui M-750 strain. Was released and purified to obtain konjac-derived ceramide (kCer).

＜ＰＣ１２細胞の調製＞
ラットの副腎髄質由来の褐色細胞腫（ＰＣ１２細胞、ＰＣ１２ＨＳ）はヒューマンサイエンス研究資源バンクより分譲された。細胞は炭酸ガスインキュベータ（５％ＣＯ₂、３７℃）で培養した。培養には１０ｍＬの１０％牛胎児血清、１０％馬血清、及びｘ１００希釈ペニシリン・ストレプトマイシン（１０，０００ｕｎｉｔｓ・１０ｍｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて、１０－ｃｍプラスチック培養デッシュに接着させて培養した。プレコンフルエント細胞密度（５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）で幡種して３～４日後にコンフルエントになった時に、０．０５％トリプシンＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ）で接着した細胞を剥離させて分散した細胞をプレコンフルエントに新培地で希釈して新しい１０－ｃｍデッシュに幡種することにより継代培養しながら細胞を得た。得られた細胞を以下の各実験に用いた。 <Preparation of PC12 cells>
Pheochromocytoma derived from rat adrenal medulla (PC12 cells, PC12HS) was distributed by the Human Science Research Resources Bank. Cells were cultured in a carbon dioxide incubator (5% CO ₂ , 37 ° C). Cultures were performed using 10 mL of 10% fetal bovine serum, 10% horse serum, and Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) containing x100 diluted penicillin streptomycin (10,000 units, 10 mg / mL, Sigma), 10-cm plastic. It was adhered to the culture dish and cultured. When the cells were cultivated at a preconfluent cell density (5 × 10 ⁵ cells / mL) and became confluent 3 to 4 days later, the cells adhered with 0.05% trypsin EDTA solution (Gibco) were detached and dispersed. Was diluted with a new medium to preconfluent and seeded in a new 10-cm dish to obtain cells while subculturing. The obtained cells were used in each of the following experiments.

＜Ｎｒｐ１遺伝子発現が抑制されたＰＣ１２細胞の調製＞
セマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）の細胞膜レセプターであるニューロピリン１（Ｎｒｐ１）の遺伝子発現を、そのｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉によりノックダウンさせたＰＣ１２細胞を調製した。具体的には、ｓｉＮＲＰ１（ＲＳＳ３３２４２７：５’－ＧＣＡＣＣＵＡＣＡＵＣＡＵＣＵＵＵＧＣＡＣＣＡＡＡ－３’（配列番号１）、５’－ＵＵＵＧＧＵＧＣＡＡＡＧＡＵＧＡＵＧＵＡＧＧＵＧＣ－３’（配列番号２），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ネガテイブコントロールｓｉＮＧＣＴＲＬ（ｍｅｄｉｕｍＧＣＤｕｐｌｅｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^TM ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、トランスフェクションプロトコールに従って細胞を調製した。このような方法で調製した細胞（ｓｉＮＲＰ１処理した細胞）は、Ｎｒｐ１遺伝子発現およびタンパク発現が抑制されることを確認してから実験に用いた。 <Preparation of PC12 cells in which Nrp1 gene expression is suppressed>
PC12 cells were prepared in which the gene expression of neuropilin 1 (Nrp1), which is a cell membrane receptor of semaphorin 3A (Sema3A), was knocked down by RNA interference using the siRNA. Specifically, siNRP1 (RSS332427: 5'-GCACCUAUCAUCUUCUCCACAAA-3'(SEQ ID NO: 1), 5'-UUUGGUGCAAAGAUGAUAGGUGC-3'(SEQ ID NO: 2), Invitrogen), negative control siNGCTR. Cells were prepared according to the transfection protocol using the introduction reagent Lipofectamine ^TM 2000 (Invitrogen). The cells prepared by such a method (cells treated with siNRP1) were used in the experiment after confirming that Nrp1 gene expression and protein expression were suppressed.

実験例１
シグナル伝達阻害剤を用いたｋＣｅｒの突起伸長阻害の作用点について、図２に示すように検討した。具体的には、以下の通りに行った。 Experimental Example 1
The points of action of kCer's process elongation inhibition using a signal transduction inhibitor were examined as shown in FIG. Specifically, the procedure was as follows.

＜神経突起伸張阻害活性の測定＞
あらかじめ０．０１％ポリＬ－リジンで表面処理した１２－ウェル培養プレートに、ＰＣ１２細胞を７．５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｍＬで１ｍＬの血清を含むＤＭＥＭ培地とともに播種して一晩培養した。培養後に無血清のＤＭＥＭで接着細胞を洗浄した後、細胞をｔｒｋＡ経路の特異的阻害剤Ｋ２５２ａ（ＡｌｏｍｏｎｅＬａｂｓ）、Ｓｅｍａ３Ａ経路の特異的阻害剤ａｎｔｉ－ＮＲＰ１ｒｐＡｂ抗Ｎｒｐ１ラビット抗体（αＮｒｐ１）（Ｓｉｇｍａ）、上記で調製したｋＣｅｒ、及びＳｅｍａ３Ａ（Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｅ３Ａ）を用いて処理した。この処理は、Ｋ２５２ａ（０～１０．０ｎＭ）、αＮｒｐ１（５μｇ／ｍＬ）、ｋＣｅｒ（５０μＭ）、Ｓｅｍａ３Ａ（５μｇ／ｍＬ）をそれぞれ所定量で含む無血清のＤＭＥＭで細胞を洗浄することにより行った。各群４ウェルとした。前記処理の３０分後に、１００ｎｇ／ｍＬ神経成長因子（ＮＧＦ，２．５Ｓマウス由来，ＡｌｏｍｏｎｅＬａｂｓ）と０．０２５％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ培地１ｍＬに置換して、３日間培養した。
培養後に、１ｍＬの２％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ溶液を各ウェルに重層して２０分間固定処理を行った。その後、１ｍＬのＣＢＢ染色液（１％クマシーブリリアントブルー／５０％メタノールのＰＢＳ溶液）で２時間染色した。染色後、２ｍＬの１０％メタノール／ＰＢＳ溶液、ＰＢＳ溶液、脱イオン水で脱染して風乾した。
得られた細胞について、オールインオン蛍光顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７００、キーエンス）を用いて各ウェルから×２０倍率で明視野カラー撮影し、得られた細胞画像を、色相抽出プログラムによって染色性の高い細胞体と神経突起を含む細胞周囲部分に分離し、その相対比より比率（％）を算出して神経突起伸張活性を求めた。 <Measurement of neurite outgrowth inhibitory activity>
PC12 cells were seeded in 7.5 × 10 ⁴ cells / mL with DMEM medium containing 1 mL of serum on a 12-well culture plate surface-treated with 0.01% polyL-lysine and cultured overnight. After culturing, the adherent cells were washed with serum-free DMEM, and then the cells were subjected to trkA pathway-specific inhibitor K252a (Alomone Labs), Sema3A pathway-specific inhibitor anti-NRP1 rpAb anti-Nrp1 rabbit antibody (αNrp1) (Sigma). , The kCer prepared above, and Sema3A (Semaphorine 3A) were used for treatment. This treatment was performed by washing the cells with serum-free DMEM containing K252a (0 to 10.0 nM), αNrp1 (5 μg / mL), kCer (50 μM), and Sema3A (5 μg / mL) in predetermined amounts. .. Each group had 4 wells. Thirty minutes after the treatment, the cells were replaced with 1 mL of DMEM medium containing 100 ng / mL nerve growth factor (NGF, 2.5S mouse-derived, Alomone Labs) and 0.025% BSA, and cultured for 3 days.
After culturing, 1 mL of 2% glutaraldehyde / PBS solution was layered on each well and fixed for 20 minutes. Then, the cells were stained with 1 mL of CBB staining solution (1% Coomassie Brilliant Blue / 50% methanol in PBS solution) for 2 hours. After staining, the cells were decontaminated with 2 mL of 10% methanol / PBS solution, PBS solution, and deionized water and air-dried.
The obtained cells were photographed in bright-field color from each well using an all-in-on fluorescent microscope (BZ-X700, Keyence) at a magnification of × 20, and the obtained cell images were photographed with highly stainable cells by a hue extraction program. The cells were separated into the body and the pericellular part including the neurites, and the ratio (%) was calculated from the relative ratio to determine the neurite outgrowth activity.

＜統計処理＞
得られたデータについて、統計解析ソフトＧａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．ｍＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法による有意差検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）を行った。 <Statistical processing>
For the obtained data, a significant difference test (*** P <0.001, *** P <0.01, * P) by the Bonferroni method using the statistical analysis software GaphPad Prism (GraphPad Software Inc.m CA, USA). <0.05) was performed.

結果を図５（Ａ）～図５（Ｃ）に示す。図５（Ａ）によれば、Ｋ２５２ａ処理によりＮＧＦ誘導神経突起伸張活性は用量依存的に阻害されることが示された（図５（Ａ）黒の棒グラフ）。同条件でさらに５０μＭｋＣｅｒを添加することによって、ｋＣｅｒはＫ２５２ａの神経突起伸張阻害作用に対して相乗的阻害作用を示した（図５（Ａ）白の棒グラフ）。一方、５μｇ／ｍＬ αＮｒｐ１の添加により、Ｋ２５２ａの神経突起伸張阻害作用は影響を受けなかったが（図５（Ｂ）黒の棒グラフ）、ｋＣｅｒの相乗的阻害作用はαＮｒｐ１を添加することによって減弱して消失した（図５（Ｂ）白の棒グラフ）。次に、αＮｒｐ１添加のみでは神経突起伸張作用に影響しなかったが（図５（Ｃ）黒の棒グラフ）、ｋＣｅｒによる神経突起伸長阻害はαＮｒｐ１によって用量依存的に減弱して消失した（図５（Ｃ）白の棒グラフ）。図５に示した結果より、ｋＣｅｒはｔｒｋＡシグナル経路ではなくＳｅｍａ３Ａ経路で作用していることが示唆された。 The results are shown in FIGS. 5 (A) to 5 (C). According to FIG. 5 (A), it was shown that K252a treatment inhibited NGF-induced neurite outgrowth activity in a dose-dependent manner (FIG. 5 (A) black bar graph). By further adding 50 μM kCer under the same conditions, kCer showed a synergistic inhibitory effect on the neurite outgrowth inhibitory effect of K252a (Fig. 5 (A) white bar graph). On the other hand, the addition of 5 μg / mL αNrp1 did not affect the neurite outgrowth inhibitory effect of K252a (Fig. 5 (B) black bar graph), but the synergistic inhibitory effect of kCer was attenuated by the addition of αNrp1. Disappeared (Fig. 5 (B) white bar graph). Next, the addition of αNrp1 alone did not affect the neurite outgrowth effect (Fig. 5 (C) black bar graph), but the inhibition of neurite outgrowth by kCer was attenuated and disappeared by αNrp1 in a dose-dependent manner (Fig. 5 (C)). C) White bar graph). The results shown in FIG. 5 suggest that kCer acts on the Sema3A pathway rather than the trkA signaling pathway.

実験例２
シグナル伝達阻害剤を用いたｋＣｅｒのＣＲＭＰ２リン酸化の作用点について、図３に示すように検討した。具体的には、以下の方法で行った。 Experimental Example 2
The site of action of CRMP2 phosphorylation of kCer using a signal transduction inhibitor was examined as shown in FIG. Specifically, it was carried out by the following method.

＜ＣＲＭＰ２のリン酸化活性の測定＞
６－ウェルプレートに４×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１．５ｍＬの血清含有ＤＭＥＭ培地に播種して２４時間培養したＰＣ１２細胞を、次いで１００ｎｇ／ｍＬＮＧＦを含む培地に交換して４８時間分化させた。その後、所定の５０μＭｋＣｅｒ、５００ｎｇ／ｍＬＳｅｍａ３Ａ、５μｇ／ｍＬ αＮｒｐ１をそれぞれ含む無血清ＤＭＥＭ培地に置換して２４時間培養した。培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ｃＣｏｍｐｌｅｔｅ（ロッシェ）とＰｈｏｓＳＴＯＰフォスファターゼインヒビターカクテル（ロッシェ）を含むＲＩＰＡ溶解緩衝液（和光純薬工業）で細胞タンパク質を溶解して回収した。
タンパク液はビシコニン酸－タンパク定量キット（ナカライテスク）により定量した。細胞タンパクを電気泳動用ＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒＳｏｌｕｔｉｏｎ（２ＭＥ＋ｘ４，和光純薬工業）と水で希釈して１μｇ／μＬに調製して、１００℃で５分間の変性処理を行った後に、ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，和光純薬工業、ＳｕｐｅｒＳｅｐＴＭＡｃｅ，５－２０％）で１０μｇのタンパクを泳動分離した。泳動したゲルはＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐｔｒａｎｓｆｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ０．４５μｍ、ミリポア）にトランスブロットＳＤセミドライ転写セル（バイオラッド）で転写した。その後、メンブレンはＢｌｏｃｋｉｎｇＯｎｅ（ナカライテスク）で１時間処理した後に一次抗体液（１０％ＢｌｏｃｋｉｎｇＯｎｅ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ・Ｔｒｉｓ・Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳＴ））中で振とうした。翌日に、メンブレンをＴＢＳＴで洗浄して、二次抗体液（ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体を１０％ＢｌｏｃｋｉｎｇＯｎｅ／ＴＢＳＴで１：２０００～４０００に希釈）中で室温で１時間振とうした。その後、ＴＢＳＴで洗浄後にケミルミワンＳｕｐｅｒ（ナカライテスク）を用いて蛍光・化学ルミネッセンスイメージングシステム（ケンブリッジ）により標的タンパク質を検出した。タンパク量はＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＤＰＨ）に対する相対量比で定量化した。得られた値について、実験例１と同じ方法で統計処理を行った。一次抗体としてはａｎｔｉ－ＣＲＭＰ２ｒｐＡｂ、ａｎｔｉ－ｐＣＲＭＰ２ｒｐＡｂ（ｐｔｈｒ５０９）、ａｎｔｉ－ＮＲＰ１ｒｐＡｂ（Ｓｉｇｍａ）、ａｎｔｉ－β－ａｃｔｉｎｍＡｂ（和光純薬工業）、ａｎｔｉ－ＧＡＰＤＨｍＡｂ（コスモバイオ）を用いた。 <Measurement of phosphorylation activity of CRMP2>
PC12 cells seeded in 6-well plates in 4 × 10 ⁵ cells / mL, 1.5 mL serum-containing DMEM medium and cultured for 24 hours were then replaced with a medium containing 100 ng / mL NGF for 48 hours of differentiation. .. Then, the cells were replaced with serum-free DMEM medium containing the predetermined 50 μM kCer, 500 ng / mL Sema3A, 5 μg / mL αNrp1 and cultured for 24 hours. After culturing, the cells were washed with PBS, and the cell protein was lysed and recovered with a RIPA lysis buffer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing cComplete (Roche) and PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail (Roche).
The protein solution was quantified using the bisiconic acid-protein quantification kit (Nacalai Tesque). Cell protein is diluted with Sample Buffer Solution for electrophoresis (2ME + x4, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and water to prepare 1 μg / μL, and after denaturation treatment at 100 ° C. for 5 minutes, polyacrylamide gel (SDS-) 10 μg of protein was electrophoretically separated by PAGE, Wako Pure Chemical Industries, SuperSepTMAce, 5-20%). The electrophoresed gel was transferred to a PVDF membrane (Immobilon-P transfer membrane 0.45 μm, Millipore) with a transblot SD semi-dry transfer cell (Bio-Rad). The membrane was then treated with Blocking One (Nacalai Tesque) for 1 hour and then shaken in a primary antibody solution (10% Blocking One / 0.05% Tween Tris Saline (TBST)). The next day, the membrane was washed with TBST and shaken in a secondary antibody solution (wasabi peroxidase-labeled secondary antibody diluted 1: 2000-4000 with 10% Blocking One / TBST) at room temperature for 1 hour. Then, after washing with TBST, the target protein was detected by a fluorescence / chemical luminescence imaging system (Cambridge) using Chemilmiwan Super (Nacalai Tesque). The amount of protein was quantified as a relative amount ratio to Glyceraldehyde 3-phosphate dehydogenase (GADPH). The obtained values were statistically processed in the same manner as in Experimental Example 1. As the primary antibody, anti-CRMP2 rpAb, anti-pCRMP2 rpAb (pthr509), anti-NRP1 rpAb (Sigma), anti-β-actin mAb (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and anti-GAPDH mAb (Cosmo Bio) were used.

結果を図６（Ａ）に示す。図６（Ａ）から、Ｓｅｍａ３又はｋＣｅｒの添加によりＣＲＭＰ２のリン酸化が誘導されることが示され、また、Ｓｅｍａ３Ａ又はｋＣｅｒの添加と同時にαＮｒｐ１を添加すると、リン酸化が減弱消失されることが示された。これらの結果より、ｋＣｅｒはＳｅｍａ３Ａシグナル経路のＮｒｐ１に作用している可能性が示唆された。 The results are shown in FIG. 6 (A). FIG. 6A shows that the addition of Sema3 or kCer induces phosphorylation of CRMP2, and that the addition of αNrp1 at the same time as the addition of Sema3A or kCer attenuates and eliminates phosphorylation. Was done. These results suggest that kCer may act on Nrp1 of the Sema3A signaling pathway.

実験例３
Ｎｒｐ１遺伝子発現をｓｉＲＮＡで抑制することによるｋＣｅｒのＣＲＭＰリン酸化の作用点の検討について、図４に示すように、具体的には以下の方法で行った。すなわち、６－ウェルプレートに４×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１．５ｍＬの血清含有ＤＭＥＭ培地に播種して２４時間培養したＰＣ１２細胞を、１００ｎｇ／ｍＬＮＧＦを含む培地に交換して２４時間分化させた。そして、前述のようにｓｉＮＲＰ１、ｓｉＮＧＣＴＲＬで細胞を処理して、その細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。その後、５０μＭｋＣｅｒ、５００ｎｇ／ｍＬＳｅｍａ３Ａをそれぞれ含む無血清ＤＭＥＭ培地に置換して２４時間培養した。培養後、実験例２の方法と同様にして、細胞タンパク質を溶解して回収し、ウエスタンブロットを行った。 Experimental Example 3
As shown in FIG. 4, the site of action of CRMP phosphorylation of kCer by suppressing Nrp1 gene expression with siRNA was specifically investigated by the following method. That is, PC12 cells seeded in 4 × 10 ⁵ cells / mL, 1.5 mL serum-containing DMEM medium on a 6-well plate and cultured for 24 hours were replaced with a medium containing 100 ng / mL NGF and differentiated for 24 hours. rice field. Then, the cells were treated with siNRP1 and siNGCTRL as described above, and the cells were cultured in serum-free DMEM medium for 24 hours. Then, the cells were replaced with serum-free DMEM medium containing 50 μM kCer and 500 ng / mL Sema3A, respectively, and cultured for 24 hours. After culturing, the cell protein was lysed and recovered in the same manner as in Experimental Example 2, and Western blotting was performed.

結果を図６（Ｂ）に示す。ｓｉＮＲＰ１で細胞を処理することによりＮｒｐ１タンパクの発現がウエスタンブロットメンブレン上から減弱消失した（図６（Ｂ）、レーン３）。また、ｓｉＮＲＰ１処理細胞ではＳｅｍａ３Ａ又はｋＣｅｒで誘導されるＣＲＭＰ２のリン酸化も減弱消失した（図６（Ｂ）、レーン５、７）。図６（Ｂ）に示した結果より、ｋＣｅｒの作用はＮｒｐ１と直接に作用することで活性を有することが示唆された。 The results are shown in FIG. 6 (B). By treating the cells with siNRP1, the expression of Nrp1 protein was attenuated and abolished from the Western blot membrane (FIG. 6 (B), lane 3). In addition, in siNRP1 treated cells, phosphorylation of CRMP2 induced by Sema3A or kCer was also attenuated and disappeared (FIGS. 6 (B), lanes 5 and 7). From the results shown in FIG. 6 (B), it was suggested that the action of kCer has activity by acting directly with Nrp1.

実験例４
あらかじめ０．０１％ポリＬ－リジンで表面処理した１２－ウェル培養プレートにＰＣ１２細胞を７．５ｘ１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｍＬで、血清を含む１ｍＬのＤＭＥＭ培地とともに播種して一晩培養した。培養後に無血清のＤＭＥＭで接着細胞を洗浄した後に、１００ｎｇ／ｍＬ神経成長因子（ＮＧＦ，２．５Ｓマウス由来，ＡｌｏｍｏｎｅＬａｂｓ）と、０．０２５％ＢＳＡと、Ｓｅｍａ３Ａ（０、０．０１、０．１、１又は１０μＭ）と、ｋＣｅｒ（０、０．０１、５又は２５μＭ）をそれぞれ所定量含むＤＭＥＭ培地１ｍＬに置換して３日間培養した。各群４ウェルとした。培養後、実験例１と同様の方法で、細胞を染色し、蛍光顕微鏡で画像を得て、神経突起伸長活性を算出し、統計処理した。結果を図７に示す。 Experimental Example 4
PC12 cells were seeded at 7.5x10 ⁴ cells / mL in a 12-well culture plate surface-treated with 0.01% poly L-lysine in advance with 1 mL of DMEM medium containing serum and cultured overnight. After culturing, the adherent cells were washed with serum-free DMEM, followed by 100 ng / mL nerve growth factor (NGF, 2.5S mouse-derived, Alomone Labs), 0.025% BSA, and Sema3A (0, 0.01, 0). .1, 1 or 10 μM) and kCer (0, 0.01, 5 or 25 μM) were replaced with 1 mL of DMEM medium containing a predetermined amount, respectively, and cultured for 3 days. Each group had 4 wells. After culturing, the cells were stained by the same method as in Experimental Example 1, images were obtained with a fluorescence microscope, neurite outgrowth activity was calculated, and statistical processing was performed. The results are shown in FIG.

また、培養後の細胞について、実験例２と同様の方法で、ＰＢＳで洗浄した後、細胞タンパク質を溶解して回収し、ＣＲＭＰ２のリン酸化活性を測定した。統計処理は、実験例１と同様の方法で行った。結果を図８に示す。 In addition, the cultured cells were washed with PBS in the same manner as in Experimental Example 2, then the cell protein was lysed and recovered, and the phosphorylation activity of CRMP2 was measured. Statistical processing was performed in the same manner as in Experimental Example 1. The results are shown in FIG.

図７によれば、低濃度０．０１μＭＳｅｍａ３Ａに対してはｋＣｅｒは突起伸張阻害の相乗作用を示したが、高濃度１０μＭＳｅｍａ３Ａに対してはｋＣｅｒはＳｅｍａ３Ａの突起伸張阻害を減弱する相反的作用を示した。図８によれば、Ｓｅｍａ３Ａの用量依存的な作用に対して、ｋＣｅｒはＳｅｍａ３Ａシグナル伝達経路の下流にあるＣＲＭＰ２のリン酸化作用においても高濃度１０μＭＳｅｍａ３Ａでは逆にＣＲＭＰ２のリン酸化作用を減弱する相反作用を示した。図７、図８に示した結果より、ｋＣｅｒはＳｅｍａ３Ａのパーシャルアゴニストとして、高濃度Ｓｅｍａ３Ａに対してはアンタゴニスト作用を示すことが認められた。 According to FIG. 7, kCer showed a synergistic effect of inhibiting projection elongation at a low concentration of 0.01 μM Sema3A, whereas kCer had a reciprocal effect of reducing the inhibition of projection elongation of Sema3A at a high concentration of 10 μM Sema3A. showed that. According to FIG. 8, for the dose-dependent action of Sema3A, kCer conversely attenuates the phosphorylation action of CRMP2 at a high concentration of 10 μM Sema3A even in the phosphorylation action of CRMP2 downstream of the Sema3A signal transduction pathway. Showed action. From the results shown in FIGS. 7 and 8, it was confirmed that kCer has an antagonistic effect on high-concentration Sema3A as a partial agonist of Sema3A.

実験例５
ｋＣｅｒのＳｅｍａ３ＡレセプターＮｒｐ１との結合作用について、以下の方法で測定した。
＜細胞膜レセプターＮｒｐ１との結合の測定＞
Ｓｅｍａ３Ａの細胞膜レセプターであるＮｒｐ１への結合を調べるために、ヒト組み換え体Ｓｅｍａ３Ａ（ｒｈＳＥＭＡ３Ａ、和光純薬工業）を、フルオレセイン標識キットＮＨ２（同仁化学）を用いて、標識したＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａを調製した。ＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａのタンパク量に対する相対蛍光単位は３２，１００ＲＦＵ／ｐｍｏｌであった。ポリＬ－リジンで表面処理した９６－ウェル蛍光測定用培養マイクロプレートに１×１０⁵個のＰＣ１２細胞を播種して一晩３７℃で培養後、１％ＢＳＡ／１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄し、その後、終濃度０．３７５μＭから１０μＭのＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａを含む１％ＢＳＡ／１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液で置換して、２２℃で９０分間インキュベートした。その後に、細胞を１％ＢＳＡ／１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄して、各ウェルの蛍光量を、蛍光ウェルリーダー（ＡｐｐｌｉｓｋａｎＴＭ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２５ｎｍで測定した。
ｋＣｅｒ及びその他のセラミドのリガンド置換効果の測定には１０μＭＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａと、ｋＣｅｒ、Ｃ１６セラミド（Ｃ１６Ｃｅｒ、Ｎ－Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｏ－ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）、Ｃ１８セラミド（Ｃ１８Ｃｅｒ、Ｎ－ｓｔｅａｒｏｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｏ－ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）、Ｃ２４セラミド（Ｃ２４Ｃｅｒ、Ｎ－Ｌｉｎｇｏｃｅｒｏｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｏ－ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）、又はＣ２セラミド（Ｃ２Ｃｅｒ、Ｎ－Ａｃｅｔｏｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｏ－ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）を、０．０５、０．１８７５、０．３７５、０．７５、１．０、１．２５、２．５、５．０、１０、２０、５０、又は１００μＭを含む１％ＢＳＡ／１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液で，ウェルプレートの細胞を上記と同様に処理した後に、蛍光量を測定した。
また、１０μＭＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａと、１０μＭＳｅｍａ３Ａ又は１００μＭｋＣｅｒで細胞を処理した場合について、共焦点レーザ走査型蛍光顕微鏡（ＦｌｕｏｖｉｅｗＦＶ１０ｉ，ＥＸ４９０，ＥＭ５２５，オリンパス）で観察した。コントロールとして、１０μＭＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａのみで細胞を処理した場合を観察した。 Experimental Example 5
The binding action of kCer on the Sema3A receptor Nrp1 was measured by the following method.
<Measurement of binding to cell membrane receptor Nrp1>
In order to investigate the binding of Sema3A to the cell membrane receptor Nrp1, a human recombinant Sema3A (rhSEMA3A, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was prepared using the fluorescein labeling kit NH2 (Dojin Kagaku) to prepare labeled FITC-Sema3A. The relative fluorescence unit for the amount of protein in FITC-Sema3A was 32,100 RFU / pmol. 1 × 10 ⁵ PC12 cells were seeded on a 96-well fluorescence measurement culture microplate surface-treated with poly L-lysine, cultured at 37 ° C overnight, washed with 1% BSA / 10 mM HEPES buffer, and washed with 1% BSA / 10 mM HEPES buffer. It was then replaced with 1% BSA / 10 mM HEPES buffer containing FITC-Sema3A at a final concentration of 0.375 μM to 10 μM and incubated at 22 ° C. for 90 minutes. After that, the cells were washed with 1% BSA / 10 mM HEPES buffer, and the fluorescence amount of each well was measured at an excitation wavelength of 490 nm and a fluorescence wavelength of 525 nm using a fluorescence well reader (AppliscanTM, Thermo Fisher).
For the measurement of the ligand substitution effect of kCer and other ceramides, 10 μM FITC-Sema3A, kCer, C16 ceramide (C16Cer, N-Palmitoyl-D-erythro-sphingosine), C18 ceramide (C18Cer, N-ceramide-D-erythro). Sphingosine), C24 ceramide (C24Cer, N-Lingocelloyl-D-erythro-sphingosine), or C2 ceramide (C2Cer, N-Acetoyl-D-erythro-sphingosine), 0.05, 0.1875, 0.375, 0. Wellplate cells were treated as above with 1% BSA / 10 mM HEEPS buffer containing .75, 1.0, 1.25, 2.5, 5.0, 10, 20, 50, or 100 μM. Later, the amount of fluorescence was measured.
The cells treated with 10 μM FITC-Sema3A and 10 μM Sema3A or 100 μM kCer were observed with a confocal laser scanning fluorescence microscope (Fluorescein FV10i, EX490, EM525, Olympus). As a control, the case where the cells were treated with only 10 μM FITC-Sema3A was observed.

結果を図９（Ａ）～図９（Ｂ）、表１及び表２に示す。図９（Ａ）は、蛍光画像であり、図９（Ｂ）は、各セラミドの量に対する細胞に結合した蛍光量を示すグラフである。１０μＭＦＩＴＣ（フルオレセイン標識）－Ｓｅｍａ３Ａを用いたＰＣ１２細胞との結合を調べた結果、図９（Ａ）のコントロールのような結合が蛍光画像で観察された。１０μＭＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａに加えて、１０μＭＳｅｍａ３Ａ又は１００μＭｋＣｅｒで細胞を処理すると、コントロールに比べてＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａの蛍光量の顕著な減弱が起きた。蛍光の減弱はＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａが細胞膜レセプターであるＮｒｐ１に結合する際の置換効果と考えられた。さらに、ＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａ（０．３７５、０．７５、１．２５、２．５、５．０、１０μＭ）で細胞を処理することで、ＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａの細胞への用量依存的な結合が観察されたが、２．５μＭ以上では結合量に飽和が見られた。ＦＩＴＣ－Ｓｅｍａ３Ａ用量曲線からスキャッチャードプロットすることにより下記の表１の結合定数が算出された。 The results are shown in FIGS. 9 (A) to 9 (B), Tables 1 and 2. 9 (A) is a fluorescence image, and FIG. 9 (B) is a graph showing the amount of fluorescence bound to cells with respect to the amount of each ceramide. As a result of examining the binding to PC12 cells using 10 μM FITC (fluorescein label) -Sema3A, the binding like the control in FIG. 9 (A) was observed in the fluorescent image. Treatment of cells with 10 μM Sema3A or 100 μM kCer in addition to 10 μM FITC-Sema3A resulted in a marked attenuation of the fluorescence level of FITC-Sema3A compared to the control. The attenuation of fluorescence was considered to be a substitution effect when FITC-Sema3A binds to the cell membrane receptor Nrp1. Furthermore, by treating the cells with FITC-Sema3A (0.375, 0.75, 1.25, 2.5, 5.0, 10 μM), dose-dependent binding of FITC-Sema3A to the cells was observed. However, saturation was observed in the binding amount above 2.5 μM. The binding constants in Table 1 below were calculated by scatchard plotting from the FITC-Sema3A dose curve.

次に、１０μＭＳｅｍａ３Ａの細胞への結合に対してＳｅｍａ３Ａ、ｋＣｅｒ、Ｃ１６Ｃｅｒ、Ｃ１８Ｃｅｒ、Ｃ２４Ｃｅｒ、又はＣ２Ｃｅｒの置換効果を調べた結果、Ｓｅｍａ３ＡとｋＣｅｒは用量依存的置換効果を示したが、Ｃ１６Ｃｅｒ、Ｃ１８Ｃｅｒ、Ｃ２４Ｃｅｒ、又はＣ２Ｃｅｒにはそのような効果は認められなかった（図９（Ｂ））。Ｓｅｍａ３ＡとｋＣｅｒの置換効果によるＩＣ₅₀を表２に示した。Ｃｈｅｎｇ－Ｐｒｕｓｏｆｆの変換式に従って算出した置換効果のＫｉは３μＭであった。 Next, as a result of examining the substitution effect of Sema3A, kCer, C16Cer, C18Cer, C24Cer, or C2Cer on the binding of 10 μM Sema3A to cells, Sema3A and kCer showed a dose-dependent substitution effect, but C16Cer and C18Cer. , C24Cer, or C2Cer did not show such an effect (FIG. 9 (B)). Table 2 shows the IC ₅₀ due to the substitution effect of Sema3A and kCer. The Ki of the substitution effect calculated according to the conversion formula of Cheng-Prusoff was 3 μM.

図９に示した結果より、ｋＣｅｒはＳｅｍａ３ＡのＮｒｐ１結合に対して置換効果を示すことが明らかになった。 From the results shown in FIG. 9, it was clarified that kCer showed a substitution effect on the Nrp1 bond of Sema3A.

実験例６
＜バイオレイヤー干渉法によるＮｒｐ１との分子間結合の測定＞
０．３％ｆａｔｔｙａｃｉｄ－ｆｒｅｅＢＳＡ／ＤＰＢＳ緩衝液により可溶化したｋＣｅｒ、Ｃ１６Ｃｅｒ、Ｃ１８Ｃｅｒ、Ｃ２４Ｃｅｒ、又はＣ２Ｃｅｒをアナライトとして、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｍｏｕｓｅｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－１（Ｎｒｐ，Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ６－Ｈｉｓｔａｇ，Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍ）をリガンドとして、Ｂｌｉｚ（プライムテック）を用いてバイオレイヤー干渉法による分子間結合測定を行った。０．６、０．３、又は０．１５μＭＳｅｍａ３Ａ（ｒｈＳＥＭＡ３Ａ、和光純薬工業）をアナライトとして結合相と解離相からｃｕｒｖｅ－ｆｉｔｔｉｎｇで求めた反応速度定数（結合速度Ｋａ，解離速度Ｋｄ）及び解離定数ＫＤを、ｋＣｅｒ、Ｃ１６Ｃｅｒ、Ｃ１８Ｃｅｒ、Ｃ２４Ｃｅｒ、又はＣ２Ｃｅｒと比較検討した。リガンドの固相化にはＮｉ－ＮＴＡセンサー（１４８２０２１４、プライムテック）を用いた。結果を表３及び図１０に示す。 Experimental Example 6
<Measurement of intermolecular bond with Nrp1 by biolayer interferometry>
Recombinant mouse neuropilin-1 (Nrp, C-terminal 6-Histage, Rp, C-terminal 6-Histidine-Tag, using kCer, C16Cer, C18Cer, C24Cer, or C2Cer solubilized with 0.3% fatty acid-free BSA / DPBS buffer as an analyst. ) Was used as a ligand, and the molecular binding was measured by the biolayer interference method using Bliz (Prime Tech). Reaction rate constants (binding rate Ka, dissociation rate Kd) obtained by curve-fitting from the bound phase and dissociated phase using 0.6, 0.3, or 0.15 μM Sema3A (rhSEMA3A, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as an analyst and The dissociation constant KD was compared with kCer, C16Cer, C18Cer, C24Cer, or C2Cer. A Ni-NTA sensor (14820214, Prime Tech) was used for immobilization of the ligand. The results are shown in Table 3 and FIG.

図１０から、Ｒｍａｘでは弱いながらｋＣｅｒが直接にＮｒｐ１に結合できることが示された。その結合定数は表３に示したようにｋＣｅｒのＫＤ値が５．０５７μＭであり、Ｓｅｍａ３Ａの３．６倍であった。他方の反応速度定数で比較を行うと、Ｋａは６７１２．０と５８２６．３であり大きな差異はなかったが、Ｋｄが４．３倍であり、ｋＣｅｒのＫＤ値は解離速度の寄与が大きいと考えられた。他方、Ｃ１６ＣｅｒとＣ１８ＣｅｒではＲｍａｘがＳｅｍａ３Ａの１／５０以下であり、ＫＤの算出は不可能（Ｎ／Ａ）であった。しかしながら、結合相と解離相から各々算出された反応速度定数で比較検討したところ、Ｋａが１０⁵以上であり、Ｋａも０．１と比較的大きかったので、その結合は非特異的な吸着によって起きており解離も容易であるということが考察された。図１０の結果より、ｋＣｅｒはＮｒｐ１分子に対して結合する活性を持っていることが確認された。 From FIG. 10, it was shown that kCer can directly bind to Nrp1 although it is weak at Rmax. As shown in Table 3, the KD value of kCer was 5.057 μM, which was 3.6 times that of Sema3A. Comparing with the other reaction rate constants, Ka was 6712.0 and 5826.3, which were not significantly different, but Kd was 4.3 times, and the KD value of kCer was largely contributed by the dissociation rate. it was thought. On the other hand, in C16Cer and C18Cer, Rmax was 1/50 or less of Sema3A, and it was impossible to calculate KD (N / A). However, when the reaction rate constants calculated from the bound phase and the dissociated phase were compared and examined, Ka was ¹⁰⁵ or more and Ka was also relatively large at 0.1, so that the binding was due to non-specific adsorption. It was considered that it was awake and easy to dissociate. From the results shown in FIG. 10, it was confirmed that kCer has an activity of binding to the Nrp1 molecule.

実験例７
＜示差走査熱量測定による熱安定性の測定＞
ｋＣｅｒ、ｋＧｌｃＣｅｒ、Ｃ２４Ｃｅｒ、Ｃ１８Ｃｅｒ、Ｃ１６Ｃｅｒ、Ｃ８Ｃｅｒ（Ｃ８セラミド、Ｎ－Ｏｃｔａｎｏｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｏ－ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）、Ｃ２Ｃｅｒを、０．３％ＢＳＡを含むＤＰＢＳ緩衝液で１００μＭに調製した。測定はＭｉｃｒｏＣａｌＶＰ－ＣａｐｉｌｌａｒｙＤＳＣ（Ｍａｌｖｅｒｎ）で行い、２０℃から９０℃まで走査速度０．２℃／分で昇温した。測定結果はＤＰＢＳ緩衝液の測定値を差し引くことで補正を行った。測定チャートを用いてＭｉｃｒｏｃａｌ：ＣａｐｉｌｌａｒｙＤＳＣＡｕｔｏｍａｔｅｄＡｎａｌｙｓｉｓにより解析し、融解温度（Ｔｍ）とエントロピー変化量（ΔＨ）を求めた。 Experimental Example 7
<Measurement of thermal stability by differential scanning calorimetry>
kCer, kGlcCer, C24Cer, C18Cer, C16Cer, C8Cer (C8 ceramide, N-Octanoyl-D-erythro-sphingosine) and C2Cer were prepared in 100 μM with DPBS buffer containing 0.3% BSA. The measurement was carried out by MicroCal VP-Capillary DSC (Malvern), and the temperature was raised from 20 ° C. to 90 ° C. at a scanning speed of 0.2 ° C./min. The measurement results were corrected by subtracting the measured values of DPBS buffer. Analysis was performed by Micro cal: Capillary DSC Automated Analysis using a measurement chart, and the melting temperature (Tm) and the amount of change in entropy (ΔH) were determined.

ｋＣｅｒ、ＢＳＡ、ｋＧｌｃＣｅｒの昇温比熱変化の結果を図１１に示し、各サンプルの解析結果を表４に示した。ｋＣｅｒはＢＳＡ単独に比べＴｍの温度が上昇していた。すなわちＢＳＡにｋＣｅｒが結合したことで、ＢＳＡの安定性が増したことを示している。また、ΔＨがＢＳＡやｋＧｌｃＣｅｒがｋＣｅｒより減少していることから、ＢＳＡと複合体を形成する際にグルコースが外れることで熱力学的パラメータに違いが出来ると考えられる。脂肪酸側鎖長の異なるセラミドと比較するとＴｍとΔＨともに、炭化水素の短いＣ８セラミドやＣ２セラミドにより近い傾向を示した（表４）。この結果から、ＫＣｅｒはＣ１６ＣｅｒやＣ１８Ｃｅｒとは一部異なる形でＢＳＡと複合体を形成し、Ｎｒｐ１への特異的な結合活性を示すと考えられる。 The results of the temperature change specific heat change of kCer, BSA, and kGlcCer are shown in FIG. 11, and the analysis results of each sample are shown in Table 4. The temperature of tm of kCer was higher than that of BSA alone. That is, it is shown that the stability of BSA is increased by the binding of kCer to BSA. In addition, since ΔH is lower than BSA and kGlcCer than kCer, it is considered that the thermodynamic parameters can be different due to the release of glucose when forming a complex with BSA. Compared with ceramides having different fatty acid side chain lengths, both Tm and ΔH tended to be closer to C8 ceramide and C2 ceramide having short hydrocarbons (Table 4). From this result, it is considered that KCer forms a complex with BSA in a form partially different from that of C16Cer and C18Cer, and exhibits specific binding activity to Nrp1.

Claims

A neuropilin function regulator containing plant-derived ceramide,
The plant-derived ceramides are trans-4, cis-8-sphingazienin, cis4-cis8-sphingazienin, trans4-trans8-sphingazienin, and cis4-trans8-sphingazier. A neuropyrin function regulator having a structure in which a fatty acid having 14 to 24 carbon atoms is bound to nin, 4-hydroxy-cis-8-sphingenin, or 4-hydroshiki-trans 8-sphingenin.

The neuropilin function regulator according to claim 1, which is used as an antagonist of semaphorin 3A.