JP7035972B2

JP7035972B2 - 核酸配列計測用デバイス

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Publication number: JP7035972B2
Application number: JP2018211188A
Authority: JP
Inventors: 崇蓼沼; 祐樹宮内; 朋之田口
Original assignee: Yokogawa Electric Corp
Current assignee: Yokogawa Electric Corp
Priority date: 2018-11-09
Filing date: 2018-11-09
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2038-11-09
Also published as: WO2020095657A1; EP3878938A1; EP3878938A4; US12215380B2; CN112996899B; JP2020074726A; CN112996899A; US20220042080A1

Description

本発明は、ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測用デバイスに関する。

ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測方法としては、蛍光プローブと消光プローブを用いた、核酸検出工程が簡素化された核酸配列計測方法が報告されている（特許文献１）。特許文献１の方法においては、ターゲットが存在しないときには、蛍光プローブと消光プローブに存在する結合部を介する蛍光プローブと消光プローブとの結合が維持されて、蛍光分子に接近した消光分子の蛍光が消光され、ターゲットが存在すると、蛍光プローブまたは消光プローブに存在する検出部にターゲットが結合して、前記結合部を介する結合が解消され、消光分子が蛍光分子から離れることにより蛍光分子が蛍光を呈する。この蛍光を測定することにより、サンプル中に含まれるターゲットを計測することができる。

特許第５９２８９０６号公報

しかしながら、特許文献１の方法は、蛍光分子が付加された蛍光プローブと、消光分子が付加された消光プローブとが、蛍光プローブおよび消光プローブ上の一部に存在するお互いに相補的な核酸配列を有する結合部で結合するため、蛍光プローブと消光プローブとの結合力が弱く、消光分子による蛍光の抑制が十分とはいえないことから、ターゲットが存在しないときの蛍光、即ちオフセット光が高くなる傾向がある。オフセット光が高くなると、ターゲットが低濃度である場合、蛍光の変化を判別しにくくなり、検出感度が低下する。

また、特許文献１の方法では、蛍光プローブおよび消光プローブ上の一部に存在する、お互いに相補的な核酸配列を有する前記結合部の核酸配列の長さを適切に決める必要があり、前記結合部の核酸配列が短すぎると、蛍光プローブと消光プローブとが、前記結合部を介して結合することができず、蛍光プローブを消光プローブで消光することができなくなる。反対に、前記結合部の核酸配列が長すぎると、前記結合部を介する蛍光プローブと消光プローブとの結合が強すぎて、ターゲットが供給されても、蛍光プローブと消光プローブとが結合したままで離れず、サンプル中のターゲットを計測することができない。

したがって、本発明の目的は、ターゲットが存在しないときのオフセット光を低下させることにより、検出感度に優れ、また、蛍光プローブと消光プローブとの結合部の長さに依存せずに、ターゲットを検出することが可能な核酸配列計測用デバイスを提供することにある。

上記の目的を達成するために、本発明は以下の構成を採用した。
［１］ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測用デバイスにおいて、
蛍光分子が所定の位置に付加された蛍光プローブと、
消光分子が所定の位置に付加された消光プローブと、
前記蛍光プローブおよび前記消光プローブのそれぞれの基端が固定される固相面を有する基板と、
を備え、
前記蛍光プローブまたは前記消光プローブの一方は、前記ターゲットの核酸配列と相補的な核酸配列を有する検出配列を有し、
前記蛍光プローブまたは前記消光プローブの他方は、前記検出配列の一部の核酸配列と相補的な核酸配列（以下、相補配列ともいう）を有し、前記相補配列の固相面側の基端から、他の基端までの核酸配列が、前記検出配列の一部と相補的であり、
前記検出配列を有する前記蛍光プローブまたは消光プローブは、前記相補配列を有する蛍光プローブまたは消光プローブよりも核酸配列が長く、
前記蛍光プローブおよび前記消光プローブは、前記蛍光分子に接近した前記消光分子により前記蛍光分子が呈する蛍光が消光される位置関係となるように、前記蛍光プローブおよび前記消光プローブのそれぞれの基端が固相面に固定される、
ことを特徴とする核酸配列計測用デバイス。
［２］前記ターゲットと前記検出配列とのハイブリダイゼーションが生じていない場合、前記蛍光プローブと消光プローブとの結合が維持されることにより、前記蛍光分子に接近した前記消光分子により前記蛍光分子が呈する蛍光が消光され、前記ターゲットと前記検出配列とのハイブリダイゼーションが生じた場合、前記蛍光プローブと消光プローブとの結合が解消されることにより、前記消光分子から離れた前記蛍光分子が蛍光を呈することを特徴とする［１］に記載の核酸配列計測用デバイス。
［３］前記消光プローブが、前記検出配列を有することを特徴とする［１］または［２］に記載の核酸配列計測用デバイス。
［４］前記基板が平板であり、前記固相面が、前記平板の一平面であることを特徴とする［１］～［３］のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
［５］前記基板がビーズであり、前記固相面が、前記ビーズの表面である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
［６］前記消光プローブの数が前記蛍光プローブの数よりも多いことを特徴とする［１］～［５］のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
［７］前記蛍光プローブの数が前記消光プローブの数よりも多いことを特徴とする［１］～［５］のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
［８］前記消光分子の数が前記蛍光分子の数よりも多いことを特徴とする［１］～［７］のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
［９］前記蛍光分子の数と前記消光分子の数との比が２：３である、［８］に記載の核酸配列計測用デバイス。
［１０］前記蛍光分子が付加される前記所定の位置は、前記蛍光プローブの途中であることを特徴とする［１］～［９］のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
［１１］前記消光分子が付加される前記所定の位置は、前記消光プローブの途中であることを特徴とする［１］～［９］のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
［１２］前記蛍光分子が付加される前記所定の位置が複数あることを特徴とする、［１］～［１１］のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
［１３］前記消光分子が付加される前記所定の位置が複数あることを特徴とする、［１］～［１１］のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。

本発明の核酸配列計測用デバイスによれば、蛍光プローブと消光プローブは、前記相補配列の固相面側の基端から、他の基端までの核酸配列部分で結合するので、蛍光プローブおよび消光プローブ上の一部に存在する、お互いに相補的な結合部で、蛍光分子が付加されたプローブと消光分子が付加された消光プローブとが結合する従来の核酸配列計測用デバイスと比較して、消光効果に優れ、オフセット光を低減させることができる。そのため、検出可能な最小光量を小さくすることができ、検出感度を向上させることができる。

また、前記検出配列を有する前記蛍光プローブまたは消光プローブは、前記相補配列を有する前記蛍光プローブまたは消光プローブよりも核酸配列が長いので、前記相補配列で結合している蛍光プローブと消光プローブとの結合力よりも、前記検出配列を有する蛍光プローブまたは消光プローブとターゲットとの結合力の方が強い。そのため、検出配列を有する蛍光プローブまたは消光プローブは、前記相補配列を有する蛍光プローブまたは消光プローブと解離し、ターゲットと結合することができる。

また、本発明の核酸配列計測用デバイスによれば、蛍光プローブと消光プローブとは、前記相補配列の固相面側の基端から、他の基端までの核酸配列部分で結合するので、ターゲットの検出の可否が、前記蛍光プローブと消光プローブとの結合部の核酸配列の長さに依存する従来の核酸配列計測用デバイスと比較して、ターゲットの検出が可能な蛍光プローブと消光プローブとを容易に設計することができる。

また、この核酸配列計測用デバイスによれば、お互いに独立した分子である蛍光プローブおよび消光プローブのそれぞれの基端が基板に固定されるので、消光効果を適切に発揮させることが可能となり、検出感度を良好なものとすることができるとともに、ラベリング工程が不要となり、洗浄工程を省略することも可能となる。ラべリング工程が不要なうえ、洗浄工程を省略することによってハイブリダイズの実験にかかる手間がさらに短縮され、作業時間とともにコストが削減される。さらに、洗浄工程の不備による性能悪化、光量低下、オフセット光上昇、あるいはバラつきの発生等を回避することが可能となる。それによりアレイ面上でより均一な結果を得ることができ、検出の再現性も向上する。

さらに、本発明の核酸配列計測用デバイスによれば、ハイブリダイズのリアルタイム観察が可能となる。すなわち、ＤＮＡアレイ等の核酸配列計測用デバイスに検出対象分子（ターゲット）を含む溶液を添加した状態のまま（ウェット状態）での観察が可能となる。それにより洗浄の影響を排した状態の光量の確認やハイブリダイズのリアルタイム観察が可能となる。したがって、サンプル濃度が高く、ハイブリダイゼーションが早く進む場合など、状況によっては、より短時間でハイブリダイゼーションを終了させることが可能となる。

本発明による核酸配列計測用デバイスの構成を示す図である。プローブの構成例を示す図である。ターゲットを検出する原理を模式的に示す図である。ターゲットを検出する操作手順を示す図である。変形例を示す図であり、複数個所に消光分子が付加された例を示す図である。変形例を示す図であり、蛍光プローブに検出配列を与えた例を示す図である。変形例を示す図であり、複数個所に蛍光分子および消光分子が付加された例を示す図である。実施例１～３の核酸配列計測用デバイスおよび比較例１～３の核酸配列計測用デバイスの構造を模式的に示す図である。実施例１～３の核酸配列計測用デバイスのオフセット光と、比較例１～３の核酸配列計測用デバイスのオフセット光とを比較したグラフである。

本発明の核酸配列計測用デバイスは、ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測用デバイスにおいて、
蛍光分子が所定の位置に付加された蛍光プローブと、
消光分子が所定の位置に付加された消光プローブと、
前記蛍光プローブおよび前記消光プローブのそれぞれの基端が固定される固相面を有する基板と、
を備え、
前記蛍光プローブまたは前記消光プローブの一方は、前記ターゲットの核酸配列と相補的な核酸配列を有する検出配列を有し、
前記蛍光プローブまたは前記消光プローブの他方は、前記検出配列の一部の核酸配列と相補的な核酸配列（以下、相補配列ともいう）を有し、前記相補配列の固相面側の基端から、他の基端までの核酸配列が、前記検出配列の一部と相補的であり、
前記検出配列を有する前記蛍光プローブまたは消光プローブは、前記相補配列を有する蛍光プローブまたは消光プローブよりも核酸配列が長く、
前記蛍光プローブおよび前記消光プローブは、前記蛍光分子に接近した前記消光分子により前記蛍光分子が呈する蛍光が消光される位置関係となるように、前記蛍光プローブおよび前記消光プローブのそれぞれの基端が固相面に固定される、
ことを特徴とする。

以下、本発明の核酸配列計測用デバイスの実施形態について説明する。

図１は、本発明の核酸配列計測用デバイスの構成を示す図、図２はプローブの構成例を示す図である。

図１および図２に示すように、本実施形態の核酸配列計測用デバイスは、基板などの固相面１００に、検出対象となる核酸であるターゲット３０の相補的な配列である検出配列２３に消光分子２１を付加した消光プローブ２０と、検出配列２３の一部と相補的な配列である相補配列１２に蛍光物質１１を付加した蛍光プローブ１０とが、前記蛍光分子１１に接近した前記消光分子２１により前記蛍光分子１１が呈する蛍光が消光される位置関係となるように、それぞれ固定されて構成される。検出配列２３の核酸配列は、相補配列１２の核酸配列よりも長い。

本発明では、蛍光共鳴エネルギー転移による消光の原理が用いられ、蛍光分子１１としては、特に制限はないが、例えば、ＥＤＡＮＳ、Ｃｏｕｍａｒｉｎ、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ２、ＴＦ２、ＴＦ３、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＴＥＴ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６１０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＡＴＴＯ５３２、ＡＴＴＯ６３３、Ｑｄｏｔ（登録商標）５６５、Ｑｄｏｔ（登録商標）５８５、Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５、Ｑｄｏｔ（登録商標）７０５、ｉＦｌｕｏｒ^ＴＭ５３２、ｉＦｌｕｏｒ^ＴＭ６４７などの公知の物質を使用できる。消光分子２１としては、特に制限はないが、例えば、Ｄａｂｃｙｌ、ＴＱ１、ＴＱ２、ＴＱ３、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、Ｃｙ５Ｑ、Ｃｙ７Ｑ、ＩｏｗａＢｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ、ＩｏｗａＢｌａｃｋ（登録商標）ＲＱ、ＩＲＤｙｅＱＣ－１、ＱＳＹ７、ＱＳＹ２１、ＱＸＬ５７０、ＱＸＬ５７０、ＱＸＬ５７0などの公知の物質を使用できる。蛍光分子１１と消光分子２１の組み合わせについても特に制限はないが、例えば、ＥＤＡＮＳ、ＣｏｕｍａｒｉｎまたはＴＦ２とＤａｂｃｙｌまたはＴＱ１との組み合わせ、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、ＴＥＴ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ｃｙ２、Ｃｙ３、ＴＦ２またはＴＦ３とＴＱ２との組み合わせ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ｃｙ３、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＴＦ２、ＴＦ３、ＴＦ４またはＴＥＴとＴＱ３との組み合わせ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＴＦ２、Ｃｙ３、ＦＡＭまたはＨＥＸとＥｃｌｉｐｓｅ（登録商標）との組み合わせ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＴＦ２、ＴＦ３、Ｃｙ３、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴまたはＣｙ３とＢＨＱ１との組み合わせ、ＴＦ３、ＴＦ４、Ｃｙ３、Ｃｙ５またはＨＥＸとＢＨＱ２との組み合わせ、Ｃｙ５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＴＦ５とＩｏｗａＢｌａｃｋ（登録商標）ＲＱ、ＩＲＤｙｅＱＣ－１、ＱＳＹ２１、ＴＱ４、ＴＱ５、ＢＨＱ２またはＢＨＱ３との組み合わせ、Ｃｙ３、ＴＦ３、ＴＦ４とＣｙ５Ｑ、ＩｏｗａＢｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ、ＩｏｗａＢｌａｃｋ（登録商標）ＲＱ、ＩＲＤｙｅＱＣ－１、ＱＳＹ７またはＱＸＬ５７０との組み合わせ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２とＣｙ５Ｑ、ＴＱ２、ＴＱ３、ＩｏｗａＢｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ、ＩｏｗａＢｌａｃｋ（登録商標）ＲＱ、ＩＲＤｙｅＱＣ－１、ＱＳＹ７またはＱＸＬ５７０との組み合わせ、ＴＦ３とＢＨＱ１、ＢＨＱ２またはＣｙ５Ｑとの組み合わせ等が挙げられる。

図２に示すように、蛍光プローブ１０は、３’末端から設けられ、５’末端までの核酸配列が、消光プローブ２０の検出配列２３の固相面１００側の３’末端から、蛍光プローブ１０の３’末端に対応する部分までの核酸配列と相補的な配列である相補配列１２と、相補配列１２の５’末端に接続され、固相面１００まで続くリンカー１４と、を備え、蛍光プローブ１０の３’末端に蛍光分子１１が付加される。

消光プローブ２０は、５’末端から設けられる検出配列２３と、検出配列２３の３’末端に接続され、固相面１００まで続くリンカー２４と、を備え、蛍光プローブ１０に付加されている蛍光分子１１に接近した位置に消光分子２１が固定される。消光プローブ２０が有する検出配列２３の核酸配列の長さは、相補配列１２より核酸配列が長い。

蛍光プローブ１０および消光プローブ２０は、それぞれリンカー１４およびリンカー２４を介して固相面１００に固定化される。また、蛍光プローブ１０のリンカー１４に接続される、固相面１００側の基端（５’末端）から、他の基端（３’末端）までの核酸配列と、消光プローブ２０が有する検出配列２３の、リンカー２４に接続される、固相面１００側の末端（３’末端）から、蛍光プローブ１０の３’末端に対応する部分までの核酸配列とは、互いに相補的とされる。

なお、本発明において相補的であるとは、一方の核酸配列が、他方の核酸配列と２本鎖状態を形成することのできる核酸配列を持つことを意味し、必ずしも完全に相補的である必要はなく、いくつかのミスマッチ塩基対を含んでいてもよい。

また、蛍光プローブ１０と消光プローブ２０とが互いに結合可能な位置に蛍光プローブ１０および消光プローブ２０が、固相面１００に固定されるとともに、蛍光プローブ１０と消光プローブ２０とが結合したときに、消光分子２１が蛍光分子１１に接近し、これにより蛍光分子１１が消光状態となるような位置関係が確保されている。

次に、核酸配列計測用デバイスによりターゲット３０を検出する原理および操作手順について説明する。図３はターゲットを検出する原理を模式的に示す図、図４はターゲットを検出する操作手順を示す図である。

図３に示すように、ターゲット３０が存在しないときは蛍光分子１１および消光分子２１がそれぞれ付加された蛍光プローブ１０と消光プローブ２０とが結合することにより、蛍光分子１１と消光分子２１が接近した状態にある。この状態では励起光が照射されても消光分子２１の影響により蛍光分子１１は蛍光を呈さない。

図４に示すように、サンプル５０に対し、遺伝子（ターゲット３０）の増幅を行う（ステップ１）。次に、増幅後のターゲット３０を含む溶液をＤＮＡチップの固相面１００に供給し、ハイブリダイゼーションを行う（ステップ２）。

図３に示すように、消光プローブ２０が有する、ターゲット３０の核酸配列と相補的な核酸配列である検出配列２３の核酸配列は、蛍光プローブ１０が有する相補配列１２より長いので、この相補配列１２の部分で結合している蛍光プローブ１０と消光プローブ２０との結合力よりも、検出配列２３を有する消光プローブ２０とターゲット３０との結合力の方が強い。そのため、ターゲット３０が存在するときは、検出配列２３を有する消光プローブ２０は、蛍光プローブ１０と解離し、ターゲット３０と結合する。ターゲット３０が蛍光プローブ１０と結合すると、蛍光プローブ１０と消光プローブ２０の結合が外れて消光分子２１と蛍光分子１１の距離が離れることで消光状態が解かれ、励起光の照射により蛍光分子１１が蛍光を呈するようになる。したがって、図４に示すように、蛍光読取装置６０での固相面１００の観察により、蛍光プローブ１０が蛍光を呈するか否かでサンプル中の対象核酸（ターゲット３０）の有無を確認することができる（ステップ３）。またこの時、溶液中に含まれる捕集されていないターゲット３０は蛍光を呈さないために、洗浄する必要がない。したがって、ターゲット溶液存在下で、溶液を通して固相面１００を観察することが可能である。このため、洗浄の影響を排した状態での光量が測定できるとともに、ハイブリダイゼーション中のリアルタイム測定も可能となる。

遺伝子の増幅を行った段階（ステップ１）で、遺伝子が増幅されたか否かを確認する試験を行い、遺伝子が増幅されている場合にのみハイブリダイズ（ステップ２）を行うようにしてもよい。

なお、遺伝子の存在の有無を検査するタイミングは、増幅終了後に限定されず、増幅反応中であってもよい。検査の手法としては、電気泳動、抗原抗体反応、質量分析やリアルタイムＰＣＲ法などを適宜、利用することができる。

また、核酸（ターゲット３０）はタンパク質や糖鎖などに結合させても良い。この場合には、核酸（ターゲット３０）に対するタンパク質や糖鎖などの相互作用が確認できる。

本発明の核酸配列計測用デバイスは上記実施形態に限定されず、以下のような種々の変形が可能である。

蛍光体を修飾した蛍光プローブと消光分子を修飾した消光プローブの存在比を変えてそれぞれを固定化することで、消光状態における消光効率を制御することができる。例えば、消光プローブを蛍光プローブよりも多くすると、カップリングされる蛍光分子の確率が高まり、消光効率が上昇する。それによってオフセット光を低く抑えることができる。また、蛍光プローブを消光プローブよりも多くすると、消光作用を受ける蛍光プローブの確率が低くなり、対象物質検出後に呈する蛍光（ハイブリダイズ光量）がより強くなる。

前記検出配列は、前記相補配列より核酸配列が長い。前記検出配列の長さは、前記相補配列の長さより長ければ特に制限はなく、例えば、前記相補配列の長さより、１塩基以上、５塩基以上、１０塩基以上長くてよい。

蛍光分子または消光分子はプローブの先端についていなくてもよく、図５～図７に示すように、蛍光分子または消光分子は、プローブの途中の位置に付加されていてもよい。図５の例では、消光分子２１が消光プローブ２０Ａの途中に付加されている。図６の例では、蛍光分子１１が蛍光プローブ１０Ｂの途中に付加されている。図７の例では、蛍光分子１１および消光分子２１が、それぞれ蛍光プローブ１０Ｃおよび消光プローブ２０Ｃのプローブの途中に付加されている。ただし、消光作用が生じるように、蛍光プローブ１０Ａ～１０Ｃおよび消光プローブ２０Ａ～２０Ｃがそれぞれ結合した状態において、消光分子２１が蛍光分子１１に接近するように互いに向き合う位置となるように設計することが望ましい。蛍光分子もしくは消光分子をプローブの先端以外の位置に付加する場合には、プローブの先端にはさらに別の修飾が可能となる利点がある。

蛍光分子と消光分子はそれぞれ複数種類・複数個所に付加されてもよい。図５および図６は、複数個所に消光分子が付加された例を示す図である。図５の例では、蛍光プローブ１０Ａに蛍光分子１１が、消光プローブ２０Ａに消光分子２１、２１が、それぞれ付加されている。図６の例では、蛍光プローブ１０Ｂに蛍光分子１１が、消光プローブ２０Ｂに消光分子２１、２１が、それぞれ付加されている。複数の消光分子を１つのプローブに付加する場合、消光分子の種類を異なるものとしてもよい。１つのプローブに複数の消光分子を付加した場合、蛍光分子に対する消光分子の消光効果を高めることができるため、オフセット光をより低くすることができる。そのため、検出可能な最小光量を小さくすることができ、検出感度を向上させることができる。

図７は、複数個所に蛍光分子および消光分子が付加された例を示す図である。図７の例では、蛍光プローブ１０Ｃに蛍光分子１１、１１が、消光プローブ２０Ｃに消光分子２１、２１、２１が、それぞれ付加されている。複数の蛍光分子および消光分子をそれぞれ１つのプローブに付加する場合、それぞれの蛍光分子または消光分子の種類を異なるものとしてもよい。１つのプローブにそれぞれ複数の蛍光分子および消光分子を付加した場合、ターゲットが結合した際の蛍光量が増加し、より高感度な検出が可能となる。また、消光分子の数を蛍光分子の数より多くすることにより、ターゲットが存在しないときのオフセット光を低くすることができる。

前記検出配列は、消光プローブに設けても、蛍光プローブに設けてもよい。消光プローブが検出配列を有する場合は、前記したように、ターゲット３０が、消光プローブが有する検出配列に結合するが、蛍光プローブが検出配列を有する場合は、ターゲット３０が、蛍光プローブが有する検出配列に結合する。図６は、蛍光プローブに検出配列を与え、消光プローブに複数の消光分子２１、２１を付加した場合の状態を模式的に示す図である。図６に示すように、消光プローブに複数の消光分子を付加することにより、ターゲットが存在しないときのオフセット光を低くすることができる。また、蛍光プローブと消光プローブとの結合力よりも、ターゲットと蛍光プローブとの結合力が強いため、ターゲットが存在するときは、蛍光プローブは消光プローブと解離し、ターゲットと結合することができ、蛍光分子が蛍光を呈するようにすることができる。

また、蛍光プローブおよび消光プローブが固定される基板は、平板であっても、ビーズであってもよい。前記基板が平板である場合、蛍光プローブ及び消光プローブが固定される固相面は、前記平板の一平面とすることができる。前記基板がビーズである場合は、蛍光プローブおよび消光プローブの固相面は、前記ビーズの表面とすることができる。ビーズの表面に蛍光プローブおよび消光プローブを固定することにより、蛍光プローブおよび消光プローブがビーズを中心として放射状に広がった形状となる。この場合、プローブを固定する固相面の表面積が大きくなり、単位面積当たりのプローブ量を増やすことができる。また、検出対象分子を捕集したビーズをその大きさや磁気等で回収することで、検出対象分子の選択的な回収も可能となる。回収した分子は後工程における別の試験などに使用可能となる。

次に、本発明の核酸配列計測方法にかかる核酸配列計測用デバイスの製造方法について説明する。

（１）溶液調製
まず、蛍光プローブ１０および消光プローブ２０を混合したプローブ液を調製し、プローブ濃度を調整する。

（２）カップリング
次に、プローブ液を加熱後、急冷し、蛍光プローブ１０と消光プローブ２０をカップリングさせる。これにより、蛍光プローブ１０または前記消光プローブ２０の一方が有する相補配列の部分で蛍光プローブ１０と消光プローブ２０が結合される。ここでは、例えば、プローブ液を９５℃に加熱後、５分間温度を保持し、その後、２５℃に急冷することで蛍光プローブ１０と消光プローブ２０をカップリングさせる。

（３）固相面への固定
次に、蛍光プローブ１０と消光プローブ２０がカップリングした状態にあるプローブ液を固相面にスポットして、蛍光プローブ１０と消光プローブ２０を固相面１００に固定化する。

（４）洗浄
次に、固相面１００を洗浄し、固定化されていない余剰のプローブを除去する。以上の手順により、核酸配列計測用デバイスが製造される。

このように、蛍光プローブ１０または消光プローブ２０の一方が有する相補配列の部分で互いに結合された状態で、蛍光プローブ１０および消光プローブ２０を固相面１００に結合させるので、蛍光プローブ１０および消光プローブ２０の位置関係を適切に管理でき、消光効果を適切に発揮させることが可能となるため、検出感度を良好なものとすることができる。

本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測用デバイスに対し、広く適用することができる。

以下、実施例および比較例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。

（実施例１）
リンカー配列と、核酸配列の長さ３３の検出配列とを有し、蛍光分子が結合した蛍光プローブ１、及び、リンカー配列と、前記蛍光プローブ１の検出配列の固相面側の基端から２８塩基の部分と相補的な核酸配列とを有し、消光分子が結合した消光プローブ１を混合したプローブ液を調製した。
次に、プローブ液を９５℃に加熱後、５分間温度を維持し、その後、２５℃に急冷し、蛍光プローブ１と消光プローブ１とをカップリングさせた。これにより、消光プローブ１が有する相補配列の部分で蛍光プローブ１と消光プローブ１を結合させた。なお、消光プローブ１において、消光分子は、消光プローブ１の固相面側の基端とは反対側の基端に結合させ、蛍光分子は、消光プローブ1における消光分子の固相面からの高さと同じ高さの位置で、蛍光プローブ１に結合させた。

次に、蛍光プローブ１と消光プローブ１がカップリングした状態にあるプローブ液を固相面にスポットして、蛍光プローブ１と消光プローブ１を固相面に固定化した。
その後、固相面を洗浄し、固定化されていない余剰のプローブを除去することにより、蛍光プローブ１と消光プローブ１とからなる核酸配列計測用デバイス１を製造した（図８）。
表１に、核酸配列計測用デバイス１の蛍光プローブと消光プローブの長さ、及び蛍光プローブが消光プローブのどの部分で結合するかを示す。

次に、上記で製造された核酸配列計測用デバイス１のオフセット光を測定した。その結果を図９に示す。

（実施例２）
蛍光プローブ１の代わりに、蛍光プローブ１の蛍光分子の結合位置を、蛍光プローブの固相面側の基端とは反対側の基端とした蛍光プローブ２を用いる以外は、実施例１と同様にして、蛍光プローブ２と消光プローブ１とからなる核酸配列計測用デバイス２を製造した（図８）。
表１に、核酸配列計測用デバイス２の蛍光プローブと消光プローブの長さ、及び蛍光プローブが消光プローブのどの部分で結合するかを示す。

次に、上記で製造された核酸配列計測用デバイス２のオフセット光を測定した。その結果を図９に示す。

（実施例３）
蛍光プローブ１の代わりに、蛍光プローブ１の検出配列の長さを３４とした蛍光プローブ３を用い、消光プローブ１の代わりに、前記蛍光プローブ３の検出配列の固相面側の基端から２４塩基の部分と相補的な核酸配列を有し、消光分子が、固相面側の基端とは反対側の基端に結合している消光プローブ３を用いる以外は、実施例１と同様にして、蛍光プローブ３と消光プローブ３とからなる核酸配列計測用デバイス３を製造した（図８）。なお、蛍光プローブ３において蛍光分子は、消光プローブ３における消光分子の固相面からの高さと同じ高さの位置で、蛍光プローブ３に結合させた。
表１に、核酸配列計測用デバイス３の蛍光プローブと消光プローブの長さ、及び蛍光プローブが消光プローブのどの部分で結合するかを示す。

次に、上記で製造された核酸配列計測用デバイス３のオフセット光を測定した。その結果を図９に示す。

（比較例１）
蛍光プローブ１の代わりに、リンカー配列と、核酸配列の長さ２８の検出配列とを有し、蛍光分子が、固相面側の基端とは反対側の基端に結合した蛍光プローブ１’を用い、消光プローブ１の代わりに、リンカー配列と、前記蛍光プローブ１’の検出配列の固相面側の基端とは反対側の基端側の核酸配列（以下、先端配列ともいう）の一部と相補的で、核酸配列の長さ２８の核酸配列とを有し、消光分子が、固相面側の基端とは反対側の基端に結合した、消光プローブ１’を用いる以外は、実施例１と同様にして、蛍光プローブ１’と消光プローブ１’とからなる核酸配列計測用デバイス１’を製造した（図８）。
表１に、核酸配列計測用デバイス１’の蛍光プローブと消光プローブの長さ、及び蛍光プローブが消光プローブのどの部分で結合するかを示す。

次に、上記で製造された核酸配列計測用デバイス１’のオフセット光を測定した。その結果を図９に示す。

（比較例２）
蛍光プローブ１の代わりに、リンカー配列と、核酸配列の長さ３３の検出配列を有し、蛍光分子が、固相面側の基端とは反対側の基端に結合した蛍光プローブ２’を用い、消光プローブ１の代わりに、リンカー配列と、先端配列の一部が蛍光プローブ２’と相補的で、核酸配列の長さが２８の核酸配列とを有し、消光分子が、固相面側の基端とは反対側の基端に結合した消光プローブ２’を用いる以外は、実施例１と同様にして、蛍光プローブ２’と消光プローブ２’とからなる核酸配列計測用デバイス２’を製造した（図８）。
表１に、核酸配列計測用デバイス２’の蛍光プローブと消光プローブの長さ、及び蛍光プローブが消光プローブのどの部分で結合するかを示す。

次に、上記で製造された核酸配列計測用デバイス２’のオフセット光を測定した。その結果を図９に示す。

（比較例３）
蛍光プローブ１の代わりに、リンカー配列と、核酸配列の長さ２４の検出配列とを有し、蛍光分子が、固相面側の基端とは反対側の基端に結合した蛍光プローブ３’を用い、消光プローブ１の代わりに、リンカー配列と、蛍光プローブ３’の先端配列の一部と相補的で、核酸配列の長さ２４の核酸配列とを有し、消光分子が、固相面側の基端とは反対側の基端に結合した、消光プローブ３’を用いる以外は、実施例１と同様にして、蛍光プローブ３’と消光プローブ３’とからなる核酸配列計測用デバイス３’を製造した（図８）。
表１に、核酸配列計測用デバイス３’の蛍光プローブと消光プローブの長さ、及び蛍光プローブが消光プローブのどの部分で結合するかを示す。

次に、上記で製造された核酸配列計測用デバイス３’のオフセット光を測定した。その結果を図９に示す。

図９に示すように、リンカー配列を除く消光プローブの全核酸配列部分で、蛍光プローブが消光プローブと結合する、実施例１～３の核酸配列計測用デバイスは、消光プローブの先端配列の一部で、蛍光プローブが消光プローブと結合する、比較例１～３の核酸配列用計測用デバイスと比較して、オフセット光が低かった。その結果、実施例１～３の核酸配列計測用デバイスは、検出可能な最小光量を小さくすることができ、検出感度を向上させることができることが確認された。
また、オフセット光は、実施例１～３及び比較例１～３のいずれでも、蛍光分子と消光分子の位置がお互いに近い方が、蛍光分子と消光分子の位置が離れている方よりも低かったが、蛍光分子と消光分子の位置が離れている実施例２の核酸配列計測用デバイスは、同様に蛍光分子と消光分子の位置が離れている比較例２の核酸配列計測用デバイスと比較して、オフセット光を低くすることができた。

１０蛍光プローブ
１１蛍光分子
１２相補配列
１３検出配列
１４リンカー
２０消光プローブ
２１消光分子
２２相補配列
２３検出配列
２４リンカー
６０蛍光読取装置
１００固相面

Claims

ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測用デバイスにおいて、
蛍光分子が先端又は途中の位置に付加された蛍光プローブと、
前記蛍光プローブと結合した時に、消光分子が前記蛍光プローブの蛍光分子と近接する位置に付加された消光プローブと、
前記蛍光プローブおよび前記消光プローブのそれぞれの基端が固定される固相面を有する基板と、
を備え、
前記蛍光プローブまたは前記消光プローブの一方は、前記ターゲットの核酸配列と相補的な核酸配列を有する検出配列を有し、
前記蛍光プローブまたは前記消光プローブの他方は、前記検出配列の一部の核酸配列と相補的な核酸配列（以下、相補配列ともいう）を有し、前記相補配列の固相面側の基端から、他の基端までの核酸配列が、前記検出配列の一部と相補的であり、
前記検出配列を有する前記蛍光プローブまたは消光プローブは、前記相補配列を有する前記蛍光プローブまたは消光プローブよりも核酸配列が長く、
前記蛍光プローブおよび前記消光プローブは、前記蛍光分子に接近した前記消光分子により前記蛍光分子が呈する蛍光が消光される位置関係となるように、それぞれの基端が固相面に固定され、
前記相補配列の固相面側の基端から他の基端までの核酸配列が、前記検出配列の固相面側の基端から前記相補配列の前記他の基端に対応する部分までの核酸配列と相補的である、
ことを特徴とする核酸配列計測用デバイス。
前記ターゲットと前記検出配列とのハイブリダイゼーションが生じていない場合、前記蛍光プローブと消光プローブとの結合が維持されることにより、前記蛍光分子に接近した前記消光分子により前記蛍光分子が呈する蛍光が消光され、
前記ターゲットと前記検出配列とのハイブリダイゼーションが生じた場合、前記蛍光プローブと消光プローブとの結合が解消されることにより、前記消光分子から離れた前記蛍光分子が蛍光を呈することを特徴とする請求項１に記載の核酸配列計測用デバイス。
前記消光プローブが、前記検出配列を有することを特徴とする請求項１または２に記載の核酸配列計測用デバイス。
前記基板が平板であり、前記固相面が、前記平板の一平面であることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
前記基板がビーズであり、前記固相面が、前記ビーズの表面である、請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
前記消光プローブの数が前記蛍光プローブの数よりも多いことを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
前記蛍光プローブの数が前記消光プローブの数よりも多いことを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
前記消光分子の数が前記蛍光分子の数よりも多いことを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
前記蛍光分子の数と前記消光分子の数との比が２：３である、請求項８に記載の核酸配列計測用デバイス。
前記蛍光分子が付加される前記所定の位置は、前記蛍光プローブの途中であることを特徴とする請求項１～９のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
前記消光分子が付加される前記所定の位置は、前記消光プローブの途中であることを特徴とする請求項１～９のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
前記蛍光分子が付加される前記所定の位置が複数あることを特徴とする、請求項１～１１のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。
前記消光分子が付加される前記所定の位置が複数あることを特徴とする、請求項１～１１のいずれか１項に記載の核酸配列計測用デバイス。