JP7054573B2 - Ｐｄ－１結合抗体及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、概して分離されたモノクローナル抗体に関し、特に、高い親和性及び機能性でヒトＰＤ－１に特異的に結合するマウス、キメラ又はヒト化のモノクローナル抗体に関する。さらに、本発明は抗体をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞及び抗体の発現方法を提供する。さらに、本発明は免疫複合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、二重特異性分子、腫瘍溶解性ウイルス及び当該抗体を含む医薬組成物、並びに本発明の抗ＰＤ－１抗体を使用する診断及び治療方法を提供する。

プログラムされた細胞死タンパク質１は、ＰＤ－１又はＣＤ２７９とも呼ばれ、Ｔ細胞レギュレーターのＣＤ２８ファミリーのメンバーであり、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞及び骨髄細胞において発現される（Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：７６５－７２、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３９１７７９－８２及びＢｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０：７１１－８）。膜近位の免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）及び膜遠位のチロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む（Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｌ．（１９９５）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８１：１９５３－６及びＶｉｖｉｅｒ，Ｅ ａｎｄ Ｄａｅｒｏｎ，Ｍ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １８：２８６－９１）。ＰＤ－１の２つのリガンド、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２が既に発見されており、両者はいずれもＰＤ－１に結合し、他のＣＤ２８ファミリーメンバーとは結合しないＢ７ホモログである。

複数の証拠によってＰＤ－１及びそのリガンドが免疫応答を負に調節することが判明した。例えば、様々なヒトがんでＰＤ－１が豊富であることが発見された（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７８７－９）。さらに、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用が腫瘍浸潤リンパ球及びＴ細胞受容体媒介性増殖の低減、並びにがん細胞の免疫回避を引き起こすことが報告された（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８１：２８１－７、Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５４：３０７－３１４及びＫｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：５０９４－１００）。関連の研究では、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の局所的な相互作用を阻害することで免疫抑制を反転させることができ、しかもＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２の相互作用も遮断された場合に、当該効果が相加的であることが判明した（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１２２９３－７及びＢｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７－６６）。

ＰＤ－１欠損動物には、自己免疫性心筋症や関節炎及び腎炎を伴うループス様症候群など、様々な自己免疫表現型が発生する（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１：１４１－５１及びＮｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：３１９－２２）。また、ＰＤ－１が自己免疫性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、Ｉ型糖尿病及び関節リウマチにおいて役割を果たすことがわかった（Ｓａｌａｍａ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９８：７１－７８、Ｐｒｏｋｕｎｉｎａ ａｎｄ Ａｌａｒｃｏｎ－Ｒｉｑｕｅｌｍｅ（２００４）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １３：Ｒ１４３及びＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｌｕｐｕｓ １３：５１０）。マウスＢ細胞腫瘍株では、ＢＣＲ媒介性Ｃａ２＋フラックス及び下流エフェクター分子のチロシンリン酸化の遮断でＰＤ－１のＩＴＳＭが不可欠であることが示された（Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００１）ＰＮＡＳ ９８：１３８６６－７１）。

疾患の治療のために、ＰＤ－１を標的とする様々ながん免疫療法剤が既に開発されていた。このような抗ＰＤ－１抗体の一つがニボルマブであり（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂによって商品名ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）で販売されている）、計２９６人の患者を対象とする臨床試験では、非小細胞肺がん、黒色腫及び腎細胞がんで完全又は部分的な応答が生じていた（Ｔｏｐａｌｉａｎ ＳＬ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．３６６（２６）：２４４３－５４）。２０１４年に、日本で使用が承認され、米国ＦＤＡによって転移性黒色腫の治療薬として承認された。ＰＤ－１を標的とするもう１つの抗ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標），ＭＫ－３４７５，Ｍｅｒｃｋ）も、転移性黒色腫の治療薬として２０１４年に米国ＦＤＡによって承認された。米国では、既に肺がん、リンパ腫及び中皮腫の臨床試験に使用されている。

抗ＰＤ－１抗体が開発され、承認されていたものの、ＰＤ－１に対して増強された結合親和性及び他の所望の医薬特性を持つ他のモノクローナル抗体がなおも必要である。

本発明は、分離されたモノクローナル抗体、例えば、マウス、ヒト、キメラ又はヒト化のモノクローナル抗体を提供し、当該モノクローナル抗体は、ＰＤ－１（例えば、ヒトＰＤ－１及びサルＰＤ－１）に結合し、増加されたＰＤ－１親和性を持ち、且つ既存の抗ＰＤ－１抗体（例えば、ニボルマブ）と比べて、（より優れたものでない場合に）同等の抗腫瘍効果を有する。

本発明の抗体は、ＰＤ－１タンパク質の検出や、がん、自己免疫性心筋症、自己免疫性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、Ｉ型糖尿病及び関節リウマチ等のＰＤ－１関連疾患の治療と予防等、様々な用途で使用することができる。

これに応じて、本発明の一態様では、ＰＤ－１に結合する分離されたモノクローナル抗体（例えば、マウス、キメラもしくはヒト化の抗体）又はその抗原結合部分に関し、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域を含み、ただし、前記ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域はそれぞれ（１）配列番号１、２及び３、（２）配列番号４、５及び６、（３）配列番号７、８及び９、（４）配列番号１０、１１及び１２、（５）配列番号１３、１４及び１５、（６）配列番号１６、１７及び１８、（７）配列番号１９、２０及び２１、（８）配列番号２２、２３及び２４、（９）配列番号２５、２６及び２７、（１０）配列番号２８、２９及び３０、又は（１１）配列番号３１、３２及び３３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、前記抗体又はその抗原結合断片はＰＤ－１に結合する。

本発明の一態様では、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分は重鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は配列番号６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８又は７９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、前記抗体又はその抗原結合断片はＰＤ－１に結合する。配列番号６７及び６９～７９はそれぞれ配列番号１０２～１１３の核酸配列によってコードされてもよい。

本発明の一態様では、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分は軽鎖可変領域を含み、当該軽鎖可変領域はＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域を含み、ただし、前記ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域はそれぞれ（１）配列番号３４、３５及び３６、（２）配列番号３７、３８及び３９、（３）配列番号４０、４１及び４２、（４）配列番号４３、４４及び４５、（５）配列番号４６、４７及び４８、（６）配列番号４９、５０及び５１、（７）配列番号５２、５３及び５４、（８）配列番号５５、５６及び５７、（９）配列番号５８、５９及び６０、（１０）配列番号６１、６２及び６３、又は（１１）配列番号６４、６５及び６６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、前記抗体又はその抗原結合断片はＰＤ－１に結合する。

本発明の一態様では、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分は軽鎖可変領域を含み、当該軽鎖可変領域は配列番号８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５又は９６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、前記抗体又はその抗原結合断片はＰＤ－１に結合する。配列番号８０及び８６～９６はそれぞれ配列番号１１４～１２５の核酸配列によってコードされてもよい。

本発明の一態様では、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のそれぞれはＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域を含み、ただし、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びに軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はそれぞれ（１）配列番号１、２、３、３４、３５及び３６、（２）配列番号４、５、６、３７、３８及び３９、（３）配列番号７、８、９、４０、４１及び４２、（４）配列番号１０、１１、１２、４３、４４及び４５、（５）配列番号１３、１４、１５、４６、４７及び４８、（６）配列番号１６、１７、１８、４９、５０及び５１、（７）配列番号１９、２０、２１、５２、５３及び５４、（８）配列番号２２、２３、２４、５５、５６及び５７、（９）配列番号２５、２６、２７、５８、５９及び６０、（１０）配列番号２８、２９、３０、６１、６２及び６３、又は（１１）配列番号３１、３２、３２、６４、６５及び６６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、前記抗体又はその抗原結合断片はＰＤ－１に結合する。

本発明の一実施形態では、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ（１）配列番号６７及び８０、（２）配列番号６８及び８１、（３）配列番号６９及び８１、（４）配列番号６８及び８２、（５）配列番号６８及び８３、（６）配列番号６８及び８４、（７）配列番号６８及び８５、（８）配列番号６８及び８６、（９）配列番号６９及び８６、（１０）配列番号７０及び８７、（１１）配列番号７１及び８８、（１２）配列番号７２及び８９、（１３）配列番号７３及び９０、（１４）配列番号７４及び９１、（１５）配列番号７５及び９２、（１６）配列番号７６及び９３、（１７）配列番号７７及び９４、（１８）配列番号７８及び９５、又は（１９）配列番号７９及び９６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、前記抗体又はその抗原結合断片はＰＤ－１に結合する。

本発明の一実施形態では、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分は重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含み、軽鎖は軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含み、ただし、重鎖定常領域は配列番号９７、９９又は１２９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ軽鎖定常領域は配列番号９８又は１３０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は前記アミノ酸配列を含み、ただし、抗体又はその抗原結合断片はＰＤ－１に結合する。配列番号９７及び９９のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１２６及び１２８の核酸配列によってコードされてもよい。配列番号９８は配列番号１２７によってコードされてもよい。

いくつかの実施形態では、本発明の抗体は２つの重鎖及び２つの軽鎖を含み、又は２つの重鎖及び２つの軽鎖からなり、ただし、各重鎖は前記重鎖定常領域、重鎖可変領域又はＣＤＲ配列を含み、且つ各軽鎖は前記軽鎖定常領域、軽鎖可変領域又はＣＤＲ配列を含み、ただし、抗体はＰＤ－１に結合する。本発明の抗体は全長抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプであってもよい。他の実施形態では、本発明の抗体は一本鎖抗体又は抗体断片、例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ’２断片であってもよい。

本発明の抗体又はその抗原結合部分は従来技術による抗ＰＤ－１抗体（例えば、ニボルマブ）と比べて、ヒトＰＤ－１に対するより高い結合親和性を有し、６．３６×１０－９Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ－１に結合し、且つＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の結合を阻害する。既存の抗ＰＤ－１抗体（例えば、ニボルマブ）と比べ、本発明の抗体又はその抗原結合部分は（より優れたものでない場合に）同等の抗腫瘍効果を提供する。

さらに、本発明は治療剤（例えば、細胞毒素）にリンクされた本発明の抗体又はその抗原結合部分を含む免疫複合体を提供する。さらに、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合部分を含む二重特異性分子を提供し、当該抗体又はその抗原結合部分は前記抗体又はその抗原結合部分と異なる結合特異性を有する第２機能部分（例えば、第２抗体）にリンクされている。別の態様では、本発明の抗体又はその抗原結合部分はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の一部として製造されてもよい。本発明の抗体又はその抗原結合部分は腫瘍溶解性ウイルスによってコードされ、又は腫瘍溶解性ウイルスに複合させて使用されてもよい。

さらに、本発明は、本発明の抗体もしくはその抗原結合部分、もしくは免疫複合体、二重特異性分子、腫瘍溶解性ウイルス、又はＣＡＲ、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

本発明の抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子、並びにこのような核酸を含む発現ベクター及びこのような発現ベクターを含む宿主細胞も本発明に含まれる。さらに、（ｉ）宿主細胞の中で抗体を発現させるステップと、（ｉｉ）宿主細胞又はその細胞培養物から抗体を分離するステップとを含む、発現ベクターを含む宿主細胞を使用する抗ＰＤ－１抗体の製造方法も提供される。

本発明の別の態様では、本発明の抗体又はその抗原結合部分を対象に投与して、対象における免疫応答を調節することを含む、対象における免疫応答の調節方法を提供する。好ましくは、本発明の抗体は対象の免疫応答を増強、刺激又は増加させる。いくつかの実施形態では、前記方法は本発明の、組成物、二重特異性分子、免疫複合体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、又は抗体をコードしもしくは抗体を持つ腫瘍溶解性ウイルス、あるいは対象の中でこれらを発現できる核酸分子を投与することを含む。

本発明の別の態様では、治療有効量の本発明の抗体又はその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象における腫瘍増殖の阻害方法を提供する。前記腫瘍は、固形腫瘍であってもよいし非固形腫瘍であってもよく、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、黒色腫、結腸腺がん、膵臓がん、結腸がん、胃腸がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、腎細胞がん、鼻咽頭がんを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、当該方法は本発明の、組成物、二重特異性分子、免疫複合体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、又は抗体をコードしもしくは抗体を持つ腫瘍溶解性ウイルス、あるいは対象の中でこれらを発現できる核酸分子を投与することを含む。

本発明の別の態様では、治療有効量の本発明の抗体又はその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象における感染性疾患の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、当該方法は本発明の、組成物、二重特異性分子、免疫複合体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、又は抗体をコードしもしくは抗体を持つ腫瘍溶解性ウイルス、あるいは対象の中でこれらを発現できる核酸分子を投与することを含む。

さらに、本発明は、（ｉ）抗原、（ｉｉ）抗体又はその抗原結合部分を対象に投与して、抗原に対する対象の免疫応答を増強させることを含む、対象における抗原への免疫応答の増強方法を提供する。前記抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、又は病原体由来の抗原であってもよい。

本発明の抗体は少なくとも１種の追加の薬剤と組み合わせて使用することができ、当該薬剤は、例えば、免疫刺激抗体（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び／又は抗ＣＴＬＡ－４抗体）、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２及び／又はＩＬ－２１）、又は共刺激抗体（例えば、抗ＣＤ１３７及び／又は抗ＧＩＴＲ抗体）である。

本発明の態様をさらに記載する：
［項１］
ＰＤ－１に結合する分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分であって、
ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域を含み、前記ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域は、
（１）それぞれ配列番号１、２及び３、
（２）それぞれ配列番号４、５及び６、
（３）それぞれ配列番号７、８及び９、
（４）それぞれ配列番号１０、１１及び１２、
（５）それぞれ配列番号１３、１４及び１５、
（６）それぞれ配列番号１６、１７及び１８、
（７）それぞれ配列番号１９、２０及び２１、
（８）それぞれ配列番号２２、２３及び２４、
（９）それぞれ配列番号２５、２６及び２７、
（１０）それぞれ配列番号２８、２９及び３０、又は
（１１）それぞれ配列番号３１、３２及び３３に記載のアミノ酸配列を含み、
ただし、前記抗体又はその抗原結合断片はＰＤ－１に結合する、ＰＤ－１に結合する分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
［項２］
配列番号６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８又は７９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を備える重鎖可変領域を含む上記項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
［項３］
ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変領域をさらに含み、前記ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域は、
（１）それぞれ配列番号３４、３５及び３６、
（２）それぞれ配列番号３７、３８及び３９、
（３）それぞれ配列番号４０、４１及び４２、
（４）それぞれ配列番号４３、４４及び４５、
（５）それぞれ配列番号４６、４７及び４８、
（６）それぞれ配列番号４９、５０及び５１、
（７）それぞれ配列番号５２、５３及び５４、
（８）それぞれ配列番号５５、５６及び５７、
（９）それぞれ配列番号５８、５９及び６０、
（１０）それぞれ配列番号６１、６２及び６３、又は
（１１）それぞれ配列番号６４、６５及び６６に記載のアミノ酸配列を含む上記項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
［項４］
配列番号８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５又は９６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を備える軽鎖可変領域をさらに含む上記項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
［項５］
（１）配列番号６７及び８０、（２）配列番号６８及び８１、（３）配列番号６９及び８１、（４）配列番号６８及び８２、（５）配列番号６８及び８３、（６）配列番号６８及び８４、（７）配列番号６８及び８５、（８）配列番号６８及び８６、（９）配列番号６９及び８６、（１０）配列番号７０及び８７、（１１）配列番号７１及び８８、（１２）配列番号７２及び８９、（１３）配列番号７３及び９０、（１４）配列番号７４及び９１、（１５）配列番号７５及び９２、（１６）配列番号７６及び９３、（１７）配列番号７７及び９４、（１８）配列番号７８及び９５、又は（１９）配列番号７９及び９６に対してそれぞれ８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を備える重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む上記項１に記載の分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
［項６］
配列番号９７、９９又は１２９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を備える重鎖定常領域、及び／又は配列番号９８又は１３０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を備える軽鎖定常領域を含む上記項１に記載の分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
［項７］
（ａ）ヒトＰＤ－１に結合し、（ｂ）サルＰＤ－１に結合し、（ｃ）ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の結合を阻害し、（ｄ）Ｔ細胞の増殖を増加させ、（ｅ）免疫応答を刺激し、且つ／又は（ｆ）抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する上記項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
［項８］
マウス、ヒト、キメラ又はヒト化の抗体である上記項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
［項９］
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプである上記項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
［項１０］
上記項１に記載の抗体又はその抗原結合部分と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
［項１１］
抗腫瘍剤をさらに含む上記項１０に記載の医薬組成物。
［項１２］
治療有効量の上記項１０に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む対象における腫瘍増殖の阻害方法。
［項１３］
前記腫瘍は固形腫瘍又は非固形腫瘍である上記項１２に記載の方法。
［項１４］
前記腫瘍はリンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、黒色腫、結腸腺がん、膵臓がん、結腸がん、胃腸がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、腎細胞がん、鼻咽頭がんからなる群から選ばれる上記項１２に記載の方法。
本開示の他の特徴及び利点が下記の詳細な説明及び実施例によって明瞭なものになり、これらの内容に限定されるものではない。本願で言及される参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋ登録エントリー、特許及び公開特許出願の全ての内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

図１はヒト化抗ＰＤ－１抗体ｈｕＣｌＥｌ－Ｖ１０の融解曲線を示す。 図２はヒト化抗ＰＤ－１抗体ｈｕＣｌＥ１－Ｖ１０のサイズ排除クロマトグラフィー結果を示す。

本開示が一層理解されやすいように、まずは関連の用語を定義する。詳細な説明において他の定義も記載される。

用語「ＰＤ－１」とはプログラムされた細胞死タンパク質１をいう。用語「ＰＤ－１」は変異体、アイソタイプ、ホモログ、オーソログ及びパラログを含む。例えば、場合によっては、ヒトＰＤ－１タンパク質に特異的な抗体がヒト以外の生物種（例えば、サル）からのＰＤ－１タンパク質と交差反応することができる。他の実施形態では、ヒトＰＤ－１タンパク質に特異的な抗体はヒトＰＤ－１タンパク質に完全に特異であり、なお且つ他の生物種又は他のタイプに対して交差反応性を示さず、又は他の全ての生物種ではなく特定の他の生物種のＰＤ－１と交差反応を行うものであってもよい。

用語「ヒトＰＤ－１」とはヒト由来のアミノ酸配列、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５００９．２のヒトＰＤ－１のアミノ酸配列を有するＰＤ－１タンパク質をいう。用語「サル又はアカゲザルＰＤ－１」及び「マウスＰＤ－１」はそれぞれサル及びマウスＰＤ－１配列を言い、例えば、それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１０７８３０及びＣＡＡ４８１１３のアミノ酸配列を有するものである。

用語「免疫応答」とは、例えばリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、前記細胞又は肝臓によって産生された可溶性高分子（抗体、サイトカイン及び補体を含む）の作用を言い、侵入する病原体、病原体に感染された細胞もしくは組織、がん細胞、又は自己免疫もしくは病理学的炎症の場合に正常なヒト細胞もしくは組織の選択的損傷、破壊又は人体からの排除を引き起こす。

「抗原特異的Ｔ細胞応答」とは、Ｔ細胞特異的抗原がＴ細胞を刺激することで起こる、Ｔ細胞によって行われる応答を言う。抗原特異的刺激に対するＴ細胞の応答の非限定的な例は増殖及びサイトカイン産生（例えば、ＩＬ－２産生）を含む。

本明細書で使用される用語「抗体」は完全な抗体及びその任意の抗原結合断片（即ち「抗原結合部分」）又はその鎖を含む。完全な抗体は、ジスルフィド結合によって互いに接続された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬによって構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができ、間にはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保守的な領域が散在する。ＶＨ及びＶＬのそれぞれは３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなり、アミノ基末端からカルボキシル基末端まではＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に並ぶ。重鎖及び軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域が宿主組織又は因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介することができ、前記宿主組織又は因子は免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的な補体系の第１コンポーネント（Ｃ１ｑ）を含む。

本明細書で使用される用語、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）とは、抗原（例えば、ＰＤ－１タンパク質）に特異的に結合する能力が保持される抗体の１つ以上の断片をいう。抗体の抗原結合機能は全長抗体の断片によって実行できることは示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語には、結合断片の例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド結合によってリンクされた２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体シングルアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）、（ｖｉ）分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び（ｖｉｉｉ）重鎖可変領域が１つの可変ドメイン及び２つの定常ドメインを含むナノボディを含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬ及びＶＨは異なる遺伝子によってコードされるものの、組換えによりこれらを合成リンカーで接合させて、１つのタンパク質鎖を生成することができ、ただしＶＬ及びＶＨ領域がマッチングして一価分子を形成する（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれる。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照する）。このような一本鎖抗体も、用語抗体の「抗原結合部分」に含まれることが意図される。当業者に知られる従来の手法を用いてこれらの抗体断片を得、完全な抗体の場合と同じ方法で断片の有用性についてスクリーニングする。

本明細書で使用される「分離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する（例えば、ＰＤ－１タンパク質に特異的に結合する分離された抗体はＰＤ－１タンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ただし、ヒトＰＤ－１タンパク質に特異的に結合する分離された抗体は他の生物種からのＰＤ－１タンパク質など、他の抗原に対して交差反応性を示す場合がある。さらに、分離された抗体は他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まなくてもよい。

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、単一の分子組成の抗体分子の調製物をいう。モノクローナル抗体組成物は特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。

本明細書で使用される用語「マウス抗体」は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域がいずれもマウス生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含む。さらに、抗体が定常領域を含む場合に、定常領域もマウス生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する。本発明のマウス抗体はマウス生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発又はインビボ体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含んでもよい。しかしながら、本明細書で使用される用語「マウス抗体」は、別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がマウスフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことは意図されない。

用語「キメラ抗体」とは、非ヒト供給源からの遺伝物質及びヒト由来の遺伝物質を組み合わせて作られた抗体をいう。より一般的には、キメラ抗体は特定の生物種からの遺伝物質と別の生物種からの遺伝物質を有する抗体である。

本明細書で使用される用語「ヒト化抗体」とは非ヒト種由来の抗体を言い、そのタンパク質配列はヒトに自然に産生した抗体変異体との類似度を増すために修飾されている。

用語「アイソタイプ」とは重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）をいう。

本明細書では、用語「抗原認識抗体」及び「抗原に特異的な抗体」は、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と入れ替えて使用される。

本明細書で使用される用語「ヒトＰＤ－１と特異的に結合する」抗体とは、ヒトＰＤ－１タンパク質（及び１種以上の非ヒト生物種に由来するＰＤ－１タンパク質）に結合するが、非ＰＤ－１タンパク質に実質的に結合しない抗体を意味する。好ましくは、抗体は「高い親和性」でヒトＰＤ－１タンパク質に結合され、即ちＫＤは５．０×１０－８Ｍ以下であり、１．０×１０－８Ｍ以下であることがより好ましく、７．０×１０－９Ｍ以下であることがさらに好ましい。

本明細書で使用されるタンパク質又は細胞に「実質的に結合しない」という用語とは、タンパク質もしくは細胞に結合せず、又は高い親和性で結合しないこと、即ちタンパク質又は細胞との結合のＫＤは１．０×１０－６Ｍ以上であり、１．０×１０－５Ｍ以上であることが好ましく、１．０×１０－４Ｍ以上であることがより好ましく、１．０×１０－３Ｍ以上であることがさらに好ましく、１．０×１０－２Ｍ以上であることが一層好ましい。

用語ＩｇＧ抗体の「高い親和性」とは、標的抗原に対する抗体のＫＤは１．０×１０－６Ｍ以下であることを言い、５．０×１０－８Ｍ以下であることが好ましく、１．０×１０－８Ｍ以下であることがより好ましく、７．０×１０－９Ｍ以下であることがさらに好ましく、１．０×１０－９Ｍ以下であることが一層好ましい。しかしながら、他の抗体アイソタイプである場合に、「高い親和性」での結合は異なる場合がある。例えば、ＩｇＭアイソタイプの「高い親和性」結合とは、抗体は１０－６Ｍ以下のＫＤを有することを言い、１０－７Ｍ以下であることが好ましく、１０－８Ｍ以下であることがより好ましい。

本明細書で使用される用語「Ｋａｓｓｏｃ」又は「Ｋａ」とは、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を言い、本明細書で使用される用語「Ｋｄｉｓ」又は「Ｋｄ」とは特定の抗体－抗原相互作用の解離速度をいう。本明細書で使用される用語「ＫＤ」は、ＫｄとＫａの比（即ち、Ｋｄ／Ｋａ）で算出される解離定数を言い、モル濃度（Ｍ）で表す。抗体のＫＤ値は本分野の周知の方法で決定できる。抗体のＫＤの決定方法としては、表面プラズモン共鳴を用いることが好ましく、バイオセンサーシステム、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムを使用することが好ましい。

用語「ＥＣ５０」は、半数効果濃度とも呼ばれ、所定の曝露時間後にベースラインと最大値の間の半分の応答を誘発する抗体の濃度を言う。

用語「ＩＣ５０」は、半数阻害濃度とも呼ばれ、抗体が存在しない場合と比べ、特定の生物学的又は生化学的機能を５０％阻害する抗体の濃度を言う。

用語「対象」は任意のヒト又は非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」には全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物（例えば、非ヒト霊長類動物、ヤギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生動物及び爬虫動物）が含まれ、非ヒト霊長類動物、ヤギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ等の哺乳動物であることが好ましい。

用語「治療有効量」とは、疾患又は状態（例えば、がん）に関連する症状を予防又は改善し且つ／又は疾患もしくは状態の重症度を軽減するのに十分な本発明の抗体の量をいう。治療有効量は治療される状態に関連することが理解され、当業者が実際の有効量を容易に認識することができる。

次の各見出しにおいて、本発明の各態様をより詳細に説明する。

増加されたヒトＰＤ－１との結合親和性及びより優れた抗腫瘍効果を有する抗ＰＤ－１抗体
本発明の抗体又はその抗原結合部分はヒトＰＤ－１に特異的に結合し、且つ前述した抗ＰＤ－１抗体（特にニボルマブ）と比べて、改善された結合親和性及び（より優れたものでない場合に）同等の抗腫瘍効果を有する。

本発明の抗体又はその抗原結合部分は好ましくは７．０×１０－９Ｍ以下のＫＤ、より好ましくは５．０×１０－１０Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ－１タンパク質に結合する。また、本発明の抗体は約１．０×１０－７Ｍから１．０×１０－１０ＭのＫＤでカニクイザルＰＤ－１に結合する。

他の機能特性はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断能力を含む。一実施形態では、本発明の抗体はニボルマブの場合と同様な濃度でＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合を阻害できる。

他の機能特性は抗体の免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）刺激能力を含む。例えば、抗体が抗原特異性Ｔ細胞応答におけるインターロイキン２（ＩＬ－２）の産生を刺激する能力を評価することでテストできる。特定の実施形態では、抗体がヒトＰＤ－１に結合して抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する。他の実施形態では、抗体がヒトＰＤ－１に結合するが、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激しない。抗体の免疫応答刺激能力を評価する他の方法は、（例えば、インビボ腫瘍移植モデルにおける）腫瘍増殖の阻害能力、もしくは（自己免疫モデルにおける自己免疫疾患の発達促進能力など）自己免疫応答の刺激能力（例えば、ＮＯＤマウスモデルにおける糖尿病発症の促進能力）をテストすることを含む。

本発明の好ましい抗体はヒトモノクローナル抗体である。追加的に又はあるいは、抗体は、例えば、キメラ又はヒト化のモノクローナル抗体である。

モノクローナル抗ＰＤ－１抗体
本発明の好ましい抗体は次の及び「実施例」の部分に記載される構造的及び化学的に特徴付けられたモノクローナル抗体である。抗ＰＤ－１抗体のＶＨアミノ酸配列は配列番号６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８又は７９に記載される。抗ＰＤ－１抗体のＶＬアミノ酸配列は配列番号８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５又は９６に記載される。抗体の重／軽鎖可変領域のアミノ酸配列の識別番号を表１にまとめ、一部のクローンでは同じＶＨ又はＶＬを共有する。全てのクローンの重鎖定常領域はＩｇＧ１重鎖定常領域であってもよく、例えば、配列番号９７に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１重鎖定常領域、又は、配列番号１２９に記載のアミノ酸配列を有するマウスＩｇＧ１重鎖定常領域であり、且つ全てのクローンの軽鎖定常領域はκ定常領域であってもよく、例えば、配列番号９８に記載のアミノ酸配列を有するヒトκ定常領域、又は配列番号１３０に記載のアミノ酸配列を有するマウスκ定常領域である。抗体Ｆａｂは重鎖／軽鎖可変領域、重鎖ＣＨ１領域（例えば、配列番号９９に記載されたもの）及び軽鎖定常領域を含んでもよい。

表１で重鎖可変領域ＣＤＲ及び軽鎖可変領域ＣＤＲはそれぞれＩＭＧＴ番号付け体系及びＫａｂａｔ番号付け体系によって定義される。なお、本分野で周知されるように、ＣＤＲ領域は他の体系（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＣＣＧ体系／方法）によって、重鎖／軽鎖可変領域配列に基づいて決定されてもよい。

ヒトＰＤ－１に結合する他の抗ＰＤ－１抗体のＶＨ及びＶＬ配列（又はＣＤＲ配列）は本発明の抗ＰＤ－１抗体のＶＨ及びＶＬ配列（又はＣＤＲ配列）に「混合且つ適合」されることが可能である。好ましくは、ＶＨ及びＶＬ鎖（又はこのような鎖中のＣＤＲ）が混合且つ適合される場合には、特定のＶＨ／ＶＬペアに由来するＶＨ配列が構造的に類似しているＶＨ配列によって置換される。同様に、特定のＶＨ／ＶＬペアからのＶＬ配列を構造的に類似しているＶＬ配列に置換することが好ましい。

したがって、一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、
（ａ）前記表１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）前記表１に記載のアミノ酸配列、又は別の抗ＰＤ－１抗体のＶＬを含み、当該抗体がヒトＰＤ－１に特異的に結合する軽鎖可変領域とを含む。

別の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、
（ａ）前記表１に記載の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域と、
（ｂ）前記表１に記載の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域、又は別の抗ＰＤ－１抗体のＣＤＲであって、当該抗体がヒトＰＤ－１に特異的に結合するものとを含む。

別の実施形態では、抗体又はその抗原結合部分はヒトＰＤ－１に結合する他の抗体のＣＤＲに結合された抗ＰＤ－１抗体の重鎖可変ＣＤＲ２領域を含み、例えば、異なる抗ＰＤ－１抗体からの重鎖可変領域のＣＤＲ１及び／もしくはＣＤＲ３、及び／又は軽鎖可変領域からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／もしくはＣＤＲ３である。

また、本分野で周知されるように、ＣＤＲ３ドメインはＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２ドメインから独立しているもので、同種抗原に対する抗体の結合特異性を単独で決定することができ、しかも共通のＣＤＲ３配列に基づいて同じ結合特異性を有する複数の抗体を生成できることが予想される。例えば、Ｋｌｉｍｋａ ｅｌ ａｌ．，，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ８３（２）：２５２－２６０（２０００）、Ｂｅｉｂｏｅｒ ｅｌ ａｌ．，，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３－８４９（２０００）、Ｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０－８９１５（１９９８）、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１－２１６２（１９９４）、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９２：２５２９－２５３３（１９９５）、Ｄｉｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９－７４９（１９９６）、Ｂｅｒｅｚｏｖ ｅｔ ａｌ．，，ＢＩＡｊｏｕｒｎａｌ ８：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ８（２００１）、Ｉｇａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，，Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１７：４５２－７（１９９５）、Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２：８０７－１０（１９９８）、Ｌｅｖｉ ｅｔ ａｌ．，，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４３７４－８（１９９３）、Ｐｏｌｙｍｅｎｉｓ ａｎｄ Ｓｔｏｌｌｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５２１８－５３２９（１９９４）及びＸｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：３７－４５（２０００）を参照する。さらに、米国登録特許第６，９５１，６４６号、同６，９１４，１２８号、同６，０９０，３８２号、同６，８１８，２１６号、同６，１５６，３１３号、同６，８２７，９２５号、同５，８３３，９４３号、同５，７６２，９０５号及び同５，７６０，１８５号を参照する。前記参考文献のそれぞれはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

したがって、別の実施形態では、本発明の抗体は抗ＰＤ－１抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２及び少なくとも抗ＰＤ－１抗体の重鎖及び／もしくは軽鎖可変領域のＣＤＲ３、又は別の抗ＰＤ－１抗体の重鎖及び／もしくは軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含み、ただし、当該抗体がヒトＰＤ－１に特異的に結合できる。好ましくは、これらの抗体が、（ａ）ＰＤ－１に競合的に結合し、（ｂ）機能特性が保持され、（ｃ）同じエピトープに結合し、且つ／又は（ｄ）本発明の抗ＰＤ－１抗体と類似する結合親和性を有する。別の実施形態では、前記抗体は抗ＰＤ－１抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、又は別の抗ＰＤ－１抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２をさらに含んでもよく、ただし、前記抗体はヒトＰＤ－１に特異的に結合できる抗体である。別の実施形態では、本発明の抗体は抗ＰＤ－１抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１、又は別のＰＤ－１抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１を含んでもよく、ただし、当該抗体がヒトＰＤ－１に特異的に結合できる。

保守的修飾
別の実施形態では、本発明の抗体はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の重鎖及び／又は軽鎖可変領域配列を含み、前記配列と本発明の抗ＰＤ－１抗体の配列の相違点は１つ以上の保守的修飾を有することである。本分野で理解されるように、特定の保守的配列修飾は抗原結合を除去せずに行うことができる。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２：１１８０－８、ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５－４１、Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４－２６８７０、Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５－１２、Ｋｅｌｌｅｙ ａｎｄ Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２－３５、Ａｄｉｂ－Ｃｏｎｑｕｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０．３４１－６及びＢｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５－４３を参照する。

したがって、一実施形態では、当該抗体はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域及び／又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域を含み、ただし、
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ１配列が前記表１に記載の配列、及び／又はその保守的修飾を含み、且つ／又は
（ｂ）重鎖可変領域ＣＤＲ２配列が前記表１に記載の配列、及び／又はその保守的修飾を含み、且つ／又は
（ｃ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列が前記表１に記載の配列、及びその保守的修飾を含み、且つ／又は
（ｄ）軽鎖可変領域ＣＤＲ１及び／もしくはＣＤＲ２及び／もしくはＣＤＲ３配列が前記表１に記載の配列、及び／又はその保守的修飾を含み、且つ
（ｅ）抗体がヒトＰＤ－１に特異的に結合する。

本発明の抗体は、例えば、ヒトＰＤ－１と高い親和性での結合、ＰＤ－１を発現する細胞に対するＡＤＣＣ又はＣＤＣの誘発能力等、前述した機能特性の１種以上を有する。

様々な実施形態では、抗体は例えば、マウス、ヒト、ヒト化の抗体又はキメラ抗体である。

本明細書で使用される用語「保守的配列修飾」は、当該アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響せず又は改変させないアミノ酸修飾を意味する。このような保守的修飾にはアミノ酸の置換、追加及び削除が含まれる。本分野で知られる標準的な技術、例えば、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介性突然変異誘発によって本発明の抗体に修飾を導入することができる。保守的なアミノ酸の置換とは、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されるアミノ酸置換をいう。同様の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは本分野で既に定義されている。このようなファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基によって置換されてもよく、しかも改変された抗体の保持された機能（即ち、上記の機能）はここに記載の機能アッセイを用いてテストすることができる。

操作及び修飾された抗体
本発明の抗ＰＤ－１抗体の１つ以上のＶＨ／ＶＬ配列を有する抗体を出発材料として、修飾された抗体を操作して本発明の抗体を製造することができる。１つ又は２つの可変領域（即ちＶＨ及び／又はＶＬ）内（例えば、１つ以上のＣＤＲ領域内及び／又は１つ以上のフレームワーク領域内）の１つ以上の残基を修飾することによって抗体を操作することができる。追加的に又はあるいは、定常領域内の残基を修飾することによって、例えば、抗体のエフェクター機能を改変させるために抗体を操作することができる。

特定の実施形態では、ＣＤＲ移植は抗体の可変領域を操作するために用いることができる。抗体は主に６つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基によって標的抗原と相互作用する。したがって、各抗体間のＣＤＲ内のアミノ酸配列がＣＤＲ外の配列よりも差異が大きい。抗体－抗原相互作用の殆どにＣＤＲ配列が関与するため、異なる特徴を有する異なる抗体のフレームワーク配列に移植されている特定の天然抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現することが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．並びにＵ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９－１００３３、米国登録特許第５，２２５，５３９号、同５，５３０，１０１号、同５，５８５，０８９号、同５，６９３，７６２号及び同６，１８０，３７０号を参照する）。

したがって、本発明の別の実施形態は分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分に関し、本発明の前記配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を備える重鎖可変領域、及び／又は、本発明の前記配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む配列を備える軽鎖可変領域を含む。これらの抗体は本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列を含むが、それらは異なるフレームワーク配列を含んでもよい。

このようなフレームワーク配列は公共のＤＮＡデータベース又は生殖系列抗体遺伝子配列が言及された公開文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（Ｉｎｔｅｒｎｅｔ上のウェブサイトｗｗｗ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅにて利用可能）、及びＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）による前掲文献、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－７９８及びＣｏｘ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７－８３６で見つけることができる。各内容は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。別の例として、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースでヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列を見つけることができる。例えば、ＨＣｏ７ ＨｕＭＡｂマウスに発見された次の重鎖生殖系列配列のそれぞれは、１～６９（ＮＧ－００１０１０９，ＮＴ－０２４６３７＆ＢＣ０７０３３３）、３～３３（ＮＧ－００１０１０９＆ＮＴ－０２４６３７）及び３～７（ＮＧ－００１０１０９＆ＮＴ－０２４６３７）のように、前記Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号で得ることができる。別の例として、ＨＣｏｌ２ ＨｕＭＡｂマウスに発見された次の重鎖生殖系列配列のそれぞれは、１～６９（ＮＧ－００１０１０９，ＮＴ－０２４６３７＆ＢＣ０７０３３３）、５～５１（ＮＧ－００１０１０９＆ＮＴ－０２４６３７）、４～３４（ＮＧ－００１０１０９＆ＮＴ－０２４６３７）、３～３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）＆３～２３（ＡＪ４０６６７８）のように、前記Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号で得ることができる。

当業者に周知されるＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴと呼ばれる配列類似度探索方法の一つ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７），前掲）を用いて、抗体タンパク質配列とコンパイルされたタンパク質配列データベースを比較する。

本発明の抗体に用いるフレームワーク配列は、本発明の抗体が使用するフレームワーク配列と構造的に類似しているものが好ましい。ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列が当該フレームワーク配列からの生殖系列免疫グロブリン遺伝子と同一の配列を有するフレームワーク領域に移植されてもよいし、ＣＤＲ配列が生殖系列配列と比べて１つ以上の突然変異を含むフレームワーク領域に移植されてもよい。例えば、場合によっては、フレームワーク領域内の残基を突然変異させて、抗体の抗原結合能力を維持又は増強させることが役立つことが発見された（例えば、米国登録特許第５，５３０，１０１号、同５，５８５，０８９号、同５，６９３，７６２号及び同６，１８０，３７０号を参照する）。

可変領域修飾のもう１つのタイプはＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を突然変異させることによって、目的抗体の１つ以上の結合特性（例えば、親和性）を改善することである。部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ媒介性突然変異誘発を行って突然変異を導入することができ、しかも本分野で周知されるように、インビトロ又はインビボアッセイによって抗体結合又は他の目的機能特性に対する影響を評価することができる。（本分野で知られるように）保守的修飾を導入することが好ましい。突然変異はアミノ酸の置換、追加又は削除であってもよく、置換が好ましい。さらに、一般にＣＤＲ領域では１個、２個、３個、４個又は５個以下の残基が変更される。

したがって、本発明の別の実施形態では、分離された抗ＰＤ－１モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供し、（ａ）本発明の配列、又は１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸の置換、削除もしくは追加を有するアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲ１領域、（ｂ）本発明の配列、又は１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸の置換、削除もしくは追加を有するアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲ２領域、（ｃ）本発明の配列、又は１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸の置換、削除もしくは追加を有するアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲ３領域、（ｄ）本発明の配列、又は１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸の置換、削除もしくは追加を有するアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲ１領域、（ｅ）本発明の配列、又は１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸の置換、削除もしくは追加を有するアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲ２領域、（ｆ）本発明の配列、又は１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸の置換、削除もしくは追加を有するアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲ３領域、を備える重鎖可変領域を含む。

本発明の操作された抗体はＶＨ及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基を修飾することによって、例えば抗体の特性を改善するような抗体を含む。一般に、このようなフレームワーク修飾は抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば、その１つの方法は１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「復帰突然変異」することである。より具体的には、体細胞突然変異が行われた抗体は当該抗体が由来する生殖系列配列と異なるフレームワーク残基を含んでもよい。抗体フレームワーク配列と抗体が由来する生殖系列配列を比較することによってこのような残基を同定することができる。

フレームワーク修飾のもう１つのタイプはフレームワーク領域内ひいては１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基を突然変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去して、抗体の潜在的免疫原性を低下させることに関する。当該方法は「脱免疫」とも呼ばれ、その詳細な説明は米国出願公開特許第２００３０１５３０４３号に記載されている。

また、フレームワーク又はＣＤＲ領域内で行われる修飾の代わりに、Ｆｃ領域内の修飾を含むように、一般に抗体の１種以上の機能特性、例えば血中半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、及び／又は抗原依存性細胞傷害を改変させるように、本発明の抗体を操作してもよい。また、本発明の抗体を化学的に修飾し（例えば、１つ以上の化学部分を当該抗体に結合させ）、又はグリコシル化を変えるように修飾を行って、再び当該抗体の１つ以上の機能特性を変更させてもよい。

一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域を修飾して、ヒンジ領域中のシステイン残基の数量を変更させる（例えば、増加又は減少する）。当該方法の説明は米国登録特許第５，６７７，４２５号を参照する。ＣＨ１のヒンジ領域のシステイン残基の数量を変更して、例えば、軽鎖及び重鎖の組み立てを促進させ、又は抗体の安定性を向上もしくは低下させる。

別の実施形態では、抗体の生物学的半減期を短縮させるために抗体のＦｃヒンジ領域が突然変異される。より具体的には、１種以上のアミノ酸突然変異をＦｃ－ヒンジ断片のＣＨ２－ＣＨ３ドメインのインタフェース領域に導入して、天然Ｆｃ－ヒンジドメインＳｐＡ結合に対して、抗体は障害された黄色ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合を有する。当該方法の詳細な説明は米国登録特許第６，１６５，７４５号に記載される。

別の実施形態では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、グリコシル化抗体を製造することができる（即ち、当該抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化を変更させて、例えば、抗原に対する抗体の親和性を高めることができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を変更させることによって完了される。例えば、１つ以上のアミノ酸の置換を行い、その結果、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位が除去されて、当該部位のグリコシル化が除去される。このような脱グリコシル化の除去は抗原に対する抗体の親和性を増加させることができる。例えば、米国登録特許第５，７１４，３５０号及び同６，３５０，８６１号を参照する。

加えて又はあるいは、改変タイプのグリコシル化を有する抗体、例えばフコシル残基の量の減少した低フコシル化抗体又はバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を追加した抗体を作ることができる。このような改変されたグリコシル化パターンによって抗体のＡＤＣＣ能力が向上することが既に証明されている。このような炭水化物修飾は、例えば、宿主細胞において改変されたグリコシル化機構によって抗体を発現することで実現できる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は本分野で既に説明されており、しかも宿主細胞として用いることができ、本発明の組換え抗体を発現して、改変されたグリコシル化を有する抗体を産生することができる。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９はフコシル基転移酵素遺伝子ＦＵＴ８（α（ｌ，６）－フコシル基転移酵素）を欠くため、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９細胞株で発現された抗体はその炭水化物においてフコースを欠く。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９ ＦＵＴ８－／－細胞株は２つの置換ベクターを用いるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的破壊により作成される（米国出願公開特許第２００４０１１０７０４号及びａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７：６１４－２２を参照する）。別の例として、欧州特許出願第ＥＰ１，１７６，１９５号では、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株が説明されており、当該遺伝子がフコシル基転移酵素をコードして、このような細胞株で発現された抗体はα－１，６結合に関連する酵素を減少又は除去することによって低フコシル化が表現される。欧州特許出願第ＥＰ１，１７６，１９５号では、低酵素活性により、フコースを抗体Ｆｃ領域に結合されたＮ－アセチルグルコサミンに追加する又は酵素活性を持たない細胞株、例えばラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）が説明される。ＰＣＴ国際出願第ＷＯ０３／０３５８３５号では、Ａｓｎ（２９７）がリンクされた炭水化物に対するフコースの結合能力を低下させ、当該宿主細胞で発現された抗体の低フコシル化につながる変異体ＣＨＯ細胞株Ｌｅｃ１３細胞が説明される（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０も参照する）。ＰＣＴ国際出願第ＷＯ０６／０８９２３１号に記載されるように、ニワトリの卵において修飾されたグリコシル化特徴を有する抗体を産生することができる。又は、植物細胞（例えば、ウキクサ）において修飾されたグリコシル化特徴を有する抗体を産生することができる。Ａｌｓｔｏｎ＆Ｂｉｒｄ ＬＬＰ弁護士整理番号０４０９８９／３１４９１１に対応する２００６年８月１１日に提出された米国特許出願では、植物系における抗体産生方法が開示される。ＰＣＴ国際出願第ＷＯ９９／５４３４２号では、細胞株を操作して、糖タンパク質によって修飾されたグリコシル転移酵素（例えばβ（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニル転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現することによって、操作細胞株で発現された抗体が追加のバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を示し、抗体のＡＤＣＣ活性増加につながる（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６－１８０も参照する）。あるいは、フコシダーゼを用いて、抗体のフコース残基を切断して除去してもよい。例えば、フコシダーゼα－Ｌ－フコシダーゼで抗体からフコシル残基を削除する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６－２３）。

本開示の内容から想定された本発明の抗体の別の修飾はペグ化である。例えば、抗体の生物学的（例えば、血中）半減期を増やすために、抗体をペグ化してもよい。抗体をペグ化するには、一般に１つ以上のＰＥＧ基が抗体又は抗体断片に結合されている状態において、抗体又はその断片をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体）と反応させてもよい。好ましくは、反応性ＰＥＧ分子（又は、類似する反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応によりペグ化を行う。本明細書で使用される用語「ポリエチレングリコール」は既に他のタンパク質の誘導体化のために用いた任意の形態のＰＥＧ、例えば、モノ（Ｃ１－Ｃ１０）アルコキシ－もしくはアリールオキシ－ポリエチレングリコールもしくはポリエチレングリコール－マレイミドを含むことが意図される。特定の実施形態では、ペグ化される抗体は非グリコシル化抗体である。タンパク質のペグ化方法は本分野で既知の内容であり、且つ本発明の抗体に用いることができる。例えば、欧州特許出願第ＥＰ０，１５４，３１６号及び同ＥＰ０，４０１，３８４号を参照する。

抗体の物性
本発明の抗体は、その様々な物性で特徴付けて、その異なるクラスを検出及び／又は区別することができる。

例えば、抗体は軽鎖又は重鎖可変領域に１つ以上のグリコシル化部位が含まれてもよい。抗原結合の変化により、このようなグリコシル化部位は抗体の免疫原性増加又は抗体のｐＫ変化につながる（Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ（１９７２）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４１：６７３－７０２、Ｇａｌａ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（２００４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：５４８９－９４、Ｗａｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６８：１０９９－１０９、Ｓｐｉｒｏ（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：４３Ｒ－５６Ｒ、Ｐａｒｅｋｈ ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１６：４５２－７及びＭｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７：６９７－７０６）。なお、グリコシル化がＮ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフに発生することは既知の事項である。場合によっては、可変領域グリコシル化を含まない抗ＰＤ－１抗体を有することが好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択し、又はグリコシル化領域内の残基を突然変異させることによって実現できる。

好ましい実施形態では、抗体はアスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンの脱アミド化はＮ－Ｇ又はＤ－Ｇ配列に生じて、イソアスパラギン酸の残基生成につながる場合があり、当該残基はポリペプチド鎖にリンクを導入してその安定性を低下させる（イソアスパラギン酸作用）。

各抗体は、一般に６～９．５のｐＨ範囲にある独特な等電点（ｐＩ）を有する。ＩｇＧ１抗体のｐＩは一般に７～９．５のｐＨ範囲にあり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは一般に６～８のｐＨ範囲にある。ｐＩ値が正常な範囲を超える抗体はインビボにおいて一部アンフォールディング及び不安定性を生じるとの推測もある。したがって、正常な範囲にあるｐＩ値を含む抗ＰＤ－１抗体を有することが好ましい。これは、ｐＩが正常な範囲内にある抗体を選択し、又は荷電表面残基の突然変異により実現できる。

本発明の抗体をコードする核酸分子
本発明の別の態様では、本発明の抗体の重鎖及び／もしくは軽鎖可変領域又はＣＤＲをコードする核酸分子を提供する。核酸は完全な細胞、細胞溶解物に存在してもよいし、又は部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な状態で存在してもよい。標準的な技術により他の細胞成分又は他の汚染物質（例えば、他の細胞核酸又はタンパク質）から精製された時、核酸は「分離された」ものであり又は「実質的に純粋な状態で提供される」。本発明の核酸は例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、且つ、イントロン配列を含んでもよいし又は含まなくてもよい。好ましい一実施形態では、核酸はｃＤＮＡ分子である。

本発明の核酸は標準的な分子生物学技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を持つ遺伝子組換えマウスから作成されたハイブリドーマ、次の更なる説明を参照）によって発現された抗体である場合に、標準的なＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術により、ハイブリドーマから製造された抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡを得ることができる。（例えば、ファージディスプレイ技術を用いて）免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られた抗体である場合に、遺伝子ライブラリーから、このような抗体をコードする核酸を回収することができる。

本発明の核酸分子は、好ましくは、ＰＤ－１モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬ配列又はＣＤＲをコードする核酸分子を含む。ＶＨ及びＶＬ断片をコードするＤＮＡ断片が得られると、標準的な組換えＤＮＡ技術により、このようなＤＮＡ断片をさらに操作することができ、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換する。これらの操作では、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片と、別のタンパク質（例えば、抗体定常領域又はフレキシブルリンカー）をコードするもう１つのＤＮＡ断片が操作可能にリンクされる。本明細書で使用される用語「操作可能にリンクされる」とは、２つのＤＮＡ断片がリンクされて、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままだということである。

ＶＨをコードするＤＮＡと重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードするもう１つのＤＮＡ分子を操作可能にリンクさせることによって、ＶＨ領域をコードする分離されたＤＮＡを全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は本分野で既知の内容であり、しかも標準的なＰＣＲ増幅により、これらの領域を包含するＤＮＡ断片を得ることができる。重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であってもよく、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４定常領域であることが最も好ましい。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子である場合に、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域をコードするもう１つのＤＮＡ分子に操作可能にリンクしてもよい。

ＶＬをコードするＤＮＡと軽鎖定常領域ＣＬをコードするもう１つのＤＮＡ分子を操作可能にリンクさせることによって、ＶＬ領域をコードする分離されたＤＮＡを全長軽鎖遺伝子（及びＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は本分野では既知の内容であり、しかも標準的なＰＣＲ増幅により、これらの領域を包含するＤＮＡ断片を得ることができる。好ましい実施形態では、軽鎖定常領域はκ又はλ定常領域であってもよい。

ｓｃＦｖ遺伝子を作成するために、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ断片とコードフレキシブルリンカー（例えば、コードアミノ酸配列（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）３）をコードするもう１つの断片を操作可能にリンクさせて、ＶＨ及びＶＬ配列を連続的な一本鎖タンパク質として発現することができ、ただし、ＶＬ及びＶＨ領域はフレキシブルリンカーによってリンクされる（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４を参照する）。

本発明のモノクローナル抗体の産生
Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５に記載された周知の体細胞雑種形成（ハイブリドーマ）技術を用いて、本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生することができる。モノクローナル抗体の産生に関する他の実施形態はＢリンパ球のウイルス性又は発癌性形質転換及びファージディスプレイ技術を含む。キメラ抗体又はヒト化抗体も本分野の周知事項である。参照文献の例は、米国登録特許第４，８１６，５６７号、同５，２２５，５３９号、同５，５３０，１０１号、同５，５８５，０８９号、同５，６９３，７６２号及び同６，１８０，３７０号であり、これらの文献の全ての内容が本明細書に組み込まれる。

本発明のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの生成
さらに、例えば、本分野で周知される組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション方法を組み合わせて（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２）、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて本発明の抗体を産生してもよい。一実施形態では、標準的な分子生物学技術によって得られた、部分的な又は全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを１種以上の発現ベクターに挿入して、転写及び翻訳調節配列に遺伝子を操作可能にリンクすることができる。本明細書では、用語「操作可能にリンクする」とは、抗体遺伝子をベクターに連結して、ベクター内の転写及び翻訳制御配列に抗体遺伝子の転写及び翻訳に対するその所望の調節機能を発揮させる。

用語「調節配列」は、抗体遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列の説明としては、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０））を参照する。哺乳動物宿主細胞での発現に好ましい調節配列は哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現をガイドするウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルスからのプロモーター及び／又はエンハンサーを含み、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）及びポリオーマである。あるいは、非ウイルス調節配列、例えば、ユビキチンプロモーター又はβ－グロビンプロモーターを用いてもよい。さらに、調節エレメントは異なる供給源からの配列、例えば、ＳＶ４０初期プロモーターからの配列及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列を含むＳＲαプロモーターシステムからなる（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６－４７２）。使用される発現宿主細胞に適応するように、発現ベクター及び発現制御配列を選択する。

抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は同一又は別々の発現ベクターに挿入することができる。好ましい実施形態では、可変領域は任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作成するために用いられ、なお、所望のアイソタイプの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をコードするための発現ベクターに可変領域を挿入することによって、ＶＨセグメントをベクトル内のＣＨセグメントに操作可能にリンクさせ、ＶＬセグメントをベクトル内のＣＬセグメントに操作可能にリンクさせる。加えて又はあるいは、組換え発現ベクターは宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードできる。抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングして、シグナルペプチドをインフレームで抗体鎖遺伝子のアミノ基末端にリンクさせてもよい。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（即ち、非免疫グロブリンに由来するシグナルペプチド）であってもよい。

抗体鎖遺伝子及び調節配列の他に、本発明の組換え発現ベクターは他の配列、例えば、調節ベクターが宿主細胞で複製される配列（例えば、複製起点）及び選択マーカー遺伝子を持ってもよい。選択マーカー遺伝子は既にベクターが導入された宿主細胞の選択に役立つ（例えば、米国登録特許第４，３９９，２１６号、同４，６３４，６６５号及び同５，１７９，０１７号を参照する）。例えば、一般には、選択マーカー遺伝子はベクターが導入された宿主細胞において、薬剤（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサート）耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子はジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を持つｄｈｆｒ宿主細胞に用いる）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）を含む。

軽鎖及び重鎖を発現させるために、標準的な技術により、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトさせる。用語「トランスフェクト」及び類似する各種の用語は一般に外因性ＤＮＡを原核又は真核宿主細胞に導入する様々な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション等を含むことを意味する。理論的には原核又は真核宿主細胞で本発明の抗体を発現することが可能であるが、真核細胞（最も好ましくは哺乳動物宿主細胞）で抗体を発現することが最も好ましく、これは真核細胞（特に哺乳動物細胞）が原核細胞よりも、適切に折り畳まれた且つ免疫学的活性を持つ抗体を組み立て、これを分泌する可能性が高いためである。

本発明の組換え抗体を発現するのに好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６－４２２０に記載されるｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含み、例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１－６２１に記載のＤＨＦＲ選択マーカーと使用する）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞と使用する場合に、もう１つの好ましい発現系はＰＣＴ国際出願第ＷＯ８７／０４４６２号、同ＷＯ８９／０１０３６号及び欧州特許出願第ＥＰ３３８，８４１号に開示されたＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合に、抗体が宿主細胞で発現され、又は好ましくは宿主細胞が成長する培地に抗体が分泌される期間に抗体が産生されるように、宿主細胞を培養する。標準的なタンパク質精製方法を用いて、培地から抗体を回収できる。

免疫複合体
本発明の抗体は治療剤と複合して免疫複合体、例えば、抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）を形成することができる。適切な治療剤は細胞毒素、アルキル化剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核輸出阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質、有糸分裂阻害剤を含む。ＡＤＣでは、好ましくは、抗体と治療剤が切断可能なリンカー（例えば、ペプチジル基、ジスルフィド結合又はヒドラゾンリンカー）によって複合される。より好ましくは、リンカーはペプチジルリンカーであり、例えば、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ、Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｖａｌ、Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ、Ｃｉｔ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ又はＧｌｕである。米国登録特許第７，０８７，６００号、同６，９８９，４５２号、同７，１２９，２６１号、ＰＣＴ国際出願第ＷＯ０２／０９６９１０号、同ＷＯ０７／０３８，６５８号、同ＷＯ０７／０５１，０８１号、同ＷＯ０７／０５９，４０４号、同ＷＯ０８／０８３，３１２号、同ＷＯ０８／１０３，６９３号、米国出願公開特許第２００６００２４３１７号、同２００６０００４０８１号及び同２００６０２４７２９５号の記載内容を参照してＡＤＣを調製することができ、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。

二重特異性分子
本開示の別の態様では、少なくとも１つの他の機能性分子（例えば、別のペプチド又はタンパク質（例えば、別の抗体又は受容体のリガンド））にリンクされた本発明の１種以上の抗体を含む二重特異性分子を提供することによって、少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を生成する。したがって、本明細書で使用される「二重特異性分子」は３つ以上の特異性を有する分子を含む。

一実施形態では、抗Ｆｃ結合特異性及び抗ＰＤ－１結合特異性の他に、二重特異性分子はさらに第３特異性を有する。第３特異性は抗増強因子（ＥＦ）、例えば、細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合することによって標的細胞に対する免疫応答を増す分子に対するものである。例えば、抗増強因子は（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＰＤ－１又はＩＣＡＭ－１によって）細胞傷害性Ｔ細胞又は他の免疫細胞に結合して、標的細胞に対する免疫応答を増加させることができる。

二重特異性分子は様々なフォーマット及びサイズを有してもよい。サイズスペクトルの一端では、二重特異性分子は従来の抗体フォーマットを保持しており、ただし、２つの同じ特異性の結合アームを有するのではなく、それぞれ異なる特異性を有する２つの結合アームを有することで異なる。もう一方の極端な例は、ペプチド鎖によってリンクされた２つの一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）からなる二重特異性分子であり、即ち、いわゆるＢｓ（ｓｃＦｖ）２構築体である。中間サイズの二重特異性分子はペプチジルリンカーによってリンクされた２つの異なるＦ（ａｂ）断片を含む。前記及び他のフォーマットの二重特異性分子は遺伝子工学、体細胞雑種形成又は化学的方法により製造することができる。例えば、Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌによる上掲文献、Ｃａｏ ａｎｄ Ｓｕｒｅｓｈ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９（６），６３５－６４４（１９９８）、ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ，，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，２１（８），３９１－３９７（２０００）、及び中に引用された参考文献を参照する。

抗体をコードし又は抗体を持つ腫瘍溶解性ウイルス
腫瘍溶解性ウイルスはがん細胞に感染し、死滅させることが好ましい。本発明の抗体は腫瘍溶解性ウイルスと組み合わせて使用することができる。あるいは、本発明の抗体をコードする腫瘍溶解性ウイルスを人体に導入することができる。

医薬組成物
本開示の別の態様では、薬学的に許容される担体と製剤化される１種以上の本発明の抗体を含む医薬組成物を提供する。組成物が１種以上の抗体を含む場合には、個別に投与を抗体することができる。当該組成物は、任意選択で、１種以上の追加の薬学的に活性な成分、例えば、別の抗体又は薬物（例えば、抗腫瘍薬）を含んでもよい。

医薬組成物は任意の数量の賦形剤を含んでもよい。使用可能な賦形剤は担体、界面活性剤、増粘剤もしくは乳化剤、固体結合剤、分散剤もしくは懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、防腐剤、等張剤、及びそれらの組み合わせを含む。Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）では、適切な賦形剤の選択及び使用が説明され、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる。

医薬組成物は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄もしくは表皮投与（例えば、注射又は注入）用に適することが好ましい。投与経路によって、酸及び不活性化させる可能性のある他の自然条件から保護するように、有効成分を材料にコーティングする。本明細書で使用される用語「非経口投与」は、一般には経腸又は局所投与ではなく、注射投与を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内の注射及び注入を含むが、これらに限定されない。あるいは、本発明の抗体は非経口経路、例えば、局所、表皮、又は粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下もしくは局所によって投与されてもよい。

医薬組成物は滅菌水溶液又は分散液の形態であってもよい。これらは高薬物濃度に適するマイクロエマルジョン、リポソーム又は他の規則的な構造として製剤化することができる。

担体材料と組み合わせて、単一剤形を製造する有効成分の量は、治療対象及び特定の投与パターンによって変わり、しかも一般には治療効果を生じる組成物の量である。一般に、１００パーセントに対して、当該量は薬学的に許容される担体と組み合わせた有効成分の約０．０１％から約９９％であり、約０．１％から約７０％が好ましく、約１％から約３０％が最も好ましい。

投与計画を調整して、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供する。例えば、１回のみのボーラス投与であってもよいし、用量を分けて経時的に投与してもよいし、又は治療状況の緊急性に応じて比例的に用量を減少又は増加させてもよい。投与及び用量の均一性のために、用量単位形態で非経口組成物を調製することが特に好適である。本明細書で使用される用量単位形態とは、治療対象への単一投与量として適する物理的に分離していた単位を言い、各単位は、必要な医薬担体と所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の有効成分を含む。あるいは、抗体は徐放性製剤として投与されてもよく、その場合に、より少ない頻度での投与でよい。

抗体の投与について、用量は宿主体重に対して約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇであってもよく、より一般には０．０１から５ｍｇ／ｋｇであってもよい。例えば、用量は０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、又は１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。例示的な治療計画では、週に１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、月に１回、３か月に１回又は３～６か月に１回投与する必要がある。本発明の抗ＰＤ－１抗体の好ましい投与計画は１ｍｇ／ｋｇ体重又は３ｍｇ／ｋｇ体重で静脈内投与することを含み、（ｉ）４週に６つの用量、その後、３か月に同用量、（ｉｉ）３週に１回、（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重で１回、その後、３週に１ｍｇ／ｋｇ体重のうちのいずれかの投与計画で抗体を投与する。いくつかの方法では、用量を調整して、約１～１０００μｇ／ｍｌ（いくつかの方法では、約２５～３００μｇ／ｍｌ）の血漿抗体濃度にする。

本発明の抗ＰＤ－１抗体の「治療有効用量」は疾患症状の重症度の低減、疾患無症状期間の頻度及び持続時間の増加、又は疾患がもたらす障害（身体障害を含む）の予防につながることが好ましい。例えば、担がん対象の治療では、「治療有効用量」は未治療の対象と比べ、腫瘍増殖を少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％阻害することが好ましい。治療有効量の治療用抗体は腫瘍のサイズを縮小し、又は対象の症状を改善させることができ、対象は一般にヒト又は別の哺乳動物である。

医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、マイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤であってもよい。生分解性又は生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸を使用できる。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照する。

例えば、（１）無針皮下注射装置（例えば、米国登録特許第５，３９９，１６３号、同５，３８３，８５１号、同５，３１２，３３５号、同５，０６４，４１３号、同４，９４１，８８０号、同４，７９０，８２４号及び同４，５９６，５５６号）、（２）微量注入ポンプ（米国登録特許第４，４８７，６０３号）、（３）経皮装置（米国登録特許第４，４８６，１９４号）、（４）注入装置（米国登録特許第４，４４７，２３３号及び同４，４４７，２２４号）、及び（５）浸透装置（米国登録特許第４，４３９，１９６号及び同４，４７５，１９６号）といった医療装置で治療組成物を投与することができ、前記文献の開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態では、インビボでの適切な分布を確保するために、本発明のモノクローナル抗体を製剤化することができる。例えば、本発明の治療用抗体は血液脳関門を通過しやすいように、リポソームとしてもよいし、また、特定の細胞又は器官への選択的輸送を増強させるために、標的部分をさらに含んでもよい。例えば、米国登録特許第４，５２２，８１１号、同５，３７４，５４８号、同５，４１６，０１６号及び同５，３９９，３３１号、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５、Ｕｍｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８、Ｂｌｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０、Ｍ．Ｏｗａｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０、Ｂｒｉｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４、Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０、Ｋｅｉｎａｎｅｎ ａｎｄ Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１２３及びＫｉｌｌｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２７３を参照する。

本発明の用途及び方法
本発明の抗体（組成物、二重特異性抗体、免疫複合体及び腫瘍溶解性ウイルスを含む他の形態）は、ＰＤ－１遮断による免疫応答増強等、様々なインビトロ又はインビボ効果を備える。インビトロ又はエクスビボで、抗体を培養中の細胞に投与してもよいし、例えば、インビボでヒト対象に投与して、様々な状況において免疫力を増強させる。したがって、本発明の一態様では、本発明の抗体又はその抗原結合部分を対象に投与して、対象における免疫応答を修飾することを含む、対象における免疫応答の修飾方法を提供する。応答が増強、刺激又はアップレギュレートされることが好ましい。

好ましい対象は免疫応答の増強を必要とするヒト患者を含む。前記方法は、免疫応答（例えば、Ｔ細胞媒介性免疫応答）を増強させて治療する障害を抱えるヒト患者の治療に特に適する。特定の実施形態では、前記方法は特に、インビボでのがん治療に適する。抗原特異的な免疫力増強を実現するために、抗ＰＤ－１抗体と対象抗原を共に投与してもよいし、又は当該抗原は既に治療対象（例えば、腫瘍又はウイルスを担持する対象）に存在している。ＰＤ－１に対する抗体が他の薬剤と投与される場合に、順に投与されてもよいし、同時に投与されてもよい。

本発明の抗ＰＤ－１抗体のＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２分子の結合を阻害し抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する能力により、本発明は、さらに、抗体を使用して抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激、増強又はアップレギュレートするインビトロ及びインビボ方法を提供する。例えば、本発明は、前記Ｔ細胞と本発明の抗体を接触させて、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激することを含む、抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激方法を提供する。抗原特異的Ｔ細胞応答に対する任意の適切な指示は、抗原特異的Ｔ細胞応答を測定するために使用できる。

このような適切な指示の非限定的な例は、抗体の存在下でのＴ細胞増殖の増加及び／又は抗体の存在下でのサイトカインの産生増加が挙げられる。好ましい一実施形態では、抗原特異性Ｔ細胞の刺激によるインターロイキン２の産生である。

本発明は、さらに、本発明の抗体を対象に投与して、対象の免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を刺激することを含む対象における免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）の刺激方法を提供する。好ましい一実施形態では、前記対象は担がん対象であり、且つ前記腫瘍に対する免疫応答が刺激される。別の好ましい実施形態では、前記対象はウイルスを持つ対象であり、しかも前記ウイルスに対する免疫応答が刺激される。

別の実施形態では、本発明は、本発明の抗体を対象に投与して、対象における腫瘍の増殖を阻害することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖阻害方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の抗体を対象に投与し、対象におけるウイルス感染を治療することを含む、対象におけるウイルス感染の治療方法を提供する。

次に、本発明の前記方法及び他の方法をより詳細に説明する。

がん
抗体によるＰＤ－１遮断は患者のがん細胞に対する免疫応答を増強させることができる。本発明の一態様では、抗ＰＤ－１抗体を使用してインビボで対象を治療して、がん性腫瘍の増殖を阻害することに関する。抗ＰＤ－１抗体はがん性腫瘍の増殖を阻害するために単独で使用することができる。あるいは、抗ＰＤ－１抗体は下記のように、がん治療で使用される他の免疫原性薬剤（例えば、腫瘍溶解性ウイルス）又は他の抗体と組み合わせて使用されてもよい。

したがって、本発明の一実施形態では、治療有効量の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象における腫瘍細胞増殖の阻害方法を提供する。当該抗体は、マウス、キメラ又はヒト化の抗ＰＤ－１抗体であることが好ましい。

本発明の抗体を使用して増殖を阻害できるがんの好ましい例には、一般には免疫療法に応答があるがんを含む。治療対象として好ましいがんの非限定的な例には、原発性か転移性かを問わず、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓がん（例えば、明細胞がん）、前立腺がん（例えば、ホルモン抵抗性前立腺腺癌）、乳がん、結腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）を含む。また、本発明は、本発明の抗体を用いてその増殖を阻害できる難治性又は再発性の悪性腫瘍を含む。

本発明の方法を用いて治療できる他のがんの例には、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域がん、胃がん、精巣がん、輸卵管のがん腫、子宮内膜のがん腫、子宮頸のがん腫、膣のがん腫、外陰部のがん腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性又は急性の白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病を含む）、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓がんもしくは尿管がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ）肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発がん（アスベストによって誘発されたがんを含む）、及び前記がんの組み合わせを含む。本発明は、転移性がん、特に、ＰＤ－１を発現する転移性がんの治療に有用である（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１３３－１４４）。

任意選択で、ＰＤ－１に対する抗体を免疫原性薬剤と組み合わせてもよく、当該薬剤は、例えば、がん細胞、精製された腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド、炭水化物分子を含む）及び免疫刺激性サイトカインでコードする遺伝子によってトランスフェクションされた細胞である（Ｈｅ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：４９１９－２８）。使用可能な腫瘍ワクチンの非限定的な例には黒色腫抗原のペプチド、例えば、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ－２、ＭＡＲＴ１及び／又はチロシナーゼのペプチド、又はサイトカインＧＭ－ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞を含む。

ワクチン接種計画と組み合わされた場合に、ＰＤ－１遮断がより効果的である傾向にある。腫瘍に対するワクチン接種について様々な実験方法が設計されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．，２０００，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇ：６０－６２、Ｌｏｇｏｔｈｅｔｉｓ，Ｃ．，２０００，ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇ：３００－３０２、Ｋｈａｙａｔ，Ｄ．２０００，ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇ：４１４－４２８及びＦｏｏｎ，Ｋ．２０００，ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇ：７３０－７３８、並びに、Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．ａｎｄ Ｓｚｎｏｌ，Ｍ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｃｈ．６１，ｐｐ．３０２３－３０４３ ｉｎ ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９７，Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎを参照する）。これらの方法の１つでは、自家又は同種異系の腫瘍細胞を使用してワクチンを製造する。ＧＭ－ＣＳＦを発現するために腫瘍細胞が形質導入された場合に、これらの細胞ワクチンが最も効果的であることが既に証明されている。ＧＭ－ＣＳＦは腫瘍ワクチンの接種で抗原提示に強力な活性化因子であることが示されている（Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０：３５３９－４３）。

様々な腫瘍における遺伝子発現及び大規模な遺伝子発現パターンの研究が、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義につながる（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＳＡ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２８１－７）。多くの場合に、これらの腫瘍特異的抗原は腫瘍及び腫瘍が発生する細胞で発現された分化抗原であり、例えば、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原及びＴｒｐ－２である。より重要なのは、これらの抗原の多くは宿主に見られる腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であることが示された。ＰＤ－１遮断は腫瘍に発現された組換えタンパク質及び／又はペプチドのコレクションと組み合わせて使用して、これらのタンパク質に対する免疫応答を生じることができる。これらのタンパク質は一般に免疫系によって自己抗原と見なされるため、寛容的である。腫瘍抗原はタンパク質テロメラーゼを含んでもよく、当該タンパク質は染色体のテロメアの合成に必要とされ、しかもヒトがんの８５％以上及び限定的な一部の細胞組織において発現される（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：２０１１－２０１３）。様々な手段を利用して、これらの体細胞組織を免疫攻撃から守ることができる。体細胞突然変異がタンパク質配列を改変させ、２つの無関係な配列（即ち、フィラデルフィア染色体のｂｃｒ－ａｂｌ）の間に融合タンパク質、Ｂ細胞腫瘍のイディオタイプを形成させるため、腫瘍抗原はがん細胞で発現された「ネオ抗原（ｎｅｏ－ａｎｔｉｇｅｎ）」であってもよい。

他の腫瘍ワクチンはヒトがんに関連するウイルスのタンパク質、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶ及びＨＣＶ）、カポジ（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ）ヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ）を含んでもよい。ＰＤ－１遮断と組み合わせて使用できるもう１つのタイプの腫瘍特異的抗原は腫瘍組織自体から分離された、精製された熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）である。これらの熱ショックタンパク質は腫瘍細胞からのタンパク質の断片を含み、しかもこれらのＨＳＰは抗原提示細胞に送達して腫瘍免疫を引き起こす上で効率的である（Ｓｕｏｔ＆Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１５８５－１５８８及びＴａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１１７－１２０）。

樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答を引き起こすために用いる強力な抗原提示細胞である。エクスビボでＤＣを生成し、様々なタンパク質及びペプチド抗原並びに腫瘍細胞抽出物をロードすることができる（Ｎｅｓｔｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：３２８－３３２）。ＤＣは遺伝的手段による形質導入で、これらの腫瘍抗原を発現することができる。免疫化の目的で、ＤＣは既に腫瘍細胞に直接的に融合されている（Ｋｕｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：３３２－３３６）。ワクチン接種の方法として、ＤＣ免疫はＰＤ－１遮断と効果的に組み合わせて、より強力な抗腫瘍反応を活性化することができる。

ＰＤ－１遮断は標準的ながん治療と組み合わせることもできる。ＰＤ－１遮断は化学療法と効果的に組み合わせることができる。この場合には、投与される化学療法剤の用量を低減することができる（Ｍｏｋｙｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：５３０１－５３０４）。このような組み合わせの例は、黒色腫の治療のための抗ＰＤ－１抗体とダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）の組み合わせである。このような組み合わせの別の例は、黒色腫の治療のための抗ＰＤ－１抗体とインターロイキン２（ＩＬ－２）の組み合わせである。ＰＤ－１遮断及び化学療法の併用の科学的根拠は、細胞死が多くの化学療法化合物の細胞毒性作用の結果であり、抗原提示経路における腫瘍抗原レベルの増加を招くことである。細胞死とＰＤ－１遮断との相乗効果による他の併用療法は放射線、手術及びホルモン欠乏化である。これらの方法のそれぞれは宿主中の腫瘍抗原の由来を作り出す。血管新生阻害剤もＰＤ－１遮断と組み合わせることができる。血管新生の阻害が腫瘍細胞死を引き起こし、これは腫瘍抗原を宿主抗原提示経路に提供することができる。

ＰＤ－１遮断抗体はＦｃα又はＦｃγ受容体を発現するエフェクター細胞を腫瘍細胞に向かわせる二重特異性抗体と組み合わせて使用することができる（例えば、米国登録特許第５，９２２，８４５号及び同５，８３７，２４３号を参照する）。二重特異性抗体は２つの単独な抗原に向かわせるために用いることができる。例えば、マクロファージを腫瘍部位に標的化させるために、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（例えば、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ）二重特異性抗体を使用したことがある。このような標的化は腫瘍特異的応答をより効果的に活性化することができる。これらの応答のＴ細胞アームはＰＤ－１遮断によって増強される。あるいは、腫瘍抗原に結合する二重特異性抗体及び樹状細胞特異的細胞表面マーカーを使用して、直接的に抗原をＤＣに送達することができる。

腫瘍が様々なメカニズムによって宿主の免疫監視を避ける。これらのメカニズムの多くは、腫瘍によって発現された免疫抑制性タンパク質の不活性化により克服できる。これらにはＴＧＦ－β（Ｋｅｈｒｌ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：１０３７－１０５０）、ＩＬ－１０（Ｈｏｗａｒｄ＆Ｏ’Ｇａｒｒａ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １３：１９８－２００）、Ｆａｓリガンド（Ｈａｈｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：１３６３－１３６５）を含む。これらの実体のそれぞれの抗体は抗ＰＤ－１と組み合わせて使用して、免疫抑制剤の効果を相殺し宿主の腫瘍免疫応答を促進することができる。

宿主の免疫応答を活性化する他の抗体は抗ＰＤ－１と組み合わせて使用することができる。これには樹状細胞の表面上におけるＤＣ機能及び抗原提示を活性化させる分子を含む。抗ＣＤ４０抗体はＴ細胞ヘルパー活性（Ｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４７４－４７８）を効果的に代替し、且つＰＤ－１抗体と組み合わせて使用することができる（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１（５）５２７－４０）。Ｔ細胞共刺激分子に対する活性化抗体、例えば、ＣＴＬＡ－４（例えば、米国登録特許第５，８１１，０９７号）、ＯＸ－４０（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：２１６０－２１６９）、４－１ＢＢ（Ｍｅｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：６８２－６８５（１９９７））及びＩＣＯＳ（Ｈｕｔｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９７：２６２－２６６）も、レベルを引き上げたＴ細胞活性化を提供することができる。

他にも、抗原特異性Ｔ細胞の刺激による腫瘍への抵抗のための、抗原特異性Ｔ細胞のエクスビボ活性化及び増幅、並びにこれらの細胞の受容体への養子移入に関するいくつかの実験的な治療方法がある（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ＆Ｒｉｄｄｅｌｌ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：５４６－５１）。これらの方法は、ＣＭＶ等の感染性病原体に対するＴ細胞応答を活性化させるために用いることができる。抗ＰＤ－１抗体の存在下でのエクスビボ活性化によりＴ細胞への養子移入の頻度及び活性を高めることができる。

感染性疾患
本発明の他の方法は既に特定の毒素又は病原体に曝露された患者を治療するために用いられる。したがって、本発明の別の態様では、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合部分を前記対象に投与して、前記対象の前記感染性疾患を治療することを含む、対象における感染性疾患の治療方法を提供する。抗体はキメラ又はヒト化の抗体であることが好ましい。

腫瘍に対する前記用途と同様に、抗体媒介性ＰＤ－１遮断は単独で使用し、又はアジュバントとしてワクチンと組み合わせて使用して、病原体、毒素及び自己抗原に対する免疫応答を刺激することができる。このような治療方法が特に有用な病原体の例には、現在有効なワクチンがない病原体、又は従来のワクチンが完全に有効ではない病原体を含む。これには、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ及びＣ）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）、マラリア、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含むが、これらに限定されない。ＰＤ－１遮断はＨＩＶ用薬剤によって感染中に変化する抗原の既知の感染において特に有用である。これらの新規なエピトープは抗ヒトＰＤ－１投与時に外来性と見なされるため、強力なＴ細胞応答が起こり、当該応答はＰＤ－１による負のシグナルによって抑制されない。

本発明の方法で治療できる感染を引き起こす病原性ウイルスの一部の例には、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ又はＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ－１、ＨＡＶ－６、ＨＳＶ－ＩＩ及びＣＭＶ、エプスタインバー（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ）ウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ）、エコーウイルス（ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）、サイウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、コクサッキー（ｃｏｘｓａｃｋｉｅ）ウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、伝染性軟属腫（ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ）ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、アルボウイルスを含む。

本発明の方法で治療できる感染を引き起こす病原性細菌の一部の例には、クラミジア、リケッチア（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ）、マイコバクテリウム属、ブドウ球菌、レンサ球菌、肺炎レンサ球菌、髄膜炎菌及び淋菌、クレブシエラ属、変形菌、セラチア菌、シュードモナス属、レジオネラ、ジフテリア菌、サルモネラ、バシラス属（ｂａｃｉｌｌｉ）、コレラ菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、炭疽菌、ペスト菌、レプトスピラ属、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｌｙｍｅｓ）を含む。

本発明の方法で治療できる感染を引き起こす病原性真菌の一部の例には、カンジダ（カンジダ・アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・クルーセイ（ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・グラブラータ（ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）等）、クリプトコックス・ネオフォルマンス、アスペルギルス（アスペルギルス・フミガーツス（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（ｎｉｇｅｒ）等）、ケカビ目（ケカビ（ｍｕｃｏｒ）、ユミケカビ（ａｂｓｉｄｉａ）、クモノスカビ（ｒｈｉｚｏｐｕｓ））、スポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｋｉｉ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）を含む。

本発明の方法で治療できる感染を引き起こす病原性寄生生物の一部の例には、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）、フォーラーネグレリア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａｆｏｗｌｅｒｉ）、アカントアメーバ属（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｓｐ．）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）、ブルーストリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）ドノバン・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、ブラジル鉤虫（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）を含む。

前記方法の全てにおいて、ＰＤ－１遮断は他の形態の免疫療法（例えば、サイトカイン治療（例えば、インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－２）又は二重特異性抗体治療）と組み合わせて使用して、増強された腫瘍抗原提示を提供することができる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８及びＰｏｌｊａｋ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－１１２３を参照する）。

自己免疫応答
抗ＰＤ－１抗体は自己免疫応答を誘発及び増幅することができる。実際には、腫瘍細胞及びペプチドワクチンを用いる抗腫瘍応答の導入により、多くの抗腫瘍応答に抗自己反応性が関与することが判明した（ｖａｎ Ｅｌｓａｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：４８１－４８９、Ｏｖｅｒｗｉｊｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：２９８２－２９８７、Ｈｕｒｗｉｔｚ，（２０００）前掲、及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇ＆Ｗｈｉｔｅ（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９（１）：８１－４）。したがって、疾患治療のために、抗ＰＤ－１遮断と様々な自己タンパク質を組み合わせて使用して、ワクチン接種計画を設計して、これらの自己タンパク質に対する免疫応答を効率的に生成することが考えられる。

他の自己タンパク質も、例えば、アレルギー及び喘息を治療するＩｇＥ、並びに関節リウマチ用のＴＮＦαのように、標的として用いることができる。最後に、抗ＰＤ－１抗体を使用して、様々なホルモンに対する抗体応答を誘発することができる。生殖ホルモンに対する中和抗体反応は避妊目的で用いることができる。特定の腫瘍増殖に必要なホルモン及び他の可溶性因子に対する中和抗体の反応も、可能なワクチン接種標的と見なされてもよい。

上記の抗ＰＤ－１抗体の使用と同様な方法は治療用自己免疫応答を誘発して、他の自己抗原（例えば、サイトカイン（例えば、ＴＮＦα及びＩｇＥ））の不適切な蓄積を伴う患者の治療に用いることができる。

併用療法
本発明の別の態様では、本発明の抗ＰＤ－１抗体（又はその抗原結合部分）を、効果的に免疫を刺激する１種以上の他の抗体とともに投与して、対象の免疫応答を一層増強、刺激又はアップレギュレートさせる併用治療方法を提供する。一実施形態では、本発明は、抗ＰＤ－１抗体及び１種以上の他の免疫刺激抗体（例えば、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び／又は抗ＣＴＬＡ－４抗体）を対象に投与して、対象における免疫応答を刺激し、例えば、腫瘍増殖を阻害し又は抗ウイルス応答を刺激することを含む、対象における免疫応答の刺激方法を提供する。別の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＬＡＧ－３抗体を対象に投与する。別の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体を対象に投与する。別の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＣＴＬＡ－４抗体を対象に投与する。別の実施形態では、少なくとも１種の別の免疫刺激抗体（例えば、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１及び／又は抗ＣＴＬＡ－４抗体）はヒト抗体である。あるいは、少なくとも１種の別の免疫刺激抗体は、例えば、キメラ又はヒト化の抗体である（例えば、マウス抗ＬＡＧ－３、抗ＰＤ－Ｌ１及び／又は抗ＣＴＬＡ－４抗体から製造される）。

本発明の別の実施形態では、ＰＤ－１抗体及びＣＴＬＡ－４抗体を対象に投与することを含む過剰増殖性疾患（例えば、がん）の治療方法を提供する。別の実施形態では、治療量以下の用量で抗ＰＤ－１抗体を投与し、治療量以下の用量で抗ＣＴＬＡ－４抗体を投与し、又は治療量以下の用量で両者を投与する。本発明の別の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体及び治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ－４抗体を対象に投与することを含む、免疫刺激剤を用いる過剰増殖性疾患の治療に関連する有害事象の緩和方法を提供する。特定の実施形態では、対象はヒトである。他の実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体はヒト配列モノクローナル抗体１０Ｄ１（ＰＣＴ国際出願第ＷＯ０１／１４４２４号を参照）であり、且つ抗ＰＤ－１抗体はマウス配列モノクローナル抗体であり、例えば、本明細書に記載の抗ＰＤ－１抗体Ｃ１Ｈ５である。本発明の方法に含まれる他の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、次の文献（ＰＣＴ国際出願第ＷＯ９８／４２７５２号、同ＷＯ００／３７５０４号及び米国登録特許第６，２０７，１５６号、Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１７）：１００６７－１００７１、Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．２５０５（ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＰ－６７５２０６）及びＭｏｋｙｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：５３０１－５３０４）に開示されたものを含む。特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は５×１０－８Ｍ以下のＫＤでヒトＣＴＬＡ－４に結合し、１×１０－８Ｍ以下のＫＤでヒトＣＴＬＡ－４に結合し、５×１０－９Ｍ以下のＫＤでヒトＣＴＬＡ－４に結合し、又は、１×１０－８Ｍから１×１０－１０Ｍ又はより小さいＫＤでヒトＣＴＬＡ－４に結合する。

本発明の別の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＬＡＧ－３抗体を対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患（例えば、がん）の治療方法を提供する。

本発明の別の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体を対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患（例えば、がん）の治療方法を提供する。

ＰＤ－１及び１種以上の第２標的抗原（例えば、ＣＴＬＡ－４及び／又はＬＡＧ－３及び／又はＰＤ－Ｌ１）に対する抗体遮断が、患者のがん細胞への免疫応答を増強させることができる。本開示の抗体を用いて増殖を阻害できるがんには、一般には免疫療法に応答があるがんを含む。本開示の併用療法で治療するがんの代表的な例には抗ＰＤ－１抗体の単一療法の説明で具体的に記載されたがんを含む。

特定の実施形態では、本明細書で説明される治療用抗体の組み合わせは単一の組成物として、薬学的に許容される担体に同時に投与されてもよいし、別個の組成物として、各抗体が薬学的に許容される担体において同時に投与されてもよい。別の実施形態では、治療用抗体の組み合わせが連続して投与されてもよい。

また、併用療法の複数の用量が連続して投与される場合に、投与の各時点で連続投与の順番は逆にしてもよいし、又は順番のままであってもよく、連続投与は同時投与と組み合わされてもよいし、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。

腫瘍が様々なメカニズムによって宿主の免疫監視を避ける。これらのメカニズムの多くは、腫瘍によって発現された免疫抑制性タンパク質の不活性化により克服できる。これらにはＴＧＦ－β（Ｋｅｈｒｌ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：１０３７－１０５０）、ＩＬ－１０（Ｈｏｗａｒｄ＆Ｏ’Ｇａｒｒａ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １３：１９８－２００）及びＦａｓリガンド（Ｈａｈｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：１３６３－１３６５）を含む。別の例では、これらの実体のそれぞれの抗体は抗ＰＤ－１及び抗ＣＴＬＡ－４及び／又は抗ＬＡＧ－３及び／又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせて使用して、免疫抑制剤の効果を相殺し宿主の腫瘍免疫応答を促進することができる。

宿主免疫応答の活性化に利用できる他の抗体は、さらに、抗ＰＤ－１及び抗ＣＴＬＡ－４及び／又は抗ＬＡＧ－３及び／又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせて使用することができる。これには樹状細胞の表面上におけるＤＣ機能及び抗原提示を活性化させる分子を含む。抗ＣＤ４０抗体（Ｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，，前掲）は抗ＰＤ－１及び抗ＣＴＬＡ－４及び／又は抗ＬＡＧ－３及び／又は抗ＰＤ－Ｌ１と組み合わせて使用することができる（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，，前掲）。Ｔ細胞共刺激分子に対する他の活性化抗体（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，，前掲、Ｍｅｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，，前掲及びＨｕｔｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，，前掲）も、レベルを引き上げたＴ細胞活性化を提供することができる。

前述したように、現在骨髄移植は造血起源の種々の腫瘍の治療に用いられる。ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４及び／又はＬＡＧ－３及び／又はＰＤ－Ｌ１遮断の組み合わせはドナーに移植される腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を高めることができる。

いくつかの実験的な治療方法は、抗原特異性Ｔ細胞のエクスビボ活性化及び増幅、並びにこれらの細胞の腫瘍に対する抗原特異性Ｔ細胞の受容体への養子移入に関する（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ＆Ｒｉｄｄｅｌｌ，前掲）。これらの方法は、ＣＭＶ等の感染性病原体に対するＴ細胞応答を活性化させるために用いることができる。抗ＰＤ－１及び抗ＣＴＬＡ－４及び／又は抗ＬＡＧ－３及び／又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の存在下でエクスビボ活性化を行うとＴ細胞への養子移入の頻度及び活性が向上することが予想される。

本発明の特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体及び治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ－４及び／又は抗ＬＡＧ－３及び／又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体を対象に投与することを含む、免疫刺激剤を用いる過剰増殖性疾患（例えば、がん）の治療に関連する有害事象の緩和方法を提供する。例えば、本発明では、非吸収性ステロイドを患者に投与して免疫刺激治療用抗体誘発大腸炎又は下痢の発生率を低減させる方法を提供する。免疫刺激治療用抗体を受ける患者であれば、このような抗体が引き起こす大腸炎又は下痢に発展させるリスクは誰にでもあるため、患者集団全体には本発明の方法に従って治療するのに適する。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療及びＩＢＤの悪化予防のためにステロイドが使用されているが、ステロイドはＩＢＤとは診断されていない患者におけるＩＢＤの予防（ＩＢＤの発生率低減）のために利用されていない。ステロイド（ひいては非吸収性ステロイド）に関連する顕著な副作用が予防的使用を妨げている。

更なる実施形態では、ＰＤ－１とＣＴＬＡ－４及び／又はＬＡＧ－３及び／又はＰＤ－Ｌ１遮断の組み合わせ（即ち、免疫刺激治療用抗体の抗ＰＤ－１と抗ＣＴＬＡ－４及び／又は抗ＬＡＧ－３抗体及び／又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体）は、さらに、任意の非吸収性ステロイドと組み合わせて使用することができる。本明細書で使用される「非吸収性ステロイド」は糖質コルチコイドであり、広範な初回通過代謝を示すため、肝臓での代謝後、ステロイドの生物学的利用能が低く、約２０％以下である。本発明の一実施形態では、非吸収性ステロイドはブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ）である。ブデソニドは局所的に作用する糖質コルチコイドであり、経口投与後、主に肝臓によって広範に代謝される。ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（商標）（Ａｓｔｒａ－Ｚｅｎｅｃａ）は回腸及び結腸全体への薬物送達を最適化するために開発された、ｐＨ・時間依存的ブデソニド経口製剤である。米国でＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（商標）は回腸及び／又は上行結腸の軽度から中等度のクローン病の治療薬として承認されている。クローン病治療用の場合に、ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（商標）の通常経口投与量は６～９ｍｇ／日である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（商標）が腸内で放出されて吸収されると、腸粘膜に保持される。標的組織腸粘膜を通過すると、ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（商標）が肝臓のチトクロームＰ４５０システムによって広範に、糖質コルチコイド活性を無視できる代謝物に代謝される。したがって、生物学的利用能が低い（約１０％）。他の糖質コルチコイドと比べ、ブデソニドの低い生物学的利用能により治療率の改善につながり、初回通過代謝の程度が低い。全身作用性コルチコステロイドと比べ、ブデソニドが、視床下部－下垂体抑制をはじめ、より少ない副作用を生じる。したがって、ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（商標）の長期投与が全身性糖質コルチコイド効果、例えば、副腎皮質機能亢進及び副腎抑制を招く。ＰＤＲ ５８ｔｈ ｅｄ．２００４：６０８－６１０を参照する。

別の実施形態では、ＰＤ－１とＣＴＬＡ－４及び／又はＬＡＧ－３及び／又はＰＤ－Ｌ１遮断の組み合わせ（即ち、免疫刺激治療用抗体の抗ＰＤ－１と抗ＣＴＬＡ－４及び／又は抗ＬＡＧ－３及び／又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体）と非吸収性ステロイドの組み合わせはさらにサリチル酸塩と組み合わせることができる。サリチル酸塩は５－ＡＳＡ薬剤、例えば、スルファサラジン（ＡＺＵＬＦＩＤＩＮＥ（商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆ＵｐＪｏｈｎ）、オルサラジン（ｏｌｓａｌａｚｉｎｅ）（ＤＩＰＥＮＴＵＭ（商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆ＵｐＪｏｈｎ）、バルサラジド（ｂａｌｓａｌａｚｉｄｅ）（ＣＯＬＡＺＡＬ（商標）、Ｓａｌｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、及びメサラミン（ｍｅｓａｌａｍｉｎｅ）（ＡＳＡＣＯＬ（商標）、Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＰＥＮＴＡＳＡ（商標）、Ｓｈｉｒｅ ＵＳ、ＣＡＮＡＳＡ（商標）、Ａｘｃａｎ Ｓｃａｎｄｉｐｈａｒｍ，Ｉｎｃ．及びＲＯＷＡＳＡ（商標）、Ｓｏｌｖａｙ）を含む。

本発明の方法によれば、サリチル酸塩と、抗ＰＤ－１と抗ＣＴＬＡ－４及び／又は抗ＬＡＧ－３及び／又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体と非吸収性ステロイドを組み合わせて投与することは、サリチル酸塩及び非吸収性ステロイドの任意の同時投与又は連続投与を含んでもよく、免疫刺激抗体誘発大腸炎の発生率を低減させる。したがって、例えば、本発明による免疫刺激抗体誘発大腸炎の発生率の低減方法はサリチル酸塩及び非吸収性ステロイドの同時投与又は連続投与（例えば、非吸収性ステロイドの投与６時間後、サリチル酸塩を投与）、又は任意の組み合わせを含む。さらに、本発明によれば、サリチル酸塩及び非吸収性ステロイドは同じ経路で投与（例えば、いずれも経口投与）されてもよいし、又は異なる経路で投与（例えば、サリチル酸塩は経口投与、非吸収性ステロイドは直腸投与）されてもよく、抗ＰＤ－１と抗ＣＴＬＡ－４及び／又は抗ＬＡＧ－３及び／又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の組み合わせの投与経路と異なる場合がある。

次に、実施例を用いて本開示をさらに説明するが、その更なる制限と理解されるべきではない。本願に言及された全ての図面及び参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

（実施例）
実施例１：ハイブリドーマ技術を用いるマウス抗ＰＤ－１モノクローナル抗体の生成
免疫付与
Ｅ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８に記載の方法に従って、マウスを免疫化する。Ｃ末端にヒトＩｇＧ１ Ｆｃタグを有する組換えヒトＰＤ－１タンパク質（Ａｅｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，＃ＰＤ－ｌ－Ｈ５２５７、細胞外ドメイン含有、ＡＡ Ｌｅｕ ２５－Ｇｌｎ １６７）を免疫原として用いる。ヒトＰＤ－１－ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，＃１０３７７－Ｈ０８Ｈ）を、抗血清力価を決定し抗原特異的抗体を分泌するハイブリドーマをスクリーニングするために用いる。

具体的には、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）中のヒトＰＤ１ Ｆｃタンパク質２５μｇを各動物に注射した後、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）中のヒトＰＤ１ Ｆｃタンパク質２５μｇを注射することによって免疫を２～３回強化させる（抗血清力価による）。組換えヒトＰＤ １－ｈｉｓタンパク質を用いるＥＬＩＳＡに基づくスクリーニングによって抗血清力価を測定する。簡単に説明すると、希釈された血清（６０μｌ）を各ウェルに加え、３７℃下で４０分間インキュベートする。その後、プレートを４回洗浄し、ＨＲＰ－ヤギ抗マウス－ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１１５－０３６－０７１）を用いて検出し、４５０ｎｍで結合ＯＤを観察する。ハイブリドーマ融合前に、腹腔内注射により力価の良い動物に最終的な追加免疫を与える。

ハイブリドーマ融合及びスクリーニング
融合前に、マウス骨髄腫細胞株（ＳＰ２／０－Ａｇｌ４，ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－ｌ５８ｌ）細胞を培養し、対数期にする。免疫マウスからの脾臓細胞を無菌的に用意し、Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ，ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ，Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７（１９７５）に記載の方法に従って骨髄腫細胞に融合させる。その後、融合「ハイブリッド細胞」をＤＭＥＭ／２０％ＦＣＳ／ＨＡＴ培地中の９６ウェルプレートに分注する。融合７～１０日後、顕微鏡下で生存するハイブリドーマコロニーを観察する。２週間後、組換えヒトＰＤ １－ｈｉｓタンパク質を用いて、各ウェルの上清に対してＥＬＩＳＡスクリーニングを行う。簡単に説明すると、４℃下で６０μｌのヒトＰＤ１－ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，＃１０３７７－Ｈ０８Ｈ，ＰＢＳ中２．０μｌ／ｍｌ）でＥＬＩＳＡプレートを一晩コーティングする。ＰＢＳＴでプレートを４回洗浄し、２００μｌのブロッキングバッファ（ＰＢＳＴ中５％無脂肪乳）でブロックする。希釈されたハイブリドーマ上清（６０μｌ）を各ウェルに加え、３７℃下で４０分間インキュベートする。その後、プレートを４回洗浄し、ＨＲＰ－ヤギ抗マウス－ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号ｌ １５－０３６－０７１）を用いて検出し、４５０ｎｍで結合ＯＤを観察する。その後、ヒトＰＤ１－ｈｉｓに結合する抗体を分泌する陽性ハイブリドーマを選択し、２４ウェルプレートに移す。高い特異的結合及びＰＤ１／ＰＤＬ１遮断活性を示す抗体を生成するハイブリドーマクローンをサブクローニングし、サブクローニングで生成した抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。簡単に説明すると、ＰＢＳバッファを用いて５から１０倍のカラム体積でプロテインＡセファロースカラム（ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ提供）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号ＡＡ０２７３）を洗浄する。細胞上清をカラムに通過させた後、タンパク質の吸光度がベースラインに達するまでＰＢＳバッファでカラムを洗浄する。溶出バッファ（０．１Ｍグリシン－ＨＣｌ，ｐＨ２．７）を用いてカラムを溶出し、直ちに中和バッファ（１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ９．０）で１．５ｍｌチューブに集める。ＩｇＧ含有画分を合わせ、ＰＢＳにおいて４℃下で一晩透析する。

実施例２：ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴技術を用いるマウス抗ＰＤ－１モノクローナル抗体の親和性測定
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００システム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）によって、実施例１によって生成された精製抗ＰＤ－１マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（即ち、クローンＣ１Ｅ１、Ｄ１Ｆ２、Ｃ１Ｆ５、Ｄ１Ａ１、Ｄ１Ｆ１、Ｃ１Ｅ２、Ｃ１Ａ１、Ｃ１Ｆ４、Ｄ２Ｃ２、２Ｇ２及びＣ１Ｃ５、後にいずれもＩｇＧ１／κアイソタイプと判明）の親和性及び結合動態を特徴づける。

簡単に説明すると、Ｂｉａｃｏｒｅが提供する標準的なアミン結合キット（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用して、第一級アミンによってヤギ抗マウスＩｇＧ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，カタログ番号ＢＲｌ ００８３９，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ）を共有結合を介してＣＭ５チップ（カルボキシメチルデキストランによってコーティングされたチップ）にリンクする。バイオセンサーの表面上の未反応部分はエタノールアミンでブロックする。その後、精製された抗ＰＤ－１抗体及び濃度６６．７ｎＭのニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））を１０μＬ／ｍｉｎの流量でチップに付与する。その後、ＨＢＳ ＥＰバッファ（Ｂｉａｃｏｒｅ提供）中の組換えヒトＰＤ－１－Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，＃１０３７７－Ｈ０８Ｈ）又はカニクイザルＰＤ－１－ｈｉｓタンパク質（Ａｅｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，＃ＰＤ－ｌ－Ｃ５２２３）を３０μＬ／ｍｉｎの流量でチップに付与する。抗原－抗体結合動態を２分間、解離動態を１０分間追跡する。ＢＩＡ評価ソフトウェアを用いて、結合及び解離曲線を１：１ラングミュア結合モデルに当てはめする。
ｋａ、ｋｄ及びＫＤの値を決定し、表２に示す。

本発明の抗体はニボルマブより低いＫＤでヒトＰＤ－１に特異的に結合するため、ヒトＰＤ－１に対する親和性がより高いことが示される。

実施例３：マウス抗ＰＤ－１モノクローナル抗体の結合活性
ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃγ断片（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，＃１１５－００６－０７１，１００μｇ／ウェル）を用いて９６ウェルマイクロプレートをコーティングし、４℃で一晩インキュベートする。洗浄バッファ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０，ＰＢＳＴ）を用いてプレートを４回洗浄した後、２００μｌ／ウェルのブロッキングバッファ（ＰＢＳＴ中５％ｗ／ｖ無脂肪乳）において、３７℃下で２時間ブロックする。再びプレートを洗浄し、３７℃下で、実施例１による精製抗ＰＤ－１抗体１００μｇ／ウェル及びニボルマブ（０．００４～６６．７ｎＭ，ＰＢＳＴ中２．５％無脂肪乳において５倍段階希釈）をインキュベート４０分間した後、４回洗浄する。捕捉された抗ＰＤ－１抗体を含有するプレートとビオチンで標識されたヒトＰＤ－１ Ｆｃタンパク質（配列番号１００、ＰＢＳＴ中２．５％無脂肪乳中６０ｎＭ、１００μｇ／ウェル）を３７℃で４０分間インキュベートする。４回洗浄し、３７℃下でストレプトアビジンに複合させたＨＲＰ（ＰＢＳＴ中１：１００００希釈，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，＃０１６－０３０－０８４，１００μｇ／ウェル）と４０分間インキュベートする。最終回の洗浄後、プレートをＥＬＩＳＡ基質ＴＭＢ（Ｉｎｎｏｒｅａｇｅｎｔｓ）１００μｇ／ウェルとインキュベートする。２５℃下で１ＭのＨ２ＳＯ４ ５０μｇ／ウェルを用いて１５分間以内に反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取る。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析し、ＥＣ５０値を報告する。
結果を表３にまとめる。

結果では、本発明の抗体がヒトＰＤ－１に特異的に結合し、一部のクローンがニボルマブより低いＥＣ５０値を有することが示される。

実施例４：ＥＬＩＳＡを用いる機能的遮断アッセイ及び報告アッセイ
４．１ リガンド遮断ＥＬＩＳＡ
競合的ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１相互作用に対する本発明の抗ＰＤ－１抗体の遮断能力を測定する。簡単に説明すると、ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質（配列番号１０１）を２μｇ／ｍＬのＰＢＳで９６ウェルマイクロプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートする。翌日、洗浄バッファ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０，ＰＢＳＴ）でプレートを洗浄し、３７℃下でＰＢＳＴ中５％無脂肪乳を用いて２時間ブロックする。次に、洗浄バッファを用いてプレートを再度洗浄する。

ビオチンで標識されたヒトＰＤ－１－Ｆｃ（配列番号１００，ＰＢＳＴ中２．５％無脂肪乳中１０ｎＭ）中の本発明の抗ＰＤ－１抗体又はニボルマブの希釈液（１００ｎＭから４倍段階希釈）を調製し、室温下で４０分間インキュベートした後、抗体／ＰＤ－１－Ｆｃ－ビオチン混合物（１００μｌ／ウェル）をＰＤ－Ｌ１によってコーティングされたプレートに加える。３７℃下で４０分間インキュベートした後、洗浄バッファでプレートを４回洗浄する。その後、ストレプトアビジン複合ＨＲＰを１００μｌ／ウェル加え、３７℃下で４０分間インキュベートして、ＰＤ－Ｌ１に結合されたビオチンで標識されたヒトＰＤ－１を検出する。再び洗浄バッファでプレートを洗浄する。最後に、ＴＭＢを加え、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取る。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析し、ＩＣ５０値を報告する。

４．２ 基準遮断ＥＬＩＳＡ
競合的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて基準（ニボルマブ）－ヒトＰＤ－１結合に対する本発明の抗ＰＤ－１抗体の遮断能力を測定する。簡単に説明すると、ニボルマブを２μｌ／ｍＬのＰＢＳ溶液によって９６ウェルマイクロプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートする。翌日、洗浄バッファでプレートを洗浄し、３７℃下でＰＢＳＴ中５％無脂肪乳を２時間ブロックする。ブロック時は、ビオチンで標識されたヒトＰＤ－１ Ｆｃ（配列番号１００，ＰＢＳＴ中２．５％無脂肪乳１０ｎＭ）とテスト用各抗体（１３７ｐＭ～１００ｎＭ、３倍段階希釈）を混合して２５℃下で４０分間インキュベートする。洗浄後、ＰＤ－１／抗体混合物（１００μｌ／ウェル）をニボルマブによってコーティングされたプレートに加え、３７℃下で４０分間インキュベートする。再び洗浄バッファでプレートを洗浄し、その後、ＳＡ－ＨＲＰを１００μｌ／ウェル加え、３７℃下で４０分間インキュベートして、Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）に結合するビオチンで標識されたヒトＰＤ－１を検出する。最後に、洗浄バッファでプレートを洗浄する。ＴＭＢを加え、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取る。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析し、ＩＣ５０値を報告する。

４．３細胞ベースの機能アッセイ
細胞ベースのレポーターアッセイを用いて、細胞膜ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用に対する抗体の遮断活性を評価する。当該アッセイは、ヒトＰＤ－１及びＮＦＡＴ応答エレメント（ＮＦＡＴ－ＲＥ）によって駆動されたルシフェラーゼレポーターを安定的に発現するＰＤ－１エフェクター細胞株（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，ＧＳ－Ｊ２／ＰＤ－１）、及びヒトＰＤ－Ｌ１及び操作された細胞表面タンパク質－抗原ペプチド／主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）を安定的に発現するＰＤ－Ｌ１細胞株（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，ＧＳ－Ｃ２／ＰＤ－Ｌ１，ＡＰＣ細胞）の２種の遺伝子操作細胞株からなる。当該２種の細胞株を共培養すると、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用がＰＤ－１エフェクター細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が媒介するルシフェラーゼ発現を（ＮＦＡＴ経路によって）阻害する。

細胞ベースの機能アッセイが以下のように行われる。簡単に説明すると、対数期段階のＰＤ－Ｌ１細胞を５×１０５／ｍｌの密度で３８４ウェル細胞培養プレートに接種する。翌日、アッセイバッファ（ＲＰＭＩ １６４０＋１％ＦＢＳ）中の本発明の抗ＰＤ－１抗体又はニボルマブの希釈液（３３３．３ｎＭから５倍段階希釈）を調製する。同時に、３８４ウェルプレート中のＰＤ－Ｌ１細胞の培地を捨て、その後、抗ＰＤ－１抗体（２０μｌ／ウェル）及びＰＤ－１エフェクター細胞（密度は６．２５×１０５／ｍ，２０μｌ／ウェル）の希釈液を３８４ウェル細胞培養プレートに加える。３７℃下で６時間共培養後、インキュベータからプレートを取り出し、製造元からの説明に従ってＯｎｅ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｅ６ｌ２０）を用いて各ウェルの発光を読み取る。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて用量－反応曲線を分析し、ＥＣ５０値を報告する。
この３つのアッセイの結果を表４にまとめる。

上述したように、本発明の抗体はヒトＰＤ－１／ヒトＰＤ－Ｌ１の相互作用を遮断でき、一部のクローンはニボルマブよりＥＣ５０又はＩＣ５０値が低い。

また、データから分かるように、本発明の抗体がヒトＰＤ－１／ニボルマブの相互作用を遮断でき、クローン２Ｇ２からの抗体は部分的に遮断することから、ニボルマブの場合と同様な又は類似するエピトープに結合することが示される。

実施例５：キメラ抗体の生成及び特徴づけ
抗ＰＤ１マウスｍＡｈ Ｃ１Ｅ１の重鎖及び軽鎖の可変ドメインをそれぞれインフレームでヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトκ軽鎖定常領域にクローニングする。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号６７及び８０に記載のアミノ酸配列を有し、ヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号９７及び９８に記載される。前記実施例の方法に従って、結合捕捉ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ及び細胞ベースの機能性レポーターアッセイにおいて、キメラ抗体の活性が証明される。表５のデータに示すように、キメラＣ１Ｅ１抗体は基準（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））と同等の活性を有する。

実施例６：抗ＰＤ－１マウスモノクローナル抗体Ｃ１Ｅ１のヒト化
ヒト化及び更なる研究のために、マウス抗ＰＤ１抗体Ｃ１Ｅ１を選択する。マウス抗体のヒト化は、次のように、定着しているＣＤＲ移植方法を用いて行う。

マウス抗体Ｃ１Ｅ１のヒト化のためのアクセプターフレームワークを選択するために、ヒト免疫グロブリン遺伝子データベースに対して、マウスＣ１Ｅ１の軽鎖及び重鎖可変領域配列のｂｌａｓｔ処理を行う。マウスＣ１Ｅ１と最も高い相同性を有するヒト生殖系列ＩＧＶＨ及びＩＧＶＫを、ヒト化のためのアクセプターフレームワークとして選択する。マウス抗体重／軽鎖可変領域ＣＤＲを、選択されたフレームワークに挿入し、さらにフレームワーク中の残基を突然変異させて、より多くの候補重鎖／軽鎖可変領域を得る。

ヒト化Ｃ１Ｅ１重鎖／軽鎖可変領域並びにヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトκ軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを、１．２ｍｇ／ｍｌ ＰＥＩによって６０％対４０％の軽鎖－重鎖構築体比率で２９３Ｆ懸濁細胞培養物５０ｍｌに一過性トランスフェクトする。振盪フラスコに６日間静置した後、細胞上清を集め、遠心分離して細胞ペレットを得、ＩｇＧ分離前に、０．２２μｍフィルターにより濾過する。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製する。簡単に説明すると、ＰＢＳバッファを用いて５から１０倍のカラム体積でプロテインＡセファロースカラム（ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ提供，カタログ番号ＡＡ０２７３）を洗浄する。細胞上清をカラムに通過させた後、タンパク質の吸光度がベースラインに達するまでＰＢＳバッファを用いてカラムを洗浄する。溶出バッファ（０．１Ｍグリシン－ＨＣｌ，ｐＨ２．７）でカラムを溶出した後、すぐに中和バッファ（１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ９．０）で１．５ｍｌチューブに集める。ＩｇＧ含有画分を合わせ、ＰＢＳにおいて４℃下で一晩透析する。

合計で１０種のヒト化抗体を得、さらに特徴付けたのは、ｈｕＣｌＥ１－Ｖ１からｈｕＣｌＥ１－Ｖ７及びｈｕＣｌＥ１－Ｖ１０の８種である。表１には８種の抗体の重鎖／軽鎖可変領域アミノ酸配列がまとめられ、ヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトκ軽鎖定常領域配列はそれぞれ配列番号９７及び９８に記載される。

実施例２に記載のように、ＢＩＡＣＯＲＥ技術によってｈｕＣｌＥ１－Ｖ１からｈｕＣｌＥ１－Ｖ７とヒトＰＤ１の結合親和性を評価し、親和性ＫＤ値を表６にまとめる。実施例３に記載のとおり、結合捕捉ＥＬＩＳＡによって抗体ｈｕＣｌＥ１－Ｖ１０とヒトＰＤ１の結合活性を評価し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ捕捉抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１０９－００５－０９７）を用いてＩｇＧを捕捉し、結合ＥＣ５０値を表７にまとめる。全８種のヒト化抗体がキメラ抗体Ｃ１Ｅ１と同等の親和性を有する。

次に、実施例２から４の方法に従って、Ｂｉａｃｏｒｅ及び結合捕捉ＥＬＩＳＡによってヒト及びカニクイザルＰＤ１に対するヒト化抗体ｈｕＣｌＥ１－Ｖ１０の親和性をテストし、さらに競合ＥＬＩＳＡ及び細胞ベースのレポーターアッセイテスト機能活性によってテストする。表８に示すように、ｈｕＣｌＥ１－Ｖ１０がキメラＣ１Ｅ１抗体と同等のインビトロ活性を示す。

実施例７：ヒト化Ｃ１Ｅ１抗体の物理・化学的特性
次に、タンパク質熱シフトアッセイ、ｃＩＥＦ技術、ＳＥＣ技術及び凍結－融解法を用いて、抗ＰＤ１ヒト化抗体ｈｕＣｌＥ１－Ｖ１０の物理・化学的特性を検査する。

タンパク質の熱シフトアッセイによるＴｍ決定
ＧｌｏＭｅｌｔ（商標）熱シフトタンパク質安定性キット（Ｂｉｏｔｉｕｍ，カタログ番号３３０２２－Ｔ，ロット番号１８１２１４）を用いて抗ＰＤ１ヒト化抗体ｈｕＣｌＥ１－Ｖ１０の熱安定性を測定する。簡単に説明すると、ＧｌｏＭｅｌｔ（商標）色素を解凍して室温にする。色素を含有するバイアルをボルテックスして遠心分離する。２００×色素５μＬをＰＢＳ ９５μＬに加えて１０×色素を調製する。合計２０μＬの反応容積に１０×色素２μＬ及び抗体１０μＬを加える。表９の詳細なパラメータによる融解曲線プログラムを確立する。簡易にチューブを回転させて、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー（Ｒｏｃｈｅ，ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＩＩ）に入れる。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１０ソフトウェアを用いて結果を分析する。

ｃＩＥＦ技術によるｐＩ決定
キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）を用いて抗ＰＤ１ヒト化抗体ｈｕＣｌＥ１－Ｖ１０のｐＩ及び電荷不均一性を決定する。簡単に説明すると、０．１％ＭＣ ３５μＬ、ｐＨ３～１０のＰｈａｒｍｌｙｔｅ（ファルマライト）４μＬ、０．５ｍｏｌ／ＬのＡｒｇ ２μＬ、Ｍａｒｋ（マーク）－７．０５ １μＬ及びＭａｒｋ（マーク）－９．９９ １μＬをＰＢＳ中抗体２０μｇのチューブに加え、その後、ｄｄＨ２Ｏを加えて１００μＬにする。電気泳動プログラムは、１５００Ｖ下での最初１分間分離、３０００Ｖ下での６分間の２つの段階を含む。５分間曝露して検出した後、Ｍａｕｒｉｃｅ（商標）Ｃｏｍｐａｓｓ（商標）ソフトウェア（Ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｍｐｌｅ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いてデータを分析する。

ＳＥＣ技術による凝集解析決定
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ）によってモノマーのパーセンテージを評価する。水性移動相に含まれた抗体を、カラムに充填された多孔質固定相樹脂に通過させる。カラム内の保持時間はタンパク質の流体力学的サイズと樹脂ベッド中の細孔のサイズの関数である。小さな分子は樹脂の小さな細孔内に浸透し、大きな分子よりも保持時間が長い。カラムから溶出された後、ＵＶ吸光度によってタンパク質を検出する。移動相はリン酸緩衝生理食塩水であり、２８０ｎｍで吸光度をモニターする。流量は０．８ｍＬ／分間である。注入量は１ｍｇ／ｍＬサンプル４０μＬである。カラム温度は室温である。オートサンプラー温度は２～８℃である。合計実行時間は２５分間である。

凍結－融解法による安定性判定
１×ＰＢＳ配合物（配合は１３７ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４）中の１ｍｇ／ｍｌ抗体溶液を－８０℃で少なくとも２４時間凍結し、その後、室温下で３０～６０分間解凍させる。各サンプルは凍結－解凍サイクルを５回繰り返す。一部の凍結－解凍サイクル後、例えば、２回目、３回目及び４回目後に、凍結を再開する前に、ＳＥＣ分析用として溶液の一部を取り出す。

ＧｌｏＭｅｌｔ（商標）熱シフトタンパク質安定性キットによって、変性の原因となる不安定性を評価する。図１に示すように、抗ＰＤ１ヒト化抗体ｈｕＣ１Ｅ１－Ｖ１０は一般に７８℃下で高い融解温度（Ｔｍ）を示し、６９．５℃でマイナーピークを示す。ｈｕＣｌＥ１－Ｖ１０のｃＩＥＦアッセイから分かるように、主なアイソタイプのパーセンテージは約８１．５％、酸性種のパーセンテージは約１１．０％、塩基性種のパーセンテージは約７．５％である。Ｍａｕｒｉｃｅ（商標）Ｃｏｍｐａｓｓ（商標）ソフトウェアを用いてｐＩを算出し、ｈｕＣｌＥ１－Ｖ１０抗体のｐＩ値は８．３６である。ｈｕＣｌＥ１－Ｖ１０ヒト化抗体のｐＩが有意に７を上回ることから、中性ｐＨ値では有意に正電荷を持つと予想される。ｈｕＣｌＥ１－Ｖ１０のＳＥＣテストでは、モノマーのパーセンテージは１００．０％であることが示される（図２参照）。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって凍結及び解凍の安定性を評価する。抗体ｈｕＣｌＥ１－Ｖ１０は経時的に凝集レベルの明らかな上昇を示さず、凍結－融解を５回繰り返した後、沈殿又は濁りは見られなかった。

実施例８：マウスＣ１Ｅ１抗体のインビボ抗腫瘍効果
ＮＣＧマウスにおいてマウスＣ１Ｅ１抗体のインビボ抗腫瘍活性を評価する。簡単に説明すると、１日目に、５×１０５個の腫瘍活性化ＰＢＭＣと混合した４×１０６個のヒト悪性黒色腫Ａ３７５細胞をＮＣＧマウスの右腋窩に皮下注射する。３週間にわたり週に２回、電子カリパスを用いて測定し、（長さ×幅２）／２のように腫瘍体積を算出する。担がんマウスを２４匹選択し、１４日目にランダムに４群に分ける。それぞれ３ｍｇ／ｋｇの用量で、１４日目、２１日目及び２８日目に、ビヒクル（５％ブドウ糖溶液）、マウスＣ１Ｅ１、マウスＣ１Ｅ１ Ｆａｂ及びニボルマブを腹腔内投与する。マウス抗体Ｃ１Ｅ１がマウス重鎖可変領域及びヒトＩｇＧ１定常領域並びにマウス軽鎖可変領域及びヒトＣｋ１定常領域を含み、それぞれ配列番号６７、９７、８０及び９８に記載の配列を有し、マウスＣ１Ｅ１ Ｆａｂがマウス重鎖可変ドメイン及びヒトＩｇＧ１ ＣＨ１定常ドメイン並びに軽鎖可変ドメイン及びヒトＣｋ１定常ドメインを含み、それぞれ配列番号６７、９９、８０及び９８に記載の配列を有する。

３５日目にマウスを安楽死させ、腫瘍を回収して秤量する。腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ＝（１－各治療群の平均腫瘍体積／対照群の平均腫瘍体積）×１００％）を算出する。

全ての治療は担がん動物において良好に受け入れられた。表１０に示すように、ヒト悪性黒色腫Ａ３７５異種移植モデルにおいて、３ｍｇ／ｋｇのマウスＣ１Ｅ１治療及び３ｍｇ／ｋｇのマウスＣ１Ｅ１ Ｆａｂ治療はいずれも３ｍｇ／ｋｇのニボルマブより有意に優れていた有効性を有する。

ａはスチューデントのｔ検定によるビヒクル対照群との比較、＊はＰ＜０．０５である。

実施例９：マウスＣ１Ｅ１コード配列が挿入されたヘルペスウイルスＴ３０１１のインビボ抗腫瘍効果
Ｂ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１悪性黒色腫異種移植モデルにおいて、マウスＣ１Ｅ１抗体コード配列が挿入されたヘルペスウイルスＴ３０１１の抗腫瘍効果を評価する。

ヘルペスウイルスＴ３０１１は、Ｃ１Ｅ１ Ｆａｂ断片配列をＵＬ３－ＵＬ４間のゲノム領域に挿入する他に、逆方向反復領域を除去しヒトＩＬ－１２遺伝子で置換する（例えば、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０８００２５号を参照する）ことによって遺伝子修飾された単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）である。Ｃ１Ｅ１ Ｆａｂ配列はマウス重鎖可変ドメイン及びヒトＩｇＧ１ ＣＨ１定常ドメイン並びにマウス軽鎖可変ドメイン及びヒトＣｋａｐｐａｌ定常ドメインを含み、それぞれ配列番号６７、９９、８０及び９８に記載の配列を有する。

簡単に説明すると、雌Ｂ－ｈＰＤ－１ヒト化マウスの右前脇腹に１×１０５個のＢｌ６ＦｌＯ－ｈＰＤ－Ｌｌ悪性黒色腫細胞を皮下注射する。腫瘍体積が約９０ｍｍ３になると、マウスをランダムに５群に分け、各群は８匹である。これらのマウス腫瘍内にはそれぞれビヒクル（５％ブドウ糖溶液）、Ｔ３０１１（５×１０６ＰＦＵ／マウス）、Ｔ３０１１（１×１０７ＰＦＵ／マウス）、Ｔ３０１１（３×１０７ＰＦＵ／マウス）及びＮＶ１０２０（３×１０７ＰＦＵ／マウス、ＭｅｄｉＧｅｎｅ（元ＮｅｕｒｏＶｉｒ）によって開発された潜在的ながんの治療用組換え腫瘍溶解性ＨＳＶベースのウイルスで、例えば、広範に前処置された不応性結腸直腸がんの肝臓転移患者における腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスＮＶ１０２０のＩ／ＩＩ期研究、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｓｅｐ，２ｌ（９）：１１１９－２８を参照）を投与する。腫瘍体積を週に２回測定する。

薬物投与後１２日目に、マウスを安楽死させて腫瘍を回収し、秤量し撮影する。相対的腫瘍体積（ＲＴＶ＝ＴＶｎ／ＴＶ０、式中、ＴＶｎはｎ日目の腫瘍体積、ＴＶ０は０日目の腫瘍体積）、腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ％＝１－各治療群の平均腫瘍体積／対照群の平均腫瘍体積×１００％）及び腫瘍重量阻害率（ＩＲＴＷ＝（１－各治療群の平均腫瘍重量／対照群の平均腫瘍重量）×１００％）を算出する。

表１１に示すように、マウスＣ１Ｅ１抗体コード配列が挿入されたＴ３０１１が用量依存的に明らかな抗腫瘍活性を示している。３×ｌ０７ＰＦＵ／マウスの用量レベルでは、Ｔ３０１１投与がＮＶ１０２０投与よりも優れた抗腫瘍効果を示す。

ａはスチューデントのｔ検定によるビヒクル対照群との比較、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１である。

実施例１２：ヒト化Ｃ１Ｅ１抗体のインビボ抗腫瘍効果
ＭＣ３８異種移植モデルにおいて腫瘍増殖に対するヒト化Ｃ１Ｅ１抗体の効果を評価する。簡単に説明すると、雌Ｂ－ｈＰＤ－１マウスの右後肢脇腹に５×ｌ０５個の細胞を皮下注射する。腫瘍体積が約１００～１５０ｍｍ３になると、マウスをランダムに７群に分け、各群は８匹のマウスである。３週間にわたり週に２回で、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの用量でビヒクル（ＰＢＳ）、ｈｕＣｌＥ１－Ｖ１０及びＯＰＤＩＶＯ（登録商標）を腹腔内投与する。ヒト化抗体ｈｕＣ１１－Ｖ１０は重鎖可変領域及び定常領域並びに軽鎖可変領域及び定常領域を含み、それぞれ配列番号６９、９７、８６及び９８に記載の配列を有する。研究期間中に腫瘍体積を測定する。

治療開始後２３日目に、マウスを安楽死させて腫瘍を回収し、秤量し撮影する。腫瘍体積増殖阻害率（ＴＧＩＴＶ）を算出し表１２に示す。

表１２に示すように、担がん動物は全ての治療を良好に受け入れていた。ＨｕＣｌＥｌ－Ｖ１０処理はＭＣ３８異種移植モデルにおいて、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）と同等の用量依存的抗腫瘍活性を示す。

ａはスチューデントのｔ検定によるビヒクル対照群との比較、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１である。

上述した内容では１つ以上の実施例を用いて本発明を説明しているが、本発明はこれらの実施例に限定されず、当該説明には、特許請求の範囲の趣旨及び範囲に含まれるものであれば、全ての可能な置換、修正及び均等な形態を網羅することが意図される。本明細書で言及される全ての参考文献は参照により全体が本明細書に含まれる。

本願に関連する配列は次にまとめてある。

米国登録特許第６，９５１，６４６号 米国登録特許第６，９１４，１２８号 米国登録特許第６，０９０，３８２号 米国登録特許第６，８１８，２１６号 米国登録特許第６，１５６，３１３号 米国登録特許第６，８２７，９２５号 米国登録特許第５，８３３，９４３号 米国登録特許第５，７６２，９０５号 米国登録特許第５，７６０，１８５号 米国登録特許第５，２２５，５３９号 米国登録特許第５，５３０，１０１号 米国登録特許第５，５８５，０８９号 米国登録特許第５，６９３，７６２号 米国登録特許第６，１８０，３７０号 米国出願公開特許第２００３０１５３０４３号 米国登録特許第５，６７７，４２５号 米国登録特許第６，１６５，７４５号 米国登録特許第５，７１４，３５０号 米国登録特許第６，３５０，８６１号 米国出願公開特許第２００４０１１０７０４号 欧州特許出願第ＥＰ１，１７６，１９５号 ＰＣＴ国際出願第ＷＯ０３／０３５８３５号 ＰＣＴ国際出願第ＷＯ０６／０８９２３１号 Ａｌｓｔｏｎ＆Ｂｉｒｄ ＬＬＰ弁護士整理番号０４０９８９／３１４９１１に対応する２００６年８月１１日に提出された米国特許出願 ＰＣＴ国際出願第ＷＯ９９／５４３４２号 欧州特許出願第ＥＰ０，１５４，３１６号 欧州特許出願第ＥＰ０，４０１，３８４号 米国登録特許第４，８１６，５６７号 米国登録特許第４，３９９，２１６号 米国登録特許第４，６３４，６６５号 米国登録特許第５，１７９，０１７号 ＰＣＴ国際出願第ＷＯ８７／０４４６２号 ＰＣＴ国際出願第ＷＯ８９／０１０３６号 欧州特許出願第ＥＰ３３８，８４１号 米国登録特許第７，０８７，６００号 米国登録特許第６，９８９，４５２号 米国登録特許第７，１２９，２６１号 ＰＣＴ国際出願第ＷＯ０２／０９６９１０号 ＰＣＴ国際出願第ＷＯ０７／０３８，６５８号 ＰＣＴ国際出願第ＷＯ０７／０５１，０８１号 ＰＣＴ国際出願第ＷＯ０７／０５９，４０４号 ＰＣＴ国際出願第ＷＯ０８／０８３，３１２号 ＰＣＴ国際出願第ＷＯ０８／１０３，６９３号 米国出願公開特許第２００６００２４３１７号 米国出願公開特許第２００６０００４０８１号 米国出願公開特許第２００６０２４７２９５号 米国登録特許第５，３９９，１６３号 米国登録特許第５，３８３，８５１号 米国登録特許第５，３１２，３３５号 米国登録特許第５，０６４，４１３号 米国登録特許第４，９４１，８８０号 米国登録特許第４，７９０，８２４号 米国登録特許第４，５９６，５５６号 米国登録特許第４，４８７，６０３号 米国登録特許第４，４８６，１９４号 米国登録特許第４，４４７，２３３号 米国登録特許第４，４４７，２２４号 米国登録特許第４，４３９，１９６号 米国登録特許第４，４７５，１９６号 米国登録特許第４，５２２，８１１号 米国登録特許第５，３７４，５４８号 米国登録特許第５，４１６，０１６号 米国登録特許第５，３９９，３３１号 米国登録特許第５，９２２，８４５号 米国登録特許第５，８３７，２４３号 米国登録特許第５，８１１，０９７号 ＰＣＴ国際出願第ＷＯ０１／１４４２４号 ＰＣＴ国際出願第ＷＯ９８／４２７５２号 ＰＣＴ国際出願第ＷＯ００／３７５０４号 米国登録特許第６，２０７，１５６号 ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０８００２５号

Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：７６５－７２． Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３９１７７９－８２． Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０：７１１－８． Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｌ．（１９９５）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８１：１９５３－６． Ｖｉｖｉｅｒ，Ｅ ａｎｄ Ｄａｅｒｏｎ，Ｍ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １８：２８６－９１． Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７８７－９． Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８１：２８１－７． Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５４：３０７－３１４． Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：５０９４－１００． Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１２２９３－７． Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７－６６． Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１：１４１－５１． Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：３１９－２２． Ｓａｌａｍａ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９８：７１－７８． Ｐｒｏｋｕｎｉｎａ ａｎｄ Ａｌａｒｃｏｎ－Ｒｉｑｕｅｌｍｅ（２００４）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １３：Ｒ１４３． Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｌｕｐｕｓ １３：５１０． Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００１）ＰＮＡＳ ９８：１３８６６－７１． Ｔｏｐａｌｉａｎ ＳＬ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．３６６（２６）：２４４３－５４． Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６． Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３． Ｋｌｉｍｋａ ｅｌ ａｌ．，，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ８３（２）：２５２－２６０（２０００）． Ｂｅｉｂｏｅｒ ｅｌ ａｌ．，，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３－８４９（２０００）． Ｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０－８９１５（１９９８）． Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１－２１６２（１９９４）． Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９２：２５２９－２５３３（１９９５）． Ｄｉｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９－７４９（１９９６）． Ｂｅｒｅｚｏｖ ｅｔ ａｌ．，，ＢＩＡｊｏｕｒｎａｌ ８：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ８（２００１）． Ｉｇａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，，Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１７：４５２－７（１９９５）． Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２：８０７－１０（１９９８）． Ｌｅｖｉ ｅｔ ａｌ．，，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４３７４－８（１９９３）． Ｐｏｌｙｍｅｎｉｓ ａｎｄ Ｓｔｏｌｌｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５２１８－５３２９（１９９４）． Ｘｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：３７－４５（２０００）． Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２：１１８０－８． ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５－４１． Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４－２６８７０． Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５－１２． Ｋｅｌｌｅｙ ａｎｄ Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２－３５． Ａｄｉｂ－Ｃｏｎｑｕｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０．３４１－６． Ｂｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５－４３． Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７． Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５． Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．． Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９－１００３３． Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）． Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－７９８． Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７－８３６． Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７），前掲． ａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７：６１４－２２． Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０． Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６－１８０． Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６－２３． Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ（１９７２）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４１：６７３－７０２． Ｇａｌａ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（２００４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：５４８９－９４． Ｗａｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６８：１０９９－１０９． Ｓｐｉｒｏ（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：４３Ｒ－５６Ｒ． Ｐａｒｅｋｈ ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１６：４５２－７． Ｍｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７：６９７－７０６． ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４． Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５． Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２． Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）． Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６－４７２． Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６－４２２０． Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１－６２１． Ｃａｏ ａｎｄ Ｓｕｒｅｓｈ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９（６），６３５－６４４（１９９８）． ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ，，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，２１（８），３９１－３９７（２０００）． Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）． Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８． Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５． Ｕｍｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８． Ｂｌｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０． Ｍ．Ｏｗａｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０． Ｂｒｉｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４． Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０． Ｋｅｉｎａｎｅｎ ａｎｄ Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１２３． Ｋｉｌｌｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２７３． Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１３３－１４４． Ｈｅ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：４９１９－２８． Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．，２０００，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇ：６０－６２． Ｌｏｇｏｔｈｅｔｉｓ，Ｃ．，２０００，ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇ：３００－３０２． Ｋｈａｙａｔ，Ｄ．２０００，ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇ：４１４－４２８． Ｆｏｏｎ，Ｋ．２０００，ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇ：７３０－７３８． Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．ａｎｄ Ｓｚｎｏｌ，Ｍ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｃｈ．６１，ｐｐ．３０２３－３０４３ ｉｎ ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９７，Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０：３５３９－４３． Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＳＡ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２８１－７． Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：２０１１－２０１３． Ｓｕｏｔ＆Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１５８５－１５８８． Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１１７－１２０． Ｎｅｓｔｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：３２８－３３２． Ｋｕｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：３３２－３３６． Ｍｏｋｙｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：５３０１－５３０４． Ｋｅｈｒｌ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：１０３７－１０５０． Ｈｏｗａｒｄ＆Ｏ’Ｇａｒｒａ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １３：１９８－２００． Ｈａｈｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：１３６３－１３６５． Ｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４７４－４７８． Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１（５）５２７－４０． Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：２１６０－２１６９． Ｍｅｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：６８２－６８５（１９９７）． Ｈｕｔｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９７：２６２－２６６． Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ＆Ｒｉｄｄｅｌｌ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：５４６－５１． Ｈｏｌｌｉｇｅｒ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８． Ｐｏｌｊａｋ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－１１２３． ｖａｎ Ｅｌｓａｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：４８１－４８９． Ｏｖｅｒｗｉｊｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：２９８２－２９８７． Ｈｕｒｗｉｔｚ，（２０００）前掲． Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ＆Ｗｈｉｔｅ（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９（１）：８１－４． Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１７）：１００６７－１００７１． Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．２５０５（ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＰ－６７５２０６）． ＰＤＲ ５８ｔｈ ｅｄ．２００４：６０８－６１０． Ｅ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８． Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ，ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ，Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７（１９７５）． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｓｅｐ，２ｌ（９）：１１１９－２８．

Claims (11)

1. ＰＤ－１に結合する分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分であって、
   重鎖ＣＤＲ１領域、重鎖ＣＤＲ２領域及び重鎖ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲ１領域、軽鎖ＣＤＲ２領域及び軽鎖ＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変領域を含み、前記重鎖ＣＤＲ１領域、重鎖ＣＤＲ２領域、重鎖ＣＤＲ３領域、軽鎖ＣＤＲ１領域、軽鎖ＣＤＲ２領域及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、
   （１）それぞれ配列番号１、２、３、３４、３５及び３６、
   （２）それぞれ配列番号４、５、６、３７、３８及び３９、
   （３）それぞれ配列番号７、８、９、４０、４１及び４２、
   （４）それぞれ配列番号１０、１１、１２、４３、４４及び４５、
   （５）それぞれ配列番号１３、１４、１５、４６、４７及び４８、
   （６）それぞれ配列番号１６、１７、１８、４９、５０及び５１、
   （７）それぞれ配列番号１９、２０、２１、５２、５３及び５４、
   （８）それぞれ配列番号２２、２３、２４、５５、５６及び５７、
   （９）それぞれ配列番号２５、２６、２７、５８、５９及び６０、
   （１０）それぞれ配列番号２８、２９、３０、６１、６２及び６３、又は
   （１１）それぞれ配列番号３１、３２、３３、６４、６５及び６６
   に記載のアミノ酸配列を含む、ＰＤ－１に結合する分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
2. （１）配列番号６７及び８０、（２）配列番号６８及び８１、（３）配列番号６９及び８１、（４）配列番号６８及び８２、（５）配列番号６８及び８３、（６）配列番号６８及び８４、（７）配列番号６８及び８５、（８）配列番号６８及び８６、（９）配列番号６９及び８６、（１０）配列番号７０及び８７、（１１）配列番号７１及び８８、（１２）配列番号７２及び８９、（１３）配列番号７３及び９０、（１４）配列番号７４及び９１、（１５）配列番号７５及び９２、（１６）配列番号７６及び９３、（１７）配列番号７７及び９４、（１８）配列番号７８及び９５、又は（１９）配列番号７９及び９６に対してそれぞれ８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を備える重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む請求項１に記載の分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
3. 配列番号９７、９９又は１２９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を備える重鎖定常領域、及び／又は配列番号９８又は１３０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を備える軽鎖定常領域を含む請求項１に記載の分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
4. （ａ）ヒトＰＤ－１に結合し、（ｂ）サルＰＤ－１に結合し、（ｃ）ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の結合を阻害し、（ｄ）Ｔ細胞の増殖を増加させ、（ｅ）免疫応答を刺激し、且つ／又は（ｆ）抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
5. マウス、ヒト、キメラ又はヒト化の抗体である請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
6. ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプである請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
7. 請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
8. 抗腫瘍剤をさらに含む請求項７に記載の医薬組成物。
9. 対象において腫瘍増殖を阻害するために治療有効量で対象に投与される請求項７に記載の医薬組成物。
10. 前記腫瘍は固形腫瘍又は非固形腫瘍である請求項９に記載の医薬組成物。
11. 前記腫瘍はリンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、黒色腫、結腸腺がん、膵臓がん、結腸がん、胃腸がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、腎細胞がん、鼻咽頭がんからなる群から選ばれる請求項９に記載の医薬組成物。

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