JP7059007B2

JP7059007B2 - 腎オルガノイドを形成させるための多能性幹細胞の分化の方法

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Publication number: JP7059007B2
Application number: JP2017549557A
Authority: JP
Inventors: 実 ▲高▼里; メリッサリトル
Original assignee: ザユニバーシティオブクィーンズランド
Priority date: 2014-12-15
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2022-04-25
Anticipated expiration: 2035-12-15
Also published as: KR20230107694A; JP2017537655A; US20200339957A1; AU2022204362B2; WO2016094948A1; US20250075188A1; AU2022204362A1; KR102723169B1; EP4130242A1; KR20170110579A; EP3234108A4; CN107208051B; MA40987A; EP3234108A1; CN114591884B; EP4279583A3; KR102555627B1; CA2969249A1; CN107208051A; US20190032020A1

Description

本発明は、腎臓の発生に関する。より具体的には、本発明は、ネフロンおよび/もしくは尿管芽ならびに/またはこれらの前駆体を含み、少なくとも部分的に血管が新生しており、腎臓の間質区画を含む、腎オルガノイドを作製するためのインビトロの方法に関する。

背景
全世界での末期腎疾患罹患率が1年ごとに8％上昇しており、腎臓再生の戦略が切実に必要とされている。腎臓は、尿管芽(UB)の形成およびこの尿管芽と中間中胚葉由来の隣接する後腎間葉(MM)との相互作用を介して中間中胚葉(IM)から分化する中胚葉系器官である。ネフロンは、MMに由来するネフロン前駆体集団から生じる。IMまたはMM内の他の前駆体は、腎臓の支質/間質、および糸球体毛細血管を含む腎臓血管系の構成要素のもととなるとみなされている。IMそれ自体は、後方原始線条に由来する。腎臓の発生起源は十分に理解されており、ヒト腎臓におけるネフロン形成は出生前に完了している⁵。したがって、失われたネフロンを置き換えることができる出生後幹細胞は存在しない。

ヒト多能性幹細胞は、細胞を用いる(cell-based)腎臓疾患治療法を作り出すうえで大きな可能性を有している。しかし、例えば腎臓疾患に対して、臨床使用向けの細胞の供給源として、および治療法としてヒト多能性幹細胞を実用化することは、ネフロンおよび他の腎臓構造体を生じる必要な細胞型を作製する方法の理解が十分でないために妨げられていた。

概要
本発明者らは、正常な胚形成の間に使用される増殖因子を用いる、組成がすべて化学的に明らかな単層培養条件下で、後方原始線条および中間中胚葉(IM)を経るヒト多能性幹細胞の分化を方向付けることに成功した。この分化プロトコールは、インビトロで、遠位尿細管、近位尿細管、およびボーマン嚢を形成するためのネフロン形成ならびに分節化を含む、自己組織化構造体を形成する尿管芽(UB)および後腎間葉(MM)の同期的誘導をもたらす。オルガノイドはまた、間葉に由来する腎臓支質も含む。このようなhESC由来の構成要素はエクスビボで幅広い腎臓能力を示すことから、多能性幹細胞に基づく腎臓再生の可能性が示される。これに加えて、本発明者らは、分化した尿管芽(UB)、後腎間葉(MM)、ならびにMMに由来するネフロンおよび支質を含む腎臓オルガノイド内の血管系の分化も方向付けた。特定の形態において、本発明は、短い培養期間で腎オルガノイドを形成する集合したネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞の作製を提供する。より具体的には、本発明は、ヒト多能性幹細胞を方向付けて、内皮および腎間質に取り囲まれた完全に分節化したネフロンを含み、かつヒト胎児腎臓に転写的に類似している、複雑な多細胞性腎臓オルガノイドを形成させるための方法を提供する。

したがって、本発明の1つの局面は、ネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞を作製する方法を提供し、該方法は、ネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞が集合して、少なくとも部分的に血管が新生しておりかつ/または血管前駆細胞を含む1つまたは複数の腎オルガノイドになるのを誘導または促進する条件下で、中間中胚葉(IM)細胞を、線維芽細胞増殖因子9(FGF9)、ならびに/または線維芽細胞増殖因子20(FGF20)および/もしくは線維芽細胞増殖因子2(FGF2)、ならびに任意で、骨形態形成タンパク質7(BMP7);ヘパリン;Wntアゴニスト;レチノイン酸(RA)、類似体またはアゴニスト;およびRAアンタゴニストからなる群より選択される1種または複数種の作用物質と接触させ、それによって、IM細胞からネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞を生じさせる段階を含む。

いくつかの態様において、少なくとも部分的な血管新生および/または血管前駆細胞の出現(presence)は、間葉細胞または間葉組織からの血管内皮または血管前駆体の発生を促進するかまたは方向付ける条件によって、容易になる。

1つの態様において、腎オルガノイドの血管新生は、1つまたは複数のヒト多能性幹細胞および/またはそれから分化した血管内皮前駆体を含めることによって容易になる。

別の態様において、腎オルガノイドの血管新生は、血管新生を容易にする適切な酸素分圧の使用によって容易になる。

1つの態様において、IM細胞は、後方原始線条細胞に由来するか、またはそれから分化する。

1つの態様において、後方原始線条細胞は、ヒト多能性幹細胞(hPSC)に由来するか、またはそれから分化する。hPSCの非限定的な例には、ヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(iPSC)が含まれる。

本発明の関連局面は、hPSCをWntアゴニストと接触させ、それによって中胚葉細胞を生じさせる段階を含む、中胚葉細胞を作製する方法を提供する。中胚葉細胞は、完成形の中胚葉ならびに頭側IMおよび/または尾側IMを含む中間中胚葉(IM)などの中胚葉系細胞の混合集団であってよい。

この方法は、完成形の中胚葉細胞を線維芽細胞増殖因子9(FGF9)ならびに/または線維芽細胞増殖因子20(FGF20)および/もしくは線維芽細胞増殖因子2(FGF2)と接触させる後続の段階をさらに含んでもよい。

適切には、完成形の中胚葉細胞を線維芽細胞増殖因子9(FGF9)ならびに/または線維芽細胞増殖因子20(FGF20)および/もしくは線維芽細胞増殖因子2(FGF2)と接触させる後続段階の段階は、中間中胚葉(IM)の形成を容易にし、この中間中胚葉(IM)は、その後、IM細胞からの尿管上皮前駆細胞およびネフロン前駆細胞の両方の分化を起こす。

さらなる態様において、この方法は、FGF2、FGF9、および/またはFGF20の存在下で培養するために細胞を解離および再集合させてペレットにする後続の段階をさらに含む。適切には、この段階は、ネフロンを含む腎オルガノイドの作製を容易にする。FGF2、FGF9、および/またはFGF20の存在下での培養は、空気/培地の境界に位置するフローティングフィルターを用いて実施され得る。

さらなる態様において、方法は、FGF2、FGF9、および/またはFGF20を除去する前にWntアゴニストを添加すること、ならびにその後に増殖因子なしで培養することをさらに含む。この段階により、腎オルガノイド内でのネフロンの形成がさらに容易になる。適切には、Wntアゴニストは、比較的短い期間(例えば30～60分)、比較的高濃度で存在する。

任意で、前述の段階のいずれかにおいてWntアゴニスト、線維芽細胞増殖因子9(FGF9)、ならびに/または線維芽細胞増殖因子20(FGF20)、および/もしくは線維芽細胞増殖因子2(FGF2)の存在下で細胞を培養する段階は、レチノイン酸(RA)アンタゴニスト、RAもしくはRAアゴニスト、骨形態形成タンパク質7(BMP7)、および/またはレチノイン酸の内の1種または複数種をさらに含んでよい。

好ましくは、腎オルガノイドは、少なくとも部分的に血管が新生している。

好ましくは、腎オルガノイドは、内皮、血管周囲細胞、および腎間質に取り囲まれた、分節化したネフロンを含む。

1つの態様において、腎臓オルガノイドの血管新生は、1つまたは複数のヒト多能性幹細胞および/またはそれから分化した血管内皮前駆体を含めることによって容易になる。

別の態様において、腎臓オルガノイドの血管新生は、血管新生を容易にする適切な酸素分圧の使用によって容易になる。

1つの態様において、方法は、生存能力があるネフロン前駆細胞および/または尿管上皮前駆細胞を同定する段階もさらに含む。

特定の態様において、生存能力があるネフロン前駆細胞および/または尿管上皮前駆細胞の同定は、生存能力があるネフロン前駆細胞および/または尿管上皮前駆細胞のマーカーとしての複数の核酸および/またはタンパク質の同時発現の測定または検出を含む。

別の局面において、本発明は、前述の局面の方法に従って作製された、単離、濃縮、または精製されたネフロン前駆細胞および/もしくは尿管上皮前駆細胞ならびに/または腎オルガノイドを提供する。

好ましくは、腎オルガノイドは、内皮および腎間質に取り囲まれた、分節化したネフロンを含む。

さらに別の局面において、本発明は、腎臓または腎臓細胞もしくは腎臓組織を作製する方法を提供し、該方法は、前述の局面のネフロン前駆細胞および/もしくは尿管上皮前駆細胞ならびに/または腎オルガノイドから腎臓または腎臓細胞もしくは腎臓組織を分化させ、それによって、腎臓または腎臓細胞もしくは腎臓組織を生じさせる段階を含む。

いくつかの態様において、ネフロン前駆細胞および/もしくは尿管上皮前駆細胞ならびに/または腎オルガノイドは、器官全体が脱細胞化した腎臓を再細胞化し、それによって、再構成された腎臓または代替腎臓を作り出すために使用され得る。

他の態様において、ネフロン前駆細胞および/もしくは尿管上皮前駆細胞ならびに/または腎オルガノイドは、腎臓疾患および腎臓病態の細胞療法のための供給源として使用され得る。

特定の局面において、ネフロン前駆細胞および/もしくは尿管上皮前駆細胞ならびに/または腎オルガノイドは、腎臓移植または慢性の腎臓損傷もしくは腎臓疾患の治療のために腎臓全体、腎臓細胞、および/または腎臓組織をバイオプリントするかまたは生物工学によって作製するための、細胞または組織の供給源として使用され得る。

特定の局面は、腎臓構造体をバイオプリントする方法を提供し、該方法は、複数のhPSCまたは本明細書において開示される他の前駆細胞を付着させて、腎臓もしくはその構成要素の1つもしくは複数の機能的特徴を有しているか、または腎臓もしくはその構成要素の1つもしくは複数の機能的特徴を示すようになることができる、腎臓構造体を形成させる段階を含む。

適切には、腎臓構造体は、少なくとも部分的に血管が新生しておりかつ/または血管前駆細胞を含む。

適切には、hPSCまたは他の前駆細胞は、三次元構造体中でネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞を作製するための本明細書において開示される方法に供される。

この特定の局面はまた、腎臓もしくはその構成要素の1つもしくは複数の機能的特徴を有しているか、または腎臓もしくはその構成要素の1つもしくは複数の機能的特徴を示すようになることができる、前述の方法によって作製された、バイオプリントされた腎臓構造体を提供する。

別の特定の局面は、腎臓構造体をバイオプリントする方法を提供し、該方法は、本明細書において開示される複数のネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞を付着させて、腎臓もしくはその構成要素の1つもしくは複数の機能的特徴を有しているか、または腎臓もしくはその構成要素の1つもしくは複数の機能的特徴を示すようになることができる、腎臓構造体を形成させる段階を含む。

適切には、バイオプリントされた腎臓構造体は、少なくとも部分的に血管が新生しておりかつ/または血管前駆細胞を含む。

適切には、ネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞は、本明細書において開示される方法によって、hPSCから作製された。

本発明の別の局面は、平面形状を有する、ネフロン前駆体および尿管前駆体のアレイを提供する。

アレイは、2～15個またはそれ以上の積み重ねられたアレイを含んでよい。

これらのアレイは、モザイク式のパターンで積み重ねられてよい。

本発明の関連局面は、前述の局面のアレイまたはその中の細胞を成熟または分化させることによって得られる腎オルガノイドを提供する。

適切には、腎オルガノイドは、少なくとも一部分は血管が新生しておりかつ/または血管前駆体を含む。

さらなる局面において、本発明は、1種または複数種の化合物の腎毒性を判定する方法を提供し、該方法は、1種または複数種の化合物を、前述の局面の単離もしくは精製されたネフロン前駆細胞および/もしくは尿管上皮前駆細胞、バイオプリントされた腎臓構造体、アレイ、および/もしくは腎オルガノイド、またはそれらから分化させるかもしくは別の方法で得られた腎臓細胞もしくは腎臓組織と接触させ、それによって、それら1種または複数種の化合物が腎毒性であるか否かを判定する段階を含む。

1つの態様において、この局面は、腎毒性スクリーニング用の腎臓オルガノイド中へのネフロン前駆体および/または尿管上皮前駆体のバイオプリンティングを提供する。
[本発明1001]
以下の段階を含む、ネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞を作製する方法:
ネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞が集合して、少なくとも部分的に血管が新生しておりかつ/または血管前駆体を含む1つまたは複数の腎オルガノイドになるのを誘導する条件下で、中間中胚葉(IM)細胞を、線維芽細胞増殖因子9(FGF9)、ならびに/または線維芽細胞増殖因子20(FGF20)および/もしくは線維芽細胞増殖因子2(FGF2)、ならびに任意で、骨形態形成タンパク質7(BMP7);ヘパリン;Wntアゴニスト;レチノイン酸(RA)、類似体またはアゴニスト;およびRAアンタゴニストからなる群より選択される1種または複数種と接触させ、それによって、ネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞を生じさせる段階。
[本発明1002]
間葉細胞または間葉組織からの血管内皮または血管前駆体の発生を促進するかまたは方向付ける条件によって、血管新生を容易にする、本発明1001の方法。
[本発明1003]
FGF9ならびに/またはFGF20および/もしくはFGF2が、約20ng～1μg/mLの範囲、約50～500ng/mLの範囲、約100～300ng/mLの範囲、および約200ng/mLからなる群より選択される濃度である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
BMP7が、約25～75ng/mLの範囲、約35～60ng/mLの範囲、約45～55ng/mLの範囲、および約50ng/mLからなる群より選択される濃度で存在する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1005]
RA、類似体、またはアゴニストが、IM細胞からの尿管上皮前駆細胞の相対的発生を増加させる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1006]
RA、類似体、またはアゴニストが、約10pM～1μMの範囲、約30pM～0.5μMの範囲、約50pM～0.2μMの範囲、および約0.1μMからなる群より選択される濃度で存在する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1007]
RAアンタゴニストが、IM細胞からのネフロン前駆体前駆細胞の相対的発生を増加させる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1008]
RAアンタゴニストが、約0.50pM～10μMの範囲、約0.01μM～5μMの範囲、約0.1μM～5μMの範囲、および約1μMからなる群より選択される濃度で存在する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1008]
Wntアゴニストが、IM細胞からのネフロン前駆体前駆細胞の相対的発生を増加させる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1009]
Wntアゴニストが、約0.1μM～10μMの範囲、約0.2μM～5μMの範囲、および約1～2μMの範囲からなる群より選択される濃度で存在する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1010]
ヘパリンが、約0.1～10μg/mLの範囲の濃度で存在する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1011]
中間中胚葉(IM)細胞を、FGF9のみと、またはBMP7、RA、RAアンタゴニスト、Wntアゴニスト、FGF20、FGF2、および/もしくはヘパリンの内の1種もしくは複数種と組み合わせたFGF9と、約72～360時間接触させる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
ネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞を同期的または同時にIM細胞から作製する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
後方原始線条細胞を、該後方原始線条細胞がIM細胞に分化するのを容易にする1種または複数種の作用物質と接触させる段階を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1014]
ヒト多能性幹細胞(hPSC)を、該hPSCが後方原始線条細胞に分化するのを容易にする1種または複数種の作用物質と接触させる段階を含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
hPSCをWntアゴニストと接触させ、それによって中胚葉細胞を生じさせる段階を含む、中胚葉細胞を作製する方法。
[本発明1016]
中胚葉細胞が、完成形の中胚葉および中間中胚葉の内の1つまたは複数を含む混合集団である、本発明1015の方法。
[本発明1017]
Wntアゴニストの濃度が約8μMである、本発明1015または1016の方法。
[本発明1018]
hPSCをWntアゴニストと約4日間接触させる、本発明1015、1016、または1017の方法。
[本発明1019]
中胚葉細胞を、続いてFGF9ならびに/またはFGF20および/もしくはFGF2と約3日間接触させる、本発明1015～1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記細胞をWntアゴニストと接触させる後続の段階をさらに含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
Wntアゴニストの濃度が約5μMである、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記細胞をWntアゴニストと約1時間接触させる、本発明1019、1020、または1021の方法。
[本発明1023]
前記細胞を、RAアンタゴニスト、RAもしくはRAアゴニスト、BMP7、および/またはヘパリンの内の1種または複数種と接触させる段階をさらに含む、本発明1015～1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
血管系および/または血管前駆細胞の作製をさらに含む、本発明1015～1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
間葉細胞または間葉組織からの血管内皮または血管前駆体の発生を促進するかまたは方向付ける条件によって、血管新生を容易にする、本発明1024の方法。
[本発明1026]
hPSCが、ヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1027]
本発明1001～1026のいずれかの方法に従って作製された、単離、濃縮、または精製されたネフロン前駆細胞、尿管上皮前駆細胞、および/または腎オルガノイド。
[本発明1028]
分節化したネフロン、内皮、および腎間質を含む、本発明1027の腎オルガノイド。
[本発明1029]
ヒト胎児腎臓または1種もしくは複数種のその細胞型に転写的に類似している1種または複数種の腎細胞または腎細胞型を含む、本発明1028の腎オルガノイド。
[本発明1030]
本発明1026の単離または精製されたネフロン前駆細胞、尿管上皮前駆細胞、および/または腎オルガノイドから腎臓または腎臓細胞もしくは腎臓組織を分化させ、それによって、腎臓または腎臓細胞もしくは腎臓組織を生じさせる段階を含む、腎臓または腎臓細胞もしくは腎臓組織を作製する方法。
[本発明1031]
腎臓または腎臓細胞もしくは腎臓組織を作製する際に使用するための、本発明1030の単離、濃縮、または精製されたネフロン前駆細胞および/もしくは尿管上皮前駆細胞または腎オルガノイド。
[本発明1032]
複数のhPSCまたは他の前駆細胞を付着させて腎臓構造体を形成させる段階を含む、腎臓構造体をバイオプリントする方法であって、該腎臓構造体が、少なくとも部分的に血管が新生しておりかつ/もしくは血管前駆体を含み、かつ腎臓もしくはその構成要素の1つもしくは複数の機能的特徴を有しているか、または腎臓もしくはその構成要素の1つもしくは複数の機能的特徴を示すようになることができる、方法。
[本発明1033]
hPSCまたは他の前駆細胞を本発明1001～1026のいずれかの方法に供し、それによって、バイオプリントされた腎臓構造体中でネフロン前駆細胞、尿管上皮前駆細胞、および血管系を生じさせる、本発明1033の方法。
[本発明1034]
本明細書において開示される複数のネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞を付着させて腎臓構造体を形成させる段階を含む、腎臓構造体をバイオプリントする方法であって、該腎臓構造体が、少なくとも部分的に血管が新生しておりかつ/もしくは血管前駆体を含み、かつ腎臓もしくはその構成要素の1つもしくは複数の機能的特徴を有しているか、または腎臓もしくはその構成要素の1つもしくは複数の機能的特徴を示すようになることができる、方法。
[本発明1035]
ネフロン前駆細胞、尿管上皮前駆細胞、および血管系が、本発明1001～1026のいずれかの方法によってhPSCから作製された、本発明1036の方法。
[本発明1036]
本発明1032～1035のいずれかの方法によって作製された、少なくとも部分的に血管が新生しており、腎臓もしくはその構成要素の1つもしくは複数の機能的特徴を有しているか、または腎臓もしくはその構成要素の1つもしくは複数の機能的特徴を示すようになることができる、バイオプリントされた腎臓構造体。
[本発明1037]
(i)腎臓移植もしくは慢性腎臓疾患の治療のために腎臓全体および腎臓組織をバイオプリントするかもしくは生物工学によって作製するための;(ii)器官全体が脱細胞化した腎臓を再細胞化し、それによって、再構成された腎臓もしくは代替腎臓を作り出すための;または(iii)損傷した腎臓または1種もしくは複数種の腎臓疾患もしくは腎臓病態の細胞療法のための、本発明1031または本発明1032～1035のいずれかの方法。
[本発明1038]
平面形状を有する、ネフロン前駆体および尿管前駆体のアレイ。
[本発明1039]
2～15個またはそれ以上の積み重ねられたアレイを含む、本発明1038のアレイ。
[本発明1040]
アレイが、モザイク式のパターンで積み重ねられている、本発明1039のアレイ。
[本発明1041]
本発明1038、1039、または1040のアレイを成熟させることによって得られる、腎オルガノイド。
[本発明1042]
少なくとも一部分は血管が新生しておりかつ/または血管前駆体を含む、本発明1041の腎オルガノイド。
[本発明1043]
以下の段階を含む、1種または複数種の化合物の腎毒性を判定する方法:
該1種または複数種の化合物を、本発明1026、1041、もしくは1042のいずれかの単離もしくは精製されたネフロン前駆細胞および/もしくは尿管上皮前駆細胞もしくは腎オルガノイド、本発明1036のバイオプリントされた腎臓構造体、本発明1038～1040のいずれかのアレイ、またはそれらから分化させるかもしくは別の方法で得られた腎臓細胞もしくは腎臓組織と接触させ、それによって、該1種または複数種の化合物が腎毒性であるか否かを判定する段階。
[本発明1044]
1種または複数種の化合物を、単離もしくは精製されたネフロン前駆細胞および/もしくは尿管上皮前駆細胞、腎オルガノイド、バイオプリントされた構造体、またはそれらから分化させるかもしくは別の方法で得られた腎臓細胞もしくは腎臓組織と接触させることによって実施される、本発明1038の方法。

CHIRと共に3日、4日、または5日間培養し、続いてFGF9のみ(b)またはRAを伴うFGF9(a)もしくはRAアンタゴニストを伴うFGF9(c)と培養した際の、異なる(differential)効果。形成中のネフロンの間にあるMEIS1⁺支質集団の存在。赤=MEIS1;青=核。 CD31⁺血管前駆体の存在。赤色=NPHS1(足細胞)、青色=核、緑色=CD31。正常な胚器官形成を示唆する、互いに連結している集合管(GATA3⁺PAX2⁺ECAD⁺)、遠位尿細管(ECAD⁺GATA3^-LTL^-)、近位尿細管(LTL⁺AQP1⁺)、および糸球体(WT1⁺NPHS1⁺SYNPO⁺)を含む、正常な発生中のネフロンの全分節の存在。ピンク色=GATA3、緑色=ECAD、青色=LTL、赤色=WT1、集合管(ピンク色および緑色)、遠位尿細管(緑色)、近位尿細管(青色)、糸球体(核が赤色)。ペレット状にされた後11日間培養した腎オルガノイド。a=直径3～5cmを示す明視野の画像。b=免疫蛍光染色の画像。緑色=ECAD、赤色=NPHS1、青色=LTL、遠位尿細管(緑色)、近位尿細管(青色)、糸球体(赤色)。再集合直後に多量のCHIR(5μM)の45分の短時間適用を追加し、それに続いて、AGN(レチノイン(retinoic)阻害剤)、BMP7、少量のCHIR、またはRAを伴うまたは伴わないFGF9の存在下で5日間、次いで、これらの因子を用いずに6日間、培養。a=CHIRを用いない場合の4日目のペレット;b=45分間CHIRを短時間適用した場合の4日目のペレット;c=CHIRを用いない場合の11日目のペレット;d=45分間CHIRを短時間適用した場合の11日目のペレット。集合管系統または腎臓間葉系統のいずれかの選択的誘導。a、胚形成におけるIMのA-Pパターン化のメカニズムを例示する概略図¹³。PSM細胞移動のタイミングによってFGF9およびRAへの曝露のタイミングが決まり、その結果、AIになるかPIになるかの運命が選択される。PSM、未分節中胚葉(presomitic mesoderm);AI、前方中間中胚葉(anterior intermediate mesoderm);PI、後方中間中胚葉(posterior intermediate mesoderm);UE、尿管上皮(ureteric epithelium);MM、後腎間葉(metanephric mesenchyme)。b、3通りの実験スケジュール表の概略図。c、上記のタイミングから最初の7日間の分化についての時間経過qPCR。実験は、単層培養条件を用いて実施した。(平均値±s.d.、3回の(n=3)独立した実験)。d、AIマーカーGATA3およびPIマーカーHOXD11を用いた、分化7日目の時点の免疫蛍光法。スケール=100μm。実験反復数=3。e、原始線条期後のRAシグナル伝達を例示する概略図。RA代謝酵素CYP26がPSM領域において発現されて、RAシグナル伝達からPSM細胞を守っている。f、3通りの実験スケジュール表の概略図。CHIR99021後にRAまたはAGN193109(AGN)をFGF9と共に添加し、続いて増殖因子を除去した(GFなし)。実験は、単層培養条件を用いて実施した。g、3日間のCHIR99021とそれに続く±RA/AGNからの分化18日目の時点での免疫蛍光法。AGNは初期の移動性細胞のAI特定化(specification)を阻害して、後方化(posteriorization)を引き起こした。18日目に、GATA3およびHOXD11は、UEおよびMMをそれぞれ標識している(左のパネル)。GATA3⁺PAX2⁺ECAD⁺細胞はUEに相当するのに対し、GATA3^-PAX2⁺細胞はMM(ECAD^-)およびその派生物(ECAD⁺)に対応する(右のパネル)。実験反復数=3。スケール=100μm。ヒト胎児腎臓と同等の腎臓オルガノイドのインビトロでの作製。a、hPSCからの分化プロトコールの概略図。b、自己組織化する腎臓オルガノイドの時系列の全体的(global)明視野観察結果。オルガノイド分化の成功率は94.2％であった(138個のオルガノイド、5回の実験)。スケール=1mm。c、構造の複雑性を示している、腎臓オルガノイド全体のタイルスキャン免疫蛍光法。スケール=1mm。d、集合管(CD、GATA3⁺ECAD⁺)、遠位尿細管(DT、GATA3^-ECAD⁺LTL^-)、近位尿細管(PT、ECAD^-LTL⁺)、および糸球体(G、WT1⁺)を含む4つの区画に分節化したネフロンを示す、高性能免疫蛍光顕微鏡検査。スケール=100μm。e、11日目の腎臓オルガノイドの底部から上部までの連続的zスタック画像を生成する共焦点顕微鏡検査(拡張データビデオ1および2)。概略図は、オルガノイド内の様々な構造体の位置を示している。e'、e''、およびe'''は、eに表示した位置でオルガノイドを撮影した代表的な画像である。ネフロンの各分節は、以下のように標識されている(または概略図中で着色されている):集合管、GATA3⁺ECAD⁺(黄色中の緑色の点);遠位尿細管、ECAD⁺(黄色);近位尿細管、LTL⁺(赤色);糸球体、NPHS1(緑色の円)。スケール=100μm。f、13種のヒト胎児組織に対する腎臓オルガノイドの相対的転写同一性(transcriptional identity)(KeyGeneアルゴリズム¹⁵を用いて決定された0～1のスコア)を可視化したヒートマップ。4つの時点(集合後0日目、3日目、11日目、18日目)の腎臓オルガノイド全体に対して、1回の実験/時点について3個の個別のオルガノイドを用いて、RNAシークエンス(RNA-seq)を実施した(補足の表2を参照されたい)。g、以前に確定されている85種の鍵となる遺伝子(補足の表3)に基づいた¹⁵、0日目、3日目、11日目、および18日目の腎臓オルガノイドと第1三半期および第2三半期の両方のヒト胎児器官との階層的クラスタリングを示す樹状図。これは、培養の11日目および18日目から、第1三半期胎児腎臓とよく合致している(a close match)ことをはっきりと示している。腎臓オルガノイドは、培養中に時間とともに漸進的に成熟する、分化中のネフロン、支質、および血管系を含む。a、IMから腎臓の各細胞構成要素までの発生経路を示す概略図。CD、集合管(collecting ducts);DT、遠位尿細管(distal tubules);LoH、ヘンレ係蹄(loops of Henle); PT、近位尿細管(proximal tubules);POD、足細胞(podocytes);VASC、血管系(vasculature);STROM、腎間質(renal interstitium)。b～j、11日目または18日目いずれかの腎臓オルガノイドの免疫蛍光法。b、PAX2、GATA3、およびECADによって標識された集合管。スケール=50μm。c、d、11日目のLTL⁺ECAD^-の初期近位尿細管(色を塗っていない(blanked)矢印先端部)。LTL⁺ECAD⁺の成熟近位尿細管は、18日目までに現れる(白い矢印先端部)。スケール=100μm。e、近位尿細管はキュビリン(CUBN)を発現する。スケール=50μm。f、UMODおよびECADによって標識されたヘンレ係蹄。スケール=50μm。g、WT1およびNPHS1によって標識された足細胞を有している発生中の糸球体。スケール=50μm。h、腎間質内のCD31⁺内皮。スケール=200μm。i、培養18日目時点の糸球体への内皮侵入の証拠。スケール=50μm。j、MEIS1によって標識された腎間質。スケール=100μm。k～m、腎臓オルガノイドの透過型電子顕微鏡検査。k、比較的まばらな短い微絨毛(m)およびタイトジャンクション(tj)を有している、推定上の遠位尿細管。l、刷子縁(bb)の特徴である広範囲の密に詰まった微絨毛で満たされた管腔を有している、推定上の近位尿細管。m、特徴的な大きな核ならびに一次足突起(pf)および二次足突起(sf)を有している足細胞(p)。データは、最低でも3回の独立した実験から得られた代表である。近位尿細管の機能成熟。a、LTL⁺尿細管のエンドサイトーシス能力を示すデキストラン取込みアッセイ法。スケール=50μm。b、腎臓オルガノイドを20μMシスプラチンで処理すると、LTL⁺ECAD⁺近位尿細管細胞のアポトーシスを引き起こした。アポトーシス細胞は、切断型カスパーゼ3の抗体染色(CASP3)によって検出した。スケール=100μm。c、腎毒性物質シスプラチンによる成熟近位尿細管に特異的なアポトーシスを示しているアポトーシス性尿細管の数の定量。5uMおよび20uMのシスプラチンに応答して、LTL⁺ECAD⁺成熟近位尿細管(PT)は、用量依存的にアポトーシスを受けた。対照的に、LTL⁺ECAD^-未成熟PTはシスプラチンに応答しなかった。p値は、独立t検定によって算出した(平均値±s.e.、5回の(n=5)独立した実験)。腎臓オルガノイドにおける腎形成の調節。a、集合直後に5μMのCHIR99021で1時間オルガノイドを刺激すると、腎形成が促進されたのに対し(CHIR短時間適用)、CHIR99021を用いない場合(短時間適用なし)は、ごく限られた数の腎形成事象しか起こらなかった。スケール=1mm。b、このCHIR99021短時間適用後にFGF9を添加しなかった場合、オルガノイドは腎形成を始めなかった(-FGF9)。スケール=200μm。腎臓オルガノイドの発生中の遺伝子発現の変化。a～c、腎臓オルガノイド培養物の選択されたマーカー遺伝子の4つの時点(0日目、3日目、11日目、および18日目)における発現変化を示すグラフ。X軸は、RNAシークエンシング解析における各遺伝子の検出回数を表す。ネフロン前駆体(キャップ状間葉)および集合管前駆体(尿管先端部)のマーカーは、3日目までにピークに達し、その後、減少した(a)。初期ネフロンのマーカーは3日目までに増加したのに対し、成熟したネフロン構成要素(近位尿細管および遠位尿細管ならびに足細胞)のものは3日目より後に出始めた。図は、発生中の腎臓における選択された各遺伝子の発現領域(青色に着色)を示している(b)。 0日目、3日目、11日目、18日目の分化実験ならびに第1三半期および第2三半期の21種のヒト胎児器官の階層的クラスタリングを示す樹状図(GSE66302)¹⁵。試料の名称は、個体IDとそれに続けた器官名および妊娠週から構成されている。例えば、「DJ1腎臓_9」は、個体ID:DJ1に由来する妊娠第9週時点の腎臓を表す。0日目および3日目の腎臓オルガノイドは、性腺とクラスター形成し、これは、性腺および腎臓の両方が中間中胚葉に由来し起源が共通であることと整合が取れていた。11日目および18日目の腎臓オルガノイドは、第1三半期のヒト腎臓と最も強い類似性を示している。この解析のために使用されたクラシファー遺伝子は、表3に詳述している。腎臓オルガノイドの非上皮構造体の特徴付け。画像はすべて、18日目の腎臓オルガノイドから撮影した。a、KDR⁺血管に付着しているPDGFRA⁺周皮細胞。スケール=50μm。b、一部の糸球体は、初期のメサンギウム細胞に相当する可能性が高いPDGFRA⁺細胞を含んでいた¹⁹。スケール=50μm。

詳細な説明
本発明は、中間中胚葉(IM)からのネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆体の同期的な同時分化を促進して、少なくとも部分的に血管が新生している腎オルガノイドまたは他の腎細胞集合体もしくは腎組織集合体を生じるように調整された特殊なインビトロ培養条件を特定することに少なくとも部分的に基づいている。より具体的には、FGF9およびヘパリンは、それらのみで、または骨形態形成タンパク質7(BMP7)、レチノイン酸(RA)、RAアンタゴニスト;Wntアゴニスト;ならびに/もしくはFGF20およびヘパリン;ならびに/もしくはFGF2およびヘパリンを含む1種もしくは複数種の作用物質との組合せで、中間中胚葉がネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆体に分化するのを容易にすることができる。これに加えて、インビトロ培養方法は、後方原始線条期、IM期、および後腎間葉期を経てヒト胚性幹細胞を分化させてネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞を生じさせるためのシステムを提供する。有利なことに、RA、RAアンタゴニスト、および/またはWntアゴニストなどある種の分子の存在または非存在を操作して、尿管上皮前駆体に対してネフロン前駆細胞の発生(production)を優先的に促進することができ、逆もまた同様である。より具体的には、本発明は、ヒト多能性幹細胞を方向付けて、内皮および腎間質に取り囲まれた完全に分節化したネフロンを含み、かつヒト胎児腎臓に転写的に類似している、複雑な多細胞性腎臓オルガノイドを形成させることができるという発見にも基づいている。血管新生は、間葉細胞または間葉組織からの血管内皮の発生を促進するかまたは方向付ける条件によって、容易になり得る。

ネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞は、同時に誘導され、インビボで互いの分化を方向付け、かつ尿管樹(ureteric tree)およびネフロン前駆体間葉を含む別個の管状上皮構造体に発達することができ、その間、これらの上皮構造体は尿管先端部の代わりをしてネフロン前駆細胞を守っている(maintain)。したがって、本発明に従って作製されたhESC由来の尿管上皮前駆細胞および/またはネフロン前駆細胞を方向付けて、尿管区画および間葉区画の両方から腎細胞に分化させ得ることが提唱される。さらに、これらの細胞が「自己組織化」して集合したオルガノイド構造体になる能力は、それゆえ、腎臓生物工学などを手段とする腎臓修復を容易にするために活用され得る。ネフロン前駆細胞、それに由来するネフロン、または前述したように「自己組織化した」腎臓オルガノイドはまた、試験に適した細胞を作製することがこれまでできなかったために妨げられていた腎毒性試験に向いている可能性がある。

他に規定されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有している。本明細書において説明されるものと同様または等価な任意の方法および材料を、本発明の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を説明する。

本明細書において使用される場合、文脈から異なった意味に解される場合を除き、「含む(comprise)」という用語、ならびにこの用語の変形、例えば「含んでいる(comprising)」、「含む(comprises)」、および「含んだ(comprised)」は、さらなる添加物、構成要素、整数、または段階を除外することを意図しない。

不定冠詞「1つの(a)」および「1つの(an)」は、単数形の不定冠詞として解釈されるべきでもなく、そうでなければこの不定冠詞が言及する複数(more than one)または1つより多い(more than a single)対象を除外するものとして解釈されるべきでもないことが認識されると考えられる。例えば、「1つの(a)」細胞は、1個の細胞、1つまたは複数の細胞、および複数の細胞を含む。

本発明の目的において、「単離された(isolated)」とは、天然状態から取り出された、またはそうでなければヒトによる操作に供された、材料を意味する。単離された材料(例えば細胞)は、天然状態では通常それに付随する構成要素を実質的もしくは本質的に含まなくてよく、または天然の状態では通常それに付随する構成要素と共に人工状態で存在するように操作されてもよい。

「濃縮された(enriched)」または「精製された(purified)」とは、濃縮または精製より前の以前の状態と比べて、特定の状態(例えば、濃縮または精製された状態)において発生率、出現率(representation)、または頻度が高いことを意味する。

「分化する(differentiate)」、「分化している(differentiating)」、および「分化した(differentiated)」という用語は、発生経路の早期段階または初期段階から発生経路の後期段階またはより成熟した段階への細胞の発達(progression)を意味する。この文脈において、「分化した(differentiated)」とは、細胞が完全に分化しており、その発生経路に沿って、または他の発生経路に沿ってさらに発達する多能性(pluropotentiality)または能力を失っていることを意味も暗示もしないことが、認識されると考えられる。分化は、細胞分裂を伴う場合がある。

「前駆細胞」とは、自己複製の有無に関わらず、1つまたは複数の発生経路に沿って分化することができる細胞である。典型的には、前駆細胞は、単能性または寡能性であり、少なくとも限定的な自己複製を行う能力がある。

当技術分野において十分に理解されているように、細胞の分化の段階または状態は、複数のマーカーの内の1つの発現および/または非発現に基づいて特徴付けることができる。この文脈において、「マーカー」とは、細胞、細胞集団、系統、区画、または部分集合のゲノムにコードされており、その発現または発現パターンが、発生を通して変化する、核酸またはタンパク質を意味する。核酸マーカーの発現は、それらに限定されるわけではないが、核酸配列増幅(例えばポリメラーゼ連鎖反応)および核酸ハイブリダイゼーション(例えば、マイクロアレイ、ノーザンハイブリダイゼーション、インサイチューハイブリダイゼーション)を含む、当技術分野において公知である任意の技術によって検出または測定することができる。タンパク質マーカーの発現は、それらに限定されるわけではないが、フローサイトメトリー、免疫組織化学、イムノブロッティング、タンパク質アレイ、タンパク質プロファイリング(例えば2Dゲル電気泳動)を含む、当技術分野において公知である任意の技術によって検出または測定することができる。

本発明の1つの局面は、中間中胚葉(IM)細胞をBMP7;レチノイン酸(RA);RAアンタゴニスト;Wntアゴニスト;線維芽細胞増殖因子9(FGF9)および/またはFGF20;ならびにヘパリンと接触させ、それによって、IM細胞からネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞を生じさせる段階を含む、ネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞を作製する方法を提供する。

本明細書における「レチノイン酸」または「RA」への言及は、あらゆる形態のレチノイン酸(例えば、あらゆるトランスRAおよび9-シスRAを含む)、類似体、および/またはRAに類似した生物活性を有しているレチノイン酸受容体(RAR)アゴニストを含む。様々な異なるRA類似体およびRARアゴニスト(RARα、RAR β、またはRAR γに対して非選択的なアゴニストおよび選択的なアゴニストを含む)は、R & D SystemsおよびTocris Bioscienceなどから市販されている。

「RAアンタゴニスト」への個々の言及は、レチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストおよびRARを介するRAシグナル伝達を阻害、遮断、または阻止する他の任意の分子を含む。RARアンタゴニストの非限定的な例には、それらに限定されるわけではないが、AGN193109、LE135、ER50891、BMS493、BMS453、およびMM11253が含まれる。この定義は、RAアンタゴニストが、同様にまたは代わりに、別のリガンドの結合による(from)、RARを介したシグナル伝達の遮断を模倣する可能性を除外しない。

本明細書において使用される場合、「Wntアゴニスト」とは、古典的Wntシグナル伝達経路においてGSK3(例えばGSK3-β)を阻害するが、好ましくは、他の非古典的Wntシグナル伝達経路においてはそれを阻害しない分子である。Wntアゴニストの非限定的な例には、CHIR99021、LiCl SB-216763、CAS853220-52-7、ならびにSanta Cruz BiotechnologyおよびR & D Systemsなどの供給業者から市販されている他のWntアゴニストが含まれる。この定義は、WntアゴニストがGSK3β活性の1種または複数種の他の阻害剤を模倣する可能性を無条件に除外すると解釈されるべきではない。

また、FGF9が好ましくはあるものの、FGF2、FGF9、およびFGF20などの線維芽細胞増殖因子は交換可能であり得ることも認識されると考えられる。典型的には、ヘパリンは、FGF2、FGF9、および/またはFGF20などの線維芽細胞増殖因子の生物活性を促進または増強するために含まれる。

FGF9、BMP7、レチノイン酸(RA)、RAアンタゴニスト、Wntアゴニスト、FGF20、およびヘパリンそれぞれの好ましい濃度は、以下により詳細に説明する。また、RAアゴニストもしくはRA類似体、RAアンタゴニスト、および/またはWntアゴニストなどある種の分子の存在または非存在を管理または操作して、尿管上皮前駆体に対してネフロン前駆細胞の発生を優先的に促進すること(逆もまた同様)にも言及する。

本明細書において使用される場合、「ネフロン前駆細胞」は、初期の間葉上皮移行を経てあらゆるネフロン分節(集合管以外)に分化できる、後腎間葉由来の前駆細胞であり、ネフロン分節には、それらに限定されるわけではないが、連結部分(connecting segment)、遠位曲尿細管(DCT)細胞、遠位直尿細管(DST)細胞、近位直尿細管(PST)分節1および2、PST細胞、足細胞、糸球体内皮細胞、上行するヘンレ係蹄、ならびに/または下行するヘンレ係蹄などのネフロン上皮が含まれる。ネフロン前駆細胞はまた、自己複製する能力もある。

後腎間葉に特徴的または典型的なマーカーの非限定的な例には、それらに限定されるわけではないが、WT1、SIX1、SIX2、SALL1、GDNF、および/またはHOXD11が含まれる。ネフロン前駆細胞に特徴的または典型的なマーカーの非限定的な例には、それらに限定されるわけではないが、WT1、SIX1、SIX2、CITED1、PAX2、GDNF、SALL1、OSR1、およびHOXD11が含まれる。

「尿管上皮前駆細胞」とは、中腎管またはその派生物である尿管芽に由来するか、それから取得可能であるか、またはそれから生じ、腎臓組織および/または集合管のような腎臓構造体に発達することができる上皮前駆細胞を意味する。

尿管上皮前駆細胞に特徴的または典型的なマーカーの非限定的な例には、それらに限定されるわけではないが、HOXB7、cRET、GATA3、CALB1、E-カドヘリン、およびPAX2が含まれる。

上述したように、ネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞は、FGF9のみの存在下で、あるいはBMP7、レチノイン酸(RA)、アゴニストもしくは類似体、AGN193109のようなRAアンタゴニスト、および/またはFGF20、ならびに好ましくはヘパリンを含む1種または複数種の作用物質と組み合わせたFGF9の存在下で、中間中胚葉(IM)細胞から分化する。

「中間中胚葉(IM)」細胞とは、後方原始線条から順に誘導される完成形の中胚葉から生じ、かつ尿管および腎臓ならびに性腺のような他の組織を含めて、泌尿生殖器系に最終的に発達することができる、胚性中胚葉系細胞を意味する。中間中胚葉に特徴的または典型的なマーカーの非限定的な例には、PAX2、OSR1、および/またはLHX1が含まれる。

IM細胞の作製は、IM細胞が、他の細胞型が存在しない純粋または均一なIM細胞集団である(例えば、完成形の中胚葉)ことを意味するつもりではないこともまた、認識されると考えられる。したがって、「IM細胞」または「IM細胞集団」への言及は、それらの細胞または細胞集団がIM細胞を含むことを意味する。

適切には、本発明によれば、下記により詳細に説明するように、IM細胞は、後方原始線条細胞を、後方原始線条細胞がIM細胞に分化するのを容易にする1種または複数種の作用物質と接触させることによって作製される。

好ましくは、IM細胞は、後方原始線条細胞を、後方原始線条細胞がIM細胞に分化するのを容易にする1種または複数種の作用物質と接触させることによって作製される。

典型的には、これら1種または複数種の作用物質には、線維芽細胞増殖因子9(FGF9)、ならびに任意で、AGN193109のようなRAアンタゴニストならびに/またはFGF2および/もしくはFGF20などの1種もしくは複数種の他のFGFが含まれる。

「後方原始線条(PPS)」細胞とは、哺乳動物の胚発生の初期段階の間に胞胚において形成する原始線条構造体の後端の細胞から取得可能である細胞、またはそれらに機能的かつ/もしくは表現型的に対応する細胞を意味する。後方原始線条は、左右相称を確立し、原腸形成の部位を決定し、かつ胚葉形成を開始させる。典型的には、後方原始線条は、中胚葉前駆体(すなわち、予定中胚葉)であり、前部原始線条は、内胚葉前駆体(すなわち、予定内胚葉)である。後方原始線条に特徴的または典型的なマーカーの非限定的な例には、ブラキュリ(Brachyury)(T)が含まれる。前部原始線条に特徴的または典型的なマーカーの非限定的な例は、SOX17である。MIXL1は、後方原始線条および前部原始線条の両方によって発現され得る。

後方原始線条細胞の作製は、後方原始線条細胞が、他の細胞型が存在しない純粋または均一な後方原始線条細胞の集団であることを意味するつもりではないこともまた、認識されると考えられる。したがって、「後方原始線条細胞」または「後方原始線条細胞の集団」への言及は、それらの細胞または細胞集団が後方原始線条細胞を含むことを意味する。

適切には、本発明によれば、下記により詳細に説明するように、後方原始線条細胞は、hPSC細胞を、hPSC細胞が後方原始線条細胞に分化するのを容易にする1種または複数種の作用物質と接触させることによって作製される。

典型的には、1種または複数種の作用物質には、骨形態形成タンパク質4(BMP4)、アクチビンA、および/またはCHIR99021のようなWntアゴニストが含まれる。

「ヒト多能性幹細胞」および「hPSC」という用語には、多能性を示すヒト組織に由来するか、それから取得可能であるか、またはそれから生じる、細胞を意味する。hPSCは、ヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞であってよい。

ヒト多能性幹細胞は、内部細胞塊に由来し得るか、または山中因子を用いて多くの胎児体細胞型または成体体細胞型から再プログラムされ得る。hPSCの作製は、体細胞核移植を用いて実行可能である場合がある。

「ヒト胚性幹細胞」、「hES細胞」、および「hESC」という用語は、ヒト胚またはヒト胚盤胞に由来するか、それから取得可能であるか、またはそれから生じる、自己複製し、多能性または全能性であり、成熟動物中に存在するあらゆる細胞型を生じる能力を有している、細胞を意味する。ヒト胚性幹細胞(hESC)は、例えば、ヒトのインビボの着床前胚、インビトロで受精させた胚、または胚盤胞期まで増殖させた単細胞ヒト胚から得られるヒト胚盤胞から単離することができる。

「人工多能性幹細胞」および「iPSC」という用語は、外来遺伝子、例えば、OCT4、SOX2、KLF4、およびc-MYCという好ましい組合せを含む転写因子の発現を通じて多能性状態に再プログラムされた任意の型のヒト成体体細胞から誘導可能であるか、取得可能であるか、または生じる、細胞を意味する。hiPSCは、hESCと同等レベルの多能性を示すが、分化および細胞送達の前の同時遺伝子修復を併用または併用せずに、自家療法のために患者から誘導することができる。

より一般的には、本明細書において開示される方法は、任意の患者に由来する任意の多能性幹細胞、または変異モデルを生じるように遺伝子編集によって後で改変されたhPSC、または遺伝子編集によって修復された変異hPSCに適用され得る。遺伝子編集は、CRISPR技術、TALEN技術、またはZFヌクレアーゼ技術を用いて行われ得る。

前記の内容から、本発明の好ましい広範な形態は、以下の順次的な段階を含む方法を提供することが認識されると考えられる:
(i)hPSCを、hPSCが後方原始線条細胞に分化するのを容易にする1種または複数種の作用物質と接触させる段階;
(ii)後方原始線条細胞を、後方原始線条細胞が中間中胚葉細胞に分化するのを容易にする1種または複数種の作用物質と接触させる段階;ならびに
(iii)中間中胚葉細胞を、FGF9ならびに任意で、BMP7;レチノイン酸;AGN193109のようなRAアンタゴニスト;CHIR99021のようなWntアゴニスト;FGF20;およびヘパリンの内の1種または複数種と接触させ、それによって、中間中胚葉細胞から後腎間葉細胞および尿管上皮前駆細胞を生じさせる段階。

これらの順次的な段階を以下の通り、本明細書において後述する。

(i)hPSCを後方原始線条に分化させる段階
前記の内容から認識されるように、それに限定されるわけではないが、APEL分化培地(Ng et al., 2008, Nat. Protoc. 3: 768)のような血清を含まない適切な培地において、hPSCをBMP4、アクチビンA、および/またはCHIR99021と接触させ、それによって、後方原始線条細胞を適切に含む後方原始線条細胞を生じさせる。hPSCは、hESCまたはiPSCであってよい。

適切には、BMP4は、約5～40ng/mLの濃度で存在し、アクチビンAは、約3～40ng/mLの濃度で存在する。1つの態様において、BMP4の濃度は約20～35ng/mLであり、またはより好ましくは約30ng/mLである。1つの態様において、アクチビンAの濃度は約5～30ng/mLであり、またはより好ましくは約10ng/mLである。適切には、最適な相対活量(relative activity)比は、BMP4とアクチビンAの比が3:1～1:6である範囲である。好ましくは、最適な相対活量比は、BMP4とアクチビンAの比が3:1～1:1である範囲である。

いくつかの態様において、CHIR99021のようなWntアゴニストは、約0.5～50μM、好ましくは約4～30μM、より好ましくは約5～20μM、または有利には約8μMの範囲の濃度で存在してよい。特定の態様において、CHIR99021は、BMP4およびアクチビンAの非存在下で、単独で存在する。

幹細胞の集団は、BMP4、アクチビンA、および/またはCHIR99021のようなWntアゴニストを含む培地中で、36～120時間、培養されてよい。

いくつかの非限定的な態様において、細胞は、hESCに対して必要とされるより長い期間、BMP4、アクチビンA、および/またはCHIR99021と接触させられてよい。例として、iPSCのような細胞は、BMP4、アクチビンA、および/またはCHIR99021と、最長で96～120時間接触させられてよい。

培地は、24～48時間毎に交換されてよい。

理論に拘泥するものではないが、本明細書において開示されるようにhPSCをBMP4、アクチビンA、および/またはCHIR99021のようなWntアゴニストと接触させると、後方原始線条を含む原始線条(PS)が形成される。これは、中胚葉組織および内胚葉組織の発生に向かう最初の段階である。典型的には、hPSCの分化は、後方原始線条(すなわち予定中胚葉)に特徴的なマーカーを発現する細胞および前部原始線条(すなわち予定内胚葉)に特徴的なマーカーを発現する細胞を含む、細胞の混合集団へと向かう。

後方原始線条(予定中胚葉)に特徴的なマーカーの非限定的な例には、ブラキュリ(T)が含まれる。

前部原始線条(予定内胚葉)に特徴的なマーカーの非限定的な例は、SOX17である。

(ii)後方原始線条細胞の中間中胚葉(IM)への分化
適切には、後方原始線条細胞、または後方原始線条細胞を含む原始線条混合集団を、APEL分化培地のような血清を含まない適切な培地において、FGF9ならびに任意でFGF2および/またはFGF20を少なくとも含む1種または複数種の線維芽細胞増殖因子(FGF)、ならびに/またはレチノイン酸(RA)アンタゴニストと接触させる。

典型的には、レチノイン酸シグナル伝達アンタゴニストは、レチノイン酸受容体(RAR)の阻害剤またはAGN193109のようなアンタゴニストである。

適切には、FGF2、FGF9、および/またはFGF20は、約100～400ng/mLの濃度で存在する。好ましい態様において、FGF2、FGF9、および/またはFGF20は、約150～300ng/MLまたは有利には約200ng/mLの濃度で存在する。1つの態様において、RAアンタゴニスト(例えばAGN193109)の濃度は、約0.1～10μMまたはより好ましくは0.5～5μMである。

これらの細胞を、FGF9のみと、またはFGF2および/もしくはFGF20ならびに/またはRAアンタゴニスト(例えばAGN193109)を伴うFGF9と、少なくとも約96時間、ただし約190～200時間以下の間、接触させる。好ましくは、これらの細胞を、FGF9のみと、またはFGF2および/もしくはFGF20ならびに/またはRAアンタゴニスト(例えばAGN193109)を伴うFGF9と、約96時間接触させる。

培地は、40～48時間毎に交換されてよい。

1つの態様において、(典型的には、後方原始線条(予定中胚葉)および前部原始線条(予定内胚葉)に特徴的なマーカーを発現する)後方原始線条細胞を、FGF9のみと、またはFGF2および/もしくはFGF20を伴うFGF9と接触させると、中間中胚葉(IM)に特徴的なマーカーを発現する細胞の集団へと、それらの細胞は分化する。中間中胚葉に特徴的なマーカーの非限定的な例には、PAX2、LHX1、およびOSR1が含まれる。

(iii)中間中胚葉(IM)のネフロン前駆体および尿管上皮前駆体への分化
適切には、後方原始線条細胞をFGF2、FGF9、および/またはFGF20と接触させた後に、結果として生じるIM細胞を、APEL分化培地のような血清を含まない適切な培地において、FGF9のみと、またはBMP7、RA、RAアンタゴニスト、FGF20、Wntアゴニスト、および/もしくはヘパリンの内の1種もしくは複数種と組み合わせたFGF9と接触させる。

適切には、FGF9は、約20ng～1μg/mLの濃度で存在する。好ましい態様において、FGF9は、約50～500ng/mL、より好ましくは約100～300ng/mL、または有利には約200ng/mLの濃度で存在する。典型的には、ヘパリンは、約0.1～10μg/mL、好ましくは約0.3～5μg/mL、0.5～2μg/mL、または有利には約1μg/mLの濃度で含まれる。

ある態様において、FGF20は、約20ng～1μg/mLの濃度で存在する。好ましい態様において、FGF20は、約50～500ng/mL、より好ましくは約100～300ng/mL、または有利には約200ng/mLの濃度で存在する。

ある態様において、FGF2は、約20ng～1μg/mLの濃度で存在する。好ましい態様において、FGF2は、約50～500ng/mL、より好ましくは約100～300ng/mL、または有利には約200ng/mLの濃度で存在する。

FGF20およびFGF2でFGF9を置き換えるか、またはこれらをFGF9に追加してよく、これらの作用物質は同様の生物活性を有していることが認識されると考えられる。

ある態様において、BMP7は、約25～75ng/mLの濃度で存在する。好ましい態様において、BMP7は、約35～60ng/mL、45～55ng/mL、または有利には約50ng/mLの濃度で存在する。

ある態様において、RAは、約10pM～1μMの濃度で存在する。好ましい態様において、RAは、約30pM～0.5μM、より好ましくは約50pM～0.2μM、または有利には約0.1μMの濃度で存在する。本発明に拘泥するものではないが、予備データから、RA濃度が高いほど、尿管上皮前駆細胞の比率の相対的増加が促進されること、およびRA濃度が低いほど、尿管上皮前駆細胞の比率の相対的減少が促進されることが示唆される。

ある態様において、AGN193109のようなRAアンタゴニストは、約50pM～10μMの濃度で存在する。好ましい態様において、AGN193109は、約0.01μM～5μM、より好ましくは約0.1μM～5μM、または有利には約1μMの濃度で存在する。本発明に拘泥するものではないが、予備データから、AGN193109濃度が高いほど、後腎間葉細胞の比率の相対的増加が促進されることが示唆される。

ある態様において、CHIR99021のようなWntアゴニストは、約0.1μM～10μM、好ましくは約0.2μM～5μM、またはより好ましくは約1～2μMの範囲の濃度で存在する。

本発明に拘泥するものではないが、Wntアゴニストは、IM細胞からのネフロン前駆細胞の発生の相対的増加を促進する。好ましくは、細胞を、FGF9のみと、あるいはBMP7、RA、Wntアゴニスト、RAアンタゴニスト、ならびに/またはFGF20および/もしくはFGF2、ならびにヘパリンの内の1種または複数種を伴うFGF9と少なくとも72時間、ただし360時間以下の間、接触させる。好ましくは、約160～220時間、またはより好ましくは約190～200時間、細胞を接触させる。

培地は、48～72時間毎に交換されてよい。

典型的には、本明細書において開示されるように、中間中胚葉細胞を、FGF9のみと、あるいはBMP7、RA、RAアンタゴニスト;Wntアゴニスト、ならびに/またはFGF20および/もしくはFGF2、ならびに好ましくはヘパリンの内の1種または複数種を伴うFGF9と接触させると、中間中胚葉細胞が後腎間葉細胞系統および尿管上皮細胞系統の細胞に分化する。後腎間葉系統は、最適にはFGF9およびヘパリンの存在下で(in)約72時間培養した後に生じるネフロン前駆細胞を含む。RA類似体もしくはRAアゴニストおよび/またはRAアンタゴニストの存在、非存在、および/または濃度を選択して、この方法によって生じる後腎間葉と比べた、この方法によって生じる尿管上皮の相対量を操作できることもまた、提唱される。先に説明したように、RAは、後腎間葉を犠牲にして尿管上皮の形成を促進するのに対し、AGN193109のようなRAアンタゴニストは、尿管上皮を犠牲にして後腎間葉の形成を促進する。CHIR99021のようなWntアゴニストもまた、尿管上皮を犠牲にして後腎間葉の存続および/または形成を促進し得る。

後腎間葉系統の細胞またはその細胞に特徴的または典型的なマーカーの非限定的な例には、それらに限定されるわけではないが、WT1、SIX1、SIX2、SALL1、GDNF、および/またはHOXD11が含まれる。

ネフロン前駆細胞に特徴的または典型的なマーカーの非限定的な例には、それらに限定されるわけではないが、WT1、SIX2、CITED1、PAX2、GDNF、SALL1、およびHOXD11が含まれる。

尿管上皮系統の細胞に特徴的または典型的なマーカーの非限定的な例には、それらに限定されるわけではないがHOXB7、GATA3、CALB1、E-カドヘリン、PAX2、および/またはcRETが含まれる。

WT1、SIX2、CITED1、PAX2、GDNF、SALL1、およびHOXD11の同時発現に基づくと、ネフロン前駆細胞は、hPSC細胞培養の開始によって方法を開始した後、11～15日目、または有利には14日目(11～15日の範囲)に最大限に生じる可能性が高い。

HOXB7、cRET、E-カドヘリン、およびPAX2の同時発現に基づくと、尿管上皮前駆細胞は、hPSC培養の開始によって方法を開始した後、少なくとも10日後、または有利には14日後に最大限に生じ得る。

方法の好ましい形態において、FGF9は、本明細書において説明する段階(ii)および(iii)の両方の少なくとも一部分の間、または始めから終わりまでずっと、存在する。より好ましくは、CHIR99021のようなWntアゴニストは、本明細書において説明する段階(i)の少なくとも一部分の間、存在する。

そのための特に好ましい方法は、以下の順次的な段階を含む:
(a)ヒト多能性幹(hPCS)細胞をCHIR99021と接触させて、hPSC細胞が後方原始線条細胞に分化するのを容易にする段階;
(b)後方原始線条細胞を、FGF9のみと、またはAGN193109のようなRAアンタゴニストを伴うFGF9と接触させて、後方原始線条細胞がIM細胞に分化するのを容易にする段階;ならびに
(c)IM細胞を、FGF9およびヘパリンのみと、またはAGN193109のようなRAアンタゴニストを伴うFGF9およびヘパリンと接触させ、それによって、IM細胞からネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞を生じさせる段階。

この好ましい形態によれば、合計で約18～20日の培養期間で、hES細胞の初期集団からの腎臓分化を促進することが可能である。

hPSCからの腎オルガノイドの迅速な作製
本発明の関連する局面は、より長い期間(最適には3～5日)、hPSCをWntアゴニストと接触させる段階を含む、完成形の中胚葉細胞を作製する方法を提供する。適切には、この局面の方法は、完成形の中胚葉細胞、ならびに頭側IMおよび尾側IMの両方を含み得るIM細胞の内の1つまたは複数を含む、中胚葉細胞集団を作製する。典型的には、Wntアゴニストを用いた培養期間が長いほど、より多くの尾側IMが生じ、より少ない頭側IMが存続する。

1つの態様において、方法は、中胚葉細胞を線維芽細胞増殖因子9(FGF9)ならびに/または線維芽細胞増殖因子20(FGF20)および/もしくは線維芽細胞増殖因子2(FGF2)と接触させる後続の段階をさらに含む。適切には、この段階は、尾側IMおよび頭側IMの分化を容易にする。適切には、尾側IMおよび頭側IMは次に、それぞれ、ネフロン前駆細胞および尿管上皮細胞に分化する。先に説明したように、RAまたは類似体もしくはアゴニストを含めると、尿管上皮前駆細胞の相対的発生が増加し得る。

別の態様において、中間中胚葉(IM)細胞を線維芽細胞増殖因子9(FGF9)ならびに/または線維芽細胞増殖因子20(FGF20)および/もしくは線維芽細胞増殖因子2(FGF2)と接触させた後、方法は、細胞を解離および再集合させる後続の段階をさらに含む。これは、空気と培地の境界に位置するフローティングフィルターを用いる培養において実施され得る。適切には、この段階は、ネフロン、支質、および血管系を含む腎オルガノイドの形成を容易にする。

別の態様において、(例えば、フローティングフィルター上での)培養のための集合体を形成させた後、方法は、続いてWntアゴニストを30～60分間添加することをさらに含む。適切なことには、この段階は、最大限のネフロンを含む集合した腎オルガノイドの作製を容易にする。

方法の好ましい目的は、オルガノイドまたは他の少なくとも部分的に組織化した腎臓構造体を形成する、分化したネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞の集合体(aggregated)を作製することであることが認識されると考えられる。好ましくは、正常な胚器官形成を示唆する、集合管(表現型的にはGATA3⁺ECAD⁺)、初期の遠位尿細管(表現型的にはGATA3^-LTL^-ECAD⁺)、初期の近位尿細管(表現型的にはLTL⁺ECAD^-)、および糸球体(表現型的にはWT1⁺)を含む、正常な発生中のネフロンの全分節の出現が、オルガノイド中であり得る。

1つの態様において、オルガノイドとして培養するための分化細胞の集合体の形成は、前述したように約7日間の培養において実現され得る。

Wntアゴニスト(例えばCHIR99021)の好ましい濃度は、約1～50mM、好ましくは約1～20μM、5～15μM、または有利には約8μMである。好ましくは、Wntアゴニストとの接触期間は約4日である。

適切には、FGF9は、約20ng～1μg/mLの濃度で存在する。好ましい態様において、FGF9は、約50～500ng/mL、より好ましくは約100～300ng/mL、または有利には約200ng/mLの濃度で存在する。好ましくは、それに続くFGF9/FGF20/FGF2との接触期間は、ヘパリンを約3日間含む。

好ましくは、CHIR99021のようなWntアゴニストの短時間適用(short pulse)を続いて追加するのは、FGF9/FGF20/FGF2およびヘパリンの存在下での培養の後に再集合した直後である。Wntアゴニスト(例えばCHIR99021)の好ましい濃度は、約1～15μM、好ましくは約2～10μM、または有利には約5μMである。短時間適用は、典型的には、0.5～2時間の間、例えば、約45分または1時間である。

腎オルガノイドのような、集合し少なくとも部分的に組織化した構造体の形成は、培養細胞間の物理的接触を維持または促進することによって補助され得る。この点に関して、Wntアゴニスト(例えばCHIR99021)の「短時間適用」を追加する前に細胞をペレットにすることが、オルガノイド形成の補助となり得る。

任意で、培養物は、レチノイン酸(RA)アンタゴニスト、RAもしくはRAアゴニスト、骨形態形成タンパク質7(BMP7)、および/またはヘパリンの内の1種または複数種をさらに含んでもよい。レチノイン酸(RA)アンタゴニスト、RAアゴニスト、骨形態形成タンパク質7(BMP7)、および/またはヘパリンの個々の濃度および効果は、前述したとおりであってよい。

血管新生の誘導
適切には、腎オルガノイドまたは集合体における少なくとも部分的な血管新生および/または血管前駆細胞の出現は、間葉細胞または間葉組織からの血管内皮または血管前駆体の発生を促進するかまたは方向付ける条件によって、容易になる。

適切には、前述の局面に従って作製された分化細胞の集合体および/またはオルガノイドは、少なくとも部分的な血管新生、特に糸球体構造体の血管新生、あるいは少なくとも血管内皮または他の血管細胞もしくは血管組織の前駆体の発生を容易にする条件下で培養されてよい。いくつかの態様において、血管新生は、血管内皮型の間葉細胞または間葉組織(vascular endothelium form mesenchyme cells or tissues)の発生を促進するかまたは方向付ける条件によって、容易になる。

1つの態様において、方法は、(ヒト多能性幹細胞から分化したような)血管内皮前駆体を、前述したような、または少なくとも部分的に分化したネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞の培養物に添加された、IM細胞と一緒に同時培養し、それによって、血管内皮のような血管細胞または血管組織を生じさせる段階を含んでよい。

別の態様において、方法は、培養の間、低い酸素分圧を含んでよい。典型的には、21％O₂が、標準的な組織培養インキュベーター中に存在する通常の酸素分圧である。本発明は、発生中の胚において経験される酸素分圧との等価性が高い可能性がある5～12％ O₂を企図する。これにより、後腎間葉がVEGFAを産生する能力が向上し、それによって、Flk1⁺血管内皮前駆体の形成および移動が誘導され得る。

前述の内容の観点から、BMP4、BMP7、アクチビンA、FGF2、FGF9、およびFGF20などのタンパク質作用物質への言及は、それらに限定されるわけではないが、ヒト、マウス、およびラットを含む任意の哺乳動物に由来する天然タンパク質または組み換えタンパク質もしくは化学合成タンパク質を包含するものとして理解されるべきである。さらに、これらのタンパク質は、当技術分野において周知であるような、化学修飾、グリコシル化、脂質化、ビオチンのような標識、およびエピトープタグまたは融合相手のような付加的アミノ酸配列を含んでもよい。典型的には、前述のタンパク質は、市販品を得ることができるか、かつ/またはごく普通の実験手順もしくは製造手順によって組み換えタンパク質もしくは化学合成タンパク質として調製することができる。

別の局面において、本発明は、本明細書において開示される方法に従って作製された、単離または精製されたネフロン前駆細胞、尿管上皮前駆細胞、および/または腎オルガノイドを提供する。

特定の態様において、ネフロンは、集合管(表現型的にはGATA3⁺ECAD⁺)、初期の遠位尿細管(表現型的にはGATA3^-LTL^-ECAD⁺)、初期の近位尿細管(表現型的にはLTL⁺ECAD^-)、および糸球体(表現型的にはWT1⁺)を含む、4つまたはそれ以上の構成要素に分節化する。適切には、樹状の集合管(collecting duct trees)がオルガノイドの底面で形成され、中央部で遠位尿細管および近位尿細管につながり、オルガノイドの上部には糸球体がある。

ネフロン前駆細胞および/または尿管上皮前駆細胞を、前述したように適切な培養期間の後に取得できること、およびいくつかの任意の態様において、表面マーカーの同時発現に基づいてさらに濃縮または精製できることが、認識されると考えられる。細胞の濃縮または精製は、それらに限定されるわけではないが、フローサイトメトリー細胞選別(例えばFACS)、磁性免疫ビーズ(例えばDynabeads(商標))による陽性細胞選択または陰性細胞選択、パニング、密度分離、または補体媒介による溶解などを含む、当技術分野において公知である任意の技術またはプロセスによって行ってよい。

腎臓の再生および移植
慢性腎臓疾患は、毎年3100万人のアメリカ人および170万人のオーストラリア人が発症する、重篤な医学的状態である。患者は、症状を示す前に腎臓機能の90％を失い、腎不全および透析または腎臓移植という結果になる場合がある。末期腎疾患に関するアメリカ合衆国のメディケア支出は、2010年に280億ドルと概算された。

したがって、本発明のある局面は、腎臓または腎臓細胞もしくは腎臓組織を作製する方法を提供し、該方法は、単離または精製されたネフロン前駆細胞および/または尿管上皮前駆細胞から腎臓または腎臓細胞もしくは腎臓組織を分化させ、それによって、腎臓または腎臓細胞もしくは腎臓組織を生じさせる段階を含む。さらに、本発明のこの局面は、間葉細胞または間葉組織からの血管内皮または血管前駆体の発生を促進するかまたは方向付ける条件下での、少なくとも部分的な血管新生および/または血管前駆細胞の発生も提供する。

本発明は、尿管上皮および後腎間葉の系統または区画の細胞を作製するための方法を提供する。好ましくは、これらの細胞は、同時に誘導され、インビボで互いの分化を方向付ける。これらの細胞は、尿管樹およびネフロン前駆体間葉を含む別個の管状上皮構造体に発達することができる。したがって、本発明に従って作製されたhPSC細胞由来の尿管上皮前駆細胞および/またはネフロン前駆細胞を方向付けて、尿管区画および腸間膜(mesenteric)間葉区画の両方から腎細胞に分化させ得ることが提唱される。適切な条件下で、ネフロン前駆細胞は、それらに限定されるわけではないが、連結部分、遠位曲尿細管(DCT)細胞、遠位直尿細管(DST)細胞、近位直尿細管(PST)分節1および2、PST細胞、足細胞、糸球体内皮細胞、上行するヘンレ係蹄、ならびに/または下行するヘンレ係蹄などのネフロン上皮を含む任意のネフロン分節(集合管以外)に分化する能力があり得る。

さらに、これらの細胞が「自己組織化」する能力は、それゆえ、腎臓の組織または器官の生物工学などを手段とする腎臓修復を容易にするために活用され得る。

この局面の方法の1つの態様が、単離または精製されたネフロン前駆細胞および/または尿管上皮前駆細胞をヒトに養子移入または養子移植し、それによって腎臓または腎臓細胞もしくは腎臓組織を生じさせる段階を含んでよいことが、認識されると考えられる。

この態様によれば、単離または精製されたネフロン前駆細胞および/または尿管上皮前駆細胞の腎臓または腎臓細胞もしくは腎臓組織への分化はインビボで起こる。

この局面の方法の別の態様は、単離または精製されたネフロン前駆細胞および/または尿管上皮前駆細胞をインビトロで腎臓または腎臓細胞もしくは腎臓組織、またはそれらの前駆体に少なくとも部分的に分化させる段階を含んでよい。適切には、インビトロで少なくとも部分的に分化させた細胞腎臓または腎臓細胞もしくは腎臓組織、またはそれらの前駆体が、ヒトに養子移入または養子移植される。

いずれかまたは両方の態様によれば、これらの腎臓、腎臓細胞、または腎臓組織は、腎臓、それらの細胞または組織の再生または修復を容易にし得るか、または寄与し得る。

1つの態様は、工学的に作られた(engineered)腎臓または人工腎臓を作製するための、オルガノイドまたはそれから得られる単離されたネフロン前駆体および/もしくは尿管上皮前駆体の使用を提供する。例えば、単離されたネフロン前駆体および/または尿管上皮前駆体を、脱細胞化したヒト腎臓もしくはその細胞外マトリックス(ECM)構成要素、ポリエステルフリース、または生分解性ポリマー足場などの足場内に組み入れ、それによって、再生された腎尿細管構造体を作製することができる。例として、このような方法は、(a)1種または複数種の分化した細胞型および/またはまたは中間の前駆細胞型をオルガノイドから単離する段階;ならびに(b)それら1種または複数種の分化した細胞型および/またはまたは中間の前駆細胞型を、脱細胞化した腎臓足場の中に送達する段階、の内の1つまたは複数を含んでよい。いくつかの態様において、腎臓足場に由来するECMは、1種または複数種の分化した細胞型および/またはまたは中間の前駆細胞型を播種またはバイオプリントし、それによって腎臓の足場またはマトリックスを再細胞化する場となる、(例えば、ECMのみから、またはヒドロゲルと一緒にECMから作製された)マトリックスとして使用することができる。

別の態様は、損傷した腎臓または罹病腎臓の修復に関係し得る。例として、方法は、(i)1種または複数種の分化した細胞型および/またはまたは中間の前駆細胞型をオルガノイドから単離する段階;(ii)それら1種または複数種の分化した細胞型および/またはまたは中間の前駆細胞型を、損傷した腎臓または罹病腎臓の中に送達し、それによって、罹病腎臓または損傷した腎臓の修復および/または再生を容易にする段階、の内の1つまたは複数を含んでよい。送達は、実質への注射によって損傷した腎臓または罹病腎臓中に直接的に行ってもよく、または血管経路を介してもよい。

本発明の別の態様は、腎臓透析を補助するか、または容易にするための装置における、単離されたネフロン前駆体および/または尿管上皮前駆体から分化させた腎臓細胞または腎臓組織の使用を提供する。例えば、バイオ人工腎臓は、透析と並行して使用するための「腎臓補助装置」を作るための反応器中に腎臓細胞またはそれらの前駆体を播種することによって、作製することができる。

本明細書において説明する単離されたネフロン前駆体および/または尿管上皮前駆体から分化させるか、または別の方法で得られた腎臓細胞または腎臓組織を用いる、「バイオプリントされた」腎臓、または他のネフロンを含む器官、オルガノイド、もしくは器官に似た構造体もまた、企図される。

したがって、本発明の1つの特定の局面は、腎臓構造体をバイオプリントする方法を提供し、該方法は、複数のhPSCまたは本明細書において開示される他の前駆細胞を付着させて、腎臓もしくはその構成要素の1つもしくは複数の機能的特徴を有しているか、または腎臓もしくはその構成要素の1つもしくは複数の機能的特徴を示すようになることができる、腎臓構造体を形成させる段階を含む。

本発明の別の特定の局面は、腎臓構造体をバイオプリントする方法を提供し、該方法は、本明細書において開示される複数のネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞を付着させて、腎臓もしくはその構成要素の1つもしくは複数の機能的特徴を有しているか、または腎臓もしくはその構成要素の1つもしくは複数の機能的特徴を示すようになることができる、腎臓構造体を形成させる段階を含む。

適切には、ネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞は、本明細書において開示される方法によって、hPSCから作製された。いくつかの態様において、方法は、少なくとも部分的な血管新生および/または血管前駆細胞を有しているか、または発達させることができる、バイオプリントされた腎臓構造体を作製する。

この特定の局面はまた、腎臓もしくはその構成要素の1つもしくは複数の機能的特徴を有しているか、または腎臓もしくはその構成要素の1つもしくは複数の機能的特徴を示すようになることができる、前述の方法によって作製された、バイオプリントされた腎臓構造体を提供する。いくつかの態様において、少なくとも部分的な血管新生および/または血管前駆細胞を有しているか、または発達させることができる、バイオプリントされた腎臓構造体。

適切には、バイオプリントされた腎臓構造体は、三次元の腎臓構造体である。

以下により詳細に説明するように、三次元の構造体は、複数のバイオプリントされた「層」または「アレイ」から構築または形成され得ることもまた、認識されると考えられる。

バイオプリントされた腎臓構造体の構成要素は、それらに限定されるわけではないが、糸球体、傍糸球体装置、間質組織、集合管、ボーマン嚢、近位および/または遠位の曲尿細管、血管系、例えば、細動脈、動脈、静脈、および/または毛細血管など腎臓の任意の構造的かつ/または機能的構成要素であってもよく、またはそれらを含んでもよい。

いくつかの態様において、バイオプリントされた腎臓または腎臓構成要素は、埋め込み可能であるか、または別の方法で宿主に養子移入することができる。

本明細書において使用される場合、「バイオプリンティング」とは、自動化または半自動化された、コンピューター援用の、三次元のプロトタイプ作製装置(例えばバイオプリンター)と相性のよい方法論による、細胞(例えば、細胞溶液、細胞を含有するゲル、細胞懸濁液、細胞濃縮物、多細胞集合体、オルガノイド、多細胞体など)の三次元の精密な付着を利用することを含み、包含する。この点に関しては、参照により本明細書に組み入れられ、適している可能性があるバイオプリンティング技術の非限定的な例を提供する、米国特許出願US20120116568、US20130164339、およびUS20140012407を参照されたい。

例として、いくつかの態様において、工学的に作られた埋め込み可能な腎オルガノイドの組織および/または器官の少なくとも1つの構成要素が、バイオプリントされ得る。別の態様において、これらの工学的に作られた埋め込み可能な組織および/または器官は、全体がバイオプリントされる。さらに別の態様において、バイオプリントされた構築物は、三次元送達装置(例えばバイオプリンター)によって、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞を含むゲルまたはペースト、細胞濃縮物、多細胞体(例えば、円柱、回転楕円体、リボン状のものなど)および生体適合性表面への閉じ込め(confinement)材料(例えば、ヒドロゲルおよび/または多孔膜から構成される)を含む、本明細書において開示される腎臓細胞の三次元の自動化されたコンピューター援用の付着に基づく迅速なプロトタイプ作製技術を利用する方法を用いて、作製される。本明細書において使用される場合、いくつかの態様において、「工学的に作られた」という用語は、腎臓組織および/または腎臓器官に関し、細胞、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞を含むゲルまたはペースト、細胞濃縮物、多細胞集合体、およびそれらの層が、コンピューターのスクリプトに従ってコンピューター援用装置(例えばバイオプリンター)によって三次元構造体を形成するように配置されることを意味する。別の態様において、コンピューターのスクリプトは、例えば、1つまたは複数のコンピュータープログラム、コンピューターアプリケーション、またはコンピューターモジュールである。さらに別の態様において、三次元組織構造体は、初期の形態形成における自己集合現象に似た、細胞または多細胞体のプリント後融合を通して形成する。

細胞、多細胞集合体、および/またはそれらの層を生体適合性の表面に整列させて三次元構造体を作製するためには、手作業で配置することを含むいくつかの方法が利用可能であるが、バイオプリンターのような自動化されたコンピューター援用の機械による配置が有利である。この技術を用いて細胞または多細胞体を送達する利点には、細胞または多細胞体を迅速に、正確に、かつ再現可能に配置して、細胞、多細胞集合体、および/またはそれらの層が計画または前もって決定された向きまたはパターンを示す、様々な組成の構築物を作製することが含まれる。利点にはまた、細胞損傷を最小限に抑えながら高い細胞密度を確実にすることが含まれる。いくつかの態様において、バイオプリンティングの方法は、連続的かつ/または実質的に連続的である。連続的バイオプリンティング法の非限定的な例は、バイオインクの貯蔵部に連結されている分注チップ(例えば、シリンジ、毛細管など)を介してバイオプリンターからバイオインクを分注することである。さらなる非限定的な態様において、連続的バイオプリンティング法は、繰り返しパターンの機能的単位にバイオインクを分注するものである。様々な態様において、繰り返しの機能的単位は、例えば、円、正方形、長方形、三角形、多角形、および不規則な形状を含む、任意の適切な形状を有している。別の態様において、バイオプリントされた機能単位の繰り返しパターンは、1つの層またはアレイを含み、複数の層またはアレイが、隣接して(例えば、積み重ねられて)バイオプリントされて、工学的に作られた組織または器官を形成する。様々な態様において、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、またはそれ以上の層またはアレイが、隣接して(例えば、積み重ねられて)バイオプリントされて、工学的に作られた腎臓組織または腎臓器官を形成する。

いくつかの態様において、バイオプリントされた機能的単位は、モザイク式のパターンで繰り返す。「モザイク式のパターン」とは、重なりも隙間もなく平面を埋める図からなる平面(a plane of figures)である。連続的かつ/またはモザイク式のバイオプリンティングの利点には、非限定的な例として、バイオプリントされた組織の高い生産性が含まれる。別の非限定的な例示的利点は、バイオプリンターを既に付着したバイオインク成分と位置合わせする必要をなくすことである。また、連続的バイオプリンティングにより、任意でシリンジメカニズムを用いて、バイオインクの大きな貯蔵部から大型組織をプリントすることも容易になる。

様々な態様において、連続的バイオプリンティングのための方法は、印刷物の高さ、ポンプの速度、自動装置(robot)の速度、またはそれらの組合せなどのパラメーターを、互いとは無関係にまたは互いに相関的に、最適化および/またはバランス合わせする段階を伴う。1つの例において、付着のためのバイオプリンターのヘッドの速度は3mm/秒であり、最初の層に対する分注高さは0.5mmであり、その後の各層に対して、分注高さを0.4mm高くした。いくつかの態様において、分注高さは、バイオプリンターの分注チップの直径にほぼ等しい。限定されるわけではないが、分注距離が適切かつ/または最適であると、材料が平坦になることも、分注針に付着することもなくなる。様々な態様において、バイオプリンターの分注チップの内径は、約20μm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1000μm、またはそれ以上であり、それらにおける増分(increments)も含まれる。様々な態様において、バイオプリンターのバイオインク貯蔵部の体積は、約0.5cm³、1cm³、2cm³、3cm³、4cm³、5cm³、6cm³、7cm³、8cm³、9cm³、10cm³、15cm³、20cm³、25cm³、30cm³、35cm³、40cm³、45cm³、50cm³、55cm³、60cm³、65cm³、70cm³、75cm³、80cm³、85cm³、90cm³、95cm³、100cm³、またはそれ以上であり、それらにおける増分(increments)も含まれる。いくつかの態様において、ポンプ速度は、システムの残留圧力の高まりが小さい場合、適切かつ/または最適である。いくつかの態様において、好都合なポンプ速度は、貯蔵部と分注針の横断面積の比に応じて変わり、比が大きいほど、遅いポンプ速度が必要となる。いくつかの態様において、適切かつ/または最適な印刷速度を用いると、材料の機械的完全性に影響を及ぼさずに均質な線を付着させることが可能になる。

ほんの一例として、OrganovoはInvetechと提携して、ヒドロゲル足場を用いて所望の向きにヒト細胞を配置してヒト器官を再現する器官プリンティング機を開発した。本明細書において説明する単離されたネフロン前駆体および/または尿管上皮前駆体から分化させるか、または別の方法で得た、腎臓細胞または腎臓組織を、前述のOrganovo機のような機械と共に用いて、「バイオプリントされた」ヒト腎臓オルガノイドまたは腎臓を作り出すことができる。

アレイは、複数の積み重ねられたアレイ、好ましくは、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、もしくは15個、またはそれ以上の積み重ねられたアレイを含んでよい。

アレイは、モザイク式のパターンで積み重ねられてよい。

本発明の関連局面は、前述の局面のアレイを成熟させることによって得られる腎臓オルガノイドを提供する。

本明細書において説明する単離されたネフロン前駆体および/または尿管上皮前駆体、オルガノイド、ならびにバイオプリントされた腎臓構造体を方向付けて分化させると、細胞療法のための精製された、分化させられた腎細胞サブタイプ、オルガノイド、および/またはバイオプリントされた腎臓構造体の潜在的供給源となり得ることもまた、認識されると考えられる。

例えば、本明細書において説明する単離されたネフロン前駆体および/または尿管上皮前駆体は、いくつかの遺伝学的に受け継がれた腎臓病態において遺伝子修復後に腎細胞または腎組織を発生させるのに有用であり得る。例えば、アルポート症候群(COL4A3変異)および多発性嚢胞腎疾患(PKD1、PKD2など)を含む単一遺伝子腎障害の修復は、遺伝子修復後に、本明細書において説明する単離されたネフロン前駆体および/または尿管上皮前駆体から腎組織を再生することによって補助され得るか、または容易にされ得る。

特定の態様において、遺伝的腎疾患の患者に由来するか、それから得られるか、または生じるiPSC株は、インビトロで遺伝子変異を修復するために使用され得る。このような細胞は、本発明の方法に従って使用され得、その後、自家細胞療法のために患者に投与され得る。

腎毒性のスクリーニング
本明細書において説明する単離されたネフロン前駆体および/または尿管上皮前駆体を方向付けて分化させることにより、腎毒性スクリーニングのための精製された、分化させられた腎細胞、バイオプリントされた腎臓構造体、腎オルガノイド、アレイ、または腎臓組織サブタイプの潜在的供給源を提供し得ることもまた、認識されると考えられる。

薬物療法および細胞を用いる療法を含む、疾患の予防を目指す治療処置の開発は、インビトロの薬物試験に初代ヒト腎臓細胞を利用できる可能性がないため、困難になっている。

したがって、本発明の別の局面は、1種または複数種の化合物の腎毒性を判定する方法を提供し、該方法は、1種または複数種の化合物を、オルガノイドとしての、もしくは単離および精製後のいずれかの、本明細書において説明するネフロン前駆細胞および/もしくは尿管上皮前駆細胞、またはそれらから分化させるかもしくは別の方法で得られた腎臓細胞もしくは腎臓組織と接触させ、それによって、それら1種または複数種の化合物が腎毒性であるか否かを判定する段階を含む。

好ましくは、方法は、オルガノイドまたは単離もしくは精製されたネフロン前駆細胞、またはネフロン前駆細胞に由来する腎臓細胞もしくは腎臓組織を用いて実施される。

多くの有用な薬物は、例えば、尿細管への直接的な作用(例えば、アミノグリコシド系抗生物質、シスプラチン、造影剤、NSAID、ACE阻害剤)、間質性腎炎(例えば、βラクタム系抗生物質、リチウム、CsA、フェニトインのような抗てんかん薬)、または糸球体腎炎などによる、腎毒性の副作用を有している。したがって、本明細書において説明する単離または精製されたネフロン前駆細胞から分化させるかまたは別の方法で得られた、輪郭のはっきりした(defined)特殊な腎臓細胞型および腎臓組織型を用いて、新薬または既存薬を試験することが有利である可能性がある。前述の「バイオプリントされた」腎臓またはバイオプリントされた腎臓オルガノイドもまた、腎毒性スクリーニングに応用可能であり得る。

腎毒性は、それらに限定されるわけではないが、Qiagen社のヒト腎毒性RT²Profiler(商標)PCRアレイまたはEurofins社のハイコンテント解析(HCA)マルチプレックス腎毒性アッセイ法などにより、クレアチニンクリアランスの減少またはバイオマーカー発現を含む、インビトロでの腎細胞機能についての任意の適切な試験によって評価または測定することができる。

実施例においてより詳細に説明するように、シスプラチンは、腎臓において近位尿細管細胞のカスパーゼを介した急性アポトーシスを誘導する腎毒性物質であり、腎オルガノイドをシスプラチンで処置すると、成熟した近位尿細管細胞の特異的な急性アポトーシスを誘導したのに対し、未成熟な細胞は、アポトーシスを起こさなかった。

本発明を容易に理解し実施することができるように、以下の非限定的な実施例に言及する。

本発明につながる研究において、中間中胚葉(IM)からのネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆体の同期的な同時分化を促進するように調整された特殊なインビトロ培養条件を特定した。より具体的には、FGF9およびヘパリンは、それらのみで、または骨形態形成タンパク質7(BMP7)、レチノイン酸(RA)、RAアンタゴニスト;Wntアゴニスト;ならびに/もしくはFGF20およびヘパリンを含む1種もしくは複数種の作用物質との組合せで、中間中胚葉がネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆体に分化するのを容易にすることができる。これに加えて、インビトロ培養方法は、後方原始線条期、IM期、および後腎間葉期を経てhPSCを分化させてネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞を生じさせるためのシステムを提供する。RA、RAアンタゴニスト、および/またはWntアゴニストなどある種の分子の存在または非存在を操作して、尿管上皮前駆体に対してネフロン前駆細胞の発生を優先的に促進することが可能であり、逆もまた同様である。後部PSは、IMのような中胚葉の前駆体集団であり、Wntアゴニスト(例えばCHIR99021)を用いてhPSCから誘導される。IMは、次の2種の重要な腎臓前駆体集団に分化する:集合管の前駆体である尿管上皮(UE)およびネフロンの前駆体である後腎間葉(MM)。前部IMはUEを生じ、後部IMはMMに発達する。本明細書において、本発明者らは、慎重に決定した期間、CHIR99021を使用することによる、同時に前部IMおよび後部IMの両方を誘導するための方法を提示する。この同時誘導により、ネフロン、間質(interstitia)、および内皮を含む予想される腎臓構成要素すべてを含む腎臓オルガノイドがうまく生じる。本発明者らはまた、合成の強力な汎用的レチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストAGN193109のようなRAシグナル伝達の阻害剤を添加すると、後腎間葉形成が促進されるであろうことも提唱する。

実施例1
材料および方法
これらの方法において言及する試薬の供給業者の非限定的な例を表1に提供する。
培地は、以下のものである:
・ゼラチン溶液:PBSに溶かした0.1％ゼラチン。次いで、この溶液をオートクレーブする。
・FDMEM:89％高グルコースDMEM、10％ウシ胎仔血清、1％GlutaMAXサプリメント、0.5％ペニシリン/ストレプトマイシン。
・KSR培地:77.8％DMEM/F-12、20％ノックアウト血清代替品、1％NEAA、1％GlutaMAX、0.5％ペニシリン/ストレプトマイシン、0.2％ 2-メルカプトエタノール(55mM)。次いで、培地をステリカップ-GPによってろ過する。
・MEF馴化KSR培地:T175フラスコ中の1000万個のマウス胚線維芽細胞細胞にKSR培地40mLを1日供給する。培地を翌日回収し、さらに40mLのKSR培地を供給する。これを6回繰り返した後、回収し集めた培地をステリカップ-GPによってろ過する。
・APEL:1瓶のSTEMdiff APEL(100mL)に0.5mLの抗生物質-抗真菌物質(Antibiotic-Antimycotic)を追加する。

その他の試薬、方法、およびPCRプライマーなどについては、文書全体が参照により本明細書に組み入れられる国際公開WO2014/197934およびTakasato, M. et al., 2014,. Nat. Cell Biol. 16, 118-26も参照されたい。

シードフィーダー(8日前)
25cm²組織培養フラスコを0.1％ゼラチン溶液3mLで被覆する。
氷の小粒(ice pellet)が残存する程度まで37℃でバイアルを温めることによって、有糸分裂を不活化したマウス胚線維芽細胞(MEF)の凍結バイアルを解凍する。温めたFDMEM培地5mLを一滴ずつバイアルに加え、穏やかに混合する。15mL容チューブに回収し、1,500rpmで3分間、遠心分離する。
上清を取り除き、MEFをFDMEM中に再懸濁する。FDMEMを入れたフラスコに12,000細胞/cm²で播種し、37℃のCO₂インキュベーター中で一晩インキュベートする。

hESC/iPSCの解凍(7日前)
氷の小粒が残存する程度まで37℃でバイアルを温めることによって、iPSC/hESCの凍結バイアルを解凍して、有糸分裂を不活化したMEFを含む準備しておいた25cm²組織培養フラスコに加える(onto)。温めたKSR培地(付属書類Aを参照されたい)5mLを一滴ずつバイアルに加え、穏やかに混合する。15mL容チューブに回収し、1,500rpmで3分間、遠心分離する。
25cm²組織培養フラスコ1つにつきKSR培地5mLを調製する。10ng/mLのbFGFをKSR培地に添加する。
上清を取り除き、10ng/mL bFGFを含むKSR培地にiPSC/hESCを再懸濁する。フラスコに播種し、37℃のCO₂インキュベーター中で3日間インキュベートする。
毎日、使用済みKSR培地を吸引し、10ng/mL bFGFを含む新鮮なKSR培地5mLで補充する。

hESC/iPSCの解離およびマトリゲル順応(3日前)
マトリゲル被覆:
15mL容チューブ中に冷たいDMEM/F12基本培地3mLを分注する。
hESC最適化マトリゲル25uLをDMEM/F12に添加する。十分に混合し、25cm²組織培養フラスコに移す。(*マトリゲルは温めると固化するため、氷上で扱うこと)。
フラスコを少なくとも30分間室温で保って、マトリゲルで表面を被覆させる。
MEF馴化KSR培地5mLを調製し(付属書類Bを参照されたい)、10ng/mL bFGFを培地に添加する。

細胞の解離:
(*最良の結果を得るためには、細胞は約80～90％コンフルエントであることが望ましい。細胞がコンフルエントではない場合、もう1日インキュベーションするか、またはより低い分割比で行う)。
コンフルエントな25cm²フラスコを3mLのPBSで2回洗浄する。
TrypLE Select 2mLを細胞に添加し、37℃で3分間インキュベートする。
DMEM/F12基本培地5mLを細胞にピペットで加え、混合し、細胞がプラスチック表面から持ち上がるように徹底する。
細胞懸濁液を15mL容チューブに分割比1:3で回収し、1,500rpmで3分間、遠心分離する。

マトリゲルで被覆したフラスコへの細胞播種:
上清を取り除き、調製しておいた馴化KSR培地5mLを細胞に添加する。穏やかに混合する。
準備しておいた組織培養フラスコから、マトリゲルを含むDMEM/F12を吸引し、細胞を播種する。
37℃のCO₂インキュベーター中で終夜、2日間インキュベートする。
毎日、使用済み馴化KSR培地を吸引し、10ng/mL bFGFを含む新鮮な馴化KSR培地5mLで補充する。

分化用の細胞播種(1日前)
25cm²フラスコを3mLのPBSで2回洗浄する。TrypLE Select 2mLを細胞に添加し、37℃で3分間インキュベートする。
DMEM/F12基本培地5mLを細胞にピペットで加え、混合し、細胞がプラスチック表面から持ち上がるように徹底する。
15mL容チューブに細胞懸濁液を回収する。計数する。
所望の細胞数を計算して、ウェル当たり細胞4,000個(細胞12,500個/cm²)を達成する。
15mL容チューブに所望の細胞数を分取する。1,500rpmで3分間、遠心分離する。
10ng/mL bFGFを含む馴化KSRをウェル1つにつき50uL入れ、その中に細胞を再懸濁する。96ウェルのガラス底プレートに細胞を播種し、37℃で一晩インキュベートする。

分化段階1(0日目)
新しく開けたAPELの瓶に、抗生物質-抗真菌物質(Antibiotic-Antimycotic)(100倍)を1:100の割合で加える。
APELに溶かした8μM CHIRを調製する。
96ウェルプレートから馴化KSRを吸引する。
8μM CHIRを含むAPEL 100μLを細胞に添加する。
37℃で4日間インキュベートし、2日毎に培地を新しくした。

分化段階2(4日目)
APELに溶かした200ng/mL FGF9+1μg/mLヘパリンを調製する。
CHIRを含む使用済みAPELを96ウェルプレートから吸引する。
200ng/mL FGF9+1μg/mLヘパリンを含むAPEL 100μLを細胞に添加する。
37℃で2日間インキュベートし、6日目に200ng/mL FGF9+1μg/mLヘパリンを含む新しいAPELを培地に補給した。

3Dオルガノイド培養(7日目)
96ウェルプレートにおいて様々な条件の培養C32 IPS細胞を得る。
培地を吸引し、滅菌済みPBSでさっと洗浄する。
PBSを吸引する。
トリプシンEDTA(0.25％)50μLを各ウェルに添加する。
37℃インキュベーター中に最長3分間置いて、細胞を表面から持ち上がらせる。
顕微鏡下で観察して、全細胞がガラス(96ウェル)表面から持ち上がったことを確かめる。細胞が依然として表面に付着している場合、細胞にトリプシンを穏やかにピペットで加え、インキュベーターに戻してさらに2分間置く。
100μLのDMEM+10％FBS+1％P/Sによってトリプシンを無効にする。
培養物全体を15mL容ファルコンチューブに分取する。
速度1500rpmで5分間、細胞を遠心分離する。
細胞ペレットだけが残るまで、培地を吸引で取り除く。
3mLのCHIRで細胞を再懸濁する。
細胞懸濁液10μLを取り出し、血球計算器を用いて細胞計数を実施する。
各3Dペレットオルガノイドは、約5×10⁵個の細胞を有していると考えられる。必要量の細胞懸濁液を15mL容ファルコンチューブに分取する。
2000RPMで2分間、チューブを遠心分離する。
1.2mLのAPEL＋5μM CHIRを、6ウェルTranswellポリステル(polyster)メンブレン細胞培養プレートに分注する。
P1000ピペットを使用して、APELで溶液中のペレットをゆっくりと取り外す。
P1000の口径の広いチップを用いて、このペレットを持ち上げる。
培地の持ち越しが最小限であるtranswellフィルター上に、ペレットを注意深く置く。
細胞培養インキュベーター中に1時間置く。
1.2mLのAPEL+200ng/mL FGF9+1μg/mLヘパリンをCorning Costar6ウェルプレート中に分注する。
APEL+5μM CHIR中で1時間培養したフィルターを取り外して、APEL+200ng/mL FGF9+1μg/mLヘパリンのプレートに移し、5日間培養する。(2日毎に培地交換)
5日後、フィルターを取り外し、1.2mlの新鮮なAPELを入れた新しく準備したCorning Costar6ウェルプレート中に置く。
APELのみの培地中でオルガノイドをさらに6日間培養する。(2日毎に培地交換)

3Dオルガノイド免疫蛍光法(18日目)
6日間のオルガノイド培養後、1％パラホルムアルデヒドを用いて4℃で20分間、ペレットを固定する。
パラホルムアルデヒドを除去し、PBSで3回洗浄する。
固定し洗浄した後、免疫蛍光法による染色前に最長1週間、4℃でオルガノイドを保存することができる。
約150uLのブロッキング緩衝液(10％ロバ血清/0.3％トリトン-x/PBS)をMatTekガラス底シャーレに分注する。
注意深くフィルターからオルガノイドを切り離し、フィルターをブロッキング緩衝液中に浸す。
オルガノイドを2～3時間ブロックする。
ブロッキング緩衝液に溶かした、選択した一次抗体を調製する。
列挙した抗体の大半は、1:300の希釈率を使用する。
MatTekシャーレからブロッキング緩衝液を吸引除去し、150μLのブロッキング緩衝液+一次抗体をMatTekシャーレに分注する。
オルガノイドを一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートする。
シャーレから一次抗体を吸引除去し、PBTXで6回、各10分洗浄する。
PBTX(0.1％トリトン-X/PBS)に溶かした、選択した二次抗体(1:400希釈)を調製する。
オルガノイドを二次抗体の存在下で(in)4時間インキュベートする。
二次抗体を除去し、PBSに溶かしたDAPI(1:1000希釈)と共に1時間インキュベートする。
PBSで3回、各10分、洗浄する。
画像化の準備が整う。

結果
図1に示すように、集合管(ECAD⁺,GATA3⁺、PAX2⁺)を選択するためには、初期に短い日数(2～3日)Wntアゴニストを用い、かつ/またはその後に、レチノイン酸シグナル伝達を活性化すると共にFGF9と培養するのが最適である。ネフロン形成後腎間葉(WT1⁺HOXD11⁺ECAD^-)を選択し、初期ネフロンのマーカーを発現する上皮構造体を生じさせるためには、初期に、より長い日数(3～5日)Wntアゴニストを用い、かつ/またはその後に、レチノイン酸シグナル伝達を阻害すると共にFGF9と培養するのが最適である。

本発明者らは、本明細書において開示する方法を用いてヒト多能性幹細胞の集合によって形成させたオルガノイドが、正常な腎臓器官形成を示唆する以下の特徴を示すという証拠を今や有している。図2に示すように、Meis1⁺支質集団の存在が、形成中のネフロンの間にあることが示されている。この集団は、後腎間葉から生じることが公知であり、胚性腎臓の発生中ネフロンの間に存在し、最終器官の血管周囲部分(perivasculature)の形成に寄与することが示されている。図3において、CD31⁺血管前駆体が存在している。本発明者らは、CD31によって評価される内皮の証拠を認識しているが、CD31は成熟内皮のマーカーであり、本発明者らは、今のところまだ、初期の内皮前駆体が糸球体への活発な侵入を示して機能的ろ過装置を形成するのを確認していない。図4および図5は、正常な胚器官形成を示唆する、互いに連結している集合管(GATA3⁺PAX2⁺ECAD⁺)、遠位尿細管(ECAD⁺GATA3^-LTL^-)、近位尿細管(LTL⁺AQP1⁺)、および糸球体(WT1⁺NPHS1⁺SYNPO⁺)を含む、正常な発生中のネフロンの全分節の存在を示している。

いくつかのパラメーターを変化させることにより、全体的な大きさ、複雑さ、成熟度、およびヒト多能性幹細胞から形成させたオルガノイド内に存在するネフロンの数が改善した。

これらには、7日間の誘導後に培養用の分化細胞の集合体をオルガノイドとして形成させることが含まれる。当初は、これらは、14日または18日間の事前培養後に形成できることが示された。今では、本発明者らは、7日後にオルガノイド形成を確実に実現でき、これは、8μM CHIRの存在下で4日間培養し、それに続いて、前述した濃度範囲のAGN(レチノイン阻害剤)、BMP7、少量のCHIR、またはRAを伴うまたは伴わないFGF9の存在下で3日間培養することを含む。図6に示すように、集合体の形成は、再集合直後に多量のCHIR(5μM)の45分の短時間適用を追加し、それに続いて、前述した濃度範囲のAGN(レチノイン阻害剤)、BMP7、少量のCHIR、またはRAを伴うまたは伴わないFGF9の存在下で培養することによって、促進された。

血管が新生した糸球体の形成は、腎臓機能にとって不可欠である。このような糸球体の血管系がインビトロでさえ形成できるという証拠は、腎臓モデルとしてのオルガノイドの信頼性を顕著に高めるであろう。

1つのアプローチでは、Orlova³¹のもののようなプロトコールを用いて、腎臓に分化させられるヒト多能性幹細胞を、血管内皮前駆体に分化させられるヒト多能性幹細胞と組み合わせる。

別のアプローチでは、分化の進行中に酸素分圧を21％O₂(標準的な組織培養インキュベーター中に存在する通常の酸素分圧)から5～12％O₂(発生中の胚において経験される酸素分圧との等価性が高い)に減少させる。これにより、後腎間葉がVEGFAを産生する能力がかなり向上し、Flk1+血管内皮前駆体の形成および移動が誘導され得ると本発明者らは予想している。

実施例2
細胞培養および分化
提示する実験はいずれも、エピソームリプログラミング²⁸を用いて作製された以前に説明されている野生型ヒトiPSC株CRL1502(クローン番号C32)を使用した。以前に説明したように、未分化のヒトiPSCを、ヒトES細胞(hES)培地と共にフィーダー層としてのマウス胚線維芽細胞(MEF)(Millipore)上で維持した¹。細胞は本物であることを確認し、マイコプラズマ感染について試験した²⁸。マトリゲルで被覆した(Millipore)培養皿にヒトiPSCを播種し、60～100％コンフルエントに達するまで、MEF馴化hES培地(MEF-CM)中で培養した。次いで、MEF-CMを入れたマトリゲル被覆に、5,000細胞/cm²で細胞を再び播種した。翌日、細胞は40～50％のコンフルエントに達した。抗生物質-抗真菌物質(Antibiotic-Antimycotic)(Life Technologies)を追加したAPEL基本培地(STEMCELL Technologies)に溶かした8μM CHIR99021で2～5日間、続いて、FGF9(200ng mL^-1)およびヘパリン(1μg mL^-1)でさらに5～2日間、2日毎に培地を交換しながら、細胞を処理した。7日目に、細胞を回収し、トリプシンまたはTrypLE Select(Life Technologies)を用いて単細胞に解離させた。400gで2分間、細胞(0.5×10⁶個)を遠心沈殿してペレットを形成させ、次いで、Transwellの0.4μm細孔のポリエステルメンブレン(番号CLS3450、Corning)上に移した。APELに溶かした5μM CHIR99021でペレットを1時間処理し、次いで、FGF9(200ng mL^-1)およびヘパリン(1μg mL^-1)と共に5日間、続いて、APEL基本培地中でさらに6～13日間、1週間に3回培地を交換しながら、培養した。培地は、メンブレンより上に来るべきではない(exceed above)。単層培養物において分化させるために、CHIR99021による誘導後の細胞をFGF9(200ng mL^-1)およびヘパリン(1μg mL^-1)で10日間、続いて、APEL基本培地でさらに6日間、処理した。一部の実験では、RA(0.1μM)またはAGN193109(5μM)をFGF9培地に添加した。腎臓オルガノイドの作製を説明する段階的プロトコールは、実施例1で提供した。

免疫組織化学
単層細胞に対して、以前に説明したようにして抗体染色を実施した¹。腎臓オルガノイドに対して、PBS中2％パラホルムアルデヒドを用いて4℃で20分間、オルガノイドを固定し、続いて、PBSで3回洗浄した。次いで、室温で2～3時間、10％ロバ血清、0.3％トリトンX/PBSを用いてオルガノイドをブロックし、4℃で一晩、一次抗体と共にインキュベートした。0.1％トリトンX/PBSを用いて5回洗浄した後、室温で4時間、二次抗体をインキュベートした。次の抗体および希釈率を使用した:ウサギ抗PAX2(1:300、番号71-6,000、Zymed Laboratories)、ヤギ抗SIX1(1:300、番号sc-9709、Santa Cruz Biotechnology)、ウサギ抗SIX2(1:300、番号11562-1-AP、Proteintech)、マウス抗ECAD(1:300、番号610181、BD Biosciences)、ウサギ抗WT1(1:100、番号sc-192、Santa Cruz Biotechnology)、マウス抗HOXD11(1:300、番号SAB1403944、Sigma-Aldrich)、ヤギ抗GATA3(1:300、AF2605、R&D Systems)、ウサギ抗JAG1(1:300、番号ab7771、Abcam)、ヤギ抗キュビリン(1:150、番号sc-20607、Santa Cruz Biotechnology)、ヒツジ抗NPHS1(1:300、AF4269、R&D Systems)、LTL-ビオチン結合(1:300、B-1325、Vector Laboratories)、DBA-ビオチン結合(1:300、B-1035、Vector Laboratories)、マウス抗KRT8(1:300、番号TROMA、DSHB)、マウス抗CD31(1:300、番号555444、BD Pharmingen)、ウサギ抗KDR(1:300、番号2479、Cell Signaling Technology)、ヤギ抗SOX17(1:300、番号AF1924、R&D Systems)、ウサギ抗NG2(1:300、番号AB5320、Merck Millipore)、ウサギ抗SMA(1:300、番号ab15267、Abcam)、マウス抗PDGFRA(1:200、番号556001、BD Pharmingen)、ウサギ抗ラミニン(1:300、番号L9393、Sigma-Aldrich)、ウサギ抗UMOD(1:300、番号BT-590、Biomedical Technologies)、マウス抗MEIS1(1:300、番号ATM39795、activemotif)、ヤギ抗FOXD1(1:200、番号sc-47585、Santa Cruz Biotechnology)、およびウサギ抗切断型CASP3(1:300、番号9661、Cell Signaling Technology)。画像は、Nikon Ti-U顕微鏡またはZeiss LSM 780共焦点顕微鏡を用いて撮影した。免疫蛍光法解析はすべて、3回より多く繰り返すのに成功した。代表的な画像を示している。

電子顕微鏡検査
以下の方法を用いて、電子顕微鏡検査用にオルガノイドを加工した。増殖培地と等しい体積量の、2×PBSに溶かした5％グルタルアルデヒド溶液を、オルガノイド培養皿に直接添加し、減圧下に5分間置いた。小さな塊(約2×2mm)に切り分けることによってオルガノイドの大きさを小さくし、電力80WのPelco Biowave(Ted Pella In, Redding, CA)において、再び減圧下で、新鮮な固定液2.5％中で6分間、放射線照射した。次いで、0.1Mカコジル酸緩衝液中で4回、各2分間、試料を洗浄した。次いで、0.1Mカコジル酸緩衝液に溶かしたフェリシアン化カリウム(3％)および四酸化オスミウム(2％)を含む溶液に室温で30分間、試料を浸した。蒸留水中での6回、各3分間の洗浄後、次いで、組織の塊をチオカルボヒドラジド(1％)を含むろ過した溶液中、室温で30分間、インキュベートした。続いて蒸留水中で洗浄(6×2分間)した後、試料を四酸化オスミウム水溶液(2％)中で30分間インキュベートし、次いで蒸留水に入れ(in)(6×2分間)、1％酢酸ウラニル水溶液中で、4℃で30分間、インキュベートした。蒸留水でさらに洗浄した後(2×2分間)、新しく調製しろ過したアスパラギン酸中0.06％硝酸鉛の溶液(pH5.5)を60℃まで温めてシャーレに加え、60℃で20分間、さらにインキュベートした後、室温にて蒸留水中ですすいだ(6×3分間)。Pelco Biowaveにおいて、250ワットで40秒間、30％、50％、70％、90％の各エタノール溶液および無水エタノール中で、組織の塊を2回、脱水した。Epon LX112樹脂を用いて、250ワット、減圧下のPelco Biowave中で、3分間、25％、50％、および75％の樹脂:無水エタノールでの浸潤で組織を包埋し、100％樹脂(2回)で仕上げた後、60℃で12時間、最終的な包埋/ブロッキングおよび硬化を行った。

qRT-PCR解析
Purelink RNAミニキット(Life Technologies)を用いて、細胞から全RNAを抽出し、Super Script III逆転写酵素(Life Technologies)を用いて、100ngより多い全RNAからcDNAを合成した。GoTaq qPCRマスターミックス(Promega)を用いて、Roche LightCycler 96リアルタイムPCR機により、qRT-PCR解析を実施した。絶対データはすべて、最初にGAPDHに対して標準化し、次いで、対照試料に対して標準化した(δ-δ-Ct法)。qRT-PCRのために使用したプライマーの配列は、表2に列挙したとおりである。

KeyGenesを用いる、次世代のRNAシークエンシングおよび比較的解析
Illumina NextSeq500(NextSeqコントロールソフトウェアv1.2/リアルタイム解析(Real Time Analysis)v2.1)プラットフォームを用いて、シークエンシングを実施した。標準的なNextSeq500プロトコールに従ってライブラリープールを希釈し変性させ、75サイクルNextSeq500高出力試薬キット(カタログ番号FC-404-1005)を用いてシークエンシングを実施して、76bpシングルエンドリードを生成した。STAR²⁹を用いて、参照ヒトゲノム(hg19)に対してリードをマッピングし、HTSeq pythonパッケージのhtseq-countを用いてUCSCアノテーションにおける各遺伝子のリードカウントを得た(http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/index.html)。一意的にマッピングされたリードの数は、試料1つ当たり18810634～36706805個の範囲であった。DESeq2パッケージ³⁰を用いて、標準化したリードカウントを計算した。

KeyGenesを用いて、腎臓を含む様々な第1三半期のヒト器官に対して、0日目、3日目、11日目、18日目の腎臓オルガノイドのアイデンティティスコアを生成した(GSE66302)¹⁵。0日目、3日目、11日目、18日目の腎臓オルガノイドならびに第1三半期および第2三半期の21種のヒト胎児器官の階層的クラスタリングを示す樹状図(図13)(GSE66302)は、KeyGenes(www.keygenes.nl;表3)によって決定された85種の分類指標遺伝子の発現レベルのピアソン相関に基づいた。これらの分類指標遺伝子は、ヒト胎児データの上位500位の最も差次的に発現された遺伝子を用いて、ただしこのデータセットに由来する胚体外組織を含めずに、KeyGenesによって算出した。

近位尿細管の機能解析
デキストラン取込みアッセイ法のために、17日目のオルガノイドを、10μg mL^-1の10,000MWデキストラン(Alexa488結合)(D-22910、Life Technologies)と共に24時間培養した。透過処理を行わずに、オルガノイドを固定しLTLによって染色した。腎毒性アッセイ法のために、17日目のオルガノイドを0、5、20、または100μMのシスプラチン(Sigma-Aldrich)と共に24時間培養した。実験1回につき2つまたは3つの代表的領域において、近位尿細管全体に対するアポトーシス性近位尿細管の比をImageJを用いて手作業で計数した。合計で、5回の独立した実験(n=5)。画像は、Zeiss LSM 780共焦点顕微鏡を用いて撮影した。

結果および考察
本発明者らは、IMの形成にFGF9またはFGF2が必要であることを以前にインビトロで実証した¹。したがって、インビボにおいて、本発明者らは、原始線条期から間もなくFGF9およびRAに曝露された初期の移動性PSM細胞からUEが形成し、一方、移動するのに遅れ、その結果、Wntシグナル伝達により長く曝露された細胞は、MMを生じるはずであると仮定した¹³(図7a)。このことを確認するために、実施例1で示したデータに加えて、本発明者らは、FGF9添加前の初期のWntシグナル伝達(CHIR99201)の期間を変更し(図7b)、qPCRによってAIおよびPIのマーカーをモニターした。7日目の時点で、CHIR99021の期間が短い場合、AIマーカーであるLHX1およびGATA3が誘導されたのに対し、CHIR99021の日数が長い場合、PIマーカーであるHOXD11およびEYA1が増加していた。予測されたとおり、CHIR99021の存在下での長い日数の後、PSMマーカーであるTBX6およびTが長く発現されたことから、FGF9に誘導される運命決定の遅れが示唆された(図7c)。免疫蛍光解析によって、分化7日目の時点にGATA3およびHOXD11によってそれぞれ示されるように、長い(または短い)期間のCHIR99021は、少ない(多い)AIを誘導するが、多い(少ない)PIを誘導することが示された(図7d)。これらの観察結果は、18日間の培養後まで続き、少ない日数のCHIR99201存在後はUEが優性に誘導され(GATA3⁺PAX2⁺ECAD⁺)、より長い日数のCHIR66201存在の場合、MM(PAX2⁺ECAD^-)およびその派生物(PAX2⁺ECAD⁺)が優先的に誘導された。さらに、本発明者らは、RAシグナル伝達もまたIMのA-P運命パターン化を制御するかを、FGF9と共にRAまたはRARアンタゴニストAGN193109を用いて調査した(図7e、f)。RAはUE誘導を促進したのに対し、AGN193109はUEを阻害したが、MM系統の誘導を強めた(図7g、h)。

これらの結果は、胚形成についての本発明者らの理解を深めて、さらには腎臓形成に不可欠な2種のIM由来前駆体集団のそれぞれの相対的誘導を調節するための方法を提供する。結果として、本発明者らは、本発明者らの既存の腎臓分化プロセスを改良して、形成されるMMの比率を高め、3D培養の時間を長くし、かつネフロン形成を能動的に誘発した。この最適化されたアプローチは、hESCまたはヒトiPSCのいずれにも適用され、単層培養においてUEおよびMMの両方の誘導をもたらす最初の4日間のCHIR99021と、それに続く、オルガノイド培養に移す前の3日間のFGF9を必要とした(図8a)。結果として生じる集合体を最長20日間培養し、その間に、それら集合体は複雑な腎臓オルガノイドを自発的に形成した(図8b)。正常な腎臓発生の間、MMからのネフロン形成は、UEから分泌されたWnt9bに応答して開始される。マウスでは、古典的Wntアゴニストの添加によって、異所的なネフロン形成が誘発され得る¹⁴。実際、オルガノイド1つ当たりのネフロンが最大数になるには、ペレット形成後に1時間のCHIR99021短時間適用が必要であった(図8aおよび図11a)。さらに、このCHIR99021短時間適用後にFGF9が継続的に存在することが腎形成にとって不可欠であったことから、Wntを媒介とするネフロン誘導後の、FGFシグナル伝達のさらなる役割が示唆された(図11b)。各オルガノイド内で、ネフロンは、集合管(GATA3⁺ECAD⁺)、初期の遠位尿細管(GATA3^-LTL^-ECAD⁺)、初期の近位尿細管(LTL⁺ECAD^-)、および糸球体(WT1⁺)を含む、4つの構成要素に適切に分節化していた(図8c、d)。さらに、腎臓オルガノイドは、樹状の集合管がオルガノイドの底部で形成し、中央部で遠位近位尿細管および近位尿細管につながっており、各オルガノイドの上部には糸球体がある、複雑な形態形成パターン化を示していた(図8e'、e''、e''')。このパターン化は、糸球体が皮質から生じ、一方、集合管が中央から器官の至る所に四方に広がる、インビボで観察される組織構成を模倣している。この場合もやはり、個々のオルガノイド内の集合管対ネフロンの相対的レベルは、初期のCHIR99201からFGF9への切り換えのタイミングを利用して変更することができた。次に、本発明者らは、集合および3D培養後の0日目、3日目、11日目、および18日(d)目の腎臓オルガノイド全体のRNAシークエンシングを実施した。この時間経過の間に(Across)、本発明者らは、ネフロン前駆体遺伝子発現の一時的減少を観察したが、足細胞、近位尿細管、および遠位尿細管を含む複数のネフロン分節のマーカーの増加を観察した(図12)。転写プロファイリングを実施し、妊娠第1三半期および/または妊娠第2三半期に由来する21種のヒト胎児器官/組織から得られたヒト胎児転写データセットと、偏りのない方法を用いて比較した¹⁵。この解析では、培養11日目および18日目の腎臓オルガノイドが、第1三半期のヒト胎児腎臓と共にクラスター化された(図8f、g;図13)。これよりも早い培養時点(0日、3日)では、オルガノイドは、同じくIMに由来する発生学的に近縁の組織である胎児性腺との合致度が高かった(more closely matched)。

腎臓において、上皮細胞型(ネフロンおよび集合管)は、腎間質(支質)に取り囲まれており、この腎間質内には血管網が存在する。MMを形成するだけでなく、IMは、支質前駆体および血管前駆体も生じる(図9a)^16、17。本発明者らは、その他の細胞型の証拠および機能成熟の証拠を得るために腎臓オルガノイドを検査した。集合管は、PAX2、GATA3、およびECADの同時発現に基づいて区別することができた(図9b)。11日目に、ネフロン上皮は、近位(LTL⁺ECAD^-)要素および遠位(LTL⁺ECAD^-)要素を示した(図9c)。18日目までに、近位尿細管は成熟してECADと共にLTLを同時発現し、頂端面にキュビリンがはっきり表われていた(図9d、e)。透過型電子顕微鏡(TEM)により、異なる上皮サブタイプが示された:集合管/遠位尿細管の特徴である開いた管腔を取り囲む短い微絨毛がほとんどない細胞(図9k)およびタイトジャンクションと共に頂端の刷子縁を示している典型的な近位尿細管上皮(図9l)。18日目までに、ヘンレ係蹄(UMOD⁺)が形成し始めた(図9f)。11日目までに、中央の足細胞形成を伴うボーマン嚢を含むWT1⁺NPHS1⁺初期糸球体¹⁸が、近位尿細管に連結されているのが認められた(図9g)。腎臓オルガノイドはまた、管腔形成を伴うCD31⁺KDR⁺SOX17⁺内皮網も発達させた(図9h)。TEMにより、足細胞の特徴である一次足突起および二次足突起の存在が示された(図9m)。発生中の腎臓において、腎間質は、周皮細胞およびメサンギウム細胞に分化する¹⁹。予想される通り、腎臓オルガノイドは、ヒト胎児腎臓において観察されるように、KDR⁺内皮に沿って存在するPDGFRA⁺血管周囲細胞および糸球体を収めている(invaginating)PDGFRA⁺初期メサンギウム細胞を含んでいた(図14a、b)²⁰。初期の無血管性糸球体は、ラミニン染色およびTEMによって示されたように、基底膜を含んでおり、基底膜に付着している足突起を示していた。場合により、糸球体は、内皮侵入の証拠を示し(図9i)、これは、移植された胎仔マウス腎臓では一度も観察されたことのない特徴であった²¹。最後に、ネフロンはMEIS1⁺腎間質細胞によって取り囲まれており²²、これらの細胞の一部もまたFOXD1⁺であったことから(図9j)、皮質(FOXD1⁺MEIS1⁺)および髄質(FOXD1^-MEIS1⁺) 支質の存在が示唆された。したがって、予期される腎臓構成要素すべてが、これらのhPSC由来腎臓オルガノイド内で形成し、パターン化し、成熟し始めている。培養中の経時的な転写変化はこれらの観察結果と一致しており、腎形成間葉および尿管先端部のマーカーが徐々に減少し、それに続いて、足細胞、近位尿細管、遠位尿細管、およびヘンレ係蹄に特異的な遺伝子が上方調節された^23、24(図11)。

疾患モデリングまたは薬物スクリーニングに対する幹細胞由来腎臓オルガノイドの有用性は、これらのオルガノイド内のネフロンの機能成熟によって左右されると考えられる。このことを検証するために、本発明者らは、近位尿細管、すなわち、溶質、ビタミン、ホルモン、およびアミノ酸の再吸収において重要な役割を果たすネフロン分節に焦点を合わせた。キュビリンを介した近位尿細管特異的エンドサイトーシスの能力は、24時間の曝露後にLTL⁺尿細管によって培地からデキストラン-Alexa488が選択的に取り込まれたことによって実証された(図10a)。近位尿細管は、多剤耐性(例えばABCB1、ABCG2)ならびに陰イオン輸送体および陽イオン輸送体(例えばSLC22遺伝子ファミリー)の発現が原因で、腎毒性の具体的な標的になる^23、24。シスプラチンは、腎臓の近位尿細管細胞のカスパーゼを介した急性アポトーシスを誘導するそのような腎毒性物質の内の1つである^25、26。本発明者らは、0、5、および20μMのシスプラチンで腎臓オルガノイドを24時間処理した後、切断型CASP3の抗体染色を調査した。対照オルガノイドが、ところどころにアポトーシス性間質細胞を示したのに対し、5μMシスプラチンおよび20μMシスプラチンの両方とも、成熟した近位尿細管細胞(LTL⁺ECAD⁺)において特異的な急性アポトーシスを誘導したが、未成熟細胞(LTL⁺ECAD^-)はアポトーシスを経なかった(図10b、c)。

要約すれば、この研究は、低分子を用いてIMのA/Pパターン化のバランスを注意深く取ることによって、ヒト多能性幹細胞を方向付けて、内皮および腎間質に取り囲まれた完全に分節化したネフロンを含み、かつヒト胎児腎臓に転写的に類似している、複雑な多細胞性腎臓オルガノイドを形成させることが可能であることを実証する。したがって、これらにより、ヒト腎臓発生に関する本発明者らの理解が深まると考えられる。各腎臓オルガノイドは、オルガノイド1つにつきネフロンが500個を超える、すなわち14.5dpc時点のマウス腎臓と同等数である相当な大きさに達する²⁷。尿細管の機能成熟度、糸球体の血管新生、および尿のための1つの出口経路を有している連続した集合管上皮に関してさらに改善の余地はあるものの、本明細書において観察される組織の複雑性およびオルガノイド機能化の程度は、毒性について薬物をスクリーニングするため、遺伝的腎臓疾患のモデリング、または細胞療法のための特定の腎臓細胞型の供給源の役目を果たすためにそれらを使用することを後押しするものである。

本発明者らが、分化したhES細胞培養物のみからオルガノイドを形成させることができるということにより、組織に基づく腎毒性スクリーニング、インビトロの疾患モデルを作る、または腎臓機能を補うための移植可能なオルガノイドを開発するという可能性が開ける。また、後で精製するための特異的な成熟腎細胞型を作製することの実現可能性も示唆される。

この方法を用いて作製される細胞の具体的な用途には、以下のものが含まれ得る:
・腎毒性スクリーニングのための、小型腎臓オルガノイドもしくは精製腎細胞の作製;
・一般的もしくは患者ごとの疾患モデリングのための、小型腎臓オルガノイドもしくは精製腎細胞の作製;および/または
・腎臓疾患の治療的処置についての薬物スクリーニングのための、小型腎臓オルガノイドもしくは精製腎細胞型の作製。

これらは、マイクロバイオリアクター中で、または大型のスクリーンにバイオプリンティングした後に、実施され得る。疾患モデリングまたは薬物スクリーニングの場合、本発明者らは、個々の細胞型を精製し、個々の疾患に基づく有用な情報を提供すると思われる様式または形式で、それらを培養する可能性が高い。例えば、本発明者らは、(例えば、腎ろうのような疾患の場合は)UBを単離しマトリゲル培養物中で増殖させて包嚢形成を評価する可能性があり、または(例えば、フィンランド型腎症もしくはアルポート症候群のような疾患の場合は)MMを単離して足細胞を作製する可能性がある。

細胞療法および器官の置換または修復の具体的な例には、以下が含まれ得る:
・細胞療法のための腎臓細胞型の作製(急性の腎臓損傷もしくは慢性の腎臓損傷);
・器官全体を置換する生物工学のための腎臓細胞型の作製(複数の小型腎臓を相互に連結して、置換「器官」を形成させる必要がある場合がある);および/または
・脱細胞化した足場の再細胞化のための腎臓細胞型の作製。
・その他の用途には以下が含まれる:
・1)個々の腎細胞型への分化の読み取り情報として1種または複数種の蛍光性レポーターの存在を知らせるように(report)操作されたヒト多能性幹細胞株からの腎臓オルガノイドの作製。これにより、特異的抗体の可視化を必要とせずに分化の複雑性の程度を知らせもし、かつ1回の分化に由来する様々な特異的腎細胞型を精製するためのコンビナトリアルFACS選別を容易にもする、単一の出発細胞株からのオルガノイドの作製が可能になると思われる。このような選別された細胞は、細胞療法において有用である可能性がある。
・2)細胞損傷の読み取り情報(腎毒性、細胞毒性、またはアポトーシス/ネクローシスの誘導に対する予測された応答)として1種または複数種の蛍光性レポーターまたはルシフェラーゼに基づくレポーターの存在を知らせるように操作されたヒト多能性幹細胞株からの腎臓オルガノイドの作製。これにより、応答の定量可能な読み取り情報を用いる薬物スクリーニングまたは腎毒性スクリーニングのためのオルガノイドの作製が可能になると思われる。
・3)他のバイオプリントされた構造体と組み合わせるための、集合管のみまたは後腎間葉のみの作製。例えば、別々に分化させられるが尿管樹中にバイオプリントされる集合管細胞と組み合わせるためのネフロン形成間葉のみの作製。この場合の利点は、特殊にパターン化された集合管網を作り出すことであろう。この集合管網の周囲でネフロンは分化することができ、その結果、最終産物は、単一の出口に尿を導くことができる移植可能な器官の役割を果たし得る。

本明細書の全体を通して、本発明を任意の1つの態様にも特徴の特定の集まりにも限定することなく、本発明の好ましい態様を説明することを目的としてきた。したがって、本開示を考慮して、本発明の範囲から逸脱することなく、例示した個々の態様において様々な修正および変更を加えられることが、当業者には認識されると考えられる。

本明細書において言及されるコンピュータープログラム、アルゴリズム、特許、および科学文献はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。

（表１）試薬の供給源

（表２）qRTPCRのために使用されるプライマーの配列

（表３）

参考文献

Claims

以下の段階を含む、１つまたは複数の腎オルガノイドを作製する方法:
（ａ）ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）を、Wntアゴニストと接触させ、それによって、後方原始線条細胞を含む細胞を生じさせる段階、
（ｂ）後方原始線条細胞を含む細胞を、線維芽細胞増殖因子9(FGF9)と接触させ、それによって、中間中胚葉(IM)細胞を含む細胞を生じさせる段階、
（ｃ）中間中胚葉(IM)細胞を含む細胞を、線維芽細胞増殖因子9(FGF9)、または骨形態形成タンパク質7(BMP7);ヘパリン;Wntアゴニスト;レチノイン酸(RA);RA類似体; RA受容体アンタゴニスト;線維芽細胞増殖因子2(FGF2)および線維芽細胞増殖因子20(FGF20)からなる群より選択される1種または複数種と組み合わせたFGF9と接触させ、それによって、ネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞を含む細胞を生じさせる段階、
（ｄ）（ｃ）の細胞の集合体を形成させる段階、および
（ｅ）（ｄ）において形成された細胞の集合体をFGF9とともに培養する段階
を含み、それによって、血管内皮前駆細胞または血管内皮を含む１つまたは複数の腎オルガノイドを作製する、前記方法。
（ｄ）において細胞の集合体を形成させる段階が、フローティングフィルター上での培養を含む、請求項１に記載の方法。
（ｃ）において接触させる段階が、RAまたはRA類似体と培養することを含む、請求項１または２に記載の方法。
（ｃ）において接触させる段階が、RA受容体アンタゴニストと培養することを含む、請求項１～３のいずれか一項記載の方法。
（ｃ）において接触させる段階が、Wntアゴニストと接触させることを含む、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
（ｅ）において細胞の集合体を培養する段階が、5%～12%の酸素分圧の下で培養することを含む、請求項１～５のいずれか一項記載の方法。
（ｄ）において細胞の集合体を形成させる段階が、0.5～2時間の間、Wntアゴニストを追加することをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
（ｅ）において細胞の集合体を培養する段階が、RAアンタゴニスト、RA、BMP7およびヘパリンの１つまたは複数と培養することをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項記載の方法。
請求項１～８のいずれか一項記載の方法に従って作製された、単離、濃縮、または精製された血管前駆細胞または血管内皮を含む腎オルガノイド。
以下の段階を含む、インビトロで腎臓、腎臓細胞または腎臓組織を作製する方法:
（ａ）ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）を、Wntアゴニストと接触させ、それによって、後方原始線条細胞を含む細胞を生じさせる段階、
（ｂ）後方原始線条細胞を含む細胞を、線維芽細胞増殖因子9(FGF9)と接触させ、それによって、中間中胚葉(IM)細胞を含む細胞を生じさせる段階、
（ｃ）中間中胚葉(IM)細胞を含む細胞を、線維芽細胞増殖因子9(FGF9)、または骨形態形成タンパク質7(BMP7);ヘパリン;Wntアゴニスト;レチノイン酸(RA);RA類似体;RA受容体アンタゴニスト;線維芽細胞増殖因子2(FGF2)および線維芽細胞増殖因子20(FGF20)からなる群より選択される1種または複数種と組み合わせたFGF9と接触させ、それによって、ネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞を含む細胞を生じさせる段階、
（ｄ）（ｃ）の細胞の集合体を形成させる段階、および
（ｅ）（ｄ）において形成された細胞の集合体をFGF9とともに培養する段階
を含み、それによって、血管内皮前駆細胞または血管内皮を含む腎臓、腎臓細胞または腎臓組織を作製する、前記方法。
（ｅ）において細胞の集合体を培養する段階が、最長20日間培養する段階である、請求項１～８および１０のいずれか一項記載の方法。
（ｄ）において形成された細胞の集合体が、生体適合性表面上にバイオプリントされる、請求項１～８、１０および１１のいずれか一項記載の方法。
以下の段階を含む、腎組織をバイオプリントする方法:
（ａ）ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）を、Wntアゴニストと接触させ、それによって、後方原始線条細胞を含む細胞を生じさせる段階、
（ｂ）後方原始線条細胞を含む細胞を、線維芽細胞増殖因子9(FGF9)と接触させ、それによって、中間中胚葉(IM)細胞を含む細胞を生じさせる段階、
（ｃ）中間中胚葉(IM)細胞を含む細胞を、線維芽細胞増殖因子9(FGF9)、または骨形態形成タンパク質7(BMP7);ヘパリン;Wntアゴニスト;レチノイン酸(RA);RA類似体;RA受容体アンタゴニスト;線維芽細胞増殖因子2(FGF2)および線維芽細胞増殖因子20(FGF20)からなる群より選択される1種または複数種と組み合わせたFGF9と接触させ、それによって、ネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞を含む細胞を生じさせる段階、
（ｄ）（ｃ）の細胞の集合体を形成させる段階、
（ｅ）（ｄ）の細胞の集合体を生体適合性表面上にバイオプリントする段階、および
（ｆ）（ｅ）においてバイオプリントされた細胞の集合体をFGF9とともに培養する段階
を含み、それによって、血管内皮前駆細胞または血管内皮を含む腎組織を作製する、前記方法。
以下の段階を含む、1種または複数種の化合物の腎毒性を判定する方法:
（ａ）ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）を、Wntアゴニストと接触させ、それによって、後方原始線条細胞を含む細胞を生じさせる段階、
（ｂ）後方原始線条細胞を含む細胞を、線維芽細胞増殖因子9(FGF9)と接触させ、それによって、中間中胚葉(IM)細胞を含む細胞を生じさせる段階、
（ｃ）中間中胚葉(IM)細胞含む細胞を、線維芽細胞増殖因子9(FGF9)、または骨形態形成タンパク質7(BMP7);ヘパリン;Wntアゴニスト;レチノイン酸(RA);RA類似体;RA受容体アンタゴニスト;線維芽細胞増殖因子2(FGF2)および線維芽細胞増殖因子20(FGF20)からなる群より選択される1種または複数種と組み合わせたFGF9と接触させ、それによって、ネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞含む細胞を生じさせる段階、
（ｄ）（ｃ）の細胞の集合体を形成させる段階、
（ｅ）（ｄ）において形成された細胞の集合体をFGF9とともに培養し、それによって、血管内皮前駆細胞または血管内皮を含む１つまたは複数の腎オルガノイドを作製する段階、および
（ｆ）該1種または複数種の化合物を、（ｅ）の腎オルガノイドと接触させ、それによって、該1種または複数種の化合物が腎毒性であるか否かを判定する段階。
請求項１３に記載の方法によって作成された、血管内皮前駆細胞または血管内皮を含む、バイオプリントされた腎組織。
腎オルガノイド、腎臓、腎臓細胞、もしくは腎臓組織、または腎組織が、分節化したネフロン、内皮および腎間質を含む、請求項１～８および１０～１４のいずれか一項記載の方法。
分節化したネフロン、内皮および腎間質を含む、請求項９または１５に記載の腎オルガノイドまたはバイオプリントされた腎組織。