JP7059481B2 - Ｃｄ４ｃｄ８両陽性ｔ細胞の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、造血前駆細胞からCD4CD8両陽性T細胞を製造する方法、多能性幹細胞からCD4CD8両陽性T細胞を製造する方法、および当該CD4CD8両陽性T細胞からCD8陽性T細胞を製造する方法に関する。
T細胞は、細菌やウィルスなどの外来の病原体や癌細胞などの異常な細胞に対する免疫システムにおいて中心的な役割を果たしているが、様々な原因によりT細胞の機能が低下し、易感染性やがん等に罹患すると考えられている。このような疾患に対して、免疫細胞等の補充や再生をすることができれば、疾患の病態改善や治療効果の向上などに極めて有効な手段となる。このような免疫細胞の補充療法において、細胞性免疫を担うＴリンパ球の機能補充や再生が強く求められているが、現在有効な治療方法は確立されていない。
このようなＴリンパ球の補充療法として、抗原特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子を各種リンパ球系細胞に遺伝子導入し、特異的免疫反応を補充や賦活させることが提案されている（非特許文献１または２）。これらの試みでは遺伝子導入細胞として骨髄前駆細胞であるＣＤ３４陽性細胞や、ナイーブＴリンパ球などが用いられているが、これらは、Ｅｘ－ｖｉｖｏでの自己再生能が低い、遺伝子導入の効率が低い、遺伝子導入による分化の調節が困難である、など多くの課題を有している。
また、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞から誘導したＴリンパ球を用いた補充療法も提案されている（非特許文献３または特許文献１）。多能性幹細胞からＴリンパ球の誘導方法においては、（１）多能性幹細胞から造血前駆細胞を誘導する工程、（２）造血前駆細胞からＣＤ４ＣＤ８両陰性細胞を誘導する工程、（３）ＣＤ４ＣＤ８両陰性細胞からＣＤ４ＣＤ８両陽性細胞を誘導する工程、および（４）ＣＤ４ＣＤ８両陽性細胞からＴリンパ球を誘導する工程が提案されている。
（１）の工程では、多能性幹細胞からネット様構造物サック（ＥＳ－ｓａｃ）を形成させ造血前駆細胞を製造する方法が知られている（非特許文献４）。また、（２）および（３）の工程は、ＯＰ９－ＤＬ１細胞層上でＩＬ－７およびＦｌｔ－３Ｌを添加した培地で培養する方法が知られている（非特許文献５または６）。さらに、（４）の工程は、抗CD3抗体（ＯＫＴ－３）およびＩＬ－２を添加した培地で培養する方法が知られている。
また、特許文献２には、ビタミンC類を添加した培養液を利用して多能性幹細胞からCD4CD8両陽性T細胞を製造する方法が開示されている。
しかし、これらの方法によって多能性幹細胞からＴリンパ球を製造する効率は十分ではなく、改良が望まれている。
このようなＴリンパ球の補充療法として、抗原特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子を各種リンパ球系細胞に遺伝子導入し、特異的免疫反応を補充や賦活させることが提案されている（非特許文献１または２）。これらの試みでは遺伝子導入細胞として骨髄前駆細胞であるＣＤ３４陽性細胞や、ナイーブＴリンパ球などが用いられているが、これらは、Ｅｘ－ｖｉｖｏでの自己再生能が低い、遺伝子導入の効率が低い、遺伝子導入による分化の調節が困難である、など多くの課題を有している。
また、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞から誘導したＴリンパ球を用いた補充療法も提案されている（非特許文献３または特許文献１）。多能性幹細胞からＴリンパ球の誘導方法においては、（１）多能性幹細胞から造血前駆細胞を誘導する工程、（２）造血前駆細胞からＣＤ４ＣＤ８両陰性細胞を誘導する工程、（３）ＣＤ４ＣＤ８両陰性細胞からＣＤ４ＣＤ８両陽性細胞を誘導する工程、および（４）ＣＤ４ＣＤ８両陽性細胞からＴリンパ球を誘導する工程が提案されている。
（１）の工程では、多能性幹細胞からネット様構造物サック（ＥＳ－ｓａｃ）を形成させ造血前駆細胞を製造する方法が知られている（非特許文献４）。また、（２）および（３）の工程は、ＯＰ９－ＤＬ１細胞層上でＩＬ－７およびＦｌｔ－３Ｌを添加した培地で培養する方法が知られている（非特許文献５または６）。さらに、（４）の工程は、抗CD3抗体（ＯＫＴ－３）およびＩＬ－２を添加した培地で培養する方法が知られている。
また、特許文献２には、ビタミンC類を添加した培養液を利用して多能性幹細胞からCD4CD8両陽性T細胞を製造する方法が開示されている。
しかし、これらの方法によって多能性幹細胞からＴリンパ球を製造する効率は十分ではなく、改良が望まれている。
Gattinoni L, et al., Nat Rev Immunol. 6(5):383-393, 2006
Morgan RA, et al., Science. 314(5796):126-129, 2006
Nishimura T, et al., Cell Stem Cell. 12(1):114-126, 2013.
Takayama N, et al., Blood. 111(11):5298-5306, 2008
Timmermans F, et al., J Immunol. 182(11):6879-6888, 2009
Ikawa T, et al., Science. 329(5987):93-96, 2010
本発明の目的は、造血前駆細胞からCD4CD8両陽性T細胞を効率良く製造すること、および多能性幹細胞からCD4CD8両陽性T細胞を効率良く製造することにある。
本発明者らは、上記目的を達成すべく、造血前駆細胞からCD4CD8両陽性T細胞を効率よく誘導するために有効な物質の探索を行った。その結果、p38阻害剤および／またはSDF-1を培養液へ添加して造血前駆細胞を培養することで、効率よくCD4CD8両陽性T細胞が誘導されることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
［１］造血前駆細胞を、p38阻害剤および／またはSDF-1を含有する培養液中で培養し、CD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程を含む、CD4CD8両陽性T細胞の製造方法。
［２］前記培養液はp38阻害剤およびSDF-1を含む、［１］に記載の方法。
［３］前記p38阻害剤は、SB203580である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記工程において、培養液はビタミンC類を含有する、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記工程は、接着培養で行われる、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記造血前駆細胞はフィーダー細胞を用いることなく培養される、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記造血前駆細胞は多能性幹細胞から分化誘導された造血前駆細胞である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［７］に記載の方法。
［９］人工多能性幹細胞がT細胞以外の体細胞に由来する、［８］に記載の方法。
［１０］人工多能性幹細胞がキメラ抗原受容体が導入された人工多能性幹細胞である、［８］または［９］に記載の方法。
［１１］以下の工程を含む、CD4CD8両陽性T細胞の製造方法；
（１）多能性幹細胞を培養液中で培養し、造血前駆細胞を誘導する工程、
（２）前記工程（１）で得られた造血前駆細胞を、p38阻害剤および／またはSDF-1を含有する培養液中で培養し、CD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程。
［１２］前記工程（２）において、培養液はp38阻害剤およびSDF-1を含む、［１１］に記載の方法。
［１３］前記p38阻害剤は、SB203580である、［１１］または［１２］に記載の方法。
［１４］前記工程（１）は、浮遊培養で行われる、［１１］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］前記工程（２）は、接着培養で行われる、［１１］～［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］前記工程（１）および（２）において、培養液はビタミンC類を含有する、［１１］～［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］前記工程（１）および（２）において、培養はフィーダー細胞を用いることなく行われる、［１１］～［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［１１］～［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］人工多能性幹細胞がT細胞以外の体細胞に由来する、［１８］に記載の方法。
［２０］人工多能性幹細胞がキメラ抗原受容体が導入された人工多能性幹細胞である、［１８］または［１９］に記載の方法。
［２１］［１］～［２０］のいずれかに記載の方法によりCD4CD8両陽性T細胞を製造する工程、および得られたCD4CD8両陽性T細胞を副腎皮質ホルモン剤を添加した培養液中で培養してCD8陽性T細胞を得る工程を含む、CD8陽性T細胞の製造方法。
［２２］［１］～［２０］のいずれかに記載の方法により得られたCD4CD8両陽性T細胞および／または［２１］の方法で得られたCD8陽性T細胞を含む細胞製剤。
［１］造血前駆細胞を、p38阻害剤および／またはSDF-1を含有する培養液中で培養し、CD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程を含む、CD4CD8両陽性T細胞の製造方法。
［２］前記培養液はp38阻害剤およびSDF-1を含む、［１］に記載の方法。
［３］前記p38阻害剤は、SB203580である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記工程において、培養液はビタミンC類を含有する、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記工程は、接着培養で行われる、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記造血前駆細胞はフィーダー細胞を用いることなく培養される、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記造血前駆細胞は多能性幹細胞から分化誘導された造血前駆細胞である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［７］に記載の方法。
［９］人工多能性幹細胞がT細胞以外の体細胞に由来する、［８］に記載の方法。
［１０］人工多能性幹細胞がキメラ抗原受容体が導入された人工多能性幹細胞である、［８］または［９］に記載の方法。
［１１］以下の工程を含む、CD4CD8両陽性T細胞の製造方法；
（１）多能性幹細胞を培養液中で培養し、造血前駆細胞を誘導する工程、
（２）前記工程（１）で得られた造血前駆細胞を、p38阻害剤および／またはSDF-1を含有する培養液中で培養し、CD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程。
［１２］前記工程（２）において、培養液はp38阻害剤およびSDF-1を含む、［１１］に記載の方法。
［１３］前記p38阻害剤は、SB203580である、［１１］または［１２］に記載の方法。
［１４］前記工程（１）は、浮遊培養で行われる、［１１］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］前記工程（２）は、接着培養で行われる、［１１］～［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］前記工程（１）および（２）において、培養液はビタミンC類を含有する、［１１］～［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］前記工程（１）および（２）において、培養はフィーダー細胞を用いることなく行われる、［１１］～［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［１１］～［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］人工多能性幹細胞がT細胞以外の体細胞に由来する、［１８］に記載の方法。
［２０］人工多能性幹細胞がキメラ抗原受容体が導入された人工多能性幹細胞である、［１８］または［１９］に記載の方法。
［２１］［１］～［２０］のいずれかに記載の方法によりCD4CD8両陽性T細胞を製造する工程、および得られたCD4CD8両陽性T細胞を副腎皮質ホルモン剤を添加した培養液中で培養してCD8陽性T細胞を得る工程を含む、CD8陽性T細胞の製造方法。
［２２］［１］～［２０］のいずれかに記載の方法により得られたCD4CD8両陽性T細胞および／または［２１］の方法で得られたCD8陽性T細胞を含む細胞製剤。
本発明によれば、造血前駆細胞から効率よくCD4CD8陽性T細胞を製造することが可能である。また、多能性幹細胞から効率よくCD4CD8陽性T細胞を製造することが可能である。さらに、副腎皮質ホルモン剤を培養液へ添加することで、CD4CD8両陽性T細胞から効率よくCD8陽性T細胞を製造することが可能である。
本発明は、造血前駆細胞からCD4CD8両陽性T細胞を製造する方法を提供する。
造血前駆細胞からCD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程
本発明において、造血前駆細胞（Hematopoietic Progenitor Cells（HPC））とは、リンパ球、好酸球、好中球、好塩基球、赤血球、巨核球等の血球系細胞に分化可能な細胞である。本発明において、造血前駆細胞と造血幹細胞は、区別されるものではなく、特に断りがなければ同一の細胞を示す。造血幹細胞／前駆細胞は、例えば、表面抗原であるCD34および/またはCD43が陽性であることによって認識できる。
なお、造血前駆細胞は後述のようにして多能性幹細胞から誘導した造血前駆細胞を用いることもできるし、臍帯血由来のCD34陽性細胞のように、別の方法で入手した造血前駆細胞を用いることもできる。
本発明において、造血前駆細胞（Hematopoietic Progenitor Cells（HPC））とは、リンパ球、好酸球、好中球、好塩基球、赤血球、巨核球等の血球系細胞に分化可能な細胞である。本発明において、造血前駆細胞と造血幹細胞は、区別されるものではなく、特に断りがなければ同一の細胞を示す。造血幹細胞／前駆細胞は、例えば、表面抗原であるCD34および/またはCD43が陽性であることによって認識できる。
なお、造血前駆細胞は後述のようにして多能性幹細胞から誘導した造血前駆細胞を用いることもできるし、臍帯血由来のCD34陽性細胞のように、別の方法で入手した造血前駆細胞を用いることもできる。
本発明において、CD4CD8両陽性T細胞とは、T細胞のうち、表面抗原のCD4およびCD8が共に陽性である細胞（CD8+CD4+）を意味し、T細胞は、表面抗原であるCD3およびCD45が陽性であることによって認識することができることから、CD4CD8両陽性T細胞は、CD4、CD8、CD3およびCD45が陽性である細胞として同定することができる。CD4CD8両陽性T細胞は、誘導によってCD4陽性細胞またはCD8陽性細胞へと分化させることができる。
本発明において、CD4CD8両陽性T細胞は、p38阻害剤および／またはSDF-1を添加した培養液中で造血前駆細胞を培養する工程を含む方法によって製造することができる。
＜p38阻害剤＞
本明細書に係る「p38阻害剤」とは、p38タンパク質（p38MAPキナーゼ）の機能を阻害する物質として定義され、例えば、p38の化学的阻害剤、p38のドミナントネガティブ変異体もしくはそれをコードする核酸などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明における、p38の化学的阻害剤としては、SB203580(4-(4-フルオロフェニル)-2-(4-メチルスルホニルフェニル)-5-(4-ピリジル)-1H-イミダゾール)、及びその誘導体、SB202190（4-(4-フルオロフェニル)-2-(4-ヒドロキシフェニル)-5-(4-ピリジル)-1H-イミダゾール）及びその誘導体、SB239063（trans-4-[4-(4-フルオロフェニル)-5-(2-メトキシ-4-ピリミジニル)-1H-イミダゾール-1-イル]シクロヘキサノール）及びその誘導体、SB220025及びその誘導体、PD169316、RPR200765A、AMG-548、BIRB-796、SClO-469、SCIO-323、VX-702、FR167653が例示されるが、これらに限定されない。これらの化合物は市販されており、例えばSB203580、SB202190、SC239063、SB220025およびPD169316についてはCalbiochem社、SClO-469およびSCIO-323についてはScios社などから入手可能である。
また、p38のドミナントネガティブ変異体は、p38のDNA結合領域に位置する180位のスレオニンをアラニンに点変異させたp38T180A、ヒトおよびマウスにおけるp38の182位のチロシンをフェニルアラニンに点変異させたp38Y182Fなどが挙げられる。
p38阻害剤は、例えば、約1μM～約50μMの範囲で培地に含有される。
本明細書に係る「p38阻害剤」とは、p38タンパク質（p38MAPキナーゼ）の機能を阻害する物質として定義され、例えば、p38の化学的阻害剤、p38のドミナントネガティブ変異体もしくはそれをコードする核酸などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明における、p38の化学的阻害剤としては、SB203580(4-(4-フルオロフェニル)-2-(4-メチルスルホニルフェニル)-5-(4-ピリジル)-1H-イミダゾール)、及びその誘導体、SB202190（4-(4-フルオロフェニル)-2-(4-ヒドロキシフェニル)-5-(4-ピリジル)-1H-イミダゾール）及びその誘導体、SB239063（trans-4-[4-(4-フルオロフェニル)-5-(2-メトキシ-4-ピリミジニル)-1H-イミダゾール-1-イル]シクロヘキサノール）及びその誘導体、SB220025及びその誘導体、PD169316、RPR200765A、AMG-548、BIRB-796、SClO-469、SCIO-323、VX-702、FR167653が例示されるが、これらに限定されない。これらの化合物は市販されており、例えばSB203580、SB202190、SC239063、SB220025およびPD169316についてはCalbiochem社、SClO-469およびSCIO-323についてはScios社などから入手可能である。
また、p38のドミナントネガティブ変異体は、p38のDNA結合領域に位置する180位のスレオニンをアラニンに点変異させたp38T180A、ヒトおよびマウスにおけるp38の182位のチロシンをフェニルアラニンに点変異させたp38Y182Fなどが挙げられる。
p38阻害剤は、例えば、約1μM～約50μMの範囲で培地に含有される。
＜SDF-1＞
本発明において、SDF-1（Stromal cell-derived factor 1）は、SDF-1αまたはその成熟型だけでなく、SDF-1β、SDF-1γ、SDF-1δ、SDF-1εもしくはSDF-1φ等のアイソフォームまたはそれらの成熟型であってもよく、またこれらの任意の割合の混合物等であってもよい。好ましくは、SDF-1αが使用される。なお、SDF-1は、CXCL-12またはPBSFと称される場合もある。
本発明において、SDF-1（Stromal cell-derived factor 1）は、SDF-1αまたはその成熟型だけでなく、SDF-1β、SDF-1γ、SDF-1δ、SDF-1εもしくはSDF-1φ等のアイソフォームまたはそれらの成熟型であってもよく、またこれらの任意の割合の混合物等であってもよい。好ましくは、SDF-1αが使用される。なお、SDF-1は、CXCL-12またはPBSFと称される場合もある。
本発明において、SDF-1は、そのケモカインとしての活性を有する限り、そのアミノ酸配列中の１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失および／または付加されていてもよい。少なくとも４つのシステイン残基（ヒトSDF-1αの場合、Ｃｙｓ３０、Ｃｙｓ３２、Ｃｙｓ５５およびＣｙｓ７１）が保持されており、かつ天然体のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有する範囲であれば、アミノ酸変異が許容される。SDF-1は、哺乳動物、例えば、ヒトや、例えば、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス等の非ヒト哺乳動物のものであってもよい。例えば、ヒトのSDF-1αとして、GenBank登録番号：NP_954637で登録されているタンパク質が使用でき、SDF-1βとして、GenBank登録番号：NP_000600で登録されているタンパク質が使用できる。
SDF-1は、市販のものを使用してもよいし、天然から精製されたものを使用してもよいし、あるいはペプチド合成や遺伝子工学的手法によって製造されたものを使用してもよい。
SDF-1は、例えば、約10 ng/mlから約100 ng/mlの範囲で培地に含有される。
SDF-1は、例えば、約10 ng/mlから約100 ng/mlの範囲で培地に含有される。
なお、SDF-1にはSDF-1様の活性を有するSDF-1代替物を使用することもできる。このようなSDF-1代替物としてはCXCR4アゴニストが例示され、CXCR4アゴニスト活性を有する低分子化合物などをSDF-1の代わりに培地に添加してもよい。
本発明においてCD4CD8両陽性T細胞の製造に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地とし、これにp38阻害剤および／またはSDF-1、さらに好ましくはビタミンC類を添加して調製することができる。なお、CD4CD8両陽性T細胞製造工程で使用されるビタミンC類の種類は上述のとおりであるが、ビタミンC類の濃度は、例えば、5μg/mlから200μg/mlである。基礎培地には、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、OP9培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清を使用してもよい。必要に応じて、基礎培地は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどの1つ以上の物質も含有し得る。
本発明のCD4CD8両陽性T細胞の製造に用いる培養液は、SCF、TPO（トロンボポエチン）、FLT-3LおよびIL-7から成る群より選択されるサイトカインをさらに培養液に添加してもよい。これらの濃度は、例えば、SCFは10 ng/mlから100 ng/mlであり、TPOは1 0ng/mlから200 ng/mlであり、IL-7は1 ng/mlから100 ng/mlであり、FLT-3Lは1 ng/mlから100 ng/mlである。
CD4CD8両陽性T細胞の製造において、造血前駆細胞はフィーダー細胞を用いて培養してもよいが、好ましくはフィーダー細胞を用いずに培養を行う。
造血前駆細胞は接着培養または浮遊培養してもよいが、本工程は接着培養が好ましい。接着培養の場合、培養容器をコーティングして用いてもよく、例えば、コーティング剤としては、マトリゲル（Niwa A, et al. PLoS One.6(7):e22261, 2011）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、レトロネクチン、Fc-DLL4またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
なお、胚様体を浮遊培養して造血前駆細胞を得た場合は、これを単細胞に解離させたのちに、接着培養を行うことが好ましい。
造血前駆細胞は接着培養または浮遊培養してもよいが、本工程は接着培養が好ましい。接着培養の場合、培養容器をコーティングして用いてもよく、例えば、コーティング剤としては、マトリゲル（Niwa A, et al. PLoS One.6(7):e22261, 2011）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、レトロネクチン、Fc-DLL4またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
なお、胚様体を浮遊培養して造血前駆細胞を得た場合は、これを単細胞に解離させたのちに、接着培養を行うことが好ましい。
本発明において、CD4CD8両陽性T細胞を製造するために造血前駆細胞を培養する際の培養温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃～約42℃程度、約37～約39℃程度が好ましい。また、培養期間については、当業者であればCD4CD8両陽性T細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することが可能である。造血前駆細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも10日間以上、12日以上、14日以上、16日以上、18日以上、20日以上、22日以上、23日以上であり、好ましくは23日である。
本発明において、得られたCD4CD8両陽性T細胞は、単離して用いても良く、他の細胞種が含有される細胞集団としても良い。単離する場合、CD4、CD8、CD3およびCD45から成るいずれか一つの指標を用いて単離することができ、当該単離の方法は、当業者に周知の方法を用いることができ、例えば、CD4、CD8、CD3およびCD45の抗体により標識し、フローサイトメーターを用いて単離する方法、または所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法が挙げられる。
多能性幹細胞から造血前駆細胞を誘導する工程
本発明は、多能性幹細胞からCD4CD8両陽性T細胞を製造する方法を提供する。当該製造方法は、（１）多能性幹細胞から造血前駆細胞を誘導する工程、および（２）当該造血前駆細胞からCD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程を含む。
工程（２）の造血前駆細胞からCD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程は前述したとおりであり、工程（１）の多能性幹細胞から造血前駆細胞を誘導する工程について以下に説明する。
本発明は、多能性幹細胞からCD4CD8両陽性T細胞を製造する方法を提供する。当該製造方法は、（１）多能性幹細胞から造血前駆細胞を誘導する工程、および（２）当該造血前駆細胞からCD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程を含む。
工程（２）の造血前駆細胞からCD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程は前述したとおりであり、工程（１）の多能性幹細胞から造血前駆細胞を誘導する工程について以下に説明する。
多能性幹細胞
本発明において多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、少なくとも本発明で使用される造血前駆細胞に誘導される任意の細胞が包含される。多能性幹細胞は哺乳動物由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。
多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹（ES）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞、精子幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、人工多能性幹（iPS）細胞、培養線維芽細胞や臍帯血由来の多能性幹細胞、骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、製造工程において胚、卵子等の破壊をしないで入手可能であるという観点から、iPS細胞であり、より好ましくはヒトiPS細胞である。
本発明において多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、少なくとも本発明で使用される造血前駆細胞に誘導される任意の細胞が包含される。多能性幹細胞は哺乳動物由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。
多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹（ES）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞、精子幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、人工多能性幹（iPS）細胞、培養線維芽細胞や臍帯血由来の多能性幹細胞、骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、製造工程において胚、卵子等の破壊をしないで入手可能であるという観点から、iPS細胞であり、より好ましくはヒトiPS細胞である。
iPS細胞の製造方法は当該分野で公知であり、任意の体細胞へ初期化因子を導入することによって製造され得る。ここで、初期化因子とは、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等の遺伝子または遺伝子産物が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat. Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）血液細胞（末梢血細胞、臍帯血細胞等）、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
なお、CD4CD8陽性T細胞を製造する目的に使用するためには体細胞としてT細胞を使用することが好ましいと考えられていたが、本発明では、体細胞として非T細胞を用いて得られたiPS細胞からもCD4CD8陽性T細胞を製造することも可能である。
本発明において、体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。本発明によって調製されたCD4CD8陽性T細胞またはCD8陽性T細胞を輸血に使用する場合、輸血される患者とヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）の型を適合させ易いという観点から、iPS細胞の元となる体細胞は、輸血される対象から単離されることが好ましい。
本発明において、造血前駆細胞の誘導に使用されるiPS細胞は、キメラ抗原受容体（Chimeric antigen receptor : CAR）が導入されたiPS細胞であってもよい。ここで、キメラ抗原受容体（CAR）とは、抗原に結合する細胞外ドメインと、前記細胞外ドメインとは異なるポリペプチドに由来する細胞内ドメインを含む融合タンパク質を意味し、特定の抗原に対する抗体の抗原認識部位（可変領域のL鎖とH鎖）を、CD3などのT細胞受容体の細胞内ドメイン、およびCD28や4-1BBなどの共刺激分子の細胞内ドメインと結合させた融合タンパク質が挙げられる（例えば、特表2015-509716）。
CARの抗原認識部位は目的とする抗原に応じて選択でき、それにより目的の抗原に対して特異的なT細胞を作製することが可能である。例えば、CD19を抗原とする場合、抗CD19抗体の抗原認識部位をクローニングし、CD3分子の細胞内ドメインと結合させることにより、CARとすることができる（例えば、Cancer Res 2006;66:10995-11004.）。また、結合させる共刺激分子の種類や数を選択することにより、活性化の強さや持続時間をコントロールすることができる（例えば、Mol Ther. 2009;17:1453-1464.）。
CARを導入することにより、T細胞を由来とするiPS細胞およびT細胞を由来としないiPS細胞から分化誘導したT細胞のいずれにおいても、目的の抗原に対する特異性を付与することが可能となる。また、抗原分子を直接認識することができ、HLAクラスI遺伝子の発現が低下した腫瘍に対しても高い免疫反応を起こすことが可能である。
CARの抗原認識部位は目的とする抗原に応じて選択でき、それにより目的の抗原に対して特異的なT細胞を作製することが可能である。例えば、CD19を抗原とする場合、抗CD19抗体の抗原認識部位をクローニングし、CD3分子の細胞内ドメインと結合させることにより、CARとすることができる（例えば、Cancer Res 2006;66:10995-11004.）。また、結合させる共刺激分子の種類や数を選択することにより、活性化の強さや持続時間をコントロールすることができる（例えば、Mol Ther. 2009;17:1453-1464.）。
CARを導入することにより、T細胞を由来とするiPS細胞およびT細胞を由来としないiPS細胞から分化誘導したT細胞のいずれにおいても、目的の抗原に対する特異性を付与することが可能となる。また、抗原分子を直接認識することができ、HLAクラスI遺伝子の発現が低下した腫瘍に対しても高い免疫反応を起こすことが可能である。
多能性幹細胞から造血前駆細胞を誘導する工程
造血前駆細胞は、好ましくは、ビタミンC類を添加した培養液中で多能性幹細胞を培養することによって製造される。ここで、ビタミンC類とは、L-アスコルビン酸およびその誘導体を意味し、L-アスコルビン酸誘導体とは、生体内で酵素反応によりビタミンCとなるものを意味する。L-アスコルビン酸の誘導体として、リン酸ビタミンC、アスコルビン酸グルコシド、アスコルビルエチル、ビタミンCエステル、テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビルおよびアスコルビン酸-2リン酸-6パルミチン酸が例示される。好ましくは、リン酸ビタミンCであり、例えば、リン酸-Lアスコルビン酸Naまたはリン酸-L-アスコルビン酸Mgなどのリン酸-Lアスコルビン酸塩が挙げられる。ビタミンC類は、例えば、培養液において、5μg/mlから500μg/mlの濃度で含有される。
造血前駆細胞は、好ましくは、ビタミンC類を添加した培養液中で多能性幹細胞を培養することによって製造される。ここで、ビタミンC類とは、L-アスコルビン酸およびその誘導体を意味し、L-アスコルビン酸誘導体とは、生体内で酵素反応によりビタミンCとなるものを意味する。L-アスコルビン酸の誘導体として、リン酸ビタミンC、アスコルビン酸グルコシド、アスコルビルエチル、ビタミンCエステル、テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビルおよびアスコルビン酸-2リン酸-6パルミチン酸が例示される。好ましくは、リン酸ビタミンCであり、例えば、リン酸-Lアスコルビン酸Naまたはリン酸-L-アスコルビン酸Mgなどのリン酸-Lアスコルビン酸塩が挙げられる。ビタミンC類は、例えば、培養液において、5μg/mlから500μg/mlの濃度で含有される。
造血前駆細胞の製造に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地へビタミンC類等を添加して調製することができる。基礎培地には、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清を使用してもよい。必要に応じて、基礎培地は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどの1つ以上の物質も含有し得る。
本発明において造血前駆細胞の製造に用いる培養液は、BMP4 (Bone morphogenetic protein 4)、VEGF (vascular endothelial growth factor)、bFGF（basic fibroblast growth factor）、SCF (Stem cell factor)、TPO（トロンボポエチン）、およびFLT-3L (Flt3 Ligand)から成る群より選択されるサイトカインがさらに添加されていてもよい。
これらの濃度は、例えば、BMP4は1 ng/mlから100 ng/mlであり、VEGFは1 ng/mlから100ng/mlであり、SCFは10 ng/mlから100 ng/mlであり、TPOは1 ng/mlから100 ng/mlであり、FLT-3Lは1 ng/mlから100 ng/mlであり、bFGFは1 ng/mlから100 ng/mlである。
また、TGFβ阻害剤が添加されてもよい。TGFβ阻害剤とは、TGFβファミリーのシグナル伝達に干渉する低分子阻害剤であり、例えばSB431542、SB202190(以上、R.K.Lindemannet al., Mol. Cancer 2:20(2003))、SB505124 (GlaxoSmithKline)、 NPC30345 、SD093、SD908、SD208 (Scios)、LY2109761、LY364947、 LY580276 (Lilly Research Laboratories)などが包含され、例えば、TGFβ阻害剤がSB431542である場合、培地中の濃度は、好ましくは0.5μM～100μMである。
多能性幹細胞は、C3H10T1/2（Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830, 2010）、異種由来のストローマ細胞（Niwa A et al. J Cell Physiol. 2009 Nov;221(2):367-77.）などのフィーダー細胞と共培養されてもよいが、本発明においては、好ましくは、フィーダー細胞を使用せずに培養が行われる。
本発明の造血前駆細胞の製造において、多能性幹細胞の培養方法は、接着培養または浮遊培養であってもよいが、浮遊培養が好ましい。例えば、多能性幹細胞は、使用したディッシュに対して80％コンフルエントになるまで培養されたコロニーを分離し、単細胞に解離させたのちに、浮遊培養に供することができる。多能性幹細胞の分離方法としては、例えば、力学的に分離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Accutase(商標)およびAccumax(商標)など）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離方法が挙げられる。
浮遊培養とは、細胞を培養容器へ非接着の状態で培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていない培養容器、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）または非イオン性の界面活性ポリオール（Pluronic F-127等）によるコーティング処理）した培養容器を使用して行うことができる。浮遊培養の際には、胚様体（EB）を形成させて培養することが好ましい。
本発明では、造血前駆細胞は、多能性幹細胞を培養することで得られるネット様構造物（ES－sac又はiPS－sacとも称する）から調製することもできる。ここで、「ネット様構造物」とは、多能性幹細胞由来の立体的な嚢状（内部に空間を伴うもの）構造体で、内皮細胞集団などで形成され、内部に造血前駆細胞を含む構造体である。
本発明において、造血前駆細胞を製造するための培養する際の温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃～約42℃程度、約37～約39℃程度が好ましい。また、培養期間については、当業者であれば造血前駆細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することが可能である。造血前駆細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも6日間以上、7日以上、8日以上、9日以上、10日以上、11日以上、12日以上、13日以上、14日以上であり、好ましくは14日である。培養期間が長いことについては、造血前駆細胞の製造においては問題とされない。また、低酸素条件で培養してもよく、本発明において低酸素条件とは、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％またはそれら以下の酸素濃度が例示される。
CD4CD8両陽性T細胞からCD8陽性T細胞を誘導する工程
本発明においては、上記のようにして得られたCD4CD8陽性T細胞からCD8陽性T細胞を誘導することができる。
CD8陽性T細胞とは、T細胞のうち、表面抗原のCD8が陽性である細胞（CD8+CD4-）を意味し、細胞傷害性T細胞とも呼ばれる。T細胞は、表面抗原であるCD3およびCD45が陽性であることによって認識することができることから、CD8陽性T細胞は、CD8、CD3およびCD45が陽性であり、CD4が陰性である細胞として同定することができる。
本発明においては、上記のようにして得られたCD4CD8陽性T細胞からCD8陽性T細胞を誘導することができる。
CD8陽性T細胞とは、T細胞のうち、表面抗原のCD8が陽性である細胞（CD8+CD4-）を意味し、細胞傷害性T細胞とも呼ばれる。T細胞は、表面抗原であるCD3およびCD45が陽性であることによって認識することができることから、CD8陽性T細胞は、CD8、CD3およびCD45が陽性であり、CD4が陰性である細胞として同定することができる。
本発明において、CD8陽性T細胞は、副腎皮質ホルモン剤を添加した培養液中でCD4CD8両陽性T細胞を培養する工程を含む方法によって製造することができる。
副腎皮質ホルモン剤は、糖質コルチコイドあるいはその誘導体であり、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プロピオン酸ベクロメタゾンが例示される。好ましくは、デキサメタゾンである。副腎皮質ホルモン剤が、デキサメタゾンである場合、培養液中におけるその濃度は、例えば、1nMから100nMである。
CD8陽性T細胞の製造に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地へ副腎皮質ホルモン剤を添加して調製することができる。基礎培地には、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清を使用してもよい。必要に応じて、基礎培地は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどの1つ以上の物質も含有し得る。
本発明においてCD8陽性T細胞の製造に用いる培養液は、抗CD3抗体、ビタミンC類、サイトカインをさらに含有することが好ましい。当該サイトカインは、IL-2およびIL-7等が例示される。
抗CD3抗体とは、CD3を特異的に認識する抗体であれば特に限定されないが、例えば、OKT3クローンから産生される抗体が挙げられる。抗CD3抗体の培養液中における濃度は、例えば、10ng/mlから1000ng/mlである。
本発明においてCD8陽性T細胞の製造に用いるビタミンC類は上述と同じ条件で用いることができる。
本発明においてCD8陽性T細胞の製造に用いる各成分の培養液中における濃度は、例えば、IL-2は10 U/mlから1000 U/mlであり、IL-7は1ng/mlから100ng/mlである。
抗CD3抗体とは、CD3を特異的に認識する抗体であれば特に限定されないが、例えば、OKT3クローンから産生される抗体が挙げられる。抗CD3抗体の培養液中における濃度は、例えば、10ng/mlから1000ng/mlである。
本発明においてCD8陽性T細胞の製造に用いるビタミンC類は上述と同じ条件で用いることができる。
本発明においてCD8陽性T細胞の製造に用いる各成分の培養液中における濃度は、例えば、IL-2は10 U/mlから1000 U/mlであり、IL-7は1ng/mlから100ng/mlである。
本発明において、CD8陽性T細胞を製造するためにCD4CD8両陽性T細胞を培養する際の温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃～約42℃程度、約37～約39℃程度が好ましい。また、培養期間については、当業者であればCD8陽性T細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することが可能である。造血前駆細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも1日間以上、2日以上、3日以上、4日以上、5日以上であり、好ましくは3日である。
細胞製剤
本発明は、上述の方法によって製造されたCD4CD8両陽性T細胞および／またはCD8陽性T細胞を含む細胞製剤を提供する。
本発明の細胞製剤は抗原特異的に細胞傷害活性を発揮することができるので、癌治療や免疫補充療法などに好適に使用できる。
本発明の細胞製剤の患者への投与方法としては、例えば、製造されたCD4CD8両陽性T細胞および／またはCD8陽性T細胞を生理食塩水等に懸濁させ、患者の患部に直接移植する方法、または、静脈注射する方法などが挙げられる。
本発明は、上述の方法によって製造されたCD4CD8両陽性T細胞および／またはCD8陽性T細胞を含む細胞製剤を提供する。
本発明の細胞製剤は抗原特異的に細胞傷害活性を発揮することができるので、癌治療や免疫補充療法などに好適に使用できる。
本発明の細胞製剤の患者への投与方法としては、例えば、製造されたCD4CD8両陽性T細胞および／またはCD8陽性T細胞を生理食塩水等に懸濁させ、患者の患部に直接移植する方法、または、静脈注射する方法などが挙げられる。
本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれら実施例に限定されない。
iPS細胞(TKT3v 1-7株、H25-4株およびH25-31株)は、Nishimura T, et al., Cell Stem Cell. 12(1):114-126, 2013に記載の方法を用いて、告知後に同意を得て単離されたヒトCD3陽性T細胞より樹立した。
iPS細胞(Ffl-01株およびFfl-14株)は、Nakagawa M, et al., Sci Rep. 4:3594(2014)に記載の方法で樹立されたものを用いた（末梢血の単核球由来（ただしT細胞及びB細胞以外））。なお、Ffl-14株は、Ffl-01株と同じドナーから樹立された別クローンである。
iPS細胞(GPC3#16株)は、末梢血単核球から分離された抗原特異的Tリンパ球から、Nishimura T, et al., Cell Stem Cell. 12(1) : 114-126, 2013に記載の方法を用いて樹立されたものを用いた。
iPS細胞（Ff-I01 GC33株)は、Ff-I01株にウイルスベクターを用いてキメラ抗原受容体(Chimeric Antigen Receptor : CAR)を導入したものを用いた。CARは、抗CD19抗体の抗原認識部位をクローニングし、CD3分子の細胞内ドメインと結合させることにより、作製したものを用いた。
ES細胞(KhES-3株)は、京都大学再生医科学研究所から入手した。
iPS細胞(Ffl-01株およびFfl-14株)は、Nakagawa M, et al., Sci Rep. 4:3594(2014)に記載の方法で樹立されたものを用いた（末梢血の単核球由来（ただしT細胞及びB細胞以外））。なお、Ffl-14株は、Ffl-01株と同じドナーから樹立された別クローンである。
iPS細胞(GPC3#16株)は、末梢血単核球から分離された抗原特異的Tリンパ球から、Nishimura T, et al., Cell Stem Cell. 12(1) : 114-126, 2013に記載の方法を用いて樹立されたものを用いた。
iPS細胞（Ff-I01 GC33株)は、Ff-I01株にウイルスベクターを用いてキメラ抗原受容体(Chimeric Antigen Receptor : CAR)を導入したものを用いた。CARは、抗CD19抗体の抗原認識部位をクローニングし、CD3分子の細胞内ドメインと結合させることにより、作製したものを用いた。
ES細胞(KhES-3株)は、京都大学再生医科学研究所から入手した。
＜実施例１＞
超低接着処理された6well plate(CORNING社：#3471)にTkT3V1-7、FfI-01、Ffl-14またはKhES-3を3x105～6x105個／ウェルで播種し(Day0)、EB培地(StemPro34に10 μg/ml ヒトインスリン、5.5μg/ml ヒトトランスフェリン、5ng/ml 亜セレン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン、45mM α-モノチオグリセロール、および50 μg/ml アスコルビン酸を添加)に10 ng/ml BMP4、5ng/ml bFGF、 15ng/ml VEGF、2μM SB431542、を加えて、低酸素条件下(5% O2)にて5日間培養を行った(Day5)。
続いて、50ng/ml SCF、30ng/ml TPO、10ng/ml Flt3Lを添加し、さらに5～9日間培養を行った(～Day14)。
得られた造血前駆細胞は、Fc-DLL4(5μg/ml) （Sino Biological Inc.）およびRetronectin(5μg/ml) （タカラバイオ株式会社）でコーティングした48well plate上で、50ng/ml SCF、50ng/ml IL-7、50ng/ml Flt3L、100ng/ml TPO、15μM SB203580（Tocris Bioscience）、30 ng/ml SDF-1α（PeproTech）を添加したOP9培地(15% FBS、2mM L-グルタミン、100Uml ペニシリン、100ng/ml ストレプトマイシン、55μM 2-メルカプトエタノール、50μg/ml アスコルビン酸、10 μg/ml ヒトインスリン、5.5 μg/ml ヒトトランスフェリン、5ng/ml 亜セレン酸ナトリウム)中で21日間培養を行った(Day35)。
Day35にて、CD45(+)、CD3(+)、CD4(+)、CD8(+)分画をFACSを用いて単離し、CD4CD8両陽性(Double positive)細胞(DP細胞という)を得た。
結果を図１（TKT3v 1-7）、図２（Ffl-01）、図３（Ffl-14）、図４（KhES-3）に示す。なお、それぞれの図の上段は、造血前駆細胞を培養する際にSB203580とSDF-1αを加えずに培養を行った結果を示す。これらの結果より、iPS細胞やES細胞などの多能性幹細胞から造血前駆細胞を誘導し、これをp38阻害剤とSDF-1を含む培地で培養することにより、効率よくCD4CD8両陽性T細胞が得られることが分かった。
なお、上記と同様の手順でTKT3v 1-7株の培養をSB203580とSDF-1αを含まない培地、SB203580を含む培地、SDF-1αを含む培地、SB203580とSDF-1αを含む培地のそれぞれで行ったところ、p38阻害剤とSDF-1の効果はそれら単独でも発揮されることが分かった（図５）。
超低接着処理された6well plate(CORNING社：#3471)にTkT3V1-7、FfI-01、Ffl-14またはKhES-3を3x105～6x105個／ウェルで播種し(Day0)、EB培地(StemPro34に10 μg/ml ヒトインスリン、5.5μg/ml ヒトトランスフェリン、5ng/ml 亜セレン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン、45mM α-モノチオグリセロール、および50 μg/ml アスコルビン酸を添加)に10 ng/ml BMP4、5ng/ml bFGF、 15ng/ml VEGF、2μM SB431542、を加えて、低酸素条件下(5% O2)にて5日間培養を行った(Day5)。
続いて、50ng/ml SCF、30ng/ml TPO、10ng/ml Flt3Lを添加し、さらに5～9日間培養を行った(～Day14)。
得られた造血前駆細胞は、Fc-DLL4(5μg/ml) （Sino Biological Inc.）およびRetronectin(5μg/ml) （タカラバイオ株式会社）でコーティングした48well plate上で、50ng/ml SCF、50ng/ml IL-7、50ng/ml Flt3L、100ng/ml TPO、15μM SB203580（Tocris Bioscience）、30 ng/ml SDF-1α（PeproTech）を添加したOP9培地(15% FBS、2mM L-グルタミン、100Uml ペニシリン、100ng/ml ストレプトマイシン、55μM 2-メルカプトエタノール、50μg/ml アスコルビン酸、10 μg/ml ヒトインスリン、5.5 μg/ml ヒトトランスフェリン、5ng/ml 亜セレン酸ナトリウム)中で21日間培養を行った(Day35)。
Day35にて、CD45(+)、CD3(+)、CD4(+)、CD8(+)分画をFACSを用いて単離し、CD4CD8両陽性(Double positive)細胞(DP細胞という)を得た。
結果を図１（TKT3v 1-7）、図２（Ffl-01）、図３（Ffl-14）、図４（KhES-3）に示す。なお、それぞれの図の上段は、造血前駆細胞を培養する際にSB203580とSDF-1αを加えずに培養を行った結果を示す。これらの結果より、iPS細胞やES細胞などの多能性幹細胞から造血前駆細胞を誘導し、これをp38阻害剤とSDF-1を含む培地で培養することにより、効率よくCD4CD8両陽性T細胞が得られることが分かった。
なお、上記と同様の手順でTKT3v 1-7株の培養をSB203580とSDF-1αを含まない培地、SB203580を含む培地、SDF-1αを含む培地、SB203580とSDF-1αを含む培地のそれぞれで行ったところ、p38阻害剤とSDF-1の効果はそれら単独でも発揮されることが分かった（図５）。
＜実施例２＞
臍帯血由来のCD34陽性造血前駆細胞（HemaCare社 #CBCD34C-1）を、実施例１のiPS細胞由来の造血前駆細胞と同様に、Fc-DLL4(5μg/ml)およびRetronectin(5μg/ml)でコーティングした48well plate上で、50ng/ml SCF、50ng/ml IL-7、50ng/ml Flt3L、100ng/ml TPO、15μM SB203580、30 ng/ml SDF-1αを添加したOP9培地中で21日間培養を行った(Day35)。Day35にて、CD45(+)、CD3(+)、CD4(+)、CD8(+)分画をFACSを用いて単離し、CD4CD8両陽性(Double positive)細胞(DP細胞という)を得た。結果を図６に示す。なお、図６の上段は、造血前駆細胞を培養する際にSB203580とSDF-1αを加えずに培養を行った結果を示す。これらの結果より、臍帯血由来のCD34陽性造血前駆細胞を用いた場合でも、p38阻害剤とSDF-1を含む培地で培養することにより、効率よくCD4CD8両陽性T細胞が得られることが分かった。
臍帯血由来のCD34陽性造血前駆細胞（HemaCare社 #CBCD34C-1）を、実施例１のiPS細胞由来の造血前駆細胞と同様に、Fc-DLL4(5μg/ml)およびRetronectin(5μg/ml)でコーティングした48well plate上で、50ng/ml SCF、50ng/ml IL-7、50ng/ml Flt3L、100ng/ml TPO、15μM SB203580、30 ng/ml SDF-1αを添加したOP9培地中で21日間培養を行った(Day35)。Day35にて、CD45(+)、CD3(+)、CD4(+)、CD8(+)分画をFACSを用いて単離し、CD4CD8両陽性(Double positive)細胞(DP細胞という)を得た。結果を図６に示す。なお、図６の上段は、造血前駆細胞を培養する際にSB203580とSDF-1αを加えずに培養を行った結果を示す。これらの結果より、臍帯血由来のCD34陽性造血前駆細胞を用いた場合でも、p38阻害剤とSDF-1を含む培地で培養することにより、効率よくCD4CD8両陽性T細胞が得られることが分かった。
実施例１および実施例２において、FACS解析の際に、血球計算盤（ワケンテービック株式会社：#WC2-100）を用いて総細胞数を計測した（この数値には、CD4CD8両陽性細胞以外の集団も含まれる）。その結果、図７に示すように、SB203580とSDF-1αを加えて培養を行うことにより、顕著に細胞数が増加することが分かった。
＜実施例３＞
iPS細胞としてH25-4、H25-31、またはGPC3#16を用い、実施例１と同様の方法で培養を行うことによりCD4CD8両陽性細胞を得た。得られたCD4CD8両陽性細胞を副腎皮質ホルモン剤(富士製薬工業株式会社 : 10171-H02H)を添加した培養液中で抗CD3抗体(eBioscience : 16-0037-85)を用いて刺激することにより、図８に示すように、CD8陽性T細胞（CD8陽性Tリンパ球）を得ることができた。
iPS細胞としてH25-4、H25-31、またはGPC3#16を用い、実施例１と同様の方法で培養を行うことによりCD4CD8両陽性細胞を得た。得られたCD4CD8両陽性細胞を副腎皮質ホルモン剤(富士製薬工業株式会社 : 10171-H02H)を添加した培養液中で抗CD3抗体(eBioscience : 16-0037-85)を用いて刺激することにより、図８に示すように、CD8陽性T細胞（CD8陽性Tリンパ球）を得ることができた。
得られたCD8陽性Tリンパ球を、それぞれのT細胞受容体が特異的に認識して結合するテトラマー(H25-4、H25-31)あるいはデキストラマー(GPC3#16)で染色しFACS解析を行った。その結果、図９に示すように、上記で得られたCD8陽性T細胞は、特異的な抗原に対する反応性を有していることがわかった。
また、上記で得られたCD8陽性Tリンパ球を、それぞれが特異的に認識する抗原を発現するがん細胞株と共培養し、51Crリリースアッセイにより免疫反応性を評価した。その結果、図１０に示すように、H25-4株およびH25-31株は、特異的に認識するペプチド（NefあるいはGAG）を提示したがん細胞株に対して、特異的かつ高い効率で細胞傷害免疫反応を示していることが分かった。また、GPC3#16株は、遺伝子導入によりGPC3抗原を発現させたがん細胞株に対して高い細胞傷害免疫反応を示していることが分かった。
＜実施例４＞
iPS細胞としてFf-I01株に人工抗原受容体(CAR)を導入したFf-I01 GC33株を用い、実施例１と同様の方法で培養を行うことによりCD4CD8両陽性細胞を得た。その結果、図１１に示すように、CARを導入したiPS細胞でも、SB203580とSDF-1を含む培地で培養することにより、効率よくCD4CD8両陽性細胞が得られることが分かった。
iPS細胞としてFf-I01株に人工抗原受容体(CAR)を導入したFf-I01 GC33株を用い、実施例１と同様の方法で培養を行うことによりCD4CD8両陽性細胞を得た。その結果、図１１に示すように、CARを導入したiPS細胞でも、SB203580とSDF-1を含む培地で培養することにより、効率よくCD4CD8両陽性細胞が得られることが分かった。
Claims (19)
- ヒトの造血前駆細胞を、p38阻害剤、SDF－1、SCF、TPO（トロンボポエチン）、FLT-3L
及びIL-7を含有する培養液中で培養し、CD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程を含む、CD4CD8両陽性T細胞の製造方法。 - 前記p38阻害剤は、SB203580である、請求項１に記載の方法。
- 前記工程において、培養液はビタミンC類を含有する、請求項１または２に記載の方法
。 - 前記工程は、接着培養で行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記造血前駆細胞はフィーダー細胞を用いることなく培養される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記造血前駆細胞は多能性幹細胞から分化誘導された造血前駆細胞である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項６に記載の方法。
- 人工多能性幹細胞がT細胞以外の体細胞に由来する、請求項７に記載の方法。
- 人工多能性幹細胞がキメラ抗原受容体が導入された人工多能性幹細胞である、請求項７または８に記載の方法。
- 以下の工程を含む、CD4CD8両陽性T細胞の製造方法；
（１）ヒトの多能性幹細胞を培養液中で培養し、造血前駆細胞を誘導する工程、
（２）前記工程（１）で得られた造血前駆細胞を、p38阻害剤、SDF－1、SCF、TPO（トロ
ンボポエチン）、FLT-3L及びIL-7を含有する培養液中で培養し、CD4CD8両陽性T細胞を誘
導する工程。 - 前記p38阻害剤は、SB203580である、請求項１０に記載の方法。
- 前記工程（１）は、浮遊培養で行われる、請求項１０または１１に記載の方法。
- 前記工程（２）は、接着培養で行われる、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記工程（１）および（２）において、培養液はビタミンC類を含有する、請求項１０
～１３のいずれか一項に記載の方法。 - 前記工程（１）および（２）において、培養はフィーダー細胞を用いることなく行われる、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の方法。
- 多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の方法。
- 人工多能性幹細胞がT細胞以外の体細胞に由来する、請求項１６に記載の方法。
- 人工多能性幹細胞がキメラ抗原受容体が導入された人工多能性幹細胞である、請求項１６または１７に記載の方法。
- 請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法によりCD4CD8両陽性T細胞を製造する工程
、および得られたCD4CD8両陽性T細胞を副腎皮質ホルモン剤を添加した培養液中で培養し
てCD8陽性T細胞を得る工程を含む、CD8陽性T細胞の製造方法。
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