JP7060417B2 - Compounds and traction oils - Google Patents
Compounds and traction oils Download PDFInfo
- Publication number
- JP7060417B2 JP7060417B2 JP2018045352A JP2018045352A JP7060417B2 JP 7060417 B2 JP7060417 B2 JP 7060417B2 JP 2018045352 A JP2018045352 A JP 2018045352A JP 2018045352 A JP2018045352 A JP 2018045352A JP 7060417 B2 JP7060417 B2 JP 7060417B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- formula
- botriocossen
- compound
- sequence
- traction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Lubricants (AREA)
Description
本開示は化合物及びトラクション油に関する。 The present disclosure relates to compounds and traction oils.
従来、ボトリオコッセンは、バイオ燃料等の様々な用途への利用が研究されている。ボトリオコッセンは、化学合成が困難な天然化合物である。非特許文献１には、ボトリオコッセンの合成に関する遺伝子を酵母に導入することによってボトリオコッセンを合成する方法が開示されている。
Conventionally, botriocossen has been studied for use in various applications such as biofuels. Botriokossen is a natural compound that is difficult to chemically synthesize. Non-Patent
ボトリオコッセンを、トラクション機構用のトラクション油として用いることが考えられる。しかしながら、従来のボトリオコッセンは、トラクション係数が十分に大きくなかった。本開示は、トラクション係数が大きい化合物及びトラクション油を提供する。 It is conceivable to use botriocossen as a traction oil for a traction mechanism. However, the conventional Botriokossen did not have a sufficiently large traction coefficient. The present disclosure provides compounds and traction oils with high traction coefficients.
本開示の一態様は、式（１Ａ）又は式（１Ｂ）で表される化合物。式（１Ａ）及び式（１Ｂ）におけるＲは、水素原子、及び炭素数１～３のアルキル基のうちのいずれかである。 One aspect of the present disclosure is a compound represented by the formula (1A) or the formula (1B). R in the formula (1A) and the formula (1B) is any one of a hydrogen atom and an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
本開示の他の態様は、式（２Ａ）又は式（２Ｂ）で表される化合物である。式（２Ａ）及び式（２Ｂ）におけるＲは水素原子、及び炭素数１～３のアルキル基のうちのいずれかである。
本開示の他の態様は、式（３Ａ）又は式（３Ｂ）で表される化合物。式（３Ａ）及び式（３Ｂ）におけるＲは、水素原子、及び炭素数１～３のアルキル基のうちのいずれかである。
なお、特許請求の範囲に記載した括弧内の符号は、一つの態様として後述する実施態様に記載の具体的手段との対応関係を示すものであって、本開示の技術的範囲を限定するものではない。
Another aspect of the present disclosure is a compound of formula (3A) or formula (3B). R in the formula (3A) and the formula (3B) is any one of a hydrogen atom and an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
The reference numerals in parentheses described in the claims indicate, as one embodiment, the correspondence with the specific means described in the embodiments described later, and limit the technical scope of the present disclosure. is not.
本開示の実施態様を説明する。
１．第１の化合物の構成
本開示の第１の化合物は式（１Ａ）又は式（１Ｂ）で表される。式（１Ａ）及び式（１Ｂ）におけるＲは、水素原子、及び炭素数１～３のアルキル基のうちのいずれかである。
1. 1. Composition of First Compound The first compound of the present disclosure is represented by the formula (1A) or the formula (1B). R in the formula (1A) and the formula (1B) is any one of a hydrogen atom and an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
第１の化合物の例として、式（４Ａ）又は式（４Ｂ）で表される化合物が挙げられる。式（４Ａ）で表される化合物は、式（１Ａ）で表される化合物において、Ｒを炭素数１のアルキル基としたものである。式（４Ｂ）で表される化合物は、式（１Ｂ）で表される化合物において、Ｒを炭素数１のアルキル基としたものである。式（４Ａ）又は式（４Ｂ）で表される化合物はＣ３５ボトリオコッセンである。
２．第２の化合物及び第３の化合物の構成
本開示の第２の化合物は式（２Ａ）又は式（２Ｂ）で表される。式（２Ａ）及び式（２Ｂ）におけるＲは、水素原子、及び炭素数１～３のアルキル基のうちのいずれかである。
第２の化合物の例として、式（５Ａ）又は式（５Ｂ）で表される化合物が挙げられる。式（５Ａ）で表される化合物は、式（２Ａ）で表される化合物において、Ｒを炭素数１のアルキル基としたものである。式（５Ｂ）で表される化合物は、式（２Ｂ）で表される化合物において、Ｒを炭素数１のアルキル基としたものである。式（５Ａ）又は式（５Ｂ）で表される化合物はＣ４０ボトリオコッセンである。
本開示の第３の化合物は式（３Ａ）又は式（３Ｂ）で表される。式（３Ａ）及び式（３Ｂ）におけるＲは、水素原子、及び炭素数１～３のアルキル基のうちのいずれかである。
第３の化合物の例として、式（６Ａ）又は式（６Ｂ）で表される化合物が挙げられる。式（６Ａ）で表される化合物は、式（３Ａ）で表される化合物において、Ｒを炭素数１のアルキル基としたものである。式（６Ｂ）で表される化合物は、式（３Ｂ）で表される化合物において、Ｒを炭素数１のアルキル基としたものである。式（６Ａ）又は式（６Ｂ）で表される化合物はＣ４５ボトリオコッセンである。
３．トラクション油の構成
トラクション油は、第１の化合物、第２の化合物、及び第３の化合物から成る群から選択される１以上を含む。トラクション油は、第１の化合物、第２の化合物、及び第３の化合物のいずれでもない成分をさらに含んでいてもよい。トラクション油は、例えば、第１の化合物、第２の化合物、及び第３の化合物から成る群から選択される１以上を主成分とする。主成分とは、質量比において、トラクション油の５０質量％以上を占めることを意味する。
3. 3. Composition of Traction Oil A traction oil comprises one or more selected from the group consisting of a first compound, a second compound, and a third compound. The traction oil may further contain a component that is neither the first compound, the second compound, nor the third compound. The traction oil contains, for example, one or more selected from the group consisting of a first compound, a second compound, and a third compound as a main component. The main component means that it occupies 50% by mass or more of the traction oil in terms of mass ratio.
４．実施例１
４．１ 変異株の作製
４．１．１ ベクターの作成
pUC18をベースとし、定常プロモータの下流に、MH1株由来のボトリオコッセン合成酵素を挿入し、ベクター（以下では、pUC18m-MHSSL1his-MHSSL3hisとする）を得た。MH1株由来のボトリオコッセン合成酵素は、MHSSL-1、MHSSL-3である。なお、MHSSL-1を、SSL1またはSSL-1と表記することもある。また、MHSSL-3を、SSL3またはSSL-3と表記することもある。
4. Example 1
4.1 Preparation of mutant strain 4.1.1 Preparation of vector
Based on pUC18, a botriocossen synthase derived from the MH1 strain was inserted downstream of the steady promoter to obtain a vector (hereinafter referred to as pUC18m-MHSSL1his-MHSSL3his). The botriocossen synthases derived from the MH1 strain are MHSSL-1 and MHSSL-3. MHSSL-1 may be referred to as SSL1 or SSL-1. In addition, MHSSL-3 may be referred to as SSL3 or SSL-3.
SSL1、SSL3は、ともに、C末端にHis6（ヒスチジンタグ）を付している。SSL1、SSL3については後述する。pUC18m-MHSSL1his-MHSSL3hisを図１に示す。pUC18m-MHSSL1his-MHSSL3hisの核酸塩基配列は配列番号１の配列である。MHSSL-1により変換されるアミノ酸の配列を配列番号８に示す。MHSSL-3により変換されるアミノ酸の配列を配列番号９に示す。 Both SSL1 and SSL3 have His 6 (histidine tag) at the C-terminus. SSL1 and SSL3 will be described later. pUC18m-MHSSL1his-MHSSL3his is shown in FIG. The nucleic acid base sequence of pUC18m-MHSSL1his-MHSSL3his is the sequence of SEQ ID NO: 1. The sequence of amino acids converted by MHSSL-1 is shown in SEQ ID NO: 8. The sequence of amino acids converted by MHSSL-3 is shown in SEQ ID NO: 9.
また、pACYC184をベースとして作製したpAC-CrtE（Furubayshi, et al., Nature Communications：(2015)）では、lacプロモータ（operatorフリー）の下流にCrtE遺伝子（Pantoea ananatis由来のCrtE遺伝子）が構成的発現する構成となっている。このプラスミドに、lacP/lacO-人工rbs-Isopentenyl diphosphate isomerase (IDI、大腸菌由来)を挿入し、ベクター（以下では、pAC-CrtE-idiとする）を得た。pAC-CrtE-idiを図２に示す。pAC-CrtE-idiの核酸塩基配列は配列番号２の配列である。
SSL1、SSL3は以下の方法で得られる。
In pAC-CrtE (Furubayshi, et al., Nature Communications: (2015)) prepared based on pACYC184, the CrtE gene (CrtE gene derived from Pantoea ananatis) is constitutively expressed downstream of the lac promoter (operator-free). It is configured to do. A lacP / lacO-artificial rbs-Isopentenyl diphosphate isomerase (IDI, derived from Escherichia coli) was inserted into this plasmid to obtain a vector (hereinafter referred to as pAC-CrtE-idi). The pAC-CrtE-idi is shown in FIG. The nucleic acid base sequence of pAC-CrtE-idi is the sequence of SEQ ID NO: 2.
SSL1 and SSL3 can be obtained by the following methods.
（１）野生株の培養と選抜
・野生株の単離
株の採集場所：愛知県みよし市保田ヶ池
培地：AF-6培地
培養期間：１か月
上記条件で採集、培養したボトリオコッカス・ブラウニー株の中で、容器内で水面上に浮いた細胞をピペットで単離した。
(1) Culturing and selection of wild strains ・ Isolation of wild strains Collection place of strains: Yasudagaike, Miyoshi City, Aichi Prefecture Medium: AF-6 medium Culturing period: 1 month Botriococcus collected and cultured under the above conditions. In the Brownie strain, cells floating on the surface of the water in the container were isolated with a pipette.
・株の培養
通気条件：1%CO2
光源：蛍光灯
培地：AF-6培地
上記条件で培養し増殖させた。
・ Strain culture Aeration conditions: 1% CO 2
Light source: Fluorescent lamp Medium: AF-6 medium The cells were cultured and grown under the above conditions.
・オイル分析
抽出溶媒：ヘキサン
増殖した藻体にヘキサンを添加し、オイル成分を抽出した。
GC-MSにてオイルを定性分析し、ボトリオコッセンを生産する株を選抜し、MH1株と名付けた。
-Oil analysis Extraction solvent: Hexane Hexane was added to the grown algae to extract the oil component.
The oil was qualitatively analyzed by GC-MS, and the strain that produced botriocossen was selected and named MH1 strain.
・選抜株の培養
株名：MH1株
培養容器：１Lガラス培養瓶
期間：３週間
培地：AF-6培地
通気条件：1%CO2
温度：25℃室温
光量：150μmol photons/m2/sec
上記培養条件下で通気培養し、培養開始から14日目の培養液を80mL回収しRNA抽出に用いた。
・ Culturing of selected strains Strain name: MH1 strain Culture container: 1L glass culture bottle Period: 3 weeks Medium: AF-6 medium Aeration conditions: 1% CO 2
Temperature: 25 ° C Room temperature Light intensity: 150 μmol photons / m 2 / sec
After aeration culture under the above culture conditions, 80 mL of the
（２）RNA抽出
・細胞の回収
回収した培養液を9000rpm 15分間遠心分離し、上清を捨てた。
滅菌水を加え撹拌し、再度遠心分離し上清を捨てた。
細胞を含む沈殿物を凍結用のチューブへ移し、液体窒素で凍結させたのちに-80℃で保管した。
(2) RNA extraction / recovery of cells The collected culture solution was centrifuged at 9000 rpm for 15 minutes, and the supernatant was discarded.
Sterile water was added, the mixture was stirred, and the mixture was centrifuged again and the supernatant was discarded.
The precipitate containing cells was transferred to a freezing tube, frozen in liquid nitrogen, and then stored at -80 ° C.
・RNA抽出
使用キット：QIAGEN社製のRNeasy Plant Mini Kit
付属のプロトコールに従ってRNA抽出を実施した。(ただし下記ではプロトコールからの抜粋を一部修正している。)
・ RNA extraction kit: R Easy Plant Mini Kit manufactured by QIAGEN
RNA extraction was performed according to the attached protocol. (However, some excerpts from the protocol have been modified below.)
(i)-80℃で保管したサンプル 50ｍｇ程度を液体窒素中で凍結を維持した状態ですりつぶした。
(ii)すりつぶしたサンプルを液体窒素の入った2mLチューブに移し、100mgのサンプルに対してBuffer RLT 450 μlを添加し、ボルテックスで激しく撹拌した。
(iii)2 mlのコレクションチューブにセットしたQIAshredderスピンカラム（薄紫色）にライセートを添加し、20000 x gで2分間遠心操作した。QIAshredderからのろ液の上清を、コレクションチューブ中の細胞破片ペレットを乱さないように新しいチューブに移した。
(iv)清澄化したライセートに1:1となるようにRNA専用のエタノール（96～100％）を添加し、すぐに ピペッティングにより混和した。サンプル650 μLを、2 mlコレクションチューブにセッティングしたRNeasyスピンカラム（ピンク）にアプライした。
(v)蓋を静かに閉めて、8000 x gで15秒間遠心操作し、ろ液を捨てた。
(i) About 50 mg of a sample stored at -80 ° C was ground in liquid nitrogen while maintaining freezing.
(ii) The ground sample was transferred to a 2 mL tube containing liquid nitrogen, 450 μl of Buffer RLT was added to a 100 mg sample, and the mixture was vigorously stirred with a vortex.
(iii) Lysate was added to a QIA shredder spin column (light purple) set in a 2 ml collection tube and centrifuged at 20000 xg for 2 minutes. The supernatant of the filtrate from the QIA shredder was transferred to a new tube without disturbing the cell debris pellets in the collection tube.
(iv) RNA-specific ethanol (96-100%) was added to the clarified lysate in a ratio of 1: 1 and immediately mixed by pipetting. 650 μL of sample was applied to an RNeasy spin column (pink) set in a 2 ml collection tube.
(v) The lid was gently closed, centrifuged at 8000 xg for 15 seconds, and the filtrate was discarded.
(vi)700 μlのBuffer RW1をRNeasyスピンカラムに添加した。
(vii)蓋を静かに閉め、スピンカラム・メンブレン洗浄のために8000 x gで15秒間遠心し、ろ液を捨てた。
(viii)RNeasyスピンカラムに500 μlのBuffer RPEを添加した。
(iX)蓋を静かに閉め、スピンカラム・メンブレン洗浄のために8000 x gで15秒間遠心し、ろ液を捨てた。
(x)前記(viii)～（ix)の操作をもう一度繰り返した。
(xi)RNeasyスピンカラムを新しい1.5 mlコレクションチューブにセットした、RNaseフリー水50 μlを直接スピンカラム・メンブレンに添加した。
(xii)蓋を静かに閉め、8000 x gで 1分間遠心操作を行ない、 RNAを溶出した。
(xiii)溶出した液をMH1株のトータルRNAとして得た。
(vi) 700 μl of Buffer RW1 was added to the RNeasy spin column.
(vii) The lid was gently closed, centrifuged at 8000 xg for 15 seconds to wash the spin column membrane, and the filtrate was discarded.
(viii) 500 μl of Buffer RPE was added to the RNeasy spin column.
(iX) The lid was gently closed, centrifuged at 8000 xg for 15 seconds to wash the spin column membrane, and the filtrate was discarded.
(x) The above operations (viii) to (ix) were repeated once again.
(xi) 50 μl of RNase-free water with the RNeasy spin column set in a new 1.5 ml collection tube was added directly to the spin column membrane.
(xii) The lid was gently closed, and centrifugation was performed at 8000 xg for 1 minute to elute RNA.
(xiii) The eluted solution was obtained as total RNA of MH1 strain.
（３)シーケンスライブラリーの作製
使用キット：イルミナ社製 TruSeq Small RNA Sample Prep Kit及びTruSeq RNA Sample Preparation Kit v2
使用試薬：
タカラバイオ社製 アルカリホスファターゼ
タカラバイオ社製 T4ポリヌクレオチドキナーゼ
NEB社製 T4 RNA ligase 2,truncated
(3) Preparation of sequence library Use kit: Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kit and TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2
Reagents used:
Takara Bio Alkaline Phosphatase Takara Bio T4 Polynucleotide Kinase
NEB
(i)抽出したトータルRNA 8μgからPolyA+ RNAを単離した。
(ii)PolyA+ RNAを断片化し、アルカリホスファターゼで処理した後、ATPとT4ポリヌクレオチドキナーゼを用い、5’末端をリン酸化した。
(iii)リン酸化処理したRNA断片の3’末端にT4 RNA ligase 2，truncatedを用いてRNA 3‘アダプターを連結した後、5’末端にATPとT4 RNAリガーゼを用いてRNA ５’アダプターを連結した。
(iv)RNA 3‘アダプターを認識するプライマーを用いた転写反応により、一本鎖cDNAを合成した。合成した一本鎖cDNAを鋳型とし、インデックス付プライマーを用いて15サイクルのPCRによる増幅を行った。得られたPCR産物を、6％ポリアクリルアミドゲルを用い電気泳動によりサイズ選別し、シーケンスライブラリーとした。
(v)作製されたシーケンスライブラリーの品質をAgilent 2100 Bioanalyzerを用いて測定した。
(vi)シーケンスライブラリーのピークサイズは308bpのシングルピークであり、濃度は16.8nmol/lであった。
(i) PolyA + RNA was isolated from 8 μg of the extracted total RNA.
(ii) PolyA + RNA was fragmented, treated with alkaline phosphatase, and then phosphorylated at the 5'end using ATP and T4 polynucleotide kinase.
(iii) After ligating the RNA 3'adapter to the 3'end of the phosphorylated RNA fragment using
(iv) Single-stranded cDNA was synthesized by a transcription reaction using a primer that recognizes the RNA 3'adapter. Using the synthesized single-stranded cDNA as a template, amplification was performed by PCR for 15 cycles using indexed primers. The obtained PCR products were sized by electrophoresis using a 6% polyacrylamide gel and used as a sequence library.
(v) The quality of the prepared sequence library was measured using an Agilent 2100 Bioanalyzer.
(vi) The peak size of the sequence library was a single peak of 308 bp, and the concentration was 16.8 nmol / l.
（４）塩基配列の獲得
・塩基配列の獲得
作製したシーケンスライブラリーを用いて、鋳型ＤＮＡの塩基配列を取得した。
表１のイルミナ社のマニュアルを参考に、表２に記載のイルミナ社の機器、試薬、ソフトウェアを用いてシーケンスデータを解析し、fastq形式ファイルとして出力した。
シーケンスデータの解析により、リード数102,018,468個、解析鎖長10,201,846,800bpの塩基配列情報を得た。
(4) Acquisition of base sequence / acquisition of base sequence The base sequence of the template DNA was obtained using the prepared sequence library.
The sequence data was analyzed using the Illumina equipment, reagents, and software shown in Table 2 with reference to the Illumina manual in Table 1, and output as a fastq format file.
Nucleobase sequence information with 102,018,468 reads and 10,201,846,800 bp analysis chain length was obtained by analyzing the sequence data.
・De novoアセンブリ
使用ソフトウェア：株式会社CLCバイオジャパン社製 CLC Genomics Workbench 6.5.1
上記ソフトウェアを用い、fastq形式のファイルを読み込み、ペア配列に変換した後、低クオリティー部分の配列、Ｎ表示される塩基の配列、75塩基以下の配列を除去し、フィルタリングを行った。
その後、ペアが壊れた配列、重複断片を除去し、de novoアセンブリにより、308bpの35,809種類のコンティグを作製した。
De novoアセンブリの条件は以下である。
・ De novo assembly Software used: CLC Genomics Workbench 6.5.1 manufactured by CLC Bio Japan Co., Ltd.
Using the above software, a file in fastq format was read and converted into a pair sequence, and then the sequence of the low quality part, the sequence of the base displayed as N, and the sequence of 75 bases or less were removed and filtered.
The pair was then broken, stripped of duplicates, and de novo assembly to create 308 bp 35,809 contigs.
The conditions for the De novo assembly are as follows.
De novoアセンブリの条件
Ambiguous trim = Yes
Ambiguous limit = 0
Quality trim = Yes
Quality limit = 0.00035
Create report = Yes
Save discarded sequences = No
Remove 5’ terminal nucleotides = No
Maximum number of nucleotides in reads = 1,000
Minimum number of nucleotides in reads = 97
Discard short reads = Yes
Remove 3’ terminal nucleotides = No
Discard long reads = Yes
Save broken pairs = No
De novo assembly conditions
Ambiguous trim = Yes
Ambiguous limit = 0
Quality trim = Yes
Quality limit = 0.00035
Create report = Yes
Save discarded sequences = No
Remove 5'terminal nucleotides = No
Maximum number of nucleotides in reads = 1,000
Minimum number of nucleotides in reads = 97
Discard short reads = Yes
Remove 3'terminal nucleotides = No
Discard long reads = Yes
Save broken pairs = No
・該当配列の獲得
プレスクアレン二リン酸合成酵素遺伝子としてshowa株由来のSSL-1遺伝子(SHSSL-1遺伝子と称する)(GenBank:HQ585058.1)、ボトリオコッセン合成酵素遺伝子としてshowa株由来のSHSSL-3(GenBank:HQ585060.1)遺伝子が知られている。
得られたコンティグをもとにBLAST Databaseを構築し、既知のSHSSL-1遺伝子及びSHSSL-3遺伝子をクエリー配列とし、TBLASTXを用いた相同遺伝子検索を行った。それぞれの全長ORFと89%、87%の相同性を持つ配列を得ることができた。
以上のようにして、MH1株から単離したSSL-1遺伝子(MHSSL-1遺伝子と称する)およびSSL-3遺伝子(MHSSL-3遺伝子と称する)が得られた。SSL-1遺伝子(MHSSL-1)の核酸塩基配列は配列番号６である。SSL-3遺伝子(MHSSL-3)の核酸塩基配列は配列番号７である。
-Acquisition of the relevant sequence The SSL-1 gene derived from the showa strain (referred to as the SHSSL-1 gene) (GenBank: HQ585058.1) as the presqualene diphosphate synthase gene, and the SHSSL-3 derived from the showa strain as the botriocossen synthase gene. (GenBank: HQ585060.1) The gene is known.
A BLAST Database was constructed based on the obtained contigs, and a homologous gene search using TBLASTX was performed using the known SHSSL-1 gene and SHSSL-3 gene as query sequences. We were able to obtain sequences with 89% and 87% homology with the respective full-length ORFs.
As described above, the SSL-1 gene (referred to as MHSSL-1 gene) and the SSL-3 gene (referred to as MHSSL-3 gene) isolated from the MH1 strain were obtained. The nucleic acid base sequence of the SSL-1 gene (MHSSL-1) is SEQ ID NO: 6. The nucleic acid base sequence of the SSL-3 gene (MHSSL-3) is SEQ ID NO: 7.
４．１．２ 一塩基置換の方法
４．１．２．１ プライマー
SSL3に対し、ヒトスクアレン合成酵素のサイズ特異性を大きなサイズのものにシフトさせた変異を導入した。変異はヒトスクアレン合成酵素のF288Aに相当し、SSL3ではF285Aとなる。使用したプライマーは、ssl3-F285A F（配列番号３）とssl3-F285A R（配列番号４）とである。
4.1.2 Method of single base substitution 4.1.2.1 Primer
A mutation was introduced into SSL3 that shifted the size specificity of human squalene synthase to a larger size. The mutation corresponds to F288A of human squalene synthase, and becomes F285A in SSL3. The primers used were ssl3-F285A F (SEQ ID NO: 3) and ssl3-F285A R (SEQ ID NO: 4).
４．１．２．２ 部位特異的変異導入の方法
部位特異的変異を、図３に示す方法で作成した。すなわち、SSL3にF285Aアミノ酸置換つまりヒトスクアレン合成酵素のF288A相当のアミノ酸置換を導入した。この方法は、FASTR法である。導入後の核酸塩基配列は配列番号５の配列である。導入後の核酸塩基配列に対応するアミノ酸配列は配列番号１０である。
4.1.2.2 Method of introducing site-specific mutations Site-specific mutations were created by the method shown in FIG. That is, F285A amino acid substitution, that is, amino acid substitution equivalent to F288A of human squalene synthase was introduced into SSL3. This method is the FASTR method. The nucleic acid base sequence after introduction is the sequence of SEQ ID NO: 5. The amino acid sequence corresponding to the nucleobase sequence after introduction is SEQ ID NO: 10.
４．１．２．３ ＰＣＲ条件
ＰＣＲ条件は以下のとおりとした。
KOD Plus Ver2 TYB、KOD-211、使用量 1 U
10 × KOD Plus Ver2 buffer
組成： 60 mM (NH4)2SO4, 100 mM KCl, 1.2 M Tris-HCl(pH 8.8 at 25℃), 1% Triton X-100, 0.01% BSA, MgSO4：1.5 mM,dNTP：0.2 mM
温度プロトコル：94℃(5 min) → {94℃(15 sec)/51℃(15 sec)/68℃(5 mins)} x 25 cycles → 68℃ (10sec)
PCR増幅率：25倍（template濃度：100 ng， 最終収率： 2500 ng）
4.1.2.3 PCR conditions The PCR conditions were as follows.
KOD Plus Ver2 TYB, KOD-211, usage 1 U
10 × KOD Plus Ver2 buffer
Composition: 60 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 100 mM KCl, 1.2 M Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C), 1% Triton X-100, 0.01% BSA, DDL4: 1.5 mM, dNTP: 0.2 mM
Temperature protocol: 94 ° C (5 min) → {94 ° C (15 sec) / 51 ° C (15 sec) / 68 ° C (5 mins)} x 25 cycles → 68 ° C (10 sec)
PCR amplification factor: 25 times (template concentration: 100 ng, final yield: 2500 ng)
４．１．３ 形質転換方法
４．１．３．１ コンピテントセル
コンピテントセルは、XL1Blue株（Stratagene）である。
４．１．３．２ 実験条件
図４に示すプラスミドをそれぞれ、pAC-CrtEidi とともにXL1Blue株に導入し、形質転換体を作成した。この形質転換体のコロニーを形成した。
4.1.3. Transformation method 4.1.3.1 Competent cell The competent cell is XL1Blue strain (Stratagene).
4.1.3.2 Experimental conditions Each of the plasmids shown in Fig. 4 was introduced into the XL1Blue strain together with pAC-CrtEidi to prepare transformants. Colonies of this transformant were formed.
４．２ 大腸菌培養
４．２．１ プレ培養
生えてきたコロニーをLB (Car/Cm) 培地2 mLに植菌し、37℃で一晩前培養した。
４．２．２ 本培養
プレ培養液をそれぞれ、TB (Car/Cm) 培地10 mLに1/100希釈して植菌し、50 mL遠沈管で本培養開始した。30℃で48 h培養後、培養液を遠心集菌し、細胞ペレットを回収した。
4.2 E. coli culture 4.2.1 Pre-culture The grown colonies were inoculated into 2 mL of LB (Car / Cm) medium and pre-cultured at 37 ° C overnight.
4.2.2 Main culture The pre-culture solution was diluted 1/100 in 10 mL of TB (Car / Cm) medium and inoculated, and the main culture was started in a 50 mL centrifuge tube. After culturing at 30 ° C. for 48 h, the culture solution was centrifuged and the cell pellet was collected.
４．３ 脂質抽出・分析方法
４．３．１ 抽出方法
細胞ペレットをボルッテックスした後、acetone 10 mLで細胞中の脂画分を抽出した。hexane 1mL、1% NaClaq 35 mLを加え抽出物をhexaneに濃縮した。hexane相を取り無水MgSO4で水を除去した後，800 uLのhexane相を取った。その後hexaneを真空乾燥させ、 THF:methanol (6:4) 15 μLを用いて再溶解した。
4.3 Lipid extraction / analysis method 4.3.1 Extraction method After vortexing the cell pellets, the fat fraction in the cells was extracted with 10 mL of acetone. 1 mL of hexane and 35 mL of 1% NaClaq were added and the extract was concentrated in hexane. A hexane phase was taken and water was removed with anhydrous DDL 4 , and then an 800 uL hexane phase was taken. Hexane was then vacuum dried and redissolved using 15 μL of THF: methanol (6: 4).
４．３．２ 分析方法
再溶解液10 μLを Shimadzu Prominence HPLC-MS（APCI） system にて分析した。検出はセミミクロ検出機フォトダイオードアレイ（UV=205 nm）、分析カラムはShim-pack FC-ODS(75mm L. x 2.0mm I.D., 3.0μm)を用いた。移動相にはMeOH 100%を用い、流量は0.4 mL/minで測定した。
4.3.2
使用機器は以下のとおりである。
島津高速液体クロマトグラフ質量分析計 LCMS-2020システム
システムコントローラ CBM-20A
送液ユニット LC-30AD（２台）
オンライン脱器ユニット DGU-20ASR
オートサンプラ SIL-30AC
カラムオーブン CTO-20AC
液体クロマトグラフ質量分析計 LCMS-2020
ＰＤＡ検出器 SPD-M30A
LC-MSワークステーション LabSolutions LCMS Ver.5.82
LCMS分析条件は以下のとおりである。
インターフェイス：APCI
DL温度：300℃
インターフェイス電圧：4.5 kV
インターフェイス温度：500℃
ネブライザーガス温度：300℃
ヒートプロック温度：200℃
ドライイングガス流量：15 L/min
スキャンスピード：2320 u/sec
The equipment used is as follows.
Shimadzu High Performance Liquid Chromatograph Mass Spectrometer LCMS-2020 System System Controller CBM-20A
Liquid transfer unit LC-30AD (2 units)
Online removal unit DGU-20A SR
Autosampler SIL-30AC
Column oven CTO-20AC
Liquid chromatograph mass spectrometer LCMS-2020
PDA detector SPD-M30A
LC-MS Workstation LabSolutions LCMS Ver.5.82
The LCMS analysis conditions are as follows.
Interface: APCI
DL temperature: 300 ℃
Interface voltage: 4.5 kV
Interface temperature: 500 ° C
Nebulizer gas temperature: 300 ℃
Heat block temperature: 200 ℃
Drying gas flow rate: 15 L / min
Scan speed: 2320 u / sec
分析結果を図５に示す。Ｃ３５ボトリオコッセン及びＣ４０ボトリオコッセンが確認できた。図５においてＣ３５-ＢＯはＣ３５ボトリオコッセンを表し、Ｃ４０-ＢＯはＣ４０ボトリオコッセンを表す。図５においてａ）及びｂ）は、ＣｒｔＥ発現した場合の生産物分析の結果である。図５においてｃ）は、ＣｒｔＥ発現していない場合の生産物分析の結果である。
培地あたりの合成量を図６に示す。図６において、「坂口」とは坂口フラスコで培養した大腸菌を用いたことを示す。「２L」、「１L」とは、それぞれ、２L三角フラスコ、１L三角フラスコで培養した大腸菌を用いたことを示す。「gly」とは、培地中にグリセロールが含まれることを示す。
The analysis result is shown in FIG. C35 botriocossen and C40 botriocossen were confirmed. In FIG. 5, C35-BO represents C35 botriocossen and C40-BO represents C40 botriocossen. In FIG. 5, a) and b) are the results of product analysis when CrtE is expressed. In FIG. 5, c) is the result of product analysis when CrtE is not expressed.
The amount of synthesis per medium is shown in FIG. In FIG. 6, “Sakaguchi” indicates that Escherichia coli cultured in a Sakaguchi flask was used. “2L” and “1L” indicate that Escherichia coli cultured in a 2L Erlenmeyer flask and a 1L Erlenmeyer flask was used, respectively. “Gly” indicates that the medium contains glycerol.
また、ＨＰＬＣを再度行った。Ｃ３５ボトリオコッセンについてのＨＰＬＣの結果を図１４に示す。Ｃ４０ボトリオコッセンについてのＨＰＬＣの結果を図１８に示す。
Ｃ３５ボトリオコッセンについてのマススペクトルを図１５に示す。Ｃ４０ボトリオコッセンについてのマススペクトルを図１９に示す。
Ｃ３５ボトリオコッセンについての１３Ｃ-ＮＭＲの結果を図１６及び表３に示す。Ｃ４０ボトリオコッセンについての１３Ｃ-ＮＭＲの結果を図２０及び表３に示す。
Ｃ３５ボトリオコッセンについてのＨ-ＮＭＲの結果を図１７及び表３に示す。Ｃ４０ボトリオコッセンについてのＨ-ＮＭＲの結果を図２１及び表３に示す。
Moreover, HPLC was performed again. The results of HPLC for C35 botriocossen are shown in FIG. The results of HPLC for C40 botriocossen are shown in FIG.
The mass spectrum for C35 botriocossen is shown in FIG. The mass spectrum for the C40 botriocossen is shown in FIG.
The results of 13C-NMR for C35 botriocossen are shown in FIG. 16 and Table 3. The results of 13C-NMR for C40 botriocossen are shown in FIG. 20 and Table 3.
The results of 1 H-NMR for C35 botriocossen are shown in FIGS. 17 and 3. The results of 1 H-NMR for C40 botriocossen are shown in FIGS. 21 and 3.
４．４ 評価試験
n-デカン、n-ドデカン、n-トリデカン、n-テトラデカン、n-ペンタデカン、n-ヘキサデカン、1-テトラデセン、1-ヘキサデセン、スクワレン、スクワラン、及びＣ３４ボトリオコッセンをトラクション油として使用し、以下の方法でトラクション係数を測定した。 n-デカン、n-ドデカン、n-トリデカン、n-テトラデカン、n-ペンタデカン、n-ヘキサデカン、1-テトラデセン、1-ヘキサデセン、スクワレン、及びスクワランは和光純薬工業株式会社から購入したものである。Ｃ３４ボトリオコッセンは、公知の方法で藻から抽出されたものである。
4.4 Evaluation test
Using n-decane, n-dodecane, n-tridecane, n-tetradecane, n-pentadecane, n-hexadecane, 1-tetradecane, 1-hexadecane, squalene, squalene, and C34 botriocossen as traction oils, in the following manner The traction coefficient was measured. n-decane, n-dodecane, n-tridecane, n-tetradecane, n-pentadecane, n-hexadecane, 1-tetradecane, 1-hexadecane, squalene, and squalane were purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. C34 botriocossen is extracted from algae by a known method.
測定には、図７に示すボール／ディスクEHL試験機（以下では試験機１とする）を用いた。この試験機１は、PCSinstrument社製のMTM2(Mini traction machine)である。試験機１は、オイル槽３と、ディスクユニット５と、ボールユニット７と、を備える。
オイル槽３は上方が開口した槽である。ディスクユニット５は、ディスク９と、軸１１と、図示しない駆動部とを備える。ディスク９はオイル槽３内に収容されている。ディスク９は鋼製である。軸１１はディスク９の中心に取り付けられている。軸１１は鉛直方向に沿って延びている。ディスク９及び軸１１は、駆動部が供給する駆動力により、軸１１を中心として図７に示すＲａ方向に回転可能である。
The ball / disk EHL testing machine shown in FIG. 7 (hereinafter referred to as testing machine 1) was used for the measurement. This
The
ボールユニット７は、ボール１３と、軸１５とを備える。軸１５はボール１３の中心を通るように、ボール１３を貫く。ボール１３は、ディスク９の上面のうち、ディスク９の中心から外れた位置に接する。ボール１３及び軸１５は、図１に示すＲｂ方向に回転可能である。
The
オイル槽３にトラクション油１７を収容する。ディスク９の全体がトラクション油１７に浸漬される。ディスク９とボール１３との接点もトラクション油１７の中にある。ディスク９を回転させる。このとき、ボール１３の回転はフリー状態である。ボール１３はディスク９に対し滑り運動をする。ボール１３に対し、ディスク９に向けて押し付ける方向の荷重Ｗを加える。このとき、ボール１３に対し、ディスク９の周方向の伝達力Ｆが発生する。伝達力Ｆをロードセルで検出する。伝達力Ｆを荷重Ｗで除した値をトラクション係数とする。
The
具体的な測定条件は以下のとおりとした。
・3/4″ball、3/4”ball用disc
・周速0.5m/s
・荷重37N、面圧1.0GPa
The specific measurement conditions are as follows.
・ Disc for 3/4 ″ ball and 3/4 ″ ball
・ Peripheral speed 0.5m / s
・ Load 37N, surface pressure 1.0GPa
測定結果を図８に示す。図８では、鎖状炭化水素の分子量（炭素原子の数）とトラクション係数との関係を示している。この測定結果は、鎖状炭化水素の分子量が大きい（炭素原子の数が多い）ほど、トラクション係数が大きくなる傾向を示している。Ｃ３４ボトリオコッセンのトラクション係数は０．０９１であった。本願発明のＣ３５ボトリオコッセンまたはＣ４０ボトリオコッセンを本評価試験に供すると、トラクション係数は０．０９１を超える数値が試験結果として得られる。 The measurement results are shown in FIG. FIG. 8 shows the relationship between the molecular weight (number of carbon atoms) of the chain hydrocarbon and the traction coefficient. This measurement result shows that the larger the molecular weight of the chain hydrocarbon (the larger the number of carbon atoms), the larger the traction coefficient tends to be. The traction coefficient of C34 Botriokossen was 0.091. When the C35 botriocossen or the C40 botriocossen of the present invention is subjected to this evaluation test, a traction coefficient of more than 0.091 can be obtained as a test result.
５．実施例２
Ｃ４５ボトリオコッセンを製造した。製造方法は基本的には実施例１と同様であるため、実施例１との相違点について以下に説明する。
５．１ ベクターの作成
pUC18をベースとし、定常プロモータの下流に、MH1株由来のボトリオコッセン合成酵素であるSSL1、SSL3を、ともに、C末端にHis6（ヒスチジンタグ）を付して挿入した。また、SSL1に、配列番号１９、２０を使って、S207Vアミノ酸変異を導入し、SSL3に、配列番号２１～２４を使って、S199VやF285Aアミノ酸変異を導入した。
5. Example 2
A C45 botriocossen was manufactured. Since the manufacturing method is basically the same as that of the first embodiment, the differences from the first embodiment will be described below.
5.1 Creating a vector
Based on pUC18, SSL1 and SSL3, which are botriocossen synthases derived from the MH1 strain, were inserted downstream of the steady promoter with His 6 (histidine tag) attached to the C-terminal. In addition, S207V amino acid mutations were introduced into SSL1 using SEQ ID NOs: 19 and 20, and S199V and F285A amino acid mutations were introduced into SSL3 using SEQ ID NOs: 21 to 24.
また、pACYC184をベースに作製したpAC-FDS(Y81A,V157A) （Furubayshi, et al., Nature Communications：(2015)）からFDS(Y81A,V157A)をPCR増幅させ、SSL3の下流に、lacP-lacO-AGGAGGA-fds(Y81A,V157A)の構成で挿入し、fds(Y81A, V157A)を定常的発現するベクター（以下pUC18Nm-ssl1(S207V)-ssl3(S199V, F285A)-fds(Y81A,V157A)とする）を得た。このプラスミドマップを図９に示し、核酸塩基配列を配列番号１１で示す。SSL-1により変換されるアミノ酸の配列を配列番号１６に示す。 In addition, FDS (Y81A, V157A) was PCR-amplified from pAC-FDS (Y81A, V157A) (Furubayshi, et al., Nature Communications: (2015)) prepared based on pACYC184, and lacP-lacO was downstream of SSL3. -A vector that is inserted with the configuration of AGGAGGA-fds (Y81A, V157A) and constantly expresses fds (Y81A, V157A) (hereinafter pUC18Nm-ssl1 (S207V) -ssl3 (S199V, F285A)-fds (Y81A, V157A) I got). This plasmid map is shown in FIG. 9, and the nucleic acid base sequence is shown by SEQ ID NO: 11. The sequence of amino acids converted by SSL-1 is shown in SEQ ID NO: 16.
SSL-3により変換されるアミノ酸の配列を配列番号１７に示す。FDS変異体の核酸塩基配列を配列番号１５に示し、変換されるアミノ酸の配列を配列番号１８に示す。
また、pACYC184をベースとして作製したpACmod-idi（Katabami, et al., Journal of Bioscience and Bioengineering,(2015)）では、lacプロモータの下流にlacP/lacO-人工rbs-Isopentenyl diphosphate isomerase (IDI、大腸菌由来)を挿入し、idi遺伝子を定常的に発現する構成となっている（以下では、pACmod-idiとする）。pACmod-idiを図１０に示し、核酸塩基配列は配列番号１２の配列である。
The sequence of amino acids converted by SSL-3 is shown in SEQ ID NO: 17. The nucleic acid base sequence of the FDS mutant is shown in SEQ ID NO: 15, and the sequence of the amino acid to be converted is shown in SEQ ID NO: 18.
In pACmod-idi (Katabami, et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, (2015)) prepared based on pACYC184, lacP / lacO-artificial rbs-Isopentenyl diphosphate isomerase (IDI, derived from E. coli) downstream of the lac promoter. ) Is inserted to constantly express the idi gene (hereinafter referred to as pACmod-idi). The pACmod-idi is shown in FIG. 10, and the nucleic acid base sequence is the sequence of SEQ ID NO: 12.
５．２ 一塩基置換の方法
５．２．１ プライマー
SSL1に対し、ヒトスクアレン合成酵素のサイズ特異性を大きなサイズのものにシフトさせた変異を導入した。変異はヒトスクアレン合成酵素のA204Vに相当し、SSL１ではS207Vとなる。SSL3に対し、ヒトスクアレン合成酵素のサイズ特異性を大きなサイズのものにシフトさせた変異を導入した。変異はヒトスクアレン合成酵素のA204VとF288Aに相当し、SSL3ではそれぞれ、S199VやF285Aとなる。使用したプライマーは、配列番号１９～２４である。
5.2 Method of single base substitution 5.2.1 Primer
A mutation was introduced into SSL1 that shifted the size specificity of human squalene synthase to a larger size. The mutation corresponds to A204V of human squalene synthase, and becomes S207V in SSL1. A mutation was introduced into SSL3 that shifted the size specificity of human squalene synthase to a larger size. The mutations correspond to the human squalene synthases A204V and F288A, and in SSL3 they are S199V and F285A, respectively. The primers used are SEQ ID NOs: 19-24.
５．２．２ 部位特異的変異導入の方法
部位特異的変異を、図１１に示す方法で作成した。すなわち、SSL1にS207Vを、SSL1にS199VとF285Aアミノ酸置換つまりヒトスクアレン合成酵素のA204VやF288A相当のアミノ酸置換を導入した。この方法は、FASTR法である。導入後の核酸塩基配列はそれぞれ配列番号１３、１４の配列である。導入後の核酸塩基配列に対応するアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１６、１７である。
5.2.2 Method of introducing site-specific mutation A site-specific mutation was prepared by the method shown in FIG. That is, S207V was introduced into SSL1, and S199V and F285A amino acid substitutions were introduced into SSL1, that is, amino acid substitutions equivalent to A204V and F288A of human squalene synthase were introduced. This method is the FASTR method. The nucleic acid base sequences after introduction are the sequences of SEQ ID NOs: 13 and 14, respectively. The amino acid sequences corresponding to the nucleobase sequences after introduction are SEQ ID NOs: 16 and 17, respectively.
５．２．３ ＰＣＲ条件
ＰＣＲ条件は以下のとおりとした。
KOD Plus Ver2 TYB、KOD-211、使用量 1 U
10 × KOD Plus Ver2 buffer
組成： 60 mM (NH4)2SO4, 100 mM KCl, 1.2 M Tris-HCl(pH 8.8 at 25℃), 1% Triton X-100, 0.01% BSA, MgSO4：1.5 mM, dNTP：0.2 mM
温度プロトコル：94℃(5 min) → {94℃(15 sec)/51℃(15 sec)/68℃(5 mins)} x 25 cycles → 68℃ (10sec)
CR増幅率：25倍（template濃度：100 ng， 最終収率： 2500 ng）
5.2.3 PCR conditions The PCR conditions were as follows.
KOD Plus Ver2 TYB, KOD-211, usage 1 U
10 × KOD Plus Ver2 buffer
Composition: 60 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 100 mM KCl, 1.2 M Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C), 1% Triton X-100, 0.01% BSA, DDL4: 1.5 mM, dNTP: 0.2 mM
Temperature protocol: 94 ° C (5 min) → {94 ° C (15 sec) / 51 ° C (15 sec) / 68 ° C (5 mins)} x 25 cycles → 68 ° C (10 sec)
CR amplification factor: 25 times (template concentration: 100 ng, final yield: 2500 ng)
５．３ 形質転換方法
５．３．１ コンピテントセル
コンピテントセルは、XL1Blue株（Stratagene）である。
５．３．２ 実験条件
図１２に示すプラスミドをそれぞれ、pACmod-idi とともにXL1Blue株に導入し、形質転換体を作成した。この形質転換体のコロニーを形成した。
5.3 Transformation method 5.3.1 Competent cells The competent cells are XL1Blue strain (Stratagene).
5.3.2 Experimental conditions Each of the plasmids shown in FIG. 12 was introduced into the XL1Blue strain together with pACmod-idi to prepare transformants. Colonies of this transformant were formed.
５．４ 大腸菌培養
５．４．１ プレ培養
生えてきたコロニーをLB (Car/Cm) 培地2 mLに植菌し、37℃で一晩前培養した。
５．４．２本培養
プレ培養液をそれぞれ、TB (Car/Cm) 培地100 mLに1/1000希釈して植菌し、2 L遠沈管で本培養開始した。30℃で48 h培養後、培養液を遠心集菌し、細胞ペレットを回収した。
5.4 E. coli culture 5.4.1 Pre-culture The grown colonies were inoculated into 2 mL of LB (Car / Cm) medium and cultured at 37 ° C overnight before.
5.4.2 Main culture Each pre-culture solution was diluted 1/1000 in 100 mL of TB (Car / Cm) medium and inoculated, and main culture was started in a 2 L centrifuge tube. After culturing at 30 ° C. for 48 h, the culture solution was centrifuged and the cell pellet was collected.
５．５ 脂質抽出・分析方法
５．５．１ 抽出方法
100 mLのうち 40 mL細胞分のペレットをボルッテックスした後、acetone 10 mLで細胞中の脂画分を抽出した。hexane 1mL、1% NaClaq 35 mLを加え抽出物をhexaneに濃縮した。hexane相を取り無水MgSO4で水を除去した後，800 uLのhexane相を取った。その後hexaneを真空乾燥させ、 THF:methanol (6:4) 15 μLを用いて再溶解した。
5.5 Lipid extraction / analysis method 5.5.1 Extraction method
After vortexing 40 mL of pellets for 40 mL of 100 mL, the fat fraction in the cells was extracted with 10 mL of acetone. 1 mL of hexane and 35 mL of 1% NaClaq were added and the extract was concentrated in hexane. A hexane phase was taken and water was removed with anhydrous DDL4, and then an 800 uL hexane phase was taken. Hexane was then vacuum dried and redissolved using 15 μL of THF: methanol (6: 4).
５．５．２ 分析方法
再溶解液10 μLを Shimadzu Prominence HPLC-MS（APCI） system にて分析した。検出はセミミクロ検出機フォトダイオードアレイ（UV=205 nm）、分析カラムはShim-pack FC-ODS(75mm L. x 2.0mm I.D., 3.0μm)を用いた。移動相にはMeOH 100%を用い、流量は0.4 mL/minで測定した。
5.5.2
使用機器は以下のとおりである。
島津高速液体クロマトグラフ質量分析計 LCMS-2020システム
システムコントローラ CBM-20A
送液ユニット LC-30AD（２台）
オンライン脱器ユニット DGU-20ASR
オートサンプラ SIL-30AC
カラムオーブン CTO-20AC
液体クロマトグラフ質量分析計 LCMS-2020
ＰＤＡ検出器 SPD-M30A
LC-MSワークステーション LabSolutions LCMS Ver.5.82
LCMS分析条件は以下のとおりである。
インターフェイス：APCI
DL温度：300℃
インターフェイス電圧：4.5 kV
インターフェイス温度：500℃
ネブライザーガス温度：300℃
ヒートプロック温度：300℃
ドライイングガス流量：15 L/min
スキャンスピード：2320 u/sec
The equipment used is as follows.
Shimadzu High Performance Liquid Chromatograph Mass Spectrometer LCMS-2020 System System Controller CBM-20A
Liquid transfer unit LC-30AD (2 units)
Online removal unit DGU-20ASR
Autosampler SIL-30AC
Column oven CTO-20AC
Liquid chromatograph mass spectrometer LCMS-2020
PDA detector SPD-M30A
LC-MS Workstation LabSolutions LCMS Ver.5.82
The LCMS analysis conditions are as follows.
Interface: APCI
DL temperature: 300 ℃
Interface voltage: 4.5 kV
Interface temperature: 500 ° C
Nebulizer gas temperature: 300 ℃
Heat block temperature: 300 ℃
Drying gas flow rate: 15 L / min
Scan speed: 2320 u / sec
分析結果を図１３に示す。Ｃ３０ボトリオコッセン及びＣ４５ボトリオコッセンが確認できた。図１３においてＣ３０-ＢＯはＣ３０ボトリオコッセンを表し、Ｃ４５-ＢＯはＣ４５ボトリオコッセンを表す。図１３においてａ）及びｂ）は、ＣｒｔＥ発現した場合の生産物分析の結果である。図１３においてｃ）は、ＣｒｔＥ発現していない場合の生産物分析の結果である。 The analysis result is shown in FIG. C30 botriocossen and C45 botriocossen were confirmed. In FIG. 13, C30-BO represents C30 botriocossen and C45-BO represents C45 botriocossen. In FIG. 13, a) and b) are the results of product analysis when CrtE is expressed. In FIG. 13, c) is the result of product analysis when CrtE is not expressed.
Ｃ４５ボトリオコッセンについての詳細なＨＰＬＣの結果を図２２に示す。Ｃ４５ボトリオコッセンについてのマススペクトルを図２３に示す。Ｃ４５ボトリオコッセンについての１３Ｃ-ＮＭＲの結果を図２４及び表４に示す。Ｃ４５ボトリオコッセンについてのＨ-ＮＭＲの結果を図２５及び表４に示す。 Detailed HPLC results for the C45 botriocossen are shown in FIG. The mass spectrum for the C45 botriocossen is shown in FIG. The results of 13C-NMR for C45 botriocossen are shown in FIG. 24 and Table 4. The results of 1 H-NMR for C45 botriocossen are shown in FIGS. 25 and 4.
＜他の実施態様＞
以上、本開示の実施態様について説明したが、本開示は上述の実施態様に限定されることなく、種々修飾等を加えて実施することができる。
（１）Ｃ３５ボトリオコッセン、Ｃ４０ボトリオコッセン、及びＣ４５ボトリオコッセンは、トラクション油以外の用途に使用してもよい。
<Other embodiments>
Although the embodiments of the present disclosure have been described above, the present disclosure is not limited to the above-described embodiments, and can be implemented with various modifications and the like.
(1) C35 botriocossen, C40 botriocossen, and C45 botriocossen may be used for applications other than traction oil.
（２）上記実施態様における１つの構成要素が有する複数の機能を、複数の構成要素によって実現したり、１つの構成要素が有する１つの機能を、複数の構成要素によって実現したりしてもよい。また、複数の構成要素が有する複数の機能を、１つの構成要素によって実現したり、複数の構成要素によって実現される１つの機能を、１つの構成要素によって実現したりしてもよい。また、上記実施態様の構成の一部を省略してもよい。また、上記実施態様の構成の少なくとも一部を、他の上記実施態様の構成に対して付加又は置換してもよい。なお、特許請求の範囲に記載した文言から特定される技術思想に含まれるあらゆる態様が本開示の実施態様である。 (2) A plurality of functions possessed by one component in the above embodiment may be realized by a plurality of components, or one function possessed by one component may be realized by a plurality of components. .. Further, a plurality of functions possessed by the plurality of components may be realized by one component, or one function realized by the plurality of components may be realized by one component. Further, a part of the configuration of the above embodiment may be omitted. Further, at least a part of the configuration of the above embodiment may be added or replaced with the configuration of the other above embodiment. It should be noted that all aspects included in the technical idea specified from the wording described in the claims are embodiments of the present disclosure.
（３）上述した化合物及びトラクション油の他、当該化合物及びトラクション油を構成要素とするシステム、化合物の製造方法、トラクション油の製造方法等、種々の態様で本開示を実現することもできる。 (3) In addition to the above-mentioned compound and traction oil, the present disclosure can also be realized in various aspects such as a system containing the compound and traction oil as a component, a method for producing a compound, a method for producing traction oil, and the like.
１…試験機、３…オイル槽、５…ディスクユニット、７…ボールユニット、９…ディスク、１１…軸、１３…ボール、１５…軸、１７…トラクション油 1 ... testing machine, 3 ... oil tank, 5 ... disc unit, 7 ... ball unit, 9 ... disc, 11 ... shaft, 13 ... ball, 15 ... shaft, 17 ... traction oil
Claims (4)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017106008 | 2017-05-29 | ||
| JP2017106008 | 2017-05-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2018199666A JP2018199666A (en) | 2018-12-20 |
| JP7060417B2 true JP7060417B2 (en) | 2022-04-26 |
Family
ID=64667815
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018045352A Active JP7060417B2 (en) | 2017-05-29 | 2018-03-13 | Compounds and traction oils |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7060417B2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7053401B2 (en) * | 2018-08-06 | 2022-04-12 | 株式会社デンソー | New cyclized product and method for producing new cyclized product |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100041120A1 (en) | 2008-08-11 | 2010-02-18 | University Of Kentucky Research Foundation | Botryoccocus braunii Triterpene Synthase Proteins and Nucleic Acid Molecules, and Methods for Their Use |
| US20110104806A1 (en) | 2008-06-25 | 2011-05-05 | Research Foundation of the City Univeristy of New York | Regulating the production of long chain hydrocarbons |
-
2018
- 2018-03-13 JP JP2018045352A patent/JP7060417B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110104806A1 (en) | 2008-06-25 | 2011-05-05 | Research Foundation of the City Univeristy of New York | Regulating the production of long chain hydrocarbons |
| US20100041120A1 (en) | 2008-08-11 | 2010-02-18 | University Of Kentucky Research Foundation | Botryoccocus braunii Triterpene Synthase Proteins and Nucleic Acid Molecules, and Methods for Their Use |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| OKADA S. et al.，Hydrocarbon Production by the Yayoi, a New Strain of the Green Microalga Botryococcus braunii，Applied Biochemistry and Biotechnology，1997年，67，79-86 |
| 彼谷邦光，微細藻類オイルの化学，日本微生物資源学会誌，2010年，26, 1，1-10 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2018199666A (en) | 2018-12-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4760951B2 (en) | Recombinant microorganism having butanol-producing ability and method for producing butanol | |
| Özcan et al. | Type IV CRISPR RNA processing and effector complex formation in Aromatoleum aromaticum | |
| CN103923947B (en) | Method for producing α santalenes | |
| EP2527438B1 (en) | Methods and compositions for DNA fragmentation and tagging by transposases | |
| JP7288496B2 (en) | Monooxygenase mutants and their production methods and applications | |
| US20040107459A1 (en) | Diacylglycerol acyltransferase nucleic acid sequences and associated products | |
| US10563232B2 (en) | Microorganisms having increased lipid productivity | |
| JP6562950B2 (en) | Dreamenol synthase and method for producing dreammenol | |
| CN104093836B (en) | Hydrocarbon synthase gene and its utilization | |
| JP7060417B2 (en) | Compounds and traction oils | |
| Ernst et al. | Regiodivergent biosynthesis of bridged bicyclononanes | |
| JP2024534856A (en) | Systems, compositions, and methods involving retrotransposons and functional fragments thereof | |
| CN117836415A (en) | Systems and methods for transposing cargo nucleotide sequences | |
| JP6748108B2 (en) | Production of aromatic compounds | |
| CN120330171A (en) | Formaldehyde lyase and its mutant and application | |
| CN105593368B (en) | Recombinant microorganism having increased ability to produce 2,3-butanediol and method for producing 2,3-butanediol using same | |
| CN114921428A (en) | Baeyer-Villiger monooxygenase and application thereof | |
| JP2023111516A (en) | Lipid manufacturing method | |
| Le Thanh et al. | Mutation of rsmC gene from Serratia marcescens QBN using CRISPR-Cas9 to enhance prodigiosin synthesis | |
| CN113817700B (en) | C4 methyl sterol synthase gene and its encoded protein, application | |
| CN116144692B (en) | System suitable for genome evolution of Ralstonia, application and genome evolution method | |
| CN119979496B (en) | A chondroitin synthase and its high-expression, high-activity, and high-thermal-stability mutants and their applications | |
| EP4726034A1 (en) | Crispr ribonucleoprotein complex with a type ii-b cas9 and the use thereof | |
| CN114317485B (en) | Recombinant murine leukemia virus reverse transcriptase mutant, preparation method and application | |
| KR102346076B1 (en) | Transformed methanotrophs for producing α-bisabolene production from methane and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180327 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20180327 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210119 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20211020 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211109 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211202 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220322 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220414 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7060417 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |