JP7094593B2 - 多血小板血漿を自己由来トロンビンと組み合わせることにより得ることが可能な創傷処置ゲル - Google Patents

Description

本発明は、処置が多血小板血漿を含む、創傷処置組成物を生成する方法に関する。

創傷は通例、身体への物理的傷害により誘発され、感染性疾患又は根底にある病気によっても誘発され得る。創傷は一般に、慢性又は急性のどちらかに分類される。慢性創傷は、正常な創傷治癒期を経て進行せず、通例、糖尿病などの病気に関連する。急性創傷は一般に、突然罹り、正常な創傷治癒期を介して予測可能な速度及び予期された速度で治癒する。

創傷を急速かつ効率的に処置する必要性は、医療行為において非常に重要である。例えば非治癒性の慢性創傷は、糖尿病患者における死亡率及び疾病率の著しい原因であり多くの場合、創傷が処置されることができなければ、四肢は切断されなければならないであろう。糖尿病の発生率が上昇しているため、慢性創傷の効果的処置を開発する必要性が上昇している。現在、英国では年間２２０万例の慢性創傷が毎年、５１億～５３億ポンド／年のコストで処置されている。

本発明は、多血小板血漿（ＰＲＰ）を含有する創傷処置組成物を生成する方法に関する。この組成物は特別に、慢性又は急性創傷への局所適用に適する。

この創傷処置組成物は、全血試料から生成され、血液の様々な成分の創傷治癒特性を活用して増強する。全血は、血漿中に浮遊された３種の主な細胞型、つまり赤血球、白血球及びトロンボサイト（血小板）を含む。赤血球は、ヘモグロビンを含有する赤色の血液細胞であり、体中に酸素を運搬する。白血球は、自然免疫反応及び適応免疫反応を通して感染と戦うことに関与する白色の血液細胞であり、通例、血小板として知られるトロンボサイトは、損傷部位の出血を停止する止血／凝固に寄与する。

血小板は、血小板血栓を形成して出血の停止を支援することにより創傷治癒工程を援助する。損傷部位が検出された時、血小板がその部位に接着し始め、活性化されて、トロンビンなどのアゴニストにより顆粒状物質（granular material）を放出する。一旦、顆粒の活性化が起こると、これが、増殖因子の放出を刺激し、新しい組織の形成を刺激して、創傷治癒の炎症段階を始動する。

ＰＲＰに基づく創傷処置は現在、当該技術分野で知られている。しかし本発明者らは、驚くべきことに、ＰＲＰが様々なヘマトクリットレベルで生成され得、慢性又は急性創傷の処置に特に適することを見出した。より具体的には、およそ８％のヘマトクリットレベルを有するＰＲＰは、全血試料由来の白血球の実質的に全てを保持し、急性創傷を処置する際に特に効果的であることが示された。およそ２％のヘマトクリットレベルで生成されたＰＲＰは、白血球を実質的に含まず、慢性創傷を処置する場合に特に効果的であることが示された。さらに本発明の方法は、ＰＲＰを高濃度の血小板で生成することもでき、ベースライン（即ち、患者の血液中で見出される血小板の濃度）の４～６倍の血小板レベルが創傷を処置する際の使用に最も適することが見出された。全血からのＰＲＰ画分の調製のために設計された商業的分離システムが、参照により本明細書に取り込むDegen et al (2016) The musculoskeletal Journal of Hospital for Special Surgery (HSSJ) vol 13: 75-80により比較された。

本明細書に記載された発明は、ＰＲＰを自己由来トロンビンと組み合わせることにより創傷処置ゲルを生成する方法を提供する。この方法では、ＰＲＰとトロンビンの両者が、同一の全血試料に由来し、そのためゲルは、完全に自己の創傷ケア組成物である。他の同様の創傷ケア用ゲルが、生成されているが、これらは、牛トロンビンを使用しており、免疫反応などの合併症及び牛海綿状脳症などの感染症の伝染を生じる可能性がある。さらに牛トロンビンは、英国などの国々では使用が認可されていない。ＰＲＰを自己トロンビンと組み合わせることにより、血小板が活性化されるようになり、その結果、増殖因子、サイトカイン、及びケモカインを放出するだけでなく、血漿中のフィブリノゲンを活性化して、フィブリンマトリックス足場の形成を誘発する。増殖因子が、創傷治癒工程の刺激を支援し、フィブリン細胞外マトリックスの生成が、ゲル粘稠性をもたらす。

本発明者らは、驚くべきことに、低温での自己トロンビンの生成が、生成される創傷処置ゲルの粘稠性を有意に改善することを見出した。生成されたゲルは、ほぼ固形の粘稠性を有し、少なくとも１０分間形状を保持させることが可能であり、創傷適用の内部で、４８時間より長く損なわれずに原位置に留まるであろう。これは、この自己足場への組織の取り込みのためのマトリックスを効果的に提供する。

ゲル粘稠性のさらなる安定化を支援するために、アスコルビン酸（ビタミンＣ）が、この組成物に組み込まれ得る。アスコルビン酸はまた、フリーラジカルをスカベンジングすること、組織を保護すること、コラーゲン合成を可能にすることなどのさらなる利益を提供し、抗炎症性である。

本発明の方法は、自己創傷処置組成物を提供し、この組成物は、高割合の白血球を含むこと、又は処置される創傷の型に応じて白血球を実質的に含まないこと、のどちらかが可能である。そのためこの方法を利用することは、白血球レベルを処置される創傷の型に適合させることができ、より迅速かつより効果的な創傷処置組成物をもたらす。この組成物は、糖尿病患者における慢性創傷の処置に用いられており、処置過程での患者１５名のパイロットコホートでは、創傷体積の平均低減は、７５％を超えていた。創傷閉鎖が実現されるのにかかった平均時間は、創傷処置組成物のおよそ５回の処置で１７．９日間であった。この処置は明らかに、創傷のための驚くほど改善された処置を提供する。

本明細書内の明白に事前公開の文書の列挙又は議論は、必ずしも、この文書が最先端の部分であること、又は共通する一般的知識であることの認識ととらえるべきでない。

驚くべきことに、１～１０％の間のヘマトクリットレベルを有するＰＲＰ試料を生成することにより、用いられるヘマトクリットレベルに応じて急性又は慢性のどちらかの創傷において特に効果的となる創傷処置組成物が生成され得ることが見出された。詳細には、ＰＲＰが高割合の白血球を含む、およそ８％のヘマトクリットレベルを有するＰＲＰ試料が、急性創傷を処置する際に効果的であることが見出された。一方、ＰＲＰが白血球を実質的に含まない、およそ２％のヘマトクリットレベルを有するＰＲＰ試料は、慢性創傷を処置する際に効果的であることが見出された。さらに本発明者らは、異なるヘマトクリットレベルを有する創傷処置組成物が、創傷の処置の間、連続で用いられ得ることを見出した。例えば慢性創傷を処置する場合、創傷が清拭されて急性期を誘導することができ、この創傷が最初に８％ヘマトクリットレベルを有する組成物で処置される。続いての創傷の処置では、２％ヘマトクリットレベルを有する組成物が用いられる。これらの処置の組み合わせが、創傷閉鎖及び急速な創傷治癒を実現するのに特に効果的であることが示された。治験では、平均５回及び１７．９日間にわたる処置により、７５％の創傷体積の低減が実現された。本明細書での特定のパーセンテージのヘマトクリットを有する創傷処置組成物への言及が、自己トロンビン及びアスコルビン酸などの賦形剤の導入前に、適当なヘマトクリットパーセンテージに生成されたＰＲＰ調製物から生成された組成物の言及であること、そしてそれが本明細書に記載された方法を利用して調製された創傷処置組成物における最終的なヘマトクリットパーセンテージを必ずしも示さない場合があることが理解されなければならない。

本発明の創傷処置組成物を形成するために、ＰＲＰ試料が、自己トロンビンと組み合わせられる（したがってトロンビンは、ＰＲＰと同じ供給源に由来している）。これは、創傷への局所適用に特に適したゲル粘稠性を有する組成物を生成する。本発明者らは、驚くべきことに、自己トロンビンが生成される温度が最終創傷組成物の粘稠性に影響を及ぼし得ることを見出した。自己トロンビンは、プロトロンビンをトロンビンに切断することにより生成される。この工程が、１５℃未満の温度で実施される場合、トロンビンとＰＲＰの組み合わせから得られる、結果として生じたゲルは、有益な性質を有する。例えばこのゲルは、ほぼ固形の粘稠性を有し、鋳型から取り出された時、その形状をおよそ１０分間維持することができ、４８時間より長く損なわれずに原位置に残留し、海綿状の壊滅的創傷を効果的に充填し、増殖因子及び細胞タンパク質の長期作用性放出のための効果的マトリックスを提供することが示された。それに比べ過去の創傷ケアゲルは、およそ６０秒までしかその形状を維持しない。理論に結び付けるのを望むものではないが、固形粘稠性が大きいほどゲルを溶解前により長時間、創傷内に保持させることができ、そのためゲルが長い期間にわたって増殖因子を放出することができると仮定される。これらの特性が、本明細書で提供される実施例から認められ得る通り、改善された創傷治癒に導く。

さらに、ゲルの固形粘稠性が大きいほど、著しい組織体積が損失された創傷を処置する際に特に有益であることが見出された。これらの例において、ゲルは、その形状を保持し得るため、創傷内に足場を提供して組織再生が起こり得る。

それゆえ、本発明の一形態は、創傷処置組成物を作製する方法に関し、この方法は、ｉ）全血試料を、多血小板血漿（ＰＲＰ）試料、乏血小板血漿（ＰＰＰ）試料及び赤血球試料を含む複数の試料に分画することであって、前記ＰＲＰ試料が１～１０％のヘマトクリットレベルを有するものであること；ｉｉ）ＰＰＰ及び／又はＰＲＰ試料の一部を処理して、ＰＰＰ及び／又はＰＲＰ中に存在する自己プロトロンビンの切断を促進して、自己トロンビンを生成すること、並びにｉｉｉ）ＰＲＰ試料をＰＰＰ試料の一部及びステップ（ｉｉ）で生成されたトロンビンの一部と組み合わせて、創傷処置組成物を生成すること、を含み、ステップｉｉ）は、１５℃未満の温度で実行される。

一態様において、第一の形態のステップｉｉｉ）が１５℃未満の温度で実行され得ることも想定される。

本発明の第二の形態は、第一の形態の方法により得ることが可能な創傷処置組成物を含む。

本発明の更なる形態は、本発明の第一の形態による方法により得ることが可能な創傷処置組成物を投与することにより対象において創傷を処置する方法を提供する。

本発明はさらに、医薬における使用のため、より詳細には創傷を処置する際の使用のための、第二の形態による創傷処置組成物を提供する。

本発明がより明確に理解され得るように、本発明の態様が、添付の図面を参照する実施例としてここに記載される。

創傷の処置の間に行われるステップを例示したフローチャートを示す。 急性と分類された創傷の処置のために行われるステップを例示したフローチャートを示す。 図２－１の続き。 慢性と分類された創傷の処置のために行われるステップを例示したフローチャートを示す。 図３－１の続き。 実施例１に概説されたプロトコルを利用して創傷処置組成物を用いて処置された患者の創傷の例を示す。 実施例１に概説されたプロトコルを利用して処置された糖尿病患者の踵における創傷を示す。 Ａｒｔｈｒｅｘ（登録商標）Ａｎｇｅｌ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍを用いて本発明の方法に従って全血を分画した結果の図を提供する。これは、各画分中で一般に見出される細胞型、及びＰＰＰからＰＲＰへ、そして赤血球部分までヘマトクリットレベルを変化させることを示している。おおよその血小板レベルが、２％及び７％のヘマトクリットレベルのために提供される。 実施例で用いられたＡｒｔｈｒｅｘ（登録商標）Ａｎｇｅｌ（登録商標）ＳｙｓｔｅｍのＰＲＰアウトプットの図を提供する。Ａｒｔｈｒｅｘ（登録商標）Ａｎｇｅｌ（登録商標）ＳｙｓｔｅｍのＰＲＰアウトプットと全血との差異を評価するために、Ａｒｔｈｒｅｘ（登録商標）Ａｎｇｅｌ（登録商標）ＳｙｓｔｅｍのＰＲＰが、健常ドナー６名の静脈血から、２％、５％、７％、１０％及び１５％のヘマトクリット設定で調製された。血小板、白血球細胞（ＷＢＣ）及び好中球（ＮＥ）の濃度が、標準の全血球計算（ＣＢＣ）で測定された。

本発明の第一の形態において、創傷処置組成物を作製する方法が提供され、この方法は、
ｉ）全血試料を、多血小板血漿（ＰＲＰ）試料、乏血小板血漿（ＰＰＰ）試料及び赤血球試料を含む複数の試料に分画することであって、前記ＰＲＰ試料が１～１０％のヘマトクリットレベルを有するものであること；
ｉｉ）ＰＰＰ及び／又はＰＲＰ試料の一部を処理して、ＰＰＰ及び／又はＰＲＰ中に存在する自己プロトロンビンの切断を促進して、自己トロンビンを生成すること、並びに
ｉｉｉ）ＰＲＰ試料をＰＰＰ試料の一部及びステップ（ｉｉ）で生成されたトロンビンの一部と組み合わせて、創傷処置組成物を生成すること、
を含み、
ステップｉｉ）は、１５℃未満の温度で実行される。

本明細書で用いられる用語「全血」は、当該技術分野の用語であり、血漿、赤血球、白血球及び血小板を含む組成物をいう。したがって全血は、自然な成分の全てを含有する個体から採取された新鮮な血液試料であってもよい。全血試料はまた、試料の凝固の予防を支援するためにクエン酸塩又は他の適切な緩衝剤を含んでいてもよい。緩衝剤が薬理学的に許容できることが、想定される。

用語「多血小板血漿（ＰＲＰ）」は、高割合又は高濃度の血小板（即ち、全血よりも高い）を含有する血漿をいい、それはまた、赤血球を実質的に含まない。ＰＲＰは、全血試料を分画すること（例えば、遠心分離）により調製され、血小板を全血試料中で見出される濃度より高い濃度で含有する。本発明の第一の形態によれば、ＰＲＰは、６００×１０^９血小板／リットルより多く、又は８００×１０^９血小板／リットルより多く、又は１０００×１０^９血小板／リットルより多く、又は１２００×１０^９血小板／リットルより多く、又は１４００×１０^９血小板／リットルより多く、又は１６００×１０^９血小板／リットルより多く、又は１８００×１０^９血小板／リットルより多く、又は２０００×１０^９血小板／リットルより多く、又は２２００×１０^９血小板／リットルより多く、又は２４００×１０^９血小板／リットルより多くを含有してもよい。さらに、本発明の第一の形態によれば、ＰＲＰは、６００～２４００×１０^９血小板／リットル、又は８００～２２００×１０^９血小板／リットル、又は１０００～２０００×１０^９血小板／リットル、又は１２００～１８００×１０^９血小板／リットル、又は１４００～１６００×１０^９血小板／リットル、又はそれらの任意の組み合わせを含有してもよい。「乏血小板血漿（ＰＰＰ）」は、全血試料を分画することにより生成され、低割合の血小板、例えば１×１０^９血小板／リットル未満、又は１×１０^８血小板／リットル未満、又は１×１０^７血小板／リットル未満を含有する血漿をいう。

以下により詳細に説明される通り、ＰＲＰ中の最適な血小板レベルが、ステップｉ）のＰＲＰを生成するための全血の分画から直接、又はステップｉ）の後のＰＰＰでのＰＲＰの希釈後のどちらかで得られることが想定される。ＰＲＰの最適な血小板濃度は、したがって自己トロンビン（及び任意選択でのアスコルビン酸）の添加前に得られる。Ａｒｔｈｒｅｘ（登録商標）Ａｎｇｅｌ（登録商標）システムからのアウトプットの図が、図７に提供されている。

本明細書で用いられる用語「自己トロンビン」は、ＰＲＰが由来するのと同じ全血試料に由来するトロンビンをいう。

本発明の第一の形態により生成された創傷処置組成物は、２００～２４００×１０^９血小板／リットル、又は４００～２４００×１０^９血小板／リットル、又は６００～２４００×１０^９血小板／リットル、又は８００～２２００×１０^９血小板／リットル、又は１０００～２０００×１０^９血小板／リットル、又は１２００～１８００×１０^９血小板／リットル、又は１４００～１６００×１０^９血小板／リットルを含んでいてもよい。

本発明の第一の形態の特有の態様において、この方法は、トロンビン添加と同時に、トロンビン添加前、又はトロンビン添加後にアスコルビン酸（ビタミンＣ）を創傷処置組成物に添加するステップをさらに含む。アスコルビン酸は、０．５ｍＭ～５ｍＭの間、好ましくは２ｍＭ～４ｍＭの間、最も好ましくは２．５ｍＭ～３ｍＭの間の濃度で添加される。本発明の第一の形態の好ましい態様において、アスコルビン酸（ビタミンＣ）は、ＰＲＰ試料に添加される。

トロンビンへのプロトロンビンの切断を促進するのに適していて、本発明の方法における使用に適当である、当該技術分野で知られる方法が多く存在する。本発明の第一の形態の特有の態様において、この方法の段階ｉｉ）は、ＰＰＰ試料及び／又はＰＲＰ試料の一部を、塩化カルシウム及び／又はエタノールを含む組成物と接触させることを含む。エタノール中に塩化カルシウムを含む溶液が、トロンビンへのプロトロンビンの切断を促進するのに特に適する。この溶液は、およそ５～２０％ｗ／ｖの間の塩化カルシウム、又はおよそ８～１５％ｗ／ｖの間の塩化カルシウムを含有してもよく、好ましくはこの溶液は、１０％ｗ／ｖの塩化カルシウムを含有する。塩化カルシウムは、エタノールを含む溶液中に存在してもよく、この溶液は、およそ１０～３０％ｖ／ｖの間のエタノール、又はおよそ１０～２０％ｖ／ｖの間のエタノールを含有してもよく、好ましくはこの溶液は、およそ１７％ｖ／ｖのエタノールを含有する。ＰＰＰ及び／又はＰＲＰ試料の一部を処理し、ＰＰＰ及び／又はＰＲＰ中に存在する自己プロトロンビンの切断を促進して、自己トロンビンを生成するのに適した市販のキットが存在し、そのようなキットの非限定的例としては、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ ＡｃｔｉｖＡＴキット及びＡｒｔｈｒｅ
ｘ Ｔｈｒｏｍｂｉｎａｔｏｒが挙げられる。

本発明の第一の形態において、ステップｉｉ）は、１５℃未満の温度で実施される。詳細にはステップｉｉ）は、２℃～１５℃、４℃～１５℃、６℃～１５℃、８℃～１５℃、１０℃～１５℃、又は１２℃～１５℃の温度で実施されてもよい。この態様において、ＰＰＰ及び／又はＰＲＰ試料の一部、並びにプロトロンビン切断反応に必要な溶液は、１５℃未満に冷却される。典型的にはこれは、反応の前及び間の溶液を氷上で貯蔵することにより実現されてもよい。これは、より低温で起こる切断反応をもたらす。トロンビンが、ＰＲＰと組み合わせられる場合、血小板は、活性化されるようになり、ゲルの形成をもたらす。より高温であることによって、反応速度を上昇させることが知られるため、切断反応をより低温で実施することがより堅く効果的なゲルをもたらすトロンビン試料を生成する、というのは非常に驚くべきことである。疑念を回避するために、第一の形態のステップｉ）が典型的には室温で実施されることが想定される。全血試料を分画するための適切な方法が、当該技術分野で知られる。本発明の特有の機能は、遠心分離が全血試料を分画するのに用いられる。分画段階の間、遠心分離は、二段階で実施されてもよい。最初の遠心分離段階は、赤血球を他の成分から分離するために用いられて、次に、血小板の分画及びＰＲＰの形成を支援する第二の遠心分離段階が用いられてもよい。最初の遠心分離段階は、３，０００～４，５００ｒｐｍの間、好ましくは３，２００～４，０００ｒｐｍの間、より好ましくは３，７００ｒｐｍで実施されてもよい。第二の遠心分離段階は、２，０００～３，５００ｒｐｍの間、好ましくは２，５００～３，０００ｒｐｍの間、より好ましくは２，７００ｒｐｍで実施されてもよい。そのような遠心分離ステップは、好ましくはＡｒｔｈｒｅｘ（登録商標）Ａｎｇｅｌ（登録商標）システムを用いて実行されてもよい。

分画工程の間、ＰＲＰ試料が、細分画されて（sub-fractionate）、高濃度の白血球を含有するＰＲＰ、及び低濃度の白血球を含有するＰＲＰを生成するであろう。それゆえ、異なるレベルの白血球を含むＰＲＰが生成され得る。本明細書で用いられる用語「ヘマトクリットレベル」は、全血試料から分画されたＰＲＰ中に存在する白血球のおおよその量をいう。

異なるヘマトクリットレベルを有するＰＲＰ試料を生成するために、ＰＰＰ試料とＰＲＰ試料と赤血球試料とを識別し得るセンサが用いられてもよい。センサはまた、白血球が多いＰＲＰ試料と、白血球が少ない試料とを識別することができる。適切なセンサとしては、ＬＥＤセンサが挙げられる。さらに、Ｍａｇｅｌｌａｎ（登録商標）Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ、Ｂｉｏｍｅｔ ＧＰＳ（登録商標）Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ及びＡｒｔｈｒｅｘ（登録商標）Ａｎｇｅｌ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍを含む、指定されたヘマトクリットレベルを有するＰＲＰを生成するのに適した市販のシステムが多く存在する。

異なるヘマトクリットレベルを有するＰＲＰ試料を生成することにより、ＰＲＰ中に存在する白血球の量を改変することが可能である。全血試料の総白血球の８０％より多くがＰＲＰ中に存在する、高割合の白血球を含むＰＲＰを形成するためには、より高いヘマトクリットレベル、例えば５～１０％の間のヘマトクリットレベル、好ましくは７～９％の間のヘマトクリットレベルのＰＲＰが、生成されなければならない。全血試料の総白血球の１０％未満がＰＲＰ中に存在する、白血球を実質的に含まないＰＲＰを形成するためには、より低いヘマトクリットレベル、例えば１～５％の間のヘマトクリットレベル、好ましくは１～３％の間のヘマトクリットレベルのＰＲＰが、生成されなければならない。

２％のヘマトクリットレベルで生成されるＰＲＰ試料が、白血球を実質的に含まず、より具体的には全血試料の総白血球の１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは２
％未満、最も好ましくは１％未満が、ＰＲＰ試料中に存在するであろう。２％のヘマトクリットレベルで生成されるＰＲＰは、白血球を実質的に含まず、例えばＰＲＰは、１２×１０^８白血球／リットル未満、又は６×１０^８白血球／リットル未満、又は３×１０^８白血球／リットル未満、又は１２×１０^７白血球／リットル未満、又は６×１０^７白血球／リットル未満、又は３×１０^７白血球／リットル未満を含有してもよい。本発明の特有の態様において、ＰＲＰ試料は、およそ２％のヘマトクリットレベルを有する。本発明の別の態様において、ＰＲＰ試料は、およそ１、１．５、２．５、３、３．５、４又は４．５％のヘマトクリットレベルを有してもよい。

対照的に、およそ８％のヘマトクリットレベルで生成されたＰＲＰは、全血試料に存在する白血球の大部分を含み、より具体的には全血試料の総白血球の８０％より多く、好ましくは９０％より多く、より好ましくは９５％より多くが、ＰＲＰ中に存在するであろう。８％のヘマトクリットレベルで生成されたＰＲＰは、全血試料に存在する白血球の大部分を含み、例えばそれは、１×１０^９白血球／リットルより多く、又は３×１０^９白血球／リットルより多く、又は５×１０^９白血球／リットルより多く、又は１０×１０^９白血球／リットルより多くを含んでいてもよい。好ましくは８％のヘマトクリットレベルで生成されたＰＲＰは、およそ１×１０^９～１５×１０^９個／リットルの間の白血球を含んでいてもよく、より好ましくはそれは、およそ３×１０^９～１２×１０^９個の間の白血球を含んでいてもよい。そのため本発明の特有の態様において、ＰＲＰ試料は、８％ヘマトクリットレベルを有する。本発明の別の態様において、ＰＲＰ試料は、およそ５．５、６、６．５、７、７．５、８．５、９又は９．５％のヘマトクリットレベルを有してもよい。

当業者であれば理解できる通り、「ヘマトクリット」レベルは、試料中の赤色の血球細胞の濃度の直接的な目視測定である。これは、血液試料中の白血球又は血小板のレベルの直接的測定ではないが、ヒトの血液分画の状況では、それは、試料中の白血球及び／又は血小板のレベルに直接相関する。これは、本明細書に記載された通りＡｒｔｈｒｅｘ Ａｎｇｅｌ Ｓｙｓｔｅｍを用いて分画された全血中のヘマトクリットの勾配を示す図６に図示されている。当該技術分野において、ヘマトクリットレベルは通例、分画後に血液の構成要素の反復可能な測定を可能にする簡便な測定として用いられる。これは、所望の組成物の血液画分の回収が自動化され得る手段である。したがって当該技術分野において、ヘマトクリット測定は、所望の血小板レベルでの濃縮血小板試料の自動回収を可能にする。ヘマトクリットのレベルは、明白に識別可能であり、反復可能かつ予測可能であるため、ヘマトクリットレベルは、手動及びコンピュータの両方でＰＲＰ画分の回収を可能にする。血小板レベルを直接測定するより侵襲的手段は、本発明の状況では適当でなく、本発明は、患者の創傷に迅速に適用され得る創傷処置組成物を迅速に生成することを意図した方法である。ヘマトクリットを測定することは、実施例で用いられる装置により実施される通り、光学測定（光の吸収の差異を検出する）で簡単に実施され得るため、血液試料との任意の直接的接触又は任意の因子の添加を必要としない。したがってヘマトクリットは、血小板レベルの代用マーカになり、その手段及び目的は、当業者により即座に理解できるだろう。

本発明者らはさらに、ＰＲＰ試料中に最適な血小板レベルが存在することを見出した。最も効果的なＰＲＰ血小板濃度は、ベースライン血小板レベルの４～６倍の間であることが見出され、この場合のベースライン血小板レベルは、全血試料中で見出されたレベルである。それゆえＰＲＰ試料が、ベースライン血小板レベルの４～６倍より多く含有する場合、このＰＲＰ試料は、ＰＰＰ試料を用いて希釈され得る。これは、自己トロンビン及びアスコルビン酸などの賦形剤の包含の前に、ＰＲＰ試料がベースライン血小板レベルの４～６倍を含有することを、確実にするであろう。

したがって上記の観点から理解できる通り、活性化トロンビンと組み合わせる前に、本
発明の方法のステップｉｉｉ）でＰＰＰ試料の一部をＰＲＰ試料と組み合わせる主目的は、最適な血小板レベルのＰＲＰ試料を実現することである。したがってＰＰＰは、さらなる処理の前にＰＲＰ（濃縮ＰＲＰ）を希釈するために用いられてもよい。トロンビンと組み合わせる前のＰＲＰ中の最適な血小板レベルは、患者及び処置される創傷に依存するであろう。当業者に理解される通り、一部の個体は、例えば自然な素因又は疾患のせいで、より高レベルの血小板を呈するであろう。逆に一部の個体は、例えば自然な素因又は疾患のせいで、より低レベルの血小板を呈するであろう。したがって本発明の方法及びこの方法により製造される創傷処置組成物は、本発明の方法の第一のステップで発生された濃縮ＰＲＰの体積をもたらす患者の血液中の自然な血小板レベルに従って患者に適合されてもよい。上記に説明された通り、トロンビン（及び任意にアスコルビン酸）の添加前のＰＲＰ中の血小板レベルが個々の患者のベースライン血小板レベルのおよそ４～６倍の間であることが好ましい。幾つかの例において、本発明の方法のステップｉ）で生成されたＰＲＰは、続く処理（例えば患者が、低い血小板レベルを有するならば）に許容される血小板を有するが、ほとんどの例では、ステップｉ）で生成されたＰＲＰは、所望の血小板レベルより高いレベルを有するであろう。この例では、ＰＰＰが、ＰＲＰを所望の血小板レベルに希釈するために用いられてもよい。

当業者により理解される通り、この方法により生成されるＰＲＰ中の血小板の濃度は、例えばＡｒｔｈｒｅｘ（登録商標）Ａｎｇｅｌ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍを用いることにより、この方法で生成された濃縮ＰＲＰの体積と独立している。むしろこの体積は、処理前の全血試料中の血小板量の指標である。したがってＰＲＰは、ほぼ固定された血小板濃度で生成されるが、ＰＲＰの体積は、変動する。Ａｒｔｈｒｅｘ（登録商標）Ａｎｇｅｌ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍにより生成されたＰＲＰ中の血小板の濃度は、３６００×１０^９血小板／リットルの領域内である。例えば血中に１００×１０^９血小板／リットルを有する患者は、およそ１ｍｌの濃縮ＰＲＰを発生し、これはその後、ＰＰＰの添加により６ｍｌに希釈して戻され、およそ６００×１０^９血小板／リットル（ベースラインの６倍）を有する希釈ＰＲＰ溶液を生成することになる。血中におよそ４００×１０^９血小板／リットルを有する患者は、およそ４ｍｌの濃縮ＰＲＰを発生し、これはその後、６ｍｌに希釈して戻され、およそ２４００×１０^９血小板／リットル（ベースラインの６倍）を有する希釈ＰＲＰ溶液を生成することになる。それゆえ、自己トロンビンを添加する前のＰＲＰ部分の中の血小板濃度は、典型的には全血中のベースライン血小板レベルの４～６倍の間、好ましくは６倍である。

トロンビンの添加前のＰＲＰ中の最適な血小板レベルは、およそ６００×１０^９～１４００×１０^９血小板／リットルであると想定される。好ましくはおよそ６００×１０^９～１２００×１０^９血小板／リットル、およそ６００×１０^９～１０００×１０^９血小板／リットル、およそ６００×１０^９～８００×１０^９血小板／リットル、およそ８００×１０^９～１４００×１０^９血小板／リットル、およそ８００×１０^９～１２００×１０^９血小板／リットル、又はおよそ８００×１０^９～１０００×１０^９血小板／リットル。したがって本発明の方法は、トロンビン（そして任意にアスコルビン酸）の添加前に、ステップｉｉｉ）で最適な血小板レベルを有するＰＲＰ試料を提供することを含む。

２％～７％ヘマトクリット設定での全血に比較した、そして他の市販の機械に比較した、Ａｒｔｈｒｅｘ（登録商標）Ａｎｇｅｌ（登録商標）ＳｙｓｔｅｍのＰＲＰ中の血小板密度が、上記に参照されるDegen et al (2017)の表２に提供されている。

本発明の第一の形態によれば、創傷処置組成物は、２００～２，６００×１０^９血小板／リットル、好ましくは６００～２，４００×１０^９血小板／リットル、より好ましくは１，０００～２，０００×１０^９血小板／リットルの血小板レベルを含む。

本発明の第一の形態により生成された創傷処置組成物は、０．５～１０％又は１～８％の最終ヘマトクリットレベルを含む。一態様において、本発明の第一の形態により生成された創傷処置組成物は、０．５～５％、０．５～４％、０．５～３％又は０．５～２％の最終ヘマトクリットレベルを含む。さらなる態様において、本発明の第一の形態により生成された創傷処置組成物は、４～１０％、４～９％、４～８％、４～７％又は４～６％の最終ヘマトクリットレベルを含む。

本発明によれば、自己生成されたトロンビンが、ＰＲＰと組み合わせられる。トロンビンは、ＰＲＰ試料中の血小板を活性化して増殖因子の放出をもたらすアゴニストとして作用する。それゆえこれらの増殖因子は、本発明の創傷処置組成物中に存在してもよく、存在する増殖因子の非限定的例としては、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ－ＡＢ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦ－Ｂ１）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ－１
ＩＧＦ２）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来血管新生因子（ＰＤＡＦ）、血小板由来上皮成長因子（platelet-derived epidermal growth-factor）（ＰＤＥＧＦ）、血小板第４因子（ＰＦ－４）、酸性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－Ａ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－Ｂ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ－Ａ）、βトロンボグロブリン関連タンパク質（ＢＴＧ）、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）、フィブロネクチン、フォン・ビレブランド因子（ｖＷＦ）、フィブロペプチドＡ(fibropeptide A）、フィブリノゲン、アルブミン、プラスミノゲン活性化抑制因子１（ＰＡＩ－１）、オステオネクチン、活性化正常Ｔ細胞における発現及び分泌調節性（regulated upon activation normal T cell expressed and presumably secreted）（ＲＡＮＴＥＳ）、ＧＲＯ－α、ビトロネクチン、フィブリンＤ－ダイマー、第Ｖ因子、アンチトロンビンＩＩＩ、免疫グロブリン－Ｇ（ＩｇＧ）、免疫グロブリン－Ｍ（ＩｇＭ）、免疫グロブリン－Ａ（ＩｇＡ）、ａ２－マクログロブリン、アンギオゲニン、Ｆｇ－Ｄ、エラスターゼ、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）及びインターロイキン－１（ＩＬ－１）、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。これらの増殖因子は、相乗的に作用して、創傷治癒の促進を支援する。

本発明の第二の形態は、本発明の第一の形態による方法により得ることが可能な創傷処置組成物を含む。

本発明の第二の形態の特有の機能は、多血小板血漿（ＰＲＰ）、トロンビン及びアスコルビン酸を含む創傷処置組成物であり、この組成物は、２００×１０^９血小板／リットルより多い、又は４００×１０^９血小板／リットルより多い、又は６００×１０^９血小板／リットルより多い、又は８００×１０^９血小板／リットルより多い、又は１０００×１０^９血小板／リットルより多い血小板レベルを含む。

本発明の第二の形態による組成物の態様において、ＰＲＰ及びトロンビンは、単一個体から得られた全血試料から生成される。

本発明の創傷処置組成物は、創傷の処置における使用のためであってもよい。特有の態様において、本発明の創傷処置組成物は、急性又は慢性創傷の処置における使用のためであってもよい。

本発明者らは、本発明による、例えば１～５％の間の、より低いヘマトクリットレベルを有するＰＲＰ試料から生成された創傷処置組成物が、慢性創傷を処置する際に効果的であることを見出した。より具体的にはおよそ２％のヘマトクリットレベルを有するＰＲＰから生成された創傷組成物は、驚くべきことに、慢性創傷を処置する際の使用に特に効果的である。そのため本発明の創傷処置組成物の態様は、１～５％の間、好ましくは２％の
ヘマトクリットレベルを有するＰＲＰ試料から生成されてもよい。したがって一態様において、１～５％の間、好ましくは２％のヘマトクリットレベルを有するＰＲＰ試料から形成された創傷処置組成物は、必要とする患者における慢性創傷を処置する際の使用のためであってもよい。本明細書で用いられる用語「慢性創傷」は、正常な創傷治癒期を経て進行せず、多くの場合、治癒の炎症段階に残存する創傷をいう。起こる場合があり、本発明の組成物で利益を享受し、したがって処置され得る慢性創傷の非限定的例としては、糖尿病足潰瘍、静脈性下肢潰瘍、及び褥瘡が挙げられる。

さらに、例えば５～１０％の間の、より高いヘマトクリットレベルを有するＰＲＰ試料から生成された本発明による創傷処置組成物は、急性創傷を処置する際に効果的である。より具体的には、およそ８％のヘマトクリットレベルを有するＰＲＰから生成された創傷組成物は、急性創傷を処置する際の使用に特に効果的である。そのため、本発明による創傷処置組成物の一態様は、５～１０％の間、好ましくは８％のヘマトクリットレベルを有するＰＲＰ試料から生成されてもよい。したがって一態様において、５～１０％の間、好ましくは８％のヘマトクリットレベルを有するＰＲＰ試料から形成された創傷処置組成物は、必要とする患者における急性創傷を処置する際の使用のためであってもよい。本明細書で用いられる用語「急性創傷」は、経時的というよりむしろ突然起こる傷害又は損傷をいうために用いられる。慢性創傷は、デブリードマンなどの工程を受けることにより急性創傷に誘導されてもよく、その場合、死滅又は損傷組織は、創傷から除去されて、健常組織をあらわにする。これは、創傷を血液に暴露し、したがって自然な治癒を刺激する。これらの工程は通例、慢性創傷処置の間に用いられ、熟練者は、適当な方法を認知している。

本発明の創傷処置組成物は、好ましくは、一旦生成されるとゲル粘稠性を得るまで固化する。したがって鋳型が、ゲルの形状を処置される創傷に適合させるために用いられてもよく、又はゲルが、処置される創傷及び医師の選好に応じて具体的サイズ若しくは形状に切断され得る。本発明の創傷処置組成物は、過去の組成物よりも安定した構造を有するため、ゲルを切断して、又はかたどって、それを特有の創傷に適合させることがより容易である。

本発明の態様は、本発明の創傷処置組成物を適用することにより創傷を処置する方法に関する。この方法は、処置の過程で創傷処置組成物の複数の適用を含んでいてもよい。例えば創傷は、デブリードマンを受け、次に例えば５～１０％の間の、より高いヘマトクリットレベルを有するＰＲＰ試料から生成された創傷処置組成物を適用されてもよい。この創傷は、例えば１～５％の間の、より低いヘマトクリットレベルを有するＰＲＰ試料から生成された創傷処置組成物を適用することによる、続いての処置を受けてもよい。本発明のさらなる形態は、本発明の第一の形態による方法により得ることが可能な創傷処置組成物を投与することにより、対象における創傷を処置する方法である。したがって本発明により対象における創傷を処置する方法は、以下のステップ：
ｉ）処置される対象から全血試料を得るステップ；
ｉｉ）全血試料を、多血小板血漿（ＰＲＰ）試料、乏血小板血漿（ＰＰＰ）試料及び赤血球試料を含む複数の試料に分画するステップであり、前記ＰＲＰ試料が１～１０％のヘマトクリットレベルを有するものであるステップ；
ｉｉｉ）ＰＰＰ及び／又はＰＲＰ試料の一部を処理して、ＰＰＰ及び／又はＰＲＰ中に存在する自己プロトロンビンの切断を促進して、自己トロンビンを生成するステップ、並びに
ｉｖ）ＰＲＰ試料をＰＰＰ試料の一部及びステップ（ｉｉｉ）で生成されたトロンビンの一部と組み合わせて、創傷処置組成物を生成するステップであり、前記創傷処置組成物が６００×１０^９血小板／リットルより多くの血小板レベルを含むものであるステップ、並びに
ｖ）創傷処置組成物を処置される対象の創傷に適用するステップ、
を含んでいてもよく、ステップｉｉｉ）は、１５℃未満の温度で実施される。

本発明により創傷を処置する方法は最初、慢性創傷を清拭して清浄な創面を露出し、それを急性創傷に効果的に変換すること、又は最初に例えば８％の、高ヘマトクリットのＰＲＰ試料から生成された本発明の創傷処置組成物で急性創傷を処置すること、を伴っていてもよい。その後、次の処置ステップにおいて、創傷治癒の最初の急性期が、終了して、創傷が慢性と見なされ得る場合、本発明の方法はその後、例えば２％の、より低いヘマトクリットを有するＰＲＰ組成物から生成された本発明の創傷処置組成物を適用することを含んでいてもよい。この第二段階の複数の適用は、創傷の充分な治癒が起こるまで、適宜、行われてもよい。

したがって本発明のさらなる態様は、８％のヘマトクリットレベルを有するＰＲＰ試料から生成された本発明による創傷処置組成物を投与することにより、対象における急性創傷を処置する方法である。したがって本発明のさらなる態様は、２％のヘマトクリットレベルを有するＰＲＰ試料から生成された本発明による創傷処置組成物を投与することにより、対象における慢性創傷を処置する方法である。

本発明のさらなる形態は、創傷の処置のための薬剤の製造における創傷処置組成物の使用であり、この創傷処置組成物は、以下の方法：
ｉ）全血試料を、多血小板血漿（ＰＲＰ）試料、乏血小板血漿（ＰＰＰ）試料及び赤血球試料を含む複数の試料に分画することであって、前記ＰＲＰ試料が１～１０％のヘマトクリットレベルを有するものであること；
ｉｉ）ＰＰＰ及び／又はＰＲＰ試料の一部を処理して、ＰＰＰ及び／又はＰＲＰ中に存在する自己プロトロンビンの切断を促進して、自己トロンビンを生成すること、並びに
ｉｉｉ）ＰＲＰ試料をＰＰＰ試料の一部及びステップ（ｉｉ）で生成されたトロンビンの一部と組み合わせて、創傷処置組成物を生成すること、
により得ることが可能で、
ステップｉｉ）は、１５℃未満の温度で実行される。

本発明はまた、医薬における使用のため、詳細には本明細書に提示された通り慢性又は急性創傷を処置する際の使用のための、第二の形態による創傷処置組成物を提供する。

本発明の初期の形態に関係して記載された全ての態様は、適切ならば、本発明の前述の形態に等しく適用可能とする。

以下の実施例は、本発明を例証している；
実施例１
以下の実施例は、例えば糖尿病患者において、創傷を処置する場合に行われるステップを概説している。

第一段階
８％のヘマトクリットレベルを有するＰＲＰが、第一の処置における使用のために生成される。創傷は、壊死組織の外科的デブリードマンで「外科的に新鮮にされて（surgically freshened）」、新鮮な急性創底を露出させる。創傷処置組成物は、以下の配合に従って生成される。この配合は、容量が適合されるように設計されており、７０００ｍｍ^３を超える創傷を処置するためには容量が倍増される。
ｉ．全血５２ｍＬから処理されたＰＲＰ ５ｍｌ。このＰＲＰは、全血試料中に見出された血小板濃度の５～６倍を含有する。
ｉｉ．アスコルビン酸５００ｍｇ／５ｍｌ ＵＳＰの０．７５ｍＬを添加する。
ｉｉｉ．自己トロンビン２ｍＬを添加して、ＰＲＰ／アスコルビン酸液を活性化させゲル化する。

第一の処置は、濃縮された血小板及び大「用量」の白血球を含有する。この段階は、過刺激処置と称されてもよい。Ｏｐｓｉｔｅなどの半密封型ドレッシングが、ゲル及び創傷を覆うために用いられてもよい。

第二段階
第二の処置は、４８時間後に実施される。第二の処置及び続いての処置では、２％のヘマトクリットレベルを有するＰＲＰが、用いられる。続いての処置は、１週間に１回／７日ごとに実行される。２％ヘマトクリットレベルを用いて、９８％より多くの白血球が、ＰＲＰから除去され、創傷処置組成物が、以下の配合に従って生成される。
ｉ．全血５２ｍＬから処理されたＰＲＰ ５ｍＬ。このＰＲＰは、全血試料中に見出された血小板濃度の５～６倍を含有する。
ｉｉ．アスコルビン酸５００ｍｇ／５ｍｌ ＵＳＰの０．７５ｍＬを添加する。
ｉｉｉ．自己トロンビン２ｍＬを添加して、ＰＲＰ／アスコルビン酸液を活性化させゲル化する。

創傷が、１週あたり３０％より多くの創傷閉鎖改善を示さなければ、創傷は、８％のヘマトクリットレベルを有する急性配合物を用いて処置されなければならない。
このアプローチは、臨床現場における慢性創傷の反復可能かつロバストな処置を可能にする。

実施例２
臨床現場において、患者１５名で処置された１８の創傷。５名は、露出した骨／腱／軟骨を有する広範囲の組織損失を有し；３名は、腎置換療中であり；４名は、著しい末梢神障害を有し；４名は、深部の骨髄炎を有し；１名は、摂食障害に関係する重度の栄養失調を有した。処置開始時の平均創傷体積：８２０３．３ｍｍ^３（範囲１４１．３～４１２５７．２ｍｍ^３）。創傷は、実施例1に概説された方法論を利用して処置された。ＰＲＰ処置の完了時の平均創傷体積：２７８３．２ｍｍ^３（範囲０．５～２８８０９ｍｍ^３）。処置完了時の創傷体積の平均低減：７５％。ＰＲＰ処置開始後の創傷治癒が９０％を超えるまでの総日数：１７．９日（範囲６～４０日）。処置後の外科的介入が、患者１名で必要となり、大切断術に進み、残りの患者は、さらなる介入を行われずに退院した。

図４は、この研究で処置された患者の創傷の実施例を示しており、表１は、処置過程での創傷体積の低減及び９０％未満の創傷治癒にかかった日数を詳述している。

実施例３
糖尿病患者が、踵の領域の創傷の外科的デブリードマン及び骨髄炎の除去を受けた。その後、この創傷は、本発明の創傷処置組成物で処置された。３回の処置が、１４日間で実施された。

１４日間にわたる体積曲線の低減は、－３６５８１．２ｍｍ^３（－９０．７％）であった。体積変化は、－４１７．３ｍｍ^３（－３０．８％）であり、創傷が肉芽を生じて組織を再生し、創傷を閉鎖するため体積の増加を示している。創傷エリアの減少は、－１０５１．１ｍｍ^２（－２５．８％）であった。処置過程での創傷治癒の画像が、図５に示される。

創傷処置組成物が、本発明により生成された。下記の表は、創傷ケア処置の重大な特徴の幾つかに及ぼす、１５℃未満の温度でのプロトロンビンからトロンビンへの変換を実施することの影響を実証している。

血小板、好中球及び白血球細胞の濃度が、出発レベルの因子として表される。

Claims (13)

1. 創傷処置組成物を作製する方法であって、
   ｉ）全血試料を、多血小板血漿（ＰＲＰ）試料、乏血小板血漿（ＰＰＰ）試料及び赤血球試料を含む複数の試料に分画することであって、前記ＰＲＰ試料が１～１０％のヘマトクリットレベルを有するものであること；
   ｉｉ）前記ＰＰＰ及び／又はＰＲＰ試料の一部を処理して、前記ＰＰＰ及び／又はＰＲＰ中に存在する自己プロトロンビンの切断を促進して、自己トロンビンを生成すること、並びに
   ｉｉｉ）前記ＰＲＰ試料を前記ＰＰＰ試料の一部及びステップ（ｉｉ）で生成された前記トロンビンの一部と組み合わせて、前記創傷処置組成物を生成すること、
   を含み、
   ステップｉｉ）が、２℃～１５℃の温度で実行される、方法。
2. ステップｉｉｉ）が、１５℃未満の温度で実行される、請求項１に記載の方法。
3. 前記トロンビンの添加と同時に、前記トロンビンの添加前に、又は前記トロンビンの添加後にアスコルビン酸を前記創傷処置組成物に添加するステップをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記ＰＲＰ試料が、８％のヘマトクリットレベルを有する、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
5. 前記ＰＲＰ試料が、２％のヘマトクリットレベルを有する、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
6. 前記創傷処置組成物が、６００～２，４００×１０^９血小板／リットルの血小板レベルを含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
7. 請求項１～６のいずれかに記載の方法により得ることが可能な創傷処置組成物。
8. 創傷、任意に慢性又は急性創傷の処置における使用のための、請求項７に記載の創傷処
   置組成物。
9. 請求項４に記載の方法により得ることが可能な創傷処置組成物。
10. 急性創傷の処置における使用のための、請求項９に記載の創傷処置組成物。
11. 請求項５に記載の方法により得ることが可能な創傷処置組成物。
12. 慢性創傷の処置における使用のための、請求項１１に記載の創傷処置組成物。
13. 請求項９に記載の創傷処置組成物で過去に処置された創傷を処置する際の使用のための、請求項１１に記載の創傷処置組成物。

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