JP7099803B2 - 画像誘導手術用の神経標識色素の局所適用 - Google Patents

Description

本発明は、手術時の蛍光ガイド神経イメージングに関する。特に、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）神経イメージング造影剤の術中局所投与の分野に関する。また、術中の神経同定を実現するために造影剤を局所投与するための医薬製剤も提供する。

多くの救命上の外科的処置に伴う罹病の主因は、意図しない神経損傷である。かかる損傷によって発生する合併症は、神経損傷の重大度と部位に依存し、多くの場合、現れる症状は患者のクオリティオブライフ（ＱＯＬ）に悪影響を与える（例えば、機能及び／又は感覚の喪失、筋肉萎縮、麻痺、並びに慢性ニューロパチー）。腹部及び骨盤において根治的な切除を必要とするがん手術は、特に重要である。なぜなら、知覚、運動及び自律神経の機能に対して多くの小神経が関与しているためである。結腸直腸及び婦人科の手術では、がんの抑制後、膀胱及び腸を制御する自律神経を保存することが極めて重要である。泌尿器科の分野では、神経損傷の結果、処置から５年が経過しても排尿障害や性機能不全が多くみられることが、根治的前立腺切除術の後の結果研究からわかっている。神経血管束内のこうした神経は、その複雑さ、小ささ、並びに解剖学的な個人差により、たとえ拡大して観察したとしても術中の視認化が困難な場合が多い。神経損傷の原因は様々であるが、神経繊維を周囲組織から区別する能力が限られることに原因があることが多い。神経繊維を脈管と間違えたり、或いは位置的な近さから目的の悪性腫瘍と一緒に切除してしまったりする。現在の神経温存法は第一に解剖学的ランドマークの特定作業に依拠しており、外科医の経験に大きく左右される。

造影剤の全身注射を用いた前臨床試験において、蛍光画像誘導手術を用いた術中の神経同定が成功裏に実証されている（筆者らの特許及び刊行物を参照されたい）。動物の静脈（ＩＶ）注射（以下、「静注」と適宜略記する）の場合、造影剤が全身に分布し、特定のタンパク質を標的とし、標的以外の領域から消散するよう、注射後には十分な時間が必要である。蛍光ガイド手術が最初に行われて以来、光学的標的剤がヒトに対して試験されたことはこれまでごくわずかしかない。ヒトに全身投与される造影剤の試験に対して規制上の監督が行われることにより、臨床への移行には壁がある。局所投与は、臨床開発プログラムのコストを低減し、ヒトへの調査の実行可能性を高める可能性を秘めている。

造影剤の局所適用には全身送達に比べて多くの潜在的利点がある。全身吸収及び毒性の可能性を制限できる見込みがあり、したがって造影剤の安全性プロファイルを改善できる可能性がある。術中の視認化が特に必要な手術部位に高用量の造影剤を持続的に与えながら、他方でそれ以外の場所では濃度を制限できると考えられる。さらに、外科医は局所適用のタイミングが制御可能となり、必要なときに手術部位に造影剤を適用できるようになるだろう。

神経を標識できる局所医薬品が依然として必要とされている。

米国特許第９０４００１９号

本発明は、ミエリン塩基性タンパク質を結合できる局所医薬品を提供する。

一実施形態では、医薬品は式Ｉの化合物又はその塩を含有する。

式中、Ｒ¹はアルキル基であり、Ｒ²は電子供与基であり、Ｒ³は電子求引基である。ＰＥＧ－３００、プロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カーバポール及びラウロカプラムから選択される２種以上の溶媒を含有する水性医薬担体も含まれる。

手術部位に医薬品を接触させることにより、医薬品の局所投与によってミエリン塩基性タンパク質を観血的又は最小侵襲性の手術野においてイメージングする方法も提供する。医薬品は式Ｉの化合物又はその塩を含有する。

式中、Ｒ¹はアルキル基であり、Ｒ²は電子供与基であり、Ｒ³は電子求引基である。医薬品は水性医薬担体も含有する。本方法は、適用後に、医薬品の励起スペクトル特性に合わせて調整した光源の適用と医薬品の発光スペクトル特性に合わせて調整した光学フィルタを通した被検者の観察とによって医薬品を検出する工程をさらに含む。

局所投与される医薬品を提供するキットも提供する。

本発明の上記その他の特徴、態様及び利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読むとさらによく理解されるだろう。

マウスのモデルにおける、静注された式Ｉ（ｆ）の化合物の摂取と排泄の動態を示す図である。 マウスのモデルにおいて式Ｉ（ｆ）の化合物を術中局所適用した後の神経の代表的な白色光画像である。 図２Ａと同じマウスのモデルであり、マウスのモデルにおいて式Ｉ（ｆ）の化合物を術中局所適用した後の神経の代表的な蛍光画像である。 マウスのモデルにおいて術中局所適用後に式Ｉ（ｆ）の化合物で染色したドーナツ型ミエリン束を示す蛍光顕微鏡画像である。 局所適用した式Ｉ（ｄ）の化合物によるマウス内の蛍光神経標識を示す顕微鏡画像である。 マウスのモデルにおいて手術部位に局所的に適用した、様々な医薬担体中に調合した式Ｉ（ｆ）の化合物の神経対筋肉（Ｎ／Ｍ）及び神経対脂肪組織（Ｎ／Ａ）の相対比率を比較したグラフである。 マウスのモデルにおいて、全身（静脈内に）投与した式Ｉ（ｆ）の化合物（グラフＡ）と局所適用した式Ｉ（ｆ）の化合物（グラフＢ）とのコントラストを比較するマルチスペクトルイメージングのプロットである。 ０．０１ｍｇ（Ａ）及び０．０２ｍｇ（Ｂ）の式Ｉ（ｆ）の化合物を製剤６に添加した医薬品を手術部位に局所適用したときの蛍光画像である。 ４ｍｇの式Ｉ（ｆ）の化合物を製剤４に添加した医薬品をブダの手術モデルに局所適用したときの白色光画像及び蛍光画像を示すリアルタイムの術中イメージング映像から抽出したフレームである。白色光イメージング下では神経がまったく視認不能であるのに対し、蛍光ガイダンス下では明確に認められた（２枚のパネルの矢印）。 ０．３ｍｇの式Ｉ（ｆ）の化合物を製剤６に添加した医薬品を後腹膜領域周辺の手術部位に適用したときの白色光画像及び蛍光画像を示すリアルタイムの術中イメージング映像から抽出したフレームである。より少ない投与量では、神経（矢印）は白色光イメージング下に比べて蛍光イメージング下のほうが明瞭であった。 １０μＭの式Ｉの色素（Ｉｂ～Ｉｆ）で標識した凍結切片の神経組織の比較用蛍光顕微鏡画像と緩衝液のみでインキュベートした対照組織とを比較した図である。目盛り棒は約５０ミクロンである。

以下の詳細な説明は例示を目的としたものであり、本願発明や本発明の使用を限定するものではない。また、本発明の背景技術又は図面の説明で提示した何らかの理論によって本発明の用途や使用が限定されないものとする。

特許請求の範囲に規定する発明の対象をより明確かつ簡潔に説明・指摘するため、以下の説明並びに添付の特許請求の範囲に使用するいくつかの用語について以下に定義しておく。

「ミエリン性ニューロパチー」は、一般的に、神経細胞を覆う絶縁物質の鞘部分が、症候群、疾病その他の病的状態の一要素として損傷を受けるか又は機能不全に陥っている何らかの状態をいう。かかる状態の例として、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、レフサム病、副腎白質ジストロフィー、クラッベ病、フェニルケトン尿症、カナバン病、ペリツェウス・メルツバッヘル病、アレキサンダー病、糖尿病性ニューロパチー、化学療法に伴うニューロパチー、アルツハイマー病、血管性認知症、レビー小体型認知症又はその任意の組合せが挙げられるが、それらには限定されない。

「薬剤」は、化合物が所望の濃度及び効力で投与されるような要領で化合物を被検者に導入するための溶液又は担体をいう。薬剤は溶媒、安定化助剤、緩衝剤及び充・剤を含みうるが、これらには限定されない。医薬品とは、治療又は診断での使用（ただし、それらには限定されない）を含め、薬理作用その他の生物学的特性を有する薬剤をいう。

ミエリンを含まない組織との会合より、ミエリンとの会合のほうがより頻繁に、より高速に、より長期間にわたって又はより高い親和力で生じる場合に、薬剤はミエリンに対して「特異的結合」を示すという。「非特異的結合」は、薬剤がミエリンを含まない組織と結合することをいう。相対的な結合値（例えば、特異的結合又は非特異的結合）に関して、各サンプルの測定は同様の物理的条件（すなわち、温度、ｐＨ、組成及び投与様式）下で実施するべきである。特異的結合は、一般に、標的に対する薬剤の親和力が比較的高く、容量が比較的低い、ないし中程度であることを特徴とする。一般に、親和定数Ｋ_aが少なくとも１０⁶Ｍ^-1であるときにその結合は特異的であるとされる。大きい親和定数は、親和力がそれだけ強いこと従って特異性が概してそれだけ高いことを示す。例えば、抗体は一般に１０⁶Ｍ^-1～１０⁹Ｍ^-1もしくはそれより高い親和定数で抗原と結合する。「非特異的な」結合は通常、親和力が低く、容量が中程度ないし高い。通常、非特異的結合は親和定数が１０⁶Ｍ^-1未満のときに生じる。薬剤を組織と接触させる時間及び方法を制御することで非特異的結合が低減される。

「洗浄」は、非標識溶液その他の物質（次のものに限定されないが、例えば、水、生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）、緩衝生理食塩水又はエタノール）内での浸漬又はかかる溶液又は物質の反復適用による洗い流し（フラッシング）等（ただし、それらには限定されない）を行い、それにより、ミエリンとの特異的結合を消失することなく、非結合の、もしくは非特異的結合した、標識化合物を組織もしくは組織のサンプルの無髄成分から解離させる、分散させる又は除去するための媒質を提供する任意の方法を一般的に表す。

「ベースライン蛍光」は、蛍光発光化合物の投与もしくは結合がない状態で外部電磁放射源にさらされたときに、組織もしくは組織のサンプルによって放出される電磁放射の周波数及び大きさをいう。ベースライン蛍光は、かかる蛍光発光化合物の投与及び結合並びに外部電磁放射源への暴露の後に放出される放射とは区別される。

「組織切片を代表する対照サンプル」は、分析対象の組織サンプルと同様の大きさ、形態又は構造の組織サンプルであって、他のサンプルのミエリンレベルと比較する際に基準となるミエリンレベルを有する組織サンプルをいう。

「医薬担体」は、標的との特異的結合を行うのに有効な滞留時間が確保できるように、或いは放出が簡易になされるように、薬剤材料を適用部位、周囲組織又は製造した組織切片に適用できる組成物をいう。可溶化方法の例として、ｐＨの調整、塩の生成、イオン性化合物の生成、錯化、並びに共溶媒、界面活性剤、ミセル、エマルジョン及びマイクロエマルジョンの使用が挙げられうるが、これらには限定されない。医薬担体は、可溶化剤、経皮促進剤、洗剤、緩衝液、安定剤及び防腐剤を含みうるが、これらには限定されない。その例として、ＨＣｌ、クエン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、プロピレングリコール、エタノール、ＰＥＧ－３００、シクロデキストリン、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、炭酸塩又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが挙げられるが、これらには限定されない。経皮促進剤の一例はラウロカプラムである。これは、経皮透過のように化合物を障壁を越えて輸送もしくは送達することもできる。

「脱髄モデル」は、神経細胞を覆う絶縁物質の鞘部分に対して実験によって誘起した任意の損傷又はかかる鞘部分の任意の機能不全であって、神経障害性脱髄の実験研究に使用しうるものをいう。これには実験的アレルギー性脳脊髄炎を含むが、それには限定されない。

「髄鞘再生」は、ニューロンの軸索を覆う絶縁物質の鞘部分の、自発的な、治療による又は実験によって誘起された、修復、再生、或いは構造ないし機能の向上をいう。

「アルキル」は直鎖型、分岐型又は環状型の炭化水素構造及びその組合せを含むものとし、低級アルキル及び高級アルキルを含むとする。アルキル基はＣ２０以下とする。「低級アルキル」は、炭素原子数１～６、好ましくは炭素原子数１～４のアルキル基をいい、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、並びにｎ－、ｓ－及びｔ－ブチルを含む。高級アルキルは、炭素数が７以上、好ましくは炭素数が７～２０のアルキル基をいい、ｎ－、ｓ－及びｔ－ヘプチル、オクチル及びドデシルを含む。シクロアルキルはアルキルの一部であり、炭素原子数３～８の環状炭化水素基を含む。シクロアルキル基の例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びノルボルニルが挙げられる。アルケニルとアルキニルは、各々２以上の水素原子が二重結合又は三重結合に置き換わったアルキル基をいう。

「置換」の語が付く基は、アルキル、アルキルアリール、アリール、アリールアルキル及びヘテロアリール（ただし、それらには限定されない）を含む残基であって、その残基の３個以下の水素原子が、低級アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ハロアルキル、アルコキシ、カルボニル、カルボキシ、カルボキシアルコキシ、カルボキサミド、アシルオキシ、アミジノ、ニトロ、ハロ、ヒドロキシ、ＯＣＨ（ＣＯＯＨ）₂、シアノ、第一アミノ、第二アミノ、アシルアミノ、アルキルチオ、スルホキシド、スルホン、フェニル、ベンジル、フェノキシ、ベンジルオキシ、ヘテロアリール又はヘテロアリールオキシで置換されているものをいう。

「電子供与基」は、π共役系に電子密度を与え、それによって求核性を高める化学基をいう。電子供与基は、π電子系の隣接原子に孤立対電子があることによって認識しうる。電子供与基の例として、－ＮＲ’Ｒ”、－ＮＨＲ、－ＮＨ₂、－ＮＣ（ＮＨ₂）₂、－ＯＨ、－ＯＲ、－ＳＲ、－ＮＨＣＯＲ、－ＯＣＯＲ、－Ｃ₆Ｈ₅及び－ＣＨ＝ＣＲ₂が挙げられるが、これらには限定されない。

「電子求引基」は、π共役系から電子密度を奪い、それによって構造体の求核性を下げる化学基をいう。電子求引基は、π電子系の隣接原子が電気陰性度がより高い原子との間に複数の結合を有すること又は形式正電荷を有することによって認識しうる。電子求引基の例として、－ＣＨＯ、－ＣＯＲ、－ＣＯＯＲ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ₂、－ＣＯＮＨＲ、－ＣＯＮＲ₂、－ＣＦ₃、－ＣＮ、－Ｃ＝Ｃ（ＣＮ）₂、－ＳＯ₃Ｈ、－ＮＨ₃ ⁺、－ＮＲ₃ ⁺、－ＮＯ₂、－ＳＯＲ、－ＳＯ₂Ｒ、－ＳＯ₂ＮＨ₂、－ＳＯ₂ＮＨＲ及び－ＳＯ₂ＮＲ₂が挙げられるが、これらには限定されない。

無髄組織との会合よりも有髄組織との会合のほうがより頻繁に、より高速に、より長期間にわたって又はより高い親和力で生じる場合、或いは、無髄組織中より有髄組織中のほうがより多く吸収される、もしくはより多く蓄積する場合、薬剤は有髄組織に対して「特異的な摂取」を示すという。特異的な摂取は、一般に、標的に対する薬剤の親和力が比較的高いことを特徴とする。

特に記載のないかぎり、明細書及び特許請求の範囲に用いる、成分の量、特性（例えば、分子量）、反応条件等を表すすべての数値は、「約」の語によって常に修飾されているものと理解するべきである。したがって、そうでない旨の記載がないかぎり、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に記載する数値パラメータは概数であり、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変動しうる。最低限において、かつ特許請求の範囲への均等論の適用を制限しようとするのではなく、各々の数値パラメータは、少なくとも、報告される有効数字の桁数を考慮して、また通常の丸め方を適用することによって、解釈するべきである。

本明細書に記載する化合物の多くは１以上の不斉中心を有しえ、したがって、鏡像異性体（エナンチオマー）、ジアステレオ異性体（ジアステレオマー）その他の立体異性体形態が生じうる。これは絶対立体配置について「（Ｒ）－」又は「（Ｓ）－」で定義されうる。薬剤の化学構造は、例えば、可能なすべてのかかる異性体、並びにそのラセミ形態及び光学的に純粋な形態を含むが、これらには限定されない。光学活性な（Ｒ）－及び（Ｓ）－異性体は、キラルなシントン又はキラルな試薬を用いて製造できうるか又は従来の手法を用いて分離できうる。本明細書に記載する化合物がオレフィン性二重結合もしくは他の幾何学的非対称性の中心を有する場合、特に記載のないかぎり、それらの化合物はＥ及びＺの幾何異性体をともに含むものとする。同様に、すべての互変異性形態も含まれる。

ある実施形態では、ミエリン塩基性タンパク質と特異的に結合する薬剤の局所適用を通してミエリン塩基性タンパク質を定性的又は定量的に検出する方法が提供される。ミエリン塩基性タンパク質との特異的結合は式Ｉの化合物又はその塩によってなされうる。

式中、Ｒ¹はアルキル基であり、Ｒ²は電子供与基であり、Ｒ³は電子求引基である。

ある実施形態では、Ｒ¹は炭素原子数１～６、好ましくは炭素原子数１～４の低級アルキル基であり、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、並びにｎ－、ｓ－及びｔ－ブチルを含む。電子供与基であるＲ²は、第一、第二もしくは第三アミン又はアルコキシ基を含みうる。好ましくは、Ｒ²はアミン、さらに好ましくはＮＨ₂でありうる。

一部の好ましい実施形態では、ミエリン塩基性タンパク質との特異的結合は、式Ｉ（ａ）の化合物又はその塩によってなされうる。

式中、Ｒ⁴及びＲ⁵は、薬剤の水溶解度の向上及びｌｏｇＰの低減のために用いられうる。Ｒ⁴及びＲ⁵は独立に水素原子又はアルキル基、好ましくは炭素原子数１～６の低級アルキル基でありうる。他の実施形態では、Ｒ⁴及びＲ⁵は独立に置換アルキル基（次のものに限定されないが、例えば、アルコキシ又はアルコール）でありうる。ある実施形態では、アルコキシ基はエチレングリコール単位又はエチレングリコール末端アルコールを含有しうる。例えば、（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_nＸ又はＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_nＯＸ（式中、ｎは１～６の整数であり、Ｘは水素、メチル基又はエチル基である。）が挙げられる。さらに他の実施形態では、Ｒ⁴とＲ⁵とが非置換又は置換ヘテロ環構造を形成する場合、ヘテロ環構造はピペリジン、ピペラジン、モルホリン、或いはアルキル又はアルコキシル置換ピペリジン、ピペラジン又はモルホリンでありうる。

各実施形態では、Ｒ²とスルホンアミド基Ｒ⁴Ｒ⁵ＮＳＯ₂とは、ベンゼン環及びオレフィン置換基のπ二重結合軌道を介して共役している。それにより、電子が電子供与基から電子求引基に流れる明確な経路が形成されている。

ある実施形態では、薬剤は式Ｉの塩でありえ、Ｒ⁴及びＲ⁵はアニオンとともにアンモニウムカチオンを含みうる。アンモニウム塩は第三アンモニウム塩でありえ、アニオンはハロゲンイオンでありうる。他の実施形態では、アニオンは多原子アニオン（次のものに限定されないが、例えば、硝酸塩、炭酸塩、硫酸塩及びリン酸塩のアニオン）でありうる。多原子アニオンは、ハロゲンイオン（次のものに限定されないが、例えば、テトラフルオロホウ酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、フルオロポリリン酸塩の各アニオン又はその組合せ）をも含みうる。さらに他の実施形態では、アニオンはカルボン酸（次のものに限定されないが、例えば、クエン酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、イタコン酸塩又はアスコルビン酸塩）に由来しうる。インビボ適用においては、生物学的毒性の低いアニオンが好ましい。

式Ｉの他の非限定的な例を表１（式Ｉ（ｂ～ｆ））に示す。

ある実施形態では、類似の薬剤に比べて水溶解度が高い薬剤は、非標的組織（例えば、脂肪組織）への薬剤の非特異的な分配を低減しうる。また、水溶解度を高めると知られている毒作用がより少ないか、もしくはまったくない医薬担体中に薬剤を調合することが可能になりうる。その場合、より高い投与量での使用に適するとともに、研究者や臨床医にとって重要な診断及び治療の手段となる。

ある実施形態では、薬剤の励起スペクトル特性に合わせて調整した光源を適用領域に適用しうる。薬剤は、その発光スペクトル特性に合わせて調整した光学フィルタを通して観察しうる。蛍光剤との特異的結合により、神経その他のミエリン含有組織を、ミエリン塩基性タンパク質を含まない組織から区別することができる。それにより、蛍光発光組織を回避することで外科医が有髄組織を誤って切断もしくは損傷することが回避可能になるか、或いは意図した有髄組織に対する正確な治療が促進される。

ある実施形態では、医薬品は特別な形態の製剤でありえ、溶液、粉体、ゲル、エマルジョン、クリーム、軟膏、ビーズ又はコラーゲン移植片の形態で局部的に適用することができる。

局所投与後、薬剤の励起スペクトル特性に合わせて調整した光源を適用領域に適用しうる。薬剤は、その発光スペクトル特性に合わせて調整した光学フィルタを通して観察しうる。蛍光剤との特異的結合により、神経その他のミエリン含有組織を、ミエリン塩基性タンパク質を含まない組織から区別することができる。それにより、例えば、蛍光発光組織を回避することで外科医が有髄組織を誤って切断もしくは損傷することが回避可能になるか、或いは意図した有髄組織に対する正確な治療が促進される。ある実施形態では、薬剤は式Ｉの化合物を含有する。

患者の髄鞘形成が不足かどうかを判断するため、髄鞘形成レベルを、ミエリン性ニューロパチーが発症していないと考えられる（或いは判明している）１人以上の被検者が示す髄鞘形成レベルと比較してもよい。別の実施形態では、脱髄又は髄鞘再生の速度を決定しうる。脱髄を防止もしくは低速化する又はミエリン性ニューロパチーを患う患者の髄鞘再生を促進すると考えられる（又は予想される）既知の、もしくは推奨される治療剤を用いた治療を行った後、治療剤で処置した患者に経時的なイメージングを実施することによって髄鞘形成レベルの評価を行う。イメージングを複数の異なる時点で実施し、ある時点での髄鞘形成レベルを別の時点でのレベルと比較してもよい。その場合、髄鞘形成レベルは定性的に決定してもいいし、定量的に決定してもよい。

ミエリン塩基性タンパク質との結合が終わった段階で、非結合及び非特異的結合標識をサンプルから除去するのに好適な方法及び媒体でサンプルを洗浄しうる。このとき、ミエリン塩基性タンパク質との特異的結合が消失しないようにする。

ある実施形態では、式Ｉの化合物又はその塩を含む薬剤の溶解度、浸透度又はバイオアベイラビリティの少なくとも１つを高めるために医薬担体が用いられうる。ある実施形態では、医薬担体は、溶液中の化合物の溶解度を高めるために用いられうる以外に、例えば経皮浸透を可能とするために、化合物を障壁を越えて輸送もしくは送達するように作用しうる。

ある実施形態では、医薬担体は、術中局所投与のために、カーボポール、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ－３００）、プロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン又はラウロカプラムを含みうる。

ある実施形態では、医薬担体は、体積基準で１～３０％のＰＥＧ－３００、１～２０％のプロピレングリコール、１～１０％のポリビニルピロリドン及び０～１０％のラウロカプラムを含む水溶液である。

ある実施形態では、医薬担体は、体積基準で２０％のＰＥＧ－３００、１０％のプロピレングリコール、５％のポリビニルピロリドン及び５％のラウロカプラムを含む水溶液である。

他の医薬担体の例として、非イオン性界面活性剤を含む界面活性剤、トリグリセルチド、シクロデキストリン及びリン脂質を含む脂質、さらには他の洗剤、緩衝液、安定剤及び防腐剤が挙げられうるが、これらには限定されない。各ケースにおいて、投与時に析出、疼痛、炎症及び同種溶解の発生を制限するため、水溶性と水不溶性の両方の有機溶媒を他の医薬担体と組合せて用いてもよい。

薬剤の溶解度を高める手法として、ｐＨ調整、上述したような塩の生成、共溶媒、錯化、エマルジョン、ミセル及びリポソームが挙げられうる。医薬担体は、界面活性剤（例えば、洗剤）、緩衝液、安定剤及び防腐剤も含みうるが、これらには限定されない。ある実施形態では、担体は、化合物もしくは薬物を障壁を越えて送達するように作用する（経皮的送達を含む）経皮促進剤も含みうる。

ある実施形態では、式Ｉの化合物又はその塩を含む薬剤は、キットの形態でパッケージ化されて提供されうる。キットは、他の重要なパラメータ（例えば、ｐＨ、溶解度及び濃度）とともに当該薬剤の無菌状態を確実に維持する。キットは、投与に好適な形態（例えば、医薬担体に溶解した状態）で薬剤を含有することになるだろう。ある実施形態では、薬剤を適切に保管もしくは取り扱うために、医薬担体は共溶媒、界面活性剤、緩衝液、安定剤及び防腐剤又はその組合せをさらに含みうる。

ある実施形態では、キットは、第１のチャンバーに医薬品を、第２のチャンバーに医薬担体を収容するマルチチャンバー容器として構成されうる。ある実施形態では、医薬品は、医薬担体並びに任意選択において緩衝液、安定剤及び防腐剤又はその組合せとともに第１のチャンバーに収容されうる。適用前に溶解度を高めるため、第２のチャンバーは医薬担体の他の成分を含みうる。その場合、担体の成分は、医薬品の適用にとって意図したとおりに望ましいものでありうるが、医薬品の長期安定性にとっては有害である。

以下に非限定的な実施例を示す。これらの実施例は、本発明の様々な実施形態を説明するものである。実施例には、全身投与された造影剤と術中局所適用の神経標識造影剤とを比較する取得データが含まれる。示されるように、適切に調合された局所適用の神経標識造影剤は、全身投与の神経標識医薬品に比べ、より短時間に、より低い投与量で、かつ神経と筋肉に対してより高いコントラストで、神経を選択的に標識することができることがデータによって示されている。

インビトロでの造影剤の特性評価：
２００～８００ｎｍの波長域における医薬品の吸光度スペクトルを、Ｌａｍｂｄａ（ラムダ）２０紫外可視（ＵＶ／Ｖｉｓ）分光光度計（パーキンエルマー、本社：米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて、１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、無水メタノール（ＭｅＯＨ）及び蒸留／脱イオン水（ｄｄＨ₂Ｏ）中で測定した。次に、定常蛍光測定器（フォトンテクノロジーインターナショナル、本社：米国ニュージャージー州バーミングハム）で蛍光発光スペクトルの収集に使う励起波長として、最大吸光度の波長を使用した。

神経のエクスビボ標識：
オスのＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットから様々な神経を採取した。組織を灌流によって固定し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定後処理を行った。固定後処理の後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に作成した２０％スクロース溶液に組織を入れて凍結防止した。次に、神経をＯＣＴメディア内でメタノールとドライアイスを用いて急速冷凍した。一部のケースでは、神経をＯＣＴメディア内で鉛直に保つための補助としてポリフッ化ビニリデン膜を使用した。Ｌｅｉｃａミクロトームで５～１０ミクロンの切片をスライスし、－８０℃の冷凍庫に保管してから医薬品（１）～（５）で染色した。

神経切片のエクスビボ染色では、スライドをＰＢＳでリンスした（５分×３）。ＰＢＳ中に１０％クレモフォールＥＬ及び６５％ラット血清を含む緩衝剤中で、造影剤（最終濃度は１０μＭ）を組織に添加した。スライドを多湿の暗チャンバ内で１時間にわたってインキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し（５分×３）、カバーガラスを載せ、カスタムフィルタキューブ（励起フィルタ：３８７ｎｍ、１１ｎｍのバンドパス幅と４０９ｎｍのダイクロイックミラー；発光フィルタ：４０９ｎｍのロングパス）を用いて撮影した。自己蛍光を測定するため、同じ設定下でまったく同じ手順を用いて緩衝剤のみの対照評価も実施した。

インビボイメージングによる計測：
小動物向け市販システム：マルチスペクトルイメージングカメラ（ニュアンス、本社：米国マサチューセッツ州ウォーバーン、ＣＲＩ）を備えた蛍光立体顕微鏡（ＳｔｅＲＥＯ Ｌｕｍａｒ Ｖ１２、カールツァイス社、本社：米国ニューヨーク州ソーンウッド）を１～５秒の露光時間で使用した。中心波長が４０６ｎｍでバンド幅が１５ｎｍのフィルタを用いてフルオロフォアの励起を行った。付属のマルチスペクトルカメラを用い、蛍光発光スペクトルを４２０～７２０ｎｍの波長域で１０ｎｍ刻みで記録した。或いは、５５０ロングパスフィルタを備えた発光フィルタも以前に使用している（マルチスペクトルカメラは不使用）。

デュアルモード式腹腔鏡蛍光イメージング装置を用いてリアルタイムの術中イメージングを実施した。腹腔鏡モジュールは、視野７０度の標準的な１０ｍｍゼロ度手術用腹腔鏡、直径４ｍｍ、長さ１８００ｍｍの腹腔鏡光ガイド、３５ｍｍのビデオカプラ、９０グラムのコンパクトな６５９×４９４ピクセルＧｉｇＥカラーカメラ（ａｃＡ６４０－９０ｇｃ、バスラー、本社：ドイツ・アーレンスブルク）及び４０５ｎｍ遮断フィルタ（ＢＬＰ０１－４０５Ｒ、セムロック、本社：米国ニューヨーク州ロチェスター）を備えている。遮断フィルタは４２０～８００ｎｍにおいて９７％を超える透過率を有している。１／３インチ型センサは、７．４μｍのピクセルサイズによる高い感度と十分な視野（腹腔鏡を通過する７０度のうち４０度）を実現している。ビデオカプラは腹腔鏡のアイピースとインタフェースし、タイプの異なる腹腔鏡に対して互換性を提供する。４０５ｎｍフィルタはＣマウント用固定リングを用いてイメージセンサの正面に直接固定する。カメラはビデオカプラに直接ねじ込む。

白色光及び蛍光イメージングのための照射を、従来の光学系を用いて１つの光ガイドに結合する。光結合モジュールは、白色光ＬＥＤをコリメートする２枚の３２ｍｍ非球面レンズと直径４００μｍのマルチモードファイバに結合される青色レーザダイオード（５００ｍＷ、４０５ｎｍ）（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌａｓｅｒ＆Ｏｐｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．：中国）とで構成される。ＬＥＤスペクトルは４５０ｎｍロングパスフィルタ（ＮＴ４９－８１９、エドモンド・オプティクス、本社：米国ニュージャージー州バーリントン）でフィルタリングし、それによって蛍光剤の励起を最小限に抑える一方、白色光の色スペクトルを維持する。ＬＥＤとレーザとは４２５ｎｍのダイクロイックミラー（ＤＭＬＰ４２５Ｒ、ソーラボ）を用いて組合せる。組合せた照射を３枚目の３２ｍｍ非球面レンズ（ＡＣＬ４５３２、ソーラボ）を用いて光ガイドに結合する。ＬＥＤ及び４０５ｎｍレーザによる最大照射照度は、腹腔鏡の先端から２５ｍｍの位置において各々２．０ｍＷ／ｃｍ²と７．３ｍＷ／ｃｍ²である。

動物モデルでの造影剤の全身静注後のインビボイメージングにおける調合、投与及び動態：
静注による全身投与のため、次に示す賦形剤を用いて造影剤を調合した：５～１５％のプロピレングリコール（フィッシャーＰ３５５－１）、５～３０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（２－ＨＰβＣＤ、シグマＨ５７８４）及び７０～９０％の蒸留／脱イオン水。一部のケースではＰＥＧ－３００とＤＭＳＯも添加した。静脈内投与製剤は１Ｍの塩酸を用いて最終ｐＨを７．４にした。式Ｉ（ｆ）の化合物がこの製剤中に完全に溶解したことを、（１）微粒子がないかどうかの目視検査、（２）遠心分離（１２，０００ｇで５分間）後の観察、（３）生理的に適切な緩衝剤（例えば、セーレンセンのリン酸緩衝液）に溶解させた後の目視検査とＵＶ／Ｖｉｓ分析及び（４）動的光散乱を用いた沈殿と粒径の評価を用いて確認した。

具体的には、式Ｉ（ｆ）のための静脈内投与製剤は、８０％の蒸留／脱イオン水、１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（２－ＨＰβＣＤ、シグマＨ５７８４）及び１０％のプロピレングリコール（フィッシャーＰ３５５－１）で構成した。

マウスの研究では、体重が２５～３０ｇのＣＤ－１マウスと体重が２５０～３００ｇのＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットをチャールス・リバー・ラボラトリーズ社（本社：米国マサチューセッツ州ウィルミントン）から購入した。実験の当日、２％～４％イソフルランを使ってマウス又はラットに麻酔をかけ、調合した静脈内投与用の式Ｉ（ｆ）の化合物を１６ｍｇ／ｋｇで１回、尾静脈注射した。次に、マウスをケージに戻し、指定のイメージング時間を待った。

術中局所投与における調合と投与：
様々な製剤をいくつか試験した。これには以下が含まれるが、これらには限定されない。
製剤１：１０％のＰＥＧ－３００、２０％のＰＧ、０．４％のカーボポール、６９．６％の水；
製剤２：１０％のＤＭＳＯ、２０％のＰＥＧ－８００、２０％のＰＧ、０．１％のポリソルベート－８０、４９．９％の水；
製剤３：３０％のＰＥＧ－３００、５％のＤＭＳＯ、１０％のＰＶＡ、５５％の水；
製剤４：３０％のＰＥＧ－３００、１０％のＰＶＡ、６０％の水；
製剤５：３０％のＰＥＧ－３００、５％のＤＭＳＯ、３０％のプルロニックＦ－６８、０．１％のポリソルベート－８０、３４．９％の水；
製剤６：２０％のＰＥＧ－３００、１０％のＰＧ、５％のＰＶＰ、５％のラウロカプラム、６０％の水；
製剤７：２０％のＰＥＧ－３００、１０％のＰＧ、５％のＰＶＰ、５％のラウロカプラム、５％のＥｔＯＨ、５％のオレイン酸、１０％のＴｗｅｅｎ－８０、４０％の水；
ただし、ＰＶＡ＝ポリビニルアルコール、ＰＶＰ＝ポリビニルピロリドン、ＰＥＧ＝ポリエチレングリコールである。

上述の賦形剤を用いて様々な量の粉末造影剤を調合した。溶液又はゲルを１分未満から２０分の接触時間でマウスモデルの手術部位に適用した。次に、手術部位を洗浄液（例えば、温生理食塩水）で洗浄し、マウスの画像を撮影した。

ブタのイメージングの研究では、チレタミン／ゾラゼパム（４．４ｍｇ／ｋｇ）によってブタを鎮静させ、グリコピロレート（０．００７ｍｇ／ｋｇ）を投与した。また、開腹術の前に、局所浸潤のブピバカイン（０．２５％）を正中線に沿って皮下的に送達した。術中、ブタに挿管してイソフルラン（１．５％～２．５％）を維持した。１６番ゲージの血管カテーテルを耳の静脈に挿管して採血と投薬を行った。処置中、１０～１５ｍＬ／ｋｇ／ｈの割合でＮｏｒｍｏｓｏｌ－Ｒを与えた。ブタの安全と健康の確保のため、生命徴候、温度及び酸素供給を連続的にモニタした。溶液又はゲルを１分から５分の接触時間で手術部位に適用した。次に、手術部位を温生理食塩水で洗浄し、手術部位の画像を撮影した。

図１に、マウスのモデルにおける、静注された式Ｉ（ｆ）の化合物の摂取と排泄の動態を示す。式Ｉ（ｆ）の化合物を１６．６ｍｇ／ｋｇの投与量で投与し、静注から０．５時間、１時間、２時間、３時間及び４時間後に神経蛍光を測定した。座骨神経と脂肪組織の最大蛍光は静注の１時間後に観察され、いずれの蛍光もそれ以降の時点にかけて急減した。神経対筋肉の比の最良値は静注の１時間後に観察され、値は３．７であった。

局所投与された神経標識色素も生体動物の神経を標識することができた。神経の蛍光は術中局所適用から数分以内に検出できた。局所投与された式Ｉ（ｆ）の化合物のマウスにおける代表的な白色光画像と蛍光画像とを、図２Ａ（白色光）及び図２Ｂ（蛍光）に示す。術中用デュアルモード式腹腔鏡装置を用いて画像化するとマウスモデルの腕神経叢分岐における極めて細かい神経繊維は、蛍光ガイダンス下のほうがより容易に検出された。この実施例では、式Ｉ（ｆ）の化合物を製剤４に添加した医薬品をマウスの腕神経叢の手術部位に５分間、適用し、その領域を滅菌生理食塩水で洗浄してから撮影を行った。

図２Ｃは、静注された造影剤と同様、局所適用した造影剤が神経束に浸透できることを示している。マウスのモデルにおいて座骨神経への局所適用後に洗浄と摘出を行い、１５ミクロン厚の神経組織の凍結切片を製造した。蛍光顕微鏡画像からは、ドーナツ型のミエリン束がフルオロフォアで染色されたことがわかる。

図２Ｄは、局所適用した式Ｉ（ｄ）の化合物によるマウス内の蛍光神経標識を示す。この化合物はその中核構造が式Ｉ（ｆ）と関連している。撮影は小動物向けの市販装置を用いて行った。

図３は、マウスのモデルにおいて手術部位に局所適用した式Ｉ（ｆ）の化合物の神経対筋肉（Ｎ／Ｍ）及び神経対脂肪組織（Ｎ／Ａ）の相対比率を、術中局所適用のための様々な医薬担体について比較したものである。式Ｉ（ｆ）の化合物は上述した様々な方法で調合した。各々の製剤は、神経と周囲組織との間のコントラストに影響を与えた。例えば、製剤６と製剤４は、神経対筋肉と神経対脂肪組織との間に最良のコントラストを示した。製剤成分の各々は、（ａ）薬剤の可溶化、（ｂ）調合された造影剤の安定性、（ｃ）手術部位との接触を高めるための、調合された造影剤の粘性、（ｄ）手術部位内の造影剤の浸透度及び（ｅ）特異的な信号と非特異的なバックグラウンド蛍光、に対する影響を表すように添加された。調合した約７０マイクログラムの式Ｉ（ｆ）の化合物を約１分間、手術部位に適用した後、生理食塩水で洗浄した。

さらに、局所投与された神経標識医薬品はより鮮明な画像を生成することができる。これは、周囲の非標的組織（例えば、筋肉）からの非特異的な蛍光が低減されることによる。図４に、マウスのモデルにおいて全身（静脈内に）投与した式Ｉ（ｆ）の化合物（図４Ａ）と局所適用した式Ｉ（ｆ）の化合物（図４Ｂ）とでコントラストを比較したマルチスペクトルイメージングのプロットである。ある所与の手術部位について画像化に必要な合計投与量は、局所投与される造影剤のほうが少なかった。この実施例では、静注された式Ｉ（ｆ）の化合物の投与量は約１６ｍｇ／ｋｇ（標準的なマウスで０．４ｍｇ）であった。局所投与の投与量は製剤４で約０．１ｍｇであった。図４は、局所投与された造影剤のほうが神経がより鮮明に画像化されたことを示している。これは周囲の筋肉組織による蛍光強度が全発光波長域において全身投与された造影剤よりも低かったことによる。

術中局所投与はこれよりかなり低い濃度で行うことができる。マウスのモデルでは０．０１ｍｇという低い投与量でも蛍光神経を効果的に画像化することができる。図５の例では、０．０１又は０．０２ｍｇの式Ｉ（ｆ）の化合物を製剤６に添加した医薬品を手術部位に局所適用し、３分間インキュベートした後、生理食塩水でただちに洗浄した。

上述のものよりも大きな動物に規模を拡大し、ブダの手術モデルにおいても局所投与した式Ｉ（ｆ）の化合物を試験した。図６Ａの例では、４ｍｇの式Ｉ（ｆ）の化合物を製剤４に添加した医薬品を手術野に適用し、５分間インキュベートした後、温生理食塩水で洗浄した。白色光イメージング下では神経がまったく視認できなかったのに対し、蛍光ガイダンス下では明確に認められた（２枚のパネルの矢印）。図６Ｂの例では、０．３ｍｇの式Ｉ（ｆ）の化合物を製剤６に添加した医薬品を後腹膜領域の周りの手術部位に適用し、３分間インキュベートした後、生理食塩水で洗浄した。このように低い投与量であっても蛍光イメージングでは白色光イメージングに比べて神経（矢印）が明瞭に写った。このブタのモデルにおける上記の術中局所投与量は、全身静注の標準的な投与量（３５キログラムのブタの場合で一般に３０～５０ｍｇの神経標識医薬品）に比べてかなり低いものであった。

生体動物における式Ｉ（ｆ）及び式Ｉ（ｄ）の化合物について神経標識色素の術中局所適用についてここまで実証してきた。この種の化合物がもつ「プッシュプル」型コア構造に関係する分子も、この新たな適用法によってメリットを享受すると考えられる。以下に示すのは、切除した神経組織のエクスビボ標識の例である。ここでは、凍結切片にしたラットの神経組織の染色に用いた化合物。図７は、蛍光標識したラットの神経組織切片の顕微鏡画像の例である。ここでは「プッシュプル」型の化合物（式Ｉ（ｆ）、式Ｉ（ｄ）及び式Ｉ（ｅ））が神経組織切片に対して特に顕著な蛍光染色を示した。

本明細書では諸実施形態の一部の特徴のみを図示及び説明してきたが、当業者は多くの改変及び変更に想到するだろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の主旨に含まれるものとして、かかるすべての改変及び変更をカバーするものであることを理解するべきである。

Claims (11)

1. 下記の式Ｉの化合物又はその塩と
   水性医薬担体と
   を含む、神経の造影剤として使用するための局所投与用医薬品であって、水性医薬担体が、体積基準で１～３０％のＰＥＧ－３００、１～２０％のプロピレングリコール、１～１０％のポリビニルピロリドン及び５～１０％のラウロカプラムを含む、局所投与用医薬品。
   

   

   式中、Ｒ^１はアルキル基であり、Ｒ^２は電子供与基であり、Ｒ^４とＲ^５とが一緒にヘテロ環構造又は置換ヘテロ環構造を形成する。
2. 水性医薬担体が、体積基準で１０～３０％のＰＥＧ－３００及び５～２０％のポリビニルアルコールを含む、請求項１記載の医薬品。
3. Ｒ^１が炭素原子数１～６の低級アルキル基であり、Ｒ^２が第一、第二もしくは第三アミン又はアルコキシ基である、請求項１記載の医薬品。
4. Ｒ^４とＲ^５とが一緒にピペリジン、ピペラジン、モルホリン、或いはアルキル又はアルコキシル置換ピペリジン、ピペラジン又はモルホリンを形成する、請求項１記載の医薬品。
5. 式Ｉが次式のものである、請求項１記載の医薬品。
   

   
6. 式Ｉがアニオンをさらに含有する塩であり、アニオンが、ハロゲンイオン、多原子アニオン又は塩基性活性化合物である、請求項１記載の医薬品。
7. アニオンが塩素イオンである、請求項６記載の医薬品。
8. 神経の造影剤として使用するための局所投与用医薬品を提供するキットであって、医薬品が、
   式Ｉの化合物又はその塩と
   水性医薬担体と
   を含んでおり、水性医薬担体が、体積基準で１～３０％のＰＥＧ－３００、１～２０％のプロピレングリコール、１～１０％のポリビニルピロリドン及び５～１０％のラウロカプラムを含む、キット。
   

   

   式中、Ｒ^１はアルキル基であり、Ｒ^２は電子供与基であり、Ｒ^４とＲ^５とが一緒にヘテロ環構造又は置換ヘテロ環構造を形成する。
9. 水性医薬担体が、体積基準で１０～３０％のＰＥＧ－３００及び５～２０％のポリビニルアルコールを含む、請求項８に記載のキット。
10. 水性医薬担体が、共溶媒、界面活性剤、緩衝液、安定剤及び防腐剤又はその組合せをさらに含む、請求項８に記載のキット。
11. キットが、第１のチャンバーに医薬品を、第２のチャンバーに水性医薬担体を収容するマルチチャンバー容器をさらに含む、請求項８に記載のキット。

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