JP7103751B2

JP7103751B2 - 修飾された抗原結合ポリペプチド構築物及びその使用

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Publication number: JP7103751B2
Application number: JP2016569603A
Authority: JP
Inventors: マリオサンチェス; フォンクレウデンステイントーマススプレター; ドウニャウロセブ; ステイシーエー．エル．トム‐ユー; アダムルイコーパー; イゴールエドモンドパオロダンジェロ; ヤン‐チエチョウ; スージットビームラーオディクシット
Original assignee: ザイムワークス，インコーポレイテッド
Priority date: 2015-04-28
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2022-07-20
Anticipated expiration: 2035-05-29
Also published as: KR20230019503A; JP7183221B2; JP2020202848A; JP2024125389A; CN106661121A; KR20240093883A; KR102669686B1; JP7103751B6; JP2023027107A; JP2018502550A

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年５月２８日出願の米国特許仮出願第６２／００３，６６３号及び２０１５年４月２８日出願の米国特許仮出願第６２／１５４，０５５号の優先権の利益を主張し、これらの出願は、その全体が全ての目的において参照として本明細書に組み込まれる。

本出願は、２０１３年１１月２８日出願のＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０５０９１４、２０１２年１１月２８日出願の米国特許仮出願第６１／７３０，９０６号、２０１３年２月６日出願の米国特許仮出願第６１／７６１，６４１号、２０１３年５月２日出願の米国特許仮出願第６１／８１８，８７４号及び２０１３年８月２３日出願の米国特許仮出願第６１／８６９，２００号に関連し、それぞれの全ての開示は、その全体が全ての目的において参照として本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提供され、その全体が参照として本明細書に組み込まれる、配列表を含有する。当該ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１５年５月２９日に作成され、９７９９３－９４５２０４（０００１１０ＰＣ）＿ＳＬ．ｔｘｔと呼ばれ、２７，０１２バイトのサイズである。

二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに結合することができる。これらのエピトープは同じ抗原にあり得、またはそれぞれのエピトープは異なる抗原にあり得る。この二重特異性抗体の特徴は、様々な治療用に魅力的なツールとなり、疾患の治療において２つ以上の分子を標的にする、または動員する治療上の利益がある。二重特異性抗体を形成する１つの手法は、２つの特有の抗体重鎖及び２つの特有の抗体軽鎖の同時発現を伴う。抗体の重鎖が抗体の軽鎖と比較的不規則に結合するように進むので、野生型に類似しているフォーマットで二重特異性抗体を正確に形成することは未だに難題である。この不規則な対合の結果、２つの抗体重鎖及び２つの抗体軽鎖の同時発現は、当然のことながら不規則な重鎖－軽鎖対合をもたらす。この誤対合は、二重特異性治療薬の生成にとって未だに大きな課題であり、均質な対合が良好な製造性及び生物学的効力にとって必須要件である。

特定の抗体軽鎖またはフラグメントが抗体重鎖またはフラグメントと対合する二重特異性抗体を調製するため、いくつかの手法が記載されている。この問題に対処する様々な手法の総説は、Ｋｌｅｉｎら，（２０１２）ｍＡｂｓ４：６，１－１１（非特許文献１）において見出すことができる。国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５６３８８（国際出願公開第２０１１／１３１７４６号）（特許文献１）は、還元条件下でインキュベートして２つの単一特異性ＩｇＧ４抗体またはＩｇＧ４様抗体の間に「Ｆａｂアーム」または「半分子」の方向性をもった交換を導くため、２つの単一特異性出発タンパク質のＣＨ３領域に非対称性突然変異を投入する、ヘテロ二量体タンパク質を生成するインビトロ方法を記載する。

Ｓｃｈａｅｆｅｒら（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＧｍｂＨ）は、２つの存在する抗体から誘導された２つの重鎖及び２つの軽鎖を、ヒト二価二重特異性ＩｇＧ抗体に、人工的なリンカーを使用することなく組み立てる方法を記載する（ＰＮＡＳ（２０１１）１０８（２７）：１１１８７－１１１９２（非特許文献２））。この方法は、二重特異性抗体の半分の抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）内の重鎖及び軽鎖ドメインを交換することを伴う。

Ｓｔｒｏｐら（Ｒｉｎａｔ－ＰｆｉｚｅｒＩｎｃ．）は、目的の２つの抗体を別々に発現及び精製し、次に特定のレドックス条件下で一緒に混合することによって、安定した二重特異性抗体を生成する方法を記載する（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１２）４２０：２０４－１９（非特許文献３））。

Ｚｈｕら（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、定常ドメインを完全に欠いている、可変ドメイン抗体フラグメントからなるダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）構築物のＶＬ／ＶＨ界面に突然変異を遺伝子工学的に作り、ヘテロ二量体ダイアボディを生成した（ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ（１９９７）６：７８１－７８８（非特許文献４））。同様に、Ｉｇａｗａら（Ｃｈｕｇａｉ）も、ダイアボディの選択的発現を促進し、配座異性化を阻害するため、単鎖ダイアボディのＶＬ／ＶＨ界面に突然変異を遺伝子工学的に作った（ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（２０１０）２３：６６７－６７７（非特許文献５））。

米国特許公開第２００９／０１８２１２７号（特許文献２）（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ，Ｉｎｃ．）は、軽鎖－重鎖対のＦｃ界面及びＣＨ１：ＣＬ界面におけるアミノ酸残基を修飾して、一方の対の軽鎖が他方の対の重鎖と相互作用する能力を低減させることによる、二重特異性抗体の生成を記載する。

米国特許公開第２０１４／０３７００２０号（特許文献３）（Ｃｈｕｇａｉ）は、抗体のＣＨ１及びＣＬ領域の会合を、これらの領域の界面に存在するアミノ酸を荷電アミノ酸に置換することによって調節することを記載する。

国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５６３８８（国際出願公開第２０１１／１３１７４６号）米国特許公開第２００９／０１８２１２７号米国特許公開第２０１４／０３７００２０号

Ｋｌｅｉｎら，（２０１２）ｍＡｂｓ４：６，１－１１ＰＮＡＳ（２０１１）１０８（２７）：１１１８７－１１１９２Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１２）４２０：２０４－１９ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ（１９９７）６：７８１－７８８ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（２０１０）２３：６６７－６７７

少なくとも第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体を含み、第１のヘテロ二量体が、第１の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列（Ｈ１）及び第１の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド配列（Ｌ１）を含み、第２のヘテロ二量体が、第２の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列（Ｈ２）及び第２の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド配列（Ｌ２）を含み、第１のヘテロ二量体のＨ１またはＬ１配列のうち少なくとも１つが、第２のヘテロ二量体の対応するＨ２またはＬ２とは異なり、Ｈ１及びＨ２がそれぞれ、少なくとも重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈドメイン）及び重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１ドメイン）を含み、Ｌ１及びＬ２がそれぞれ、少なくとも軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌドメイン）及び軽鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｌドメイン）を含み、Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１及びＬ２のうち少なくとも１つが、少なくとも１個のアミノ酸修飾を少なくとも１つの定常ドメイン及び／または少なくとも１つの可変ドメインに含み、Ｈ１が、Ｌ２よりもＬ１と優先的に対合し、Ｈ２が、Ｌ１よりもＬ２と優先的に対合する、単離された抗原結合ポリペプチド構築物が、本明細書に記載される。

いくつかの態様において、構築物はヘテロ二量体Ｆｃを更に含み、Ｆｃは、少なくとも２つのＣ_Ｈ３配列を含み、Ｆｃは、一つまたは複数のリンカーを用いて、または用いることなく、第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体に結合し、二量体化Ｃ_Ｈ３配列は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により測定して、約６８℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、構築物は、二重特異性である。

いくつかの態様において、少なくとも１個のアミノ酸修飾は、表または実施例に示されている少なくとも１個のアミノ酸修飾から選択される。

いくつかの態様において、Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１及びＬ２が細胞もしくは哺乳類細胞において同時発現するとき、またはＨ１、Ｈ２、Ｌ１及びＬ２が無細胞発現系において同時発現するとき、またはＨ１、Ｈ２、Ｌ１及びＬ２が同時産生されるとき、またはＨ１、Ｈ２、Ｌ１及びＬ２が、レドックス産生方法を介して同時産生されるとき、Ｈ１は、Ｌ２よりもＬ１と優先的に対合し、Ｈ２は、Ｌ１よりもＬ２と優先的に対合する。

いくつかの態様において、Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１及びＬ２のうち少なくとも１つは、Ｈ１が、Ｌ２よりもＬ１と優先的に対合する及び／またはＨ２が、Ｌ１よりもＬ２と優先的に対合するように、Ｖ_Ｈ及び／またはＶ_Ｌドメインのうち少なくとも１個のアミノ酸修飾、ならびにＣ_Ｈ１及び／またはＣ_Ｌドメインのうち少なくとも１個のアミノ酸修飾を含む。

いくつかの態様において、Ｈ１が、Ｃ_Ｈ１ドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を含む場合、Ｌ１及びＬ２のうち少なくとも１つは、Ｃ_Ｌドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を含む及び／又またはＨ１が、Ｖ_Ｈドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を含む場合、Ｌ１及びＬ２のうち少なくとも１つは、Ｖ_Ｌドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を含む。

いくつかの態様において、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２及び／またはＬ２は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸修飾を含む。いくつかの態様において、Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１及びＬ２のうち少なくとも１つは、少なくとも１つの定常ドメイン及び／または少なくとも１つの可変ドメインに少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸修飾を含む。

いくつかの態様において、Ｌ１及びＬ２の両方が、Ｈ１及びＨ２のうち少なくとも１つと同時発現するとき、Ｈ１－Ｌ１及びＨ２－Ｌ２ヘテロ二量体対のうち少なくとも１つの相対的な対合は、それぞれ対応するＨ１－Ｌ２またはＨ２－Ｌ１ヘテロ二量体対に対して、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％を超え、修飾されたＨ１－Ｌ１またはＨ２－Ｌ２ヘテロ二量体対の相対的な対合は、少なくとも１個のアミノ酸修飾を有さない対応するＨ１－Ｌ１またはＨ２－Ｌ２ヘテロ二量体対において観察されるそれぞれの相対的な対合よりも大きい。

いくつかの態様において、第１及び第２のヘテロ二量体のうち少なくとも１つの、ＤＳＦにより測定する融解温度（Ｔｍ）によって測定する熱安定性は、少なくとも１個のアミノ酸修飾を有さない対応するヘテロ二量体のＴｍの約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０℃以内である。いくつかの態様において、少なくとも１個のアミノ酸修飾を含むヘテロ二量体それぞれの、ＤＳＦにより測定する融解温度（Ｔｍ）によって測定する熱安定性は、少なくとも１個のアミノ酸修飾を有さない対応するヘテロ二量体のＴｍの約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０℃以内である。いくつかの実施形態において、少なくとも１個のアミノ酸修飾を含むヘテロ二量体それぞれの、ＤＳＦにより測定する融解温度（Ｔｍ）によって測定する熱安定性は、少なくとも１個のアミノ酸修飾を有さない対応するヘテロ二量体のＴｍの約０、１、２または３℃以内である。

いくつかの態様において、結合する抗原への各ヘテロ二量体の親和性は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）またはＦＡＣＳにより測定すると、同じ抗原への対応する未修飾ヘテロ二量体の親和性の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以内である。

いくつかの態様において、Ｈ１及びＬ１のうち少なくとも１つは、Ｈ１が、Ｌ２よりもＬ１と対合するとき、アミノ酸のより大きな立体相補性をもたらす少なくとも１個のアミノ酸修飾を含む少なくとも１つのドメインを含む。いくつかの態様において、Ｈ２及びＬ２のうち少なくとも１つは、Ｈ２が、Ｌ１よりもＬ２と対合するとき、アミノ酸のより大きな立体相補性をもたらす少なくとも１個のアミノ酸修飾を含む少なくとも１つのドメインを含む。いくつかの態様において、Ｈ１及びＬ１のうち少なくとも１つは、Ｈ１が、Ｌ２よりもＬ１と対合するとき、荷電アミノ酸の間により大きな静電相補性をもたらす少なくとも１個のアミノ酸修飾を含む少なくとも１つのドメインを含む。いくつかの態様において、Ｈ２及びＬ２のうち少なくとも１つは、Ｈ２が、Ｌ１よりもＬ２と対合するとき、荷電アミノ酸の間により大きな静電相補性をもたらす少なくとも１個のアミノ酸修飾を含む少なくとも１つのドメインを含む。

いくつかの態様において、少なくとも１個のアミノ酸修飾は、表または実施例の少なくとも１つに示されている突然変異のセットである。

いくつかの態様において、構築物は、少なくとも２つのＣ_Ｈ３配列を含むＦｃを更に含み、Ｆｃは、一つまたは複数のリンカーを用いて、または用いることなく、第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体と結合する。

いくつかの態様において、Ｆｃは、ヒトＦｃ、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ、ヒトＩｇＡＦｃ、ヒトＩｇＧＦｃ、ヒトＩｇＤＦｃ、ヒトＩｇＥＦｃ、ヒトＩｇＭＦｃ、ヒトＩｇＧ２Ｆｃ、ヒトＩｇＧ３ＦｃまたはヒトＩｇＧ４Ｆｃである。いくつかの態様において、Ｆｃはヘテロ二量体Ｆｃである。いくつかの態様において、Ｆｃは、Ｃ_Ｈ３配列のうち少なくとも一つに、一つまたは複数の修飾を含む。いくつかの態様において、二量体化Ｃ_Ｈ３配列は、ＤＳＣにより測定すると、約６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７７．５、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４もしくは８５℃、またはそれより高い融解温度（Ｔｍ）を有する。いくつかの態様において、Ｆｃは、産生されるとき、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％を超える純度で形成されるヘテロ二量体である、あるいはＦｃは、発現するとき、または単一細胞を介して発現するとき、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％を超える純度で形成されるヘテロ二量体である。いくつかの態様において、Ｆｃは、野生型ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を有するヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進するＣ_Ｈ３配列のうち少なくとも一つに、一つまたは複数の修飾を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、少なくとも１つのＣ_Ｈ２配列を更に含む。いくつかの態様において、ＦｃのＣ_Ｈ２配列は、一つまたは複数の修飾を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、Ｆｃガンマ受容体の選択的結合を促進する一つまたは複数の修飾を含む。

いくつかの実施形態において、Ｆｃは、
ｉ）第１のＦｃポリペプチドに修飾Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを有し、第２のＦｃポリペプチドに修飾Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを有する、ヘテロ二量体ＩｇＧ１Ｆｃ；
ｉｉ）第１のＦｃポリペプチドに修飾Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを有し、第２のＦｃポリペプチドに修飾Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを有する、ヘテロ二量体ＩｇＧ１Ｆｃ；
ｉｉｉ）第１のＦｃポリペプチドに修飾Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを有し、第２のＦｃポリペプチドに修飾Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを有する、ヘテロ二量体ＩｇＧ１Ｆｃ；
ｉｖ）第１のＦｃポリペプチドに修飾Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを有し、第２のＦｃポリペプチドに修飾Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを有する、ヘテロ二量体ＩｇＧ１Ｆｃ；または
ｖ）第１のＦｃポリペプチドに修飾Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを有し、第２のＦｃポリペプチドに修飾Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを有する、ヘテロ二量体ＩｇＧ１Ｆｃを含む。

いくつかの態様において、Ｆｃは、一つまたは複数のリンカーによりヘテロ二量体に結合する、またはＦｃは、一つまたは複数のリンカーによりＨ１及びＨ２に結合する。いくつかの態様において、一つまたは複数のリンカーは、一つまたは複数のポリペプチドリンカーである。いくつかの態様において、一つまたは複数のリンカーは、一つまたは複数の抗体ヒンジ領域を含む。いくつかの態様において、一つまたは複数のリンカーは、一つまたは複数のＩｇＧ１ヒンジ領域を含む。いくつかの態様において、一つまたは複数のリンカーは、一つまたは複数の修飾を含む。いくつかの態様において、一つまたは複数のリンカーへの一つまたは複数の修飾は、Ｆｃガンマ受容体の選択的結合を促進する。

いくつかの態様において、少なくとも１個のアミノ酸修飾は、少なくとも１個のアミノ酸突然変異である、または少なくとも１個のアミノ酸修飾は、少なくとも１個のアミノ酸置換である。

いくつかの態様において、Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１及びＬ２のそれぞれの配列は、ヒト配列に由来する。

いくつかの態様において、構築物は、多特異性または二重特異性である。いくつかの態様において、構築物は、多価または二価である。

いくつかの態様において、本明細書に記載されるヘテロ二量体は、優先的に対合して、二重特異性抗体を形成する。例えば、いくつかの実施形態において、重鎖ポリペプチド配列Ｈ１及びＨ２は、重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１ドメイン）、Ｃ_Ｈ２ドメイン及びＣ_Ｈ３ドメインを含む完全長の重鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体において正確に対合する重鎖及び軽鎖（例えば、Ｈ１－Ｌ１：Ｈ２－Ｌ２）の率は、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％を超える。

本明細書に記載される構築物または重鎖もしくは軽鎖をコードする少なくとも１つの配列を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドのセットも、本明細書に記載される。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットは、ｃＤＮＡである。

本明細書に記載されるポリヌクレオチドのうち一つまたは複数またはポリヌクレオチドのセットを含む、ベクターまたはベクターのセットも、本明細書に記載される。いくつかの態様において、ベクターまたはベクターのセットは、プラスミド、複数シストロンベクター、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳類ベクター、発現ベクター及び組換え発現ベクターからなる群から選択される。

本明細書に記載されるポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、または本明細書に記載されるベクターもしくはベクターのセットを含む単離細胞も、本明細書に記載される。いくつかの態様において、細胞は、ハイブリドーマ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＨＥＫ２９３細胞である。

本明細書に記載される構築物と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物も、本明細書に記載される。いくつかの態様において、組成物は、緩衝液、酸化防止剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂質、キレート剤、安定剤及び賦形剤からなる群から選択される一つまたは複数の物質を更に含む。

対象における疾患もしくは障害、または癌もしくは血管疾患の治療における、あるいは医薬品の製造における、本明細書に記載される構築物または本明細書に記載される薬学的組成物の使用も、本明細書に記載される。

本明細書に記載される構築物または本明細書に記載される組成物を対象に投与することを含む、疾患もしくは障害、または癌もしくは血管疾患を有する対象の治療方法も、本明細書に記載される。

本明細書に記載される構築物を宿主細胞培養物から得る方法であって、（ａ）構築物をコードする一つまたは複数の核酸配列を含む少なくとも１つの宿主細胞を含む宿主細胞培養物を得るステップと、（ｂ）宿主細胞培養物から構築物を回収するステップとを含む方法も、本明細書に記載される。

（ａ）Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２及びＬ２を得るステップと、（ｂ）Ｈ１を、Ｌ２よりもＬ１と優先的に対合させ、かつＨ２を、Ｌ１よりもＬ２と優先的に対合させるステップと、（ｃ）構築物を得るステップとを含む、本明細書に記載される構築物を得る方法も、本明細書に記載される。

少なくとも１つの構築物をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットを得る段階と、少なくとも１つの宿主細胞に導入するためにポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットのそれぞれの最適な比を決定する段階であって、最適な比が、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２及びＬ２の発現の際に形成された誤対合Ｈ１－Ｌ２及びＨ２－Ｌ１ヘテロ二量体対と比較して、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２及びＬ２の発現の際に形成されたＨ１－Ｌ１及びＨ２－Ｌ２ヘテロ二量体対の量を評価することによって決定される段階と、好ましい最適比を選択する段階であって、好ましい最適比のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットによる少なくとも１つの宿主細胞への形質移入が、構築物の発現をもたらす段階と、少なくとも１つの宿主細胞に、最適比のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットにより形質移入する段階と、少なくとも１つの宿主細胞を培養して、構築物を発現させる段階と、を含む、本明細書に記載される構築物を調製する方法も、本明細書に記載される。

いくつかの態様において、最適比を選択する段階は、一過性形質移入系における形質移入によって評価される。いくつかの態様において、好ましい最適比のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットによる少なくとも１つの宿主細胞への形質移入は、構築物の最適な発現をもたらす。いくつかの態様において、構築物は、少なくとも２つのＣ_Ｈ３配列を含むＦｃを含み、Ｆｃは、一つまたは複数のリンカーを用いて、または用いることなく、第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体と結合する。いくつかの態様において、Ｆｃは、場合により一つまたは複数のアミノ酸修飾を含むヘテロ二量体である。

第１の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列（Ｈ１）と第１の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド配列（Ｌ１）とを含む第１のヘテロ二量体及び第２の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列（Ｈ２）と第２の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド配列（Ｌ２）とを含む第２のヘテロ二量体に相補的突然変異を表すデータを含み、Ｈ１及びＨ２がそれぞれ、少なくとも重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈドメイン）及び重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１ドメイン）を含み、Ｌ１及びＬ２がそれぞれ、少なくとも軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌドメイン）及び軽鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｌドメイン）を含み、相補的突然変異のデータセットが、表もしくは実施例に提示されている突然変異またはこれらの突然変異のサブセットを表すデータを含む、データセット、ならびにＨ１が、Ｌ２よりもＬ１と優先的に対合する及び／またはＨ２が、Ｌ１よりもＬ２と優先的に対合する可能性を決定するコンピューター実行可能コード、を記憶するコンピューター読み取り可能記憶媒体も、本明細書に記載される。

第１の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列（Ｈ１）と第１の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド配列（Ｌ１）とを含む第１のヘテロ二量体及び第２の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列（Ｈ２）と第２の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド配列（Ｌ２）とを含む第２のヘテロ二量体に相補的突然変異を表すデータを含み、Ｈ１及びＨ２がそれぞれ、少なくとも重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈドメイン）及び重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１ドメイン）を含み、Ｌ１及びＬ２がそれぞれ、少なくとも軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌドメイン）及び軽鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｌドメイン）を含むデータセットであって、相補的突然変異のデータセットが、表もしくは実施例に提示されている突然変異またはこれらの突然変異のサブセットを表すデータを含む、データセットを得る段階と、Ｈ１が、Ｌ２よりもＬ１と優先的に対合する及び／またはＨ２が、Ｌ１よりもＬ２と優先的に対合する可能性をコンピュータープロセッサーにより決定する段階と、を含む、優先的対形成を決定するコンピューターによる実施方法も、本明細書に記載される。いくつかの態様において、方法は、本明細書に記載される構築物を産生する段階を更に含む。

二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物を産生する方法であって、該二重特異性構築物が、第１の単一特異性抗原結合ポリペプチドの第１の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列（Ｈ１）と第１の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド配列（Ｌ１）とを含む第１のヘテロ二量体及び第２の単一特異性抗原結合ポリペプチドの第２の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列（Ｈ２）と第２の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド配列（Ｌ２）とを含む第２のヘテロ二量体を含み、Ｈ１及びＨ２がそれぞれ、少なくとも重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈドメイン）及び重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１ドメイン）を含み、Ｌ１及びＬ２がそれぞれ、少なくとも軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌドメイン）及び軽鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｌドメイン）を含み、本明細書に記載されるデータセットの一つまたは複数の相補的突然変異を第１のヘテロ二量体及び／または第２のヘテロ二量体に導入する段階と、第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体を少なくとも１つの宿主細胞に同時発現させて、二重特異性構築物を含む発現産物を産生する段階と、を含む方法も、本明細書に記載される。

いくつかの態様において、方法は、発現産物における二重特異性構築物の量を、他のポリペプチド産物と比べて決定して、相補的突然変異の好ましいサブセットを選択する段階を更に含む。いくつかの態様において、二重特異性構築物は、他のポリペプチド産物と比較して、７０％を超える（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超える）純度で産生される。いくつかの態様において、データセットは、本明細書に記載されるデータセットである。いくつかの態様において、方法は、追加のアミノ酸修飾を、Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１またはＬ２のうち少なくとも１つに付加して、二重特異性構築物の純度を他のポリペプチド産物と比較して増加させるステップを更に含む。いくつかの態様において、構築物は、少なくとも２つのＣ_Ｈ３配列を含むＦｃを含み、Ｆｃは、一つまたは複数のリンカーを用いて、または用いることなく、第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体と結合する。いくつかの態様において、Ｆｃは、場合により一つまたは複数のアミノ酸修飾を含むヘテロ二量体である。いくつかの態様において、抗原結合ポリペプチドは、抗体、ＦａｂまたはｓｃＦｖである。

構築物のいくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ｌ１２４、Ｋ１４５、Ｄ１４６、Ｑ１７９及びＳ１８６に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｑ１２４、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｑ１６０、Ｓ１７６、Ｔ１７８及びＴ１８０に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。例えば、いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ｌ１２４Ｒ、Ｌ１２４Ｅ、Ｋ１４５Ｍ、Ｋ１４５Ｔ、Ｄ１４６Ｎ、Ｑ１７９Ｅ、Ｑ１７９Ｋ、Ｓ１８６Ｒ及びＳ１８６Ｋから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１３１Ｒ、Ｓ１３１Ｋ、Ｖ１３３Ｇ、Ｑ１６０Ｅ、Ｓ１７６Ｒ、Ｓ１７６Ｄ、Ｔ１７８Ｄ、Ｔ１７８Ｅ及びＴ１８０Ｅから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、Ｌ１２４Ｅ、Ｋ１４５Ｍ、Ｋ１４５Ｔ及びＱ１７９Ｅまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ１は、Ｓ１３１Ｒ、Ｓ１３１Ｋ、Ｖ１３３Ｇ及びＳ１７６Ｒまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｈ２は、Ｌ１２４Ｒ、Ｄ１４６Ｎ、Ｑ１７９Ｋ、Ｓ１８６Ｒ及びＳ１８６Ｋまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ２は、Ｑ１２４Ｅ、Ｖ１３３Ｇ、Ｑ１６０Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｔ１７８Ｄ、Ｔ１７８Ｅ及びＴ１８０Ｅまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｌ１２４Ｅ、Ｋ１４５Ｔ及びＱ１７９Ｅを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｓ１３１Ｋ、Ｖ１３３Ｇ及びＳ１７６Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｌ１２４Ｒ及びＳ１８６Ｒを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｖ１３３Ｇ、Ｓ１７６Ｄ及びＴ１７８Ｄを含む。

構築物のいくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ｌ１２４、Ｌ１４３、Ｋ１４５、Ｄ１４６、Ｑ１７９及びＳ１８６に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｑ１２４、Ｖ１３３、Ｑ１６０、Ｓ１７６、Ｔ１７８及びＴ１８０に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｒ、Ｌ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｋ１４５Ｔ、Ｋ１４５Ｍ、Ｄ１４６Ｎ、Ｑ１７９Ｋ、Ｓ１８６Ｒ及びＳ１８６Ｋから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｑ１２４Ｋ、Ｑ１２４Ｅ、Ｖ１３３Ｇ、Ｑ１６０Ｋ、Ｓ１７６Ｒ、Ｓ１７６Ｄ、Ｔ１７８Ｅ、Ｔ１７８Ｋ、Ｔ１７８Ｒ、Ｔ１７８Ｄ及びＴ１８０Ｅから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｋ１４５Ｔ及びＫ１４５Ｍまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ１は、Ｑ１２４Ｋ、Ｖ１３３Ｇ、Ｑ１６０Ｋ、Ｓ１７６Ｒ、Ｔ１７８Ｋ及びＴ１７８Ｒまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｈ２は、Ｌ１２４Ｒ、Ｄ１４６Ｎ、Ｑ１７９Ｋ、Ｓ１８６Ｒ及びＳ１８６Ｋまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ２は、Ｑ１２４Ｅ、Ｖ１３３Ｇ、Ｓ１７６Ｄ、Ｔ１７８Ｅ、Ｔ１７８Ｄ及びＴ１８０Ｅまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１４３Ｅ及びＫ１４５Ｔを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｋ、Ｖ１３３Ｇ及びＳ１７６Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｌ１２４Ｒ及びＱ１７９Ｋを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｖ１３３Ｇ、Ｓ１７６Ｄ及びＴ１７８Ｅを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１４３Ｅ及びＫ１４５Ｔを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｋ、Ｖ１３３Ｇ及びＳ１７６Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｌ１２４Ｒ及びＳ１８６Ｒを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｖ１３３Ｇ、Ｓ１７６Ｄ及びＴ１７８Ｄを含む。

構築物のいくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ｑ３９、Ｌ４５、Ｌ１２４、Ｌ１４３、Ｆ１２２及びＨ１７２に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｑ３８、Ｐ４４、Ｑ１２４、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｎ１３７、Ｓ１７４、Ｓ１７６及びＴ１７８に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｒ、Ｌ４５Ｐ、Ｆ１２２Ｃ、Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｒ、Ｌ１４３Ｆ、Ｈ１７２Ｔ及びＨ１７２Ｒから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｑ３８Ｒ、Ｑ３８Ｅ、Ｐ４４Ｆ、Ｑ１２４Ｃ、Ｓ１３１Ｔ、Ｓ１３１Ｅ、Ｖ１３３Ｇ、Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１７４Ｒ、Ｓ１７６Ｒ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６Ｄ、Ｔ１７８Ｙ及びＴ１７８Ｄから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、Ｑ３９Ｅ、Ｌ４５Ｐ、Ｆ１２２Ｃ、Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１４３Ｆ、Ｈ１７２Ｔ及びＨ１７２Ｒまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ１は、Ｑ３８Ｒ、Ｐ４４Ｆ、Ｑ１２４Ｃ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ｇ、Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１７４Ｒ、Ｓ１７６Ｒ、Ｓ１７６Ｋ及びＴ１７８Ｙまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｈ２は、Ｑ３９Ｒ、Ｌ１２４Ｒ及びＨ１７２Ｒまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ２は、Ｑ３８Ｅ、Ｓ１３１Ｅ、Ｖ１３３Ｇ、Ｓ１７６Ｄ及びＴ１７８Ｄまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｑ３９Ｅ及びＬ１２４Ｅを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｑ３８Ｒ、Ｖ１３３Ｇ及びＳ１７６Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｑ３９Ｒ及びＬ１２４Ｒを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｑ３８Ｅ、Ｖ１３３Ｇ及びＳ１７６Ｄを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｌ４５Ｐ及びＬ１２４Ｅを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｐ４４Ｆ、Ｖ１３３Ｇ及びＳ１７６Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｌ１２４Ｒを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｖ１３３Ｇ、Ｓ１７６Ｄ及びＴ１７８Ｄを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｌ１２４Ｅ及びＬ１４３Ｆを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｖ１３３Ｇ及びＳ１７６Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｌ１２４Ｒを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｖ１３３Ｇ、Ｓ１７６Ｄ及びＴ１７８Ｄを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｆ１２２Ｃ及びＬ１２４Ｅを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｃ、Ｖ１３３Ｇ及びＳ１７６Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｌ１２４Ｒを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｖ１３３Ｇ及びＳ１７６Ｄを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｌ１２４Ｅ及びＨ１７２Ｔを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｖ１３３Ｇ、Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１７４Ｒ及びＳ１７６Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｌ１２４Ｒ及びＨ１７２Ｒを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｖ１３３Ｇ、Ｓ１７６Ｄ及びＴ１７８Ｄを含む。

構築物のいくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ｌ１２４、Ａ１２５、Ｈ１７２及びＫ２２８に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｓ１２１、Ｖ１３３、Ｎ１３７、Ｓ１７４、Ｓ１７６及びＴ１７８に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｒ、Ａ１２５Ｓ、Ａ１２５Ｒ、Ｈ１７２Ｒ、Ｈ１７２Ｔ及びＫ２２８Ｄから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、（ｉｉ）Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｓ１２１Ｋ、Ｖ１３３Ｇ、Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１７４Ｒ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６Ｒ、Ｓ１７６Ｄ及びＴ１７８Ｄから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、Ｌ１２４Ｅ、Ａ１２５Ｓ、Ｈ１７２Ｒ及びＫ２２８Ｄまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ１は、Ｓ１２１Ｋ、Ｖ１３３Ｇ及びＳ１７６Ｒまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｈ２は、Ｌ１２４Ｒ、Ａ１２５Ｒ及びＨ１７２Ｔまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ２は、Ｖ１３３Ｇ、Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１７４Ｒ、Ｓ１７６Ｄ及びＴ１７８Ｄまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｌ１２４Ｅ及びＫ２２８Ｄを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｓ１２１Ｋ、Ｖ１３３Ｇ及びＳ１７６Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｌ１２４Ｒ及びＡ１２５Ｒを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｖ１３３Ｇ及びＳ１７６Ｄを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｌ１２４Ｅ及びＨ１７２Ｒを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｖ１３３Ｇ及びＳ１７６Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｌ１２４Ｒ及びＨ１７２Ｔを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｖ１３３Ｇ、Ｓ１７４Ｒ及びＳ１７６Ｄを含む。

構築物のいくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ｌ１２４、Ａ１３９及びＶ１９０に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２はＦ１１６、Ｖ１３３、Ｌ１３５及びＳ１７６に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｒ、Ａ１３９Ｗ、Ａ１３９Ｇ及びＶ１９０Ａから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｆ１１６Ａ、Ｖ１３３Ｇ、Ｌ１３５Ｖ、Ｌ１３５Ｗ、Ｓ１７６Ｒ及びＳ１７６Ｄから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、Ｌ１２４Ｅ及びＡ１３９Ｗまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ１は、Ｆ１１６Ａ、Ｖ１３３Ｇ、Ｌ１３５Ｖ及びＳ１７６Ｒまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｈ２は、Ｌ１２４Ｒ、Ａ１３９Ｇ及びＶ１９０Ａまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ２は、Ｖ１３３Ｇ、Ｌ１３５Ｗ及びＳ１７６Ｄまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｌ１２４Ｅ及びＡ１３９Ｗを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｆ１１６Ａ、Ｖ１３３Ｇ、Ｌ１３５Ｖ及びＳ１７６Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｌ１２４Ｒ、Ａ１３９Ｇ及びＶ１９０Ａを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｖ１３３Ｇ、Ｌ１３５Ｗ及びＳ１７６Ｄを含む。

構築物のいくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ｑ３９、Ｌ４５、Ｋ１４５、Ｈ１７２、Ｑ１７９及びＳ１８６に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｑ３８、Ｐ４４、Ｑ１２４、Ｓ１３１、Ｑ１６０、Ｔ１８０及びＣ２１４に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｒ、Ｌ４５Ｐ、Ｋ１４５Ｔ、Ｈ１７２Ｒ、Ｑ１７９Ｅ及びＳ１８６Ｒから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｑ３８Ｒ、Ｑ３８Ｅ、Ｐ４４Ｆ、Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１３１Ｋ、Ｑ１６０Ｅ、Ｔ１８０Ｅ及びＣ２１４Ｓから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、Ｑ３９Ｅ、Ｌ４５Ｐ、Ｋ１４５Ｔ、Ｈ１７２Ｒ及びＱ１７９Ｅまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ１は、Ｑ３８Ｒ、Ｐ４４Ｆ及びＳ１３１Ｋまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｈ２は、Ｑ３９Ｒ、Ｈ１７２Ｒ及びＳ１８６Ｒまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ２は、Ｑ３８Ｅ、Ｑ１２４Ｅ、Ｑ１６０Ｅ、Ｔ１８０Ｅ及びＣ２１４Ｓまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｑ３９Ｅ、Ｋ１４５Ｔ及びＱ１７９Ｅを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｑ３８Ｒ及びＳ１３１Ｋを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｑ３９Ｒ及びＳ１８６Ｒを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｑ３８Ｅ、Ｑ１２４Ｅ、Ｑ１６０Ｅ及びＴ１８０Ｅを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｌ４５Ｐ、Ｋ１４５Ｔ、Ｈ１７２Ｒ及びＱ１７９Ｅを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｐ４４Ｆ及びＳ１３１Ｋを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｈ１７２Ｒ及びＳ１８６Ｒを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｅ、Ｑ１６０Ｅ及びＴ１８０Ｅを含む。

構築物のいくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ａ１３９、Ｌ１４３、Ｋ１４５、Ｑ１７９及びＶ１９０に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｆ１１６、Ｑ１２４、Ｌ１３５、Ｑ１６０、Ｔ１７８及びＴ１８０に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ａ１３９Ｗ、Ａ１３９Ｇ、Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ、Ｑ１７９Ｋ及びＶ１９０Ａから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｆ１１６Ａ、Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１２４Ｅ、Ｌ１３５Ｖ、Ｌ１３５Ｗ、Ｑ１６０Ｅ、Ｔ１７８Ｒ及びＴ１８０Ｅから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、Ａ１３９Ｗ、Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ及びＱ１７９Ｅまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ１は、Ｆ１１６Ａ、Ｑ１２４Ｒ、Ｌ１３５Ｖ及びＴ１７８Ｒまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｈ２は、Ａ１３９Ｇ、Ｑ１７９Ｋ及びＶ１９０Ａまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ２は、Ｑ１２４Ｅ、Ｌ１３５Ｗ、Ｑ１６０Ｅ及びＴ１８０Ｅまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ａ１３９Ｗ、Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ及びＱ１７９Ｅを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｆ１１６Ａ、Ｑ１２４Ｒ、Ｌ１３５Ｖ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｑ１７９Ｋを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｅ、Ｌ１３５Ｗ、Ｑ１６０Ｅ及びＴ１８０Ｅを含む。

構築物のいくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ｑ３９、Ｌ１４３、Ｋ１４５、Ｄ１４６、Ｈ１７２及びＱ１７９に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｑ３８、Ｑ１２４、Ｑ１６０、Ｔ１７８及びＴ１８０に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｒ、Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｄ１４６Ｇ、Ｈ１７２Ｒ、Ｑ１７９Ｅ及びＱ１７９Ｋから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｑ３８Ｒ、Ｑ３８Ｅ、Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１２４Ｅ、Ｑ１６０Ｋ、Ｑ１６０Ｅ、Ｔ１７８Ｒ及びＴ１８０Ｅから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、Ｑ３９Ｅ、Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｈ１７２Ｒ及びＱ１７９Ｅまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ１は、Ｑ３８Ｒ、Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｈ２は、Ｑ３９Ｒ、Ｈ１７２Ｒ及びＱ１７９Ｋまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ２は、Ｑ３８Ｅ、Ｑ１２４Ｅ、Ｄ１４６Ｇ、Ｑ１６０Ｅ及びＴ１８０Ｅまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｑ３９Ｅ、Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ及びＱ１７９Ｅを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｑ３８Ｒ、Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｑ３９Ｒ、Ｈ１７２Ｒ及びＱ１７９Ｋを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｑ３８Ｅ、Ｑ１２４Ｅ、Ｑ１６０Ｅ及びＴ１８０Ｅを含む。

構築物のいくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ｌ４５、Ｌ１４３、Ｋ１４５、Ｄ１４６、Ｈ１７２及びＱ１７９に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｑ３８、Ｐ４４、Ｑ１２４、Ｎ１３７、Ｑ１６０、Ｓ１７４、Ｔ１７８、Ｔ１８０及びＣ２１４に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ｌ４５Ｐ、Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｄ１４６Ｇ、Ｈ１７２Ｒ、Ｈ１７２Ｔ、Ｑ１７９Ｅ及びＱ１７９Ｋから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、（ｉｉ）Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｑ３８Ｅ、Ｐ４４Ｆ、Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１２４Ｅ、Ｎ１３７Ｋ、Ｑ１６０Ｋ、Ｑ１６０Ｅ、Ｓ１７４Ｒ、Ｔ１７８Ｒ、Ｔ１８０Ｅ及びＣ２１４Ｓから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、Ｌ４５Ｐ、Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｈ１７２Ｒ及びＱ１７９Ｅまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ１は、Ｐ４４Ｆ、Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｈ２は、Ｄ１４６Ｇ、Ｈ１７２Ｒ、Ｈ１７２Ｔ及びＱ１７９Ｋまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ２は、Ｑ３８Ｅ、Ｑ１２４Ｅ、Ｎ１３７Ｋ、Ｑ１６０Ｅ、Ｓ１７４Ｒ、Ｔ１８０Ｅ及びＣ２１４Ｓまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｌ４５Ｐ、Ｌ１４３Ｅ及びＫ１４５Ｔを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｐ４４Ｆ、Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｄ１４６Ｇ及びＱ１７９Ｋを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｑ３８Ｅ、Ｑ１２４Ｅ、Ｑ１６０Ｅ及びＴ１８０Ｅを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ及びＨ１７２Ｒを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｈ１７２Ｔ及びＱ１７９Ｋを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｅ、Ｑ１６０Ｅ、Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１７４Ｒ及びＴ１８０Ｅを含む。

構築物のいくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ｌ１２４、Ｌ１４３、Ｋ１４５及びＱ１７９に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｑ１２４、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｓ１７６、Ｔ１７８及びＴ１８０に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ｌ１２４Ｗ、Ｌ１２４Ａ、Ｌ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｆ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ及びＱ１７９Ｋから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１２４Ｋ、Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１３１Ｋ、Ｖ１３３Ａ、Ｖ１３３Ｗ、Ｓ１７６Ｔ、Ｔ１７８Ｒ、Ｔ１７８Ｌ、Ｔ１７８Ｅ及びＴ１８０Ｅから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、Ｌ１２４Ｗ、Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ及びＱ１７９Ｅまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ１は、Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１２４Ｋ、Ｓ１３１Ｋ、Ｖ１３３Ａ、Ｓ１７６Ｔ、Ｔ１７８Ｒ及びＴ１７８Ｌまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｈ２は、Ｌ１２４Ａ、Ｌ１４３Ｆ及びＱ１７９Ｋまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ２は、Ｑ１２４Ｅ、Ｖ１３３Ｗ、Ｓ１７６Ｔ、Ｔ１７８Ｌ、Ｔ１７８Ｅ及びＴ１８０Ｅまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｌ１２４Ｗ、Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ及びＱ１７９Ｅを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｒ、Ｖ１３３Ａ、Ｓ１７６Ｔ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｌ１２４Ａ、Ｌ１４３Ｆ及びＱ１７９Ｋを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｅ、Ｖ１３３Ｗ、Ｓ１７６Ｔ、Ｔ１７８Ｌ及びＴ１８０Ｅを含む。

構築物のいくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ａ１３９、Ｌ１４３、Ｋ１４５、Ｑ１７９及びＳ１８６に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｆ１１６、Ｑ１２４、Ｖ１３３、Ｑ１６０、Ｔ１７８及びＴ１８０に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ａ１３９Ｃ、Ｌ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｒ、Ｌ１４３Ｋ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ、Ｑ１７９Ｄ、Ｑ１７９Ｒ、Ｑ１７９Ｋ、Ｓ１８６Ｋ及びＳ１８６Ｒから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｆ１１６Ｃ、Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１２４Ｋ、Ｑ１２４Ｅ、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｑ１６０Ｋ、Ｑ１６０Ｅ、Ｔ１７８Ｒ、Ｔ１７８Ｋ、Ｔ１７８Ｅ及びＴ１８０Ｅから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、Ａ１３９Ｃ、Ｌ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ及びＱ１７９Ｄまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ１は、Ｆ１１６Ｃ、Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１２４Ｋ、Ｑ１６０Ｋ、Ｔ１７８Ｒ及びＴ１７８Ｋまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｈ２は、Ｌ１４３Ｒ、Ｌ１４３Ｋ、Ｑ１７９Ｒ、Ｑ１７９Ｋ、Ｓ１８６Ｋ及びＳ１８６Ｒまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ２は、Ｑ１２４Ｅ、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｑ１６０Ｅ、Ｔ１７８Ｅ及びＴ１８０Ｅまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ａ１３９Ｃ、Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ及びＱ１７９Ｅを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｆ１１６Ｃ、Ｑ１２４Ｒ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｑ１７９Ｋを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｅ、Ｑ１６０Ｅ及びＴ１８０Ｅを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ及びＱ１７９Ｅを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｒ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｓ１８６Ｋを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｅ、Ｑ１６０Ｅ及びＴ１７８Ｅを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ及びＱ１７９Ｅを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｒ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｌ１４３Ｒを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｅ及びＶ１３３Ｅを含む。

構築物のいくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ｌ１２４、Ｌ１４３、Ｋ１４５、Ｄ１４６、Ｑ１７９、Ｓ１８６及びＳ１８８に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｑ１２４、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｑ１６０、Ｓ１７６、Ｔ１７８及びＴ１８０に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、Ｌ１２４Ａ、Ｌ１４３Ａ、Ｌ１４３Ｒ、Ｌ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｋ、Ｋ１４５Ｔ、Ｄ１４６Ｇ、Ｑ１７９Ｒ、Ｑ１７９Ｅ、Ｑ１７９Ｋ、Ｓ１８６Ｒ、Ｓ１８６Ｋ及びＳ１８８Ｌから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１及び／またはＬ２は、Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１３１Ｅ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ｙ、Ｖ１３３Ｗ、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｑ１６０Ｅ、Ｑ１６０Ｋ、Ｑ１６０Ｍ、Ｓ１７６Ｌ、Ｔ１７８Ｒ、Ｔ１７８Ｅ、Ｔ１７８Ｆ、Ｔ１７８Ｙ及びＴ１８０Ｅから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ及びＳ１８８Ｌまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ１は、Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｈ２は、Ｌ１２４Ａ、Ｌ１４３Ａ、Ｌ１４３Ｒ、Ｌ１４３Ｋ、Ｄ１４６Ｇ、Ｑ１７９Ｒ、Ｑ１７９Ｋ、Ｓ１８６Ｒ及びＳ１８６Ｋまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ２は、Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１３１Ｅ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ｙ、Ｖ１３３Ｗ、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｑ１６０Ｅ、Ｑ１６０Ｍ、Ｓ１７６Ｌ、Ｔ１７８Ｅ、Ｔ１７８Ｆ、Ｔ１７８Ｙ及びＴ１８０Ｅまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｒ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｓ１８６Ｋを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１７６Ｌ及びＴ１８０Ｅを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｒ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｓ１８６Ｋを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１３１Ｔ、Ｔ１７８Ｙ及びＴ１８０Ｅを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｌ１４３Ｅ及びＫ１４５Ｔを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｓ１８６Ｋを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｓ１３１Ｅを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｌ１４３Ｅ及びＫ１４５Ｔを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｒを含み、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｌ１４３Ｒを含み、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｅ及びＶ１３３Ｅを含む。

構築物のいくつかの実施形態において、Ｈ１は、Ｆ１２２及びＣ２３３に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１は、Ｑ１２４及びＣ２１４に少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、Ｆ１２２Ｃ及びＣ２３３Ｓから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含み、Ｌ１は、Ｑ１２４Ｃ及びＣ２１４Ｓから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾またはアミノ酸修飾のセットを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、Ｆ１２２Ｃ及びＣ２３３Ｓまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｌ１は、Ｑ１２４Ｃ及びＣ２１４Ｓまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、Ｈ２は、野生型または未修飾アミノ酸配列を含み、Ｌ２は、野生型または未修飾アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｆ１２２Ｃ及びＣ２３３Ｓを含み、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｑ１２４Ｃ及びＣ２１４Ｓを含み、Ｈ２は、野生型または未修飾アミノ酸配列を含み、Ｌ２は、野生型または未修飾アミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、構築物は、本明細書の表のＳＭＣＡ設計９５６１－９０９５＿１、９５６１－９０９５＿２、９１２１－９３７３＿１、９１２１－９３７３＿２、９１１６－９３４９＿１、９１１６－９３４９＿２、９１３４－９５２１＿１、９１３４－９５２１＿２、９２８６－９４０２＿１、９２８６－９４０２＿２、９６６７－９８３０＿１、９６６７－９８３０＿２、９６９６－９８４８＿１、９６９６－９８４８＿２、９０６０－９７５６＿１、９０６０－９７５６＿２、９６８２－９７４０＿１、９６８２－９７４０＿２、９０４９－９７５９＿１、９０４９－９７５９＿２、９８２０－９８２３＿１及び９８２０－９８２３＿２から選択されるアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、構築物は、本明細書の表のＳＭＣＡ設計９３２７－６０５４＿１、９８１５－９８２５＿１、９８１５－９８２５＿２、９５８７－９７３５＿１、９５８７－９７３５＿２、３５２２＿１、３５２２＿２、３５１９＿１及び３５１９＿２から選択されるアミノ酸修飾を含む。

いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、位置Ｑ１７９にアミノ酸修飾を含まない。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｑ１７９Ｅを含まない及び／またはＨ２は、アミノ酸修飾Ｑ１７９Ｋを含まない。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、位置Ｓ１３１にアミノ酸修飾を含まない。１つの実施形態において、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｓ１３１Ｋを含まない。いくつかの実施形態において、Ｌ２は、位置Ｔ１８０にアミノ酸修飾を含まない。１つの実施形態において、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｔ１８０Ｅを含まない。いくつかの実施形態において、構築物は、Ｈ１がＱ１７９Ｅを含み、Ｌ１がＳ１３１Ｋを含み、Ｈ２がＱ１７９Ｋを含み、Ｌ２がＴ１８０Ｅを含む、アミノ酸修飾の組み合わせを含まない。

いくつかの実施形態において、Ｈ１は、位置Ｑ３９及び／またはＱ１７９にアミノ酸修飾を含まない。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｑ３９Ｅ及び／またはＱ１７９Ｅを含まない。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、位置Ｑ１６０にアミノ酸修飾を含まない。１つの実施形態において、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｑ１６０Ｋを含まない。いくつかの実施形態において、Ｈ２は、位置Ｑ１７９にアミノ酸修飾を含まない。１つの実施形態において、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｑ１７９Ｋを含まない。いくつかの実施形態において、Ｌ２は、位置Ｑ３８、Ｑ１６０及び／またはＴ１８０にアミノ酸修飾を含まない。１つの実施形態において、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｑ３８Ｅ、Ｑ１６０Ｅ及び／またはＴ１８０Ｅを含まない。いくつかの実施形態において、構築物は、Ｈ１がＱ３９Ｅ及び／またはＱ１７９Ｅを含み、Ｌ１がＱ１６０Ｋを含み、Ｈ２がＱ１７９Ｋを含み、Ｌ２がＱ３８Ｅ、Ｑ１６０Ｅ及び／またはＴ１８０Ｅを含む、アミノ酸修飾の組み合わせを含まない。例えば、いくつかの実施形態において、構築物は、（ｉ）Ｈ１がＱ１７９Ｅを含み、Ｌ１がＱ１６０Ｋを含み、Ｈ２がＱ１７９Ｋを含み、Ｌ２がＱ１６０Ｅ及びＴ１８０Ｅを含む、（ｉｉ）Ｈ１がＱ３９Ｅ及びＱ１７９Ｅを含み、Ｌ１がＱ１６０Ｋを含み、Ｈ２がＱ１７９Ｋを含み、Ｌ２がＱ３８Ｅ、Ｑ１６０Ｅ及びＴ１８０Ｅを含む、または（ｉｉｉ）Ｈ１がＱ３９Ｅを含み、Ｌ１がＱ１６０Ｋを含み、Ｈ２がＱ１７９Ｋを含み、Ｌ２がＱ３８Ｅ、Ｑ１６０Ｅ及びＴ１８０Ｅを含む、アミノ酸修飾の組み合わせを含まない。

いくつかの実施形態において、Ｈ１は、位置Ｑ１７９にアミノ酸修飾を含まない。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｑ１７９ＫまたはＱ１７９Ｅを含まない。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、位置Ｑ１６０及び／またはＴ１８０にアミノ酸修飾を含まない。１つの実施形態において、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｑ１６０Ｅ、Ｑ１６０Ｋ及び／またはＴ１８０Ｅを含まない。いくつかの実施形態において、Ｈ２は、位置Ｑ１７９にアミノ酸修飾を含まない。１つの実施形態において、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｑ１７９ＫまたはＱ１７９Ｅを含まない。いくつかの実施形態において、Ｌ２は、位置Ｑ１６０及び／またはＴ１８０にアミノ酸修飾を含まない。１つの実施形態において、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｑ１６０Ｋ、Ｑ１６０Ｅ及び／またはＴ１８０Ｅを含まない。いくつかの実施形態において、構築物は、Ｈ１がＱ１７９ＫまたはＱ１７９Ｅを含み、Ｌ１がＱ１６０Ｅ、Ｑ１６０Ｋ及び／またはＴ１８０Ｅを含み、Ｈ２がＱ１７９ＫまたはＱ１７９Ｅを含み、Ｌ２がＱ１６０Ｋ、Ｑ１６０Ｅ及び／またはＴ１８０Ｅを含む、アミノ酸修飾の組み合わせを含まない。

いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、位置Ｑ１７９にアミノ酸修飾を含まない。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｑ１７９Ｋを含まない及び／またはＨ２は、アミノ酸修飾Ｑ１７９Ｅを含まない。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、位置Ｔ１８０にアミノ酸修飾を含まない。１つの実施形態において、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｔ１８０Ｅを含まない。いくつかの実施形態において、Ｌ２は、位置Ｓ１３１にアミノ酸修飾を含まない。１つの実施形態において、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｓ１３１Ｋを含まない。いくつかの実施形態において、構築物は、Ｈ１がＱ１７９Ｋを含み、Ｌ１がＴ１８０Ｅを含み、Ｈ２がＱ１７９Ｅを含み、Ｌ２がＳ１３１Ｋを含む、アミノ酸修飾の組み合わせを含まない。

いくつかの実施形態において、Ｈ１は、位置Ｑ１７９にアミノ酸修飾を含まない。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ｑ１７９Ｅを含まない。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、位置Ｑ１６０にアミノ酸修飾を含まない。１つの実施形態において、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｑ１６０Ｋを含まない。いくつかの実施形態において、Ｈ２は、位置Ｑ１７９にアミノ酸修飾を含まない。１つの実施形態において、Ｈ２は、アミノ酸修飾Ｑ１７９Ｋを含まない。いくつかの実施形態において、Ｌ２は、位置Ｔ１８０にアミノ酸修飾を含まない。１つの実施形態において、Ｌ２は、アミノ酸修飾Ｔ１８０Ｅを含まない。いくつかの実施形態において、構築物は、Ｈ１がＱ１７９Ｅを含み、Ｌ１がＱ１６０Ｋを含み、Ｈ２がＱ１７９Ｋを含み、Ｌ２がＴ１８０Ｅを含む、アミノ酸修飾の組み合わせを含まない。

いくつかの実施形態において、Ｈ１は、位置Ａ１３９にアミノ酸修飾を含まない。いくつかの実施形態において、Ｈ１は、アミノ酸修飾Ａ１３９Ｃを含まない。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、位置Ｆ１１６にアミノ酸修飾を含まない。１つの実施形態において、Ｌ１は、アミノ酸修飾Ｆ１１６Ｃを含まない。いくつかの実施形態において、構築物は、Ｈ１がＡ１３９Ｃを含み、Ｌ１がＦ１１６Ｃを含む、アミノ酸修飾の組み合わせを含まない。

いくつかの実施形態において、構築物は、重鎖と軽鎖の間に未変性ジスルフィド連結を含まない。例えば、いくつかの実施形態において、Ｌ１及び／またはＬ２の位置２１４のシステインは修飾されて、別のアミノ酸になっている。いくつかの実施形態において、Ｌ１及び／またはＬ２は、アミノ酸修飾Ｃ２１４Ｓを含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２の位置２３３のシステインは修飾されて、別のアミノ酸になっている。１つの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２は、アミノ酸修飾Ｃ２３３Ｓを含む。

本明細書に記載されている実施形態は、Ｆａｂフォーマット及び完全抗体フォーマットの構築物に適用可能である。

可変、定常及びＪ領域セグメントについて、基本となるヒト生殖系配列に対して整列されたＤ３Ｈ４４重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を示す（図中表示：^＊配列同一性）。図１Ａは、ヒトＶＨ生殖系部分群を示す（１つの代表的な配列が、各ファミリーにおいて表示されている）。ＶＨ３及びＩＧＨＪ３^＊０２に対するＤ３Ｈ４４の整列に基づいた配列同一性である。ヒトカッパＶＬ生殖系部分群を示す（１つの代表的な配列が、各ファミリーにおいて表示されている）。ＶＫＩ及びＩＧＫＪ１^＊０１に対するＤ３Ｈ４４の整列に基づいた配列同一性である。ヒトラムダＶＬ生殖系部分群を示す（１つの代表的な配列が、各ファミリーにおいて表示されている）。ＶＬ１及びＩＧＬＪ１^＊０１に対するＤ３Ｈ４４の整列に基づいた配列同一性である。ヒトＣＨ１対立遺伝子配列を示す。ヒトカッパ及びラムダ対立遺伝子配列を示す。重要な界面残基を特定するため及び優先的な重鎖－軽鎖対合を設計する計算モデル化のためのフローチャートを示す。Ｈ１が、Ｌ２よりＬ１と優先的に対合し、Ｈ２が、Ｌ１よりＬ２と優先的に対合するように設計された、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２、Ｌ２鎖の例示的な一組を示す。可変領域の重鎖及び軽鎖界面の三次元結晶構造を表す図が提示されている。界面に導入された突然変異は、絶対的な対であるＨ１－Ｌ１及びＨ２－Ｌ２をそれぞれ優先的に形成するための静電及び立体相補性を達成する。他方、低減された対成形の傾向ならびに低減された安定性を不適合対にもたらす、好ましくない立体及び静電不適合が、不正確な対に存在する。二重特異性Ｍａｂ（モノクローナル抗体）を形成するための遺伝子工学的な操作要件に関する高水準な概略図、及び重鎖軽鎖対を定量化するのに必要なアッセイ要件を説明する。高純度の二重特異性Ｍａｂ（すなわち、誤対合Ｈ－Ｌの会合が、ほとんどないかまたは全くない）を遺伝子工学的に操作する設計目標は、２つの特有の重鎖と特有の同族軽鎖との優先的な対形成を合理的に遺伝子工学的に操作することによって（特定のアミノ酸突然変異の導入を介して）達成することができる。このプロセスが概略的に示されており、ここではＨ１が遺伝子工学的に操作されて、Ｌ２ではなくＬ１と優先的に対形成する。同様に、Ｈ２が遺伝子工学的に操作されて、Ｌ１ではなくＬ２と優先的に対形成する。二重特異性Ｍａｂ設計の実験用の選別には、Ｈ１－Ｌ１：Ｈ１－Ｌ２及びＨ２－Ｌ２：Ｈ２－Ｌ１を同時に定量化できるアッセイを必要とする。これらのアッセイ要件は、各二重特異性Ｆａｂアームが独立して遺伝子工学的に操作され得ると想定することによって簡素化することができる。この場合、アッセイは、Ｈ１－Ｌ１：Ｈ１－Ｌ２またはＨ２－Ｌ２：Ｈ２－Ｌ１を定量化するだけでよく、両方を同時に定量化する必要はない。重鎖及び軽鎖がどのようにタグ付けされ、優先的な対形成がどのように決定されるかについての概略的描写を提供する。この概略図では、円状のものは、３つの構築物が形質移入された細胞を表す。発現産物が細胞から分泌され、上澄み（ＳＰＮＴ）が、この場合はＳＰＲチップである検出デバイスへ流れる。重鎖対形成について競合する２つの軽鎖に融合された２つの異なるタグの検出レベルに基づいて、２つの軽鎖への重鎖の優先的な対形成の定量的推定値を、推定することができる。各クラスターにおいて、Ｆａｂヘテロ二量体の対合：誤対合が少なくとも８６：１４である、平均ＬＣＣＡ性能値の箱髭図を示す。Ａ）ＷＴＦａｂヘテロ二量体と、Ｂ）代表的な設計Ｆａｂヘテロ二量体（ＬＣＣＡ設計９７３５、９７３７及び９７４０の、Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ構成要素）の代表的なＵＰＬＣ－ＳＥＣプロファイルを示す。２つの異なる軽鎖が、細胞において２つの異なる重鎖と同時発現する場合に予測され得る、可能性のある重鎖会合産物を示す。優先的な対合をＳＭＣＡ（モノクローナル抗体競合アッセイ）の使用によって評価する。Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブの二重特異性系における、偏向／鎖利用優先性を示す。鎖利用は、ＬＣ－ＭＳにより観察された異なる種において評価した。Ｘ軸は、Ｈ１：Ｈ２：Ｌ１：Ｌ２のＤＮＡ比を表し、Ｙ軸は、異なる形質移入実験における各鎖の対応する率を示す。平衡系では、全てのＨ鎖及びＬ鎖が２５％を示す。１つの軽鎖の利用への偏向が、全ての二重特異性系にわたって観察される。Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブの二重特異性系における偏向／鎖利用優先性を示す。鎖利用は、ＬＣ－ＭＳにより観察された異なる種において評価した。Ｘ軸は、Ｈ１：Ｈ２：Ｌ１：Ｌ２のＤＮＡ比を表し、Ｙ軸は、異なる形質移入実験における各鎖の対応する率を示す。平衡系では、全てのＨ鎖及びＬ鎖が２５％を示す。１つの軽鎖の利用への偏向が、全ての二重特異性系にわたって観察される。トラスツズマブ／セツキシマブの二重特異性系における偏向／鎖利用優先性を示す。鎖利用は、ＬＣ－ＭＳにより観察された異なる種において評価した。Ｘ軸は、Ｈ１：Ｈ２：Ｌ１：Ｌ２のＤＮＡ比を表し、Ｙ軸は、異なる形質移入実験における各鎖の対応する率を示す。平衡系では、全てのＨ鎖及びＬ鎖が、２５％を示す。１つの軽鎖の利用への偏向が、全ての二重特異性系にわたって観察される。図１０は、ＷＴヘテロ二量体と改変ヘテロ二量体抗体それぞれの、代表的なＵＰＬＣ－ＳＥＣプロファイルを示す。図１０ａは、Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブＷＴを指す。９０６０－９７５６＿１を指す。Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブＷＴを指す。９８２０－９８２３＿１を指す。トラスツズマブ／セツキシマブＷＴを指す。９６９６－９８４８＿１を指す。クラスター毎の改変二重特異性抗体試料において、同じ重鎖を利用する全ての誤対合Ｆａｂ構成要素に対する正確に対合したＦａｂ構成要素の変化割合（％）（Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ及びＤ３Ｈ４４／セツキシマブの野生型に関して全てのＨ１種に対するＨ１：Ｌ１の変化、トラスツズマブ／セツキシマブの野生型に関して全てのＨ２種に対するＨ２：Ｌ２の変化）、ならびに野生型に対する所望の二重特異性抗体の率の変化の箱髭図を示す。クラスター毎の、同じ重鎖を利用する全ての誤対合Ｆａｂ構成要素に対する正確に対合したＦａｂ構成要素の変化割合（％）を、Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブの系において示す。クラスター毎の、野生型に対する所望の二重特異性抗体の率の変化を、Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブの系において示す。クラスター毎の改変二重特異性抗体試料において、同じ重鎖を利用する全ての誤対合Ｆａｂ構成要素に対する正確に対合したＦａｂ構成要素の変化割合（％）（Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ及びＤ３Ｈ４４／セツキシマブの野生型に関して全てのＨ１種に対するＨ１：Ｌ１の変化、トラスツズマブ／セツキシマブの野生型に関して全てのＨ２種に対するＨ２：Ｌ２の変化）、ならびに野生型に対する所望の二重特異性抗体の率の変化の箱髭図を示す。クラスター毎の、同じ重鎖を利用する全ての誤対合Ｆａｂ構成要素に対する正確に対合したＦａｂ構成要素の変化割合（％）を、Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブの系において示す。クラスター毎の、野生型に対する所望の二重特異性抗体の率の変化を、Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブの系において示す。クラスター毎の改変二重特異性抗体試料において、同じ重鎖を利用する全ての誤対合Ｆａｂ構成要素に対する正確に対合したＦａｂ構成要素の変化割合（％）（Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ及びＤ３Ｈ４４／セツキシマブの野生型に関して全てのＨ１種に対するＨ１：Ｌ１の変化、トラスツズマブ／セツキシマブの野生型に関して全てのＨ２種に対するＨ２：Ｌ２の変化）、ならびに野生型に対する所望の二重特異性抗体の率の変化の箱髭図を示す。クラスター毎の、同じ重鎖を利用する全ての誤対合Ｆａｂ構成要素に対する正確に対合したＦａｂ構成要素の変化割合（％）を、トラスツズマブ／セツキシマブの系において示す。クラスター毎の、野生型に対する所望の二重特異性抗体の率の変化を、トラスツズマブ／セツキシマブの系において示す。全ての二重特異性系にわたって、クラスター毎の、同じ重鎖を利用する全ての誤対合Ｆａｂ構成要素に対する正確に対合したＦａｂ構成要素の変化割合（％）を示す。クラスター毎の、野生型に対する所望の二重特異性抗体の率の変化を示す。図１１において報告されている値は、対応する野生型構築物がＳＭＣＡにより評価されなかった改変二重特異性抗体試料の推定変化も含むことに留意すること。本明細書において提供される絶対的な突然変異対のライブラリーを使用して二重特異性抗体を調製する方法を示す。

第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体を含むことができ、各ヘテロ二量体が免疫グロブリン重鎖またはそのフラグメント及び免疫グロブリン軽鎖を含む、抗原結合ポリペプチド構築物（ヘテロ二量体対とも呼ばれる）が、本明細書に提供される。両方のヘテロ二量体は、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）に一つまたは複数のアミノ酸修飾及び免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に一つまたは複数のアミノ酸修飾、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）に一つまたは複数のアミノ酸修飾及び免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に一つまたは複数のアミノ酸修飾、または重鎖及び軽鎖の定常及び可変ドメインの両方に前述のアミノ酸修飾の組み合わせを含むことができる。修飾されたアミノ酸は、典型的には軽鎖と重鎖の界面の一部であり、第１のヘテロ二量体の重鎖が一方の軽鎖と優先的に対合するが他方とは対合しないように修飾されて、各重鎖と所望の軽鎖との間に優先的な対合を作り出す。同様に、第２のヘテロ二量体の重鎖は、第１ではなく第２の軽鎖と優先的に対合することができる。

上記に示されているように、本明細書に記載されているアミノ酸修飾の特定の組み合わせは、重鎖と、特定の軽鎖との優先的な対合を促進し、それによって、無視できるほどの誤対合または限られた誤対合を伴い、望ましくない産物または誤対合している産物から所望のヘテロ二量体を精製する必要性が最小限であるように、二重特異性モノクローナル抗体（Ｍａｂ）の発現を生じることができる。ヘテロ二量体は、アミノ酸修飾を含まないヘテロ二量体に匹敵する熱安定性を示すことができ、アミノ酸修飾を含まないヘテロ二量体に匹敵する結合親和性を抗原に対して実証することもできる。

第１及び第２のヘテロ二量体の設計を使用して、２つの異なる治療標的を標的にする、または同じ抗原内の２つの別個のエピトープ（重複もしくは非重複）を標的にする、二重特異性抗体を作ることができる。

ヘテロ二量体対を調製する方法も、本明細書に提供される。

定義
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語は、特許請求される主題に属する当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書の用語に複数の定義が存在する場合、この章におけるものが優先される。参照がＵＲＬまたは他のそのような識別子もしくはアドレスに対して行われる場合、そのような識別子は変わることがあり、インターネット上の特定の情報は現れたり消えたりすることがあるが、同等の情報は、インターネットを検索することによって見つけることができる。これらへの参照は、そのような情報が利用可能であり、一般に普及されていることの証拠である。

前述の一般的な記載及び以下の詳細な記載は、例示及び説明のためだけのものであり、任意の特許請求される主題を限定するものではないことが理解されるべきである。本出願において、単数の使用は、特定的に記述されない限り、複数を含む。

本記載において、任意の濃度範囲、百分率範囲、比の範囲、または整数範囲は、特に示されない限り、列挙された範囲内の任意の整数、適切であれば、その分数（例えば、整数の１０分の１及び１００分の１）の値を含むことが理解されるべきである。本明細書に使用されるとき、「約」は、特に示されない限り、示された範囲、値、配列または構造の±１０％を意味する。用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、本明細書に使用されるとき、特に示されない限り、または文脈から決定されない限り、列挙された構成成分のうちの「一つまたは複数」を指すことが理解されるべきである。選択肢（例えば、「または（ｏｒ）」）の使用は、選択肢のいずれか１つ、両方、または任意の組み合わせを意味することが理解されるべきである。本明細書に使用されるとき、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、同義的に使用される。加えて、本明細書に記載されている構造及び置換基の様々な組み合わせから誘導される個別の単鎖ポリペプチドまたは免疫グロブリン構築物は、それぞれの単鎖ポリペプチドまたはヘテロ二量体が個別に記載されているのと同じ程度に、本出願において開示されていることが理解されるべきである。したがって、個別の単鎖ポリペプチドまたはヘテロ二量体を形成する特定の構成成分の選択は、本開示の範囲内である。

本明細書に使用される章の見出しは、構成の目的のためだけのものであり、記載される主題を制限するものと解釈されるべきではない。特許、特許出願、記事、書籍、マニュアル及び条約文書が含まれるが、これらに限定されない、本出願に引用されている全ての文書または文書に一部は、任意の目的においてその全体が参照として本明細書に明確に組み込まれる。

本明細書に記載されている方法及び組成物は、本明細書に記載されている特定の方法論、プロトコール、細胞系、構築物及び試薬に限定されず、それらは変わり得ることが理解されるべきである。本明細書に使用される用語法は、特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、本明細書に記載されている方法及び組成物の範囲を限定することを意図せず、これらは添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも、理解されるべきである。

本明細書に記述される全ての出版物及び特許は、例えば、本明細書に記載されている方法、組成物及び化合物と関連して使用され得る、出版物に記載されている構築物及び方法論を記載及び開示する目的において、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。本明細書において考察される出版物は、単に、本出願の出願日に先行した開示として提供される。本明細書に記載されている発明が、先行発明のため、または任意の他の理由によって、そのような開示に先立つ権利を受けないことを承認すると解釈されるべきことは、本明細書において何もない。

本出願において、アミノ酸の名称及び原子の名称（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｃ等）は、ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ（ＰＤＢ）（ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ）に定義されているように使用され、これは、ＩＵＰＡＣ命名法（ＩＵＰＡＣＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅａｎｄＳｙｍｂｏｌｉｓｍｆｏｒＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓａｎｄＰｅｐｔｉｄｅｓ（残基の名称、原子の名称等）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５２，１（１９８５）による修正を伴うＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８，９－３７（１９８４）に基づいている。用語「アミノ酸残基」は、２０個の、天然に生じるアミノ酸、すなわち、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）及びチロシン（ＴｙｒまたはＹ）残基からなる群に含有されたアミノ酸残基を示すことが主に意図されている。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において交換可能に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを指す。すなわち、ポリペプチドを対象とする記載は、ペプチドを対象とする記載及びタンパク質を対象とする記載に等しく当てはまり、その逆も同じである。この用語は、天然に生じるアミノ酸ポリマー、ならびに一つまたは複数のアミノ酸残基が非天然にコードされているアミノ酸であるアミノ酸ポリマーに当てはまる。本明細書に使用されるとき、この用語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合により連結している完全長タンパク質を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。

用語「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」は、２つ以上のヌクレオチド分子が連続して延びていることを示すことが意図される。ヌクレオチド配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成もしくは合成由来、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。

「細胞」、「宿主細胞」、「細胞系」及び「細胞培養物」は、本明細書において交換可能に使用され、そのような用語は、全て、細胞の増殖または培養によってもたらされる継代を含むことが理解されるべきである。「形質転換」及び「形質移入」は交換可能に使用されて、核酸配列を細胞に導入する過程を指す。

用語「アミノ酸」は、天然に生じる及び非天然に生じるアミノ酸、ならびに天然に生じるアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類縁体及び模倣体を指す。天然にコードされたアミノ酸は、２０個のアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）、ならびにピロールリジン及びセレノシステインである。アミノ酸類縁体は、天然に生じるアミノ酸と同じ基本的な化学構造、すなわち、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどの、水素に結合している炭素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基を有する化合物を指す。そのような類縁体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然に生じるアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。アミノ酸への参照には、例えば、天然に生じるタンパク新生Ｌアミノ酸、Ｄ－アミノ酸、アミノ酸変種及び誘導体などの化学的に修飾されたアミノ酸、アラニン、オルニチン等などの天然に生じる非タンパク新生アミノ酸、ならびにアミノ酸の特徴であることが当該技術に知られている特性を有する化学的に合成された化合物が含まれる。非天然に生じるアミノ酸の例には、□－メチルアミノ酸（例えば、メチルアラニン）、Ｄ－アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば、２－アミノ－ヒスチジン、ヒドロキシ－ヒスチジン、ホモヒスチジン）、追加のメチレンを側鎖に有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、及び側鎖のカルボン酸官能基がスルホン酸基（例えば、システイン酸）に代えられているアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。合成非未変性アミノ酸、置換アミノ酸または一つまたは複数のＤ－アミノ酸を含む非天然アミノ酸の、本発明のタンパク質への組み込みは、多数の異なる方法で有益であり得る。Ｄ－アミノ酸含有ペプチド等は、Ｌ－アミノ酸含有対応物と比較して、インビトロまたはインビボにおいて増加した安定性を示す。したがって、Ｄ－アミノ酸を組み込んだペプチド等の構築は、より大きな細胞内安定性が望ましいとき、またはそれが求められるときに特に有用であり得る。より詳細には、Ｄ－ペプチド等は、内在性ペプチダーゼ及びプロテアーゼに抵抗性があり、それによって、そのような特性が望ましい場合、分子の改善された生物学的利用能及びインビボにおける延長された寿命をもたらす。加えて、Ｄ－ペプチド等は、主要な組織適合性複合体クラスＩＩの、Ｔヘルパー細胞への制限された提示によって効率的に処理されず、したがって、生物体全体に体液性免疫応答を誘発する可能性が少ない。

アミノ酸は、本明細書において、一般的に知られている３文字符号により、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字符号により参照される。ヌクレオチドも同様に、一般的に許容される単一文字コードにより参照され得る。

「保存的修飾変種」は、アミノ酸と核酸の両方の配列に当てはまる。特定の核酸配列に関して、「保存的修飾変種」は、同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、実質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンのＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは、全てアミノ酸のアラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定されるすべての位置において、コドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンのいずれかに変更され得る。そのような核酸変異は、「サイレント変異」であり、これは保存的に修飾された変異の１種である。ポリペプチドをコードする本明細書における全ての核酸配列も、核酸の全ての可能なサイレント変異を記載する。当業者は、核酸におけるそれぞれのコドンが（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ及び通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除いて）修飾されて、機能的に同一の分子を生じ得ることを認識する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異は、それぞれの記載される配列に潜在している。

アミノ酸配列では、当業者は、コードされた配列における単一のアミノ酸または僅かな率のアミノ酸を変更、付加または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列への個別の置換、欠失または付加が、変更がアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、またはアミノ酸の化学的に類似したアミノ酸への置換をもたらす、「保存的修飾変種」であることを認識している。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当業者に知られている。そのような保存的に修飾された変種は、本発明の多形、変種、種間相同体及び対立遺伝子に追加されるものであり、これらを除外しない。

機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当業者に知られている。以下の８つ群は、それぞれ互いに保存的置換があるアミノ酸を含有する。
アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び
システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（ＷＨＦｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、第２版（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ１９９３）を参照すること。）

用語「同一」または「同一性」率は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、同じである２つ以上の配列または部分配列を指す。配列は、比較範囲にわたって最大限に対応させて比較及び整列したとき、または指定された領域にわたって以下の配列比較アルゴリズムの１つ（もしくは当業者に利用可能な他のアルゴリズム）を使用して測定したとき、または手作業の整列及び目視検査によって、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの率（すなわち、特定された領域にわたって少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性）を有する場合、「実質的に同一」である。この定義は、試験配列の相補とも呼ばれる。同一性は、少なくとも約５０個のアミノ酸もしくはヌクレオチド長さの領域にわたって、または７５～１００個のアミノ酸もしくはヌクレオチド長さの領域にわたって、または特定されない場合、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの全配列にわたって存在することができる。ヒト以外の種からの相同体を含む、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ライブラリーを、本発明のポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを有する標識プローブを用いて厳密なハイブリッド形成条件下で選別するステップ及び前記ポリヌクレオチド配列を含有する完全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するステップを含むプロセスによって、得ることができる。そのようなハイブリッド形成技術は、当業者に良く知られている。

ポリペプチドの誘導体または変種は、誘導体または変種のアミノ酸配列が元のペプチドの１００個のアミノ酸の配列と少なくとも５０％の同一性を有する場合、ペプチドと「相同性」を共有する、または「相同性がある」と言われる。ある特定の実施形態において、誘導体または変種は、誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドのフラグメントと少なくとも７５％同じである。ある特定の実施形態において、誘導体または変種は、誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドのフラグメントと少なくとも８５％同じである。ある特定の実施形態において、誘導体のアミノ酸配列は、誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドのフラグメントと少なくとも９０％同じである。いくつかの実施形態において、誘導体のアミノ酸配列は、誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドのフラグメントと少なくとも９５％同じである。ある特定の実施形態において、誘導体または変種は、誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドのフラグメントと少なくとも９９％同じである。

本明細書に使用されるとき、「単離された」ポリペプチドまたは構築物は、天然の細胞培養環境の構成成分から特定及び分離、ならびに／または回収された構築物またはポリペプチドを意味する。天然環境の汚染構成成分は、ヘテロ多量体の診断的または治療的使用を典型的に妨げる材料であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれ得る。

ある特定の実施形態において、本明細書に使用されるとき、本明細書に記載されている「単離された」抗原結合ポリペプチド構築物は、天然の細胞培養環境の構成成分から特定及び分離、ならびに／または回収されたヘテロ二量体またはヘテロ二量体対を含む、ヘテロ二量体対または「単離された」ヘテロ二量体対を含む。天然環境の汚染構成成分は、ヘテロ二量体または抗原結合ポリペプチド構築物の診断的または治療的使用を妨げる材料であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれ得る。

ヘテロ二量体及び抗原結合ポリペプチド構築物、ならびにヘテロ二量体対は、一般に実質的に均質に精製される。語句「実質的に均質」、「実質的に均質な形態」及び「実質的均質性」は、産物が望ましくないポリペプチドの組み合わせ（例えば、ホモ二量体）から生じる副産物を実質的に欠いていることを示すために使用される。この文脈において、目的の種は、Ｈ１及びＬ１（Ｈ１－Ｌ１）またはＨ２及びＬ２（Ｈ２－Ｌ２）を含むヘテロ二量体である。汚染物質には、Ｈ１及びＬ２（Ｈ１－Ｌ２）もしくはＨ２及びＬ１（Ｈ２－Ｌ１）を含むヘテロ二量体、またはＨ１及びＬ１もしくはＨ２及びＬ２を含むホモ二量体が（Ｆａｂ部分が正確に対合されている、または誤対合されているにかかわらず）含まれる。純度に関して表現すると、実質的均質性は、副産物の量が混合物の存在する全ての種の総ＬＣ－ＭＳ強度の１０％を超えないこと、例えば、５％未満、１％未満または０．５％未満であることを意味し、百分率は、質量分析の結果を反映している。

語句「選択的（または特異的）にハイブリッド形成する」は、特定のヌクレオチド配列のみに、その配列が複合混合物（全細胞もしくはライブラリーＤＮＡまたはＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない）に存在するとき、厳密なハイブリッド形成条件下で、分子を結合、複製またはハイブリッド形成させることを意味する。

抗体技術の当業者により理解される用語は、本明細書において特に異なって明確に定義されない限り、当該技術において取得された意味を、それぞれ提示する。抗体は、可変領域、ヒンジ領域及び定常ドメインを有することが知られている。免疫グロブリンの構造及び機能は、例えば、Ｈａｒｌｏｗら編、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第１４章（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，１９８８）において総説されている。

本明細書に使用されるとき、用語「抗体」及び「免疫グロブリン」または「抗原結合ポリペプチド構築物」は、交換可能に使用される。「抗原結合ポリペプチド構築物」は、免疫グロブリン遺伝子または一つまたは複数のそのフラグメントにより実質的にコードされ、分析物（抗原）に特異的に結合するポリペプチドを指す。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常ドメイン遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンと分類され、次に免疫グロブリンアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥをそれぞれ定義する。更に、抗体は、多数のサブタイプの１つに属することができ、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブクラスに属することができる。

例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、２対のポリペプチド鎖から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤ）を有する。用語「軽鎖」には、結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する完全長軽鎖及びそのフラグメントが含まれる。完全長軽鎖は、可変領域ドメインＶＬ及び定常領域ドメインＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖には、カッパ鎖およびラムダ鎖が含まれる。用語「重鎖」には、結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する完全長重鎖及びそのフラグメントが含まれる。完全長重鎖は、可変領域ドメインＶＨ、ならびに３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨドメインは、カルボキシル末端にあり、ＣＨ３が、ポリペプチドのカルボキシ末端に最も近いところにある。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブクラスを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２サブクラスを含む）、ＩｇＭ、ならびにＩｇＥが含まれる、任意のアイソタイプであり得る。用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、典型的には、重鎖（ＶＨ）におよそ１２０～１３０個のアミノ末端アミノ酸及び軽鎖（ＶＬ）に約１００～１１０個のアミノ末端アミノ酸を含む、一般に抗原認識に関与する抗体の軽鎖及び／または重鎖の一部を指す。「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗原結合特性及び親和性に寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域（ＦＲ）は、ＣＤＲの正確な立体構造を維持することを助けて、抗原結合領域と抗原との結合を促進することができる。構造的に、フレームワーク領域は抗体においてＣＤＲ間に位置することができる。可変領域は、比較的保護されたフレームワーク領域（ＦＲ）が３つの超可変領域ＣＤＲと結合した、同じ一般構造を典型的に示す。各対の２つの鎖のＣＤＲは、典型的にフレームワーク領域により整列され、これが、特定のエピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖及び重鎖可変領域は両方とも、典型的にはドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。それぞれのドメインへのアミノ酸の指定は、特に記述されない限り、典型的にはＫａｂａｔＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７ａｎｄ１９９１））の定義に従っている。ある特定の実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、治療用ポリペプチド結合されているＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥのうち少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されている抗原結合ポリペプチド構築物に含まれる免疫グロブリンドメインは、ダイアボディまたはナノボディなどの免疫グロブリンに基づいた構築物のものである。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されている抗原結合ポリペプチド構築物は、ラクダ抗体などの重鎖抗体の少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。ある特定の実施形態において、本明細書に提供されている抗原結合ポリペプチド構築物は、ウシ抗体、ヒト抗体、ラクダ抗体（単一ドメイン及び非単一ドメイン）、齧歯類抗体、ヒト化抗体、非ヒト化抗体、マウス抗体または任意のキメラ抗体などの、哺乳類抗体からの少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。ある特定の実施形態において、本明細書に提供されている抗原結合ポリペプチド構築物は、合成ライブラリーから生成された抗体の少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。

「二重特異性（ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、「二重特異性（ｄｕａｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」または「二機能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」の抗原結合タンパク質または抗体は、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質である。二重特異性抗原結合タンパク質及び抗体は、多特異性抗原結合タンパク質抗体の一種である。二重特異的抗原結合タンパク質及び抗体の２つの結合部位は、同じ、または異なる分子標的に存在し得る２つの異なるエピトープに結合する。「多特異性抗原結合タンパク質」または「多特異性抗体」は、１つを超える抗原またはエピトープを標的にする。「二価抗原結合タンパク質」または「二価抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。いくつかの場合において、２つの結合部位は、同じ抗原特異性を有する。二価抗原結合タンパク質及び二価抗体は、二重特異性であり得る。上記を参照すること。「多特異性」または「多機能性」抗体以外の二価抗体は、ある特定の実施形態において、典型的には、それぞれ同一の結合部位を有すると理解される。

用語「優先的な対合」は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの対合パターンを記載するために本明細書に使用され、例えば、本明細書に記載されている抗原結合ポリペプチド構築物及びヘテロ二量体における免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖である。このように、「優先的な対合」は、第１と第２のポリペプチドの間に対合が生じるとき、一つまたは複数の追加の異なるポリペプチドが同時に存在する場合、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの優先的な対合を指す。典型的には、優先的な対合は、第１及び第２のポリペプチドの一方または両方の修飾（例えば、アミノ酸修飾）の結果として生じる。典型的には、優先的な対合は、対合した第１及び第２のポリペプチドが、対合が生じた後に最も豊富な二量体であることをもたらす。免疫グロブリン重鎖（Ｈ１）は、２つの異なる免疫グロブリン軽鎖（Ｌ１及びＬ２）と同時発現すると、両方の軽鎖と統計的に等しく対合し、Ｌ１と対合したＨ１、及びＬ２と対合したＨ１についておよそ５０：５０の混合物をもたらすことが、当該技術において知られている。この文脈において、「優先的な対合」は、例えば、Ｈ１がＬ１及びＬ２と同時発現するとき、Ｈ１－Ｌ１重鎖－軽鎖ヘテロ二量体の量が、Ｈ１－Ｌ２ヘテロ二量体の量よりも大きい場合、Ｈ１とＬ１の間に生じる。したがって、この場合では、Ｈ１はＬ２と比べてＬ１と優先的に対合する。

しかし、２つの出発抗体系から生成される野生型二重特異性抗体の文脈では、一方の抗体系の軽鎖が両方の抗体系の重鎖と優先的に対合する本質的な偏向が、いくつかの場合において存在することも知られている。したがって、二重特異性抗体結合構築物の文脈において設計の強度を決定するとき、野生型系の対合の程度と比較して設計の対合程度を評価する必要があり得る。したがって、１つの実施形態において、設計は、所望の二重特異性抗体の量が野生型系において得られる所望の二重特異性抗体の量より大きい場合、優先的な対合を示すことが考慮される。別の実施形態において、設計は、抗体の弱いアームにおける対合の量が、野生型系において見られるものより大きい場合、優先的な対合を示すことが考慮される。

抗体の重鎖は抗体の軽鎖と対合し、一つまたは複数の「界面」において互いに出会う、または接触する。「界面」には、第２のポリペプチドの一つまたは複数の「接触」アミノ酸残基と相互作用する第１のポリペプチドの一つまたは複数の「接触」アミノ酸が含まれる。例えば、界面は、二量体化ＣＨ３ドメインのＣＨ３ポリペプチド配列間、重鎖のＣＨ１ドメインと軽鎖のＣＬドメインの間、及び重鎖のＶＨドメインと軽鎖のＶＬドメインの間に存在する。「界面」は、ＩｇＧ抗体から、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体から誘導され得る。

用語「アミノ酸修飾」には、本明細書に使用されるとき、アミノ酸突然変異、挿入、欠失、置換、化学修飾、物理的修飾及び再編成が含まれるが、これらに限定されない。

抗原結合ポリペプチド構築物及びヘテロ二量体対
本明細書に記載されている抗原結合ポリペプチド構築物は、第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体を含むことができ、それぞれのヘテロ二量体は、免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖との対合によって得られる。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の定常及び可変ドメインの構造及び組織は、当該技術において良く知られている。免疫グロブリン重鎖は、典型的には、１つの可変（ＶＨ）ドメイン、ならびに３つの定常ドメインであるＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。免疫グロブリン軽鎖は、典型的には、１つの可変（ＶＬ）ドメイン及び１つの定常（ＣＬ）ドメインを含む。これらの典型的なフォーマットに対して様々な修飾を行うことができる。

本明細書に記載されている抗原結合ポリペプチド構築物及びヘテロ二量体対は、第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体を含むことができ、それぞれのヘテロ二量体は、少なくともＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む免疫グロブリン／抗体重鎖またはそのフラグメント、ならびにＶＬドメイン及びＣＬドメインを有する免疫グロブリン／抗体軽鎖を含む。１つの実施形態において、ヘテロ二量体対及び抗原結合ポリペプチド構築物の両方のヘテロ二量体は、完全長免疫グロブリン重鎖を含む。別の実施形態において、ヘテロ二量体対または抗原結合ポリペプチド構築物の両方のヘテロ二量体は、少なくともＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む免疫グロブリン重鎖のフラグメントを含む。１つの実施形態において、ヘテロ二量体対の両方のヘテロ二量体は、少なくともＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む免疫グロブリン重鎖のアミノ末端フラグメントを含む。別の実施形態において、ヘテロ二量体対の両方のヘテロ二量体は、少なくともＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む免疫グロブリン重鎖のカルボキシ末端フラグメントを含む。

ヘテロ二量体対のそれぞれのヘテロ二量体は、抗原またはエピトープに特異的に結合することができる。１つの実施形態において、それぞれのヘテロ二量体の免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖は、既知の抗体、例えば治療用抗体から誘導または改変される。治療用抗体は、疾患もしくは障害を有する、または疾患もしくは障害にかかり易くなっている哺乳動物における疾患または障害の治療に有効なものである。それぞれのヘテロ二量体が誘導され得る適切な治療用抗体には、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アダリムマブ、アレムツズマブ、アウログラブ（ａｕｒｏｇｒａｂ）、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、ルミリキシマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ、マイコグラブ（ｍｙｃｏｇｒａｂ）、ナタリズマブ、ニモツズマブ（ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、テプリズマブ、トシリズマブ／アトリズマブ（ａｔｌｉｚｕｍａｂ）、トシツモマブ、トラスツズマブ、Ｐｒｏｘｉｎｉｕｍ（商標）、Ｒｅｎｃａｒｅｘ（商標）、ウステキヌマブ及びザルツムマブが含まれるが、これらに限定されない。

１つの実施形態において、それぞれのヘテロ二量体の免疫グロブリン重鎖及び／または免疫グロブリン軽鎖は、以下のリストのタンパク質、ならびに以下のリストのタンパク質に属するサブユニット、ドメイン、モチーフ及びエピトープが含まれるが、これらに限定されない分子に結合する抗体から誘導または改変される。レニン；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ－１－アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）及びフォン・ヴィルブランド因子などの凝固因子；プロテインＣなどの凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子：肺サーファクタント；ウロキナーゼなどのプラスミノーゲン活性化因子またはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；腫瘍壊死因子－アルファ及びベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（正常に発現及び分泌されたＴ細胞の活性化を調節する（ｒｅｇｕｌａｔｅｄｏｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｎｏｒｍａｌｌｙＴ－ｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｎｄｓｅｃｒｅｔｅｄ））；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１－アルファ）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロレラキシン（ｐｒｏｒｅｌａｘｉｎ）；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ベータラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ－４などの細胞障害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；例えばＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲなどのホルモンまたは増殖因子の受容体；アルファインターフェロン（アルファ－ＩＦＮ）、ベータインターフェロン（ベータ－ＩＦＮ）及びガンマインターフェロン（ガンマ－ＩＦＮ）などのインターフェロン；プロテインＡまたはＤ；リウマトイド因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３、－４、－５もしくは－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５もしくはＮＴ－６）などの神経栄養因子、または神経成長因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；ＡＦＧＦ及びＰＦＧＦなどの線維芽細胞増殖因子；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ－１、ＴＧＦ－２、ＴＧＦ－３、ＴＧＦ－４またはＴＧＦ－５を含むＴＧＦ－アルファ及びＴＧＦ－ベータなどの形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）；デス（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ８０及びＣＤ１４７などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロンアルファ、ベータ及びガンマなどのインターフェロン；Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ及びＧ－ＣＳＦなどのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１３；ＴＮＦ－アルファ、スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えばＡＩＤＳエンベロープの一部、例えばｇｐ１２０などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－３及びＶＣＡＭなどの細胞接着分；ａまたはそのサブユニットを含むａ４／ｐ７インテグリン及び（Ｘｖ／ｐ３インテグリン；ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、アルファ７、アルファ８、アルファ９、アルファＤ、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ５１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４１、アルファＩＩｂ、アルファＩＥＬｂなどのインテグリンアルファサブユニット；ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、ベータ５、ベータ６、ベータ７及びベータ８などのインテグリンベータサブユニット；アルファＶベータ３、アルファＶベータ５及びアルファ４ベータ７が含まれるが、これらに限定されないインテグリンサブユニットの組み合わせ；アポトーシス経路のメンバー；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐＩ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ；ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＢ２等などのＥｐｈ受容体；ＨＬＡ－ＤＲなどのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）；補体受容体ＣＲ１、Ｃ１Ｒｑなどの補体タンパク質、ならびにＣ３及びＣ５などの他の補体因子；ＧｐＩｂアルファ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ及びＣＤ２００などの糖タンパク質受容体；ならびに上記に列挙されたポリペプチドのいずれかのフラグメント。

ある実施形態において、それぞれのヘテロ二量体の免疫グロブリン重鎖及び／または免疫グロブリン軽鎖は、ＡＬＫ受容体（プレイオトロフィン受容体）、プレイオトロフィン、ＫＳ１／４汎性癌抗原（ｐａｎ－ｃａｒｃｉｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎ）；卵巣癌抗原（ＣＡ１２５）；前立腺酸性ホスファターゼ；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）；黒色腫関連抗原ｐ９７；黒色腫抗原ｇｐ７５；高分子黒色腫抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）；前立腺特異的膜抗原；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；多形上皮ムチン抗原；ヒト乳脂肪球抗原；ＣＥＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＯ１７－１Ａ、ＧＩＣＡ１９－９、ＣＴＡ－１及びＬＥＡなどの結腸直腸癌関連抗原；バーキットリンパ腫抗原－３８．１３；ＣＤ１９；ヒトＢリンパ腫抗原ＣＤ２０；ＣＤ３３；ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２及びガングリオシドＧＭ３などの黒色腫特異的抗原；腫瘍特異的移植型細胞表面抗原（ＴＳＴＡ）；ＲＮＡ腫瘍ウイルスのＴ抗原、ＤＮＡ腫瘍ウイルス及びエンベロープ抗原を含むウイルス誘発性腫瘍抗原；結腸のＣＥＡ、５１４癌胎児性栄養芽層糖タンパク質及び膀胱腫瘍抗原などの癌胎児性抗原アルファフェトプロテイン；ヒト肺抗原Ｌ６及びＬ２０などの分化抗原；線維肉腫の抗原；ヒト白血病Ｔ細胞抗原Ｇｐ３７；ネオ糖タンパク質；スフィンゴ脂質；ＥＧＦＲ（表皮増殖因子受容体）などの乳癌抗原；ＮＹ－ＢＲ－１６；ＮＹ－ＢＲ－１６及びＨＥＲ２抗原（ｐ１８５ＨＥＲ２）；多形上皮ムチン（ＰＥＭ）；悪性腫瘍ヒト白血球抗原ＡＰＯ－１；胎児の赤血球に見出されるＩ抗原などの分化抗原；成人の赤血球に見出される初期内胚葉Ｉ抗原；着床前胚；胃腺癌に見出されるＩ（Ｍａ）；乳房上皮に見出されるＭ１８、Ｍ３９；骨髄細胞に見出されるＳＳＥＡ－１；ＶＥＰ８；ＶＥＰ９；Ｍｙｌ；Ｖａ４－Ｄ５；結腸直腸癌に見出されるＤ１５６－２２；ＴＲＡ－１－８５（血液型Ｈ）；精巣及び卵巣癌に見出されるＳＣＰ－１；直腸腺癌に見出されるＣ１４；肺腺癌に見出されるＦ３；胃癌に見出されるＡＨ６；Ｙハプテン；胚性癌細胞に見出されるＬｅｙ；ＴＬ５（血液型Ａ）；Ａ４３１細胞に見出されるＥＧＦ受容体；膵癌に見出されるＥ１シリーズ（血液型Ｂ）；胚性癌細胞に見出されるＦＣ１０．２；胃腺癌抗原；腺癌に見出されるＣＯ－５１４（血液型Ｌｅａ）；腺癌に見出されるＮＳ－１０；ＣＯ－４３（血液型Ｌｅｂ）；Ａ４３１細胞のＥＧＦ受容体に見出されるＧ４９；結腸腺癌に見出されるＭＨ２（血液型ＡＬｅｂ／Ｌｅｙ）；結腸癌に見出される１９．９；胃癌ムチン；骨髄細胞に見出されるＴ５Ａ７；黒色腫に見出されるＲ２４；胚性癌細胞に見出される４．２、ＧＤ３、Ｄ１．１、ＯＦＡ－１、ＧＭ２、ＯＦＡ－２、ＧＤ２及びＭ１：２２：２５：８、ならびに胚の４～８細胞期に見出されるＳＳＥＡ－３及びＳＳＥＡ－４；皮膚Ｔ細胞リンパ腫抗原；ＭＡＲＴ－１抗原；ＳｉａｌｙＴｎ（ＳＴｎ）抗原；結腸癌抗原ＮＹ－ＣＯ－４５；肺癌抗原ＮＹ－ＬＵ－１２変種Ａ；腺癌抗原ＡＲＴ１；傍腫瘍性関連脳精巣癌抗原（腫瘍神経細胞抗原（ｏｎｃｏｎｅｕｒｏｎａｌａｎｔｉｇｅｎ）ＭＡ２、傍腫瘍性神経細胞抗原（ｐａｒａｎｅｏｐｌａｓｔｉｃｎｅｕｒｏｎａｌａｎｔｉｇｅｎ））；神経腫瘍学的腹部抗原２（Ｎｅｕｒｏ－ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａｌｖｅｎｔｒａｌａｎｔｉｇｅｎ２）（ＮＯＶＡ２）；肝細胞癌抗原遺伝子５２０；腫瘍関連抗原ＣＯ－０２９；腫瘍関連抗原ＭＡＧＥ－Ｃ１（癌／精巣抗原ＣＴ７）、ＭＡＧＥ－Ｂ１（ＭＡＧＥ－ＸＰ抗原）、ＭＡＧＥ－Ｂ２（ＤＡＭ６）、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－４－ａ、ＭＡＧＥ－４－ｂ及びＭＡＧＥ－Ｘ２；癌－精巣抗原ＮＹ－ＥＯＳ－１）、ならびに上記に列挙されたポリペプチドのいずれかのフラグメントが含まれるが、これらに限定されない癌抗原に特異的に結合する抗体から誘導または改変される。

ヒト抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＤを含むアイソタイプに分けることができる。１つの実施形態において、Ｆｃは、ＩｇＧアイソタイプから誘導される。別の実施形態において、Ｆｃは、ＩｇＡアイソタイプから誘導される。別の実施形態において、Ｆｃは、ＩｇＥアイソタイプから誘導される。別の実施形態において、Ｆｃは、ＩｇＭアイソタイプから誘導される。別の実施形態において、Ｆｃは、ＩｇＤアイソタイプから誘導される。

ヒトＩｇＧ抗体は、サブクラスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に分けることもできる。したがって、いくつかの実施形態において、Ｆｃが抗体のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスから誘導され得ることが考慮される。

ヘテロ二量体対のそれぞれのヘテロ二量体は、エピトープまたは抗原に特異的に結合することができる。１つの実施形態において、ヘテロ二量体対のそれぞれのヘテロ二量体は、同じエピトープに結合する。別の実施形態において、ヘテロ二量体対の第１のヘテロ二量体は、１つの抗原のエピトープに特異的に結合し、ヘテロ二量体対の第２のヘテロ二量体は、同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合する。別の実施形態において、ヘテロ二量体対の第１のヘテロ二量体は、第１の抗原のエピトープに特異的に結合し、ヘテロ二量体対の第２のヘテロ二量体は、第１の抗原とは異なる第２の抗原のエピトープに特異的に結合する。例えば、１つの実施形態において、第１のヘテロ二量体は、組織因子に特異的に結合し、一方、第２のヘテロ二量体は、抗原Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ２）に特異的に結合し、その逆も同じである。代替的な実施形態において、第１のヘテロ二量体は、組織因子に特異的に結合し、一方、第２のヘテロ二量体は、ＥＧＦＲに特異的に結合し、その逆も同じである。なお別の実施形態において、第１のヘテロ二量体は、ＥＧＦＲに特異的に結合し、一方、第２のヘテロ二量体は、抗原Ｈｅｒ２に特異的に結合し、その逆も同じである。別の実施形態において、第１のヘテロ二量体は、上記に記載された分子または癌抗原に特異的に結合する。別の実施形態において、第２のヘテロ二量体は、上記に記載された分子または癌抗原に特異的に結合する。

上記に示されたように、いくつかの実施形態において、それぞれのヘテロ二量体の免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖は、既知の治療用抗体から、または様々な標的分子もしくは癌抗原に結合する抗体に由来してもよく、あるいはそれらから遺伝子工学的に操作されてもよい。多数のそのような分子のアミノ酸及びヌクレオチド配列は、容易に入手可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＪ３０８０８７．１（ヒト化抗ヒト組織因子抗体Ｄ３Ｈ４４軽鎖可変領域及びＣＬドメイン）；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＪ３０８０８６．１（ヒト化抗ヒト組織因子抗体Ｄ３Ｈ４４重鎖可変領域及びＣＨ１ドメイン）；ＧｅｎＢａｎｋ：ＨＣ３５９０２５．１（ペルツズマブＦａｂ軽鎖遺伝子モジュール）；ＧｅｎＢａｎｋ：ＨＣ３５９０２４．１（ペルツズマブＦａｂ重鎖遺伝子モジュール）；ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＭ６８５４６５．１（抗体トラスツズマブ（＝Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）－野生型；軽鎖）；ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＭ６８５４６３．１（抗体トラスツズマブ（＝Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）－野生型；重鎖）；ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＭ６８５４６６．１（抗体トラスツズマブ（＝Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）－ＧＣ最適化軽鎖）；及びＧｅｎＢａｎｋ：ＧＭ６８５４６４．１（抗体トラスツズマブ（＝Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）－ＧＣ最適化重鎖を参照すること）。本明細書に記載されているそれぞれのＧｅｎＢａｎｋ番号の配列は、２０１２年１１月２８日付けのＮＣＢＩウエブサイトから入手可能であり、それぞれ全ての目的においてその全体が参照として本明細書に組み込まれる。セツキシマブのアミノ酸及びヌクレオチド配列も、当該技術に知られており、例えば、ＣａｎａｄｉａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈＲｅｓｅａｒｃｈ，ＡｌｂｅｒｔａＩｎｎｏｖａｔｅｓ－ＨｅａｌｔｈＳｏｌｕｔｉｏｎｓ及びＴｈｅＭｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＣｅｎｔｒｅ（ＴＭＩＣ）により支援されたＤｒｕｇＢａｎｋウエブサイト、受入番号ＤＢ００００２を参照すること。

いくつかの態様において、単離された抗原結合ポリペプチド構築物は、本明細書に開示されている表または受入番号に記載されているアミノ酸配列またはそのフラグメントに少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一性があるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離された抗原結合ポリペプチド構築物は、本明細書に開示されている表または受入番号に記載されているヌクレオチド配列またはそのフラグメントに少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一性があるポリヌクレオチドによりコードされているアミノ酸配列を含む。

免疫グロブリン重鎖及び軽鎖へのアミノ酸修飾
ヘテロ二量体対のうち少なくとも一方のヘテロ二量体は、第１のヘテロ二量体の重鎖が一方の軽鎖と優先的に対合するが他方とは対合しないように、免疫グロブリン重鎖及び／または免疫グロブリン軽鎖に一つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。同様に、第２のヘテロ二量体の重鎖は、第１ではなく第２の軽鎖と優先的に対合することができる。１つの重鎖の、２つの軽鎖のうちの一方との優先的な対合は、１つの免疫グロブリン重鎖及び２つの免疫グロブリン軽鎖を含む設計セット（ＬＣＣＡ設計セットと呼ばれる）に基づくことができ、免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリン重鎖が両方の免疫グロブリン軽鎖と同時発現するとき、２つの免疫グロブリン軽鎖のうちの一方と、もう一方に優先して対合する。したがって、ＬＣＣＡ設計セットは、１つの免疫グロブリン重鎖、第１の免疫グロブリン軽鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖を含むことができる。

１つの実施形態において、一つまたは複数のアミノ酸修飾は一つまたは複数のアミノ酸置換を含む。

１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットにより実証される優先的対合は、軽鎖と重鎖の間の界面の一部である一つまたは複数のアミノ酸を修飾することによって確立される。１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットにより実証される優先的対合は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ１ドメイン、第１の免疫グロブリン軽鎖のＣＬドメイン及び第２の免疫グロブリン軽鎖のＣＬドメインのうち少なくとも１つにおける一つまたは複数のアミノ酸を修飾することによって確立される。

１つ実施形態において、一つまたは複数のアミノ酸修飾は、残基のＫａｂａｔ番号付けにより示されている、可変（ＶＨ、ＶＬ）及び定常（ＣＨ１、ＣＬ）ドメインの保存的フレームワーク残基に限定されている。例えば、Ａｌｍａｇｒｏ［ＦｒｏｎｔｉｅｒｓＩｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００８）１３：１６１９－１６３３］は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｉａ及びＩＭＧＴ番号付けに基づいたフレームワーク残基の定義を提供する。

１つの実施形態において、ヘテロ二量体のうち少なくとも一方は、互いに相補的である免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖に導入された一つまたは複数の突然変異を含む。重鎖及び軽鎖界面における相補性は、立体及び疎水的接触、静電／荷電相互作用または様々な相互作用の組み合わせに基づいて達成することができる。タンパク質表面の間の相補性は、鍵と鍵穴の適合（ｌｏｃｋａｎｄｋｅｙｆｉｔ）、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｉｎｔｏｈｏｌｅ）、突起及び空洞（ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎａｎｄｃａｖｉｔｙ）、供与体及び受容体等に関して文献に広く記載されており、全て、相互作用する２つの表面の間の構造的及び化学的性質の一致を含んでいる。１つの実施形態において、ヘテロ二量体のうち少なくとも一方は、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖に導入された突然変異が界面における重鎖及び軽鎖に新たな水素結合を導入する、一つまたは複数の突然変異を含む。１つの実施形態において、ヘテロ二量体のうち少なくとも一方は、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖に導入された突然変異が界面における重鎖及び軽鎖に新たな塩架橋を導入する、一つまたは複数の突然変異を含む。

適切なＬＣＣＡ設計セットの非限定例は、実施例、表及び図に記載されている。１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＣＨ１ドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する免疫グロブリン重鎖、ＣＬドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する第１の免疫グロブリン軽鎖及びＣＬドメインにアミノ酸修飾を有さない第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。別の実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＣＨ１ドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する免疫グロブリン重鎖、ＣＬドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する第１の免疫グロブリン軽鎖及びＣＬドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。別の実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＣＨ１ドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する免疫グロブリン重鎖、ＣＬドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する第１の免疫グロブリン軽鎖及びＣＬドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。別の実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＣＨ１ドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する免疫グロブリン重鎖、ＣＬドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する第１の免疫グロブリン軽鎖及びＣＬドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。

１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＣＨ１ドメインにアミノ酸修飾を有さない免疫グロブリン重鎖、ＣＬドメインにアミノ酸修飾を有さない第１の免疫グロブリン軽鎖及びＣＬドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＣＨ１ドメインにアミノ酸修飾を有さない免疫グロブリン重鎖、ＣＬドメインにアミノ酸修飾を有さない第１の免疫グロブリン軽鎖及びＣＬドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。

１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＣＨ１ドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する免疫グロブリン重鎖、ＣＬドメインにアミノ酸修飾を有さない第１の免疫グロブリン軽鎖及びＣＬドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＣＨ１ドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する免疫グロブリン重鎖、ＣＬドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する第１の免疫グロブリン軽鎖及びＣＬドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＣＨ１ドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する免疫グロブリン重鎖、ＣＬドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する第１の免疫グロブリン軽鎖及びＣＬドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＣＨ１ドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する免疫グロブリン重鎖、ＣＬドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する第１の免疫グロブリン軽鎖及びＣＬドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＣＨ１ドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する免疫グロブリン重鎖、ＣＬドメインに少なくとも３個のアミノ酸修飾を有する第１の免疫グロブリン軽鎖及びＣＬドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。

１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＣＨ１ドメインに少なくとも３個のアミノ酸修飾を有する免疫グロブリン重鎖、ＣＬドメインにアミノ酸修飾を有さない第１の免疫グロブリン軽鎖及びＣＬドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＣＨ１ドメインに少なくとも３個のアミノ酸修飾を有する免疫グロブリン重鎖、ＣＬドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する第１の免疫グロブリン軽鎖及びＣＬドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＣＨ１ドメインに少なくとも３個のアミノ酸修飾を有する免疫グロブリン重鎖、ＣＬドメインに少なくとも３個のアミノ酸修飾を有する第１の免疫グロブリン軽鎖及びＣＬドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＣＨ１ドメインに少なくとも３個のアミノ酸修飾を有する免疫グロブリン重鎖、ＣＬドメインに少なくとも４個のアミノ酸修飾を有する第１の免疫グロブリン軽鎖及びＣＬドメインに少なくとも３個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットにより実証される優先的対合は、免疫グロブリン重鎖のＶＨドメイン、第１の免疫グロブリン軽鎖のＶＬドメイン及び第２の免疫グロブリン軽鎖のＶＬドメインのうち少なくとも１つにおける一つまたは複数のアミノ酸を修飾することによって確立される。適切なＬＣＣＡ設計セットの非限定例は、下記の表及び実施例に示されている。

１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＶＨドメインにアミノ酸修飾を有さない免疫グロブリン重鎖、ＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さない第１の免疫グロブリン軽鎖及びＶＬドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＶＨドメインにアミノ酸修飾を有さない免疫グロブリン重鎖、ＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さない第１の免疫グロブリン軽鎖及びＶＬドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。

１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＶＨドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する免疫グロブリン重鎖、ＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さない第１の免疫グロブリン軽鎖及びＶＬドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＶＨドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する免疫グロブリン重鎖、ＶＬドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する第１の免疫グロブリン軽鎖及びＶＬドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＶＨドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する免疫グロブリン重鎖、ＶＬドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する第１の免疫グロブリン軽鎖及びＶＬドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。

１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＶＨドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する免疫グロブリン重鎖、ＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さない第１の免疫グロブリン軽鎖及びＶＬドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＶＨドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する免疫グロブリン重鎖、ＶＬドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する第１の免疫グロブリン軽鎖及びＶＬドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットは、ＶＨドメインに少なくとも２個のアミノ酸修飾を有する免疫グロブリン重鎖、ＶＬドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する第１の免疫グロブリン軽鎖及びＶＬドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。

１つの実施形態において、ＬＣＣＡ設計セットを組み合わせて、２つの別個の免疫グロブリン重鎖（Ｈ１及びＨ２）、ならびに２つの別個の免疫グロブリン軽鎖（Ｌ１及びＬ２）を含む組み合わせを提供し、ここでＨ１、Ｈ２、Ｌ１及びＬ２が同時発現するとき、Ｈ１はＬ１と優先的に対合し、Ｈ２はＬ２と優先的に結合する。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているアミノ酸修飾は、二重特異性抗体構築物の文脈におけるものである。例えば、本明細書に記載されている設計セットを、完全長重鎖が免疫グロブリン軽鎖と優先的に対合するように、完全長の免疫グロブリン重鎖に組み込むことができる。いくつかの実施形態において、完全長免疫グロブリン重鎖は、実施例に記載されているように、Ｆｃ領域に二量体化を促進するアミノ酸修飾を含有する。

本明細書に特定されている特定のアミノ酸修飾の他の抗体への移行可能性：
上記に特定された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖への特定のアミノ酸修飾は、Ｄ３Ｈ４４抗組織因子細胞外ドメイン抗体、トラスツズマブ及びセツキシマブの免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に関して記載されてきたが、これらのアミノ酸修飾は他の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能であり、一方の免疫グロブリン重鎖と２つの免疫グロブリン軽鎖の一方との優先的対合の類似したパターンをもたらすことが、以下の観点から、本明細書において考慮及び実証されている（例えば、実施例、図及び表を参照すること）。

免疫グロブリン重鎖と軽鎖の界面におけるＶＨ：ＶＬ及びＣＨ１：ＣＬの界面残基は、比較的十分に保存されている（Ｐａｄｌａｎら，１９８６，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３（９）：９５１－９６０）。この配列保存は、進化抑制の結果であり、機能的に活性な抗原結合ドメインが軽鎖と重鎖の組み合わせ対合の際に形成される可能性を増加させる。この配列保存の結果、優先的対合を導く、Ｄ３Ｈ４４について上述された特定の例における配列修飾を、他の重鎖及び軽鎖対ヘテロ二量体に移行して、優先的対合についてほぼ同等の結果を得られることがわかり、それは、この領域が抗体全体にわたって高い配列保存を示すからである。更に、配列の差異が生じる場合、これらは、通常ＣＨ１：ＣＬ界面から遠位にある。これは、ＣＨ１及びＣＬドメインにおいて特に当てはまる。しかし、ＣＤＲ（相補性決定領域）ループ残基（及び長さ）、特にＣＤＲ－Ｈ３に関して、抗原結合部位に幾らかの配列変動性がある。したがって、１つの実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ二量体対は、抗原結合部位のアミノ酸配列がＤ３Ｈ４４抗体と有意に異なるとき、少なくとも１つのヘテロ二量体が一つまたは複数のアミノ酸修飾をＣＤＲループの遠位にあるＶＨ及び／またはＶＬドメインに含む、ヘテロ二量体を含む。別の実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ二量体対は、抗原結合部位のアミノ酸配列がＤ３Ｈ４４抗体と実質的に同じであるとき、少なくとも１つのヘテロ二量体が一つまたは複数のアミノ酸修飾をＣＤＲループの近位または遠位にあるＶＨ及び／またはＶＬドメインに含む、ヘテロ二量体を含む。

１つの実施形態において、本明細書に記載されているアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ１／κに基づいた抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。そのようなＩｇＧ１／κ鎖の非限定例には、オファツムマブ（ヒト）またはトラスツズマブ、ペルツズマブもしくはベバシズマブ（ヒト化）が含まれる。

別の実施形態において、本明細書に記載されているアミノ酸修飾は、一般的に使用されるＶＨ及びＶＬ部分群を利用した抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。そのような抗体の非限定例には、ペルツズマブが含まれる。

１つの実施形態において、本明細書に記載されているアミノ酸修飾は、生殖系に近いフレームワークを有する抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。そのような抗体の例には、オビヌツズマブが含まれる。

１つの実施形態において、本明細書に記載されているアミノ酸修飾は、重鎖及び軽鎖対に平均的に観察されるものに近いＶＨ：ＶＬドメイン間角度を有する抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。この種類の抗体の例には、ペルツズマブが含まれるが、これに限定されない。別の実施形態において、本明細書に記載されているアミノ酸修飾は、基本となるＣＬ及びＣＨ１ドメインを有する抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。そのような抗体の適切な例には、トラスツズマブが含まれるが、これに限定されない。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているアミノ酸修飾の特定のサブセットが、上記に提供された抗原結合構築物の可変ドメインに利用される。

実施例、図及び表は、アミノ酸修飾（例えば、可変領域及び定常領域を含む一つまたは複数のＦａｂフラグメント内）が、他の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能であり、一方の免疫グロブリン重鎖と２つの免疫グロブリン軽鎖の一方との優先的対合の類似したパターンをもたらすことを、実証している。

優先的対合
上記に記載されたように、本明細書に記載されている抗原結合構築物／ヘテロ二量体対のうち少なくとも一方のヘテロ二量体は、一方のヘテロ二量体の重鎖、例えばＨ１が、軽鎖の一方、例えばＬ１と優先的に対合し、他方の軽鎖Ｌ２とは対合しないように、及び他方のヘテロ二量体の重鎖Ｈ２が、軽鎖Ｌ２と優先的に対合し、軽鎖Ｌ１とは対合しないように、免疫グロブリン重鎖及び／または免疫グロブリン軽鎖に一つまたは複数のアミノ酸修飾を含むことができる。換言すると、所望の優先的対合は、Ｈ１とＬ１の間及びＨ２とＬ２の間であることが考慮される。例えば、Ｈ１とＬ１の優先的対合は、Ｈ１がＬ１及びＬ２と組み合わされるとき、Ｈ１－Ｌ１ヘテロ二量体の収率が、一つまたは複数のアミノ酸修飾を有さないＨ２／Ｌ２対に対する、対応するＨ１／Ｌ１対のそれぞれの対合に関して、誤対合Ｈ１－Ｌ２ヘテロ二量体の収率より大きい場合に生じると考慮される。同様に、Ｈ２とＬ２の優先的対合は、Ｈ２がＬ１及びＬ２と組み合わされるとき、Ｈ２－Ｌ２ヘテロ二量体の収率が、一つまたは複数のアミノ酸修飾を有さないＨ２／Ｌ２対に対する、対応するＨ１／Ｌ１対のそれぞれの対合に関して、誤対合Ｈ２－Ｌ１ヘテロ二量体の収率より大きい場合に生じると考慮される。この文脈において、Ｈ１及びＬ１（Ｈ１－Ｌ１）またはＨ２及びＬ２（Ｈ２－Ｌ２）を含むヘテロ二量体は、優先的に対合された、正確に対合された、絶対的な対または所望のヘテロ二量体と本明細書において呼ばれ、一方、Ｈ１とＬ２（Ｈ１－Ｌ２）またはＨ２とＬ１（Ｈ２－Ｌ１）を含むヘテロ二量体は、誤対合ヘテロ二量体と本明細書において呼ばれる。Ｈ１－Ｌ１及びＨ２－Ｌ２の選択的対合を達成することが意図される、２つの重鎖及び２つの軽鎖に対応する突然変異のセットは、設計セットと呼ばれる。

したがって、１つの実施形態において、ヘテロ二量体の１つの免疫グロブリン重鎖が２つの免疫グロブリン軽鎖と同時発現するとき、所望のヘテロ二量体の相対収率は、５５％を超える。別の実施形態において、ヘテロ二量体の１つの免疫グロブリン重鎖が２つの免疫グロブリン軽鎖と同時発現するとき、所望のヘテロ二量体の相対収率は、６０％を超える。別の実施形態において、ヘテロ二量体の１つの免疫グロブリン重鎖が２つの免疫グロブリン軽鎖と同時発現するとき、所望のヘテロ二量体の相対収率は、７０％を超える。別の実施形態において、ヘテロ二量体の１つの免疫グロブリン重鎖が２つの免疫グロブリン軽鎖と同時発現するとき、所望のヘテロ二量体の相対収率は、８０％を超える。別の実施形態において、ヘテロ二量体の１つの免疫グロブリン重鎖が２つの免疫グロブリン軽鎖と同時発現するとき、所望のヘテロ二量体の相対収率は、９０％を超える。別の実施形態において、ヘテロ二量体の１つの免疫グロブリン重鎖が２つの免疫グロブリン軽鎖と同時発現するとき、所望のヘテロ二量体の相対収率は、９５％を超える。

上記の例において、Ｈ１－Ｌ１の優先的対合は、所望のＨ１－Ｌ１ヘテロ二量体の量が、Ｈ１がＬ１及びＬ２と同時発現するとき、誤対合Ｈ１－Ｌ２ヘテロ二量体の量よりも大きい場合に生じると考慮される。同様に、Ｈ２－Ｌ２の優先的対合は、所望のＨ２－Ｌ２ヘテロ二量体の量が、Ｈ２がＬ１及びＬ２と同時発現するとき、誤対合Ｈ２－Ｌ２ヘテロ二量体の量よりも大きい場合に生じると考慮される。したがって、１つの実施形態において、ヘテロ二量体の１つの免疫グロブリン重鎖が２つの免疫グロブリン軽鎖と同時発現するとき、所望のヘテロ二量体と誤対合ヘテロ二量体の比は、１．２５：１を超える。１つの実施形態において、ヘテロ二量体の１つの免疫グロブリン重鎖が２つの免疫グロブリン軽鎖と同時発現するとき、所望のヘテロ二量体と誤対合ヘテロ二量体の比は、１．５：１を超える。別の実施形態において、ヘテロ二量体の１つの免疫グロブリン重鎖が２つの免疫グロブリン軽鎖と同時発現するとき、所望のヘテロ二量体と誤対合ヘテロ二量体の比は、２：１を超える。別の実施形態において、ヘテロ二量体の１つの免疫グロブリン重鎖が２つの免疫グロブリン軽鎖と同時発現するとき、所望のヘテロ二量体と誤対合ヘテロ二量体の比は、３：１を超える。別の実施形態において、ヘテロ二量体の１つの免疫グロブリン重鎖が２つの免疫グロブリン軽鎖と同時発現するとき、所望のヘテロ二量体と誤対合ヘテロ二量体の比は、５：１を超える。別の実施形態において、ヘテロ二量体の１つの免疫グロブリン重鎖が２つの免疫グロブリン軽鎖と同時発現するとき、所望のヘテロ二量体と誤対合ヘテロ二量体の比は、１０：１を超える。別の実施形態において、ヘテロ二量体の１つの免疫グロブリン重鎖が２つの免疫グロブリン軽鎖と同時発現するとき、所望のヘテロ二量体と誤対合ヘテロ二量体の比は、２５：１を超える。別の実施形態において、ヘテロ二量体の１つの免疫グロブリン重鎖が２つの免疫グロブリン軽鎖と同時発現するとき、所望のヘテロ二量体と誤対合ヘテロ二量体の比は５０：１を超える。

いくつかの態様において、本明細書に記載されるヘテロ二量体は、優先的に対合して、二重特異性抗体を形成する。いくつかの実施形態において、構築物は、Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ、Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ及びトラスツズマブ／セツキシマブから選択される二重特異性抗体を形成するように優先的に対合するヘテロ二量体を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、表２８ａ～２８ｃに記載されているアミノ酸修飾を含む。

いくつかの実施形態において、２つの完全長重鎖構築物は、２つの特有の軽鎖構築物と同時発現して、１０個の可能な抗体種：Ｈ１－Ｌ１：Ｈ１－Ｌ１、Ｈ１－Ｌ２：Ｈ１－Ｌ２、Ｈ１－Ｌ１：Ｈ１－Ｌ２、Ｈ２－Ｌ１：Ｈ２－Ｌ１、Ｈ２－Ｌ２：Ｈ２－Ｌ２、Ｈ２－Ｌ１：Ｈ２－Ｌ２、Ｈ１－Ｌ１：Ｈ２－Ｌ１、Ｈ１－Ｌ２：Ｈ２－Ｌ２、Ｈ１－Ｌ２：Ｈ２－Ｌ１及びＨ１－Ｌ１：Ｈ２－Ｌ２を生じる。Ｈ１－Ｌ１：Ｈ２－Ｌ２種は、正確に対合した二重特異性抗体種であると考慮される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ比は、最大量の正確に対合した二重特異性抗体種を生じるように選択される。例えば、いくつかの実施形態において、Ｈ１：Ｈ２：Ｌ１：Ｌ２の比は、１５：１５：５３：１７である。いくつかの実施形態において、Ｈ１：Ｈ２：Ｌ１：Ｌ２の比は、１５：１５：１７：５３である。

いくつかの実施形態において、正確に対合した二重特異性種の率は、全ての種と比べて少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である（例えば、表２９ａ～２９ｃ及び３０ａ～３０ｃを参照すること）。いくつかの実施形態において、正確に対合した二重特異性種の率は、表２８ａ～２８ｃに記載されているアミノ酸修飾を有さない対応する野生型Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１及びＬ２を同時発現させることによって得られる正確に対合した二重特異性抗体種の率よりも大きい。いくつかの実施形態において、正確に対合した二重特異性種の率は、表２８ａ～２８ｃに記載されているアミノ酸修飾を有さない対応する野生型Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１及びＬ２を同時発現させることによって得られる正確に対合した二重特異性抗体種の率と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または７５％増加している。

ヘテロ二量体の熱安定性
優先的対合の促進に加えて、アミノ酸置換は、突然変異がＦａｂヘテロ二量体を不安定化しないように選択された。したがって、大部分の場合において、Ｆａｂヘテロ二量体の安定性の測定値は、野生型Ｆａｂに非常に近いもの（例えば、野生型Ｆａｂの３℃以内）であった。

したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ二量体対のそれぞれのヘテロ二量体は、同じ免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むが本明細書に記載されているＣＨ１、ＣＬ、ＶＨまたはＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体に匹敵する熱安定性を有する。１つの実施形態において、熱安定性は、融解温度またはＴｍの測定によって決定される。したがって１つの実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ二量体の熱安定性は、同じ免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むが本明細書に記載されているＣＨ１、ＣＬ、ＶＨまたはＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体の約１０℃以内である。したがって、１つの実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ二量体の熱安定性は、同じ免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むが本明細書に記載されているＣＨ１、ＣＬ、ＶＨまたはＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体の約５℃以内である。別の実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ二量体の熱安定性は、同じ免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むが本明細書に記載されているＣＨ１、ＣＬ、ＶＨまたはＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体の約３℃以内である。別の実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ二量体の熱安定性は、同じ免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むが本明細書に記載されているＣＨ１、ＣＬ、ＶＨまたはＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体の約２℃以内である。別の実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ二量体の熱安定性は、同じ免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むが本明細書に記載されているＣＨ１、ＣＬ、ＶＨまたはＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体の約１．５℃以内である。別の実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ二量体の熱安定性は、同じ免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むが本明細書に記載されているＣＨ１、ＣＬ、ＶＨまたはＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体の約１℃以内である。別の実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ二量体の熱安定性は、同じ免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むが本明細書に記載されているＣＨ１、ＣＬ、ＶＨまたはＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体の約０．５℃以内である。別の実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ二量体の熱安定性は、同じ免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むが本明細書に記載されているＣＨ１、ＣＬ、ＶＨまたはＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体の約０．２５℃以内である。

更に、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ二量体の熱安定性は、同じ免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むが本明細書に記載されているＣＨ１、ＣＬ、ＶＨまたはＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体と比べて驚くほど改善（すなわち、増加）される。したがって、１つの実施形態において、本明細書に記載されるヘテロ二量体の熱安定性は、同じ免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むが本明細書に記載されているＣＨ１、ＣＬ、ＶＨまたはＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体と比較して、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．５、５．０℃、またはそれ以上増加される。

抗原へのヘテロ二量体の親和性
１つの実施形態において、ヘテロ二量体対のそれぞれのヘテロ二量体は、同じ免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むが本明細書に記載されているＣＨ１、ＣＬ、ＶＨまたはＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体と同じ、または匹敵する親和性を、それぞれの抗原に対して有する。１つの実施形態において、ヘテロ二量体対のヘテロ二量体は、同じ免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むが本明細書に記載されているＣＨ１、ＣＬ、ＶＨまたはＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体の約５０倍以内の親和性を、それぞれの抗原に有する。１つの実施形態において、ヘテロ二量体対のヘテロ二量体は、同じ免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むが本明細書に記載されているＣＨ１、ＣＬ、ＶＨまたはＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体の約２５倍以内の親和性を、それぞれの抗原に有する。１つの実施形態において、ヘテロ二量体対のヘテロ二量体は、同じ免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むが本明細書に記載されているＣＨ１、ＣＬ、ＶＨまたはＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体の約１０倍以内の親和性を、それぞれの抗原に有する。別の実施形態において、ヘテロ二量体対のヘテロ二量体は、同じ免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むが本明細書に記載されているＣＨ１、ＣＬ、ＶＨまたはＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体の約５倍以内の親和性を、それぞれの抗原に有する。別の実施形態において、ヘテロ二量体対のヘテロ二量体は、同じ免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むが本明細書に記載されているＣＨ１、ＣＬ、ＶＨまたはＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体の約２．５倍以内の親和性を、それぞれの抗原に有する。別の実施形態において、ヘテロ二量体対のヘテロ二量体は、同じ免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むが本明細書に記載されているＣＨ１、ＣＬ、ＶＨまたはＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体の約２倍以内の親和性を、それぞれの抗原に有する。別の実施形態において、ヘテロ二量体対のヘテロ二量体は、同じ免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むが本明細書に記載されているＣＨ１、ＣＬ、ＶＨまたはＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体の約１．５倍以内の親和性を、それぞれの抗原に有する。別の実施形態において、ヘテロ二量体対のヘテロ二量体は、同じ免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含むが本明細書に記載されているＣＨ１、ＣＬ、ＶＨまたはＶＬドメインにアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体とほぼ同じ親和性を、それぞれの抗原に有する。

追加の選択的な修飾
１つの実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ二量体対の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を、共有結合が重鎖と軽鎖の優先的対合を妨げない、またはヘテロ二量体が抗原に結合する能力に影響を与えない、またはヘテロ二量体の安定性に影響を与えないように、更に修飾（すなわち、様々な種類の分子の共有結合によって）することができる。そのような修飾には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結等によるものが含まれるが、これらに限定されない。多数の化学修飾のいずれかを、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等が含まれるがこれらに限定されない既知の技術によって実施することができる。

別の実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ二量体対の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を、所定の生物学的応答を修飾する治療剤または薬物の部分に（直接的または間接的に）コンジュゲートさせることができる。治療剤または薬物の部分は、古典的な化学治療剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物の部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンＡ、オンコナーゼ（Ｏｎｃｏｎａｓｅ）（または別の細胞障害性ＲＮアーゼ）、シュードモナス外毒素、コレラ毒素またはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、例えば、ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－ベータ、ＡＩＭＩ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９号を参照すること）、ＡＩＭＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照すること）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：１５６７）及びＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１０５号を参照すること）、血栓形成剤または抗血管新生剤、例えば、アンジオスタチンまたはエンドスタチン、などのタンパク質；あるいは、例えばリンホカイン（例えば、インターロイキン－１（「ＩＬ－１」）、インターロイキン－２（「ＩＬ－２」）、インターロイキン－６（「ＩＬ－６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ－ＣＳＦ」）及び顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ－ＣＳＦ」））などの生物学的応答修飾因子、または増殖因子（例えば、成長ホルモン（「ＧＨ」））が含まれ得る。

更に、代替的な実施形態において、抗体を、放射性金属イオンをコンジュゲートさせるのに有用な放射性材料または大環状キレート剤などの治療用部分に、コンジュゲートさせることができる（放射性材料の例については、上記を参照すること）。ある特定の実施形態において、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体に結合され得る１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ'，Ｎ"，Ｎ"－四酢酸（ＤＯＴＡ）である。そのようなリンカー分子は、当該技術において一般的に知られており、Ｄｅｎａｒｄｏら、１９９８、ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４：２４８３；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、１９９９、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：５５３；及びＺｉｍｍｅｒｍａｎら、１９９９、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６：９４３に記載されている。

いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖は、精製及び／または試験等を推進するためにタグを含む融合タンパク質として発現される。本明細書において参照されるとき、「タグ」は、Ｃ末端、Ｎ末端または内部のいずれかでタンパク質に提供されてタンパク質の特定または精製に寄与する、任意の付加された一連のアミノ酸である。適切なタグには、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、グルタチオン－ｓ－トランスフェラーゼ、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びマルトース結合タンパク質などの精製及び／又は試験に有用であることが当業者に知られているタグが含まれるが、これらに限定されない。そのようなタグ付タンパク質は、精製の前、間または後のタグの容易な除去のために、トロンビン、エンテロキナーゼまたはＸ因子切断部位などの切断部位を含むように改変することもできる。

いくつかの実施形態において、鎖間ジスルフィド結合を形成する軽鎖（位置２１４、Ｋａｂａｔ番号付け）及び重鎖（位置２３３、Ｋａｂａｔ番号付け）におけるＦａｂドメインの下部のシステイン残基のうちの一つまたは複数を修飾して、セリン、またはアラニン、または非システイン、または別のアミノ酸にすることができる。

追加のアミノ酸修飾を免疫グロブリン重鎖に行って、ヘテロ二量体対の優先的対合のレベル及び／または熱安定性を増加できることが考慮される。例えば、追加のアミノ酸修飾を免疫グロブリン重鎖Ｆｃドメインに行って、ホモ二量体対と比べてヘテロ二量体対に優先的な対合を導くことができる。そのようなアミノ酸修飾は、当該技術に知られており、例えば、米国特許公開第２０１２／０１４９８７６号に記載されているものが含まれる。あるいは、例えば、「ノブ・イントゥ・ホール」、イオン相互作用を有する荷電残基及び鎖交換改変ドメイン（ＳＥＥＤ）技術などの、ホモ二量体対と比べてヘテロ二量体対に優先的な対合を導く代替的戦略を用いることもできる。後者の戦略は、当該技術に記載されており、Ｋｌｅｉｎら、上記において総説されている。Ｆｃドメインについての更なる考察が下記に続く。

Ｆｃドメイン
抗原結合ポリペプチド構築物が完全長免疫グロブリン重鎖を含む実施形態において、構築物はＦｃを含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、少なくとも１または２つのＣＨ３ドメイン配列を含む。いくつかの態様において、抗原結合ポリペプチド構築物が、重鎖のＦａｂ領域のみを含むヘテロ二量体を含む場合、Ｆｃは、一つまたは複数のリンカーを用いて、または用いることなく、第１のヘテロ二量体及び／または第２のヘテロ二量体に結合する。いくつかの態様において、ＦｃはヒトＦｃである。いくつかの態様において、Ｆｃは、ＩｇＧまたはＩｇＧ１Ｆｃである。いくつかの態様において、Ｆｃはヘテロ二量体Ｆｃである。いくつかの態様において、Ｆｃは、少なくとも１または２つのＣＨ２ドメイン配列を含む。

いくつかの態様において、Ｆｃは、Ｃ_Ｈ３ドメイン配列の少なくとも１つに、一つまたは複数の修飾を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、Ｃ_Ｈ２ドメイン配列の少なくとも１つに、一つまたは複数の修飾を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは単一のポリペプチドである。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、複数のポリペプチド、例えば２つのポリペプチドである。

いくつかの態様において、Ｆｃは、Ｃ_Ｈ３配列の少なくとも１つに、一つまたは複数の修飾を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、Ｃ_Ｈ２配列の少なくとも１つに、一つまたは複数の修飾を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは単一のポリペプチドである。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、複数のポリペプチド、例えば２つのポリペプチドである。

いくつかの実施形態において、Ｆｃは、２０１１年１１月４日出願のＰＣＴ／ＣＡ２０１１／００１２３８及び２０１２年１１月２日出願のＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０７８０の特許出願に記載されているＦｃであり、これらそれぞれの全開示は、全ての目的においてその全体が参照として本明細書に組み込まれる。

いくつかの態様において、本明細書に記載されている構築物は、非対称的に修飾された修飾ＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃを含む。ヘテロ二量体Ｆｃは、２つの重鎖定常ドメインポリペプチド：第１の重鎖ポリペプチド及び第２の重鎖ポリペプチドを含むことができ、これらを交換可能に使用することができ、但し、Ｆｃが１つの第１の重鎖ポリペプチド及び１つの第２の重鎖ポリペプチドを含むことが条件である。一般に、第１の重鎖ポリペプチドは、第１のＣＨ３配列を含み、第２の重鎖ポリペプチドは、第２のＣＨ３配列を含む。

非対称的に導入された一つまたは複数のアミノ酸修飾を含む２つのＣＨ３配列は、２つのＣＨ３配列が二量体化するとき、一般にホモ二量体ではなくヘテロ二量体Ｆｃをもたらす。本明細書に使用されるとき、「非対称アミノ酸修飾」は、第１のＣＨ３配列の特定の位置のアミノ酸が同じ位置の第２のＣＨ３配列のアミノ酸とは異なり、第１と第２のＣＨ３配列が優先的に対合して、ホモ二量体ではなくヘテロ二量体を形成する、任意の修飾を指す。このヘテロ二量体化は、それぞれの配列における同じ対応するアミノ酸位置の２個のアミノ酸のうちの一方のみの修飾、または第１及び第２のＣＨ３配列のそれぞれにおける同じ対応する位置のそれぞれの配列の両方のアミノ酸の修飾の結果であり得る。ヘテロ二量体Ｆｃの第１及び第２のＣＨ３配列は、１個または１個を超える非対称アミノ酸修飾を含むことができる。

表Ｘは、完全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１～４４７に対応する、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ配列のアミノ酸配列を提供する。ＣＨ３配列は、完全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸３４１～４４７を含む。

典型的には、Ｆｃは、二量体化することができる２つの連続重鎖配列（Ａ及びＢ）を含むことができる。いくつかの態様において、Ｆｃの一方または両方の配列は、ＥＵ番号付けを使用して、以下の位置：Ｌ３５１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｔ３６６、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｔ３５０、Ｓ４００及び／またはＮ３９０に一つまたは複数の突然変異または修飾を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、表Ｘに示されている突然変異配列を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、変種１Ａ－Ｂの突然変異を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、変種２Ａ－Ｂの突然変異を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、変種３Ａ－Ｂの突然変異を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、変種４Ａ－Ｂの突然変異を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、変種５Ａ－Ｂの突然変異を含む。

（表Ｘ）

第１及び第２のＣＨ３配列は、完全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１～４４７を参照して、本明細書に記載されているアミノ酸突然変異を含むことができる。１つの実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、第１のＣＨ３配列が位置Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を有し、第２のＣＨ３配列が位置Ｔ３９４にアミノ酸修飾を有する、修飾ＣＨ３ドメインを含む。１つの実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、第１のＣＨ３配列がＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖから選択される一つまたは複数のアミノ酸修飾を有し、第２のＣＨ３配列がＴ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ及びＴ３９４Ｗから選択される一つまたは複数のアミノ酸修飾を有する、修飾ＣＨ３ドメインを含む。

１つの実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、第１のＣＨ３配列が位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を有し、第２のＣＨ３配列が位置Ｔ３６６、Ｋ３９２及びＴ３９４にアミノ酸修飾を有し、第１または第２のＣＨ３配列の一方が、位置Ｑ３４７にアミノ酸修飾を更に含み、他方のＣＨ３配列が、位置Ｋ３６０にアミノ酸修飾を更に含む、修飾ＣＨ３ドメインを含む。別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、第１のＣＨ３配列が位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を有し、第２のＣＨ３配列が位置Ｔ３６６、Ｋ３９２及びＴ３９４にアミノ酸修飾を有し、第１または第２のＣＨ３配列の一方が、位置Ｑ３４７にアミノ酸修飾を更に含み、他方のＣＨ３配列が、位置Ｋ３６０にアミノ酸修飾を更に含み、前記ＣＨ３配列の一方または両方が、アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖを更に含む、修飾ＣＨ３ドメインを含む。

１つの実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、第１のＣＨ３配列が位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を有し、第２のＣＨ３配列が位置Ｔ３６６、Ｋ３９２及びＴ３９４にアミノ酸修飾を有し、第１または第２のＣＨ３配列の一方が、Ｄ３９９ＲまたはＤ３９９Ｋのアミノ酸修飾を更に含み、他方のＣＨ３配列が、Ｔ４１１Ｅ、Ｔ４１１Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｅ及びＫ３９２Ｄのうち一つまたは複数を含む、修飾ＣＨ３ドメインを含む。別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、第１のＣＨ３配列が位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を有し、第２のＣＨ３配列が位置Ｔ３６６、Ｋ３９２及びＴ３９４にアミノ酸修飾を有し、第１または第２のＣＨ３配列の一方が、Ｄ３９９ＲまたはＤ３９９Ｋのアミノ酸修飾を更に含み、他方のＣＨ３配列が、Ｔ４１１Ｅ、Ｔ４１１Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｅ及びＫ３９２Ｄのうち一つまたは複数を含み、前記ＣＨ３配列の一方または両方が、アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖを更に含む、修飾ＣＨ３ドメインを含む。

１つの実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、第１のＣＨ３配列が位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を有し、第２のＣＨ３配列が位置Ｔ３６６、Ｋ３９２及びＴ３９４にアミノ酸修飾を有し、前記ＣＨ３配列の一方または両方がＴ３５０Ｖのアミノ酸修飾を更に含む、修飾ＣＨ３ドメインを含む。

１つの実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、以下のアミノ酸修飾を含む修飾ＣＨ３ドメインを含み、ここで、「Ａ」は、第１のＣＨ３配列へのアミノ酸修飾を含み、「Ｂ」は、第２のＣＨ３配列へのアミノ酸修飾を含む。Ａ：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ及び／またはＢ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ。

一つまたは複数の非対称アミノ酸修飾は、ヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが野生型ホモ二量体ＣＨ３ドメインに匹敵する安定性を有する、ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進することができる。ある実施形態において、一つまたは複数の非対称アミノ酸修飾は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインが野生型ホモ二量体Ｆｃドメインに匹敵する安定性を有する、ヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成を促進する。ある実施形態において、一つまたは複数の非対称アミノ酸修飾は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインが、示差走査熱量測定研究において融解温度（Ｔｍ）により観察して安定性を有し、融解温度が、対応する対称野生型ホモ二量体Ｆｃドメインにおいて観察された融解温度の４℃以内である、ヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成を促進する。いくつかの態様において、Ｆｃは、野生型ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を有するヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する、Ｃ_Ｈ３配列の少なくとも１つに一つまたは複数の修飾を含む。

１つの実施形態において、ＣＨ３ドメインの安定性は、例えば示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によりＣＨ３ドメインの融解温度を測定することによって、評価することができる。したがって、更なる実施形態において、ＣＨ３ドメインは約６８℃以上の融解温度を有する。別の実施形態において、ＣＨ３ドメインは、約７０℃以上の融解温度を有する。別の実施形態において、ＣＨ３ドメインは、約７２℃以上の融解温度を有する。別の実施形態において、ＣＨ３ドメインは、約７３℃以上の融解温度を有する。別の実施形態において、ＣＨ３ドメインは、約７５℃以上の融解温度を有する。別の実施形態において、ＣＨ３ドメインは、約７８℃以上の融解温度を有する。いくつかの態様において、二量体化Ｃ_Ｈ３配列は、約６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７７．５、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４もしくは８５℃、またはそれより高い融解温度（Ｔｍ）を有する。

いくつかの実施形態において、修飾ＣＨ３配列を含むヘテロ二量体Ｆｃは、発現産物におけるホモ二量体Ｆｃと比較して、少なくとも約７５％の純度で形成され得る。別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、約８０％を超える純度で形成される。別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、約８５％を超える純度で形成される。別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、約９０％を超える純度で形成される。別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、約９５％を超える純度で形成される。別の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、約９７％を超える純度で形成される。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、発現するとき、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％を超える純度で形成されるヘテロ二量体である。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、単一細胞を介して発現するとき、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％を超える純度で形成されるヘテロ二量体である。

モノマーＦｃポリペプチドを修飾して、ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する追加の方法は、国際特許公開第ＷＯ９６／０２７０１１号（ノブ・イントゥ・ホール）、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら（ＧｕｎａｓｅｋａｒａｎＫ．ら（２０１０）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２８５，１９６３７－４６，ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｄｅｓｉｇｎｔｏａｃｈｉｅｖｅｓｅｌｅｃｔｉｖｅｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、Ｄａｖｉｓら（Ｄａｖｉｓ，ＪＨ．ら（２０１０）ＰｒｏｔＥｎｇＤｅｓＳｅｌ；２３（４）：１９５－２０２，ｓｔｒａｎｄｅｘｃｈａｎｇｅｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｄｏｍａｉｎ（ＳＥＥＤ）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＬａｂｒｉｊｎら［ＥｆｆｉｃｉｅｎｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｓｔａｂｌｅｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃＩｇＧ１ｂｙｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄＦａｂ－ａｒｍｅｘｃｈａｎｇｅ．ＬａｂｒｉｊｎＡＦ，ＭｅｅｓｔｅｒｓＪＩ，ｄｅＧｏｅｉｊＢＥ，ｖａｎｄｅｎＢｒｅｍｅｒＥＴ，ＮｅｉｊｓｓｅｎＪ，ｖａｎＫａｍｐｅｎＭＤ，ＳｔｒｕｍａｎｅＫ，ＶｅｒｐｌｏｅｇｅｎＳ，ＫｕｎｄｕＡ，ＧｒａｍｅｒＭＪ，ｖａｎＢｅｒｋｅｌＰＨ，ｖａｎｄｅＷｉｎｋｅｌＪＧ，ＳｃｈｕｕｒｍａｎＪ，ＰａｒｒｅｎＰＷ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０１３Ｍａｒ２６；１１０（１３）：５１４５－５０に記載されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている単離された構築物は、抗原に結合する抗原結合構築物、ならびに同じＦｃポリペプチドを含まない抗原結合構築物と比べて、安定性及び製造の容易さのような優れた生物物理的特徴を有する二量体Ｆｃポリペプチド構築物を含む。Ｆｃの重鎖配列における多数の突然変異は、異なるＦｃガンマ受容体への抗体Ｆｃの親和性を選択的に変更することが、当該技術において知られている。いくつかの態様において、Ｆｃは、Ｆｃガンマ受容体の選択的結合を促進する一つまたは複数の修飾を含む。

ＣＨ２ドメインは、表Ｘに示されている配列のアミノ酸２３１～３４０である。例示的な突然変異が下記に列挙されている。

Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ，Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ／Ｋ３２６Ａ（ＬｕＹ，ＶｅｒｎｅｓＪＭ，ＣｈｉａｎｇＮ，らＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ．２０１１Ｆｅｂ２８；３６５（１－２）：１３２－４１）；Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ，Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｌ２３５Ｖ／Ｐ３９６Ｌ（ＳｔａｖｅｎｈａｇｅｎＪＢ，ＧｏｒｌａｔｏｖＳ，ＴｕａｉｌｌｏｎＮ，らＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００７Ｓｅｐ１５；６７（１８）：８８８２－９０；ＮｏｒｄｓｔｒｏｍＪＬ，ＧｏｒｌａｔｏｖＳ，ＺｈａｎｇＷ，らＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２０１１Ｎｏｖ３０；１３（６）：Ｒ１２３）；Ｆ２４３Ｌ（ＳｔｅｗａｒｔＲ，ＴｈｏｍＧ，ＬｅｖｅｎｓＭ，らＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ．２０１１Ｓｅｐ；２４（９）：６７１－８．），Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（ＳｈｉｅｌｄｓＲＬ，ＮａｍｅｎｕｋＡＫ，ＨｏｎｇＫ，らＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００１Ｍａｒ２；２７６（９）：６５９１－６０４）；Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ，Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（ＬａｚａｒＧＡ，ＤａｎｇＷ，ＫａｒｋｉＳ，らＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２００６Ｍａｒ１４；１０３（１１）：４００５－１０）；Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｅ，Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（ＣｈｕＳＹ，ＶｏｓｔｉａｒＩ，ＫａｒｋｉＳ，らＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．２００８Ｓｅｐ；４５（１５）：３９２６－３３）；Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｓ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ，Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３２６Ａ／Ａ３２７Ｈ，Ｇ２３７Ｆ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ，Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ，Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ，Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２７０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ，Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｄ，Ｌ２３４Ｆ／Ｓ２６７Ｅ／Ｎ３２５Ｌ，Ｇ２３７Ｆ／Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７Ｄ、ならびに参照として本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／１２０１３４及びＷＯ２０１１／１２０１３５に列挙されている他の突然変異。ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＡｎｔｉｂｏｄｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＷｉｌｌｉａｍＲ．ＳｔｒｏｈｌａｎｄＬｉｌａＭ．Ｓｔｒｏｈｌ，ＷｏｏｄｈｅａｄＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇｓｅｒｉｅｓｉｎＢｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅＮｏ１１，ＩＳＢＮ１９０７５６８３７９，Ｏｃｔ２０１２）は、２８３頁に突然変異を列挙している。

いくつかの実施形態において、ＣＨ２ドメインは、一つまたは複数の非対称アミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＣＨ２ドメインは、ＦｃγＲの選択的結合を促進する一つまたは複数の非対称アミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＣＨ２ドメインは、本明細書に記載されている単離された構築物の分離及び精製を可能にする。

ＦｃＲｎ結合及びＰＫパラメーター
当該技術において知られているように、ＦｃＲｎへの結合は、エンドサイトーシスされた抗体をエンドソームから血流に再循環する（Ｒａｇｈａｖａｎら，１９９６，ＡｎｎｕＲｅｖＣｅｌｌＤｅｖＢｉｏｌ１２：１８１－２２０；Ｇｈｅｔｉｅら，２０００，ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ１８：７３９－７６６）。このプロセスは、完全長分子の大きなサイズに起因する腎臓濾過の妨害と合わせて、１～３週間の範囲にわたる好ましい抗体血清半減期をもたらす。ＦｃＲｎへのＦｃの結合は、また、抗体輸送において主要な役割を果たす。したがって、１つの実施形態において、本発明の構築物はＦｃＲｎに結合することができる。

エフェクター機能を改善するための追加の修飾
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている構築物を修飾して、エフェクター機能を改善することができる。そのような修飾は当該技術において知られており、非フコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、または活性化受容体へ向けた、主にＡＤＣＣのためにＦＣＧＲ３ａに向けた及びＣＤＣのためにＣ１ｑに向けた、抗体のＦｃ部分の親和性の遺伝子工学的な操作が含まれる。以下の表Ｙは、エフェクター機能操作について文献に報告されている様々な設計をまとめる。

（表Ｙ）

したがって、１つの実施形態において、本明細書に記載されている構築物は、改善されたエフェクター機能を付与する、上記表に示された一つまたは複数のアミノ酸修飾を含む二量体Ｆｃを含むことができる。別の実施形態において、構築物を非フコシル化して、エフェクター機能を改善することができる。

リンカー
本明細書に記載されている構築物は、本明細書に記載されているＦｃに機能的に結合した、本明細書に記載されている一つまたは複数のヘテロ二量体を含むことができる。いくつかの態様において、Ｆｃは、一つまたは複数のリンカーを用いて、また用いることなく一つまたは複数のヘテロ二量体に結合する。いくつかの態様において、Ｆｃは、一つまたは複数のヘテロ二量体に直接的に結合する。いくつかの態様において、Ｆｃは、一つまたは複数のリンカーにより一つまたは複数のヘテロ二量体に結合する。いくつかの態様において、Ｆｃは、リンカーによりそれぞれのヘテロ二量体の重鎖に結合する。

いくつかの態様において、一つまたは複数のリンカーは、一つまたは複数のポリペプチドリンカーである。いくつかの態様において、一つまたは複数のリンカーは、一つまたは複数の抗体ヒンジ領域を含む。いくつかの態様において、一つまたは複数のリンカーは、一つまたは複数のＩｇＧ１ヒンジ領域を含む。

二量体対の調製方法
上記に記載されたように、本明細書に記載されているヘテロ二量体対は、第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体を含むことができ、それぞれのヘテロ二量体は、少なくともＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む免疫グロブリン重鎖またはそのフラグメント、ならびにＶＬドメイン及びＣＬドメインを有する免疫グロブリン軽鎖を含む。ヘテロ二量体の免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖は、当該技術に既知の組換えＤＮＡ技術を使用して容易に調製することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、第３版、２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、第２版、１９８９）；ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ、第４版、１９９９）；ならびにＧｌｉｃｋ及びＰａｓｔｅｒｎａｋ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ（ＡＳＭＰｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、第２版、１９９８）に記載されているものなどの標準的な技術を、組換え核酸法、核酸合成、細胞培養、導入遺伝子組み込み及び組換えタンパク質発現に使用することができる。あるいは、本明細書に記載されているヘテロ二量体及びヘテロ二量体対を、化学的に合成することができる。

ヘテロ二量体が誘導される抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の核酸及びアミノ酸配列は、当該技術において知られている、または核酸及び／もしくはタンパク質配列決定法の使用により容易に決定することができる。本明細書に記載されているタグを免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖に遺伝子融合する方法は、当該技術において知られており、いくつかは下記及び実施例に記載されている。

例えば、宿主に免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を発現及び同時発現する方法は、当該技術において良く知られている。加えて、組換えＤＮＡ技術を使用して重鎖及び／または軽鎖をタグ付けする方法も、当該技術において良く知られている。重鎖及び軽鎖の発現に適した発現ベクター及び宿主も、当該技術において良く知られており、下記に記載される。

４つ全ての鎖を発現する単一クローンまたは一過性細胞系のみの使用に依存しない二重特異性抗体産生方法は、当該技術において知られている（Ｇｒａｍｅｒ，ｅｔａｌ．（２０１３）ｍＡｂｓ５，９６２；Ｓｔｒｏｐら（２０１２）ＪＭｏｌＢｉｏｌ４２０，２０４）。これらの方法は、二重特異性抗体の形成に関与する２対の軽鎖及び重鎖のレドックス条件下の産生後アーム交換に依存している（レドックス産生）。この手法において、Ｈ１：Ｌ１及びＨ２：Ｌ２対を、２つの異なる細胞系において発現させて、２つのＦａｂアームを独立して産生させることができる。続いて、２つのＦａｂアームを選択的レドックス条件下で混合して、２つの特有の重鎖Ｈ１及びＨ２の再会合を達成して、Ｌ１：Ｈ１：Ｈ２：Ｌ２鎖を含む二重得特異性抗体を形成する。レドックス産生方法またはその方法の変更型を使用した二重抗体の産生において、本明細書に記載されている設計のライブラリー／データセットを使用することが考察され得る。

ある特定の実施形態において、無細胞タンパク質発現系を利用して、生細胞を使用することなく、ポリペプチド（例えば、ポリペプチドの重鎖及び軽鎖）を同時発現する。そうではなく、ＤＮＡをＲＮＡに転写するために及びＲＮＡをタンパク質（例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、酵素、補助因子、アミノ酸）に転写するために必要な全ての構成要素は、インビトロで使用される溶液において提供される。ある特定の実施形態において、インビトロ発現は、（１）重鎖及び軽鎖ポリペプチドをコードする遺伝子テンプレート（ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）、ならびに（２）必要な転写及び翻訳分子機構を含有する反応溶液を必要とする。ある特定の実施形態において、細胞抽出物は、反応溶液の構成要素を、例えば、ｍＲＮＡ転写のためにＲＮＡポリメラーゼ、ポリペプチド翻訳のためにリボソーム、ｔＲＮＡ、アミノ酸、酵素補助因子、エネルギー源及び正確なタンパク質折りたたみのために必須の細胞構成要素を実質的に供給する。無細胞タンパク質発現系は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞またはこれらの組み合わせから得られる溶解産物を使用して、調製することができる。そのような細胞溶解産物は、翻訳に必要な酵素及び構成要素の正確な組成及び割合を提供することができる。いくつかの実施形態において、細胞膜を除去して、細胞の細胞質及び小器官構成要素のみを残す。

いくつかの無細胞タンパク質発現系が、Ｃａｒｌｓｏｎら（２０１２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．３０：１１８５－１１９４において総説されているように、当該技術において知られている。例えば、無細胞タンパク質発現系は、原核細胞または真核細胞に基づいたものが利用可能である。無原核細胞発現系の例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のものが含まれる。無真核細胞発現系の例には、例えば、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽及び昆虫細胞の抽出物に基づいたものが利用可能である。そのような無原核細胞または真核細胞タンパク質発現系は、Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｑｉａｇｅｎ及びＮｏｖａｇｅｎなどの会社から市販されている。当業者は、互いに対合することができるポリペプチド（例えば、重鎖及び軽鎖ポリペプチド）を産生するのに適した無細胞タンパク質発現系を容易に選択することができる。更に、無細胞タンパク質発現系に、シャペロン（例えば、ＢｉＰ）及びイソメラーゼ（例えば、ジスルフィドイソメラーゼ）を補充して、ＩｇＧの折りたたみの効率を改善することもできる。

いくつかの実施形態において、無細胞発現系を利用して、ＤＮＡテンプレート（転写及び翻訳）またはｍＲＮＡテンプレート（翻訳のみ）から、重鎖及び軽鎖ポリペプチドを同時発現させる。

ベクター及び宿主細胞
重鎖及び軽鎖の組換え発現は、重鎖または軽鎖（例えば、抗体または融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドが得られると、重鎖または軽鎖を産生するためのベクターは、当該技術に周知の技術を使用して組換えＤＮＡ技術により産生することができる。したがって、ヌクレオチド配列をコードする重鎖または軽鎖を含有するポリヌクレオチドを発現してタンパク質を調製する方法が、本明細書において記載される。当業者に周知の方法を使用して、重鎖または軽鎖コード配列、ならびに適切な転写及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ遺伝子組換えが含まれる。したがって本発明は、プロモーターに機能的に連結した、重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能ベクターを提供する。

発現ベクターを従来の技術により宿主細胞に移し、次に形質移入された細胞を従来の技術により培養して、本発明の方法に使用される修飾重鎖または軽鎖を産生する。特定の実施形態において、本方法に使用される重鎖及び軽鎖は、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞において同時発現され、下記に詳述される。

様々な宿主発現ベクター系を利用して、修飾重鎖及び軽鎖を発現させることができる。そのような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、続いて精製され得るビヒクルを表し、また、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換または形質移入されると、修飾重鎖及び軽鎖をその場で発現するができる細胞も表す。これらには、修飾重鎖及び軽鎖コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌（例えば大腸菌及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｔｉｌｉｓ））などの微生物；修飾重鎖及び軽鎖コード配列を含有する組換え酵母用発現ベクターにより形質転換された酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ））；修飾重鎖及び軽鎖コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させた、もしくは修飾重鎖及び軽鎖コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）により形質転換された、植物細胞系；または哺乳類細胞のゲノムから誘導されたプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳類ウイルスから誘導されたプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を持つ哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ－２９３、ＮＳＯ及び３Ｔ３細胞）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）などの細菌細胞または真核細胞が、組換え抗体または融合タンパク質分子である修飾重鎖及び軽鎖の発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳類細胞は、ヒトサイトメガロウイルスの主要な中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと一緒になって、抗体の有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら，１９８６，Ｇｅｎｅ４５：１０１；ａｎｄＣｏｃｋｅｔｔら，１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：２）。特定の実施形態において、それぞれのヘテロ二量体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導プロモーターまたは組織特異的プロモーターにより調節される。

哺乳類宿主細胞では、ウイルスに基づいた多数の発現系を利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的の修飾重鎖及び軽鎖コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーター及び三分子リーダー配列に連結することができる。次にこのキメラ遺伝子を、インビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入は、感染宿主における修飾重鎖及び軽鎖の発現が実用的であり可能である組換えウイルスをもたらす（Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３５５－３５９を参照すること）。特定の開始シグナルも、挿入抗体コード配列の効率的な翻訳のため必要であり得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列が含まれる。更に、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするため、所望のコード配列のリーディングフレームとずれずにいなければならない。これらの外来性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然でもあり合成でもある様々な由来のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を含めることによって増強され得る（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒら、１９８７、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６－５４４を参照すること）。

ヘテロ二量体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の発現は、当該技術に既知の任意のプロモーターまたはエンハンサーエレメントにより制御され得る。修飾重鎖及び軽鎖（例えば、抗体または融合タンパク質）をコードする遺伝子の発現の制御に使用され得るプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ及びＣｈａｍｂｏｎ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ２９０：３０４－３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３'の長い末端反復に含有されたプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ２２：７８７－７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８．１４４１－１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ２９６：３９－４２）、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５５４７－５５５１）；β－ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７－３７３１）またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１－２５；"Ｕｓｅｆｕｌｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂａｃｔｅｒｉａ"ｉｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ、１９８０、２４２：７４－９４も参照すること）などの原核生物発現ベクター；ノパリンシンセターゼプロモーター領域（Ｈｅｒｒｅｒａ－Ｅｓｔｒｅｌｌａら、Ｎａｔｕｒｅ３０３：２０９－２１３）またはカリフラワーモザイクウイルス３５ＳＲＮＡプロモーター（Ｇａｒｄｎｅｒら、１９８１、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．９：２８７１）及び光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Ｈｅｒｒｅｒａ－Ｅｓｔｒｅｌｌａら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ３１０：１１５－１２０）を含む植物発現ベクター；Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターなどの酵母または他の真菌のプロモーターエレメント、ならびに組織特異性を示し、遺伝子導入動物に利用されている以下の動物用転写制御領域：膵腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４、Ｃｅｌｌ３８：６３９－６４６；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９－４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ７：４２５－５１５）、膵ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ３１５：１１５－１２２）、リンパ細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４、Ｃｅｌｌ３８：６４７－６５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ３１８：５３３－５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６－１４４４）、卵巣、乳房、リンパ及びマスト細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６、Ｃｅｌｌ４５：４８５－４９５）、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌ．１：２６８－２７６）、肝臓において活性なアルファ－フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９－１６４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５：５３－５８）、肝臓において活性なアルファ１－アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７、ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌ．１：１６１－１７１）、骨髄細胞において活性なベータ－グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ３１５：３３８－３４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６、Ｃｅｌｌ４６：８９－９４）、脳のオリゴデンドロサイト細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７、Ｃｅｌｌ４８：７０３－７１２）、骨格筋において活性なミオシン軽鎖－２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ３１４：２８３－２８６）、神経細胞において活性な神経細胞特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）（Ｍｏｒｅｌｌｉら、１９９９、Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５７１－８３）、神経細胞において活性な脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）遺伝子制御領域（Ｔａｂｕｃｈｉら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２５３：８１８－８２３）、星状膠細胞において活性なグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター（Ｇｏｍｅｓら、１９９９、ＢｒａｚＪＭｅｄＢｉｏｌＲｅｓ３２（５）：６１９－６３１；Ｍｏｒｅｌｌｉら、１９９９、Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５７１－８３）及び視床下部において活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３４：１３７２－１３７８）が含まれるが、これらに限定されない。

加えて、挿入された配列の発現を調節する、または遺伝子産物を特定の望ましい方法で修飾及び処理する宿主細胞株を、選択することができる。特定のプロモーターによる発現を特定のインデューサーの存在下で上昇させることができ、これによって、遺伝子改変された融合タンパク質の発現を制御することができる。更に、異なる宿主細胞は、翻訳及び翻訳後の処理及び修飾（例えば、タンパク質のグリコシル化、リン酸化）において特徴的で特定の機構を有する。適切な細胞系または宿主系を選択して、発現された外来性タンパク質の望ましい修飾及び処理を確実にする。例えば、細菌系における発現は、非グリコシル化産物を産生し、酵母における発現は、グリコシル化産物を産生する。遺伝子産物の一次転写物を正確に処理する細胞機構（例えば、グリコシル化及びリン酸化）を有する真核宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳類宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ－２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＮＳＯ、特に、例えば、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ、ＳＫ－Ｎ－ＦＩ、ＳＫ－Ｎ－ＤＺヒト神経芽細胞腫（Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、１９８４、Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．７３：５１－５７）、ＳＫ－Ｎ－ＳＨヒト神経芽細胞腫（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９８２、７０４：４５０－４６０）、Ｄａｏｙヒト小脳髄芽細胞腫（Ｈｅら、１９９２、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５２：１１４４－１１４８）、ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧグリア芽細胞腫細胞（Ｋｒｕｓｅら、１９９２、ＩｎＶｉｔｒｏＣｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２８Ａ：６０９－６１４）、ＩＭＲ－３２ヒト神経芽細胞腫（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、１９７０、３０：２１１０－２１１８）、１３２１Ｎ１ヒト星状細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９７７、７４：４８１６）、ＭＯＧ－Ｇ－ＣＣＭヒト星状細胞腫（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９８４、４９：２６９）、Ｕ８７ＭＧヒトグリア芽細胞腫－星状細胞腫（ＡｃｔａＰａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．、１９６８、７４：４６５－４８６）、Ａ１７２ヒトグリア芽細胞腫（Ｏｌｏｐａｄｅら、１９９２、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５２：２５２３－２５２９）、Ｃ６ラット神経膠腫細胞（Ｂｅｎｄａら、１９６８、Ｓｃｉｅｎｃｅ１６１：３７０－３７１）、Ｎｅｕｒｏ－２ａマウス神経芽細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９７０、６５：１２９－１３６）、ＮＢ４１Ａ３マウス神経芽細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９６２、４８：１１８４－１１９０）、ＳＣＰヒツジ脈絡叢（Ｂｏｌｉｎら、１９９４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４８：２１１－２２１）、Ｇ３５５－５、ＰＧ－４ネコ正常星状膠細胞（Ｈａａｐａｌａら、１９８５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３：８２７－８３３）、Ｍｐｆフェレット脳（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅら、１９８２、ＩｎＶｉｔｒｏ１８：９５２－９６０）などの神経細胞系、ならびに、例えばＣＲＬ７０３０及びＨｓ５７８Ｂｓｔなどの、例えばＣＴＸＴＮＡ２ラット正常大脳皮質（Ｒａｄａｎｙら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：６４６７－６４７１）などの正常な細胞系が含まれるが、これらに限定されない。更に、異なるベクター／宿主発現系は、異なる程度で処理反応に影響を与えることができる。

組換えタンパク質の長期間で高収率の産生のため、安定した発現が多くの場合に好ましい。例えば、本発明の修飾重鎖及び軽鎖（例えば、抗体または融合タンパク質）を安定して発現する細胞系を、遺伝子工学的に操作することができる。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するかわりに、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）により制御されたＤＮＡ及び選択的マーカーを用いて形質転換することができる。外来性ＤＮＡを導入した後、改変細胞を富栄養培地において１～２日間増殖させ、次に、選択的培地に交換した。組換えプラスミドにおける選択的マーカーは選択に対する抵抗性を付与し、細胞が、プラスミドを染色体に安定して組み込み、増殖させて増殖巣を形成することを可能にし、次に細胞株へとクローン化させ増殖させることができる。

多数の選択系を使用することができ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７７、Ｃｅｌｌ１１：２２３）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、１９６２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４８：２０２６）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、１９８０、Ｃｅｌｌ２２：８１７）遺伝子を、ｔｋ－、ｈｇｐｒｔ－またはａｐｒｔ－細胞にそれぞれ用いることができることが含まれるが、これらに限定されない。また、ｄｈｆｒ遺伝子の選択基準としてメトトレキセートに対して抵抗性を付与する（Ｗｉｇｌｅｒら、１９８０、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：３５６７；Ｏ'Ｈａｒｅら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：１５２７）、ｇｐｔ遺伝子の選択基準としてミコフェノール酸に対する抵抗性を付与する（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：２０７２）、ｎｅｏ遺伝子の選択基準としてアミノグリコシドＧ－４１８に対する抵抗性を付与する（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎら、１９８１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１）及びｈｙｇｒｏ遺伝子の選択基準としてハイグロマイシンに対する抵抗性を付与する（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、１９８４、Ｇｅｎｅ３０：１４７）、抗代謝抵抗性を使用することができる。

重鎖及び軽鎖の同時発現
本明細書に記載されているヘテロ二量体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を、上記に示されたように、哺乳類細胞において同時発現させることができる。１つの実施形態において、１つの重鎖は、上記に記載されたＬＣＣＡ設計セットの２つの異なる軽鎖と同時発現し、重鎖は、２つの軽鎖の一方と優先的に対合する。別の実施形態において、２つの特有の重鎖は、２つの特有の軽鎖と同時発現し、重鎖はそれぞれ軽鎖の一方と優先的に対合する。

ヘテロ二量体対の試験
上記に記載されたように、本明細書に記載されているヘテロ二量体対のうち少なくとも一方のヘテロ二量体は、ヘテロ二量体対の２つの特有の重鎖及び２つの特有の軽鎖が哺乳類細胞において同時発現するとき、第１のヘテロ二量体の重鎖が一方の軽鎖と優先的に対合するが他方とは対合しないように、一つまたは複数のアミノ酸修飾を免疫グロブリン重鎖及び／または免疫グロブリン軽鎖に含むことができる。同様に、第２のヘテロ二量体の重鎖は、第１ではなく第２の軽鎖と優先的に対合する。優先的対合の程度は、例えば、下記に記載されている方法を使用して評価することができる。ヘテロ二量体対のそれぞれのヘテロ二量体の対応する抗原への親和性を、下記に記載されているように試験することができる。ヘテロ二量体対のそれぞれのヘテロ二量体の熱安定性も、下記に記載されているように試験することができる。

優先的対合の測定方法
ＬＣＣＡ
１つの実施形態において、免疫グロブリン重鎖と軽鎖の優先的対合は、軽鎖競合アッセイ（ＬＣＣＡ）を実施することによって決定される。２０１３年１０月３日出願の共有特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６３３０６は、ＬＣＣＡの様々な実施形態を記載しており、その全体が全ての目的において参照として本明細書に組み込まれる。方法は、同時発現タンパク質の混合物内の重鎖と特定の軽鎖との対合の定量分析を可能にし、重鎖及び軽鎖が同時発現するとき、１つの特定の免疫グロブリン重鎖が２つの免疫グロブリン軽鎖のいずれか一方と選択的に会合するかの決定に、使用することができる。方法を以下に簡潔に記載する。少なくとも１つの重鎖及び２つの異なる軽鎖を、重鎖が限定された対合反応対であるような比率で細胞に同時発現させ、場合により分泌タンパク質を細胞から分離し、重鎖に結合した免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを分泌タンパク質の残りから分離して、単離された重鎖対合画分を産生し、それぞれの異なる軽鎖の量を単離された重鎖画分において検出し、単離された重鎖画分におけるそれぞれの異なる軽鎖の相対量を分析して、少なくとも１つの重鎖が一方の軽鎖と選択的に対合する能力を決定する。

方法は、妥当な処理量を提供し、堅牢であり（すなわち、使用者または流速などの、実施における僅かな変化に対して感度が低い）、正確である。方法は、タンパク質配列における小さな変動の効果を測定することができる高感度アッセイを提供する。大きな面積にわたる不規則なタンパク質－タンパク質、ドメイン－ドメイン、鎖－鎖の相互作用は、通常、選択性を導入するために複数の突然変異（取り替え）を必要とする。タンパク質産物を単離及び精製する必要はなく、このことはより効率的な選別を可能にする。この方法の実施形態に関する更なる詳細は、実施例に記載されている。

優先的対合を決定する代替的な方法
優先的対合を検出する代替的方法は、分子量の差を使用してそれぞれ別個の種を特定し、それぞれ軽鎖を含む相対的なヘテロ二量体個体群を定量化するため、ＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー・質量分析）を使用することを含む。抗原活性アッセイを使用して、それぞれ軽鎖を含有する相対的なヘテロ二量体個体群を定量化することもでき、測定される結合の程度（対照と比べた）を使用して、それぞれ対応するヘテロ二量体個体群を推定する。

ＳＭＣＡなどの追加の方法が、実施例、図及び表に記載されている。

熱安定性
ヘテロ二量体の熱安定性は、当該技術に既知の方法に従って決定することができる。それぞれのヘテロ二量体の融解温度は、熱安定性を示す。ヘテロ二量体の融点は、示差走査熱量測定などの技術を使用して決定することができる（Ｃｈｅｎら（２００３）ＰｈａｒｍＲｅｓ２０：１９５２－６０；Ｇｈｉｒｌａｎｄｏら（１９９９）ＩｍｍｕｎｏｌＬｅｔｔ６８：４７－５２）。あるいは、ヘテロ二量体の熱安定性は、円二色性を使用して測定することができる（Ｍｕｒｒａｙら（２００２）Ｊ．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＳｃｉ４０：３４３－９）。

抗原への親和性
ヘテロ二量体の対応する抗原への結合親和性及び相互作用のオフ速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）は、当該技術に周知の方法に従って競合結合アッセイにより決定することができる。競合結合アッセイの１つの例は、標識抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と、目的の分子（例えば、本発明のヘテロ二量体）とを、増量の非標識抗原の存在下でインキュベートすること及び標識リガンドに結合した分子を検出すること、を含むラジオイムノアッセイである。本発明のヘテロ二量体の抗原への親和性及び結合オフ速度は、スキャッチャード分析による飽和データから決定することができる。

本明細書に記載されているヘテロ二量体の動力学パラメーターは、当該技術に既知の表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）に基づいたアッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ動力学分析）を使用して決定することもできる。ＳＰＲに基づいた技術の総説には、Ｍｕｌｌｅｔら、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ２２：７７－９１；Ｄｏｎｇら、２００２、ＲｅｖｉｅｗｉｎＭｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，８２：３０３－２３；Ｆｉｖａｓｈら、１９９８、ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：９７－１０１；Ｒｉｃｈら、２０００、ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：５４－６１を参照すること。加えて、米国特許第６，３７３，５７７号、同第６，２８９，２８６号、同第５，３２２，７９８号、同第５，３４１，２１５号、同第６，２６８，１２５号に記載されているタンパク質－タンパク質相互作用を測定するＳＰＲ機器及びＳＰＲに基づいた方法のいずれもが、本発明の方法に考慮される。ＦＡＣＳを親和性の測定に使用することもでき、当該技術において知られている。

二重特異性抗体突然変異設計セットのライブラリーを使用して、二重特異性抗体の所定のＭａｂ１及びＭａｂ２を生成する
１つの実施形態において、抗原結合フラグメントＦａｂ１及びＦａｂ２をそれぞれ含む２つの基本となる抗体Ｍａｂ１及びＭａｂ２から出発して、二重特異性抗体を選択的に形成することを目的にした二重特異性抗体突然変異設計セットが、本明細書に記載される。設計セットは、Ｆａｂ１、Ｆａｂ２及びＦｃにそれぞれ対応する同族突然変異からなる。１つの実施形態において、設計セットライブラリーは、表５、表１２または表１５～１７のいずれかに含まれる設計セットにより表される。突然変異は、Ｆａｂ１の軽鎖及び重鎖の界面に導入されて、Ｆａｂ２の競合する軽鎖及び重鎖の存在下で、２つの絶対的な鎖の選択的対合を達成する。選択的対合は、好ましい相補的突然変異を、界面の特定のホットスポットフレームワーク残基間の立体的、疎水的または静電的相補性に基づいて２つの絶対的な軽鎖及び重鎖に導入し、一方、これらの突然変異残基を、非絶対的な鎖対への好ましくない界面相互作用に関与させることによって、達成される。それぞれの設計セットにおいて、選択的対合突然変異を、Ｆａｂ２の軽鎖及び重鎖の界面に導入して、Ｆａｂ１の競合する軽鎖及び重鎖の存在下で、２つの絶対的な鎖の選択的対合を達成することもできる。突然変異は、Ｆａｂ１の軽鎖とＦａｂ２の重鎖との誤対合及びその逆の誤対合も低減することを目的とする。突然変異は、重鎖の選択的対合を達成して、２つの異なる重鎖を含む非対称抗体分子を形成するために、Ｆｃ界面に導入される。抗体の軽鎖及び重鎖の特定の界面残基位置の遺伝子工学的な操作は、多くの場合に、その抗体の抗原結合親和性、安定性、可溶性、凝集特性等の喪失などの有害な作用をもたらし得る。ｋｏｎ及びｋｏｆｆ速度、融解温度（Ｔｍ）、酸、塩基、酸化、凍結／解凍、撹拌、圧力等のようなストレス条件に対する安定性などの、多数の関連する特性が影響を受け得る。これは、多くの場合、目的の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）によって影響を受ける。異なる抗体のＣＤＲが一般に同一ではない場合、上記に記載された特性に対する突然変異設計セットの影響は、全ての抗体にわたって同じではないことがある。他の汚染物質含有の不正確に対合した抗体様構造に比べて際立つ純度を有する二重特異性抗体の所定の任意の２つの利用可能な抗体のＭａｂ１及びＭａｂ２を作り出す方法が、本明細書において提示される。Ｍａｂ１及びＭａｂ２の軽鎖及び重鎖を、それぞれの突然変異設計セットの同族突然変異の導入後に同時発現させ、発現した抗体産物を分析的に選別し、タンパク質産物に発現した他のＭａｂ様種に対して、好ましい二重特異性抗体の純度を推定する。いくつかの実施形態において、分析的選別手順は、ＬＣ－ＭＳ技術に基づいていてもよい。いくつかの実施形態において、分析的選別手順は、毛細管等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）技術またはクロマトグラフ技術などの電荷に基づいた分離に基づいていてもよい。選別技術の例は、ＳＭＣＡ手順に基づいた実施例９に提示されている。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体の際立った純度は、発現タンパク質産物において得られた全てのＭａｂ様種の７０％を超えると定義される。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体の際立った純度は、発現タンパク質産物において得られた全てのＭａｂ様種の９０％を超えると定義される。二重特異性Ｍａｂ設計セットの所定のＭａｂ１及びＭａｂ２の調製及び選択の手順が、図１２に概略的に示されている。

薬学的組成物
本発明は、本明細書に記載されているヘテロ二量体またはヘテロ二量体対を含む薬学的組成物も提供する。そのような組成物は、治療有効量のヘテロ二量体またはヘテロ二量体対及び薬学的に許容される担体を含む。特定の実施形態において、用語「薬学的に許容される」は、連邦もしくは州政府の規制当局により認可されたこと、または動物、とりわけヒトへの使用のための米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に提示されたことを意味する。用語「担体」は、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指し、それと共に治療薬が投与される。そのような薬学的担体は、水、及び滅菌液体ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等などの石油、動物、植物または合成由来のものを含む、油であり得る。水は、薬学的組成物が静脈内投与されるとき、好ましい担体である。食塩溶液、ならびにデキストロース及びグリセロール水溶液を、特に注射用液剤の液体担体として用いることもできる。適切な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、バクガ、コメ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が含まれる。望ましい場合、組成物は、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、持続放出製剤等の形態を取ることができる。組成物は、トリグリセリドなどの伝統的な結合剤及び担体により、坐剤として処方することができる。経口製剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｓａｃｃｈａｒｉｎｅ）、セルロース、炭酸マグネシウム等などの標準的な担体を含むことができる。適切な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ"に記載されている。そのような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、患者への正確な投与形態を提供するために適切な量の担体と一緒に含有する。製剤は、投与様式に適合するべきである。

ある特定の実施形態において、ヘテロ二量体またはヘテロ二量体対を含む組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した薬学的組成物における日常的な手順に従って処方される。典型的には、静脈内投与様の組成物は、滅菌等張水性緩衝液による液剤である。必要な場合、組成物は可溶化剤及び注射部位の痛みを和らげるためにリグノカインなどの局所麻酔薬を含むこともできる。一般に成分は、別々に、または単位剤形に一緒に混合して、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの気密封止容器に含有された凍結乾燥粉末または無水濃縮物として提供される。注入により投与される組成物の場合、医薬品等級の滅菌水または食塩水を含有する点滴ボトルにより分配することができる。組成物が注射により投与される場合、成分を投与前に混合できるように、注射用滅菌水または食塩水のアンプルを提供することができる。

ある特定の実施形態において、本明細書に記載されている組成物は、中性または塩形態で処方される。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等から誘導されるものなどのアニオンにより、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導されるものなどのカチオンにより、形成されるものが含まれる。

治療用タンパク質の異常発現及び／または活性に関連する疾患または障害の治療、阻害及び予防に有効である、本明細書に記載されている組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えてインビトロアッセイを、最適な投与量範囲の特定を助けるため、場合により用いることができる。処方に用いる正確な用量は、投与経路及び疾患または障害の重篤度によっても左右され、医師の判断及びそれぞれの患者の状況によって決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から誘導される用量応答曲線から推定される。

ヘテロ二量体対の使用
上記に記載されたように、本明細書に記載されているヘテロ二量体対は、第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体を含むことができ、それぞれのヘテロ二量体の免疫グロブリン重鎖及び／または免疫グロブリン軽鎖は、既知の治療用抗体から、または分子に結合する既知の抗体からの一つまたは複数の修飾を含む。したがって、これらの抗体に対する修飾を含むヘテロ二量体を、既知の治療用抗体または既知の抗体を使用できる同じ疾患、障害または感染の治療または予防に使用できることが考慮される。

別の実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ二量体対を、癌、自己免疫性疾患、炎症性障害または感染症の治療または予防において当該技術に既知の他の治療剤と組み合わせて、有利に利用することもできる。特定の実施形態において、本明細書に記載されているヘテロ二量体対を、モノクローナルもしくはキメラ抗体、リンホカイン、または造血成長因子（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－３及びＩＬ－７など）と組み合わせて使用することができ、このことは、例えば、分子と相互作用するエフェクターの数または活性を増加させること及び免疫応答を増加させることに役立つ。本明細書に記載されているヘテロ二量体対を、例えば、抗癌剤、抗炎症剤または抗ウイルス剤などの、疾患、障害または感染の治療に使用される一つまたは複数の薬物と組み合わせて有利に利用することもできる。

キット
本発明は、追加的に、一つまたは複数のヘテロ二量体対を含むキットを提供する。キットにおける個別の構成要素は、別々の容器に包装され、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する行政当医局により規定された表示形態を、そのような容器に関連付けることができ、表示は、当局による製造、使用または販売の認可を反映している。キットは、ヘテロ二量体対の使用方法または投与レジメンを概説する使用説明書または指示書を、場合により含有することができる。

キットの一つまたは複数の構成要素が、溶液として、例えば水溶液または滅菌水溶液として提供されるとき、容器手段は、それ自体、吸入器、シリンジ、ピペット、点眼容器または他のそのような器具であることができ、それらから、溶液を対象に投与することができる、またはキットの他の構成要素に適用または混合することができる。

キットの構成要素を、乾燥または凍結乾燥形態で提供することもでき、キットは、凍結乾燥構成要素の再構成に適した溶媒を追加的に含有することができる。容器の数または種類に関わりなく、本発明のキットは、患者への組成物の投与を補助する器具を含むこともできる。そのような器具は、吸入器、鼻内噴霧器、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼容器または同様の医学的に認可された送達ビヒクルであり得る。

コンピューターによる実施
１つの実施形態において、コンピューターは、チップセットに結合した少なくとも１個のプロセッサーを含む。メモリー、記憶装置、キーボード、デバイス、グラフィックス・アダプタ、ポインティング装置及びネットワーク・アダプタも、チップセットに結合している。ディスプレイは、グラフィックス・アダプタに結合している。１つの実施形態において、チップセットの機能性は、メモリコントローラハブ及びＩ／Ｏコントローラハブにより提供される。別の実施形態において、メモリーは、チップセットではなくプロセッサーに直接結合している。

記憶装置は、ハード・ドライブ、コンパクト・ディスク読み取り専用メモリー（ＣＤ－ＲＯＭ）、ＤＶＤまたは半導体メモリー装置のような、データを保持することができる任意の装置である。メモリーは、プロセッサーにより使用される指示及びデータを保持する。ポインティング装置は、マウス、トラック・ボールまたは他の種類のポインティング装置であることができ、キーボードと組み合わせて使用して、データをコンピューターシステムに入力することに使用される。グラフィックス・アダプタは、ディスプレイに画像及び他の情報を表示する。ネットワーク・アダプタは、コンピューターシステムを地域または広範囲のネットワークに結合する。

当該技術に知られているように、コンピューターは、前記のものと異なる構成要素及び／または他の構成要素を有することができる。加えて、コンピューターは、特定の構成要素を欠いていてもよい。さらに、記憶装置は、コンピューターに対して局所及び／または遠隔にありうる（例えば、ストレージ・エリア・ネットワーク（ＳＡＮ）内に組み入れられている）。

当該技術において知られているように、コンピューターは、本明細書に記載されている機能性を提供するために、コンピュータープログラムモジュール実行するように適合されている。本明細書に使用されるとき、用語「モジュール」は、特定の機能性を提供するために利用されるコンピュータプログラム論理を指す。したがって、モジュールは、ハードウエア、ファームウエア及び／またはソフトウエアによって実施することができる。１つの実施形態において、プログラムモジュールは、記憶装置に記憶されており、メモリーに装填され、プロセッサーにより実行される。

本明細書に記載されている例及び実施形態は、例示する目的のためだけのものであり、その観点から様々な修正または変更が当業者に示唆され、本出願の精神及び範囲の範囲内、ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであることが、理解される。

下記は、本発明を実施する特定の実施形態の例である。例は、例示する目的のためだけに提供され、本発明の範囲をいかようにも制限することを意図しない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関する正確さを確実にするために努力がなされているが、幾らかの実験誤差及び偏差は、当然のことながら許容されるべきである。

本発明の実施は、特に示されない限り、当該技術の技能の範囲内のタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来の方法を用いる。そのような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ、１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＷｏｒｔｈＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．、現行版）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ及びＮ．Ｋａｐｌａｎ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、１９９０）；ＣａｒｅｙａｎｄＳｕｎｄｂｅｒｇＡｄｖａｎｃｅｄＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ第３版（ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ）Ａ及びＢ巻（１９９２）を参照すること。

実施例１：Ｆａｂ界面の分子モデル形成及びコンピューター誘導操作
構造及びコンピューター分子モデル形成誘導手法を使用して、他の抗体（Ａｂ）またはそのフラグメントの文脈において選別することができる重鎖及び軽鎖突然変異設計のライブラリーを生成して、目的の抗体において望ましい特異性を示す突然変異を特定した。優先的な重鎖（Ｈ）－軽鎖（Ｌ）対合を操作する設計戦略は、最初に代表的なＦａｂ（すなわち、Ｄ３Ｈ４４）を特定することを含んだ。

表１に示されているように、このＦａｂの主な判断基準は、ヒトである／ヒト化されていること、一般に使用されるＶＨ及びＶＬ部分群を有すること及び最小のフレームワーク領域突然変異を含有することであった。加えて、構造的な考慮は、ＶＨ：ＶＬドメイン間角度が抗体において観察される平均に近いものであるべきであることであった。ＦａｂＤ３Ｈ４４を選択した後、Ｆａｂ界面のコンピューター分析を実施して、重鎖と軽鎖の相互作用に重要な残基を二股手法の使用により特定及び理解した。

Ｆａｂ可変及び定常界面にわたる配列保存の網羅的分析を伴う第１の手法は、既知の抗体の配列及び構造の整列を介して実施した。様々な抗体部分群の定常及び可変ドメイン配列の整列を、図１に示す。図１Ａは、代表的なヒトＶＨ生殖系部分群の整列を示す。図１Ｂは、代表的なヒトカッパＶＬ生殖系部分群の整列を示す。図１Ｃは、代表的なヒトラムダＶＬ生殖系部分群の整列を示す。図１Ｄは、ヒトＣＨ１対立遺伝子配列の整列を示す。図１Ｅは、ヒトカッパ及びラムダ対立遺伝子配列の整列を示す。第２の手法は、図２に示されているように、多数の分子モデル形成ツール（例えば、ＲｅｓｉｄｕｅＣｏｎｔａｃｔｓ（商標））を使用するＤ３Ｈ４４結晶構造界面の分析を伴った。これらの分析は、優先的なＨ－Ｌ対合を遺伝子工学的に操作するためのホットスポット位置のリストの特定をもたらした。これらの分析において決定されたホットスポット位置を、表２に列挙する。これらの位置及びアミノ酸は、主に（いくつかはＣＤＲ３ループに位置していることを除いて）フレームワーク残基であり、また大部分は、ラムダＬ鎖に保存されている。Ｋａｂａｔ番号付けを有する親Ｄ３Ｈ４４配列のアミノ酸が、表３ａ～３ｂに提示されている。

次に、三次元結晶構造におけるホットスポット位置と目的のホットスポットに隣接する位置の可能性のある突然変異を、Ｚｙｍｅｐａｃｋ（商標）によるコンピューター突然変異誘発及び詰め込み／モデル形成を介して模擬及び特定した。Ｚｙｍｅｐａｃｋ（商標）は、投入構造及び突然変異のセットが与えられると、供給された突然変異に従って投入構造の残基の種類を変更し、突然変異タンパク質の物理的構造に近似する新たな構造を生成する、ソフトウエアスイートである。加えて、Ｚｙｍｅｐａｃｋは、様々な定量的メトリクスを計算することによって、突然変異タンパク質の特性を評価する。これらのメトリクスには、立体的及び静電的相補性の測定が含まれ、これは、突然変異タンパク質の安定性、結合親和性またはヘテロ二量体特異性と相関し得る。

図３は、可変ドメインの重鎖及び軽鎖界面におけるホットスポット位置のサブセットを表し、突然変異をこれらの界面位置にどのように導入して、絶対的な鎖の選択的対合を推進し、同時に不正確な鎖対合の形成を退けるようにするかを実証している。Ｚｙｍｅｐａｃｋ（商標）を含むコンピューターによる方法を使用して、立体相補性をモデル形成し、また、ファンデルワールス詰め込み、空洞化効果及び疎水性基との緊密な接触などのエネルギー要素に基づいて計算した。同様に、静電相互作用エネルギーをモデル形成し、電荷、水素結合及び脱溶媒和効果のクーロン相互作用に基づいて評価した。目的の突然変異の導入により得られたＨ１：Ｌ１（またはＨ２：Ｌ２）などの好ましい重鎖及び軽鎖対モデル及びＨ１：Ｌ２（及びＨ２：Ｌ１）などの不正確な対モデルの両方を模擬して、相対的な立体及び静電スコアを計算した。このことは、特定の突然変異セットが、不正確（非絶対）対と比べて、好ましい（絶対）重鎖－軽鎖対に優位なエネルギー、すなわち、より大きな立体的及び／または静電的相補性をもたらすかの決定を可能にした。計算された立体及び静電エネルギーは、軽鎖及び重鎖対合に関連する自由エネルギーの構成要素である。したがって、より大きな立体及び静電相補性は、非絶対的な対の対合と比べて、絶対的な対の対合に関連するより大きな自由エネルギーを示す。より大きな立体及び静電相補性は、非絶対的な対と比べて、絶対的な重鎖及び軽鎖の優先的（選択的）対合をもたらす。

実施例２：設計の選択及び記載
実施例１に記載された手法を使用して、選択的又は優先的対合を示す重鎖－軽鎖ヘテロ二量体対（すなわち、Ｈ１－Ｌ１及びＨ２－Ｌ２）を設計した。ヘテロ二量体は対で設計され、「設計」または「設計セット」と呼ばれ、優先的対合を促進するＨ１、Ｌ１、Ｈ２及びＬ２鎖に置換のセットを含む（表５）。設計セットは、相対的対合を評価するため、１つの重鎖が２つの軽鎖と同時発現する「ＬＣＣＡ設計」（表４）として最初に試験した。アミノ酸置換は、Ｋａｂａｔ番号付け系を使用して、表３ａ、３ｂを参照することによって特定される。

国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０５０９１４の表３０に記載されている設計ライブラリーを出発点として使用して、表４に示されているＬＣＣＡ設計及び表５に示されている設計セットのいくつかを特定した。表４及び表５の設計のいくつかは、新たな独立した設計である。コア設計が、関連する特有の識別子を伴って表６に示されている。大部分の設計は、定常領域のみの範囲であるが、いくつかの設計は、可変領域にも修飾を組み込んでいる。これらの設計は、対合特異性を更に誘導し、同時に他の抗体系への好都合な移行可能性もあることが提案された。

誘導された設計において、国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０５０９１４の表３０に記載されている設計のライブラリーを出発点として使用し、設計を構造類似性によってクラスター化し、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により測定した対合特異性の強度、抗原結合の効果及び安定性に基づいてランク付けした。次に設計を組み合わせ（例えば、表７を参照すること）及び／または最適化して（例えば、表８及び表９を参照すること）、誘導された設計を生じた。組み合わせでは、少なくとも１つの設計が高い対合特異性を示し、他の設計は一連の好ましい対合特異性を示した。組み合わせ及び／または最適化に選択された設計は、全て、抗原結合に対して最小の影響を示し／影響を全く示さず、融解温度（Ｔｍ）に対して最小の影響を示した／影響を全く示さなかった。

独立した設計を単独で（表５の設計型の縦列に独立と分類されている）、また、誘導された設計と組み合わせて（表５の設計型の縦列に独立／組み合わせと分類されている。表１０も参照すること）を試験した。

設計をＤ３Ｈ４４の分子モデルに詰め込み、メトリクスを（実施例１に記載されたように）計算した。次に上位の設計を、危険性（安定性と免疫原性に対するありうる影響）及びインパクト（対合特異性を誘導する提案された強度を考慮する）に基づいて選択した。これらの上位設計を表５に示す。

実施例３：Ｄ３Ｈ４４ＩｇＧ重鎖及びＤ３Ｈ４４ＩｇＧ軽鎖をコードするＦａｂ構築物の調製
抗組織因子抗体Ｄ３Ｈ４４の野生型Ｆａｂ重鎖及び軽鎖を以下のように調製した。Ｄ３Ｈ４４Ｆａｂ軽鎖（ＡＪ３０８０８７．１）及び重鎖（ＡＪ３０８０６８．１）配列をＧｅｎＢａｎｋから取り（表３ｃ）、遺伝子を合成し、コドンを哺乳類発現のために最適化した。５'－ＥｃｏＲＩ切断部位－ＨＬＡ－Ａシグナルペプチド－ＨＡまたはＦＬＡＧタグ－軽鎖Ｉｇクローン－'ＴＧＡストップ'－ＢａｍＨ１切断部位－３'からなる軽鎖ベクター挿入物を、ｐＴＴ５ベクターに連結した（ＤｕｒｏｃｈｅｒＹら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２００２；３０，Ｎｏ．２ｅ９）。得られたベクター＋挿入物を配列決定して、コードＤＮＡの正確なリーディングフレーム及び配列を確認した。同様に、５'－ＥｃｏＲ１切断部位－ＨＬＡ－Ａシグナルペプチド－重鎖クローン（Ｔ２３８において終止、表３ａを参照すること）－ＡＢＤ_２－Ｈｉｓ_６タグ－ＴＧＡストップ－ＢａｍＨ１切断部位－３'からなる重鎖ベクター挿入物を、ｐＴＴ５ベクター（ＡＢＤ、アルブミン結合ドメイン）に連結した。また、得られたベクター＋挿入物を配列決定して、コードＤＮＡの正確なリーディングフレーム及び配列を確認した。設計セットのためのアミノ酸置換を含有する様々なＦａｂＤ３Ｈ４４構築物を、遺伝子合成により、または部位指定突然変異誘発により生成した（ＢｒａｍａｎＪ，ＰａｐｗｏｒｔｈＣ＆ＧｒｅｅｎｅｒＡ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）５７：３１－４４）。

競合アッセイＳＰＲ選別による優先的対合の評価を推進するため、重鎖及び軽鎖のＣ末端及びＮ末端にそれぞれタグ付けした。ＡＢＤ_２－Ｈｉｓ_６重鎖タグは、Ｈ－Ｌ複合体が抗ＨｉｓタグＳＰＲチップ表面において捕捉されること特定的に可能にし、一方、ＦＬＡＧ及びＨＡ軽鎖タグは、相対的Ｌ１及びＬ２個体群の定量化を可能にした。

実施例４：Ｄ３Ｈ４４ＩｇＧ軽鎖及び／または重鎖に定常ドメイン修飾または定常及び可変ドメイン修飾の組み合わせのいずれかを含むＦａｂヘテロ二量体の優先的対合の評価
表１２のＬＣＣＡ設計セットのアミノ酸修飾を含むＦａｂフォーマットにおけるＤ３Ｈ４４ＩｇＧ重鎖及び軽鎖をコードする構築物を、実施例３に記載されたとおりに調製した。優先的に対合して、ＬＣＣＡ設計セット（Ｈ１、Ｌ１、Ｌ２）の文脈において望ましいＨ１－Ｌ１ヘテロ二量体を形成する構築物の能力を、軽鎖競合アッセイ（ＬＣＣＡ）の使用により決定した。

ＬＣＣＡは、１つの重鎖と少なくとも２つの特有の軽鎖との相対的対合を定量化し、以下のようにまとめることができる。１つのＤ３Ｈ４４重鎖Ｆａｂ構築物を２つの特有のＤ３Ｈ４４軽鎖Ｆａｂ構築物と同時発現させ、相対的な軽鎖対合特異性（例えば、Ｈ１－Ｌ１：Ｈ１－Ｌ２）を競合アッセイ－ＳＰＲ選別によって決定し、これを２回実施した。Ｌ１（Ｈ鎖と優先的に対合するように設計された）の量をＬ２と比較して低減させ（例えば、重量に基づいてＬ１：Ｌ２＝１：３）、一方、重鎖を限定量（すなわち、Ｈ１：Ｌ１＋Ｌ２を１：３）に保持することによって、ＬＣＣＡ選別比を偏らせて、強力なドライバー（ｄｒｉｖｅｒ）を特定した。形成されたそれぞれのヘテロ二量体（すなわち、Ｈ１－Ｌ１及びＨ１－Ｌ２）の量を、Ｈｉｓタグのプルダウンを介したＳＰＲチップへの重鎖の結合、続くこれらのタグに特異的な抗体を使用したそれぞれの軽鎖タグ（ＨＡまたはＦＬＡＧ）の量の検出によって、決定した。続いて、選択されたヘテロ二量体のヒットを軽鎖競合アッセイの検証を介して検証し、これによると、Ｌ１：Ｌ２のＤＮＡ比は、形質移入の際に１：３及び１：９で変動しており、一方、重鎖は限定された量に保持された。軽鎖タグ（ＨＡまたはＦＬＡＧ）は、Ｄ３Ｈ４４系においてＬＣＣＡ対合に影響を与えないことにも留意すること（国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０５０９１４の実施例１０を参照すること）。このアッセイの設計の概略図を、図４に示す。図５は、重鎖及び軽鎖がどのようにタグ付けされ、優先的な対形成がどのように評価されるかを示す。ＬＣＣＡの実験の詳細を下記に提供する。

形質移入方法
実施例３に記載されたとおりに調製された、１つの重鎖及び２つの軽鎖の構築物を含むＬＣＣＡ設計を、ＣＨＯ－３Ｅ７細胞に以下のように形質移入した。ＣＨＯ－３Ｅ７細胞を、４ｍＭのグルタミン及び０．１％のＫｏｌｉｐｈｏｒＰ１８８（Ｓｉｇｍａ＃Ｋ４８９４）を補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ－１３８３５０１）において、１．７～２×１０^６細胞／ｍｌの密度により、３７℃で培養した。総量の２ｍｌに対し、ＰＥＩ－ｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ形質移入番号１１５－３７５）の使用により、ＤＮＡ：ＰＥＩ比＝１：２．５で、合計２μｇのＤＮＡにより形質移入した。ＤＮＡ－ＰＥＩ混合物を添加した２４時間後、細胞を３２℃に移した。上澄みを、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により７日目に発現について試験し、続いてクーマシーブルー染色により、バンドを可視化した。Ｈ：Ｌ比は、表１１に示されているとおりである。

競合アッセイＳＰＲ方法
ＬＣＣＡ設計におけるＤ３Ｈ４４重鎖への優先的Ｄ３Ｈ４４軽鎖対合の程度を、それぞれの軽鎖のＮ末端に位置する特有のエピトープタグのＳＰＲに基づいた読み取りの使用により評価した。

表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の供給。ＧＬＣセンサーチップ、ＢｉｏｒａｄＰｒｏｔｅＯｎアミンカップリングキット（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓＮＨＳ）及びエタノールアミン）、ならびに１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液は、Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｎａｄａ）Ｌｔｄ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）から購入した。４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びＮａＣｌは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）から購入した。１０％Ｔｗｅｅｎ２０溶液は、Ｔｅｋｎｏｖａ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から購入した。

ＳＰＲバイオセンサーアッセイ。全ての表面プラスモン共鳴アッセイは、ＢｉｏＲａｄＰｒｏｔｅＯｎＸＰＲ３６器具（Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｎａｄａ）Ｌｔｄ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ））をＰＢＳＴランニングバッファー（ｒｕｎｎｉｎｇｂｕｆｆｅｒ）（ＰＢＳ、ＴｅｋｎｏｖａＩｎｃ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を伴う）と共に２５℃の温度で使用して実施した。抗ペンタＨｉｓ捕捉表面を、分析物（水平）方向に１００μＬ／分で１４０秒間注入した標準ＢｉｏＲａｄｓＮＨＳ／ＥＤＣ溶液の１:５希釈液により活性化されたＧＬＭセンサーチップを使用して、生成した。活性化した直後、１０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５中の抗ペンタＨｉｓ抗体（ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．）の２５μｇ／ｍＬの溶液を、分析物（水平）方向に２５μＬ／分の流速で、およそ３０００共鳴単位（ＲＵ）が固定化されるまで注入した。残りの活性基を、分析物方向に１００μＬ／分の流速で１Ｍのエタノールアミンを１４０秒間注入することにより停止させ、このことは、偽活性化インタースポット（ｉｎｔｅｒｓｐｏｔ）がブランク参照のために作り出されることも確実にした。

抗ＦＬＡＧ（ＳｉｇｍａＩｎｃ．）及び抗ＨＡ（ＲｏｃｈｅＩｎｃ．）モノクローナル抗体への結合についてのヘテロ二量体の選別を２つのステップで行った。抗ペンタＨｉｓ表面へのヘテロ二量体のリガンド方向での間接的捕捉、続いて、抗ＦＬＡＧ及び抗ＨＡの分析物方向での注入である。最初に、リガンド方向での１００μＬ／分の３０秒間のＰＢＳＴの１回の注入を、ベースラインの安定化に使用した。それぞれのヘテロ二量体の捕捉では、細胞培養培地中の非精製ヘテロ二量体を、ＰＢＳＴにより４％に希釈した。１～５つのヘテロ二量体または対照（すなわち、１００％のＨＡ軽鎖もしくは１００％のＦＬＡＧ軽鎖を含有する対照）を、個別のリガンドチャンネルに流速２５μＬ／分で２４０秒間同時に注入し、飽和ヘテロ二量体捕捉のおよそ３００～４００ＲＵを抗ペンタＨｉｓ表面にもたらした。第１のリガンドチャンネルを空のままにして、必要に応じてブランク対照として使用した。このヘテロ二量体捕捉ステップの直後に、２つの緩衝液の分析物方向への注入が続いて、ベースラインを安定化させ、次に、５ｎＭの抗ＦＬＡＧ及び５ｎＭの抗ＨＡを、それぞれ、１８０秒間の解離段階を伴って、５０μＬ／分により１２０秒間注入し、これを２回繰り返し、捕捉されたヘテロ二量体のそれぞれに関して、緩衝液基準を用いる一組の結合センサーグラムをもたらした。ヘテロ二量体が結合する組織因子（ＴＦ）抗原も、最後に残った分析物チャンネルに活性対照として注入した。ヘテロ二量体を、０．８５％のリン酸の１８秒間のパルスにより１００μＬ／分で１８秒間再生して、次の注入サイクルのために抗ペンタＨｉｓ表面を調製した。センサーグラムを、緩衝液ブランク注入及びインタースポットの使用により整列及び二重参照し、得られたセンサーグラムを、ＰｒｏｔｅＯｎＭａｎａｇｅｒソフトウエアｖ３．０の使用により分析した。

結果
ＬＣＣＡの結果を表１２、１３ａ及び１４ａに示す。表１３及び１４において、「特有の識別子」は、２つの構成ＬＣＣＡの特有の識別子がいずれかの配向（（Ｈ１Ｌ１Ｌ２のセット番号－Ｈ２Ｌ２Ｌ１のセット番号）または（Ｈ２Ｌ２Ｌ１のセット番号－Ｈ１Ｌ１Ｌ２のセット番号））であり得るので、表５と正確に一致しないことがあり得ることに留意すること。それぞれのＬＣＣＡ設計の優先的対合の評価を、表１２の後ろの３つの縦列に示す。また同じデータが、表１３ａ及び１４ａの縦列５、６及び８または１０、１１及び１３に設計対の文脈で含まれる。Ｈ１、Ｌ１及びＬ２突然変異のそれぞれの特有のセット（ＬＣＣＡ設計）には、特有の番号または「セット番号」（例えば、９５６７もしくは９０８７）を割り当てた。データがＨ１Ｌ１Ｈ２Ｌ２フォーマット（Ｆａｂ対フォーマットまたは設計セット）により表されるとき、したがってそのような設計セットは、２つの構成ＬＣＣＡ（例えば９５６７－９０８７）のセット番号から構成される「特有の識別子」によって示される。大部分のＬＣＣＡ実験を、定常ドメインに位置する鎖間Ｆａｂジスルフィド結合を含有する構築物（Ｈ／Ｃ２３３－Ｌ／Ｃ２１４、Ｋａｂａｔ番号付け）において実施したことに留意すること。表１３（ａ及びｂ）ならびに１４（ａ及びｂ）において、優先的対合に関して成功した特定の設計を強調する目的で、２つの相補的ＬＣＣＡセット（Ｈ１、Ｌ１、Ｌ２及びＨ２、Ｌ２、Ｌ１）は、Ｆａｂ対フォーマットで表されている。タグの存在（Ｌ鎖：ＨＡ及びＦＬＡＧ、ならびにＨ鎖：ＡＢＤ_２－Ｈｉｓ_６）は、Ｄ３Ｈ４４ＷＴでの約５０％：５０％の予測された中立的対合に影響を与えなかった。

この表において、報告されたＬＣＣＡデータは、Ｌ１：Ｌ２ＤＮＡ比＝１：１に正規化された比率フォーマット（Ｈ１－Ｌ１：Ｈ１－Ｌ２及びＨ２－Ｌ２：Ｈ２－Ｌ１）の中央値である。更に、いくつかの変種において、Ｌ１及びＬ２の総量が１００％から有意に異なることが観察されたので、ＬＣＣＡデータを１００％に正規化した。総軽鎖率におけるこの差異は、ＳＰＲチップにおける初期ヘテロ二量体捕捉の際に、非特異的結合の変動が発生することに部分的に起因すると考えられる。ＬＣＣＡ実験が２つの異なるＬ１：Ｌ２ＤＮＡ比（それぞれ１：３及び１：９のＬ１：Ｌ２）で実施されたので、両方のＬＣＣＡ正規化比率が表に提示されている。ＬＣＣＡデータは、得られた実験データが算入の判断基準を満たさなかった（例えば、ＳＰＲチップのＦａｂ捕捉が、１００未満であった、またはＬ１及びＬ２のＬＣＣＡ総量が６０～１４０の範囲外であった）ので、いくつかのＬＣＣＡ実験について報告しなかった。

表１２は、データが得られたＬＣＣＡ設計（５３０個）の全てを網羅する。５３０個のＬＣＣＡ設計のうち、これらのＬＣＣＡの４９０個（９２．５％）は、Ｌ１：Ｌ２ＤＮＡ比＝１：３及び１：９の両方を考慮して、少なくとも６０％の正確な対合（Ｌ１：Ｌ２ＤＮＡ比＝１：１に正規化）を有した。残りのＬＣＣＡ設計は、主に中立であるＬＣＣＡ設計的（３２個／５３０個または６．０％）、ならびに一貫性のない結果を生じた少ない割合のＬＣＣＡ設計（８個／５３０個または１．５％）を含んだ。表１２に示されている設計は、主に静電的なもの（水素結合または電荷－電荷相互作用を利用する特異的ドライバーに基づいたもの）であり、いくつかの設計は、立体相補性及び／または鎖間共有ジスルフィド結合も含む。いくつかの設計は、天然の鎖間ジスルフィド結合の不在下での新たなジスルフィド結合（Ｈ／Ｃ２３３－Ｌ／Ｃ２１４により形成された）の形成のための突然変異も含んだ。

表１３（ａ及びｂ）ならびに１４（ａ及びｂ）は、ＬＣＣＡデータが設計セットの両方のヘテロ二量体に存在する４４７個の設計を網羅する。表１３ａ及び１４ａは、実施例１に記載されたコンピューター手法が、多様な設計セット及びこれらの変種にわたって、Ｈ１－Ｌ２よりもＨ１－Ｌ１の優先的対合及びＨ２－Ｌ１よりもＨ２－Ｌ２の優先的対合の達成をもたらしたことを実証している。

表１３（ａ及びｂ）は、Ｆａｂヘテロ二量体の対合：誤対合が少なくとも８６：１４である、平均ＬＣＣＡ性能を有する設計を網羅し（Ｌ１：Ｌ２比の正規化中央値はＨ１－Ｌ１：Ｈ１：Ｌ２及びＨ２－Ｌ２：Ｈ２－Ｌ１では１：１である）、一方、表１４（ａ及びｂ）は、Ｆａｂヘテロ二量体の対合：誤対合が８６：１４未満である、平均ＬＣＣＡ性能を有する設計を網羅する。それぞれのＬＣＣＡの性能を１００％に正規化し、同様にＬ１：Ｌ２ＤＮＡ比を１：１に正規化し（この実施例の上に記載されている）、両方のスカラー値（（ｌｎ（ｒ１／ｆ１）またはｌｎ（ｒ２／ｆ２））により記載し、ここで、ｒ１及びｒ２は、実験比でＨ１Ｌ１：Ｈ１Ｌ２及びＨ２Ｌ２：Ｈ２Ｌ１の中央値にそれぞれ相当し、ｆ１及びｆ２は、対応する実験比に相当する）、対合と誤対合のＦａｂヘテロ二量体の比により記載する。それぞれの設計は、関連する平均ＬＣＣＡ性能スカラー値（０．５（ｌｎ（ｒ１／ｆ１）＋ｌｎ（ｒ２／ｆ２）））も有し、これらも、１００％に正規化され、同様にＬ１：Ｌ２ＤＮＡ比も１：１に正規化される（この実施例の上に記載されている）。更に、設計のそれぞれのＬＣＣＡ（Ｈ１Ｌ１：Ｈ１Ｌ２及びＨ２Ｌ２：Ｈ２Ｌ１に対応するＬＣＣＡ１及びＬＣＣＡ２）のスカラー範囲を示す。４４７個のＭａｂ設計の内３５４個（７９．２％）は、少なくとも８６：１４である平均ＬＣＣＡ性能を示す（表１３ａ及びｂ）。表１３（ａ及びｂ）における設計を、設計の類似性に基づいた１３のクラスターに更に特徴付けた。それぞれのクラスター内の設計を最高から最低の平均ＬＣＣＡ性能スカラー値によって配列した。

加えて、表１３ａにおけるＬＣＣＡデータも、図７にグラフ表示した。図７は、各クラスターにおいて、Ｆａｂヘテロ二量体の対合：誤対合が少なくとも８６：１４である、平均ＬＣＣＡ性能値の箱髭図を示す。箱髭図の下部は、第１の四分位数（Ｑ１）を示し、これは、第１の四分位数を下回る値がデータの最低２５％を示すように、最小値と中央値の中間平均ＬＣＣＡ性能値である。箱髭図内の水平バーは、第２の四分位数を示し、これは、クラスターの中央平均ＬＣＣＡ性能値である。箱髭図の最上部は、第３の四分位数（Ｑ３）を示し、これは、第３の四分位数を上回る値がデータの最高２５％を示すように、最大値と中央値の中間平均ＬＣＣＡ性能値である。四分位数間領域は、Ｑ３とＱ１の差である。垂直に両方向へ伸びている髭線（ｗｈｉｓｋｅｒｓ）は、両方ともＱ１－（１．５^＊ＩＱＲ）またはＱ３＋（１．５^＊ＩＱＲ）内にある値のデータ範囲を示す。髭線を止める（ｃａｐ）水平バーは、範囲内の最大及び最長値を示す。箱髭図プロットを外れて存在するデータ及び髭線は、外れ値と特定され、中央外れ値は点線により示され（Ｑ１またはＱ３と１．５^＊ＩＱＲ～３^＊ＩＱＲ異なる）、極限外れ値は、＋符号により示されている（Ｑ１またはＱ３と３^＊ＩＱＲを超えて異なる）。

実施例５：生物物理的特徴決定の大規模化
特有の識別子セット（表５）により示された正確に対合したヘテロ二量体を、熱安定性及び抗原結合について試験するため、以下のように大規模化し（典型的には２０ｍｌ）、精製した。ヘテロ二量体の重鎖及び軽鎖を、ＣＨＯ－３Ｅ７細胞の２０ｍｌの培養物において発現させた。ＣＨＯ－３Ｅ７細胞を、４ｍＭのグルタミン及び０．１％のＫｏｌｉｐｈｏｒ１８８（Ｓｉｇｍａ＃Ｋ４８９４）を補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ－１３８３５０１）において、１．７～２×１０^６細胞／ｍｌの密度により、３７℃で培養した。総量の２０ｍｌに対し、ＰＥＩ－ｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓカタログ番号１１５－３７５）の使用により、ＤＮＡ：ＰＥＩ比＝１：２．５で、合計２０μｇのＤＮＡにより形質移入した。ＤＮＡ－ＰＥＩ混合物を添加した２４時間後、細胞を３２℃に移した。

細胞を形質移入の７日後に遠心分離し、ヘテロ二量体をハイスループットニッケル親和性クロマトグラフィー精製により、上澄みから、以下のように精製した。上澄みを、平衡緩衝液（カルシウム、マグネシウム及びフェノールレット（ＨｙＣｌｏｎｅ（商標）番号ＳＨ３００２８．０２を有さないダルベッコ－リン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ））により２０～２５％細胞培養上澄みに希釈し、次に、予め平衡緩衝液に平衡にもしてある、ＨｉｓＰｕｒ（登録商標）Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（ＴｈｅｒｍｏｓＳｃｉｅｎｃｔｉｆｉｃ番号ＰＩ－８８２２２）と混合しながら１２時間インキュベートした。次に樹脂を遠心分離により収集し、９６ウエルフリットプレートに移し、平衡緩衝液で３回洗浄し、ＨＩＳ－Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）溶出緩衝液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ番号Ｈ５４１３）を使用して溶出した。

精製した後、ヘテロ二量体発現を、ＣａｌｉｐｅｒＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ番号７６０４９９）を使用する非還元的ＨｉｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓアッセイにより評価した。手順は、以下の変更と伴って、ＨＴＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓＬａｂＣｈｉｐＵｓｅｒＧｕｉｄｅｖｅｒｓｉｏｎ２ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩＵｓｅｒＭａｎｕａｌに従って実施した。ヘテロ二量体試料を、２μｌまたは５μｌのいずれか（濃度範囲５～２０００ｎｇ／μｌ）により、９６ウエルプレート（ＢｉｏＲａｄ番号ＨＳＰ９６０１）の別々のウエルに、７μｌのＨＴＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ番号７６０３２８）と共に加えた。次にヘテロ二量体試料を７０℃で１５分間変性した。ＬａｂＣｈｉｐ器具を、ＨＴＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓＬａｂＣｈｉｐ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ番号７６０４９９）及びＡｂ－２００アッセイ設定の使用により作動した。使用後、チップをＭｉｌｌｉＱ水により清浄化し、４℃で保存した。

実施例６：ＤＳＦによるＦａｂヘテロ二量体の熱安定性の測定
熱安定性を評価するため、示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）を、ハイスループット方法として使用して、野生型の非修飾重鎖－軽鎖対と比較して、正確に対合したヘテロ二量体を全て選別した。ヘテロ二量体は、実施例５に記載されたとおりに調製した。

熱安定性の測定
全てのヘテロ二量体対の熱安定性は、ＤＳＦを使用して以下のように測定した。それぞれのヘテロ二量体を実施例５に記載されたように精製し、ＤＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３００２８．０２）により０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。大部分の試料において、ＳｙｐｒｏＯｒａｎｇｅゲル染色（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｓ－６６５０）の作業溶液（ｗｏｒｋｉｎｇｓｔｏｃｋ）は、４μＬのＳｙｐｒｏＯｒａｎｇｅゲル染色を２ｍｌのＤＰＢＳに希釈することによって調製した。ＤＳＦ試料は、１４μＬの０．５ｍｇ／ｍＬタンパク質を６０μＬの希釈ＳｙｐｒｏＯｒａｎｇｅゲル染色作業溶液に加えることによって調製した。しかし、０．５ｍｇ／ｍＬ未満のタンパク質では、それぞれのＤＳＦ試料は、１４μＬの非希釈タンパク質を６０μｌのＳｙｐｒｏＯｒａｎｇｅ色素作業溶液（ＤＰＢＳにより１：１５００に希釈された）に加えることによって調製した。次にＤＳＦ分析を、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ６０００ｑＰＣＲ器具（ＱｉａＧｅｎＩｎｃ）の使用により２０μｌのアリコートで２回実施した。それぞれの試料を、それぞれのステップにおいて１０秒間の平衡及び出発時に３０秒間の待機時間を有する１℃の間隔を使用して、３０℃から９４℃で走査した。９のゲインを有する４７０ｎＭの励起フィルター及び６１０ｎＭの発光フィルターを使用した。データは、Ｔｍの変性曲線の第１の微分係数からの最大値を使用して、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ６０００ソフトウエアにより分析した。残りのＤＳＦ試料は、測定したＴｍ値を変更しない以下のプロトコール改変により同様に調製及び分析した。１）作業溶液は、１μＬのＳｙｐｒｏＯｒａｎｇｅゲル染色を２ｍｌのＤＰＢＳに希釈することによって調製した。２）３０μｌのアリコートを分析した。３）１０のゲインを使用した。

ＤＳＦの結果を表１２、１３ｂ及び１４ｂに示す。ＬＣＣＡ設計の文脈におけるＨ１：Ｌ１Ｆａｂの熱安定性（ＤＳＦ値及び野生型と比較したＤＳＦ値）を、表１２の縦列３及び４に示す。また同じＤＳＦ値が、表１３ｂ及び１４ｂの縦列７及び８に設計対の文脈で含まれる。反復が実施されるそれぞれのＦａｂヘテロ二量体において、報告されたＴｍ値は、中央値である。Ｆａｂヘテロ二量体のＴｍ値と、野生型Ｆａｂヘテロ二量体のＴｍ値（Ｔｍ中央値の８１．０℃を有する、ＨＡタグを含有する野生型Ｆａｂ構築物）との比較を、Ｈ１Ｌ１＿ｄＴｍ＿ｄｓｆの縦列に報告する。天然の鎖間ジスルフィド結合（Ｈ鎖Ｃ２３３とＬ鎖Ｃ２１４の間）を欠いているいくつかのＦａｂヘテロ二量体では、Ｈ１Ｌ１＿ｄＴｍ＿ｄｓｆ値は、自然の鎖間ジスルフィドを欠いている対応する野生型Ｆａｂを評価しなかったので、決定されなかったことに留意すること。また、いくつかのＦａｂヘテロ二量体は、対応する実験の質（例えば、低収率、低強度、部分的に遮蔽されたピーク及び１℃を超えたＦａｂヘテロ二量体の反復間の変動性）に起因して、Ｔｍ値が報告されなかった（１７個／２３０個つまり７．４％のＦｅｂヘテロ二量体）ことに留意すること。これらのＦａｂヘテロ二量体のいくつかにおいて、結合Ｌ鎖タグ（ＨＡまたはＦＬＡＧ）の存在／不在または素生のみが異なる類似したＦａｂヘテロ二量体のＴｍ値に相当する推定Ｔｍ値が、代わりに報告された。推定Ｔｍ値では、対応する野生型Ｔｍ値（８１．２℃）は、全ての野生型Ｆａｂヘテロ二量体構築物（すなわち、ＨＡタグまたはＦＬＡＧタグを含有するＦａｂ構築物）から得た中央値である。ＨＡまたはＦＬＡＧタグは、野生型Ｆａｂヘテロ二量体のＴｍ値に有意な影響を与えない。全体的に、Ｆａｂヘテロ二量体はＷＴと比較して類似したＴｍ値を示した。天然の鎖間ジスルフィドを含有し、ＤＳＦデータが利用可能でもあるＦａｂヘテロ二量体のうち、９３％（１９５個／２０９個）のＦａｂヘテロ二量体が、ＷＴと比べて３℃以下の損失を示した。更に、最大の影響を受けたＦａｂヘテロ二量体は、ＷＴと比べて６．５℃の損失を示した。表１２は、Ｔｍランクが減少する順番でＬＣＣＡ設計を網羅する。

更に、Ｆａｂヘテロ二量体の安定性を一般に改善する１３個のアミノ酸置換が、特定された（表３４を参照すること）。安定化突然変異は、安定化突然変異を含むＦａｂヘテロ二量体と、安定化突然変異が不在であることが異なる類似したＦａｂヘテロ二量体との比較の後に特定した。重鎖安定化突然変異には、Ａ１２５Ｒ、Ｈ１７２Ｒ、Ｌ１４３Ｆ、Ｑ１７９Ｄ、Ｑ１７９Ｅ、Ｑ３９Ｒ、Ｓ１８８Ｌ及びＶ１９０Ｆが含まれる。軽鎖安定化突然変異には、Ｑ１２４Ｅ、Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｆ、Ｓ１７６Ｌ及びＴ１８０Ｅが含まれる。全体的に、安定化突然変異は、安定性を０．４℃～２．１℃増加させた。重鎖安定化突然変異Ａ１２５Ｒ、Ｈ１７２Ｒ、Ｌ１４３Ｆ、Ｑ１７９Ｄ、Ｑ１７９Ｅ、Ｑ３９Ｒ、Ｓ１８８Ｌ及びＶ１９０Ｆは、安定性をそれぞれ、０．４℃～０．６℃、０．４℃～２．１℃、０．４℃、０．５℃～０．６℃、０．５℃～０．８℃、１．１℃～１．６℃、０．４℃～１．２℃及び１℃増加させた。軽鎖安定化突然変異Ｑ１２４Ｅ、Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｆ、Ｓ１７６Ｌ及びＴ１８０Ｅは、安定性をそれぞれ０．４℃～０．５℃、０．８℃～０．９℃、０．６℃、０．４℃～１．０℃及び０．５℃増加させた。

実施例７：Ｆａｂヘテロ二量体の抗原親和性の測定
Ｆａｂヘテロ二量体の、組織因子に結合する能力を、アミノ酸置換がヘテロ二量体の抗原に結合する能力に任意の作用を有するかを決定するために評価した。それぞれのＦａｂヘテロ二量体の組織因子への親和性は、ＳＰＲにより以下のようにして決定した。

ＳＰＲ供給。ＧＬＣセンサーチップ、ＢｉｏｒａｄＰｒｏｔｅＯｎアミンカップリングキット（ＥＤＣ、ｓＮＨＳ及びエタノールアミン）、ならびに１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液は、Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｎａｄａ）Ｌｔｄ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）から購入した。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を伴うＰＢＳランニングバッファーは、ＴａｋｎｏｃａＩｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から購入した。

Ｆａｂヘテロ二量体のバッチ。精製されたＦａｂヘテロ二量体を、３つのバッチであるＡ、Ｂ及びＣにおいて試験した。バッチＡ及びＢは、ＳＰＲアッセイを実施する前に、４℃でおよそ１か月間保存し、一方、バッチＣのＦａｂヘテロ二量体は、ＳＰＲアッセイを実施する前に、４℃でおよそ２か月間保存した。バッチＣのＦａｂヘテロ二量体は、表１２において対応するＫＤ値の隣に「＋」を付けた。

全ての表面プラスモン共鳴アッセイは、ＢｉｏＲａｄＰｒｏｔｅＯｎＸＰＲ３６器具（Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｎａｄａ）Ｌｔｄ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ））をＰＢＳＴランニングバッファー（ｒｕｎｎｉｎｇｂｕｆｆｅｒ）と共に２５℃の温度で使用して実施した。抗ペンタＨｉｓ捕捉表面を、分析物（水平）方向に１００μＬ／分で１４０秒間注入した標準ＢｉｏＲａｄｓＮＨＳ／ＥＤＣ溶液の１．５希釈液により活性化されたＧＬＣセンサーチップを使用して、生成した。活性化した直後、１０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５中の抗ペンタＨｉｓ抗体（ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．）の２５μｇ／ｍＬの溶液を、分析物（水平）方向に２５μＬ／分の流速で、およそ３０００共鳴単位（ＲＵ）が固定化されるまで注入した。残りの活性基を、分析物方向に１００μＬ／分の流速で１Ｍのエタノールアミンを１４０秒間注入することにより停止させ、このことは、偽活性化インタースポット（ｉｎｔｅｒｓｐｏｔ）がブランク参照のために作り出されることも確実にした。

ＴＦ抗原に結合するＦａｂヘテロ二量体の選別を、２ステップで行った。リガンド方向での抗ペンタＨｉｓ抗体表面へのＦａｂヘテロ二量体の間接的な捕捉、続く、分析物方向での二重参照のための、５つの精製抗原濃縮物と１つの緩衝液ブランクの同時注入である。最初にベースラインを、１つの緩衝液のリガンド方向での１００ｕＬ／分による３０秒間の注射により安定化した。ＰＢＳＴ中３．４μｇ／ｍｌの濃度の１～５つの変種または対照を、個別のリガンドチャンネルに２５μＬ／分の流速で２４０秒間同時注入した。これは、バッチＡ及びＢでは、およそ１０００ＲＵの平均捕捉を抗ペンタＨｉｓ表面にもたらし、バッチＣでは、およそ６００ＲＵの平均捕捉を抗ペンタＨｉｓ表面にもたらした。第１のリガンドチャンネルを空のままにして、必要に応じてブランク対照として使用した。この捕捉ステップの直後に、分析物方向での１００μＬ／分で３０秒間の２つの緩衝液注入がそれぞれ続いて、ベースラインを安定化し、次に、６０ｎＭ、２０ｎＭ、６．７ｎＭ、２．２ｎＭ及び０．７４ｎＭの抗原（ＴＦ）を、緩衝液ブランクと共に、６００秒間の解離段階を伴って、５０μＬ／分で１２０秒間同時に注入した。捕捉抗体表面を、２回、０．８５％のリン酸の１８秒間のパルスにより１００μＬ／分で１８秒間再生して、次の注入サイクルのために調製した。センサーグラムを、緩衝液ブランク注入及びインタースポットの使用により整列及び二重参照し、得られたセンサーグラムを、ＰｒｏｔｅＯｎＭａｎａｇｅｒソフトウエアｖ３．１の使用により分析した。二重参照センサーグラムを１：１結合モデルに当てはめた。それぞれの抗原のＲｍａｘ値を、それぞれの変種の抗体捕捉レベルに正規化して、１００％対照と比較した。

Ｆａｂヘテロ二量体試料の抗原親和性（ＫＤ）値を、表１２、１３ｂ及び１４ｂに報告する。ＬＣＣＡ設計の文脈におけるＨ１：Ｌ１ＦａｂのＫＤ値（ＫＤ及びＫＤ値の範囲、ならびに野生型と比較したＫＤ中央値）を、表１２の縦列５、６及び７にそれぞれ示す。同じＫＤ値は、表１３ｂ及び１４ｂの縦列３（Ｈ１－Ｌ１Ｆａｂヘテロ二量体のＫＤ）、４（野生型と比較したＨ１－Ｌ１Ｆａｂヘテロ二量体のＫＤ変化）、５（Ｈ２－Ｌ２Ｆａｂヘテロ二量体のＫＤ）、ならびに６（野生型と比較したＨ２－Ｌ２Ｆａｂヘテロ二量体のＫＤ変化）の設計対の文脈においても含まれる。ＫＤ値は、少なくとも１００ＲＵのＦａｂヘテロ二量体捕捉を示したＦａｂヘテロ二量体試料のみにおいて決定された。基準野生型ＫＤ（０．１５７ｎＭ）は、軽鎖がＦＬＡＧタグを含有する野生型Ｆａｂヘテロ二量体の中央値を反映する。野生型Ｆａｂヘテロ二量体（ＦＬＡＧまたはＨＡタグのいずれかを含有する）は類似するＫＤ値を示し、２．６倍の差が最大値と最小値の間に観察された。表１２、１３ｂ及び１４ｂにおいて、野生型抗原結合親和性に関するＫＤの差は、－（対数（ＫＤ）設計－対数（ＫＤ）ｗｔ）の計算を使用して示され、正の値は、抗原への野生型結合親和性と比較して、Ｆａｂヘテロ二量体の低下したＫＤ値を示し、一方、負の値は増加したＫＤ値を示す。いくつかのＦａｂヘテロ二量体は、測定ＫＤ値を欠いていることに留意すること。これらの場合のいくつかにおいて、Ｆａｂヘテロ二量体を評価したが、ＳＰＲ実験は、低いＦａｂヘテロ二量体捕捉（すなわち、１００ＲＵ未満）を示し、したがって、ＫＤ値の正確な決定は可能ではなかった。他のＦａｂヘテロ二量体に類似性を示す（すなわち、結合したＬ鎖タグ（ＨＡまたはＦＬＡＧ）の存在／不在または素生のみが異なる）Ｆａｂヘテロ二量体では、類似したＦａｂヘテロ二量体のＫＤ値に対応する推定ＫＤ値が代わりに提供される（表１２、１３ｂ及び１４ｂに示されている）。対応する推定野生型ＫＤ値（０．１５ｎＭ）は、全ての野生型Ｆａｂヘテロ二量体構築物（すなわち、ＨＡタグまたはＦＬＡＧタグを含有するＦａｂ構築物）から得た中央値であった。全体的に、結果は、正確に対合したヘテロ二量体は（設計の観点から）、抗原に野生型様の結合親和性（基準野生型親和性の約２．３倍以内）を示すことが示されている。

実施例８．野生型タグ付きＤ３Ｈ４４ヘテロ二量体及び優先的に対合したヘテロ二量体の超高速液体クロマトグラフィーサイズ排除クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ－ＳＥＣ）プロファイル
重鎖にＣ末端ＡＢＤ２－Ｈｉｓ_６タグ及び軽鎖にＮ末端タグ（１つの構築物にＦＬＡＧ及び別の構築物にＨＡ）を有する野生型Ｄ３Ｈ４４ヘテロ二量体（１つの重鎖及び１つの軽鎖）を、当該技術の既知の方法及び実施例５に記載されたものに類似した方法によって発現させ、精製した。優先的または正確に対合したヘテロ二量体を個別に大規模化し、実施例５に記載されたようにＨｉｓタグ親和性精製によって精製した。

３０℃に設定し、ＰＤＡ検出器を有するＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣ系に取り付けたＷａｔｅｒｓＢＥＨ２００ＳＥＣカラム（２．５ｍＬ、４．６×１５０ｍｍ、ステンレス鋼、１．７μｍ粒子）を使用して、ＵＰＬＣ－ＳＥＣを実施した。実行時間は、７分間からなり、注入毎の総容量は２．８ｍＬであり、ランニングバッファーのＨｙｃｌｏｎｅＤＰＢＳ／改変－カルシウム－マグネシウム（部品番号ＳＨ３００２８．０２）を０．４ｍｌ／分で用いた。溶出は、２００～４００ｎｍの範囲のＵＶ吸収によりモニターし、クロマトグラムを２８０ｎｍで抽出した。ピーク積分は、Ｅｍｐｏｗｅｒ３ソフトウエアを使用して実施した。

図６は、代表的なＷＴＦａｂヘテロ二量体対（Ｌ鎖にＦＬＡｇタグを含有する）、ならびに設計Ｆａｂヘテロ二量体対の代表（ＬＣＣＡ設計の９７３５、９７３７及び９７４０のＨ１Ｌ１Ｆａｂ構成要素）のＵＰＬＣ－ＳＥＣプロファイルである。一般に、設計Ｆａｂヘテロ二量体対は、ＷＴと比較して類似したＵＰＬＣ－ＳＥＣプロファイルを示した。

実施例９：二重特異性抗体フォーマットで定常ドメインまたは定常及び可変ドメインの修飾を含む同時発現セットにおけるヘテロ二量体の優先的対合の評価
ヘテロ二量体設計を、二重特異性抗体フォーマットにおいても特異的対合が可能であるかを決定するために評価した。この実施例において、特有の重鎖のヘテロ二量体化を促進するため、それぞれのヘテロ二量体の完全長重鎖のＦｃ領域を、一方の重鎖が修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、他方の重鎖が修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ及びＴ３９４Ｗを含む（ＥＵ番号付け）ように、非対称的に修飾した。

構築物の調製：
ヘテロ二量体設計を、次の二重特異性抗体：ａ）Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ、ｂ）Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ、及びｃ）トラスツズマブ／セツキシマブの文脈において試験した。Ｄ３Ｈ４４はヒト抗体であり、トラスツズマブはヒト化抗体であり、セツキシマブは、ヒトＩｇＧ１及びマウスＦｖ領域を含むキメラ抗体であることに、留意すること。設計によるアミノ酸修飾を含む、Ｄ３Ｈ４４、トラスツズマブ及びセツキシマブのＩｇＧ重鎖及び軽鎖をコードする構築物を、以下のように調製した。Ｄ３Ｈ４４、トラスツズマブ及びセツキシマブの重鎖及び軽鎖の塩基ＤＮＡ配列を、表３Ｃに示す。Ｄ３Ｈ４４、トラスツズマブ及びセツキシマブ軽鎖配列は、いくつかの配列がタグを欠いているが他の配列がＦＬＡＧまたはＨＡタグを含有していることを除いて、実施例３に記載されたとおりに調製した。Ｄ３Ｈ４４、トラスツズマブ及びセツキシマブ重鎖配列は、完全長重鎖が、ヒンジＣＨ２－ＣＨ３ドメインをコードするＩｇＧ１^＊０．１ＤＮＡ配列を付加することにより作り出し、修飾して、Ｆａｂ重鎖のＣＨ１ドメインのＣ末端に二量体化を促進した以外は、実施例３に記載されたとおりに調製した。基本となるＣ末端重鎖リジン残基が、Ｃ末端リジンクリッピング（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）に起因するＬＣ－ＭＳシグナル異種性を防止するために除去した（ＬａｗｒｅｎｃｅＷ．ＤｉｃｋＪｒ．ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００８）１００：１１３２－４３）。

アッセイフォーマット（ＳＭＣＡ）
ヘテロ二量体同時発現セット設計が優先的に対合して二重特異性抗体を形成する能力を、下記に記載されているように評価した。アッセイは、４つの鎖（一方の抗体からＨ１及びＬ１鎖、他方の抗体からＨ２及びＬ２鎖）を同時発現させること及び正確に形成された二重特異性抗体の存在を質量分析（ＬＣ－ＭＳ）の使用により検出することに基づいている。図８は、４つの出発ポリペプチド鎖、ならびにヘテロ二量体対の重鎖及び軽鎖の優先的対合の不在下でのこれらの出発ポリペプチドの同時発現の結果もたらされる潜在的な産物を示す概略図を提供する。２つの完全長重鎖構築物は、２つの特有の軽鎖構築物と同時発現して、１０個の可能な抗体種：Ｈ１－Ｌ１：Ｈ１－Ｌ１、Ｈ１－Ｌ２：Ｈ１－Ｌ２、Ｈ１－Ｌ１：Ｈ１－Ｌ２、Ｈ２－Ｌ１：Ｈ２－Ｌ１、Ｈ２－Ｌ２：Ｈ２－Ｌ２、Ｈ２－Ｌ１：Ｈ２－Ｌ２、Ｈ１－Ｌ１：Ｈ２－Ｌ１、Ｈ１－Ｌ２：Ｈ２－Ｌ２、Ｈ１－Ｌ２：Ｈ２－Ｌ１及びＨ１－Ｌ１：Ｈ２－Ｌ２を生じた。Ｈ１－Ｌ１：Ｈ２－Ｌ２種は、正確に対合した二重特異性抗体である（図８を参照すること）。好ましい種のＨ１－Ｌ１：Ｈ２－Ｌ２の量に関する他のものに対する相対的対合特異性を、ｐＡ精製及び脱グリコシル化の後にＬＣ－ＭＳを使用して決定した。可能であれば、鎖をタグ付けなしのままにしたが、全てのＭａｂ及び半Ａｂ種が互いに少なくとも５０Ｄａ異なっていることが条件であった。質量の差がこの可能性から外れたとき、Ｎ末端タグ（ＨＡまたはＦＬＡＧ）を、種の間に十分な質量の差を提供するために軽鎖に付加した。

二重特異性抗体の発現及び選別ステップを伴うこのアッセイは、ＳＭＣＡと呼ばれる。

質量分析法
同時発現セットにおけるＤ３Ｈ４４重鎖への優先的Ｄ３Ｈ４４軽鎖対合の程度を、プロテインＡ精製及び非変性脱グリコシル化の後に質量分析を使用して評価した。Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブヘテロ二量体はＦｃＮ連結グリカンのみを含有するので、この系を１つの酵素、Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）のみにより処理した。精製した試料を、ＰＮＧアーゼＦにより以下のように脱グリコシル化した。５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０中０．２ＵＰＮＧアーゼＦ／μｇの抗体を３７℃で一晩インキュベートし、最終タンパク質濃度を０．５ｍｇ／ｍＬにした。Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ及びトラスツズマブ／セツキシマブの系では、セツキシマブのＦａｂ領域における追加のＮ連結グリカンに起因して、系をＮ－グリコシダーゼＦ＋多数のエキソグリコシダーゼにより処理した。典型的には、４つの酵素混合物をこの目的に使用した。Ｎ－グリコシダーゼＦ、β－ガラクトシダーゼ（Ｐｒｏｚｙｍｅ）、β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）及びノイラミニダーゼである。Ｎ－グリコシダーゼＦは、ＦｃＮ連結グリカンを除去し、一方、エキソグリコシダーゼは、ＦａｂＮ連結グリカンを切断し均一コア構造のＭ３Ｆ（ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３Ｆｕｃ_１）にする。精製した試料を、４つの酵素混合物により以下のように脱グリコシル化した。０．２ＵＰＮＧアーゼＦ／μｇの抗体、０．００２Ｕ α－ノイラミニダーゼ／μｇの抗体、０．０００１Ｕ β－ガラクトシダーゼ／μｇの抗体及び５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．０中０．２Ｕ β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ／μｇの抗体を３７℃で一晩インキュベートし、最終タンパク質濃度を０．５ｍｇ／ｍＬにした。しかし、いくつかの場合において、３つの酵素処理（Ｎ－グリコシダーゼＦ、β－ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼ）が、ＬＣ－ＭＳ分析において試料構成要素の質量重複を避けるために好ましかった。これらの場合において、Ｆａｂグルカンを還元して、僅かに大きな構造のＧ０Ｆ（Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｆｕｃ_１ＧｌｃＮＡｃ_２）にした。精製された試料を、４つの試料混合物について記載されたものと同じ濃度及び条件を使用して、３つの酵素混合物により脱グリコシル化した。脱グリコシル化した後、試料を、ＬＣ－ＭＳ分析の前に４℃で保存した。

脱グリコシル化タンパク質試料を、ＩｏｎＭａｘエレクトロスプレーイオン源（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を介してＬＴＱ－ＯｒｂｉｔｒａｐＸＬ質量分析機（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に結合したＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣ系を使用する無処理ＬＣ－ＭＳによって、分析した。試料（５μｇ）を２．１×３０ｍｍＰｏｒｏｓＲ２逆相カラム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に注入し、以下の勾配条件：２０％の溶媒Ｂにより０～３分間、２０～９０％の溶媒Ｂにより３～６分間、９０～２０％の溶媒Ｂにより６～７分間、２０％の溶媒Ｂにより７～９分間を使用して、分解した。溶媒Ａは、脱ガスした０．１％ギ酸水溶液であり、溶媒Ｂは、脱ガスしたアセトニトリルであった。流速は３ｍＬ／分であった。カラムの後で流れを分けて、１００μＬをエレクトロスプレー界面に向けた。カラムを８２．５℃に加熱し、溶媒を８０℃にプレカラム（ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎ）加熱して、タンパク質ピーク形状を改善した。ＬＴＱ－ＯｒｂｉｔｒａｐＸＬを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＬＴＱ－ＰｏｓｉｔｉｖｅＩｏｎＥＳＩ較正溶液（カフェイン、ＭＲＦＡ及びＵｌｔｒａｍａｒｋ１６２１）の使用により較正し、１０ｍｇ／ｍＬのＣｓＩの溶液の使用により調整した。コーン電圧（源断片化設定）は４０Ｖであり、ＦＴ分解は７，５００であり、走査範囲は、ｍ／ｚ４００～４，０００であった。ＬＴＱ－ＯｒｂｉｔｒａｐＸＬを、標的タンパク質の最適な検出のために調整した（＞５０ｋＤａ）。

完全サイズ抗体（ｍ／ｚ２０００～３８００）及び半抗体（ｍ／ｚ１４００から２０００）からの複数荷電イオンを含有する範囲を、器具制御及びデータ分析ソフトウエアである、ＭａｓｓＬｙｎｘのＭａｘＥｎｔ１モジュール（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して別々にデコンボリューションし、分子量プロファイルにした。簡潔には、生のタンパク質ＬＣ－ＭＳデータを、最初に、Ｘｃａｌｉｂｕｒのスペクトル観察モジュールであるＱｕａｌＢｒｏｗｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により開き、Ｗａｔｅｒから提供されるファイル変換プログラムであるＤａｔａｂｒｉｄｇｅを使用して変換して、ＭａｓｓＬｙｎｘに適合させた。変換されたタンパク質スペクトルを、ＭａｓｓＬｙｎｘのＳｐｅｃｔｒｕｍモジュールにより観察し、ＭａｘＥｎｔ１の使用によりデコンボリューションした。それぞれの試料における異なる抗体種の存在量を、得られた分子量プロファイルから直接決定した。

ＳＭＣＡアッセイにおける代表的な設計
高い平均ＬＣＣＡ性能値を有する合計２５個の代表的な設計を、ＳＭＣＡフォーマットで試験するため、クラスター１～１２から選択した。代表的な設計は、類似したドライバーを使用するが、類似した突然変異も共有する、類似した空間を占有する対応する設計セットに基づいて選択した。少なくとも１つの代表的な設計を、それぞれのクラスターから選択した。いくつかのクラスターは、１つの代表的設計を代表とした（すなわち、クラスター１、５、７、８、１０である）。残りのクラスターは、クラスターが大きい（すなわち、クラスター２）か、または小さいクラスターから構成された（すなわち、クラスター３、４、６、９、１１及び１２）ので、１つを超える代表的設計を有した。それぞれのクラスター内の設計は、配列類似性を共有したが、クラスター内の小さいクラスターは、少なくとも１つのドライバーと突然変異のセットによって異なっていた。小さいクラスターにより構成されたクラスターでは、追加の代表的設計を小さいクラスターそれぞれから選択した。

それぞれのクラスターにおけるアミノ酸置換が表１５～２７に網羅されており、それぞれのクラスター／小さいクラスターにおける対応する代表が示されている。クラスター１では、１つの設計（９１３４－９５２１）のみがクラスターを代表するために選択されており、それは、これらの設計が類似した空間を占有する類似した静電ドライバーを利用したからである（表１５を参照すること）。このクラスターの全てのメンバーでは、Ｈ１を、陰性荷電置換（Ｌ１２４Ｅ及びＱ１７９Ｅ）がＬ１の陽性荷電置換（Ｓ１７６Ｒ及びＳ１３１ＫまたはＳ１３１Ｒのいずれか）と塩架橋を形成できるように設計した。Ｈ２を、陽性荷電置換（Ｌ１２４Ｒ及びＱ１７９ＫまたはＳ１８６Ｋのいずれか）が、Ｌ２の陰性荷電置換（Ｓ１７６Ｄ及びＴ１７８ＤもしくはＴ１７８Ｅのいずれか、ならびに／またはＴ１８０Ｅ）と塩架橋を形成できるように設計した。不適合な対合のＨ１Ｌ２及びＨ２Ｌ１は、主に静電反発によって退けられる。

クラスター２では、２つの代表的設計（９２７９－９５１８及び９２８６－９４０２）が大きなクラスターを表すために選択された（表１６を参照すること）。このクラスター内の設計は、類似した空間を占有する類似した静電ドライバーを利用した。このクラスターの全てのメンバーでは、Ｈ１を、陰性荷電置換（Ｌ１２４Ｅ及びＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ）がＬ１の陽性荷電置換（Ｓ１７６Ｒ、ならびに（Ｑ１２４Ｋ及び／もしくはＴ１７８Ｋ）または（Ｑ１２４Ｋ及びＱ１６０Ｋ）のいずれかの組み合わせ）と塩架橋を形成できるように設計した。Ｈ２を、陽性荷電置換（Ｌ１２４Ｒ及びＱ１７９ＫまたはＳ１８６Ｋ若しくはＳ１８６Ｒ）が、Ｌ２の陰性荷電置換（Ｓ１７６Ｄ及びＴ１７８ＤもしくはＴ１７８Ｅ、ならびに／またはＴ１８０Ｅ）と塩架橋を形成できるように設計した。不適合な対合のＨ１Ｌ２及びＨ２Ｌ１は、主に静電反発によって退けられる。

クラスター３では、５つの代表的設計（９３３８－９７４８、９８１５－９８２５、６０５４－９３２７、９０６６－９３３５及び９１２１－９３７３）が５つの小さいクラスターを表すために選択された（表１７を参照すること）。このクラスターの全てのメンバーは、Ｈ１（Ｌ１２４Ｅ）、Ｌ１（Ｓ１７６Ｒ）、Ｈ２（Ｌ１２４Ｒ）及びＬ２（Ｓ１７６Ｄ）に類似した静電ドライバーを利用し、このことは、優先的に対合したヘテロ二量体において塩架橋の形成を可能にし、一方、不適合な対は、主に静電反発によって退けられる。主に定常領域ドライバーを利用する設計を表すため、６０５４－９３２７設計を選択して、これらの小さいクラスターの代表とした。これらの静電相互作用に加えて、１つの小さいクラスターは、可変領域立体ドライバー（Ｈ１にＬ４５Ｐ及びＬ１にＰ４４Ｆ）も含み、したがって可変領域ドライバーを含む代表を、この小さいクラスターを表すために選択した（９３３８－９７４８）。別の小さいクラスターは、両方のＦａｂヘテロ二量体に可変領域静電ドライバー（Ｈ１にＱ３９Ｅ、Ｌ１にＱ３８Ｒ、Ｈ２にＱ３９Ｒ、Ｌ２にＱ３８Ｅ）も含み、したがって、この可変領域ドライバーを含む代表を、この小さいクラスターを表すために選択した（９８１５－９８２５）。更に、１つの小さいクラスターは、１つのメンバーから構成され、したがって、１つの代表的設計（９０６６－９３３５）は、Ｈ１のＦ１２２ＣとＬ１のＱ１２４Ｃの間に改変ジスルフィドを含む。残りの小さいクラスターは、９１２１－９３７３により代表され、Ｈ１にＨ１７２Ｔ及びＬ１にＳ１７４Ｒの追加の置換を有する定常領域ドライバーを主に利用して、Ｈ１Ｌ１定常領域ドライバーの相互作用を僅かに修飾し、同時に、ＨＣ２におけるＨ１７２Ｒの効果も探索した。

クラスター４では、２つの代表的設計（９１６８－９３４２及び９１１８－６０９８）がそれぞれ２つの小さなクラスターを表すために選択された（表１８を参照すること）。このクラスターの全てのメンバーは、Ｈ１（Ｌ１２４Ｅ）、Ｌ１（Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ）、Ｈ２（Ｌ１２４Ｒ）及びＬ２（Ｓ１７６Ｄ）に類似した静電ドライバーを利用し、このことは、優先的に対合したヘテロ二量体において塩架橋の形成を可能にし、一方、不適合な対は、主に静電反発によって退けられる。１つの小さなクラスターは、９１１８－６０９８により代表され、優先的対合に共有静電ドライバーを主に利用し、一方、９１６８－９３４２により代表される他の小さいクラスターは、追加の塩架橋の形成を可能にする、Ｈ１（Ｋ２２８Ｄ）及びＬ１（Ｓ１２１Ｋ）の置換を更に利用した。

クラスター５は、特有の識別子９１１６－９３４９により代表され、１つのメンバーのみにより構成される（表１９を参照すること）。この設計は、Ｈ１（Ｌ１２４Ｅ）、Ｌ１（Ｓ１７６Ｒ）、Ｈ２（Ｌ１２４Ｒ）及びＬ２（Ｓ１７６Ｄ）での静電ドライバー、ならびＨ１（Ａ１３９Ｗ）、Ｌ１（Ｆ１１６Ａ＿Ｖ１３３Ｇ＿Ｌ１３５Ｖ）、Ｈ２（Ａ１３９Ｇ＿Ｖ１９０Ａ）及びＬ２（Ｖ１３３Ｇ＿Ｌ１３５Ｗ）での立体ドライバーの両方を利用した。その結果、優先的に対合したヘテロ二量体では、荷電置換は、塩架橋の形成を可能にする。誤対合Ｆａｂヘテロ二量体では、形成は、静電反発と追加的な立体効果によって退けられる。

クラスター６では、２つの代表的設計が、それぞれ２つの小さなクラスターを表すために選択された（表２０を参照すること）。このクラスターの全てのメンバーは、定常領域に類似した静電ドライバー（Ｈ１にＱ１７９Ｅ、Ｌ１にＳ１３１Ｋ、Ｈ２にＳ１８６Ｒ、ならびにＬ２にＱ１２４Ｅ、Ｑ１６０Ｅ及びＴ１８０Ｅ）を利用し、このことは、優先的に対合したヘテロ二量体において塩架橋の形成を可能にし、一方、不適合な対は、主に静電反発によって退けられる。加えて、小さなクラスターは、異なる可変領域ドライバーからも構成された。１つの小さいクラスターは、特有の識別子９８１４－９８２８により代表され、可変領域に静電ドライバー（Ｈ１にＱ３９Ｅ、Ｌ１にＱ３８Ｒ、Ｈ２にＱ３９Ｒ及びＬ２にＱ３８Ｅ）を利用した。他の小さなクラスターは、Ｈ１でのＬ４５Ｐ及びＬ１でのＰ４４Ｆから構成される可変領域立体ドライバーを利用した。その結果、この小さなクラスターでは、不適合な対合は、導入された立体効果によって更に退けられる。この小さいクラスターは、Ｌ２におけるＱ３８Ｅの不在のみが異なる、特有の識別子９７４５－９０７５から誘導された設計により代表される。

クラスター７では、１つの設計（９０６０－９７５６）のみがクラスターを代表するために選択されており、それは、これらの設計が類似した静電及び立体ドライバーを利用したからである（表２１を参照すること）。共有静電ドライバーは、Ｈ１でのＬ１４３Ｅ及びＱ１７９Ｅ、Ｌ１でのＱ１２４Ｒ、Ｈ２でのＱ１７９Ｋ、ならびにＬ２でのＱ１２４Ｅ、Ｑ１６０Ｅ及びＴ１８０Ｅから構成された。共有立体ドライバーは、Ｈ１でのＡ１３９Ｗ、Ｌ１でのＦ１１６Ａ＿Ｌ１３５Ｖ及びＬ２でのＬ１３５Ｗから構成された。その結果、優先的に対合したヘテロ二量体では、Ｆａｂ領域における荷電置換は、塩架橋の形成を可能にする。誤対合ヘテロ二量体では、形成は、静電反発と追加的な立体効果によって退けられる。

クラスター８では、１つの設計（９８２０－９８２３）のみがクラスターを代表するために選択されており、それは、これらの設計が類似した静電ドライバーを利用したからである（表２２を参照すること）。この可変領域において、Ｈ１にＱ３９Ｅ、Ｌ１にＱ３８Ｒ、Ｈ２にＱ３９Ｒ及びＬ２にＱ３８Ｅを利用した。定常領域において、Ｈ１にＬ１４３Ｅ、Ｌ１にＱ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒ、Ｈ２にＱ１７９Ｋ、ならびに及びＬ２にＱ１２４Ｅ、Ｑ１６０Ｅ及びＴ１８０Ｅを利用した。優先的対合するヘテロ二量体では、Ｆａｂ領域における荷電置換は、塩架橋の形成を可能にするが、誤対合ヘテロ二量体では、形成は主に静電反発によって退けられる。

クラスター９では、２つの代表的設計が、それぞれ２つの小さなクラスターを表すために選択された（表２３を参照すること）。このクラスターの全てのメンバーは、定常領域に類似した静電ドライバー（Ｈ１にＬ１４３Ｅ、Ｌ１にＱ１２４Ｒ、Ｈ２にＱ１７９Ｋ、ならびにＬ２にＱ１２４Ｅ、Ｑ１６０Ｅ及びＴ１８０Ｅ）を利用し、このことは、優先的に対合したヘテロ二量体において塩架橋の形成を可能にし、一方、不適合な対は、主に静電反発によって退けられる。加えて、小さいクラスターは、可変領域ドライバー（Ｈ１にＬ４５Ｐ及びＬ１にＰ４４Ｆ）の存在／不在によって異なる。その結果、可変領域ドライバーを含む小さなクラスターでは、不適合な対合は、導入された立体効果によって更に退けられる。可変領域ドライバーを含むこの小さいクラスターの代表的設計は、Ｌ２におけるＱ３８Ｅの不在のみが異なる、特有の識別子９７５１－９０６５から誘導された。可変領域置換を各小さいクラスターの代表的設計は、９６１１－９０７７である。

クラスター１０では、１つの設計（９５６１－９０９５）のみがクラスターを代表するために選択されており、それは、これらの設計が類似した空間を占有する類似した静電及び立体ドライバーを利用したからである（表２４を参照すること）。共有静電ドライバーは、Ｈ１でのＬ１４３Ｅ及びＱ１７９Ｅから構成され、同様に、Ｌ１のＱ１２４Ｒ、Ｑ１２４ＫまたはＳ１３１Ｋ、Ｈ２のＱ１７９Ｋ、ならびにＬ２のＱ１２４Ｅ及びＴ１８０Ｅに位置した。共有立体ドライバーは、Ｈ１でのＬ１２４Ｗ、Ｌ１でのＶ１３３Ａ及びＬ２でのＶ１３３Ｗから構成された。その結果、優先的に対合したヘテロ二量体では、Ｆａｂ領域における荷電置換は、塩架橋の形成を可能にする。誤対合ヘテロ二量体では、形成は、静電反発と追加的な立体効果によって退けられる。

クラスター１１では、３つの代表的設計（９０４９－９７５９、９６８２－９７４０及び９６６７－９８３０）が、それぞれ３つの小さなクラスターを表すために選択された（表２５を参照すること）。このクラスターの全てのメンバーは、ヘテロ二量体の優先的対合を導くために静電置換を利用した。その結果、優先的に対合したヘテロ二量体では、Ｆａｂ領域における荷電置換は、塩架橋の形成を可能にする。誤対合ヘテロ二量体では、形成は、主に静電反発よって退けられる。特有の識別子９６６７－９８３０により代表される小さいクラスターでは、共有置換は、Ｈ１に陰性荷電置換（Ｌ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ及びＱ１７９ＥまたはＱ１７９Ｄ）、Ｌ１に陽性荷電置換（Ｔ１７８ＲまたはＴ１７８Ｋ）、Ｈ２に陽性荷電置換（Ｓ１８６ＫもしくはＳ１８６Ｒ、またはＱ１７９ＫもしくはＱ１７９Ｒ）、ならびにＬ２に陰性荷電置換（Ｑ１２４Ｅ）を含んだ。別の小さいクラスターは、この小さいクラスターの単一のメンバー（特有の識別子９０４９－９７５９）により代表され、改変ジスルフィド結合の形成のために置換を追加的に含有した。残りのクラスターは、特有の識別子９６８２－９７４０により代表され、他の２つの小さいクラスターと類似したドライバーをＨ１及びＬ１に利用したが、異なった定常領域Ｈ２及びＬ２ドライバーを利用した。Ｈ２は、Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋを利用し、Ｌ２は、Ｑ１２４Ｅ置換（他の２つの小さいクラスターと共有している）に加えて、Ｖ１３３ＥまたはＶ１３３Ｄを利用した。

クラスター１２では、４つの代表的設計（９６９６－９８４８、９９８６－９９７８、９６９２－９８４６及び９５８７－９７３５）がそれぞれ、４つの小さなクラスターを表すために選択された（表２６を参照すること）。このクラスターの全てのメンバーは、ヘテロ二量体の優先的対合を導くために静電置換を利用した。いくつかのメンバーは、立体ドライバーを追加的に利用した。特有の識別子９６９６－９８４８により代表される小さいクラスターは、静電及び立体ドライバーの両方を利用した。この小さいクラスターにおいて共有されている静電置換は、Ｈ１でのＬ１４３Ｅ、Ｌ１でのＱ１２４Ｒ及びＴ１７８Ｒから構成され、同様に、Ｈ２のＳ１８６ＫもしくはＳ１８６Ｒ、またはＱ１７９ＫもしくはＱ１７９Ｒ、ならびにＬ２のＱ１２４Ｅ及びＴ１８０Ｅに位置している。このクラスターにおいて共有されている立体置換は、Ｈ１でのＳ１８８Ｌ及びＬ２でのＳ１７６ＬまたはＶ１３３ＹもしくはＶ１３３Ｗから構成され、Ｌ２でＶ１３３ＹまたはＶ１３３Ｗを利用する設計では、Ｌ１４３ＡまたはＬ１２４ＡもＨ２に存在して、嵩高い突然変異を有した。特有の識別子９６９２－９８４６により代表される小さいクラスターでは、特有の識別子９６９６－９８４８により代表される小さいクラスターと比較して、類似した静電ドライバーが利用され、いくつかのメンバーでは、類似して位置する置換Ｔ１７８Ｅが、Ｔ１８０Ｅの代わりにＬ２において利用された。更に、この小さいクラスターのサブセットも、類似した立体ドライバーを利用し、類似して位置する置換のＴ１７８ＹまたはＴ１７８ＦをＳ１７６Ｌの代わりにＬ２において利用した。特有の識別子９９８６－９９７８により代表される小さいクラスターは、優先的対合を導くために１つの静電ドライバーのみを利用した。類似した共有置換は、Ｈ１、Ｌ１及びＨ２に利用されたが、異なるＬ２置換（Ｓ１３１Ｅ）が利用された。残りの小さいクラスターは、特有の識別子９５８７－９７３５により代表され、Ｈ１及びＬ１に類似した静電ドライバーを利用したが（Ｌ１のＴ１７８Ｒがこの小さなクラスター内の全てのメンバーに利用されなかったことを除いて）、異なる静電クラスターがＨ２（Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ）及びＬ２（Ｑ１２４Ｅ及びＶ１３３ＥまたはＱ１２４Ｅ及びＶ１３３Ｄ）において利用された。この小さなクラスター内の小数のメンバーは、Ｈ１でのＳ１８８Ｌ及びＬ２でのＳ１７６Ｌから構成される類似した立体ドライバーも利用した。全体的に、優先的に対合したヘテロ二量体では、Ｆａｂ領域における荷電置換は、塩架橋の形成を可能にする。誤対合ヘテロ二量体では、形成は、静電反発よって退けられる。更に、立体ドライバーも利用する設計では、形成は、立体効果によって追加的に退けられる。クラスター１３は、１つのメンバー９１２２－９３７１から構成される（表２７を参照すること）。この設計は、Ｈ１のＦ１２２ＣとＬ１のＱ１２４Ｃの間に、ヘテロ二量体の優先対合の共有結合性ドライバーとして、改変ジスルフィドを利用した。加えて、設計が天然の鎖間ジスルフィドを欠いているので、ジスルフィド結合の形成は、非還元的及び還元的ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって確認した。この設計は、ＳＭＣＡフォーマットで試験しなかったが、改変ジスルフィドは、天然の鎖間ジスルフィドの存在下で、追加の定常領域ドライバーと組み合わせて試験した（クラスター３、代表的設計９０６６－９３３５）。

形質移入方法
２つの重鎖及び２つの軽鎖の構築物を含む同時発現セットを、ＣＨＯ－３Ｅ７細胞に以下のように形質移入した。ＣＨＯ－３Ｅ７細胞を、４ｍＭのグルタミン及び０．１％のＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号２４０４０－０３２）を補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ－１３８３５０１）において、１．７～２×１０^６細胞／ｍｌの密度により、３７℃で培養した。総量の５０ｍｌに対し、ＰＥＩ－ｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓカタログ番号１１５－０１０）の使用により、ＤＮＡ：ＰＥＩ比＝１：２．５で、合計５０μｇのＤＮＡにより形質移入した。ＤＮＡ－ＰＥＩ混合物を添加した２４時間後、細胞を３２℃に移し、採取する前に７日間インキュベートした。培養培地を遠心分離により採取し、Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ０．２μＭフィルターを使用し真空濾過した。次に、濾過した培養培地を、プロテインＡＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ番号１７－５４３８－０２）の使用により以下のように精製した。濾過した培養培地を、予めＰＢＳで平衡にしたカラム（ＨｙｃｌｏｎｅＤＰＢＳ／ｍｏｄｉｆｉｅｄ、カルシウムなし、マグネシウムなし、番号ＳＨ－３０００２８．０２）に適用した。次にヘテロ二量体抗体種を、ＰＢＳで洗浄し、１００ｍＭのクエン酸塩ｐＨ３．６により、Ａｍｉｃｏｎｕｌｔｒａ１５遠心分離フィルターＵｌｔｒａｃｅｌ１０Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ番号ＳＣＧＰ００５２５）に溶出した。次に緩衝液をＰＢＳ交換して、試料を、脱グリコシル化及びＬＣ－ＭＳの前に、カリパスにより評価した。

１つの系の軽鎖が両方のＡｂ系の重鎖と優先的に結合する、野生型二重特異性Ａｂ系に本質的な二重特異性系偏向を評価するため、Ｈ１：Ｈ２：Ｌ１：Ｌ２のＤＮＡ比のセットをＣＨＯ発現において試験した。これらの比は、２つの異なる抗体の重鎖及び軽鎖の発現レベルにおける天然の差及び／または固有の対合偏向を補うように試みる。全ての二重特異性Ａｂ系において、偏向は、試験した全ての比にわたって観察された（図９）。Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ系では、偏向は、トラスツズマブに向かって観察され、すなわち、Ｄ３Ｈ４４重鎖は、トラスツズマブ軽鎖と優先的に対合する（図９ａを参照すること）。Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブでは、偏向は、セツキシマブに向かって観察され、すなわち、Ｄ３Ｈ４４重鎖は、セツキシマブ軽鎖と優先的に対合する（図９ｂを参照すること）。トラスツズマブ／セツキシマブ系では、偏向は、トラスツズマブに向かって観察され、すなわち、セツキシマブ重鎖は、トラスツズマブ軽鎖と優先的に対合する（図９ｃを参照すること）。

それぞれの二重特異性Ａｂ系における２５個の代表的な設計のそれぞれにおける試験では、使用されたＨ１：Ｈ２：Ｌ１：Ｌ２ＤＮＡ比は、最大量の二重特異性Ａｂ種を生じ、同時に低量の半Ａｂを有する、対応する野生型二重特異性系からの比であった（表３２ａ、ｂ及びｃを参照すること）。Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ系では、使用された比は、１５（Ｈ１）、１５（Ｈ２）、５３（Ｌ１）、１７（Ｌ２）であり、ここでＨ１及びＬ１は、Ｄ３Ｈ４４を参照し、Ｈ２及びＬ２は、トラスツズマブを参照する。Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ系では、使用された比は、１５（Ｈ１）、１５（Ｈ２）、１７（Ｌ１）、５３（Ｌ２）であり、ここでＨ１及びＬ１は、トラスツズマブを参照し、Ｈ２及びＬ２は、セツキシマブを参照する。Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ系では、使用された比は、１５（Ｈ１）、１５（Ｈ２）、５３（Ｌ１）、１７（Ｌ２）であり、ここでＨ１及びＬ１は、Ｄ３Ｈ４４を参照し、Ｈ２及びＬ２は、セツキシマブを参照する。

更に、一方の配向において、Ｈ１Ｌ１及びＨ２Ｌ２に存在する置換を二重特異性Ａｂ系の抗体１（Ａｂ１）及び抗体２（Ａｂ２）のそれぞれにおいて試験し、もう一方の「反転」配向において、Ｈ１Ｌ１及びＨ２Ｌ２に存在する置換をＡｂ２及びＡｂ１のそれぞれにおいて試験するように、設計はＤ３Ｈ４４／セツキシマブ及びトラスツズマブ／セツキシマブ二重特異性系を両方の配向で試験した（表２８ａ及びｂを参照のこと）。特有の識別子に付けられた「＿１」は、より強いＬＣＣＡ優先的対合結果を与える重鎖及び関連軽鎖置換（表１３ａを参照すること）が、重鎖が他の抗体の軽鎖と比較して関連軽鎖と弱く競合する抗体に配置された設計を指す。特有の識別子に付けられた「＿２」は、より強いＬＣＣＡ優先的対合結果を与える重鎖及び関連軽鎖置換（表１３ａを参照すること）が、重鎖が他の抗体の軽鎖と比較して関連軽鎖と弱く競合する抗体に配置された、反対側の「反転」配向を指す。Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ系では、設計を、「＿１」配向のみで試験した（表２８ｃを参照すること）。

ＳＭＣＡの結果
Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ系を、１つの酵素（ＰＮＧアーゼＦ）のみで処理し、完全に脱グリコシルした。多酵素処理では、Ｆａｂ領域に結合した糖を一般的には切断して、コアＭ３Ｆ（４つの酵素処理を使用）またはＧ０Ｆ（３つの酵素を使用）のいずれかにした。全体的に、大部分の場合では、脱グリコシル化処理は、ＬＣ－ＭＳにより特定される可能な異なる種を全て特定する能力をもたらした。多くの場合において、それぞれの種は、単一のＬＣ－ＭＳピークにより表された。例外には、望ましい二重特異性種に対応する可能性もある副ピーク（ｓｉｄｅｐｅａｋ）（おそらく、付加物またはリーダーペプチドの切断による異種性）が含まれるが、副ピークの曖昧さに起因して、これらの副ピークは、二重特異性種への寄与について考慮しなかった。加えて、Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ（３５１９＿１、３５２２＿１）及びトラスツズマブ／セツキシマブ（９７４８－９３３８＿１）系におけるいくつかの設計は、結合した高マンノースの変動性のため、種を説明するのに多数のピークを必要とした。これらの設計は、全て、セツキシマブ軽鎖にグリコシル化部位を導入していた。いくつかの場合において、種間の低い質量分離（すなわち、５０Ｄａ未満の差）に起因して、いくつかの少数種（全ての種の５％未満を構成する）を区別することが可能ではなかった。更に、所望の二重特異性種Ｈ１－Ｌ１＿Ｈ２－Ｌ２は、一般に、誤対合型のＨ１－Ｌ２＿Ｈ２－Ｌ１とは、ＬＣ／ＭＳに基づいて実験的に区別することができない。このように、二重特異性含有量が表に報告されるとき、この種の誤対合種を含有しないことを完全に除外することができない。しかし、Ｈ１－Ｌ２＿Ｈ１－Ｌ２及びＨ２－Ｌ１＿Ｈ２－Ｌ１、ならびにＨ１－Ｌ２及びＨ２－Ｌ１半抗体などの種において観察される非常に低い含有量は、二重特異性種の、あるとしても非常に少ない汚染が生じることを示している。

ＬＣ－ＭＳデータを、表２９ａ、２９ｂ及び２９ｃに表す。比較のため、野生型データも表３３ａ、３３ｂ及び３３ｃに表し、「ＳＭＣＡ特有識別子」の縦列、ならびに「クラスター」の縦列に「ＮＡ」と示している。３つの二重特異性野生型系は、全て、１つの軽鎖が両方の重鎖と優位に結合するように偏った偏向を示した（表３３及び図９を参照すること）。更に、少なくともトラスツズマブ／セツキシマブ系において、タグ配置もＨ１Ｌ１及びＨ２Ｌ２対合に有意な影響を有すると思われる。したがって、野生型に対する、所望の二重特異性種の移行可能性及び率への設計の効果を評価するため、対応する野生型二重特異性構築物との同じＨ１：Ｈ２：Ｌ１：Ｌ２ＤＮＡ比での比較を実施し、「野生型に対するＨ１Ｌ１対合の割合（％）の変化（全てのＨ１種に対する）」、「野生型に対するＨ２Ｌ２対合の割合（％）の変化（全てのＨ２種に対する）」及び「野生型に対するＨ１：Ｈ２：Ｌ１：Ｌ２の割合（％）の変化」（完全サイズ抗体種のみを考慮）の縦列に報告した（表２９を参照すること）。Ｈ１Ｌ１対合割合（％）（全てのＨ１種に対する）またはＨ２Ｌ２対合割合（％）（全てにＨ２種に対する）のいずれかの評価では、全ての種をＦａｂ領域における対合について評価する。対応する野生型二重特異性種抗体がＳＭＣＡにより評価されない場合、比較は、類似した野生型構築物において行った。推定値は、報告された値のすぐ隣りの「^＊＊＊」により示される。比較のために選択された類似した野生型構築物を、以下の様に選択した。移行可能性を評価するため、それぞれの野生型構築物を、最高の「Ｈ１Ｌ１対合の割合（％）及びＨ２Ｌ２対合の割合（％）（全ての種に対する）」を示したＳＭＣＡ実験（異なる比で実施した）により表した。野生型に対する、所望の二重特異性種の率への設計の効果を評価するため、それぞれの野生型構築物を、最高のＨ１：Ｈ２：Ｌ１：Ｌ２の割合（％）（完全サイズ抗体種のみを考慮）を示したＳＭＣＡ実験（異なる比で実施した）により表した。両方の場合において、二重特異性種における全ての野生型構築物のうち、中央値を比較用野生型値として選択した。

それぞれの設計において、移行可能性は、ＷＴに関して全ての種にわたる全体的なＨ：Ｌ対合における、特にＨ１Ｌ１／全てのＨ１種の割合（％）及び／またはＨ２Ｌ２／全てのＨ２種の割合（％）における増加に注目することによって、評価した。加えて、所望の二重特異性種の率に対する効果も評価され、半抗体が、存在する場合、分取ＳＥＣにより、または更なるＨ１：Ｈ２：Ｌ１：Ｌ２ＤＮＡ滴定により除去／最小化され得るので、完全サイズ抗体種のみの比較が強調される。表３０ａ、ｂ及びｃは、分取ＳＥＣが、半Ａｂ種の除去／最小化に有効であり得ることを示す。表３２ａ、ｂ及びｃは、半Ａｂ種の率も、様々なＤＮＡ滴定比を使用した形質移入の際に操作され得ることを示す。

Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ系では（表２９ａ）、１つの設計（９３２７－６０５４＿２）を除いてすべての設計が、野生型に関して全ての種にわたるＨ１Ｌ１対合により評価して、移行された。大部分の設計（９３２７－６０５４＿２及び９１３４－９５２１＿２を除く）も、完全Ａｂ種のみを考慮すると、所望の二重特異性抗体の率の増加を示した。更に、移行しなかった１つの設計（９３２７－６０５４＿２）を除いて、設計は、野生型において観察された主な誤対合抗体種（Ｈ１Ｈ２Ｌ２Ｌ２）を減少した。加えて、９３２７－６０５４＿２及び他方の配向における対応する９３２７－６０５４＿１を除いて、設計は、両方の配向で移行され、大部分の設計は、両方の配向で類似した有効なＨ：Ｌ対合を示した。

Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ系では（表２９ｂ）、すべての設計が、野生型に関して全ての種にわたるＨ１Ｌ１対合により評価して、移行された。加えて、全ての設計が、所望の二重特異性抗体の率の増加を示した（完全Ａｂ種のみを考慮した場合）。更に、大部分の設計は、野生型に観察される主な誤対合抗体種（Ｈ１Ｈ２Ｌ２Ｌ２）を有意に減少した。しかし、発現を欠いていたため、９６１１－９０７７＿１についてデータは報告されなかった（表２８ｃ）。

トラスツズマブ／セツキシマブ系では（表２９ｃ）４９個の設計のうち少なくとも３５個は、全てのＨ２種にわたってＨ２Ｌ２対合を評価して、移行可能性を示した（「野生型に対するＨ２Ｌ２対合％の変化（全てのＨ２種に対する）」の縦列における正の値）。移行しなかったと考えられる設計には、９２７９－９５１８＿２、３５２２＿２、９８１５－９８２５＿２、９３２７－６０５４＿２、９１１８－６０９８＿２、９７４８－９３３８＿２、９６９２－９８４６＿２、９５８７－９７３５＿２、９８１４－９８２８＿２、３５１９＿２、９９８６－９９７８＿２、９１６８－９３４２＿２及び９０６６－９３３５＿１が含まれるが（「野生型に対するＨ２Ｌ２対合割合（％）の変化（全てのＨ２種に対する）」の縦列における負の値）、他方の配向の設計は、移行可能性を阻害しなかった（９２７９－９５１８＿１は、試料を欠いていたので試験しなかったことに留意すること）。移行可能性を示した全ての設計は、野生型実験において観察された主な誤対合抗体種（Ｈ１Ｈ２Ｌ１Ｌ１）の率の減少を示した。加えて、移行した設計のうち、２つの設計（９１３４－９５２１＿１及び９２７９－９５１８＿２）のみが、野生型と比較して、完全抗体種のみを考慮したときに所望の二重特異性Ａｂの率に減少を示した。

一般に、弱い競合抗体のＨ：Ｌ対合を増加した大部分の設計は、所望の二重特異性種（完全サイズ抗体のみを考慮）の率の増加によってもたらされた。配向に関して、大部分の設計は「＿１」配向において、「＿２」は移行と比較したＨ：Ｌ対合と比較して類似した、または良好な移行可能性を示した（例外は、トラスツズマブ／セツキシマブ系において主に観察されたものであった）。更に、表３５ａは、試験した３つの二重特異性系（Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ、Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ及びトラスツズマブ／セツキシマブ）の全てにおいて両方の配向で移行した設計を網羅する。表３５ｂは、試験した３つの二重特異性系（Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ、Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ及びトラスツズマブ／セツキシマブ）の全てにおいて一方の配向で移行した設計、ならびに唯一の二重特異性系においてもう一方の配向で移行した設計を網羅する。加えて、特定の配向において、同じ突然変異が３つの二重特異性系の重鎖及び弱く競合する同族軽鎖に存在し、軽鎖の利用は、少なくとも１０％を超える。

クラスターの移行可能性及び性能に関して、Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ二重特異性系では、全てのクラスター内の全てのメンバーが、移行可能性を示し（図１１ａを参照すること）、所望の二重特異性抗体（完全サイズ抗体のみを考慮）の率を増加させた（図１１ｂを参照すること）。Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ二重特異性系では、全てのクラスターが移行可能性を示し、クラスター３における１つのメンバーのみが、野生型と比較して、全てのＨ１種にわたりＨ１Ｌ１対合に減少を示した（図１１ｃを参照すること）。また、全てのクラスターは、野生型に対する所望の二重特異性抗体の率（完全長抗体のみを考慮）に増加を示したメンバーを含んだが、３つのクラスター（クラスター１、３及び４）は、野生型に対する所望の二重特異性抗体の率（完全長抗体のみを考慮）に減少を示したメンバーも含んだ（表１１ｄを参照すること）。トラスツズマブ／セツキシマブ二重特異性系に関して、全てのクラスターは、望ましい移行可能性を示す変種を含むが、いくつかのクラスター（１、５、７、８、１０、１１）のみが、対応するメンバーの全てが移行可能性を示した変種を含む（図１１ｅを参照すること）。加えて、全てのクラスターは、野生型に関して所望の二重特異性抗体の率（完全サイズ抗体のみを考慮）に増加を示すメンバーを含む（図１１ｆを参照すること）。全てのメンバーが移行可能性を示したクラスターでは、クラスター５、７、８、１０及び１１における全てのメンバーが野生型に関して所望の二重特異性抗体の率（完全サイズ抗体のみを考慮）に増加も示した。

全体的に、３つの二重特異性系を全て一緒に考慮すると、クラスター１、５、７、８、１０及び１１における全てのメンバーは、移行可能性を示し（図１１ｇを参照すること）、クラスター５、７、８，１０及び１１は、全てのメンバーが野生型に関して所望の二重特異性抗体の率（完全サイズ抗体のみを考慮）に増加を示したメンバーを含んだ（図１１ｈを参照すること）。

全体的に、弱い競合抗体のＨ：Ｌ対合を増加した大部分の設計は、所望の二重特異性種（完全サイズ抗体のみを考慮）の率の増加によってもたらされた。配向に関して、大部分の設計は「＿１」配向において、「＿２」は移行と比較したＨ：Ｌ対合と比較して類似した、または良好な移行可能性を示した（例外は、トラスツズマブ／セツキシマブ系において主に観察されたものであった）。

実施例１０：生物物理的特徴決定において選択されたＳＭＣＡ二重特異性ヘテロ二量体抗体及び親Ｍａｂの分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＳＭＣＡ試料のサブセットを、追加の生物物理的特徴決定のために選択した。これらのＳＭＣＡ試料の大部分は、典型的に高対合を示し（Ｈ１Ｌ１＋Ｈ２Ｌ２／全ての種の縦列において約８０％を超える）、低量の半抗体種（全ての半抗体種を考慮して約３０％未満）を示した。分取ＳＥＣを以下のように実施した。ヘテロ二量体抗体試料を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）ＡＫＴＡＰｕｒｉｆｉｅｒ系に取り付けたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００１０／３００ＧＬ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムの使用により分離した。ＰＢＳ（ＨｙｃｌｏｎｅＤＰＢＳ／ｍｏｄｉｆｉｅｄ、カルシウムなし、マグネシウムなし、カタログ番号ＳＨ－３０００２８．０２）中のヘテロ二量体抗体試料（０．３～０．５ｍｌ）を、ＰＢＳを充填した０．５ｍｌのループに手作業で装填した。次に試料を自動でカラムに注入させ、１ＣＶ溶出容量により０．５ｍｌ／分により分解した。タンパク質溶出をＯＤ_２８０でモニターし、０．５ｍｌ画分で収集した。それぞれのＳＭＣＡ試料において、主要なピークを含むこれらの画分をプールし、更に生物物理的に特徴決定した。

実施例１１：分取サイズ排除クロマトグラフィー後の抗体フォーマットでの二重特異性ヘテロ二量体の優先的対合の評価
分取ＳＥＣの後、選択された試料を、実施例９に記載されたＬＣ－ＭＳ法の使用により二重特異性ヘテロ二量体抗体の優先的対合について分析した。これらの試料は、全て、所望の二重特異性抗体種の率を増加させ、半抗体種の率を減少させる（表２９及び３０）。

実施例１２：ＳＭＣＡ二重特異性ヘテロ二量体抗体の熱安定性
分取ＳＥＣの後、選択されたＳＭＣＡ二重特異性ヘテロ二量体抗体の熱安定性を測定し、親Ｄ３Ｈ４４及びトラスツズマブモノクローナル抗体、ならびにセツキシマブ１アーム抗体と比較した。一般に、１アーム抗体は、１つの完全長重鎖、Ｆａｂ領域を欠いている（及びＣ２３３Ｓ置換を組み込んでいる）１つの切断型重鎖、ならびに１つの軽鎖から構成され、実施例９に記載されたように達成された重鎖ヘテロ二量体化を有する、構築物を指す。

熱安定性の測定
選択された二重特異性ヘテロ二量体抗体及び野生型対照の熱安定性を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して以下のように測定した。分取ＳＥＣ処理の後、４００μＬの試料を、主に、ＰＢＳ中０．２ｍｇ／ｍｌまたは０．４ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＶＰ－ＣａｐｉｌａｌｒｙＤＳＣ（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるＤＳＣ分析に使用した。それぞれのＤＳＣの実施の開始時に、５つの緩衝液ブランク注入を実施して、ベースラインを安定化し、緩衝液注入を、基準のためそれぞれの試料注入の前に行った。それぞれの試料を、６０℃／時間の速度で２０～１００℃、低いフィードバック、８秒間のフィルター、５分間のｐｒｅＴｓｔａｔ及び７０ｐｓｉの窒素圧で走査した。得られたサーモグラムを基準とし、Ｏｒｉｇｉｎ７ソフトウエアを使用して分析した。

結果を表３１ａ、ｂ及びｃに示す。野生型について表に報告されたＦａｂのＴｍ値は、Ｄ３Ｈ４４（７９℃）及びトラスツズマブ（８１℃）のホモ二量体抗体から、ならびにセツキシマブ（７２℃）の１アーム抗体から得た。ＷＴＤ３Ｈ４４／セツキシマブ及びトラスツズマブ／セツキシマブヘテロ二量体抗体では、ＦａｂＴｍに対応する２つのピークのみが観察される。別個のピークは、ＣＨ２において（セツキシマブＦａｂとの重複のため）またはＣＨ３において（Ｄ３Ｈ４４及びトラスツズマブＦａｂのＴｍ値の重複のため）観察されない。ＷＴＤ３Ｈ４４／トラスツズマブヘテロ二量体抗体では、Ｄ３Ｈ４４及びトラスツズマブの２つのＦａｂのＴｍ値が類似しているので、８１℃でのピークが両方のＦａｂに対応する可能性があり、一方、およそ７２℃でのピークがＣＨ２に対応する可能性がある。

表３１ａ、ｂ及びｃでは、特に示されない限り、両方のＦａｂに対応するピークのＴｍ値のみが報告された。いくつかのヘテロ二量体試料では、タンパク質濃度は、低く（０．４ｍｇ／ｍＬ未満）、ベースラインにおけるノイズの増加をもたらしたことにも留意すること。その結果、Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ系において、いくつかの試料は、ＣＨ２ピークを区別することが困難であり、Ｆａｂを不安定化させる可能性があるような低いピーク強度のＤＳＣ曲線を生じた。この場合では、７０～７２℃のＴｍ値も報告された（表３１ａ）。全体的に、大部分のヘテロ二量体抗体は、対応する野生型分子に類似した熱安定性（３℃以下）を示す。更に、大部分のヘテロ二量体は、ＣＨ２またはＣＨ３ピークの有意な不安定を示唆する追加のピークを示さない。１つの例外には、ＣＨ２不安定化に起因し得る６０℃での追加のピークを示す、トラスツズマブ／セツキシマブヘテロ系の改変ヘテロ二量体抗体９６１１－９０７７＿２が含まれる。

実施例１３：二重特異性ヘテロ二量体抗体の抗原親和性の測定
二重特異性抗体の、関連する抗原に結合する能力を、アミノ酸置換が抗原結合に任意の作用を有するかを決定するために評価した。抗原結合親和性をＳＰＲにより以下のように決定した。

ＳＰＲバイオセンサーアッセイ
ＥＤＣ：１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、ＮＨＳ：Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ＳＰＲ：表面プラスモン共鳴、ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸、ＴＦ：組織因子、ＥＧＦＲＥＣＤ：上皮増殖因子受容体細胞外ドメイン、Ｈｅｒ２ＥＣＤ：ヒト上皮増殖因子受容体２細胞外ドメイン。

ＳＰＲ供給。ＳｅｒｉｅｓＳＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐＣＭ５、Ｂｉａｃｏｒｅアミンカップリングキット（ＮＨＳ、ＥＤＣ及び１Ｍエタノールアミン）、ならびに１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液は、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）から購入した。組換えＨｅｒ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。１％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を伴うＰＢＳランニングバッファーは、ＴａｋｎｏｖａＩｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から購入したヤギポリクローナルヒトＦｃ抗体は、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．（ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ，ＰＡ）から購入した。ＥＤＴＡは、Ｂｉｏｓｈｏｐ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）から購入した。

全ての表面プラスモン共鳴アッセイは、ＰＢＳＴランニングバッファー（０．５ＭのＥＤＴＡ貯蔵溶液を加えて３．４ｍＭの最終濃度にした）により２５℃の温度でＢｉａｃｏｒｅＴ２００ＳｕｒｆａｃｅＰｌａｓｍｏｎＲｅｓｏｎａｎｃｅ器具（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ））を使用して実施した。抗ヒトＦｃ捕捉表面は、２０００共鳴単位（ＲＵ）を標的にするように設定したＢｉａｃｏｒｅＴ２００制御ソフトウエアによるＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎＷｉｚａｒｄ下において既定パラメーターを使用する、ＳｅｒｉｅｓＳＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐＣＭ５を使用して生成した。Ｈｅｒ２ＥＣＤ、ＴＦまたはＥＧＦＲＥＣＤ抗原標的に結合する抗体変種の選別を、２ステップで行った。抗ヒトＦｃ抗体フローセル表面への抗体変種の間接的な捕捉、次いで、単一サイクル動力学方法論を使用した、動力学分析用の精製抗原の５つの濃縮物の注入である。捕捉のために変種または対照を、１０μＬ／分の流速で６０秒間にわたって個別のフローセルに１μｇ／ｍＬにより注入した。一般的に、このことは、抗ヒトＦｃ表面へのおよそ５０～１００ＲＵの捕捉をもたらす。第１のフローセルを空のままにして、ブランク対照として使用した。この捕捉ステップの直後に、抗原の５つの濃縮物（ＴＦもしくはＥＧＦＲＥＣＤ抗原では５ｎＭ、２．５ｎＭ、１．２５ｎＭ、０．６３ｎＭ及び０．３１ｎＭ、またはＨｅｒ２ＥＣＤ抗原では４０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ及び２．５ｎｍ）を、４つのフローセルの全てにわたって、ＥＧＦＲＥＣＤでは３００秒間、Ｈｅｒ２ＥＣＤでは１８００秒間及びＴＦでは３６００秒間の解離段階を伴って、１８０秒間で１００μＬ／分により順次注入した。捕捉抗体表面を、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５により３０μＬ／分で１２０秒間再生して、次の注入サイクルのために調製した。少なくとも２回の偽緩衝液注入を、基準として使用するそれぞれの分析物注入のために実施した。得られた単一サイクル動力学センサーグラムを、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアの使用により分析し、１：１結合モデルに当てはめた。

ヘテロ二量体抗体の抗原親和性を、対応する野生型対照：Ｄ３Ｈ４４、トラスツズマブＯＡＡ及びセツキシマブＯＡＡのＭａｂを参照して評価した。抗原親和性は、野生型二重特異性抗体からも得たが、ＷＴ二重特異性のＳＰＲ捕捉は、不均質（例えば、誤対合ヘテロ二量体の捕捉を伴う）であり得るので、ＫＤの決定を妨げる（表３１ａ及びｃを参照すること）。Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ系において測定された抗原結合を有するヘテロ二量体抗体では、抗原親和性は、対応するＷＴ対照と類似していた（表３１ｂを参照すること）。Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ及びトラスツズマブ／セツキシマブ系の両方において測定された抗原結合を有する大部分のヘテロ二量体抗体では、抗原親和性は、対応するＷＴ対照と類似していた（表３１ａ及びｃを参照すること）。例外には、Ｈｅｒ２結合を示さなかった１１個の改変抗体が含まれる。Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ及びトラスツズマブ／セツキシマブ系の両方において、Ｈｅｒ２結合は、６個の改変ヘテロ二量体抗体９０４９－９７５９＿１及び９６８２－９７４０＿１及び３５２２＿１において観察されなかった。更に、トラスツズマブ／セツキシマブ系では、５個の更なる改変抗体９６９６－９８４８＿１、９５６１－９０９５＿２、９６１１－９０７７＿２、９２８６－９４０２＿２及び９０６０－９７５６＿２も、Ｈｅｒ２への結合を欠いていた。これらの１１個の改変抗体のうち１０個は、Ｈ鎖（Ｌ１４３Ｅ＿Ｋ１４５Ｔ）及びＬ鎖（Ｑ１２４Ｒ＿Ｔ１７８Ｒ）に定常領域突然変異を共有した。他の改変抗体９２８６－９４０２＿２は、Ｈ鎖（Ｌ１４３Ｅ＿Ｋ１４５Ｔ）に同じ定常領域突然変異及びＬ鎖（Ｑ１２４Ｋ及びＳ１７６Ｒ）に類似した突然変異を共有した。

実施例１４：改変ヘテロ二量体抗体、ならびに野生型ヘテロ二量体及びホモ二量体抗体の超高速液体クロマトグラフィーサイズ排除クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ－ＳＥＣ）プロファイル
改変ヘテロ二量体抗体、ならびに対照野生型二重特異性及びホモ二量体抗体の分取ＳＥＣの後、３０℃に設定し、ＰＤＡ検出器を有するＷａｔｅｒｓＡｃｕｉｔｙＵＰＬＣ系に取り付けたＷａｔｅｒｓＢＥＨ２００ＳＥＣカラム（２．５ｍＬ、４．６×１５０ｍｍ、ステンレス鋼、１．７μｍ粒子）を使用して、ＵＰＬＣ－ＳＥＣを実施した。実施時間は、７分間からなり、注入毎の総容量は、２．８ｍＬであり、ランニングバッファーのＰＢＳ及び０．０２％のポリソルベート２０または２０ｍＭのＮａＰＯ４、５０ｍＭのＫＣｌ、０．０２％のポリソルベート２０、１０％のアセトニトリル、ｐＨ７を０．４ｍｌ／分で用いた。溶出は、２１０～４００ｎｍの範囲のＵＶ吸収によりモニターし、クロマトグラムを２８０ｎｍで抽出した。ピーク積分は、Ｅｍｐｏｗｅｒ３ソフトウエアを使用して実施した。

図１０は、代表的な改変ヘテロ二量体抗体と代表的なＷＴヘテロ二量体のＵＰＬＣ－ＳＥＣプロファイルを示す。大部分の場合において、改変ヘテロ二量体抗体は、対応するＷＴヘテロ二量体抗体と類似したＵＰＬＣ－ＳＥＣプロファイルを示し、Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ、Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ及びトラスツズマブ／セツキシマブのそれぞれにおけるモノマーの平均率が９９．１８％、９８．７０％及び９８．７７％であった（表３１ａ、３１ｂ及び３１ｃを参照すること）。

本発明は好ましい実施形態及び様々な代替的実施形態を参照して示され、記載されてきたが、形態及び詳細における様々な変更を、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく実行できることが、当業者に理解される。

本明細書に開示されている全ての参考文献、発行特許、特許公開及び配列受入番号は、全ての目的においてその全体が参照として本明細書に組み込まれる。

（表）表のキー
表１：Ｆａｂモデルの主な判断基準
表２：Ｄ３Ｈ４４（カッパ軽鎖を含有する典型的なＦａｂ）の重鎖及び軽鎖の界面におけるホットスポットアミノ酸位置
表３Ａ．Ｄ３Ｈ４４、トラスツズマブ及びセツキシマブの重鎖アミノ酸配列のＫａｂａｔ番号付け
表３Ｂ．Ｄ３Ｈ４４、トラスツズマブ及びセツキシマブの軽鎖アミノ酸配列のＫａｂａｔ番号付け
表３Ｃ：Ｄ３Ｈ４４、トラスツズマブ及びセツキシマブのアミノ酸及びＤＮＡ配列
表４．Ｈ１がＬ１と優先的に対合する修飾を１つの免疫グロブリン重鎖及び／または２つの免疫グロブリン軽鎖に有する、ＬＣＣＡ設計
表５．設計ライブラリー
表６．コア設計
表７．組み合わせ設計の例
表８．修飾／最適化設計の例
表９．最適化設計を含む組み合わせ設計の例
表１０．独立した設計を含む組み合わせ設計の例
表１１：軽鎖競合アッセイ及び検証に使用されるＨ１：Ｌ１：Ｌ２のＤＮＡ比
表１２．Ｈ１Ｌ１Ｆａｂヘテロ二量体のＤＳＦ値を減少するように配置されたＬＣＣＡ設計のＬＣＣＡ性能、安定性及び抗原結合の評価
表１３ａ．正確に対合したＦａｂヘテロ二量体：誤対合したＦａｂヘテロ二量体が８６：１４であるＬＣＣＡ平均性能基準を満たす設計のＬＣＣＡ性能
表１３ｂ．正確に対合したＦａｂヘテロ二量体：誤対合したＦａｂヘテロ二量体が８６：１４であるＬＣＣＡ平均性能基準を満たす設計の安定性及び抗体結合の評価
表１４ａ．正確に対合したＦａｂヘテロ二量体：誤対合したＦａｂヘテロ二量体が８６：１４であるＬＣＣＡ平均性能基準を下回って機能する設計のＬＣＣＡ性能
表１４ｂ．正確に対合したＦａｂヘテロ二量体：誤対合したＦａｂヘテロ二量体が８６：１４であるＬＣＣＡ平均性能基準を下回って機能する設計の安定性及び抗体結合の評価
表１５．代表的な設計を含むクラスター１の設計
表１６．代表的な設計を含むクラスター２の設計
表１７．代表的な設計を含むクラスター３の設計
表１８．代表的な設計を含むクラスター４の設計
表１９．代表的な設計を含むクラスター５の設計
表２０．代表的な設計を含むクラスター６の設計
表２１．代表的な設計を含むクラスター７の設計
表２２．代表的な設計を含むクラスター８の設計
表２３．代表的な設計を含むクラスター９の設計
表２４．代表的な設計を含むクラスター１０の設計
表２５．代表的な設計を含むクラスター１１の設計
表２６．代表的な設計を含むクラスター１２の設計
表２７．代表的な設計を含むクラスター１３の設計
表２８ａ．トラスツズマブ／セツキシマブ二重特異性系のＳＭＣＡ特有識別子
表２８ｂ．Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ二重特異性系のＳＭＣＡ特有識別子
表２８ｃ．Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ二重特異性系のＳＭＣＡ特有識別子
表２９ａ．Ｄ３Ｈ４４（Ｈ１Ｌ１）／セツキシマブ（Ｈ２Ｌ２）二重特異性系に由来するヘテロ二量体抗体のＬＣ－ＭＳ対合データ及びｐＡ後の収量（ｍｇ／Ｌ）
表２９ｂ．Ｄ３Ｈ４４（Ｈ１Ｌ１）／トラスツズマブ（Ｈ２Ｌ２）二重特異性系に由来するヘテロ二量体抗体のＬＣ－ＭＳ対合データ及びｐＡ後の収量（ｍｇ／Ｌ）
表２９ｃ．トラスツズマブ（Ｈ１Ｌ１）／セツキシマブ（Ｈ２Ｌ２）二重特異性系に由来するヘテロ二量体抗体のＬＣ－ＭＳ対合データ及びｐＡ後の収量（ｍｇ／Ｌ）
表３０ａ．分取ＳＥＣ後のＤ３Ｈ４４（Ｈ１Ｌ１）／セツキシマブ（Ｈ２Ｌ２）二重特異性系に由来するヘテロ二量体抗体のＬＣ－ＭＳ対合
表３０ｂ．分取ＳＥＣ後のＤ３Ｈ４４（Ｈ１Ｌ１）／トラスツズマブ（Ｈ２Ｌ２）二重特異性系に由来するヘテロ二量体抗体のＬＣ－ＭＳ対合
表３０ｃ．分取ＳＥＣ後のトラスツズマブ（Ｈ１Ｌ１）／セツキシマブ（Ｈ２Ｌ２）二重特異性系に由来するヘテロ二量体抗体のＬＣ－ＭＳ対合
表３１ａ．Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ系に由来する選択された設計の生物物理学的特徴決定（抗原結合、熱安定性、ＵＰＬＣ－ＳＥＣ）
表３１ｂ．Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ系に由来する選択された設計の生物物理学的特徴決定（抗原結合、熱安定性、ＵＰＬＣ－ＳＥＣ）
表３１ｃ．トラスツズマブ／セツキシマブ系に由来する選択された設計の生物物理学的特徴決定（抗原結合、熱安定性、ＵＰＬＣ－ＳＥＣ）
表３２ａ．ＬＣ－ＭＳにより評価した、抗体種の百分率に対する野生型Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ系のＤＮＡ滴定比の効果。Ｈ１及びＬ１は、Ｄ３Ｈ４４の重鎖及び軽鎖をそれぞれ指す。Ｈ２及びＬ２は、トラスツズマブの重鎖及び軽鎖をそれぞれ指す。
表３２ｂ．ＬＣ－ＭＳにより評価した、抗体種の百分率に対する野生型Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ系のＤＮＡ滴定比の効果。Ｈ１及びＬ１は、Ｄ３Ｈ４４の重鎖及び軽鎖をそれぞれ指す。Ｈ２及びＬ２は、セツキシマブの重鎖及び軽鎖をそれぞれ指す。
表３２ｃ．ＬＣ－ＭＳにより評価した、抗体種の百分率に対する野生型トラスツズマブ／セツキシマブ系のＤＮＡ滴定比の効果。Ｈ１及びＬ１は、トラスツズマブの重鎖及び軽鎖をそれぞれ指す。Ｈ２及びＬ２は、セツキシマブの重鎖及び軽鎖をそれぞれ指す。
表３３ａ．Ｄ３Ｈ４４（Ｈ１Ｌ１）／セツキシマブ（Ｈ２Ｌ２）二重特異性系に由来する野生型抗体構築物のＬＣ－ＭＳ対合
表３３ｂ．Ｄ３Ｈ４４（Ｈ１Ｌ１）／トラスツズマブ（Ｈ２Ｌ２）二重特異性系に由来する野生型抗体構築物のＬＣ－ＭＳ対合
表３３ｃ．トラスツズマブ（Ｈ１Ｌ１）／セツキシマブ（Ｈ２Ｌ２）二重特異性系に由来する野生型抗体構築物のＬＣ－ＭＳ対合
表３４．Ｆａｂヘテロ二量体における突然変異の安定化
表３５ａ．３つ全ての二重特異性系（Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ、Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ及びトラスツズマブ／セツキシマブ）における移動性を両方の配向で示した設計
表３５ｂ．３つ全ての二重特異性系（Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ、Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ及びトラスツズマブ／セツキシマブ）における移動性を一方の配向で示し、１つの二重特異性系においてのみ他方の配向に移動し、同時に軽鎖利用基準の少なくとも１０％を満たしてもいる設計

（表１）Ｆａｂモデルの主な判断基準

（表２）Ｄ３Ｈ４４（カッパ軽鎖を含有する典型的なＦａｂ）の重鎖及び軽鎖の界面におけるホットスポットアミノ酸位置

*Ｋａｂａｔ番号付け

（表３Ａ）Ｄ３Ｈ４４、トラスツズマブ及びセツキシマブの重鎖アミノ酸配列のＫａｂａｔ番号付け

（表３Ｂ）Ｄ３Ｈ４４、トラスツズマブ及びセツキシマブの軽鎖アミノ酸配列のＫａｂａｔ番号付け

（表３Ｃ）Ｄ３Ｈ４４、トラスツズマブ及びセツキシマブのアミノ酸及びＤＮＡ配列

（表４）Ｈ１がＬ１と優先的に対合する修飾を１つの免疫グロブリン重鎖及び／または２つの免疫グロブリン軽鎖に有する、ＬＣＣＡ設計

*Ｋａｂａｔ番号付け；ＷＴは、アミノ酸突然変異を有さない野性型免疫グロブリン鎖を指す。
**Ｈ１、Ｌ１及びＬ２突然変異それぞれの特有のセット（ＬＣＣＡフォーマット）が、セット番号または「特有の識別子」として指定された。

（表５）設計ライブラリー

*Ｋａｂａｔ番号付け；ＷＴは、アミノ酸突然変異を有さない野性型免疫グロブリン鎖を指す。
**「特有の識別子」は、２つの構成要素ＬＣＣＡの特有の識別子から構成される、またはＳＭＣＡフォーマットのみにより試験された設計の単一識別子から構成される。

（表６）コア設計

*Ｋａｂａｔ番号付け；ＷＴは、アミノ酸突然変異を有さない野性型免疫グロブリン鎖を指す。
**「特有の識別子のセット」は、２つの構成要素ＬＣＣＡの特有の識別子から構成される。

（表７）組み合わせ設計の例

*Ｋａｂａｔ番号付け

（表８）修飾／最適化設計の例

*Ｋａｂａｔ番号付け

（表９）最適化設計を含む組み合わせ設計の例

（表１０）独立した設計を含む組み合わせ設計の例

*Ｋａｂａｔ番号付け；ＷＴは、アミノ酸突然変異を有さない野性型免疫グロブリン鎖を指す。

（表１１）軽鎖競合アッセイ及び検証に使用されるＨ１：Ｌ１：Ｌ２のＤＮＡ比

^追加のＤＮＡ：ＡＫＴｄｄｐＴＴ２２は、構成的に活性なタンパク質キナーゼＢ突然変異体（有意な陽性ＡＫＴ突然変異体）を含有するベクターを指す。ｓｓＤＮＡは、サケ精子ＤＮＡを指す。

（表１２）Ｈ１Ｌ１Ｆａｂヘテロ二量体のＤＳＦ値を減少するように設置されたＬＣＣＡ設計のＬＣＣＡ性能、安定性及び抗原結合の評価

*結合Ｌ鎖タグ（ＨＡまたはＦＬＡＧ）の存在／不在のみが異なる他のＦａｂヘテロ二量体から導かれた推定値を示す。
**３３３（Ｈ１）、２５０（Ｌ１）、７４９（Ｌ２）のＬＣＣＡ実験から導かれた値。
***３３３（Ｈ１）、１００（Ｌ１）、８９９（Ｌ２）のＬＣＣＡ実験から導かれた値。
ＮＤは、利用可能なデータがないことを示す。

（表１３ａ）正確に対合したＦａｂヘテロ二量体：誤対合したＦａｂヘテロ二量体が８６：１４であるＬＣＣＡ平均性能基準を満たす設計のＬＣＣＡ性能

*値は、Ｌ１：Ｌ２のＤＮＡ比１：３で実施したＬＣＣＡ実験から得て、Ｌ１：Ｌ２のＤＮＡ比を１：１に正規化した。
**値は、Ｌ１：Ｌ２のＤＮＡ比１：９で実施したＬＣＣＡ実験から得て、Ｌ１：Ｌ２のＤＮＡ比を１：１に正規化した。
***「特有の識別子」は、（Ｈ１Ｌ１Ｌ２のセット番号－Ｈ２Ｌ２Ｌ１のセット番号）または（Ｈ２Ｌ２Ｌ１のセット番号－Ｈ１Ｌ１Ｌ２のセット番号）の配向のいずれかの２つの構成要素ＬＣＣＡの特有の識別子からなる。

（表１３ｂ）正確に対合したＦａｂヘテロ二量体：誤対合したＦａｂヘテロ二量体が８６：１４であるＬＣＣＡ平均性能基準を満たす設計の安定性及び抗体結合の評価

*結合Ｌ鎖タグ（ＨＡまたはＦＬＡＧ）の存在／不在のみが異なる他のＦａｂヘテロ二量体から導かれた推定値を示す。
**「特有の識別子」は、（Ｈ１Ｌ１Ｌ２のセット番号－Ｈ２Ｌ２Ｌ１のセット番号）または（Ｈ２Ｌ２Ｌ１のセット番号－Ｈ１Ｌ１Ｌ２のセット番号）の配向のいずれかの２つの構成要素ＬＣＣＡの特有の識別子からなる。

（表１４ａ）正確に対合したＦａｂヘテロ二量体：誤対合したＦａｂヘテロ二量体が８６：１４であるＬＣＣＡ平均性能基準を下回って機能する設計のＬＣＣＡ性能

（表１４ｂ）正確に対合したＦａｂヘテロ二量体：誤対合したＦａｂヘテロ二量体が８６：１４であるＬＣＣＡ平均性能基準を下回って機能する設計の安定性及び抗体結合の評価

（表１５）代表的な設計を含むクラスター１の設計

*Ｋａｂａｔ番号付け
**代表的な設計

（表１６）代表的な設計を含むクラスター２の設計

*Ｋａｂａｔ番号付け
**代表的な設計

（表１７）代表的な設計を含むクラスター３の設計

*Ｋａｂａｔ番号付け
**代表的な設計

（表１８）代表的な設計を含むクラスター４の設計

*Ｋａｂａｔ番号付け
**代表的な設計

（表１９）代表的な設計を含むクラスター５の設計

*Ｋａｂａｔ番号付け
**代表的な設計

（表２０）代表的な設計を含むクラスター６の設計

*Ｋａｂａｔ番号付け
**代表的な設計
***代表的な設計は、Ｌ２がＱ３８Ｅ置換を欠いていることを除いて、９７４５－９０７５に類似している。

（表２１）代表的な設計を含むクラスター７の設計

*Ｋａｂａｔ番号付け
**代表的な設計

（表２２）代表的な設計を含むクラスター８の設計

*Ｋａｂａｔ番号付け
**代表的な設計

（表２３）代表的な設計を含むクラスター９の設計

*Ｋａｂａｔ番号付け
**代表的な設計
***代表的な設計は、Ｌ２がＱ３８Ｅ置換を欠いていることを除いて、９７５１－９０６５に類似している。

（表２４）代表的な設計を含むクラスター１０の設計

*Ｋａｂａｔ番号付け
**代表的な設計

（表２５）代表的な設計を含むクラスター１１の設計

*Ｋａｂａｔ番号付け
**代表的な設計

（表２６）代表的な設計を含むクラスター１２の設計

*Ｋａｂａｔ番号付け
**代表的な設計

（表２７）代表的な設計を含むクラスター１３の設計

（表２８ａ）トラスツズマブ／セツキシマブ二重特異性系のＳＭＣＡ特有識別子

*Ｋａｂａｔ番号付け。ＷＴ残基は、Ｄ３Ｈ４４系を指すことに留意すること。

（表２８ｂ）Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ二重特異性系のＳＭＣＡ特有識別子

（表２８ｃ）Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ二重特異性系のＳＭＣＡ特有識別子

（表２９ａ）Ｄ３Ｈ４４（Ｈ１Ｌ１）／セツキシマブ（Ｈ２Ｌ２）二重特異性系に由来するヘテロ二量体抗体のＬＣ－ＭＳ対合データ及びｐＡ後の収量（ｍｇ／Ｌ）

*完全なＡｂ種のみを考慮した割合（％）
**全ての種を考慮した割合（％）
***野生型に対するＨ１：Ｈ２：Ｌ１：Ｌ２の割合（％）の推定変化

（表２９ｂ）Ｄ３Ｈ４４（Ｈ１Ｌ１）／トラスツズマブ（Ｈ２Ｌ２）二重特異性系に由来するヘテロ二量体抗体のＬＣ－ＭＳ対合データ及びｐＡ後の収量（ｍｇ／Ｌ）

（表２９ｃ）トラスツズマブ（Ｈ１Ｌ１）／セツキシマブ（Ｈ２Ｌ２）二重特異性系に由来するヘテロ二量体抗体のＬＣ－ＭＳ対合データ及びｐＡ後の収量（ｍｇ／Ｌ）

*完全なＡｂ種のみを考慮した割合（％）
**全ての種を考慮した割合（％）
***野生型に対する推定変化

（表３０ａ）分取ＳＥＣ後のＤ３Ｈ４４（Ｈ１Ｌ１）／セツキシマブ（Ｈ２Ｌ２）二重特異性系に由来するヘテロ二量体抗体のＬＣ－ＭＳ対合

*完全なＡｂ種のみを考慮した（％）
**全ての種を考慮した（％）
***野生型に対するＨ１：Ｈ２：Ｌ１：Ｌ２の割合（％）の推定変化

（表３０ｂ）分取ＳＥＣ後のＤ３Ｈ４４（Ｈ１Ｌ１）／トラスツズマブ（Ｈ２Ｌ２）二重特異性系に由来するヘテロ二量体抗体のＬＣ－ＭＳ対合

（表３０ｃ）分取ＳＥＣ後のトラスツズマブ（Ｈ１Ｌ１）／セツキシマブ（Ｈ２Ｌ２）二重特異性系に由来するヘテロ二量体抗体のＬＣ－ＭＳ対合

*完全なＡｂ種のみを考慮した（％）
**全ての種を考慮した（％）
***野生型に対する推定変化

（表３１ａ）Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ系に由来する選択された設計の生物物理学的特徴決定（抗原結合、熱安定性。ＵＰＬＣ－ＳＥＣ）

*報告されたＫＤ値は、単回の測定または２回の測定の平均である。範囲は括弧内に示されている。

（表３１ｂ）Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ系に由来する選択された設計の生物物理学的特徴決定（抗原結合、熱安定性。ＵＰＬＣ－ＳＥＣ）

（表３１ｃ）トラスツズマブ／セツキシマブ系に由来する選択された設計の生物物理学的特徴決定（抗原結合、熱安定性。ＵＰＬＣ－ＳＥＣ）

*報告されたＫＤ値は、単回の測定または２回の測定の平均である。範囲は括弧内に示されている。
**ＮＤ＝決定されず。

（表３２ａ）ＬＣ－ＭＳにより評価した、抗体種の百分率に対する野生型Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ系のＤＮＡ滴定比の効果。Ｈ１及びＬ１は、Ｄ３Ｈ４４の重鎖及び軽鎖をそれぞれ指す。Ｈ２及びＬ２は、トラスツズマブの重鎖及び軽鎖をそれぞれ指す。

（表３２ｂ）ＬＣ－ＭＳにより評価した、抗体種の百分率に対する野生型Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ系のＤＮＡ滴定比の効果。Ｈ１及びＬ１は、Ｄ３Ｈ４４の重鎖及び軽鎖をそれぞれ指す。Ｈ２及びＬ２は、セツキシマブの重鎖及び軽鎖をそれぞれ指す。

（表３２ｃ）ＬＣ－ＭＳにより評価した、抗体種の百分率に対する野生型トラスツズマブ／セツキシマブ系のＤＮＡ滴定比の効果。Ｈ１及びＬ１は、トラスツズマブの重鎖及び軽鎖をそれぞれ指す。Ｈ２及びＬ２は、トラスツズマブの重鎖及び軽鎖をそれぞれ指す。

（表３３ａ）Ｄ３Ｈ４４（Ｈ１Ｌ１）／セツキシマブ（Ｈ２Ｌ２）二重特異性系に由来する野生型抗体構築物のＬＣ－ＭＳ対合

*完全なＡｂ種のみを考慮した（％）
**全ての種を考慮した（％）

（表３３ｂ）Ｄ３Ｈ４４（Ｈ１Ｌ１）／トラスツズマブ（Ｈ２Ｌ２）二重特異性系に由来する野生型抗体構築物のＬＣ－ＭＳ対合

（表３３ｃ）トラスツズマブ（Ｈ１Ｌ１）／セツキシマブ（Ｈ２Ｌ２）二重特異性系に由来する野生型抗体構築物のＬＣ－ＭＳ対合

（表３４）Ｆａｂヘテロ二量体における突然変異の安定化

*ＷＴは、野生型を指す
**ＮＡは、対応するＬＣＣＡセット番号がないので、該当なしを指す

（表３５ａ）３つ全ての二重特異性系（Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ、Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ、及びトラスツズマブ／セツキシマブ）における移動性を両方の配向で示した設計

（表３５ｂ）３つ全ての二重特異性系（Ｄ３Ｈ４４／セツキシマブ、Ｄ３Ｈ４４／トラスツズマブ、及びトラスツズマブ／セツキシマブ）における移動性を一方の配向で示し、１つの二重特異性系においてのみ他方の配向に移動し、同時に軽鎖利用基準の少なくとも１０％を満たしてもいる設計

Claims

少なくとも第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体を含む単離された抗原結合ポリペプチド構築物であって、
前記第１のヘテロ二量体が、第１のヒトまたはヒト化免疫グロブリンＧ重鎖ポリペプチド配列（Ｈ１）及び第１のヒトまたはヒト化免疫グロブリンカッパ軽鎖ポリペプチド配列（Ｌ１）を含み且つ第１のエピトープに結合するＦａｂ領域を有し、前記第２のヘテロ二量体が、第２のヒトまたはヒト化免疫グロブリンＧ重鎖ポリペプチド配列（Ｈ２）及び第２のヒトまたはヒト化免疫グロブリンカッパ軽鎖ポリペプチド配列（Ｌ２）を含み且つ第２のエピトープに結合するＦａｂ領域を有し、前記第１のヘテロ二量体のＨ１またはＬ１配列のうち少なくとも１つが、前記第２のヘテロ二量体の対応するＨ２またはＬ２配列とは異なり、
Ｈ１及びＨ２がそれぞれ、少なくとも重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈドメイン）及び重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１ドメイン）を含み、
Ｌ１及びＬ２がそれぞれ、少なくとも軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌドメイン）及び軽鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｌドメイン）を含み、
Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１及びＬ２が、アミノ酸修飾のセットを含み、ここで、Ｈ１が、Ｌ２よりもＬ１と優先的に対合し、かつ／または、Ｈ２が、Ｌ１よりもＬ２と優先的に対合し、
前記第１および第２のヘテロ二量体の示差走査熱量測定により決定される融解温度（Ｔｍ）によって測定される第１及び第２のヘテロ二量体のＦａｂ領域の熱安定性が、アミノ酸修飾のセットを有さない対応するヘテロ二量体のＦａｂ領域のＴｍの０、１、または１．５℃以内であり；
そして、ここで：
ａ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｑ１７９Ｋを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１７６Ｌ及びＴ１８０Ｅを含むか；
ｂ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｓ１８６Ｋを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１７６Ｌ及びＴ１８０Ｅを含むか；
ｃ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｑ１７９Ｒを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１３１Ｔ、Ｔ１７８Ｙ及びＴ１８０Ｅを含むか；
ｄ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｑ１７９Ｒを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１３１Ｔ、Ｔ１７８Ｆ及びＴ１８０Ｅを含むか；
ｅ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｓ１８６Ｋを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１３１Ｔ、Ｔ１７８Ｆ及びＴ１８０Ｅを含むか；
ｆ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｓ１８６Ｋを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１３１Ｔ、Ｔ１７８Ｙ及びＴ１８０Ｅを含むか；
ｇ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｑ１７９Ｋを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１７６Ｌ及びＴ１８０Ｅを含むか；
ｈ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｑ１７９Ｒを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１７６Ｌ及びＴ１８０Ｅを含むか；
ｉ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｓ１８６Ｋを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１７６Ｌ及びＴ１８０Ｅを含むか；
ｊ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｑ１７９Ｋを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１３１Ｔ、Ｔ１７８Ｙ及びＴ１８０Ｅを含むか；
ｋ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｑ１７９Ｒを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１３１Ｔ、Ｔ１７８Ｙ及びＴ１８０Ｅを含むか；
ｌ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｓ１８６Ｋを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１３１Ｔ、Ｔ１７８Ｙ及びＴ１８０Ｅを含むか；
ｍ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ及びＫ１４５Ｔを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｑ１７９Ｋを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｔ１７８Ｅ及びＴ１８０Ｅを含むか；
ｎ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ及びＫ１４５Ｔを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｑ１７９Ｒを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ及びＴ１７８Ｅを含むか；
ｏ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ及びＫ１４５Ｔを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｑ１７９Ｒを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｑ１６０Ｅ及びＴ１７８Ｅを含むか；
ｐ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ及びＫ１４５Ｔを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｓ１８６Ｋを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ及びＴ１７８Ｅを含むか；
ｑ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ及びＫ１４５Ｔを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｓ１８６Ｒを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｔ１７８Ｅ及びＴ１８０Ｅを含むか；
ｒ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｋを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｖ１３３Ｄ及びＳ１７６Ｌを含むか；
ｓ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ及びＫ１４５Ｔを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｒを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ及びＶ１３３Ｅを含むか；
ｔ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｒを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｖ１３３Ｅ及びＳ１７６Ｌを含むか；
ｕ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ、及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｒを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ及びＶ１３３Ｅを含むか；
ｖ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｌ１４３Ａ及びＱ１７９Ｋを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｖ１３３Ｙ及びＴ１８０Ｅを含むか；
ｗ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ及びＫ１４５Ｔを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｓ１８６Ｋを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｓ１３１Ｅを含むか；
ｘ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ及びＫ１４５Ｔを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｓ１８６Ｋを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｓ１３１Ｅを含むか；
ｙ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｌ１２４Ａ及びＱ１７９Ｋを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｖ１３３Ｗ及びＴ１８０Ｅを含むか；または
ｚ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｌ１２４Ａ及びＳ１８６Ｋを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｖ１３３Ｗ及びＴ１８０Ｅを含み；
ここで残基の番号付けはＫａｂａｔ番号付けにより示される、単離された抗原結合ポリペプチド構築物。
Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２、及びＬ２が以下のアミノ酸修飾を含む、請求項１に記載の抗原結合ポリペプチド構築物：
ａ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｑ１７９Ｋを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１７６Ｌ及びＴ１８０Ｅを含むか；
ｂ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｓ１８６Ｋを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１７６Ｌ及びＴ１８０Ｅを含むか；
ｆ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ及びＳ１８８Ｌを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｓ１８６Ｋを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｅ、Ｓ１３１Ｔ、Ｔ１７８Ｙ及びＴ１８０Ｅを含むか；または
ｗ）Ｈ１はアミノ酸置換Ｌ１４３Ｅ及びＫ１４５Ｔを含み、Ｌ１はアミノ酸置換Ｑ１２４Ｒ、Ｑ１６０Ｋ及びＴ１７８Ｒを含み、Ｈ２はアミノ酸置換Ｓ１８６Ｋを含み、そしてＬ２はアミノ酸置換Ｓ１３１Ｅを含む。
Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、およびＬ２が細胞または哺乳動物細胞において同時発現されるときに、またはＨ１、Ｈ２、Ｌ１、およびＬ２が無細胞発現系において同時発現されるときに、またはＨ１、Ｈ２、Ｌ１、およびＬ２が同時生成されるときに、またはＨ１、Ｈ２、Ｌ１、およびＬ２がレドックス生成法により同時生成されるときに、Ｈ１がＬ２と比較してＬ１と優先的に対合し、Ｈ２がＬ１と比較してＬ２と優先的に対合する、請求項１または請求項２に記載の抗原結合ポリペプチド構築物。
Ｈ１－Ｌ１及びＨ２－Ｌ２ヘテロ二量体対の対合が、アミノ酸修飾を有さない対応するＨ１－Ｌ１及びＨ２－Ｌ２ヘテロ二量体対において観察されるそれぞれの対合よりも大きい、請求項１または請求項２に記載の抗原結合ポリペプチド構築物。
それが結合する抗原への各ヘテロ二量体の親和性が、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）またはＦＡＣＳにより測定すると、同じ抗原への対応するアミノ酸修飾を有さないヘテロ二量体の親和性の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０倍以内である、請求項１または請求項２に記載の抗原結合ポリペプチド構築物。
前記構築物が、第１のＣＨ３配列及び第２のＣＨ３配列を含むＦｃを更に含み、該第１のＣＨ３配列が、一つまたは複数のリンカーを用いて、または用いることなく、前記第１のヘテロ二量体と結合し、該第２のＣＨ３配列が、一つまたは複数のリンカーを用いて、または用いることなく、前記第２のヘテロ二量体と結合している、請求項１～５のいずれか一項に記載の構築物。
Ｆｃが、ヒトＦｃ、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ、ヒトＩｇＧＦｃ、ヒトＩｇＧ２Ｆｃ、ヒトＩｇＧ３Ｆｃ、またはヒトＩｇＧ４Ｆｃである、請求項６に記載の抗原結合ポリペプチド構築物。
前記Ｆｃがヘテロ二量体Ｆｃである、請求項７に記載の抗原結合ポリペプチド構築物。
前記ヘテロ二量体Ｆｃが、ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する、ＣＨ３配列の少なくとも１つにおける一つまたは複数の置換を含む、請求項８に記載の抗原結合ポリペプチド構築物。
前記Ｆｃが：
ｉ）第１のＦｃポリペプチドに置換Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを有し、第２のＦｃポリペプチドに置換Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを有する、ヘテロ二量体ＩｇＧ１Ｆｃ；
ｉｉ）第１のＦｃポリペプチドに置換Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを有し、第２のＦｃポリペプチドに置換Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを有する、ヘテロ二量体ＩｇＧ１Ｆｃ；
ｉｉｉ）第１のＦｃポリペプチドに置換Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを有し、第２のＦｃポリペプチドに置換Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを有する、ヘテロ二量体ＩｇＧ１Ｆｃ；
ｉｖ）第１のＦｃポリペプチドに置換Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを有し、第２のＦｃポリペプチドに置換Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを有する、ヘテロ二量体ＩｇＧ１Ｆｃ；または
ｖ）第１のＦｃポリペプチドに置換Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを有し、第２のＦｃポリペプチドに置換Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを有する、ヘテロ二量体ＩｇＧ１Ｆｃ；
を含み、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチド中のアミノ酸残基の番号付けが、ＥＵ番号付け系に従う、請求項９に記載の抗原結合ポリペプチド構築物。
前記Ｆｃが、少なくとも１つのＣＨ２配列を更に含む、請求項６～１０のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド構築物。
前記Ｆｃが、一つまたは複数のリンカーによってヘテロ二量体に結合しているか、または前記Ｆｃが、一つまたは複数のリンカーによってＨ１及びＨ２に結合している、請求項１１に記載の抗原結合ポリペプチド構築物。
前記構築物が多特異性または二重特異性である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド構築物。
抗原結合ポリペプチド構築物が、治療剤または薬物に連結されている、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド構築物。
請求項１～１３のいずれか一項に記載の構築物をコードする少なくとも１つの配列を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドのセットであって、任意で、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットがｃＤＮＡである、単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドのセット。
請求項１５記載のポリヌクレオチドのうち一つまたは複数またはポリヌクレオチドのセットを含む、ベクターまたはベクターのセットであって、場合により、プラスミド、複数シストロンベクター、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳類ベクター、発現ベクター及び組換え発現ベクターからなる群から選択される、ベクターまたはベクターのセット。
請求項１５記載のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、または請求項１６に記載のベクターもしくはベクターのセットを含む、単離細胞であって、場合により、細胞が、酵母細胞、細菌細胞、ハイブリドーマ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＨＥＫ２９３細胞である、単離細胞。
請求項１～１４のいずれか一項に記載の構築物および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物であって、任意で、緩衝液、抗酸化剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂質、キレート剤、安定剤、および賦形剤からなる群から選択される１つ以上の物質をさらに含む、薬学的組成物。
対象における疾患もしくは障害の治療、または医薬品の製造に使用するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載の構築物、または請求項１８に記載の薬学的組成物。
請求項１～１３のいずれか一項に記載の構築物を取得または調製する方法であって、
（ａ）前記構築物をコードする一つまたは複数の核酸配列を含む少なくとも１つの宿主細胞を含む宿主細胞培養物を得る段階と；
（ｂ）該宿主細胞培養物から構築物を回収する段階
を含む方法。
請求項１～１３のいずれか一項に記載の構築物を取得または調製する方法であって、
（ａ）Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２及びＬ２を得る段階と；
（ｂ）Ｈ１を、Ｌ２よりもＬ１と優先的に対合させ、かつＨ２を、Ｌ１よりもＬ２と優先的に対合させる段階と；
（ｃ）構築物を得る段階
を含む方法。
請求項１～１３のいずれか一項に記載の構築物を取得または調製する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの構築物をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットを得る段階と；
（ｂ）少なくとも１つの宿主細胞に導入するために該ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットのそれぞれの最適な比を決定する段階であって、該最適な比が、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２及びＬ２の発現の際に形成された誤対合Ｈ１－Ｌ２及びＨ２－Ｌ１ヘテロ二量体対と比較して、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２及びＬ２の発現の際に形成されたＨ１－Ｌ１及びＨ２－Ｌ２ヘテロ二量体対の量を評価することによって決定される、段階と；
（ｃ）好ましい最適比を選択する段階であって、該好ましい最適比の前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットによる少なくとも１つの宿主細胞への形質移入が、前記構築物の発現をもたらす、段階と；
（ｄ）前記少なくとも１つの宿主細胞に、前記最適比の前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットにより形質移入する段階と；
（ｅ）前記少なくとも１つの宿主細胞を培養して、前記構築物を発現させる段階、を含み、場合により、前記最適比を選択する段階が、一過性形質移入系における形質移入によって評価される、及び／または、前記好ましい最適比の前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットによる前記少なくとも１つの宿主細胞への形質移入が、前記構築物の最適な発現をもたらす、段階を含む方法。
前記構築物が、少なくとも２つのＣＨ３配列を含むＦｃを含み、該Ｆｃが、一つまたは複数のリンカーを用いて、または用いることなく、前記第１のヘテロ二量体及び前記第２のヘテロ二量体と結合し、場合により、前記Ｆｃが、場合により一つまたは複数のアミノ酸修飾を含むヘテロ二量体である、請求項２２に記載の方法。
単離された抗原結合ポリペプチド構築物を治療剤または薬物に連結させる段階をさらに含む、請求項２０～２３のいずれか一項記載の方法。
請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離された抗原結合ポリペプチド構築物を調製する方法であって、Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１及びＬ２を少なくとも１つの発現系において発現させて、発現産物を産生する段階；前記発現産物を特徴決定する段階；及び９０％を超える前記発現産物が前記単離された抗原結合ポリペプチド構築物である前記発現系を選択する段階を含む、前記方法。