JP7108318B2 - 生体細胞凍結保存具および生体細胞凍結保存用具 - Google Patents

Description

本発明は、哺乳動物の卵子、胚などの卵、精子、造血幹細胞、多能性幹細胞等の幹細胞などの生体細胞を凍結保存する際に使用する生体細胞凍結保存具および生体細胞凍結保存用具に関する。

哺乳動物胚の凍結保存は、特定の系統や品種の遺伝資源の保存を可能とする。また、絶滅の危機に瀕している動物種の維持にも有効である。さらに、ヒトの不妊治療においても有用である。
哺乳動物胚の凍結保存方法としては、特開２０００－１８９１５５公報（特許文献１）において、哺乳動物胚または卵子を滅菌処理した凍結ストロー、凍結バイアルまたは凍結チューブ等の凍結保存用容器の内面に、これらの胚または卵子を包被するに充分な最少量のガラス化液で貼り付け、この凍結保存用容器を密封し、この容器を液体窒素に接触させて急速に冷却することが提案されている。そして、融解方法では、前記の方法で保存した凍結保存用容器を液体窒素から取り出し、容器の一端部を開口し、この容器内に３３～３９℃の希釈液を直接注入し、胚または卵子の凍結を融解希釈するものである。この方法によれば、哺乳動物胚または卵子をウイルスや細菌による感染のおそれがなく高い生存率で保存および融解希釈することができるという優れた効果を備えている。
しかし、凍結ストロー、凍結バイアルまたは凍結チューブ等の凍結保存用容器の内面に、胚または卵子などの卵を包被するに充分かつ少量のガラス化液で貼り付ける作業が必ずしも容易ではなかった。

特開２０００－１８９１５５ 特開２００２－３１５５７３（ＷＯ公開０２－０８５１１０） 特開２００４－３２９２０２（ＵＳ公開２００４－０２５９０７２） 特開２０１６－１０３５９（ＵＳ公開２０１７－０１３５３３５）

そこで、本願発明者は、特許文献２（特開２００２－３１５５７３、ＷＯ公開０２－０８５１１０）を提案している。特許文献２の卵凍結保存具１は、耐寒性材料により形成された本体部２と、本体部２の一端に取り付けられ、可撓性かつ透明性かつ液体窒素耐性材料により形成された卵付着保持用ストリップ３と、卵付着保持用ストリップ３を被包可能に本体部２に着脱自在に取り付けられる一端が封鎖され、かつ耐寒性材料により形成された筒状部材４とからなるものである。

また、本願発明者は、特許文献３（特開２００４－３２９２０２、ＵＳ公開２００４－０２５９０７２）も提案している。特許文献３の卵凍結保存具１は、耐液体窒素材料で形成された卵凍結保存用チューブ２と、チューブ２を保護するための金属製筒状保護部材３とを備える。チューブ２は、本体部２１と、内径が０．１ｍｍ～０．５ｍｍの卵保存用細径部２２とを備えるとともに、細径部の先端側にてヒートシール可能であり、本体部２１にてヒートシール可能である。筒状保護部材３は、チューブ２の細径部２２の先端部を収納する筒状部３１と、細径部２２の筒状部３１に収納されない部分および本体部２１の先端部２１ａを収納する半筒状部３２とを備えている。
また、特開２０１６－１０３５９（特許文献４、ＵＳ公開２０１７－０１３５３３５）には、支持体上に、接着層とガラス化液吸収層を少なくともこの順に有するガラス化液吸収体を有し、ガラス化液吸収層の細胞又は組織を載置する部分と支持体の間に接着層が存在しない部分を有する細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具が開示されている。

特許文献２、３および４の卵凍結保存具は、有効である。また、特許文献４のものでは、ガラス化液吸収層が透明でないため、透過型顕微鏡を用いて、細胞の載置作業を行う際、ガラス化液吸収層の上面にピペットの先端部を配置したとき、その先端が視認しにくく、作業性が悪いものであった。このため、より容易に卵凍結操作が行える卵凍結保存具が望まれている。

本発明の目的は、生体細胞凍結保存具への生体細胞載置操作が容易であり、かつ、過剰なガラス化液が滴下されても、その除去操作が不要であり、生体細胞の凍結を迅速に行うことができる生体細胞凍結保存具を提供するものである。

上記目的を達成するものは、以下のものである。
耐寒性材料により形成された本体部と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部とを備える生体細胞凍結保存具であって、
前記生体細胞保持部は、光透過性を有するベース部と、前記ベース部の表面に固定された吸水部と、前記吸水部により取り囲まれた欠損部とを備え、
前記吸水部は、光難透過性シートからなり、前記ベース部は、細長い平坦シート状であり、前記欠損部は、光難透過性シートである前記吸水部により取り囲まれた円状または多角形状となっており、さらに、前記欠損部は、前記ベース部の前記表面が露出した光透過性を有する平坦な生体細胞載置部位を形成しており、かつ、透過型顕微鏡を用いた生体細胞の載置作業を行う際に、光難透過性である前記吸水部により取り囲まれ、光が透過する前記生体細胞載置部位が前記生体細胞を載置するターゲットを形成する生体細胞凍結保存具。

また、上記目的を達成するものは、以下のものである。
上記のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具と、前記生体細胞凍結保存具を収納可能かつ耐寒性材料により形成された一端が閉塞した筒状収納部材とを備える生体細胞凍結保存用具。

図１は、本発明の実施例の生体細胞凍結保存具の正面図である。 図２は、図１に示した生体細胞凍結保存具の左側面図である。 図３は、図１に示した生体細胞凍結保存具の縦断面図である。 図４は、図１に示した生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大図である。 図５は、図２に示した生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大図である。 図６は、図５に示した生体細胞凍結保存具の縦断面図である。 図７は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大正面図である。 図８は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大正面図である。 図９は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大断面図である。 図１０は、本発明の生体細胞凍結保存用具に使用される一例の筒状収納部材の正面図である。 図１１は、本発明の実施例の生体細胞凍結保存用具の正面図である。 図１２は、図１１のＡ－Ａ線断面図である。 図１３は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存具の正面図である。 図１４は、図１３に示した生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大正面図である。 図１５は、図１３に示した生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大左側面図である。 図１６は、図１５に示した生体細胞凍結保存具の縦断面図である。 図１７は、図１３に示した生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大図である。 図１８は、図１３に示した生体細胞凍結保存具を先端側から見た拡大作用説明図である。 図１９は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存用具の説明図である。 図２０は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存具を先端側から見た拡大作用説明図である。 図２１は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存具の正面図である。 図２２は、図２１に示した生体細胞凍結保存具の左側面図である。 図２３は、図２１に示した生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大図である。 図２４は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存具の正面図である。 図２５は、図２４に示した生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大図である。 図２６は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大正面図である。

本発明の生体細胞凍結保存具を図面に示す実施例を用いて説明する。
本発明の生体細胞凍結保存具１は、耐寒性材料により形成された本体部２と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部３とを備える。生体細胞保持部３は、光透過性を有するベース部３１と、ベース部３１の表面に固定された吸水部３２とを備える。吸水部３２は、吸水部３２により取り囲まれた欠損部（言い換えれば、吸水部３２の中に設けられた欠損部）３３を備え、欠損部３３において、ベース部３１の表面が露出し、光透過性を有している。
特に、この実施例の細胞凍結保存具１は、卵凍結保存具であり、生体細胞保持部３は、卵保持部となっている。なお、本発明の細胞凍結保存具は、胚などの卵、卵子、精子、造血幹細胞、多能性幹細胞等の幹細胞などの細胞、特に上記のような生体細胞を凍結保存するために用いることができる。
また、本発明の生体細胞凍結保存用具１０は、上記の生体細胞凍結保存具１と、生体細胞凍結保存具１を収納可能かつ耐寒性材料により形成された一端が閉塞した筒状収納部材４とを備える。
なお、本発明の生体細胞凍結保存具１は、筒状収納部材４を使用せず、生体細胞凍結保存具単独としても卵凍結保存に使用することができる。

生体細胞凍結保存具１は、図１ないし図６に示すように、耐寒性材料により形成された本体部２と、本体部２の一端に取り付けられた耐寒性材料により形成された生体細胞保持部３とを備える。生体細胞保持部３は、光透過性を有するベース部３１と、ベース部３１の表面に固定された吸水部３２とを備える。吸水部３２は、吸水部３２により取り囲まれた欠損部３３を備える。

この実施例の生体細胞凍結保存具１では、図１ないし図３に示すように、本体部２は、細長い棒状の本体部となっている。また、この実施例の生体細胞凍結保存具１では、生体細胞保持部３の光透過性を有するベース部３１は、可撓性かつ透明性かつ耐寒性（具体的には、液体窒素耐性）材料により形成されており、この実施例では、細長い平坦シート状のものとなっている。

本体部２は、図１ないし図３に示すように、生体細胞保持部３（ベース部３１）の一端を保持している。本体部の長さとしては、５０～２００ｍｍ程度が好適である。また、本体部の幅としては、２～７ｍｍ程度が好適であり、厚さは、１～７ｍｍ程度が好適である。本体部２は、主軸部２１と、主軸部２１の先端部に設けられた生体細胞保持部３（ベース部３１）を保持する保持部２２と、本体部２の後端部に設けられた把持部２３と、主軸部２１と把持部２３間に設けられたテーパー部２４とを備えている。この実施例の生体細胞凍結保存具１では、把持部２３を除き、後述する筒状収納部材４内に、収納可能であり、テーパー部２４は、筒状収納部材４の開口部と係合可能なものとなっている。

本体部２は、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート）、ポリオレフィン（例えば、ポリエチレン、超高分子量ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン－プロピレン共重合体、エチレン－酢酸ビニル共重合体）、スチレン系樹脂（例えば、ポリスチレン、メタクリレート－スチレン共重合体、メタクリレート－ブチレン－スチレン共重合体）、ポリアミド（例えば、６ナイロン，６６ナイロン）、ポリサルホン、フッ素樹脂、ポリイミド等の耐寒性樹脂が使用され、特に、液体窒素の温度に耐え得るものが好ましい。

この実施例では、ベース部３１は、細長い平坦シート状のものとなっている。ベース部３１は、生体細胞（例えば、卵）の付着作業を容易にするために、光透過性、好ましくは、透明性を有する平坦シート状のものが好ましい。特に、無色透明の平坦シートが好ましい。さらには、可撓性を有するものであってもよい。

生体細胞保持部３の先端部には、マーカー３４が設けられている。マーカー３４は、生体細胞保持部３の先端部の一方の表面（具体的には、吸水シートまたはベース部の表面）に、有色を付する（油性インクで着色する）ことにより形成される。ベース部３１の長さは、１０～７０ｍｍ程度、幅０．５～４．０ｍｍ程度、厚さが０．０１～０．５ｍｍ程度のものが用いられる。そして、ベース部３１は、基端部が、上述した本体部２の保持部２２に固着されている。

ベース部３１に使用されるシート形成材料としては、光透過性を有する樹脂シート、例えば、３－フッ化ポリエチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリカーボネート、ナイロン、ポリスルホン、ポリエステル（例えば、ＰＥＴ）、ポリスチレン、ポリイミド、超高分子量ポリエチレン、エチレン－酢酸ビニル共重合体などの合成樹脂からなるフィルムあるいはそれらの積層体が挙げられる。特に、耐寒性、具体的には、液体窒素耐性材料、言い換えれば、液体窒素に接触しても脆化しないものが好ましい。

そして、本発明の生体細胞凍結保存具１では、図１、図４ないし図６に示すように、光透過性を有するベース部３１表面に固定された吸水部３２を備える。さらに、吸水部３２は、吸水部３２により取り囲まれた欠損部３３を備える。そして、欠損部３３において、ベース部３１の表面が露出し、光透過性を有している。欠損部３３におけるベース部３１の表面が、生体細胞載置部位として有効に使用できる。吸水部３２の幅は、ベース部の幅と同じ～２／３程度であることが好ましい。また、吸水部３２の長さは、５～７０ｍｍが好ましく、特に、１０～５０ｍｍが好ましい。

また、この実施例の生体細胞凍結保存具１では、図５に示すように、生体細胞保持部３は、複数の欠損部（細胞載置部位）３３を備えている。具体的には、生体細胞保持部３の長手方向に、複数設けられている。具体的には、５つの欠損部（細胞載置部位）３３が設けられている。欠損部（細胞載置部位）３３の数としては、１～７程度が好ましく、特に、２～５が好適である。欠損部の大きさとしては、円形の場合、直径が．０．５～１．５ｍｍ程度が好適である。

また、欠損部３３は、円状または多角形状であることが好ましく、特に、円形、楕円形であることが好ましい。さらに、吸水部３２は、光難透過性シートであることが好ましい。このようなものとすることにより、透過型顕微鏡を用いた生体細胞の載置作業を行う際に、吸水部３２が難透過性であり、欠損部３３には光が透過するため、細胞を載置するターゲットである欠損部（細胞載置部位）３３が浮かび上がるように見え、ターゲットの認識が極めて容易である。

また、この実施例の生体細胞凍結保存具１では、図５に示すように、吸水部３２は、欠損部３３を除き、ベース部３１の先端部の一方の表面の全体を覆うものとなっている。このようなものとすることにより、欠損部（細胞載置部位）３３の認識がより容易となる。

吸水部３２は、その全体もしくは一部が、ベース部３１の表面に固定されている。吸水部３２は、耐寒性材料により形成されている。吸水部３２のベース部３１への固定は、接着剤、両面テープなどの接着性物質により行うことが好ましい。なお、部分的なヒートシールによって、固定してもよい。

吸水部としては、繊維からなるシート、多孔性樹脂シートなどの各種シートが使用できる。吸水部の厚みは１０μｍ～５ｍｍであることが好ましく、より好ましくは２０μｍ～２．５ｍｍである。そして、繊維からなるシートとしては、紙又は不織布が使用できる。

吸水部として紙を用いる場合、紙としては、密度が０．１～０．６ｇ／ｃｍ^３であり、坪量が１０～１３０ｇ／ｍ^２の紙であることが好ましい。特に密度が０．１２～０．３ｇ／ｃｍ^３であり、坪量が１０～１００ｇ／ｍ^２である紙は、保存液の吸収性に優れ、さらには、透過型顕微鏡を用いて載置部上に載置した細胞又は組織を観察することができるような、細胞又は組織の視認性に優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため好ましい。

吸水部として不織布を用いる場合、不織布を形成する繊維としては、セルロース繊維、セルロース繊維からなる再生繊維であるレーヨン繊維やキュプラ繊維、さらにはセルロース繊維からの半合成繊維であるアセテート繊維、ポリエステル繊維、ナイロン繊維、アクリル繊維、ポリプロピレン繊維、ポリエチレン繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ビニリデン繊維、ポリウレタン繊維、ビニロン繊維、ガラス繊維、絹繊維などが挙げられ、これら繊維を各種混合した不織布も用いることができる。中でもセルロース繊維、セルロース繊維由来の繊維でセルロース再生繊維であるレーヨン繊維やキュプラ繊維、更にはセルロース繊維からの半合成繊維であるアセテート繊維が好ましい。また、不織布としては、密度が０．１～０．４ｇ／ｃｍ^３であり、坪量が１０～１３０ｇ／ｍ^２の不織布であることが好ましい。特に密度が０．１２～０．３ｇ／ｃｍ^３であり、坪量が１０～１００ｇ／ｍ^２であるものが好ましい。

吸水部として、使用可能な多孔性樹脂シートとしては、例えば特公昭４２－１３５６０号公報や、特開平０８－２８３４４７号公報に記載される、少なくとも一軸方向に延伸し、樹脂の融点以上に加熱し焼結することで得た微細繊維状構造により多孔質構造を形成した樹脂シート、特開２００９－２３５４１７号公報（ＷＯ公開０３－０１４２０５、ＵＳＰ７７５８９５３、ＵＳＰ８１１０２８９）に記載される、乳化重合又は粉砕等の方法によって得られた熱可塑性樹脂の固体粉末を金型に充填し、加熱、焼結して粉末粒子表面を融着させて冷却することにより、多孔質構造を形成した樹脂シート等が挙げられる。

上記した多孔性樹脂シートを形成する樹脂としては、低密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、超高分子ポリエチレン等の各種ポリエチレンやポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレンやポリビニリデンジフロライド等のフッ素樹脂、エチレン－酢酸ビニル共重合体、ポリアミド、スチレン－アクリロニトリル共重合体、スチレン－ブタジエン－アクリロニトリル三元共重合体、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル等が挙げられる。

なお、吸水部３２の形態としては、上記のものに限定されるものではない。例えば、図７に示す生体細胞保持部３ａのように、生体細胞保持部３ａの側部に、ベース部露出部３５を有するものであってもよい。この実施例のものでは、生体細胞保持部３ａは、吸水部３２ａの両側部に生体細胞保持部３ａの長手方向に延びる向かい合う２つのベース部露出部３５を有している。

また、図８に示す生体細胞保持部３ｂのように、中央部に欠損部３３を有する個別吸水部３２ｂが複数設けられたものであってもよい。この実施例では、個別吸水部３２ｂは、円形状のものとなっており、内部に円形状の欠損部３３を備えている。そして、複数の個別吸水部３２ｂが、ベース部３１の表面に固定されている。また、個別吸水部３２ｂの外側および欠損部３３において、ベース部３１の表面は、露出している。なお、個別吸水部３２ｂの形状は、円形に限定されるものではなく、楕円状のもの、矩形状のもの、多角形状のものであってもよい。

また、図９に示す実施例の生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部３ｃのように、吸水部３２ｃは、所定の厚さ（高さ）を有するものであってもよい。この場合、吸水部３２ｃの厚さ（高さ）としては、２～７ｍｍ程度が好適であり、特に、２～５ｍｍが好ましい。このように、吸水部３２ｃがある程度の厚さを有する場合、欠損部３３ａにおける吸水部３２ｃの内面とベース部３１の上面により、細胞収納部が形成され、細胞の離出が抑制される。

筒状収納部材４は、図１０ないし図１２に示すように、生体細胞保持部３を被包可能に本体部２に着脱自在に取り付けられるものであり、一端が封鎖され、かつ耐寒性材料により形成されたものである。特に、この実施例の筒状収納部材４は、筒状本体４１と、その一端部内に収納された封止部材４２とを備える。筒状本体４１の一端部は、収納する封止部材(具体的には、通気性封止部材）４２により通気可能に封止されている。

さらに、この実施例の筒状収納部材４では、筒状本体４１の先端部には、錘４３が収納されている。錘４３は、封止部材４２よりも先端側に収納されている。錘４３を設けることにより、液体窒素タンクに投入された筒状収納部材４は、その先端側が下方を確実に向くものとなる。また、筒状収納部材４は、生体細胞保持部３に接触することなく被包できる内径および長さを備えている。また、筒状本体４１は、後端（開口部）の外面には、開口部の認識を容易とするための着色部４４を備えている。

筒状収納部材４の形成材料としては、例えば、３－フッ化ポリエチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリカーボネート、ナイロン、ポリスルホン、ポリエステル（例えば、ＰＥＴ）、ポリスチレン、ポリイミド、超高分子量ポリエチレン、エチレン－酢酸ビニル共重合体などの合成樹脂からなるフィルムあるいはそれらの積層体が挙げられる。特に、液体窒素耐性材料、言い換えれば、液体窒素に接触しても脆化しないものが好ましい。

次に、本発明の生体細胞凍結保存具１および生体細胞凍結保存用具１０の使用方法について説明する。
この説明では、生体細胞である卵子を凍結保存する場合を例にとり説明する。
まず、ピペットの先端に卵子を採取し、卵子の細胞内液を平衡液に置換する作業を行い、さらに、細胞外液をガラス化液に置換する作業を行う。そして、顕微鏡下において、本発明の生体細胞凍結保存具１の生体細胞保持部３に設けられた吸水部３２の欠損部３３に卵子を少量のガラス化液とともに配置させ、ベース部材３１の表面に付着させる。卵子が付着した生体細胞凍結保存具１の生体細胞保持部をあらかじめ準備しておいた液体窒素に浸漬し凍結（ガラス化）させる。そして、筒状収納部材４内に、卵子が付着した生体細胞凍結保存具１を挿入し、収納容器（図示せず）内に、生体細胞凍結保存具１を収納した筒状収納部材４を収納させ、続いて、収納容器を液体窒素タンク内に入れ保存する。

また、本発明の生体細胞凍結保存具および生体細胞凍結保存用具としては、図２１ないし図２３に示すような生体細胞凍結保存具１ａであってもよい。
この実施例の生体細胞凍結保存具１ａは、耐寒性材料により形成された本体部２と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部３ｄとを備える。そして、生体細胞保持部３ｄは、光透過性を有し、細長いベース部３１と、ベース部の少なくとも一方の表面の両側部に固定された細長い２つの吸水部３２ａ，３２ｂを備える。そして、２つの吸水部３２ａ，３２ｂ間にて露出するベース部３１が、光透過性を有する細胞載置部位３３となっている。

この実施例の生体細胞凍結保存具１ａの基本構成は、上述した生体細胞凍結保存具１と同じであり、相違点は、吸水部の形態のみである。
光透過性を有するベース部３１は、上述したものと同じである。図２１および図２３に示すように、ベース部３１の一方の表面に吸水部３２ａ，３２ｂが固定されている。なお、吸水部３２ａ，３２ｂは、ベース部３１の表面および裏面に設けてもよい。吸水部３２ａ，３２ｂは、ベース部３１の表面の側部を被覆するように、長手方向に細長く延びるものとなっている。２つの吸水部３２ａ，３２ｂは、向かい合うように設けられている。

吸水部３２ａ，３２ｂの幅としては、０．２～１．５ｍｍが好ましく、特に、０．３～１．０ｍｍが好ましい。そして、向かい合う吸水部３２ａ，３２ｂ間において、ベース部３１の表面が露出し、生体細胞載置部位３３となっている。また、吸水部３２ａ，３２ｂの長さとしては、５～７０ｍｍが好ましく、特に、１０～５０ｍｍが好ましい。また、吸水部３２ａ，３２ｂ間の離間距離、言い換えれば、生体細胞載置部位３３の幅は、０．５～１．５ｍｍが好ましい。吸水部３２ａ，３２ｂの構成材料としては、上述した吸水部３２にて説明したものが使用可能である。

この実施例の生体細胞凍結保存具１ａにおいても、図２３に示すように、生体細胞保持部３ｄの先端部には、マーカー３４が設けられている。マーカー３４は、生体細胞保持部３ｄの先端部の一方の表面（具体的には、吸水シートまたはベース部の表面）に、有色を付する（油性インクで着色する）ことにより形成される。
また、この実施例の生体細胞凍結保存具１ａにおいても、上述した筒状収納部材４を用いることができる。生体細胞凍結保存具１ａと筒状収納部材４により、生体細胞凍結保存用具が、構成される。

また、本発明の生体細胞凍結保存具および生体細胞凍結保存用具としては、図２４および図２５に示すような生体細胞凍結保存具１ｂであってもよい。
この実施例の生体細胞凍結保存具１ｂは、耐寒性材料により形成された本体部２と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部３ｅとを備える。そして、生体細胞保持部３ｅは、光透過性を有し、細長いベース部３１と、ベース部３１の少なくとも一方の表面に、ベース部３１を横切るように固定された向かい合う２つの吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄを有し、吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄ間にて露出するベース部３１が、光透過性を有する細胞載置部位３３となっている。

この実施例の生体細胞凍結保存具１ｂの基本構成は、上述した生体細胞凍結保存具１と同じであり、相違点は、吸水部の形態のみである。
光透過性を有するベース部３１は、上述したものと同じである。図２４および図２５に示すように、ベース部３１の一方の表面に吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄが固定されている。なお、吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄは、ベース部３１の表面および裏面に設けてもよい。
吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄは、ベース部３１の表面を横切るように、複数設けられている。各吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄは、ベース部３１の長手方向に隣り合う吸水部が向かい合うように設けられている。隣り合う吸水部間における露出するベース部部分が、生体細胞載置部位３３となっている。

吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄは、ベース部３１の幅全体に延びるものとなっている。なお、吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄは、図２６に示す実施例の生体細胞保持部３ｆのように、ベース部３１の幅全体ではなく、ある程度の長さ延びるものであってもよい。この場合、吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄは、図ベース部３１の幅の１／２以上延びるものであることが好ましい。

吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄのベース部３１の長手方向長は、０．２～５ｍｍが好ましく、特に、０．５～３ｍｍが好ましい。吸水部の数としては、２～１０程度が好ましく、特に、２～５が好ましい。また、吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄの離間距離、言い換えれば、生体細胞載置部位３３の幅は、０．５～１．５ｍｍが好ましい。吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄの構成材料としては、上述した吸水部３２にて説明したものが使用可能である。

上述した実施例の生体細胞凍結保存具においても、図２３、図２５および図２６に示すように、生体細胞保持部３ｄ，３ｅ、３ｆの先端部には、マーカー３４が設けられている。マーカー３４は、生体細胞保持部の先端部の一方の表面（具体的には、吸水シートまたはベース部の表面）に、有色を付する（油性インクで着色する）ことにより形成される。

また、上述した実施例の生体細胞凍結保存具１ａ，１ｂおよび図２６に示した生体細胞保持部３ｆを有する実施例のすべてにおいて、図９に示す実施例の生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部３ｃのように、吸水部は、所定の厚さ（高さ）を有するものであってもよい。この場合、吸水部の厚さ（高さ）としては、２～７ｍｍ程度が好適であり、特に、２～５ｍｍが好ましい。
また、上述したの実施例の生体細胞凍結保存具１ａ，１ｂにおいても、上述した筒状収納部材４を用いることにより、生体細胞凍結保存用具を構成することができる。

また、本発明の生体細胞凍結保存具および生体細胞凍結保存用具としては、図１３ないし図１９に示すような生体細胞凍結保存具５および生体細胞凍結保存用具２０であってもよい。
この実施例の生体細胞凍結保存具５は、耐寒性材料により形成された本体部５１と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部５２とを備える。生体細胞保持部５２は、光透過性を有するベース部５３と、ベース部５３の表面に固定された吸水部５４とを備える。吸水部５４は、吸水部５４により取り囲まれた欠損部６１を備え、欠損部６１において、ベース部５３の表面が露出し、光透過性を有している。

生体細胞保持部５２のベース部５３は、断面が略矩形状であり、本体部５１と接続された基端部５９を備えている。そして、この実施例のものでは、ベース部５３は、細長い幅の狭い帯状（薄板状）のものとなっている。そして、その表面に、吸水部５４が固定されている。ベース部５３の幅は、０．４～１．０ｍｍが好ましく、長さは、５～３０ｍｍが好ましく、全体の厚さは、０．０８～１．０ｍｍが好ましい。また、ベース部５３の肉厚な基端部の長さは、５～３０ｍｍが好ましく、本体部の長さは、２０～１００ｍｍが好ましい。本体部５１は、先端方向に突出する突出部６４を備え、ベース部５３は、突出部６４を収納する凹部６５を備えている。

そして、本発明の生体細胞凍結保存具５においても、図１３、図１４、図１６および図１７に示すように、生体細胞保持部５２は、複数の欠損部（細胞載置部位）６１を備えている。具体的には、生体細胞保持部５２の長手方向に、複数設けられている。具体的には、５つの欠損部（細胞載置部位）６１が設けられている。欠損部（細胞載置部位）６１の数としては、１～７程度が好ましく、特に、２～５が好適である。欠損部の大きさとしては、円形の場合、直径が．０．５～１．５ｍｍ程度が好適である。

また、欠損部６１は、円状形態であることが好ましい。さらに、吸水部５４は、光難透過性シートであることが好ましい。このようなものとすることにより、透過型顕微鏡を用いた生体細胞の載置作業を行う際に、吸水部５４が難透過性であり、欠損部６１には光が透過するため、細胞を載置するターゲットである欠損部（細胞載置部位）６１が浮かび上がるように見え、ターゲットの認識が極めて容易である。

また、この実施例の生体細胞凍結保存具５では、図１４および図１６に示すように、生体細胞保持部５２は、吸水部５４の両側部に生体細胞保持部５２の長手方向に延びる向かい合う２つのベース部露出部（後述する膨出部５７，５８）を有している。なお、吸水部５４は、欠損部６１を除き、ベース部５３の先端部の一方の表面の全体を覆うものであってもよい。さらには、図７に示した生体細胞保持部３ｂのように、中央部に欠損部を有する個別吸水部が複数設けられたものであってもよい。

吸水部５４は、その全体もしくは一部が、ベース部５３の表面に固定されている。吸水部５４のベース部５３への固定は、接着剤、両面テープなどの接着性物質により行うことが好ましい。なお、部分的なヒートシールによって、固定してもよい。
吸水部としては、繊維からなるシート、多孔性樹脂シートなどの各種シートが使用できる。吸水部の厚みは１０μｍ～５ｍｍであることが好ましく、より好ましくは２０μｍ～２．５ｍｍである。そして、繊維からなるシートとしては、紙又は不織布が使用できる。吸水部としては、上述したものが好適に使用できる。

さらに、この実施例の生体細胞凍結保存具５では、図１３、図１４、図１６ないし図１８に示すように、ベース部５３の吸水部５４の固定部の両側部に設けられかつ生体細胞保持部５２の長手方向に延びる２つの側部膨出部５７，５８を有している。このため、生体細胞凍結保存具５は、吸水部固定部の両側部に膨出部を有するため、生体細胞載置時における生体細胞の側部方向への移動を確実に抑制できる。

さらに、この実施例の生体細胞凍結保存具５では、図１３ないし図１８（特に、図１５，図１６）に示すように、生体細胞保持部５２は、吸水部固定部より生体細胞保持部５２の先端側に設けられた突出部６３を備えている。突出部６３は、生体細胞保持部５２の先端部より、上面側（吸水部側）に突出するものとなっている。また、突出部６３は、図１７に示すように、先端面は、若干基端側に傾斜する傾斜面となっている。このような突出部６３を形成することにより、もし、生体細胞収納部より生体細胞が離脱して、先端側に移動したとき、生体細胞凍結保存具５、言い換えれば、生体細胞保持部５２からの落下を防止する。特に、この実施例の生体細胞凍結保存具５では、上述したように、生体細胞保持部５２の両側部に設けられた膨出部５７，５８と協働することにより、生体細胞の落下を防止する。

本体部５１、ベース部５３および吸水部５４は、耐寒性材料により形成されている。特に、本体部５１、ベース部５３および吸水部５４は、液体窒素耐性材料、言い換えれば、液体窒素に接触しても脆化しないものが好ましい。また、ベース部５３は、透明性を有することが好ましく、また、多少の可撓性を有するものであることが好ましい。本体部５１およびベース部５３の形成材料としては、例えば、３－フッ化ポリエチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリカーボネート、ナイロン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリイミド、超高分子量ポリエチレン、エチレン－酢酸ビニル共重合体などの合成樹脂、また、それら合成樹脂により形成されたフィルムの積層体が好適に使用される。

そして、この実施例の生体細胞凍結保存具５では、図１３ないし図１９に示すように、生体細胞保持部５２は、生体細胞保持部５２の長手方向に延び、かつ、生体細胞保持部５２の先端より突出する熱伝導性体５５，５６を有している。特に、この実施例の生体細胞凍結保存具５では、熱伝導性体５５，５６は、線状熱伝導性体となっており、生体細胞保持部５２の両方の側部に設けられている。さらに、この実施例のものでは、熱伝導性体５５，５６は、吸水部固定部を越えて、ベース部５３の基端側に延び、生体細胞保持部５２の基端もしくはその付近に到達するものとなっている。また、熱伝導性体５５，５６は、先端部５５ａ，５６ａを除き、側部膨出部５７，５８内に埋設されている。言い換えれば、先端部５５ａ，５６ａは、生体細胞保持部５２の先端より突出し、外面が露出した状態となっている。

また、この実施例では、熱伝導性体５５，５６は、線状部材もしくは細い棒状部材により形成されている。さらに、熱伝導性体５５，５６の先端部５５ａ，５６ａの形状は、基端側に向かって湾曲する湾曲先端部となっているものであってもよい。この場合、湾曲先端部５５ａ，５６ａは、図１４に示すように、生体細胞凍結保存具５の先端部の前方に突出し、かつ、突出部６３を保護するものであることが好ましい。
熱伝導性体５５，５６は、熱伝導性材料により形成されている。熱伝導性材料としては、銀、銅、アルミニウム、ステンレス鋼などの金属類、窒化アルミニウム、窒化ケイ素、アルミナなどの熱伝導性セラミックスなどが好適に使用できる。

図１９に示す実施例の生体細胞凍結保存用具２０は、上述した生体細胞凍結保存具５と、生体細胞凍結保存具５を収納可能かつ耐寒性材料により形成された一端が閉塞した筒状収納部材７とを備える。
筒状収納部材７は、図１９に示すように、生体細胞凍結保存具５を収納可能かつ耐寒性材料により形成された一端が閉塞した筒状体である。筒状収納部材７は、内部に生体細胞保持部材収納部７１を有する筒状体７０と、筒状体７０の先端に設けられた熱伝導性部材７２とを備える。また、この実施例では、筒状収納部材７は、先端閉塞部７３と、基端開口部７４と、内部に生体細胞保持部材収納部７１を有する筒状体７０と、筒状体７０の先端部内に収納された熱伝導性部材７２とにより構成されている。

熱伝導性部材７２は、筒状体７０の内部に移動不能に収納されており、また、先端閉塞部７３の内面に当接するように収納されている。また、熱伝導性部材７２は、金属製の円柱状のものが用いられている。熱伝導性部材７２の上面は、生体細胞凍結保存具５の熱伝導性体５５，５６の先端部５５ａ，５６ａと接触可能なものとなっている。なお、熱伝導性部材７２は、先端面、先端側側面などが筒状体７０より露出するものであってもよい。

また、このタイプの生体細胞凍結保存具においても、図２０に示す生体細胞凍結保存具５ａのように、ベース部５３の上面に設けられる吸水部５４ａは、所定の厚さ（高さ）を有するものであってもよい。この場合、吸水部５４ａの厚さ（高さ）としては、２～７ｍｍ程度が好適であり、特に、２～５ｍｍが好ましい。このように、吸水部５４ａがある程度の厚さを有する場合、欠損部６１における吸水部５４ａの内面とベース部５３の上面により、細胞収納部が形成され、載置される細胞６８の離出が抑制される。

筒状体７０は、耐寒性材料により形成されている。特に、筒状体７０は、液体窒素耐性材料、言い換えれば、液体窒素に接触しても脆化しないものが好ましい。また、筒状体７０は、内部が視認可能な透明もしくは半透明体であることが好ましい。筒状体７０の形成材料としては、例えば、３－フッ化ポリエチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリカーボネート、ナイロン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリイミド、超高分子量ポリエチレン、エチレン－酢酸ビニル共重合体などの合成樹脂、また、それら合成樹脂により形成されたフィルムの積層体が好適に使用される。

また、筒状収納部材７の生体細胞保持部材収納部７１の長さは、生体細胞凍結保存具５の全長より、１０～５０ｍｍ長いものであることが好ましい。また、筒状収納部材７（筒状体７０）の全長は、５０～１００ｍｍが好ましく、内径は、２～５ｍｍが好ましい。

次に、本発明の生体細胞凍結保存用具５の使用方法について説明する。
この説明では、生体細胞である卵子を凍結保存する場合を例にとり説明する。
まず、複数の卵子を採取し、卵子の細胞内液を平衡液に置換する作業を行い、さらに、細胞外液をガラス化液に置換する作業を行う。そして、顕微鏡下において、図１８に示すように、生体細胞凍結保存具５の生体細胞保持部５２に設けられた吸水部５４の欠損部６１に卵子６８を少量のガラス化液とともに配置させ、ベース部材５３の表面に付着させる。卵子が付着した生体細胞凍結保存具５を生体細胞保持部５２側より、筒状収納部材７内に挿入し、図１９に示すように、生体細胞凍結保存具５の生体細胞保持部５２の先端より突出する熱伝導性体５５，５６の先端部５５ａ，５６ａが、筒状収納部材７内の熱伝導性部材７２と接触する状態とする。

そして、生体細胞凍結保存具５を収納した筒状収納部材７を先端側（熱伝導性部材７２側）より、あらかじめ準備しておいた液体窒素に浸漬し凍結（ガラス化）させる。筒状収納部材７の液体窒素との接触により、筒状収納部材７内の熱伝導性部材７２は急激冷却され、その冷却は、熱伝導性部材７２と接触する生体細胞凍結保存具５の生体細胞保持部５２の熱伝導性体５５，５６より温度を急激に奪うものとなり、生体細胞保持部５２に保持されてる卵子も急激に冷却される。収納容器（ケーン）に、ガラス化した卵子を付着保持する生体細胞凍結保存具５を筒状収納部材７ごと収納した後、収納容器を液体窒素タンク内に入れ保存する。

本発明の生体細胞凍結保存具は、以下のものである。
（１） 耐寒性材料により形成された本体部と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部とを備える生体細胞凍結保存具であって、
前記生体細胞保持部は、光透過性を有するベース部と、前記ベース部の表面に固定された吸水部とを備え、前記吸水部は、前記吸水部により取り囲まれた欠損部を備え、前記欠損部において、前記ベース部の前記表面が露出し、光透過性を有している生体細胞凍結保存具。

この生体細胞凍結保存具では、吸水部により取り囲まれた欠損部を備え、欠損部は光透過性を有するため、細胞の載置作業を行う際、欠損部の上面にピペットの先端部を配置したとき、透過型顕微鏡によるピペット先端の確認が容易である。また、過剰なガラス化液が、細胞とともに欠損部に滴下されても、ガラス化液は、欠損部を取り囲む吸水部に吸収されるため、除去操作も不要である。このため、生体細胞の凍結を迅速に行うことができる。

また、上記の実施態様は、以下のものであってもよい。
（２） 前記欠損部における前記ベース部の表面が、細胞載置部位である上記（１）に記載の生体細胞凍結保存具。
（３） 前記生体細胞凍結保存具は、複数の前記欠損部を備えている上記（１）または（２）に記載の生体細胞凍結保存具。
（４） 前記欠損部は、円状または多角形状である上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。

また、本発明の生体細胞凍結保存具は、以下のものである。
（５） 耐寒性材料により形成された本体部と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部とを備える生体細胞凍結保存具であって、
前記生体細胞保持部は、光透過性を有し、細長いベース部と、前記ベース部の少なくとも一方の表面の両側部に固定された細長い２つの吸水部を有し、前記２つの吸水部間にて露出する前記ベース部が、光透過性を有する細胞載置部位となっている生体細胞凍結保存具。

また、本発明の生体細胞凍結保存具は、以下のものである。
（６） 耐寒性材料により形成された本体部と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部とを備える生体細胞凍結保存具であって、
前記生体細胞保持部は、光透過性を有し、細長いベース部と、前記ベース部の少なくとも一方の表面に、前記ベース部を横切るように固定された向かい合う２つの吸水部を有し、前記２つの吸水部間にて露出する前記ベース部が、光透過性を有する細胞載置部位となっている生体細胞凍結保存具。

これら生体細胞凍結保存具においても、吸水部に近接する細胞載置部位は、光透過性を有するため、細胞の載置作業を行う際、細胞載置部位の上面にピペットの先端部を配置したとき、透過型顕微鏡によるピペット先端の確認が容易である。また、過剰なガラス化液が、細胞とともに細胞載置部位に滴下されても、ガラス化液は、細胞載置部位に近接する吸水部に吸収されるため、除去操作も不要である。このため、生体細胞の凍結を迅速に行うことができる。

また、上記の実施態様は、以下のものであってもよい。
（７） 前記ベース部は、無色透明である上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
（８） 前記ベース部は、透明性シートである上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
（９） 前記ベース部は、細長い平板状の可撓性シートである上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
（１０） 前記ベース部は、細長い硬質平板部材である上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
（１１） 前記吸水部は、光難透過性シートである上記（１）ないし（１０）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。

また、本発明の生体細胞凍結保存用具は、以下のものである。
（１２） 上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具と、前記生体細胞凍結保存具を収納可能かつ耐寒性材料により形成された一端が閉塞した筒状収納部材とを備える生体細胞凍結保存用具。

Claims (10)

1. 耐寒性材料により形成された本体部と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部とを備える生体細胞凍結保存具であって、
   前記生体細胞保持部は、光透過性を有するベース部と、前記ベース部の表面に固定された吸水部と、前記吸水部により取り囲まれた欠損部とを備え、
   前記吸水部は、光難透過性シートからなり、前記ベース部は、細長い平坦シート状であり、前記欠損部は、光難透過性シートである前記吸水部により取り囲まれた円状または多角形状となっており、さらに、前記欠損部は、前記ベース部の前記表面が露出した光透過性を有する平坦な生体細胞載置部位を形成しており、かつ、透過型顕微鏡を用いた生体細胞の載置作業を行う際に、光難透過性である前記吸水部により取り囲まれ、光が透過する前記生体細胞載置部位が前記生体細胞を載置するターゲットを形成することを特徴とする生体細胞凍結保存具。
2. 前記吸水部により取り囲まれ、光が透過する前記生体細胞載置部位は、円形であり、直径が．０．５～１．５ｍｍである請求項１に記載の生体細胞凍結保存具。
3. 前記生体細胞凍結保存具は、複数の前記欠損部を備えている請求項１または２に記載の生体細胞凍結保存具。
4. 前記吸水部は、前記欠損部を除き、前記ベース部の先端部の一方の表面の全体を覆うものとなっている請求項１ないし３のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
5. 前記生体細胞保持部は、中央部に前記欠損部を有する個別吸水部を複数備えており、前記個別吸水部の外側および前記欠損部において、前記ベース部の表面は、露出している請求項１ないし３のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
6. 前記ベース部は、無色透明である請求項１ないし５のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
7. 前記ベース部は、透明性シートである請求項１ないし５のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
8. 前記ベース部は、細長い平板状の可撓性シートである請求項１ないし７のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
9. 前記ベース部は、細長い硬質平板部材である請求項１ないし８のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
10. 請求項１ないし９のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具と、前記生体細胞凍結保存具を収納可能かつ耐寒性材料により形成された一端が閉塞した筒状収納部材とを備える生体細胞凍結保存用具。

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