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JP7109532B2 - チロシナーゼアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents
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Description

本発明は、チロシナーゼによって媒介される皮膚着色の改善のための、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡを相補的にターゲットにするペプチド核酸誘導体に関するものである。
メラニンは、生きている生物体で生成される天然かつ重合体の黒茶色色素を指す。３種類のタイプのメラニン、つまり、ユーメラニン、フェオメラニン、及びニューロメラニンが存在する。ユーメラニン及びフェオメラニンは、皮膚で合成される。一方、ニューロメラニンは脳で見付かるメラニンであり、その生理学的機能は未だ明らかではない。
皮膚中のメラニンは、ＵＶ線（紫外線）を有効に吸収し、自然光中のＵＶ線（紫外線）から動物を保護する。よって、日焼けは、動物が日光中のＵＶ線から自分を保護する自然の過程である。
Figure 0007109532000001
アミノ酸のチロシンは、チロシナーゼの存在下で一連の複雑な反応後にユーメラニンまで重合する。ユーメラニンは、５，６－ジヒドロキシインドール（ＤＨＩ）及び５，６－ジヒドロキシインドール－２－カルボン酸（ＤＨＩＣＡ）の重合体を指す。フェオメラニンは、チロシンがシステインまたはグルタチオンの存在下でチロシナーゼによって重合される場合に形成される。
スキーム１は、ユーメラニン及びフェオメラニンの生合成中、ＴＹＲ（チロシナーゼ）、ＴＹＲＰ－１（チロシナーゼ関連タンパク質１、つまりＤＨＩＣＡオキシダーゼ）、及びＴＹＲＰ－２（チロシナーゼ関連タンパク質２、つまりＤＯＰＡクロムタウトメラーゼ）を伴う反応を要約するものである[Int. J. Mol. Sci. vol 10, 4066－4087 (2009)]。
スキーム１
Figure 0007109532000002
チロシナーゼ（ＴＹＲ）が皮膚でメラニン生合成に重要な役割を果たすことを考慮して、ＴＹＲ阻害剤が過度な皮膚着色、つまり過色素沈着症を軽減させるための美容成分として使用され、開発されてきた。ＴＹＲ阻害剤は、多数の論文でメラニン形成に対するその効果について考察された[Int. J. Cosmetic Sci. vol 33, 210－221 （2011）; Int. J. Mol. Sci. vol 10, 2440－2475 (2009)]。
Figure 0007109532000003
ハイドロキノン（１，４－ジヒドロキシベンゼン）が、数十年間、過色素沈着症の局所治療に使用されてきた[JAMA vol 194(9), 965－967 (1965)]。ハイドロキノンは、チロシナーゼの活性部位に結合することにより、ＴＹＲ活性を阻害することが公知となっている。２００６年、米国ＦＤＡは、潜在的な発がん性を始めとする安全上のおそれによってハイドロキノンを含む全てのＯＴＣ（処方箋がなくても買える）製品の事前承認を撤回した。ハイドロキノンは、チロシナーゼを含む膜脂質及びタンパク質を損傷させるＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ：活性酸素種）を誘導する。膜脂質の酸化的損傷によってメラニン細胞は永久的に取り除かれる。
アルブチン（ハイドロキノン－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシド）は、クマコケモモ植物から抽出したグリコシル化されたハイドロキノンである。アルブチンはまた、小麦及び梨の皮から見出される。ハイドロキノンのように、アルブチンはＴＹＲの活性部位に競合的に結合することにより、メラニン形成を阻害する[J. Pharmacol. Exp. Ther. vol 276(2), 765－769 (1996)]。アルブチンは、ハイドロキノンよりもメラニン細胞に対する毒性が弱い。
デオキシアルブチンは、アルブチンの合成誘導体であり、ＴＹＲ阻害活性においてハイドロキノン及びアルブチンに匹敵する。デオキシアルブチンは、細胞毒性がアルブチンよりも弱く、ハイドロキノンよりも同様に弱い[J. Dermatol. Sci. vol 55(3), 179－184 (2009)]。デオキシアルブチンは、12週間局所的に治療されたヒト被実験者において皮膚の美白を著しく向上させた[Exp. Dermatol. vol 14(8), 601－608 (2005)]。
コウジ酸は、醤油及び酒、つまり日本酒の製造のために真菌発酵中に生成されるキレート化剤である。コウジ酸は、食品及び化粧品において色を保存するまたは変化させるために使用されている。コウジ酸は、ＴＹＲの活性部位中、銅イオンにキレート化してメラニン形成を阻害する。また、ＤＯＰＡクロムの５，６－ジヒドロキシインドール－２－カルボン酸への互変異性化を抑制する[J. Pharm. Pharmacol. vol 46(12), 982－985 (1994)]。コウジ酸は、シミの治療に広く使用されているが、接触皮膚炎、鋭敏化、及び紅斑を誘発し得る[J. Drugs Dermatol. vol 6(1), 32－39 (2007)]。
多様なＴＹＲ阻害剤が存在するが、ＴＹＲに対するこれらのIC50値は大部分の場合にマイクロモル（μＭ）単位である[J. Enzyme Inhibition Med. Chem. vol 32(1), 403－425 (2017)]。上記のようなIC50値は、それらの分子の大きさを考慮すると不十分なものと見なされ、他の分子ターゲットとの交差反応可能性を引き起こす。不十分な阻害活性は結局多量の経皮用量ということになるので、皮膚着色に対する所望の経皮活性、及び、その上安全性を満たすためには阻害効力の著しい改善が必要となる。
プレｍＲＮＡ： 遺伝情報は、ＤＮＡ（２－デオキシリボース核酸）上に保持されている。ＤＮＡは、転写されて核でプレｍＲＮＡ（プレメッセンジャーリボ核酸）を生成する。哺乳動物プレｍＲＮＡは、通常エクソンとイントロンからなり、エクソンとイントロンは、下記に模式図的に提供されるように互いに対して相互連結される。エクソン及びイントロンを下記の図に例示したようにナンバリングする。
プレｍＲＮＡ構造の模式図
Figure 0007109532000004
プレｍＲＮＡのスプライシング： プレｍＲＮＡは、集合的に「スプライシング」と呼ばれ下記の図において模式図的に要約する一連の複雑な反応によるイントロンの除去後にｍＲＮＡに変換される[Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291－336 (2003); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5), 386－398 (2005); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15(2), 108－121 (2014)]。
Figure 0007109532000005
スプライシングは、プレｍＲＮＡとスプライシングアダブター因子の間の「スプライソソームＥ複合体」（つまり、初期スプライソソーム複合体）の形成によって開始される。「スプライソソームＥ複合体」において、Ｕ１はエクソン Ｎとイントロン Ｎの接合部に結合し、Ｕ２ＡＦ３５はイントロン Ｎとエクソン （Ｎ＋１）の接合部に結合する。よって、エクソン／イントロンまたはイントロン／エクソンの接合部は、前記初期スプライソソーム複合体の形成に重要となる。「スプライソソームＥ複合体」は、Ｕ２と追加的に複合体を形成すると発達して「スプライソソームＡ複合体」になる。前記「スプライソソームＡ複合体」は、近くのエクソンに隣接するように前記イントロンを除去またはスプライスアウトする（ｓｐｌｉｃｅ ｏｕｔ）ための一連の複雑な反応を経る。
リボソームのタンパク質合成： タンパク質は、ＤＮＡ（２－デオキシリボース核酸）によってコードされる。ＤＮＡは、細胞刺激に応答して或いは自発的に転写され、核でプレｍＲＮＡ（プレメッセンジャーリボ核酸）を生成する。プレｍＲＮＡのイントロンは、酵素によってスプライスアウトされてｍＲＮＡ（メッセンジャーリボ核酸）をもたらし、次いで前記ｍＲＮＡは細胞質に移動する。細胞質において、リボソームと呼ばれる翻訳メカニズムの複合体がｍＲＮＡに結合し、前記複合体はコードされた遺伝情報を前記ｍＲＮＡに沿ってスキャンしながらタンパク質合成を行う[Biochemistry vol 41, 4503－4510 (2002); Cancer Res. vol 48, 2659－2668 (1988)]。
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）： ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びプレｍＲＮＡを含む核酸に配列特異的な様式で（つまり相補的に）結合するオリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）と称する。
ＡＳＯが例えば細胞質中のｍＲＮＡに固く結合する場合、前記ＡＳＯは、前記ｍＲＮＡに沿った、リボソームのタンパク質合成を阻害し得る。ＡＳＯはそのターゲットタンパク質についてのリボソームのタンパク質合成を阻害するために細胞質内に存在しなければならない。
スプライシングのアンチセンス阻害： ＡＳＯが核中のプレｍＲＮＡに固く結合する場合、前記ＡＳＯはプレｍＲＮＡのｍＲＮＡへのスプライシングを阻害または調節することができる。ＡＳＯはプレｍＲＮＡのｍＲＮＡへのスプライシングを阻害または調節するために、核内に存在しなければならない。そのようなスプライシングのアンチセンス阻害によって、前記ＡＳＯがターゲットにするエクソンのないｍＲＮＡまたはｍＲＮＡが生成される。そのようなｍＲＮＡは、「スプライスバリアント」と称され、完全長ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質よりもさらに小さいタンパク質をコードする。
基本的に、「スプライソソームＥ複合体」の形成の阻害によってスプライシングを妨げることができる。ＡＳＯが（５’→３’）エクソン－イントロンの接合部、つまり「５’スプライス部位」に固く結合する場合、前記ＡＳＯはプレｍＲＮＡと因子Ｕ１の間の複合体の形成を阻止し、よって「スプライソソームＥ複合体」の形成を阻止する。同様に、ＡＳＯが（５’→３’）イントロン－エクソンの接合部、つまり「３’スプライス部位」に固く結合する場合には「スプライソソームＥ複合体」は形成され得ない。
３’スプライス部位及び５’スプライス部位を下記の図において模式図的に例示する。
Figure 0007109532000006
非天然オリゴヌクレオチド： ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドは、内因性ヌクレアーゼによる分解に感受性であり、その治療学的有用性が制限される。今まで、多くのタイプの非天然の（自然発生でない）オリゴヌクレオチドが開発され、集中的に研究されてきた[Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533－540 (2006)]。これらの一部は、ＤＮＡ及びＲＮＡに比べて長期間の代謝安定性を示す。幾つかの典型的な非天然オリゴヌクレオチドの化学構造を下記に提供する。このオリゴヌクレオチドは、予想通り、ＤＮＡまたはＲＮＡのように相補性核酸に結合する。
Figure 0007109532000007
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド： ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）は、モノマー一つ当り一つの硫黄原子で主鎖ホスフェート酸素原子のうちの一つが置換されているＤＮＡ類似体である。そのような小さい構造変化によって、ＰＴＯがヌクレアーゼによる分解に対して比較的抵抗性になった[Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367－402 (1985)]。
ＰＴＯ及びＤＮＡの主鎖における構造類似性に鑑みて、これらは二つ共、大部分の哺乳動物の細胞型における細胞膜を不十分に透過する。しかし、ＤＮＡの輸送体を豊富に発現するの細胞の一部の型の場合、ＤＮＡ及びＰＴＯは良好な細胞透過を示す。全身投与されたＰＴＯは、肝臓および腎臓に分配され易いことが公知となっている[Nucleic Acids Res. vol 25, 3290－3296 (1997)]。
インビトロでＰＴＯの細胞透過を促進するために、リポフェクションが広く実行されている。しかし、リポフェクションは、細胞膜を物理的に変更させ、細胞毒性を誘発し、よってインビボ治療的使用において長期間理想的ではない場合がある。
過去３０年にわたり、アンチセンスＰＴＯ及びＰＴＯのバリアントが、癌、免疫学的障害、代謝疾病等の治療に臨床的に評価されてきた[Biochemistry vol 41, 4503－4510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533－540 (2006)]。そのようなアンチセンス薬物候補のうち多数は、部分的にＰＴＯの不十分な細胞透過のために、うまく開発できなかった。この不十分な細胞透過を克服するためには、ＰＴＯは治療学的活性のために高用量で投与される必要がある。しかし、ＰＴＯは、血液凝固時間の増加、補体活性化、尿細管性腎症（ｔｕｂｕｌａｒ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、クッパー細胞活性化、及び、巨脾症、リンパ組織過形成、単核細胞浸潤を含む免疫刺激を含む、用量制限毒性と関連することが公知となっている[Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533－540 (2006)]。
多数のアンチセンスＰＴＯが、肝臓または腎臓から著しく起因する疾病に対して然るべき臨床的活性を示すことが明らかになっている。ミポメルセン（Ｍｉｐｏｍｅｒｓｅｎ）は、ＬＤＬコレステロール輸送に関連するタンパク質であるａｐｏＢ－１００の合成を阻害するＰＴＯ類似体である。ミポメルセンは、アテローム性動脈硬化患者において十分な臨床活性を表したが、これは肝臓へのその優先的な分配に起因する可能性が高い[Circulation vol 118(7), 743－753 (2008)]。ＩＳＩＳ－１１３７１５は、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）の合成を阻害するＰＴＯアンチセンス類似体であり、ＩＩ型糖尿病患者において治療学的活性を示すことが明らかになった[Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331－336 (2004)]。
ロックド核酸： ロックド核酸（ＬＮＡ）において、ＲＮＡの主鎖リボース環が構造的に束縛されているため、これによってＲＮＡまたはＤＮＡに対する結合親和性が増加する。よって、ＬＮＡは高親和性ＤＮＡまたはＲＮＡ類似体と見なされてもよい[Biochemistry vol 45, 7347－7355 (2006)]。
ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド： ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）において、ＤＮＡの主鎖ホスフェート及び２－デオキシリボースが、それぞれホスホアミダイト及びモルホリンに置換されている[Appl. Microbiol. Biotechnol. vol 71, 575－586 (2006)]。ＤＮＡ主鎖は負に荷電されるのに対し、ＰＭＯ主鎖は荷電されない。よって、ＰＭＯとｍＲＮＡの間の結合は、これらの主鎖間の静電気的反発がなく、ＤＮＡとｍＲＮＡの間の結合よりさらに強い傾向がある。ＰＭＯはＤＮＡと構造的に非常に相違するため、ＰＭＯはＤＮＡまたはＲＮＡを認識する肝輸送体によって認識されないと言える。それにも拘らず、ＰＭＯは細胞膜を容易に透過できない。
ペプチド核酸： ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、単位主鎖としてＮ－（２－アミノエチル）グリシンを有するポリペプチドであり、ニールセン博士（Ｄｒ．Ｎｉｅｌｓｅｎ）と同僚らによって発見された[Science vol 254, 1497－1500 (1991)]。ＰＮＡの化学構造及び略記命名法を下記の図に例示する。ＤＮＡ及びＲＮＡのように、ＰＮＡもまた、相補性核酸に選択的に結合する[Nature (London) vol 365, 566－568 (1992)]。相補性核酸への結合において、ＰＮＡのＮ末端はＤＮＡまたはＲＮＡの「５’端部」と同様なものと見なされ、ＰＮＡのＣ末端はＤＮＡまたはＲＮＡの「３’端部」と同様なものと見なされる。
Figure 0007109532000008
ＰＭＯのように、ＰＮＡ主鎖は荷電されない。よって、ＰＮＡとＲＮＡの間の結合は、ＤＮＡとＲＮＡの間の結合よりもさらに強い傾向がある。ＰＮＡは、化学構造においてＤＮＡと著しく相違するため、ＰＮＡはＤＮＡを認識する肝輸送体によって認識されないと言え、ＤＮＡまたはＰＴＯと相違する組織分布プロファイルを示す。しかし、ＰＮＡもまた、哺乳動物細胞膜の透過が十分ではない(Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267－280, 2003)。
ＰＮＡの膜透過性を改善させるための修飾された核酸塩基： ＰＮＡは、それに共有結合的に付着した陽イオン性脂質またはその均等物を有する修飾された核酸塩基の導入によって、哺乳動物細胞膜に高度に透過性となった。そのような修飾された核酸塩基の化学構造を下記に提供する。シトシン、アデニン、及びグアニンのそのような修飾された核酸塩基は、それぞれグアニン、チミン、及びシトシンと予想でき、相補的にハイブリダイゼーションすることが明らかになった[PCT出願番号PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253]。
Figure 0007109532000009
ＰＮＡへのそのような修飾された核酸塩基の組み込みはリポフェクションの状況と類似している。リポフェクションによって、ホスフェート主鎖を有するオリゴヌクレオチド分子は、陽イオン性脂質分子、例えばリポフェクトアミンで囲まれ、そのようなリポフェクトアミン／オリゴヌクレオチド複合体は、ネイキッドオリゴヌクレオチド分子に比べてむしろ容易に膜を透過する傾向がある。
前記ＰＮＡ誘導体は、良好な膜透過性以外に、相補性核酸に対して非常に強力な親和性を有することが明らかになった。例えば、１１～1３ｍｅｒのＰＮＡ誘導体上への４～５個の修飾された核酸塩基の導入は、相補性ＤＮＡとの二本鎖形成において２０℃以上のＴｍ増加をもたらした。そのようなＰＮＡ誘導体は、単一塩基ミスマッチにも非常に影響を受けやすい。単一塩基ミスマッチは、ＰＮＡ配列に依存するだけでなく、修飾された塩基のタイプにも依存して、１１～２２℃のＴｍ損失を招いた。
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）： 低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、２０～２５塩基対の二重鎖ＲＮＡを指す[Microbiol. Mol. Biol. Rev. vol 67(4), 657－685 (2003)]。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、タンパク質の一部と相互作用して「ＲＮＡによって誘導された沈黙複合体」（ＲＩＳＣ）を形成する。次いで、前記ＲＩＳＣはｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的なｍＲＮＡのある部分に結合する。前記ＲＩＳＣと複合体を形成したｍＲＮＡは切断を受ける。よって、ｓｉＲＮＡはそのターゲットｍＲＮＡの切断を触媒的に誘導し、結果的に前記ｍＲＮＡによるタンパク質発現を阻害する。前記ＲＩＳＣは、そのターゲットｍＲＮＡ内の完全相補性配列に常に結合するのではなく、これはｓｉＲＮＡ治療法のターゲット以外の効果と関連する不都合を生じさせる。ＤＮＡまたはＲＮＡ主鎖を有するオリゴヌクレオチドの他のクラスのように、ｓｉＲＮＡは、不十分な細胞透過性を有し、よって良好な膜透過性を有するように好適に製剤化かつ化学的に修飾されない限り、不十分なインビトロまたはインビボ治療学的活性を示す傾向がある。
チロシナーゼｓｉＲＮＡ： ヒトＴＹＲ ｍＲＮＡ内の１９ｍｅｒ ＲＮＡ配列をターゲットにするＴＹＲ ｓｉＲＮＡは、２０ｎＭ濃度でのリポフェクション後にヒト表皮メラニン細胞（ＨＥＭ）中のＴＹＲ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を阻害することが明らかになった。ｓｉＲＮＡは、前記ＴＹＲ ｍＲＮＡ及びタンパク質を下方調節したが、チロシナーゼと関連するタンパク質１及び２の発現には影響を及ぼさなかった。前記ｓｉＲＮＡは、ＵＶ照射によって誘導されたメラニン形成を阻害した[BMB Reports, vol 42(3), 178－183 (2009)]。
マウスＴＹＲ ｍＲＮＡをターゲットにするように設計されたｓｉＲＮＡを、４０ｎＭ濃度でのリポフェクション後にマウスＢ１６黒色腫細胞において前記ＴＹＲ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現ならびにメラニン形成を阻害するその能力について選別した。最も有効なｓｉＲＮＡをＣ５７ＢＬ／６マウスの眼球に注入し、網膜で前記ＴＹＲ ｍＲＮＡを約６０％まで阻害することを見出した[Mol. Biol. Inteｒｎａtional, vol 2010, Article ID 240472 (2010)]。
だれでも許可なく使用できる状態のＴＹＲ ｓｉＲＮＡのより多くの例がある。例えば、ある従来技術は、過色素沈着症の治療のためにヒトＴＹＲ ｍＲＮＡをターゲットにするｓｉＲＮＡを開示している[ＵＳ７５０４３８５]。しかし、そのようなｓｉＲＮＡの実用性は、過色素沈着症に対する用途の場合は疑わしい。ｓｉＲＮＡは、製造するにはコストが高すぎ、その美容学的使用が制限される傾向がある。さらに、ｓｉＲＮＡは良好な使用者コンプライアンスのために経皮投与によって皮膚から送達する必要がある。経皮送達は、オリゴヌクレオチド分野において非常に大きな技術的挑戦であるということに取り組むべきである。
本発明は、式Ｉ：
Figure 0007109532000010
によって表されるペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩を提供し、
式中、
ｎは１０と２１の間の整数であり；
式Ｉの化合物は、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ中の
Figure 0007109532000011
の１４ｍｅｒプレｍＲＮＡ配列との１０ｍｅｒ相補性オーバーラップを少なくとも１つ有し；
式Ｉの化合物は、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡに完全に相補的であるか、或いは、式Ｉの化合物全体からの１つまたは２つのミスマッチのためにヒトＴＹＲプレｍＲＮＡに部分的に相補的であり；
Ｓ１、Ｓ２、・・・、Ｓｎ－１、Ｓｎ、Ｔ１、Ｔ２、・・・、Ｔｎ－１、及びＴｎは独立して、デューテリド（ｄｅｕｔｅｒｉｄｏ）、ヒドリド、置換または非置換のアルキル、或いは置換または非置換のアリールラジカルを表し；
Ｘ及びＹは独立して、デューテリド、ヒドリド［Ｈ］、ホルミル［Ｈ－Ｃ（＝Ｏ）－］、アミノカルボニル［ＮＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－］、アミノチオカルボニル［ＮＨ２－Ｃ（＝Ｓ）－］、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のアルキルアシル、置換または非置換のアリールアシル、置換または非置換のアルキルオキシカルボニル、置換または非置換のアリールオキシカルボニル、置換または非置換のアルキルアミノカルボニル、置換または非置換のアリールアミノカルボニル、置換または非置換のアルキルアミノチオカルボニル、置換または非置換のアリールアミノチオカルボニル、置換または非置換のアルキルオキシチオカルボニル、置換または非置換のアリールオキシチオカルボニル、置換または非置換のアルキルスルホニル、置換または非置換のアリールスルホニル、置換または非置換のアルキルホスホニルラジカル、或いは置換または非置換のアリールホスホニルラジカルを表し；
Ｚは、ヒドリド、ヒドロキシ、置換または非置換のアルキルオキシ、置換または非置換のアリールオキシ、置換または非置換のアミノ、置換または非置換のアルキル、或いは置換または非置換のアリールラジカルを表し；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、及びＢｎは、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基の中から独立して選択され；かつ
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、及びＢｎのうちの少なくとも４つは、核酸塩基部分に共有結合的に連結した置換または非置換のアミノラジカルを有する非天然核酸塩基の中から独立して選択される。
式Ｉの化合物は、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡにおける「エクソン２」のスキッピング（ｓｋｉｐｐｉｎｇ）を誘導し、「エクソン２」のないヒトＴＹＲ ｍＲＮＡスプライスバリアントをもたらし、よって、前記ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡを転写する遺伝子の機能活性の阻害に有用である。
「ｎは、１０と２１の間の整数である」という状況は文字通り、ｎが１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０の整数グループから選択できる整数であることを意味する。
式ＩのＰＮＡ誘導体における天然または非天然核酸塩基の化学構造を図１ａ～１ｃに例示する。本発明の天然の（つまり自然発生の）または非天然の（自然発生でない）核酸塩基は、非制限的に図１ａ～１ｃに提供した核酸塩基を含む。そのような非天然核酸塩基の提供は、許容可能な核酸塩基の多様性を例示するためのものであり、よって、本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。
式ＩのＰＮＡ誘導体を説明するために採択された置換基を図２ａ～２ｅに例示する。図２ａでは、置換または非置換のアルキルラジカルについての例を提供する。置換または非置換のアルキルアシル及び置換または非置換のアルキルアシルアリールアシルラジカルを図２ｂに例示する。図２ｃでは、置換または非置換のアルキルアミノ、置換または非置換のアリールアミノ、置換または非置換のアリール、置換または非置換のアルキルスルホニルまたはアリールスルホニル、及び置換または非置換のアルキルホスホニルまたはアリールホスホニルラジカルについての例を例示する。図２ｄでは、置換または非置換のアルキルオキシカルボニルまたはアリールオキシカルボニル、置換または非置換のアルキルアミノカルボニルまたはアリールアミノカルボニルラジカルについての例を提供する。図２ｅでは、置換または非置換のアルキルアミノチオカルボニル、置換または非置換のアリールアミノチオカルボニル、置換または非置換のアルキルオキシチオカルボニル、及び置換または非置換のアリールオキシチオカルボニルラジカルについての例を提供する。そのような例示的な置換基の提供は、許容可能な置換基の多様性を例示するためのものであり、よって、本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。当業者は、Ｎ末端中またはＣ末端中の置換基よりもオリゴヌクレオチド配列が、ターゲットプレｍＲＮＡ配列へのオリゴヌクレオチドの配列特異的な結合のために最も重要な因子であることを容易に理解できる。
式Ｉの化合物は、従来技術において例示されたように、相補性ＤＮＡに固く結合する［ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００１２５６］。式ＩのＰＮＡ誘導体とその完全長相補性ＤＮＡまたはＲＮＡの間の二本鎖は、水性緩衝剤中で確実に測定するには高すぎるＴｍ値を有する。式ＩのＰＮＡ化合物は、より短い相補性ＤＮＡによっても高いＴｍ値をもたらす。
式Ｉの化合物は、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡの「エクソン２」の3’スプライス部位に相補的に結合する［ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＧ＿０００８７４８］。
Figure 0007109532000012
の１４ｍｅｒ配列は、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ中の「イントロン１」及び「エクソン２」の接合部に位置し、「イントロン１」からの７ｍｅｒ及び「エクソン２」からの７ｍｅｒからなる。よって、この１４ｍｅｒプレｍＲＮＡ配列は、
Figure 0007109532000013
として慣習的に示し得、ここで前記イントロン及びエクソン配列をそれぞれ「小」及び「大」の文字で提供し、前記イントロン－エクソン接合部は、「┃」によって表示する。プレｍＲＮＡについての慣習的な表示は、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ中の「イントロン１」と「エクソン２」の接合部にわたっている
Figure 0007109532000014
の３０ｍｅｒ配列によってさらに例示される。また、この３０ｍｅｒプレｍＲＮＡ配列は、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ内の、式Ｉの化合物がターゲットにする３’スプライス部位を明確に規定するが、ＴＹＲエクソンのナンバリングは他のやり方で報告されることもできる。
式Ｉの化合物は、ヒトＴＹＲ遺伝子から転写されたヒトＴＹＲプレｍＲＮＡのターゲット３’スプライス部位に固く結合し、前記化合物のターゲットエクソンを伴う「スプライソソーム初期複合体」の形成を妨害する。本発明の化合物は、前記「スプライソソーム初期複合体」の形成を立体的に阻害するため、ＴＹＲ「エクソン２」をスプライスアウトして「エクソン２」のないＴＹＲ ｍＲＮＡスプライスバリアントをもたらす。結果的に、本発明の化合物は、ＴＹＲ「エクソン２」のスキッピングを誘導する。
前記ＰＮＡ誘導体がＴＹＲプレｍＲＮＡ中のターゲット３’スプライス部位との１つまたは２つのミスマッチを有する場合にさえ、強力なＲＮＡ親和性によって、式Ｉの化合物が、ＴＹＲ「エクソン２」のスキッピングを誘導することが可能になる。また、式ＩのＰＮＡ誘導体は、ターゲットスプライス部位中に１つまたは２つのＳＮＰ（単一ヌクレオチド多形性）を有するＴＹＲ突然変異プレｍＲＮＡにおいてＴＹＲ「エクソン２」のスキッピングを依然と誘導できる。
式Ｉの化合物は、良好な細胞透過性を有し、従来技術において例示されたような「ネイキッド」オリゴヌクレオチドとして細胞に容易に送達できる［ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００１２５６］。よって、本発明の化合物は、ＴＹＲプレｍＲＮＡにおいて「エクソン２」のスキッピングを誘導し、「ネイキッド」オリゴヌクレオチドとしての式Ｉの化合物で処理された細胞中にＴＹＲ「エクソン２」のないＴＹＲ ｍＲＮＡスプライスバリアントをもたらす。式Ｉの化合物は、細胞においてターゲットエクソンのスキッピングを強力に誘導するために、細胞中への送達のための如何なる手段も製剤も必要としない。式Ｉの化合物は、フェントモル以下の濃度でも「ネイキッド」オリゴヌクレオチとしての本発明の化合物で処理された細胞においてＴＹＲ「エクソン２」のスキッピングを容易に誘導する。
良好な細胞または膜透過性によって、式ＩのＰＮＡ誘導体を「ネイキッド」オリゴヌクレオチドとして局所的に投与し皮膚においてＴＹＲ「エクソン２」のスキッピングを誘導できる。式Ｉの化合物は、意図された治療学的または生物学的活性のために、ターゲット組織内への経皮送達を増加させるための製剤を必要としない。通常、式Ｉの化合物を水及び共溶媒に溶解させ、ピコモル以下の濃度で局所または経皮投与してターゲット皮膚において所望の治療学的または生物学的活性を引き出す。本発明の化合物は、局所治療活性を引き出すために、過度にまたは侵襲的に製剤化する必要はない。それにもかかわらず、式ＩのＰＮＡ誘導体を局所クリームまたはローションとして美容成分または助剤と一緒に製剤化できる。そのような局所的な美容クリームまたはローションは、顔面過色素沈着症の治療に有用である。
式Ｉの化合物は、薬学的に許容可能な酸または塩基、例えば非制限的に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩酸、メタンスルホン酸、クエン酸、トリフルオロアセト酸等と一緒に使用できる。
式ＩのＰＮＡ誘導体またはその薬学的に許容可能な塩は、薬学的に許容可能な助剤、例えば非制限的にクエン酸、塩酸、酒石酸、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エタノール、イソプロパノール、ナトリウムビカーボネート、蒸留水、保存剤等と一緒に対象に投与できる。
本発明の化合物は、１ａＭから１ｎＭ超までの範囲の治療学的にまたは生物学的に有効な濃度で対象に局所投与することができ、この濃度範囲は、投与スケジュール、対象の条件または状況等によって変わる。
好ましくは、式ＩのＰＮＡ誘導体またはその薬学的に許容可能な塩であり、
式中、
ｎが、１０と２１の間の整数であり；
式Ｉの化合物が、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ中の
Figure 0007109532000015
の１４ｍｅｒプレｍＲＮＡ配列との１０ｍｅｒ相補性オーバーラップを少なくとも１つ有し；
式Ｉの化合物が、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡに完全に相補的であるか、或いは、式Ｉの化合物全体からの１つまたは２つのミスマッチのためにヒトＴＹＲプレｍＲＮＡに部分的に相補的であり；
Ｓ１、Ｓ２、・・・、Ｓｎ－１、Ｓｎ、Ｔ１、Ｔ２、・・・、Ｔｎ－１、及びＴｎが、独立してデューテリドまたはヒドリドラジカルを表し；
Ｘ及びＹは独立して、デューテリド、ヒドリド、ホルミル、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のアルキルアシル、置換または非置換のアリールアシル、置換または非置換のアルキルオキシカルボニル、置換または非置換のアリールオキシカルボニル、置換または非置換のアルキルアミノカルボニル、置換または非置換のアリールアミノカルボニル、置換または非置換のアルキルアミノチオカルボニル、置換または非置換のアリールアミノチオカルボニル、置換または非置換のアルキルオキシチオカルボニル、置換または非置換のアリールオキシチオカルボニル、置換または非置換のアルキルスルホニル、置換または非置換のアリールスルホニル、置換または非置換のアルキルホスホニルラジカル、或いは置換または非置換のアリールホスホニルラジカルを表し；
Ｚが、ヒドリド、ヒドロキシ、置換または非置換のアルキルオキシ、置換または非置換のアリールオキシ、或いは置換または非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、及びＢｎが、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、及びＢｎのうちの少なくとも４つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶ：
Figure 0007109532000016
によって表される非天然核酸塩基の中から独立して選択され、
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、ヒドリド及び置換または非置換のアルキルラジカルの中から独立して選択され；
Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、核酸塩基部分に塩基性アミノ基を共有結合的に連結させる、式Ｖ：
Figure 0007109532000017
によって表される共有結合性リンカーであり、
式中、
Ｑ１及びＱｍは、置換または非置換のメチレン（－ＣＨ２－）ラジカルであり、かつＱｍは塩基性アミノ基に直接連結されており；
Ｑ２、Ｑ３、・・・、及びＱｍ－１は、置換または非置換のメチレン、酸素（－Ｏ－）、硫黄（－Ｓ－）、及び置換または非置換のアミノラジカル［－Ｎ（Ｈ）－または－Ｎ（置換基）－］の中から独立して選択され；かつ
ｍは、１と１５の間の整数である。
関心対象となるのは、式ＩのＰＮＡ誘導体またはその薬学的に許容可能な塩であり、
式中、
ｎが、１１と１８の間の整数であり；
式Ｉの化合物が、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ中の
Figure 0007109532000018
の１４ｍｅｒプレｍＲＮＡ配列との１０ｍｅｒ相補性オーバーラップを少なくとも１つ有し；
式Ｉの化合物が、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡに完全に相補的であり；
Ｓ１、Ｓ２、・・・、Ｓｎ－１、Ｓｎ、Ｔ１、Ｔ２、・・・、Ｔｎ－１、及びＴｎが、ヒドリドラジカルであり；
Ｘ及びＹが独立して、ヒドリド、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のアルキルアシル、置換または非置換のアリールアシル、置換または非置換のアルキルオキシカルボニル、或いは置換または非置換のアリールオキシカルボニルラジカルを表し；
Ｚが、置換または非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、及びＢｎが、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、及びＢｎのうちの少なくとも４つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって表される非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が、ヒドリド及び置換または非置換のアルキルラジカルの中から独立して選択され；
Ｑ１及びＱｍが、置換または非置換のメチレンラジカルであり、かつＱｍが塩基性アミノ基に直接連結されており；
Ｑ２、Ｑ３、・・・、及びＱｍ－１が、置換または非置換のメチレン、酸素、及びアミノラジカルの中から独立して選択され；かつ
ｍは、１と１１の間の整数である。
特に関心対象となるのは、式ＩのＰＮＡ誘導体またはその薬学的に許容可能な塩であり、
式中、
ｎが１１と１６の間の整数であり；
式Ｉの化合物が、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ中の
Figure 0007109532000019
の１４ｍｅｒプレｍＲＮＡ配列との１０ｍｅｒ相補性オーバーラップを少なくとも１つ有し；
式Ｉの化合物が、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡに完全に相補的であり；
Ｓ１、Ｓ２、・・・、Ｓｎ－１、Ｓｎ、Ｔ１、Ｔ２、・・・、Ｔｎ－１、及びＴｎがヒドリドラジカルであり；
Ｘ及びＹが、ヒドリド、置換または非置換のアルキルアシル、或いは置換または非置換のアルキルオキシカルボニルラジカルの中から独立して選択され；
Ｚが、置換または非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、及びＢｎが、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、及びＢｎのうちの少なくとも４つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって表される非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が、ヒドリド及び置換または非置換のアルキルラジカルの中から独立して選択され；
Ｑ１及びＱｍがメチレンラジカルであり、かつＱｍが塩基性アミノ基に直接連結されており；
Ｑ２、Ｑ３、・・・、及びＱｍ－１が、メチレン、酸素、及びアミノラジカルの中から独立して選択され；かつ
ｍが、１と９の間の整数である。
非常に関心対象となるのは、式ＩのＰＮＡ誘導体またはその薬学的に許容可能な塩であり、
式中、
ｎが、１１と１６の間の整数であり；
式Iの化合物が、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ中の
Figure 0007109532000020
の１４ｍｅｒプレｍＲＮＡ配列との１０ｍｅｒ相補性オーバーラップを少なくとも１つ有し；
式Ｉの化合物が、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡに完全に相補的であり；
Ｓ１、Ｓ２、・・・、Ｓｎ－１、Ｓｎ、Ｔ１、Ｔ２、・・・、Ｔｎ－１、及びＴｎが、ヒドリドラジカルであり；
Ｘ及びＹが、ヒドリド、置換または非置換のアルキルアシル、或いは置換または非置換のアルキルオキシカルボニルラジカルの中から独立して選択され；
Ｚが、置換または非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、及びＢｎが、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、及びＢｎのうちの少なくとも４つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって表される非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｒ１、Ｒ３、及びＲ５がヒドリドラジカルであり、かつＲ２、Ｒ４、及びＲ６が独立して、ヒドリド或いは置換または非置換のアルキルラジカルを表し；
Ｑ１及びＱｍがメチレンラジカルであり、かつＱｍが塩基性アミノ基に直接連結されており；
Ｑ２、Ｑ３、・・・、及びＱｍ－１が、メチレン、酸素ラジカルの中から独立して選択され；かつ
ｍが、１と９の間の整数である。
さらに非常に関心対象となるのは、式ＩのＰＮＡ誘導体またはその薬学的に許容可能な塩であり、
式中、
ｎが、１１と１６の間の整数であり；
式Ｉの化合物が、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ中の
Figure 0007109532000021
の１４ｍｅｒプレｍＲＮＡ配列との１０ｍｅｒ相補性オーバーラップを少なくとも１つ有し；
式Ｉの化合物が、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡに完全に相補的であり；
Ｓ１、Ｓ２、・・・、Ｓｎ－１、Ｓｎ、Ｔ１、Ｔ２、・・・、Ｔｎ－１、及びＴｎが、ヒドリドラジカルであり；
Ｘ及びＹが、ヒドリド、置換または非置換のアルキルアシル、或いは置換または非置換のアルキルオキシカルボニルラジカルの中から独立して選択され；
Ｚが、置換または非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、及びＢｎが、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及び非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、及びＢｎのうちの少なくとも５つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって表される非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が、ヒドリドラジカルであり；
Ｑ１及びＱｍがメチレンラジカルであり、かつＱｍが塩基性アミノ基に直接連結されており；
Ｑ２、Ｑ３、・・・、及びＱｍ－１が、メチレン及び酸素ラジカルの中から独立して選択され；かつ
ｍが、１と９の間の整数である。
最も関心対象となるのは、式ＩのＰＮＡ誘導体またはその薬学的に許容可能な塩であり、
式中、
ｎが、１１と１６の間の整数であり；
式Ｉの化合物が、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ中の
Figure 0007109532000022
の１４ｍｅｒプレｍＲＮＡ配列との１０ｍｅｒ相補性オーバーラップを少なくとも１つ有し；
式Ｉの化合物が、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡに完全に相補的であり；
Ｓ１、Ｓ２、・・・、Ｓｎ－１、Ｓｎ、Ｔ１、Ｔ２、・・・、Ｔｎ－１、及びＴｎが、ヒドリドラジカルであり；
Ｘが、ヒドリドラジカルであり；
Ｙが、置換または非置換のアルキルアシル或いは置換または非置換のアルキルオキシカルボニルラジカルを表し；
Ｚが、置換または非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、及びＢｎが、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及び非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、及びＢｎのうちの少なくとも５つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって表される非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が、ヒドリドラジカルであり；
Ｌ１が、－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）３－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）４－、または－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）５－を表し、ここで、右側端部が塩基性アミノ基に直接連結されており；かつ
Ｌ２及びＬ３が、－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）４－、－（ＣＨ２）５－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）７－、及び－（ＣＨ２）８－の中から独立して選択され、ここで右側端部が塩基性アミノ基に直接連結されている。
特に関心対象となるのは、下記に提供した化合物のグループ：
Figure 0007109532000023
Figure 0007109532000024
から選択される式ＩのＰＮＡ誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩であり、
ここで、
Ａ、Ｇ、Ｔ、及びＣは、それぞれアデニン、グアニン、チミン、及びシトシンの天然核酸塩基を有するＰＮＡモノマーであり；
Ｃ（ｐＯｑ）、Ａ（ｐ）、Ａ（ｐＯｑ）、Ｇ（ｐ）、及びＧ（ｐＯｑ）は、それぞれ式ＶＩ、式ＶＩＩ、式ＶＩＩＩ、式ＩＸ、及び式Ｘ：
Figure 0007109532000025
によって表される非天然核酸塩基を有するＰＮＡモノマーであり、
式中、
ｐ及びｑは、整数であり；かつ
Ｎ末端置換基及びＣ末端置換基の略語は下記に具体的に記載した通り、「Ｆｍｏｃ－」が「［（９－フルオレニル）メチルオキシ］カルボニル－」；「Ｆｅｔｈｏｃ－」が「［２－（９－フルオレニル）エチル－１－オキシ］カルボニル」；「Ａｃ－」が「アセチル－」；「ベンゾイル－」が「ベンゼンカルボニル－」；「Ｐｉｖ－」が「ピバリル－」；「メチル－」が「メチル－」；「ｎ－プロピル－」が「１－（ｎ－プロピル）－」；「Ｈ－」が「ヒドリド－」基；「ｐ－トルエンスルホニル」が「（４－メチルベンゼン）－１－スルホニル－」；「－Ｌｙｓ－」がアミノ酸残基「リジン」；「－Ｖａｌ－」がアミノ酸残基「バリン」；「－Ｌｅｕ－」がアミノ酸残基「ロイシン」；「－Ａｒｇ－」がアミノ酸残基「アルギニン」；「－Ｇｌｙ－」がアミノ酸残基「グリシン」；「[Ｎ－（２－フェニルエチル）アミノ]カルボニル－」が「［Ｎ－１－（２－フェニルエチル）アミノ］カルボニル－」；「ベンジル－」が「１－（フェニル）メチル－」；「フェニル－」が「フェニル－」；「Ｍｅ－」が「メチル－」；かつ「－ＮＨ２」が非置換「－アミノ」基の略語である。
図３では、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｃ（ｐＯｑ）、Ａ（ｐ）、Ａ（ｐＯｑ）、Ｇ（ｐ）、及びＧ（ｐＯｑ）と略記されたＰＮＡモノマーについての化学構造を集合的かつ明瞭に提供する。従来技術［ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００１２５６］で論議されたように、Ｃ（ｐＯｑ）はそれが「グアニン」に対してハイブリダイスするため、「修飾されたシトシン」ＰＮＡモノマーと認識される。Ａ（ｐ）及びＡ（ｐＯｑ）は、それらが「チミン」に対してハイブリダイスするため、「修飾されたアデニン」ＰＮＡモノマーと考えられる。同様に、Ｇ（ｐ）及びＧ（ｐＯｑ）は、それらが「シトシン」と塩基対を形成するため、「修飾されたグアニン」ＰＮＡモノマーとみなされる。
図４では、本発明において式ＩのＰＮＡ誘導体のＮ末端またはＣ末端の多様化に使用された置換基の多様な略語の化学構造を明瞭に例示する。
そのようなＰＮＡ誘導体に使用された略語を例示するために、
Figure 0007109532000026
と略記された１３ｍｅｒ ＰＮＡ誘導体の化学構造を図５ａに提供する。また別の例示として、
Figure 0007109532000027
と略記された１５ｍｅｒ ＰＮＡ誘導体の化学構造を図５ｂに提供する。
図５ａに明示した
Figure 0007109532000028
の１３ｍｅｒ ＰＮＡ配列は、プレｍＲＮＡへの相補的な結合のための
Figure 0007109532000029
のＤＮＡ配列と同等である。この１３ｍｅｒ ＰＮＡは、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ中の「イントロン１」と「エクソン２」の接合部にわたっている
Figure 0007109532000030
の３０ｍｅｒ ＲＮＡ配列内の「太字」「下線」表示した１３ｍｅｒ配列との１３ｍｅｒ相補性オーバーラップを有する。
図５ｂに明示した
Figure 0007109532000031
の１５ｍｅｒ ＰＮＡ配列は、プレｍＲＮＡへの相補的な結合のための
Figure 0007109532000032
のＤＮＡ配列と同等である。この１５ｍｅｒ ＰＮＡは、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ中の「イントロン１」と「エクソン２」の接合部にわたっている
Figure 0007109532000033
の３０ｍｅｒ ＲＮＡ配列内の「太字」「下線」表示した１５ｍｅｒ配列との１５ｍｅｒ相補性オーバーラップを有する。
Figure 0007109532000034
の１７ｍｅｒ ＰＮＡ配列は、プレｍＲＮＡへの相補的な結合のための
Figure 0007109532000035
のＤＮＡ配列と同等である。この１７ｍｅｒ ＰＮＡは、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ中の「イントロン１」と「エクソン２」の接合部にわたっている
Figure 0007109532000036
の３０ｍｅｒ ＲＮＡ配列内の「太字」「下線」表示した１５ｍｅｒ配列との１５ｍｅｒ相補性オーバーラップを有する。二つのミスマッチは、引用符号“ ”で表示した。
本発明の一つの態様は、本発明にかかるペプチド核酸誘導体を含む、ヒトチロシナーゼ遺伝子の発現に関連する疾患または状態の治療用の薬学的組成物を提供する。
本発明の一つの態様は、本発明にかかるペプチド核酸誘導体を含む、過色素沈着症の治療用の薬学的組成物を提供する。メラニン過多生成による過色素沈着症の例としては、肝斑（ｍｅｌａｓｍａ）、にきび瘢痕（ａｃｎｅ ｓｃａｒｒｉｎｇ）、シミ（ｌｉｖｅｒ ｓｐｏｔ）、そばかす（ｆｒｅｃｋｌｅ）、年齢によるシミ（ａｇｅ ｓｐｏｔ）及び光線性損傷等が含まれる。
本発明の一つの態様は、本発明にかかるペプチド核酸誘導体を投与することを含む、ヒトチロシナーゼ遺伝子の発現に関連する疾患または状態を治療するための方法を提供する。投与経路は、例えば局所投与であることができる。
本発明の一つの態様は、本発明にかかるペプチド核酸誘導体を投与することを含む、過色素沈着症を治療するための方法を提供する。投与は経路、例えば局所投与であることができる。
本発明の一つの態様は、ヒトチロシナーゼ遺伝子の発現に関連する疾患または状態の治療用の医薬の調製における、本発明にかかるペプチド核酸誘導体の使用を提供する。
本発明の一つの態様は、過色素沈着症の治療用の医薬の調製における、本発明にかかるペプチド核酸誘導体の使用を提供する。
[本発明1001]
式Ｉ：
Figure 0007109532000037
によって表されるペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩：
式中、
ｎは10と21の間の整数であり；
式Ｉの化合物は、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡ中の
Figure 0007109532000038
の14ｍｅｒプレｍＲＮＡ配列との10ｍｅｒ相補性オーバーラップを少なくとも1つ有し；
式Ｉの化合物は、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡに完全に相補的であるか、或いは、式Ｉの化合物全体からの1つまたは2つのミスマッチのためにヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡに部分的に相補的であり；
Ｓ 1 、Ｓ 2 、・・・、Ｓ ｎ－1 、Ｓ ｎ 、Ｔ 1 、Ｔ 2 、・・・、Ｔ ｎ－1 、及びＴ ｎ は独立して、デューテリド（ｄｅｕｔｅｒｉｄｏ）、ヒドリド、置換または非置換のアルキル、或いは置換または非置換のアリールラジカルを表し；
Ｘ及びＹは独立して、デューテリド、ヒドリド［Ｈ］、ホルミル［Ｈ－Ｃ（＝Ｏ）－］、アミノカルボニル［ＮＨ 2 －Ｃ（＝Ｏ）－］、アミノチオカルボニル［ＮＨ 2 －Ｃ（＝Ｓ）－］、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のアルキルアシル、置換または非置換のアリールアシル、置換または非置換のアルキルオキシカルボニル、置換または非置換のアリールオキシカルボニル、置換または非置換のアルキルアミノカルボニル、置換または非置換のアリールアミノカルボニル、置換または非置換のアルキルアミノチオカルボニル、置換または非置換のアリールアミノチオカルボニル、置換または非置換のアルキルオキシチオカルボニル、置換または非置換のアリールオキシチオカルボニル、置換または非置換のアルキルスルホニル、置換または非置換のアリールスルホニル、置換または非置換のアルキルホスホニルラジカル、或いは置換または非置換のアリールホスホニルラジカルを表し；
Ｚは、ヒドリド、ヒドロキシ、置換または非置換のアルキルオキシ、置換または非置換のアリールオキシ、置換または非置換のアミノ、置換または非置換のアルキル、或いは置換または非置換のアリールラジカルを表し；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、及びＢ ｎ は、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基の中から独立して選択され；かつ
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、及びＢ ｎ のうちの少なくとも4つは、核酸塩基部分に共有結合的に連結した置換または非置換のアミノラジカルを有する非天然核酸塩基の中から独立して選択される。
[本発明1002]
ｎが、10と21の間の整数であり；
式Ｉの化合物が、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡ中の
Figure 0007109532000039
の14ｍｅｒプレｍＲＮＡ配列との10ｍｅｒ相補性オーバーラップを少なくとも1つ有し；
式Ｉの化合物が、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡに完全に相補的であるか、或いは、式Ｉの化合物全体からの1つまたは2つのミスマッチのためにヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡに部分的に相補的であり；
Ｓ 1 、Ｓ 2 、・・・、Ｓ ｎ－1 、Ｓ ｎ 、Ｔ 1 、Ｔ 2 、・・・、Ｔ ｎ－1 、及びＴ ｎ が、独立してデューテリドまたはヒドリドラジカルを表し；
Ｘ及びＹが独立して、デューテリド、ヒドリド、ホルミル、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のアルキルアシル、置換または非置換のアリールアシル、置換または非置換のアルキルオキシカルボニル、置換または非置換のアリールオキシカルボニル、置換または非置換のアルキルアミノカルボニル、置換または非置換のアリールアミノカルボニル、置換または非置換のアルキルアミノチオカルボニル、置換または非置換のアリールアミノチオカルボニル、置換または非置換のアルキルオキシチオカルボニル、置換または非置換のアリールオキシチオカルボニル、置換または非置換のアルキルスルホニル、置換または非置換のアリールスルホニル、置換または非置換のアルキルホスホニルラジカル、或いは置換または非置換のアリールホスホニルラジカルを表し；
Ｚが、ヒドリド、ヒドロキシ、置換または非置換のアルキルオキシ、置換または非置換のアリールオキシ、或いは置換または非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、及びＢ ｎ が、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、及びＢ ｎ のうちの少なくとも4つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶ：
Figure 0007109532000040
によって表される非天然核酸塩基の中から独立して選択され、
式中、
Ｒ 1 、Ｒ 2 、Ｒ 3 、Ｒ 4 、Ｒ 5 、及びＲ 6 が、ヒドリド及び置換または非置換のアルキルラジカルの中から独立して選択され；
Ｌ 1 、Ｌ 2 、及びＬ 3 が、核酸塩基部分に塩基性アミノ基を共有結合的に連結させる、式Ｖ：
Figure 0007109532000041
によって表される共有結合性リンカーであり、
式中、
Ｑ 1 及びＱ ｍ が、置換または非置換のメチレン（－ＣＨ 2 －）ラジカルであり、かつＱ ｍ は塩基性アミノ基に直接連結されており；
Ｑ 2 、Ｑ 3 、・・・、及びＱ ｍ－1 が、置換または非置換のメチレン、酸素（－Ｏ－）、硫黄（－Ｓ－）、及び置換または非置換のアミノラジカル［－Ｎ（Ｈ）－または－Ｎ（置換基）－］の中から独立して選択され；かつ
ｍが、1と15の間の整数である、
本発明1001のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩。
[本発明1003]
ｎが、11と18の間の整数であり；
式Ｉの化合物が、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡ中の
Figure 0007109532000042
の14ｍｅｒプレｍＲＮＡ配列との10ｍｅｒ相補性オーバーラップを少なくとも1つ有し；
式Ｉの化合物が、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡに完全に相補的であり；
Ｓ 1 、Ｓ 2 、・・・、Ｓ ｎ－1 、Ｓ ｎ 、Ｔ 1 、Ｔ 2 、・・・、Ｔ ｎ－1 、及びＴ ｎ が、ヒドリドラジカルであり；
Ｘ及びＹが独立して、ヒドリド、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のアルキルアシル、置換または非置換のアリールアシル、置換または非置換のアルキルオキシカルボニル、或いは置換または非置換のアリールオキシカルボニルラジカルを表し；
Ｚが、置換または非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、及びＢ ｎ が、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、及びＢ ｎ のうちの少なくとも4つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって表される非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｒ 1 、Ｒ 2 、Ｒ 3 、Ｒ 4 、Ｒ 5 、及びＲ 6 が、ヒドリド及び置換または非置換のアルキルラジカルの中から独立して選択され；
Ｑ 1 及びＱ ｍ が、置換または非置換のメチレンラジカルであり、かつＱ ｍ が塩基性アミノ基に直接連結されており；
Ｑ 2 、Ｑ 3 、・・・、及びＱ ｍ－1 が、置換または非置換のメチレン、酸素、及びアミノラジカルの中から独立して選択され；かつ
ｍが、1と11の間の整数である、
本発明1002のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩。
[本発明1004]
ｎが11と16の間の整数であり；
式Ｉの化合物が、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡ中の
Figure 0007109532000043
の14ｍｅｒプレｍＲＮＡ配列との10ｍｅｒ相補性オーバーラップを少なくとも1つ有し；
式Ｉの化合物が、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡに完全に相補的であり；
Ｓ 1 、Ｓ 2 、・・・、Ｓ ｎ－1 、Ｓ ｎ 、Ｔ 1 、Ｔ 2 、・・・、Ｔ ｎ－1 、及びＴ ｎ がヒドリドラジカルであり；
Ｘ及びＹが、ヒドリド、置換または非置換のアルキルアシル、或いは置換または非置換のアルキルオキシカルボニルラジカルの中から独立して選択され；
Ｚが、置換または非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、及びＢ ｎ が、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、及びＢ ｎ のうちの少なくとも4つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって表される非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｒ 1 、Ｒ 2 、Ｒ 3 、Ｒ 4 、Ｒ 5 、及びＲ 6 が、ヒドリド及び置換または非置換のアルキルラジカルの中から独立して選択され；
Ｑ 1 及びＱ ｍ がメチレンラジカルであり、かつＱ ｍ が塩基性アミノ基に直接連結されており；
Ｑ 2 、Ｑ 3 、・・・、及びＱ ｍ－1 が、メチレン、酸素、及びアミノラジカルの中から独立して選択され；かつ
ｍが、1と9の間の整数である、
本発明1003のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩。
[本発明1005]
ｎが、11と16の間の整数であり；
式Iの化合物が、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡ中の
Figure 0007109532000044
の14ｍｅｒプレｍＲＮＡ配列との10ｍｅｒ相補性オーバーラップを少なくとも1つ有し；
式Ｉの化合物が、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡに完全に相補的であり；
Ｓ 1 、Ｓ 2 、・・・、Ｓ ｎ－1 、Ｓ ｎ 、Ｔ 1 、Ｔ 2 、・・・、Ｔ ｎ－1 、及びＴ ｎ が、ヒドリドラジカルであり；
Ｘ及びＹが、ヒドリド、置換または非置換のアルキルアシル、或いは置換または非置換のアルキルオキシカルボニルラジカルの中から独立して選択され；
Ｚが、置換または非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、及びＢ ｎ が、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、及びＢ ｎ のうちの少なくとも4つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって表される非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｒ 1 、Ｒ 3 、及びＲ 5 がヒドリドラジカルであり、かつＲ 2 、Ｒ 4 、及びＲ 6 が独立して、ヒドリド或いは置換または非置換のアルキルラジカルを表し；
Ｑ 1 及びＱ ｍ がメチレンラジカルであり、かつＱ ｍ が塩基性アミノ基に直接連結されており；
Ｑ 2 、Ｑ 3 、・・・、及びＱ ｍ－1 が、メチレン、酸素ラジカルの中から独立して選択され；かつ
ｍが、1と9の間の整数である、
本発明1004のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩。
[本発明1006]
ｎが、11と16の間の整数であり；
式Ｉの化合物が、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡ中の
Figure 0007109532000045
の14ｍｅｒプレｍＲＮＡ配列との10ｍｅｒ相補性オーバーラップを少なくとも1つ有し；
式Ｉの化合物が、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡに完全に相補的であり；
Ｓ 1 、Ｓ 2 、・・・、Ｓ ｎ－1 、Ｓ ｎ 、Ｔ 1 、Ｔ 2 、・・・、Ｔ ｎ－1 、及びＴ ｎ が、ヒドリドラジカルであり；
Ｘ及びＹが、ヒドリド、置換または非置換のアルキルアシル、或いは置換または非置換のアルキルオキシカルボニルラジカルの中から独立して選択され；
Ｚが、置換または非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、及びＢ ｎ が、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及び非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、及びＢ ｎ のうちの少なくとも5つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって表される非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｒ 1 、Ｒ 2 、Ｒ 3 、Ｒ 4 、Ｒ 5 、及びＲ 6 が、ヒドリドラジカルであり；
Ｑ 1 及びＱ ｍ がメチレンラジカルであり、かつＱ ｍ が塩基性アミノ基に直接連結されており；
Ｑ 2 、Ｑ 3 、・・・、及びＱ ｍ－1 が、メチレン及び酸素ラジカルの中から独立して選択され；かつ
ｍが、1と9の間の整数である、
本発明1005のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩。
[本発明1007]
ｎが、11と16の間の整数であり；
式Ｉの化合物が、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡ中の
Figure 0007109532000046
の14ｍｅｒプレｍＲＮＡ配列との10ｍｅｒ相補性オーバーラップを少なくとも1つ有し；
式Ｉの化合物が、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡに完全に相補的であり；
Ｓ 1 、Ｓ 2 、・・・、Ｓ ｎ－1 、Ｓ ｎ 、Ｔ 1 、Ｔ 2 、・・・、Ｔ ｎ－1 、及びＴ ｎ が、ヒドリドラジカルであり；
Ｘが、ヒドリドラジカルであり；
Ｙが、置換または非置換のアルキルアシル或いは置換または非置換のアルキルオキシカルボニルラジカルを表し；
Ｚが、置換または非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、及びＢ ｎ が、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及び非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、及びＢ ｎ のうちの少なくとも5つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって表される非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
Ｒ 1 、Ｒ 2 、Ｒ 3 、Ｒ 4 、Ｒ 5 、及びＲ 6 が、ヒドリドラジカルであり；
Ｌ 1 が、－（ＣＨ 2 ） 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 2 －、－ＣＨ 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 2 －、－ＣＨ 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 3 －、－ＣＨ 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 4 －、または－ＣＨ 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 5 －を表し、ここで、右側端部が塩基性アミノ基に直接連結されており；かつ
Ｌ 2 及びＬ 3 が、－（ＣＨ 2 ） 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 2 －、－（ＣＨ 2 ） 3 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 2 －、－（ＣＨ 2 ） 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 3 －、－（ＣＨ 2 ） 2 －、－（ＣＨ 2 ） 3 －、－（ＣＨ 2 ） 4 －、－（ＣＨ 2 ） 5 －、－（ＣＨ 2 ） 6 －、－（ＣＨ 2 ） 7 －、及び－（ＣＨ 2 ） 8 －の中から独立して選択され、ここで右側端部が塩基性アミノ基に直接連結されている、
本発明1006のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩。
[本発明1008]
下記に提供したペプチド核酸誘導体のグループ：
Figure 0007109532000047
Figure 0007109532000048
から選択され、
ここで、
Ａ、Ｇ、Ｔ、及びＣが、それぞれアデニン、グアニン、チミン、及びシトシンの天然核酸塩基を有するＰＮＡモノマーであり；
Ｃ（ｐＯｑ）、Ａ（ｐ）、Ａ（ｐＯｑ）、Ｇ（ｐ）、及びＧ（ｐＯｑ）が、それぞれ式ＶＩ、式ＶＩＩ、式ＶＩＩＩ、式ＩＸ、及び式Ｘ：
Figure 0007109532000049
によって表される非天然核酸塩基を有するＰＮＡモノマーであり、
ここで、
ｐ及びｑが、整数であり；かつ
Ｎ末端置換基及びＣ末端置換基の略語は下記に具体的に記載した通り、「Ｆｍｏｃ－」が「［（9－フルオレニル）メチルオキシ］カルボニル－」；「Ｆｅｔｈｏｃ－」が「［2－（9－フルオレニル）エチル－1－オキシ］カルボニル」；「Ａｃ－」が「アセチル－」；「ベンゾイル－」が「ベンゼンカルボニル－」；「Ｐｉｖ－」が「ピバリル－」；「メチル－」が「メチル－」；「ｎ－プロピル－」が「1－（ｎ－プロピル）－」；「Ｈ－」が「ヒドリド－」基；「ｐ－トルエンスルホニル」が「（4－メチルベンゼン）－1－スルホニル－」；「－Ｌｙｓ－」がアミノ酸残基「リジン」；「－Ｖａｌ－」がアミノ酸残基「バリン」；「－Ｌｅｕ－」がアミノ酸残基「ロイシン」；「－Ａｒｇ－」がアミノ酸残基「アルギニン」；「－Ｇｌｙ－」がアミノ酸残基「グリシン」；「[Ｎ－（2－フェニルエチル）アミノ]カルボニル－」が「［Ｎ－1－（2－フェニルエチル）アミノ］カルボニル－」；「ベンジル－」が「1－（フェニル）メチル－」；「フェニル－」が「フェニル－」；「Ｍｅ－」が「メチル－」；かつ「－ＮＨ 2 」が非置換「－アミノ」基の略語である、
本発明1001のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩。
[本発明1009]
本発明1001のペプチド核酸誘導体を含む、ヒトチロシナーゼ遺伝子の発現に関連する疾患または状態の治療用の薬学的組成物。
[本発明1010]
本発明1001のペプチド核酸誘導体を含む、過色素沈着症の治療用の薬学的組成物。
[本発明1011]
本発明1001のペプチド核酸誘導体を投与することを含む、ヒトチロシナーゼ遺伝子の発現に関連する疾患または状態を治療するための方法。
[本発明1012]
本発明1001のペプチド核酸誘導体を投与することを含む、過色素沈着症を治療するための方法。
[本発明1013]
ヒトチロシナーゼ遺伝子の発現に関連する疾患または状態の治療用の医薬の調製における、本発明1001のペプチド核酸誘導体の使用。
[本発明1014]
過色素沈着症の治療用の医薬の調製における、本発明1001のペプチド核酸誘導体の使用。
（図１ａ）式Ｉのペプチド核酸誘導体について選択可能な天然または非天然（修飾された）核酸塩基の例である。
（図１ｂ）式Ｉのペプチド核酸誘導体について選択可能な天然または非天然（修飾された）核酸塩基の例である。
（図１ｃ）式Ｉのペプチド核酸誘導体について選択可能な天然または非天然（修飾された）核酸塩基の例である。
（図２ａ）式Ｉのペプチド核酸誘導体について選択可能な置換基の例である。
（図２ｂ）式Ｉのペプチド核酸誘導体について選択可能な置換基の例である。
（図２ｃ）式Ｉのペプチド核酸誘導体について選択可能な置換基の例である。
（図２ｄ）式Ｉのペプチド核酸誘導体について選択可能な置換基の例である。
（図２ｅ）式Ｉのペプチド核酸誘導体について選択可能な置換基の例である。
（図３）天然のまたは修飾された核酸塩基を有するＰＮＡモノマーの化学構造である。
（図４）Ｎ末端置換基またはＣ末端置換基の略語に対する化学構造である。
（図５ａ）１３ｍｅｒ ＰＮＡ誘導体
Figure 0007109532000050
の化学構造である。
（図５ｂ）１５ｍｅｒ ＰＮＡ誘導体
Figure 0007109532000051
の化学構造である。
（図６）本発明のＰＮＡ誘導体の合成のために使用されたＦｍｏｃ－ＰＮＡモノマーの化学構造である。
（図７ａ）それぞれＨＰＬＣ精製前および後の「ＡＳＯ １」のＣ１８逆相ＨＰＬＣクロマトグラムである。
（図７ｂ）それぞれＨＰＬＣ精製前および後の「ＡＳＯ １」のＣ１８逆相ＨＰＬＣクロマトグラムである。
（図８）Ｃ１８ＲＰ分取ＨＰＬＣによって精製された「ＡＳＯ １」のＥＳＩ－ＴＯＦ質量スペクトル。
（図９）図９ａ．０（陰性対照）、１、１０、または１，０００ａＭ「ＡＳＯ １Ｍ」で処理されたＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞におけるネステッドＰＣＲ産物の電気泳動分析である。図９ｂ．エクソン（２－３）のスキッピングに対して割り当て可能なＰＣＲ産物についてのサンガー配列決定データである。
（図１０ａ）０（陰性対照）、１、１０、１００、または１，０００ａＭの「ＡＳＯ １Ｍ」で処理されたＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞における、ｑＰＣＲによる完全長ＴＹＲ ｍＲＮＡレベルの変化である。（標準誤差による誤差）
（図１０ｂ）０ｚＭ（陰性対照）、１０ｚＭ、１００ｚＭ、１ａＭ、または１０ａＭ（つまり１０，０００ｚＭ）の「ＡＳＯ １Ｍ」で２４時間処理されたＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞におけるＴＹＲウェスタンブロットデータである。
（図１１）１、１０、１００、または１，０００ａＭの「ＡＳＯ １Ｍ」或いは１０μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬのアルブチンで処理されたＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞におけるメラニン含量の変化である。（標準誤差による誤差）
（図１２）０ｚＭ（陰性対照）、１ｚＭ、１００ｚＭ、または１０ａＭの「ＡＳＯ １」で処理されたヒト１次上皮メラニン細胞における、ｑＰＣＲによる完全長ＴＹＲ ｍＲＮＡレベルの変化である。（標準誤差による誤差）
発明を実施するための最良の形態
ＰＮＡオリゴマーの調製のための一般的な方法
ＰＮＡオリゴマーを、軽微であるが然るべく改変した従来技術［ＵＳ６，１３３，４４４；ＷＯ９６／４０６８５］に開示された方法によってＦｍｏｃ化学に基づいた固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって合成した。この研究に使用された固体支持体は、ＰＣＡＳバイオマトリックスインコーポレイテッド（ＰＣＡＳ ＢｉｏＭａｔｒｉｘ Ｉｎｃ．）（カナダ、ケベック）から購入したＨ－リンクアミド－ケムマトリックス（Ｈ－Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ－ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ）だった。修飾された核酸塩基を有するＦｍｏｃ－ＰＮＡモノマーを、従来技術［ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００１２５６］に記載の通りにまたはこれを軽微に改変して合成した。修飾された核酸塩基を有するそのようなＦｍｏｃ－ＰＮＡモノマー、及び天然核酸塩基を有するＦｍｏｃ－ＰＮＡモノマーを使用して、本発明のＰＮＡ誘導体を合成した。ＰＮＡオリゴマーをＣ１８逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡを有する水／アセトニトリルまたは水／メタノール）によって精製して、ＥＳＩ／ＴＯＦ／ＭＳを含む質量分光分析法によって特性決定した。
スキーム２は、本研究のＳＰＰＳにおいて採択された典型的なモノマー伸長サイクルを例示し、合成詳細を下記の通りに提供する。しかし、当業者にとっては、自動ペプチド合成機または手動ペプチド合成機上でそのようなＳＰＰＳ反応を有効に実行する際に、明らかに起こりうる小さい変化が多数ある。スキーム２の各反応段階を下記の通りに簡単に提供する。
スキーム２
Figure 0007109532000052
［Ｈ－リンク－ケムマトリックス樹脂の活性化］ １．５ｍＬの２０％ピペリジン／ＤＭＦ中の前記ケムマトリックス樹脂０．０１ｍｍｏｌ（約２０ｍｇ樹脂）を２０分間リブラ（ｌｉｂｒａ）チューブ中でボルテックスし、前記ＤｅＦｍｏｃ溶液をろ過した。前記樹脂を１．５ｍＬの塩化メチレン（ＭＣ）、１．５ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、１．５ｍＬのＭＣ、１．５ｍＬのＤＭＦ、及び１．５ｍＬのＭＣでそれぞれ３０秒間連続して洗浄した。固体支持体上に生成される遊離アミンをＦｍｏｃ－ＰＮＡモノマーまたはＦｍｏｃ保護されたアミノ酸誘導体とのカップリングに供した。
［ＤｅＦｍｏｃ］ 前記樹脂を１．５ｍＬの２０％ピペリジン／ＤＭＦ中で７分間ボルテックスし、前記ＤｅＦｍｏｃ溶液をろ過した。前記樹脂を１．５ｍＬのＭＣ、１．５ｍＬのＤＭＦ、１．５ｍＬのＭＣ、１．５ｍＬのＤＭＦ、及び１．５ｍＬのＭＣでそれぞれ３０秒間連続して洗浄した。固体支持体上に生成された遊離アミンを、Ｆｍｏｃ－ＰＮＡモノマーとのカップリングに即時供した。
［Ｆｍｏｃ－ＰＮＡモノマーとのカップリング］ 固体支持体上の遊離アミンを下記の通りにＦｍｏｃ－ＰＮＡモノマーとカップリングさせた。０．０４ｍｍｏｌのＰＮＡモノマー、０．０５ｍｍｏｌのＨＢＴＵ、及び１０ｍｍｏｌのＤＩＥＡを１ｍＬ無水ＤＭＦ中で２分間インキュベートし、遊離アミンを有する樹脂に加えた。この樹脂溶液を１時間ボルテックスし、反応媒質をろ過した。次いで、前記樹脂を１．５ｍＬのＭＣ、１．５ｍＬのＤＭＦ、及び１．５ｍＬのＭＣに連続してそれぞれ30秒間洗浄した。本発明に使用された修飾された核酸塩基を有するＦｍｏｃ－ＰＮＡモノマーの化学構造を図６に提供する。図６に提供した修飾された核酸塩基を有するＦｍｏｃ－ＰＮＡモノマーは、例として見なされなければならなく、よって、本発明の範囲を制限するものと見なしてはならない。当業者は、式ＩのＰＮＡ誘導体を合成するためのＦｍｏｃ－ＰＮＡモノマーにおける多数の変化を容易に理解することができる。
［キャッピング］ 前記カップリング反応の後、反応しなかった遊離アミンを１．５ｍＬのキャッピング溶液（ＤＭＦ中の５％アセト酸無水物および６％２，６－ルチジン）中で５分間振盪させることによりキャッピングした。次いで、前記キャッピング溶液をろ過し、１．５ｍＬのＭＣ、１．５ｍＬのＤＭＦ、及び１．５ｍＬのＭＣで連続してそれぞれ３０秒間洗浄した。
［Ｎ末端における「Ｆｅｔｈｏｃ－」ラジカルの導入］ 「Ｆｅｔｈｏｃ－」ラジカルを、塩基性カップリング条件下で前記樹脂上の遊離アミンを「Ｆｅｔｈｏｃ－ＯＳｕ」と反応させることにより、Ｎ末端に導入した。「Ｆｅｔｈｏｃ－ＯＳｕ」［ＣＡＳ Ｎｏ．１７９３３７－６９－０、Ｃ２０Ｈ１７ＮＯ５、ＭＷ ３５１．３６]の化学構造は下記の通りに提供される。
Ｆｅｔｈｏｃ－ＯＳｕ
Figure 0007109532000053
［樹脂からの切断］ 前記樹脂に結合したＰＮＡオリゴマーを、１．５ｍＬの切断溶液（トリフルオロアセト酸中の２．５％トリイソプロピルシラン及び２．５％水）中で３時間振盪させることにより、前記樹脂から切断した。前記樹脂をろ過し、ろ液を減圧下で濃縮させた。得られた残渣をジエチルエーテルで処理し、得られた沈殿物をろ過して収集した後、逆相ＨＰＬＣで精製した。
［ＨＰＬＣ分析及び精製］ 樹脂からの切断に次いで、ＰＮＡ誘導体の粗生成物を、０．１％のＴＦＡを含有する水／アセトニトリルまたは水／メタノール（勾配方法）を溶離剤として使用してＣ１８逆相ＨＰＬＣで精製した。図７ａ及び７ｂは、それぞれＨＰＬＣ精製前後の「ＡＳＯ １」についての例示的なＨＰＬＣクロマトグラムである。「ＡＳＯ １」のオリゴマー配列は、表１に提供した通りである。
式ＩのＰＮＡ誘導体についての合成例
ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ中の「エクソン２」の３’スプライス部位を相補的にターゲットにするために、本発明のＰＮＡ誘導体を、上記に提供した合成方法に従いまたはこれを軽微に改変して製造した。前記ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡをターゲットにするそのようなＰＮＡ誘導体の提供は、式ＩのＰＮＡ誘導体を例示するためのものであり、これを本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。
（表１）ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ中の「エクソン２」の３’スプライス部位を相補的にターゲットにするＰＮＡ誘導体と質量分光分析法による構造特性決定データ
Figure 0007109532000054
a)精密質量の理論値、b)精密質量の観測値。
表１は、ヒトＴＹＲ遺伝子［ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０００８７４８］から判読されたヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ中の「エクソン２」の３’スプライス部位を相補的にターゲットにするＰＮＡ誘導体と、質量分光分析法による構造特性決定データを提供する。表１のＴＹＲ ＡＳＯの提供は、式ＩのＰＮＡ誘導体を例示するためのものであり、これを本発明の範囲を制限すると解釈してはならない。
「ＡＳＯ １」は、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ中の「イントロン1」と「エクソン2」の接合部にわたっている
Figure 0007109532000055
の３０ｍｅｒ ＲＮＡ配列内の「太字」「下線」表示した１３ｍｅｒ配列との１３ｍｅｒ相補性オーバーラップを有する。よって、「ＡＳＯ １」は前記ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ内の「イントロン１」との５ｍｅｒオーバーラップ及び「エクソン２」との８ｍｅｒオーバーラップを有する。
表2は、マウスゲノムＤＮＡ［ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００００７３から入手した］から判読されたマウスＴＹＲプレｍＲＮＡ中の「エクソン２」の３’スプライス部位を相補的にターゲットにする「ＡＳＯ １Ｍ」と、質量分光分析法による構造特性決定データを提供する。「ＡＳＯ １Ｍ」の提供は、マウス起源の細胞におけるアンチセンス活性を評価するためのものである。
（表２）マウスＴＹＲプレｍＲＮＡ中の「エクソン２」の３’スプライス部位を相補的にターゲットにするＰＮＡ誘導体と質量分光分析法による構造特性決定データ
Figure 0007109532000056
a)精密質量の理論値、b)精密質量の観測値。
マウスＴＹＲプレｍＲＮＡ中のイントロン１とエクソン２の接合部にわたっている
Figure 0007109532000057
の３０ｍｅｒ ＲＮＡ配列をマウスＴＹＲ遺伝子［ＮＣＢＩ収納番号：ＮＣ＿００００７３］から判読した。
「ＡＳＯ １Ｍ」は、前記プレｍＲＮＡへの相補的な結合のための
Figure 0007109532000058
のＤＮＡ配列と同等である。「ＡＳＯ １Ｍ」は、マウスＴＹＲプレｍＲＮＡ中の「イントロン１」と「エクソン２」の接合部にわたっている
Figure 0007109532000059
の３０ｍｅｒ ＲＮＡ配列内の「太字」「下線」表示した１３ｍｅｒ配列との１３ｍｅｒ相補性オーバーラップを有する。
ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡに対する「ＡＳＯ １」のように、「ＡＳＯ １Ｍ」は、マウスＴＹＲプレｍＲＮＡ内の「イントロン１」との５ｍｅｒオーバーラップ及び「エクソン２」との８ｍｅｒオーバーラップを有する。「ＡＳＯ １Ｍ」は、ヒト起源の細胞における「ＡＳＯ １」のアンチセンス活性に対する良好な代用化合物となり得る。
図７ａは、「ＡＳＯ １」の粗生成物を用いて得られたＨＰＬＣクロマトグラムである。前記粗生成物をＣ１８－ＲＰ分取ＨＰＬＣによって精製した。図７ｂは、「ＡＳＯ １」の精製された生成物についてのＨＰＬＣクロマトグラムである。「ＡＳＯ １」の純度は、前記分取ＨＰＬＣ精製によって著しく向上した。図８は、「ＡＳＯ １」の精製された生成物を用いて得られたＥＳＩ－ＴＯＦ質量スペクトルを提供する。「ＡＳＯ １」についての分析データの提供は、式ＩのＰＮＡ誘導体を本発明においてどのように精製して同定するかを例示するためのものであり、これを本発明の範囲を制限すると解釈してはならない。
相補性ＤＮＡに対するモデルＰＮＡ誘導体の結合親和性
表１及び２において、ＰＮＡ誘導体を、Ｎ末端またはＣ末端を相補的にターゲットにする１０ｍｅｒ ＤＮＡに対するそれらの結合親和性について評価した。前記結合親和性をＰＮＡと１０ｍｅｒ相補性ＤＮＡとの二本鎖についてのＴｍ値によって評価した。前記ＰＮＡ誘導体と完全相補性ＤＮＡの間の二本鎖は、水性緩衝液中で確実に測定するには高すぎるＴｍ値を示すが、その理由は前記緩衝液が前記Ｔｍの測定中に沸騰する傾向があるためである。
Ｔｍ値を下記の通りにＵＶ／Ｖｉｓ分光計において測定した。１５ｍＬのポリプロピレンファルコンチューブ中の４ｍＬの水性緩衝剤（ｐＨ７．１６、１０ｍＭのナトリウムホスフェート、１００ｍＭのＮａＣｌ）中の４μＭのＰＮＡオリゴマー及び４μＭの相補性１０ｍｅｒ ＤＮＡの混合溶液を、１分間９０℃で維持し、周囲温度で徐々に冷却した。次いで、前記溶液を、気密式蓋が備えられた３ｍＬ石英ＵＶキュベットに移し、従来技術［ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００１２５６］に記載の通りにまたはこれを軽微に改変してＵＶ／可視分光光度計において２６０ｎｍでのＴｍ測定に供した。Ｔｍ測定のための１０ｍｅｒ相補性ＤＮＡをバイオニア（Ｂｉｏｎｅｅｒ）（www.bioneer.com、韓国、テジョン）から購入し、追加の精製をせずに使用した。
式ＩのＰＮＡ誘導体の確認されたＴｍ値は、１０ｍｅｒ ＤＮＡへの相補的な結合の場合は非常に高く、これを表３に提供する。例えば、「ＡＳＯ １」は、
Figure 0007109532000060
において「太字」「下線」表示したようなＰＮＡ中のＮ末端１０ｍｅｒをターゲットにする１０ｍｅｒ相補性ＤＮＡとの二本鎖に対して７８．０℃のＴｍ値を示した。一方、「ＡＳＯ １」は、
Figure 0007109532000061
において「太字」「下線」表示したようなＰＮＡ中のＣ末端１０ｍｅｒをターゲットにする１０ｍｅｒ相補性ＤＮＡとの二本鎖に対して７３．０℃のＴｍ値を示した。
（表３）ＰＮＡのＮ末端またはＣ末端をターゲットにする１０ｍｅｒ相補性ＤＮＡとＰＮＡの間のＴｍ値
Figure 0007109532000062
式ＩのＰＮＡ誘導体の生物学的活性についての実施例
本発明におけるＰＮＡ誘導体を、Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞及びヒトメラニン細胞におけるインビトロＴＹＲアンチセンス活性について評価した。生物学的実施例を式ＩのＰＮＡ誘導体の生物学的プロファイルを例示するための例として提供し、よってこれを本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。
実施例１．「ＡＳＯ １Ｍ」によって誘導されたエクソンスキッピング
表２に明示した「ＡＳＯ １Ｍ」は、マウスＴＹＲプレｍＲＮＡ中の「イントロン１」と「エクソン２」の接合部にわたっている
Figure 0007109532000063
の３０ｍｅｒ ＲＮＡ配列内の「太字」「下線」表示した１３ｍｅｒ配列との１３ｍｅｒ相補性オーバーラップを有する。一方、「ＡＳＯ １Ｍ」は、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ中の「イントロン１」と「エクソン２」の接合部にわたっている
Figure 0007109532000064
の３０ｍｅｒ ＲＮＡ配列内の「太字」「下線」表示したような４つのミスマッチとともに９ｍｅｒ相補性を有する。前記４つのミスマッチは、引用符（“ ”）で表示した。
「ＡＳＯ １Ｍ」がヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ中の「エクソン２」の３’スプライス部位とともに４つのミスマッチを有するにもかかわらず、マウスＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞においてＴＹＲ「エクソン２」のスキッピングを誘導する「ＡＳＯ １Ｍ」の能力について評価した。マウスＴＹＲプレｍＲＮＡに完全に相補的である「ＡＳＯ １Ｍ」は、ヒトＴＹＲプレｍＲＮＡに完全に相補的である「ＡＳＯ １」に対する良好な代用化合物となり得る。
［細胞培養＆ＡＳＯ処理］ Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞（Ｃａｔ．Ｎｕｍｂｅｒ ＣＲＬ－６４７５、ＡＴＣＣ）を、１０％ ＦＢＳ、１％ストレプトマイシン／ペニシリン、及び０．０１ｍｇ/ｍｌウシインスリンが補充されたＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグルス必須最小培地）で維持した。５ｍＬのＤＭＥＭを含有する６０ｍｍ培養ディッシュ中で増殖されたＢ１６Ｆ１０細胞を、０（陰性対照）、１、１０、１００、または１０００ａＭの「ＡＳＯ １Ｍ」とともに５時間インキュベートした。
［ＲＮＡ抽出＆１段階ＰＣＲによるcＤＮＡ合成］ ５時間のインキュベーションの後、全ＲＮＡを、「ユニバーサルＲＮＡエクストラクションキット（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）」（Ｃａｔ．Ｎｕｍｂｅｒ ９７６７、タカラ（Ｔａｋａｒａ））を使用してその製造業者の使用説明書に従って抽出した。２００ｎｇのＲＮＡ鋳型を、以下のサイクル条件：５０℃３０分および９４℃２分に次いで、１５サイクルの９４℃３０秒、５２℃３０秒および７２℃４０秒によって、［エクソン１＿順方向：
Figure 0007109532000065
；及びエクソン４＿逆方向：
Figure 0007109532000066
］のエクソン特異的プライマーセットに対してプラチナ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ）（登録商標）Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１０９２８－０４２、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を有するスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ）（登録商標）ワンステップ（Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ）ＲＴ－ＰＣＲキットを使用して、２５μｌの逆転写反応のために使用した。
［ネステッドＰＣＲ増幅］ １μｌのcＤＮＡを、以下の通りに明示されたサイクル条件：９５℃５分に次いで、３０サイクルの９５℃３０秒、５２℃３０秒及び７２℃４０秒によって、[エクソン１ｎ＿順方向：
Figure 0007109532000067
；及びエクソン４ｎ＿逆方向：
Figure 0007109532000068
］のプライマーセットに対して２０μｌネステッドＰＣＲ反応（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ２６１２、バイオニア）でさらに増幅させた。
［エクソンスキッピング生成物の同定］ 前記ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル上で電気泳動分離に供した。目的の大きさのバンドを収集し、サンガー配列決定によって分析した。
図９ａは前記ＰＣＲ産物の電気泳動データを提供するものである。「ＡＳＯ １Ｍ」処理なしの細胞は、一方が完全長ＴＹＲ ｍＲＮＡについてのＰＣＲバンドと他方がエクソン２及び３がないスプライスバリアントＴＹＲ ｍＲＮＡについてのＰＣＲバンドの、２つの強いＰＣＲバンドを生じた。よって、エクソン２－３のスキッピングは自発的に発生するものと考えられる。しかし、１～１，０００ａＭの「ＡＳＯ １Ｍ」で処理された細胞は、専らエクソン２及び３のないスプライスバリアントＴＹＲ ｍＲＮＡのみをもたらした。よって、「ＡＳＯ １Ｍ」はＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞においてエクソン２－３スキッピングの傾向を増加させる。このエクソンスキッピングＰＣＲ産物は、図９ｂに示したように、エクソン２－３のスキッピングであるものと配列決定された。
実施例２．「ＡＳＯ １Ｍ」で処理されたＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞におけるＴＹＲ ｍＲＮＡについてのｑＰＣＲ
「ＡＳＯ １Ｍ」を下記のようにＢ１６Ｆ１０細胞におけるマウスＴＹＲ ｍＲＮＡレベルの変化を誘導するその能力に対してＴＹＲネステッドｑＰＣＲによって評価した。
［細胞培養＆ＡＳＯ処理］ ５ｍＬのＤＭＥＭを含有する６０ｍｍ培養ディッシュ中で増殖したＢ１６Ｆ１０細胞を０（陰性対照）、１、１０、１００、または１０００ａＭの「ＡＳＯ １Ｍ」で処理した（１用量当り２つの培養ディッシュ）。
［ＲＮＡ抽出＆１段階ＰＣＲによるｃＤＮＡ合成］ ５時間の「ＡＳＯ １Ｍ」とのインキュベーションの後、全ＲＮＡを、製造業者の使用説明書に従って「ユニバーサルＲＮＡエクストラクションキット」（Ｃａｔ．Ｎｏ．９７６７、タカラ）を使用して細胞から抽出した。２００ｎｇのＲＮＡ鋳型を、以下のサイクル条件：５０℃３０分および９４℃２分に次いで、１５サイクルの９４℃３０秒、５２℃３０秒および７２℃４０秒によって、［エクソン１＿順方向：
Figure 0007109532000069
；及びエクソン４＿逆方向：
Figure 0007109532000070
］のエクソン特異的プライマーセットに対してワンステップＲＴ－ＰＣＲキット（インビトロゲン、米国）を使用して２５μｌ逆転写反応のために使用した。
［ネステッドｑＰＣＲ増幅］ ｃＤＮＡ溶液を１００倍まで希釈し、１μｌのそれぞれ希釈されたＰＣＲ産物を、以下のサイクル条件：９５℃３分に次いで３０サイクルの９５℃１０秒、及び６０℃３０秒によって、エクソン２及びエクソン３の接合部にわたっているＴａｑｍａｎプローブセット（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍｍ００４９５８１８＿ｍ１、サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いた２０μｌリアルタイムＰＣＲ反応に供した。
［統計学的分析］ 前記ネステッドｑＰＣＲ実験を、独立的に４回繰り返し、各実験からの個々のｍＲＮＡレベルを、「ＡＳＯ １Ｍ」処理なしのｍＲＮＡレベルに対して標準化した。すべての４回の別々の実験から得られたｍＲＮＡレベルを、スチューデントｔ－検定による統計学的分析のためにプールした。このようにしてＲＮＡサンプルの数は濃度１種類当り８つである。
図１０ａは、プールしたｑＰＣＲデータを提供するものであり、ここで完全長ｍＲＮＡレベルは１～１，０００ａＭの「ＡＳＯ １Ｍ」で処理された細胞において約４０％まで著しく減少した。
実施例３．「ＡＳＯ １Ｍ」によるＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞におけるＴＹＲタンパク質発現の阻害
「ＡＳＯ １Ｍ」を、下記の通りにＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞におけるＴＹＲタンパク質発現を下方調節するその能力について評価した。
５ｍＬのＤＭＥＭを含有する６０ｍｍ培養ディッシュ中で増殖されたＢ１６Ｆ１０細胞を、０ｚＭ（陰性対照）、１０ｚＭ、１００ｚＭ、１ａＭ、または１０ａＭの「ＡＳＯ １Ｍ」で処理した。２４時間後、細胞を、低温ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）で２回洗浄し、次いで１×プロテアーゼ阻害カクテル（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ８３４０、シグマ（Ｓｉｇｍａ））が補充された２００μｌの１×細胞溶解緩衝剤（Ｃａｔ．Ｎｏ．９８０３、セルシグナリングテクノロジー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈ））を用いた溶解に供した。１．５ｍＬのｅ－チューブ中の２００μｌの各溶解物を１００μｌの５×サンプル緩衝剤と混合し、１００℃で５分間沸騰させた。２０μｌの前記溶解物を、４～１５％勾配ＴＧＸジェル（Ｃａｔ Ｎｏ．４５６－１０８６、バイオラッド（Ｂｉｏ－Ｒａｄ））において電気泳動分離に供し、０．４５μｍのＰＶＤＦメンブレイン上でのタンパク質転写に供した。前記メンブレインを、抗ＴＹＲ抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．９３１９、セルシグナリングテクノロジー）及び抗βアクチン抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．ａ３８４５、シグマ）でプロービングした。
図１０ｂは、Ｂ１６Ｆ１０細胞におけるＴＹＲタンパク質発現についてのウェスタンブロットデータを提供する。ＴＹＲ発現のバンドの強度は、「ＡＳＯ １Ｍ」処理を施していない溶解物、つまり陰性対照よりも「ＡＳＯ １Ｍ」処理した溶解物でより遥かに弱かった。前記ＴＹＲタンパク質及びｍＲＮＡのレベルは、前記ＡＳＯ処理によって同程度に減少した（「実施例２」参照）。
実施例４．「ＡＳＯ １Ｍ」によるＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞におけるメラニン形成の阻害
「ＡＳＯ １Ｍ」を、下記の通りにＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞においてメラニン形成を阻害するその能力について評価した。
５ｍＬのＤＭＥＭを含有する６０ｍｍ培養ディッシュ中で継代培養されたＢ１６Ｆ１０細胞を、無処理（陰性対照）で、１～１，０００ａＭの「ＡＳＯ １Ｍ」で、或いは陽性対照として１０または１００μｇ／ｍＬのアルブチンで処理した（１用量当り２つの培養ディッシュ）。２４時間後、細胞を、低温ＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌの１Ｎ ＮａＯＨを用いた溶解に供した。各溶解物を１．５ｍＬのｅ－チューブに収集し、室温で一晩維持した。各溶解物中のメラニン含量を、ＥＬＩＳＡリーダーにおいて４７５ｎｍで吸光度によって測定した。同じ実験を、異なる継代の細胞を使用して４回繰り返した。４つのメラニン含量データセットを、処理を施していないメラニン含量（陰性対照）に対するスチューデントｔ－検定による統計学的分析のためにプールした。
図１１は、「ＡＳＯ １Ｍ」またはアルブチンとの２４時間インキュベーションの後のＢ１６Ｆ１０細胞中のメラニン含量の変化を要約している。前記メラニン含量は、それぞれ１０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬアルブチンで処理された細胞において約１５％及び２５％まで著しく減少した。「ＡＳＯ １Ｍ」で処理された細胞の場合、前記メラニン含量はさほど用量依存性なく、約１５％まで著しく減少した。「ＡＳＯ １Ｍ」の阻害活性は、１０μｇ／ｍＬアルブチンのものに匹敵した。
実施例５．式Ｉの化合物を含有する局所クリームの調製
式Ｉの化合物、例えば「ＡＳＯ ２」を、対象に局所適用するためのクリームとして製剤化した。この局所クリームは、下記の通りの調製物であった。多数の多様な局所クリームが存在し得ることを考慮すると、前記調製物は一例として見なさなければならなく、本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。
［溶液Ａの調製］ ビーカー中で、脱イオン水（１９６ｇ）、ＥＤＴＡ２ナトリウム（０．０６ｇ）、グリセリン（１５ｇ）、ジプロピレングリコール（３０ｇ）、フェノキシエタノール（０．９ｇ）、エチルヘキシルグリセリン（０．９ｇ）、ヒドロキシエチルアクリレート／ナトリウムアクリロイルジメチルタウレート共重合体（２．４ｇ）、及び１ｎＭの「ＡＳＯ ２」水溶液（０．３ｍＬ）を混合した。この混合物を、ホモミキサーを使用した７０～７５℃での均質化に供した。
［溶液Ｂの調製］ また別のビーカー中で、７０～７５℃でセテアリールエチルヘキサノエート（１２ｇ）、ジメチコン（６ｇ）、ステアリン酸／水素化された植物性オイル／ベヘニルアルコール／セテアリールアルコール（１５ｇ）、ブチロスペルミウムパークリー（シア）バター（９ｇ）、及びポリグリセリル－３－メチルグルコースジステアレート／グリセリルステアレートＳＥ／メチルグルコースセスキステアレート（６ｇ）を混合した。
［局所クリームの調製］ 「溶液Ａ」及び「溶液Ｂ」を、混合して、ホモミキサーを使用した３分間、７，２００ｒｐｍ及び７０～７５℃での均質化に供した。この混合物を室温で徐々に冷却して、１ｐＭの「ＡＳＯ ２」を含有する局所クリームを得た。
実施例６．「ＡＳＯ １」で処理されたヒトメラニン細胞中のＴＹＲ ｍＲＮＡについてのｑＰＣＲ
表1に明示した「ＡＳＯ １」は、
Figure 0007109532000071
の３０ｍｅｒヒトＴＹＲプレｍＲＮＡ配列において「太字」「下線」表示したようなヒトＴＹＲ中のイントロン１とエクソン２の接合部にわたっている３’スプライス部位に完全に相補的な１３ｍｅｒ ＴＹＲ ＡＳＯである。
「ＡＳＯ １」を下記の通りにヒト１次上皮メラニン細胞においてＴＹＲ ｍＲＮＡレベルの変化を誘導するその能力に対して、ＴＹＲネステッドｑＰＣＲによって評価した。
［細胞培養＆ＡＳＯ処理］ １次上皮メラニン細胞（Ｃａｔ．Ｎｕｍｂｅｒ ＰＣＳ－２００－０１３、ＡＴＣＣ）を、成人メラニン細胞成長キット成分（Ａｄｕｌｔ Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｋｉｔ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（Ｃａｔ．Ｎｕｍｂｅｒ ＰＣＳ－２００－０４２、ＡＴＣＣ）が補充された皮膚細胞基礎培地（Ｄｅｒｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｃａｔ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＣＳ－２００－０３０、ＡＴＣＣ）で維持した。５ｍＬ培養培地を含有する６０ｍｍ培養ディッシュ中で増殖したメラニン細胞を０ｚＭ（陰性対照）、１ｚＭ、１００ｚＭ、または１０ａＭの「ＡＳＯ １」で処理した（１種類の濃度当り３つの培養ディッシュ）。
［ＲＮＡ抽出＆１段階ＰＣＲによるｃＤＮＡ合成］ ５時間「ＡＳＯ １」とのインキュベーションの後、全ＲＮＡを「ＲＮｅａｓｙミニキット」（Ｃａｔ．Ｎｕｍｂｅｒ ７４１０６、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して、その製造業者の説明に従い抽出した。２００ｎｇのＲＮＡ鋳型を、以下に明示したサイクル条件：５０℃３０分及び９４℃２分に次いで、１５サイクルの９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃１分に従い、［エクソン1＿順方向（２）：
Figure 0007109532000072
；及びエクソン５＿逆方向：
Figure 0007109532000073
］のエクソン特異的プライマーセットに対してプラチナ（登録商標）Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１０９２８－０４２、インビトロゲン）を有するスーパースクリプト（登録商標）ワンステップＲＴ－ＰＣＲキットを使用した２５μｌ逆転写反応に供した。
［ネステッドＰＣＲ増幅］ １μＬのｃＤＮＡをａ Ｔａｑｍａｎプローブ
Figure 0007109532000074
に対する［エクソン２ｎ＿順方向：
Figure 0007109532000075
；及びエクソン３ｎ＿逆方向：
Figure 0007109532000076
］のエクソン特異的プライマーセットに対して２０μｌネステッドＰＣＲ反応（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ２６１２、バイオニア）でさらに増幅させた。サイクル条件：９５℃３分に次いで、４０サイクルの９５℃１０秒、及び６０℃３０秒。
図１２は、ｑＰＣＲデータを提供し、ここで完全長ＴＹＲ ｍＲＭＡレベルは、１ｚＭ～１０ａＭの「ＡＳＯ １」で処理されたヒトメラニン細胞において約３０％まで減少した。確認された減少は、１ｚＭ及び１０ａＭの「ＡＳＯ １」で処理された細胞において有意レベルだった（スチューデントｔ－検定）。

Claims (8)

  1. 式Ｉ：
    Figure 0007109532000077
    によって表されるペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩：
    式中、
    ｎは１０と２１の間の整数であり；
    式Ｉの化合物は、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡ中の
    Figure 0007109532000078
    の１４ｍｅｒプレｍＲＮＡ配列との１０ｍｅｒ相補性オーバーラップを少なくとも１つ有し；
    式Ｉの化合物は、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡに完全に相補的であるか、或いは、式Ｉの化合物全体からの１つまたは２つのミスマッチのためにヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡに部分的に相補的であり；
    Ｓ１、Ｓ２、・・・、Ｓｎ－１、Ｓｎ、Ｔ１、Ｔ２、・・・、Ｔｎ－１、及びＴｎは独立して、ヒドリドラジカルを表し；
    Ｘ及びＹは独立して、ヒドリド［Ｈ］、または置換または非置換のアルキルオキシカルボニルラジカルを表し；
    Ｚは、置換または非置換のアミノラジカルを表し；
    Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、及びＢｎは、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基の中から独立して選択され；かつ
    Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、及びＢｎのうちの少なくとも４つは、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶ：
    Figure 0007109532000079
    によって表される非天然核酸塩基の中から独立して選択され、
    式中、
    Ｒ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３ 、Ｒ ４ 、Ｒ ５ 、及びＲ ６ が、ヒドリドラジカルであり；
    Ｌ １ 、Ｌ ２ 、及びＬ ３ が、核酸塩基部分に塩基性アミノ基を共有結合的に連結させる、式Ｖ：
    Figure 0007109532000080
    によって表される共有結合性リンカーであり、
    式中、
    Ｑ １ 及びＱ ｍ が、メチレン（－ＣＨ ２ －）ラジカルであり、かつＱ ｍ は塩基性アミノ基に直接連結されており；
    Ｑ ２ 、Ｑ ３ 、・・・、及びＱ ｍ－１ が、メチレン、酸素（－Ｏ－）ラジカル［－Ｎ（Ｈ）－または－Ｎ（置換基）－］の中から独立して選択され；かつ
    ｍが、１と１５の間の整数である。
  2. ｎが、１１と１６の間の整数であり；
    式Ｉの化合物が、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡ中の
    Figure 0007109532000081
    の１４ｍｅｒプレｍＲＮＡ配列との１０ｍｅｒ相補性オーバーラップを少なくとも１つ有し；
    式Ｉの化合物が、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡに完全に相補的であり；
    Ｓ１、Ｓ２、・・・、Ｓｎ－１、Ｓｎ、Ｔ１、Ｔ２、・・・、Ｔｎ－１、及びＴｎが、ヒドリドラジカルであり；
    Ｘ及びＹが、ヒドリド、或いは置換または非置換のアルキルオキシカルボニルラジカルの中から独立して選択され；
    Ｚが、置換または非置換のアミノラジカルを表し；
    Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、及びＢｎが、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及び非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
    Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、及びＢｎのうちの少なくとも５つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって表される非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が、ヒドリドラジカルであり；
    Ｑ１及びＱｍがメチレンラジカルであり、かつＱｍが塩基性アミノ基に直接連結されており；
    Ｑ２、Ｑ３、・・・、及びＱｍ－１が、メチレン及び酸素ラジカルの中から独立して選択され；かつ
    ｍが、１と９の間の整数である、
    請求項１に記載のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩。
  3. ｎが、１１と１６の間の整数であり；
    式Ｉの化合物が、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡ中の
    Figure 0007109532000082
    の１４ｍｅｒプレｍＲＮＡ配列との１０ｍｅｒ相補性オーバーラップを少なくとも１つ有し；
    式Ｉの化合物が、ヒトチロシナーゼプレｍＲＮＡに完全に相補的であり；
    Ｓ１、Ｓ２、・・・、Ｓｎ－１、Ｓｎ、Ｔ１、Ｔ２、・・・、Ｔｎ－１、及びＴｎが、ヒドリドラジカルであり；
    Ｘが、ヒドリドラジカルであり；
    Ｙが、置換または非置換のアルキルオキシカルボニルラジカルを表し；
    Ｚが、置換または非置換のアミノラジカルを表し；
    Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、及びＢｎが、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及び非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
    Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、及びＢｎのうちの少なくとも５つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって表される非天然核酸塩基の中から独立して選択され；
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が、ヒドリドラジカルであり；
    Ｌ１が、－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）３－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）４－、または－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）５－を表し、ここで、右側端部が塩基性アミノ基に直接連結されており；かつ
    Ｌ２及びＬ３が、－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）４－、－（ＣＨ２）５－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）７－、及び－（ＣＨ２）８－の中から独立して選択され、ここで右側端部が塩基性アミノ基に直接連結されている、
    請求項１に記載のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩。
  4. 下記に提供したペプチド核酸誘導体のグループ：
    (N→C) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
    (N→C) Fethoc-AC(1/2)A(5)-GA(5)C-AA(5)T-CTG(6)-C(1/2)C-NH2
    (N→C) Fmoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2
    (N→C) Fethoc-Lys-Gly-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
    (N→C) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-Lys-NH2;
    (N→C) Fethoc-Val-Gly-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2
    (N→C) Fethoc-CA(7)G-AC(2O2)A-A(4)TC(1O2)-TG(6)T-A-NH2;
    (N→C) Fethoc-CTG(6)-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
    (N→C) Fethoc-CA(5)G-ATA(5)-ATC(1O2)-TG(5)T-A(5)-NH2;
    (N→C) Fethoc-TA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
    (N→C) Fethoc-TCA(3)-GAC(1O5)-A(5)AT-C(1O2)TG(5)-TA(5)-NH2;
    (N→C) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)C-NH2;
    (N→C) Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(6)TA(5)-C-NH2;
    (N→C) Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(6)TA(5)-CA(2O2)A-NH2;
    (N→C) Fethoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C(1O2)-AA(6)-NH2;
    (N→C) Fethoc-AC(1O3)T-GA(6)C-TA(6)T-CTG(6)-TAC(1O5)-A(4)A-NH2;
    (N→C) Fethoc-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C(1O2)-AA(6)-NH2;
    (N→C) Fethoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O2)-A-NH2;
    (N→C) Fethoc-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O2)-A-NH2;
    (N→C) Fethoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O3)-A-NH2;
    (N→C) Fethoc-GC(1O4)T-AC(1O2)A-GA(4)C-AAT-CTG(6)-TA(6)C-NH2;
    (N→C) Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-GA(4)C-AAT-C(1O2)TG-NH2;
    (N→C) Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-G(2O2)AC-A(5)AT-C(1O2)TG-NH2; 及び
    (N→C) Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-GA(4)C-A(2O2)AT-C(1O2)TG-NH2
    から選択され、
    ここで、
    Ａ、Ｇ、Ｔ、及びＣが、それぞれアデニン、グアニン、チミン、及びシトシンの天然核酸塩基を有するＰＮＡモノマーであり；
    Ｃ（ｐＯｑ）、Ａ（ｐ）、Ａ（ｐＯｑ）、Ｇ（ｐ）、及びＧ（ｐＯｑ）が、それぞれ式ＶＩ、式ＶＩＩ、式ＶＩＩＩ、式ＩＸ、及び式Ｘ：
    Figure 0007109532000083
    によって表される非天然核酸塩基を有するＰＮＡモノマーであり、
    ここで、
    ｐ及びｑが、整数であり；かつ
    Ｎ末端置換基及びＣ末端置換基の略語は下記に具体的に記載した通り、「Ｆｍｏｃ－」が「［（９－フルオレニル）メチルオキシ］カルボニル－」；「Ｆｅｔｈｏｃ－」が「［２－（９－フルオレニル）エチル－１－オキシ］カルボニル」；「－Ｌｙｓ－」がアミノ酸残基「リジン」；「－Ｖａｌ－」がアミノ酸残基「バリン」；「－Ｇｌｙ－」がアミノ酸残基「グリシン」；かつ「－ＮＨ２」が非置換「－アミノ」基の略語である、
    請求項１に記載のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩。
  5. 請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩を含む、ヒトチロシナーゼ遺伝子の発現に関連する疾患または状態の治療用の薬学的組成物。
  6. 請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩を含む、過色素沈着症の治療用の薬学的組成物。
  7. ヒトチロシナーゼ遺伝子の発現に関連する疾患または状態の治療用の医薬の調製における、請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩の使用。
  8. 過色素沈着症の治療用の医薬の調製における、請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩の使用。
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