JP7126718B2

JP7126718B2 - 重複する非対立遺伝子特異的プライマー及び対立遺伝子特異的ブロッカーオリゴヌクレオチドの組成物を用いる対立遺伝子特異的な増幅

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Publication number: JP7126718B2
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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年５月１９日に出願の米国仮出願第６２／０００，１１４号に対する優先権を請求するものであり、これの開示は、本明細書中に参照によってその全体が組み込まれる。

配列表
配列表は、電子的な形態でのみ本出願とともに提出され、本明細書中に参照によって組み込まれる。配列表テキストファイル「14-21013-WO(260947.00251)_SL.txt」は、２０１５年５月１８日に作成され、１３，１４４バイトのサイズである。

ＤＮＡ及びＲＮＡ配列における小さな差により、ヒトを含めた生物の全体の身体的な健康及びウェルネスにおける大きな差をもたらすことができる。例えば、細菌ゲノム中の単一塩基変化により、抗生物質抵抗性をもたらすことができ、また、ヒトゲノム中の単一塩基変化により、がん進行がもたらされる可能性がある。ゲノム科学分野の成熟及び多くの核酸生物マーカー配列及び分子の付随的な発見に伴って、バイオテクノロジー産業から、単一塩基変化を識別できる確実な、頑強な、安価な、且つ正確な核酸アッセイを開発する強い需要が存在する。特に、多くのＰＣＲに基づくアッセイが、開発されてきており、それらは対立遺伝子特異的である。

微量の変異の選択的な検出のためのＰＣＲに基づくアプローチは、（Ａ）対立遺伝子特異的プライマー及び（Ｂ）対立遺伝子特異的ブロッカーを伴う非対立遺伝子特異的プライマーの２つのファミリーのアプローチに大きく分類することができる。

対立遺伝子特異的プライマーの例には、増幅不応性突然変異システム（ＡＲＭＳ）、対立遺伝子特異的ブロッカーＰＣＲ（ＡＳＢ－ＰＣＲ）、及び競合的対立遺伝子特異的TaqMan PCR（ｃａｓｔＰＣＲ）が含まれる。（Ｂ）の例には、ＰＮＡブロッカーＰＣＲ及びより低い変性温度ＰＣＲ（ＣＯＬＤ－ＰＣＲ）での同時増幅が含まれる。

本発明の前、対立遺伝子特異的プライマーは、既知の一塩基変異の検出に一般に優れており（より高い変異感受性）、対立遺伝子特異的ブロッカーを伴う非対立遺伝子特異的プライマーは、接近してクラスター化した複数の変異（ホットスポット）又は未知の変異配列の検出に一般に適用されている。

ＡＲＭＳ、ＡＳＢ－ＰＣＲ、ｃａｓｔＰＣＲなどの対立遺伝子特異的ＰＣＲプライマーは、プライマーの最も３’の位置に対立遺伝子特異的なヌクレオチドを一般に有する。対立遺伝子特異的ＰＣＲプライマーは、正しく対になった塩基を特異的に伸長するためにＤＮＡポリメラーゼ酵素の識別力を利用するが、不正確なＤＮＡポリメラーゼ伸長イベントが生じる場合、プライマーの一部であった微量の対立遺伝子ヌクレオチドがテンプレートに組み込まれることになり、それ以降増幅サイクルが非特異的になるとの事実によって制限される。対立遺伝子特異的ＰＣＲプライマーは、最初の不正確な増幅イベントまで特異的であるにすぎない。非対立遺伝子特異的プライマーでの対立遺伝子特異的な検出は、正確な変性温度制御及びより小さい配列の制限分析を必要とする。非対立遺伝子特異的プライマーでの対立遺伝子特異的な検出は、低い変異感受性を有し、ポリメラーゼが導入するエラーに対してより脆弱である。

したがって、対立遺伝子特異的な増幅及び改善された変異感受性を伴った非対立遺伝子特異的プライマー及び対立遺伝子特異的ブロッカーオリゴヌクレオチドの組成物が必要とされる。したがって、大過剰のバリアント中の少量の標的の検出に適した新しいアプローチの開発は、診断上の適用に必須である。このように、本開示は、例えば、がん診断などの疾患診断上の適用のための、より正確で効率的なツールを提供するための非対立遺伝子特異的プライマー及び対立遺伝子特異的ブロッカーオリゴヌクレオチドの組成物を提供する。

本発明は、対立遺伝子特異的な増幅のための、重複する非対立遺伝子特異的プライマーオリゴヌクレオチド及び対立遺伝子特異的ブロッカーオリゴヌクレオチドの組成物に関する。

本発明は、ブロッカーオリゴヌクレオチド及び第１のプライマーオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド組成物を提供する。前記ブロッカーオリゴヌクレオチドは、標的中立性サブ配列（target-neutral subsequence）及びブロッカー可変性サブ配列（blocker variable subsequence）を有する第１の配列を含む。しかし、いくつかの例では、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドは、検出される標的核酸が挿入の検出のためである場合には前記ブロッカー可変性サブ配列を含まないこともある。前記ブロッカー可変性サブ配列は、その３’及び５’末端に標的中立性サブ配列が隣接し、該標的中立性サブ配列と連続する。前記第１のプライマーオリゴヌクレオチドは酵素による伸長を誘導するのに十分であり；ここで前記第１のプライマーオリゴヌクレオチドは第２の配列を含む。前記第２の配列が重複サブ配列（overlapping subsequence）及び非重複サブ配列を含むように、前記第２の配列は標的中立性サブ配列の５’末端と少なくとも５ヌクレオチド重複する。前記第２の配列は、ブロッカー可変性サブ配列に対して相同ないかなる配列も含まない。

本発明はさらに、標的配列の増幅のための方法に関する。方法には、バリアント配列を有する１又は２コピー以上の第１の核酸及び少なくとも１コピーの第２の核酸を含有する試料を得るステップが含まれ；ここで前記第２の核酸は標的配列を有する。前記標的配列及びバリアント配列はそれぞれ、相同性サブ配列及び可変性サブ配列を含む。前記可変性サブ配列は、少なくとも１つのヌクレオチドをさらに含む。さらに、前記標的配列の可変性サブ配列は標的特異的サブ配列であり、前記バリアント配列の可変性サブ配列は非標的特異的サブ配列である。

試料を得るステップ後、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、試料に導入される。前記ブロッカーオリゴヌクレオチドは、標的中立性サブ配列及びブロッカー可変性サブ配列を有する第１の配列を含む。前記標的中立性サブ配列は相同性サブ配列の部分に対して相補的であり、前記ブロッカー可変性サブ配列は非標的特異的サブ配列に対して相補的である。さらに、前記ブロッカー可変性サブ配列は、その３’及び５’末端に標的中立性サブ配列が隣接し、該標的中立性サブ配列と連続する。

その後、第１のプライマーオリゴヌクレオチドは、試料に導入される。前記第１のプライマーオリゴヌクレオチドは、酵素による伸長を誘導するのに十分である。前記第１のプライマーオリゴヌクレオチドは、前記相同性サブ配列の第２の部分に対して相補的である、第２の配列を含む。さらに、前記第２の配列が重複サブ配列及び非重複サブ配列を含むように、前記第２の配列は標的中立性サブ配列の５’末端と少なくとも５ヌクレオチド重複する。前記第２の配列は、可変性サブ配列に対して相補的ないかなる配列も含まない。

次のステップで、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、及びポリメラーゼに基づく核酸増幅に必要な１又は２以上の試薬が、試料に導入され；試料は、核酸増幅を達成するのに十分な条件下で反応させる。

本発明の利点は、対立遺伝子特異的プライマーアプローチに適合する及び／又はそれを超える改善された変異感受性である。

本発明の別の利点は、顕著な（８℃）温度ロバスト性を有する単純な２ステップサーマルサイクリングプロトコールである。

本発明のさらに別の利点は、複雑なバックボーン又はヌクレオチド修飾なしで、安価なＤＮＡプライマー及びブロッカー試薬を提供することである。

本発明のさらに別の利点は、高いフィデリティーの酵素との適合性である。

本発明のさらに別の利点は、非対立遺伝子特異的プライマーが、バリアントに結合したブロッカーと比較して、標的に結合したブロッカーを、より有利に置き換えるように、対立遺伝子特異的ブロッカーが標的よりもバリアントにより強く結合することである。前記非対立遺伝子特異的プライマーを用いる利点は、擬似的に増幅されるバリアントが、標的配列というよりむしろバリアント配列を保有する増幅産物（アンプリコン）をもたらすことである。したがって、特異性は、サイクルごとに度合いを増す。

この発明の概要は、下記の発明を実施するための形態においてさらに記載される、単純化された形で、発明の開示、特定の態様、利点及び新規特徴を導入するために提示される。この発明の概要は、特許請求される対象物の鍵となる特徴又は不可欠な特徴を同定することを意図するものではなく、特許請求される対象物の範囲を限定するために使用されることを意図するものでもない。

上記の発明の概要は、以下の例示的な実施形態の詳細な説明と同様に、添付の図面と併せて読めば、より良く理解される。本開示を説明する目的で、本開示の例示的な構成が図面中に示される。しかし、本開示は、本明細書に開示される特定の方法及び手段に限定されない。
本発明に従う対立遺伝子特異的な増幅のための非対立遺伝子特異的プライマー及び対立遺伝子特異的ブロッカーの概略図を説明する図である。本発明に従うプライマー及びブロッカーの熱力学的なデザインの概略図を説明する図である。本発明に従う配列からのΔＧ°値の計算の概略図を説明する図である。図３は、表示順に、それぞれ、配列番号１、３３、１、３４、２、３３、２、及び３４を開示する。実施例１に従うヒトゲノムＤＮＡ中の微量の対立遺伝子検出の概略図を説明する図である。図４は、表示順に、それぞれ、配列番号３～４、３５、３２、３６、及び３２を開示する。実施例２に従う微量の温度ロバスト性の概略図を説明する図である。図５は、表示順に、それぞれ、配列番号５～６及び３７～３８を開示する。実施例３に従う増加したプライマーデザイン柔軟性の概略図を説明する図である。実施例３に従うヒトＳＮＰｒｓ３７８９８０６を増幅する４セットのプライマー及びブロッカーペアの核酸配列の概略図を説明する図である。図６Ｂは、表示順に、それぞれ、配列番号５～１２及び３９～４０を開示する。実施例４に従う、固定されたΔΔＧ°＝２ｋｃａｌ／ｍｏｌでのΔＧ°_ｒｘｎ１の効果のシミュレーションの概略図を説明する図である。実施例４に従う、ＳＭＡＤ７ｒｓ４９３９８２７における実験検証の概略図を説明する図である。図７Ｂ（Ｉ）は、表示順に、それぞれ、配列番号３、１３～１６、４、１７、及び３５～３６を開示する。実施例４に従う、ＳＭＡＤ７ｒｓ４９３９８２７における実験検証の概略図を説明する図である。図７Ｂ（II）は、表示順に、それぞれ、配列番号３、１８～２３、３６、及び３５を開示する。実施例５に従う、３’非相同性領域を有するブロッカーの概略図を説明する図である。図８は、表示順に、それぞれ、配列番号５、２４、及び３７～３８を開示する。実施例６に従う、TaqMan（登録商標）プローブを用いるマルチプレックスの概略図を説明する図である。実施例６に従う、TaqMan（登録商標）プローブを用いるマルチプレックスの概略図を説明する図である。実施例７に従う、プライマー及びブロッカーのためのプロテクターの概略図を説明する図である。実施例８に従う、欠失（ＳＴＡＧ２ｒｓ２００８４１３３０）の検出の概略図を説明する図である。図１１Ａは、表示順に、それぞれ、配列番号２５～２６及び４１～４２を開示する。実施例８に従う、挿入（ＳＴＡＧ２ｒｓ２００８４１３３０）の検出の概略図を説明する図である。図１１Ｂは、表示順に、それぞれ、配列番号２５、４３、４２、及び４１を開示する。実施例９に従う、上流ブロッカーの概略図を説明する図である。図１２は、表示順に、それぞれ、配列番号２７～２８及び４４～４５を開示する。実施例１０に従う、真菌リボソームＲＮＡコード化ＤＮＡの特異的な増幅の概略図を説明する図である。実施例１１に従う、ＤｕａｌＮＡＳＰの概略図を説明する図である。図１４は、表示順に、それぞれ、配列番号２９、１０、４６～４９、及び３０～３１を開示する。

本発明は、特定の実施形態に関して及びある特定の図面を参照して記載されるが、本発明はそれらに限定されるものではなく、請求項によってのみ限定される。記載された図面は、概略のみを記載し、非限定的である。図面では、いくつかの要素のサイズは、誇張又は曲解される可能性があり、説明目的でのスケールで描かれていない。何か他のものが具体的に指定されない限り、本発明の要素が初出において「ａ」又は「ａｎ」として指定される場合、２回目以降の出現に対しては「前記（ｔｈｅ）」又は「前記（ｓａｉｄ）」として指定される。

以下、本発明は、添付されている図面を参照してより完全に記載され、本発明の全てではないが、一部の実施形態が示される。実際に、本発明は、多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書において説明されている実施形態に制限されるものと解釈すべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、本開示が全ての法的要件を満足するよう、提供される。

定義
他に定義されていない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語は、当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

本明細書で用いているように、用語「ブロッカーオリゴヌクレオチド」は、長さ約１２～約１００ヌクレオチドの少なくとも１本の連続的な鎖を指し、本明細書にそのように示される場合、その３’末端に官能基又はヌクレオチド配列をさらに含んでもよく、これによって、ポリメラーゼ連鎖反応法などの増幅プロセス間に酵素による伸長が防止される。

本明細書で用いているように、用語「プライマーオリゴヌクレオチド」は、長さ約１２～約１００ヌクレオチドの少なくとも１本の連続的な鎖を含み、ポリメラーゼ連鎖反応法などの増幅プロセス間に酵素による伸長を可能にするのに十分である分子を指す。

本明細書で用いているように、用語「標的中立性サブ配列」は、標的核酸及びバリアント核酸の両方における配列に対して相補的であるヌクレオチドの配列を指す。例えば、増幅のための標的とされる所望の核酸配列（標的核酸）は、可変領域（バリアント核酸）を例外として、前記標的核酸と大部分が相同な配列を有する核酸分子を含む試料中に存在していてもよく、いくつかの実例では、このような可変領域は前記標的核酸から僅かに単一ヌクレオチドが異なる。この例では、前記標的中立性サブ配列は、可変領域ではない２つの核酸間で共有される相同配列の少なくとも部分に対して相補的である。したがって、本明細書で用いているように、用語「ブロッカー可変性サブ配列」は、バリアント核酸の可変領域に対して相補的な、ブロッカーオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を指す。

本明細書で用いているように、用語「重複サブ配列」は、本明細書に記載の組成物において使用されるブロッカーオリゴヌクレオチド配列の部分と相同な、プライマーオリゴヌクレオチドの少なくとも５ヌクレオチドのヌクレオチド配列を指す。前記プライマーオリゴヌクレオチドの重複サブ配列は、ブロッカー可変性サブ配列の５’であろうと３’であろうと、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドの標的中立性サブ配列の任意の部分に対して相同であってもよい。したがって、用語「非重複サブ配列」は、重複サブ配列ではないプライマーオリゴヌクレオチドの配列を指す。

本明細書で用いているように、用語「標的配列」は、増幅される、識別される、又はそうでなければ単離される、一塩基多型などの所望の対立遺伝子を有する核酸のヌクレオチド配列を指す。本明細書で用いているように、用語「バリアント配列」は、所望の対立遺伝子を有さない核酸のヌクレオチド配列を指す。例えば、いくつかの例では、バリアント配列は野生型の対立遺伝子を有し、一方、標的配列は突然変異対立遺伝子を有する。したがって、いくつかの例では、バリアント配列及び標的配列はゲノム中の共通の遺伝子座に由来し、それぞれの配列が、２つの間で変異する所望の対立遺伝子、ヌクレオチド又はヌクレオチドの群を有する領域以外が実質的に相同であってもよい。

本発明は、オリゴヌクレオチド組成物に関する。本発明の実施形態において、オリゴヌクレオチド組成物は、対立遺伝子特異的な増幅のための、非対立遺伝子特異的プライマーオリゴヌクレオチド及び対立遺伝子特異的ブロッカーオリゴヌクレオチドを含む。

本発明の別の実施形態において、オリゴヌクレオチド組成物は、ブロッカーオリゴヌクレオチド及び第１のプライマーオリゴヌクレオチドを含む。前記ブロッカーオリゴヌクレオチドは、標的中立性サブ配列及びブロッカー可変性サブ配列を有する第１の配列を含む。前記ブロッカー可変性サブ配列は、その３’及び５’末端に標的中立性サブ配列が隣接し、該標的中立性サブ配列と連続する。換言すれば、前記ブロッカー可変性サブ配列は、前記標的中立性サブ配列をブロッカー可変性サブ配列の３’に対する部分及び５’に対する部分の２つの部分に分割し得る。前記第１のプライマーオリゴヌクレオチドは酵素による伸長を誘導するのに十分であり；ここで第１のプライマーオリゴヌクレオチドは第２の配列を含む。前記第２の配列が重複サブ配列及び非重複サブ配列を含むように、前記第２の配列は標的中立性サブ配列と少なくとも５ヌクレオチド重複する。前記第２の配列は、ブロッカー可変性サブ配列を含まない。したがって、前記プライマーオリゴヌクレオチドは、非対立遺伝子特異的プライマーと特徴付けされ得る。前記重複領域は、前記ブロッカー可変性サブ配列の５’側又はブロッカー可変性サブ配列の３’側のいずれかにおけるブロッカーオリゴヌクレオチドの標的中立性サブ配列の部分に対して相同であってもよい。図１に示されるように、前記プライマーオリゴヌクレオチド重複サブ配列は、前記ブロッカー可変性サブ配列（ブロッカーにおける「Ｃ」として表示される）の５’側におけるブロッカーの標的中立性サブ配列と相同である。ここで、前記標的中立性サブ配列は、前記ブロッカー可変性サブ配列Ｃのいずれかの側におけるブロッカーの部分である。図１２は、前記プライマーの重複サブ配列が、前記ブロッカー可変性サブ配列Ｃの３’であるブロッカーの標的中立性サブ配列の部分と相同である一例を表す。

本発明のさらに別の実施形態において、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、３’末端又はその付近に、酵素による伸長を防止する官能基又は非相補的配列領域をさらに含む。ある例では、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドの官能基は、３－炭素スペーサー又はジデオキシヌクレオチドからなる群から選択されるが、これらに限定されない。

第２の配列はハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー（ΔＧ°_ＰＴ）を生じさせ、第１の配列はハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー（ΔＧ°_ＢＴ）を生じさせ、これは以下の条件：
＋２ｋｃａｌ／ｍｏｌ≧ΔＧ°_ＰＴ－ΔＧ°_ＢＴ≧－８ｋｃａｌ／ｍｏｌ
を満たす。

非重複サブ配列は、ハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー（ΔＧ°_３）を生じさせ、これは以下の条件：
－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ≧ΔＧ°_３≧－１２ｋｃａｌ／ｍｏｌ
を満たす。

ある例では、第２の配列は、標的中立性サブ配列の５’末端と約５ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド重複する。別の例では、第２の配列は、標的中立性サブ配列の５’末端と約７ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド重複する。

ある例では、ブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約２～約１０，０００倍高い。別の例では、ブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約５～約１，０００倍高い。

本発明のさらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチド組成物は、酵素による伸長を誘導するのに十分な第２のプライマーオリゴヌクレオチドをさらに含む。前記第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、前記第１の配列又は第２の配列と重複しない第３の配列を含み、標的中立性であり、ポリメラーゼ連鎖反応法を用いる核酸の領域を増幅するため、前記第１のプライマーオリゴヌクレオチドとともに使用するのに十分である。

本発明のさらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチド組成物は、第２のブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む。前記第２のブロッカーオリゴヌクレオチドは、第２の標的中立性サブ配列及び第２のブロッカー可変性サブ配列を有する第４の配列を含む。前記第２のブロッカー可変性サブ配列は、標的のアンチセンス配列に結合するように一般的にデザインされることから、標的核酸の非標的特異的サブ配列と同じ配列を有する。前記第２のブロッカー可変性サブ配列は、その３’及び５’末端に第２の標的中立性サブ配列が隣接し、該第２の標的中立性サブ配列と連続する。前記第３の配列が第２の重複サブ配列及び第２の非重複サブ配列を含むように、前記第３の配列は第２の標的中立性サブ配列の５’末端と少なくとも５ヌクレオチド重複する。

本発明のさらに別の実施形態において、第２のブロッカーオリゴヌクレオチドは、３’末端又はその付近に、酵素による伸長を防止する第２の官能基又は第２の非相補的配列領域をさらに含む。ある例では、前記第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの第２の官能基は、３－炭素スペーサー又はジデオキシヌクレオチドからなる群から選択されるが、これらに限定されない。

第３の配列はハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー（ΔＧ°_ＰＴ２）を生じさせ、第４の配列はハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー（ΔＧ°_ＢＴ２）を生じさせ、これは以下の条件：
＋２ｋｃａｌ／ｍｏｌ≧ΔＧ°_ＰＴ２－ΔＧ°_ＢＴ２≧－８ｋｃａｌ／ｍｏｌ
を満たす。

第２の非重複サブ配列は、ハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー（ΔＧ°_６）を生じさせ、これは以下の条件：
－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ≧ΔＧ°_６≧－１２ｋｃａｌ／ｍｏｌ
を満たす。

一例では、第３の配列は、第２の標的中立性サブ配列の５’末端と約５ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド重複する。別の例では、前記第３の配列は、前記第２の標的中立性サブ配列の５’末端と約７ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド重複する。

上記実施形態のいずれかにおいて、プライマーオリゴヌクレオチド及びブロッカーオリゴヌクレオチドは、それぞれ、約１２ヌクレオチド長～約１００ヌクレオチド長であってもよい。上記実施形態のいずれかにおいて、プライマーオリゴヌクレオチド及びブロッカーオリゴヌクレオチドは、それぞれ、約１５ヌクレオチド長～約９０ヌクレオチド長であってもよい。上記実施形態のいずれかにおいて、プライマーオリゴヌクレオチド及びブロッカーオリゴヌクレオチドは、それぞれ、約２０ヌクレオチド長～約８０ヌクレオチド長であってもよい。上記実施形態のいずれかにおいて、プライマーオリゴヌクレオチド及びブロッカーオリゴヌクレオチドは、それぞれ、約２０ヌクレオチド長～約７０ヌクレオチド長であってもよい。上記実施形態のいずれかにおいて、プライマーオリゴヌクレオチド及びブロッカーオリゴヌクレオチドは、それぞれ、約２０ヌクレオチド長～約６０ヌクレオチド長であってもよい。上記実施形態のいずれかにおいて、プライマーオリゴヌクレオチド及びブロッカーオリゴヌクレオチドは、それぞれ、２１、２２、２３、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０ヌクレオチド長であってもよい。

ある例では、第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約２～約１０，０００倍高い。別の例では、第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約５～約１，０００倍高い。別の例では、第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約１０～約９００倍高い。別の例では、第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約２０～約８００倍高い。別の例では、第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約３０～約７００倍高い。別の例では、第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約４０～約６００倍高い。別の例では、第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約５０～約５００倍高い。別の例では、第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約６０～約４００倍高い。別の例では、第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約７０～約３００倍高い。別の例では、第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約８０～約２００倍高い。別の例では、第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約９０～約１００倍高い。

本発明のさらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチド組成物は、ポリメラーゼ連鎖反応法に必要な試薬をさらに含む。

本発明のさらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチド組成物は、複数のヌクレオシド三リン酸をさらに含む。

本発明のさらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチド組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼをさらに含む。

本発明のさらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチド組成物は、ポリメラーゼ連鎖反応法に必要な試薬、複数のヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む。

本発明のさらに別の実施形態において、ブロッカー可変性サブ配列は、単一ヌクレオチドである。

本発明はさらに、標的配列の増幅のための方法に関する。方法には、（ａ）バリアント配列を有する１又は２コピー以上の第１の核酸及び少なくとも１コピーの第２の核酸を含有する試料を得るステップが含まれ；ここで前記第２の核酸は標的配列を有する。標的配列及びバリアント配列は、それぞれ、相同性サブ配列及び可変性サブ配列を有する。前記可変性サブ配列は、少なくとも１つのヌクレオチドをさらに含むが、２～５ヌクレオチドを含んでもよい。さらに、前記標的配列の可変性サブ配列は標的特異的サブ配列であり、前記バリアント配列の可変性サブ配列は非標的特異的サブ配列である。

方法は、（ｂ）ブロッカーオリゴヌクレオチドを試料に導入するステップをさらに含み；ここで前記ブロッカーオリゴヌクレオチドは、標的中立性サブ配列及びブロッカー可変性サブ配列を有する第１の配列を含む。前記標的中立性サブ配列は相同性サブ配列の部分に対して相補的であり、前記ブロッカー可変性サブ配列は非標的特異的サブ配列に対して相補的である。さらに、前記ブロッカー可変性サブ配列は、その３’及び５’末端に標的中立性サブ配列が隣接し、該標的中立性サブ配列と連続する。

方法は、（ｃ）第１のプライマーオリゴヌクレオチドを試料に導入するステップをさらに含む。前記第１のプライマーオリゴヌクレオチドは、酵素による伸長を誘導するのに十分である。前記第１のプライマーオリゴヌクレオチドは、第２の配列を含む。さらに、前記第２の配列は相同性サブ配列の第２の部分に対して相補的であり、また前記第２の配列が重複サブ配列及び非重複サブ配列を含むように、前記第２の配列は標的中立性サブ配列の５’末端と少なくとも５ヌクレオチド重複してもよい。前記第２の配列は、可変性サブ配列に対して相補的ないかなる配列も含まない。

方法は、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、及びポリメラーゼに基づく核酸増幅に必要な１又は２以上の試薬を試料に導入するステップ；並びに、次に（ｅ）
試料を核酸増幅を達成するのに十分な条件下で反応させるステップをさらに含む。

本発明の実施形態において、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、３’末端又はその付近に、酵素による伸長を防止する官能基又は非相補的配列領域をさらに含む。ある例では、前記官能基は、３－炭素スペーサー又はジデオキシヌクレオチドからなる群から選択されるが、これらに限定されない。

一例では、第２の配列は、ブロッカーの標的中立性サブ配列の５’末端と約５ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド重複する（すなわち、「重複サブ配列」）。換言すれば、前記第２の配列は、前記ブロッカーのブロッカー可変性サブ配列の５’側にあるブロッカーの標的中立性サブ配列の５ヌクレオチド～約４０ヌクレオチドと相同な重複サブ配列を含む。別の例では、前記第２の配列は、標的中立性サブ配列の５’末端と約７ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド重複する。さらに別の例において、第２の配列は、前記ブロッカーのブロッカー可変性サブ配列の３’側にあるブロッカーの標的中立性サブ配列の部分と相同な重複サブ配列を含む。

一例では、試料に導入されるブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、試料に導入される第１のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約２～約１０，０００倍高い。別の例では、試料に導入されるブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、試料に導入される第１のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約５～約１，０００倍高い。別の例では、試料に導入されるブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、試料に導入される第１のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約１０～約５００倍高い。別の例では、試料に導入されるブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、試料に導入される第１のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約２０～約２５０倍高い。別の例では、試料に導入されるブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、試料に導入される第１のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約４０～約１２５倍高い。別の例では、試料に導入されるブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、試料に導入される第１のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約５０～約１００倍高い。別の例では、試料に導入されるブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、試料に導入される第１のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約３００～約４００倍高い。別の例では、試料に導入されるブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、試料に導入される第１のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約５００～約６００倍高い。

本発明の別の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。

本発明のさらに別の実施形態において、方法は、試料を少なくとも１０サイクルかける（exposing）ステップにより核酸増幅を達成するのに十分な条件をさらに含む。各サイクルは少なくとも２つの異なる温度曝露（temperature exposure）を有し、１つの温度曝露
は少なくとも８５℃であり、１つの温度曝露は７５℃以下である。

本発明のさらに別の実施形態において、方法は、試料にニッキング酵素、リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、ＲＮＡｓｅ、逆転写酵素又はその任意の組合せからなる群から選択される酵素を導入するステップをさらに含む。

本発明のさらに別の実施形態において、方法は、第２のプライマーオリゴヌクレオチドを試料に導入するステップをさらに含む。前記第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、第３の配列を含む。さらに、前記第３の配列は、可変性サブ配列と重複しない。さらに、前記第３の配列は、標的中立性であり、標的配列を有する核酸の領域を増幅するため、第１のプライマーオリゴヌクレオチドとともに使用するのに十分である。

本発明のさらに別の実施形態において、方法は、第２のブロッカーオリゴヌクレオチドを試料に導入するステップをさらに含む。前記第２のブロッカーオリゴヌクレオチドは第４の配列を含み；ここで第４の配列は第２の標的中立性サブ配列及び第２のブロッカー可変性サブ配列を有する。さらに、前記第２のブロッカー可変性サブ配列は、前記ブロッカー可変性サブ配列に対して相補的な配列である。さらに、前記第２のブロッカー可変性サブ配列は、その３’及び５’末端に第２の標的中立性サブ配列が隣接し、該第２の標的中立性サブ配列と連続する。加えて、前記第３の配列が第２の重複サブ配列及び第２の非重複サブ配列を含むように、前記第３の配列は第２の標的中立性サブ配列の５’末端と少なくとも５ヌクレオチド重複する。

本発明のさらに別の実施形態において、第２のブロッカーオリゴヌクレオチドは、酵素による伸長を防止する、３’末端又はその付近に第２の官能基又は第２の非相補的配列領域をさらに含む。ある例では、前記第２の官能基は、３－炭素スペーサー又はジデオキシヌクレオチドからなる群から選択されるが、これらに限定されない。

ある例では、第３の配列は、第２の標的中立性サブ配列の５’末端と約５ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド重複する。別の例では、前記第３の配列は、第２の標的中立性サブ配列の５’末端と約７ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド重複する。

ある例では、試料に導入される第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、試料に導入される第２のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約２～約１０，０００倍高い。別の例では、試料に導入される第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は、試料に導入される第２のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約５～約１，０００倍高い。

本発明のさらに別の実施形態において、標的配列の増幅のための方法は、試料からアリコート（aliquot）を除去するステップ；及び上記定義されるステップ（ｂ）から（ｅ）
を繰り返すステップをさらに含む。

図１は、対立遺伝子特異的な増幅のための非対立遺伝子特異的プライマー及び対立遺伝子特異的ブロッカーの概略図を説明する。核酸試薬混合物は二種のオリゴヌクレオチド種、プライマー（プライマーオリゴヌクレオチド）及びバリアント特異的ブロッカー（ブロッカーオリゴヌクレオチド）を含み、これが一緒に作用してポリメラーゼに基づく増幅方法と連動して確実な微量標的の増幅を可能にする。ブロッカーは、ジデオキシヌクレオチド又は３－炭素リンカーなどの非伸長性修飾によって３’末端で修飾されてもよい。プライマー及びブロッカーの配列は、標的核酸配列及びバリアント核酸配列へのそれらのハイブリダイゼーションの熱力学に基づいて合理的にデザインされる。いくつかの実施形態において、ブロッカーは、標的及びバリアント核酸配列の優勢がプライマーに結合する前にブロッカーに結合するように、プライマーよりも著しく高い濃度で存在する。プライマーは、ブロッカー－標的又はブロッカー－バリアント分子に一過性に結合し、標的又はバリアントに対する結合においてブロッカーに置き換わる可能性を持つ。ブロッカー配列はバリアント標的に特異的であるので、そのバリアントからの置き換えは標的からの置き換えよりも熱力学的な有利性は低い。したがって、非対立遺伝子特異的プライマーは、バリアント配列を増幅するよりも、高い収率／効率で、標的配列を増幅する。そのプライマーの非対立遺伝子特異的な性質は、擬似的に増幅されるバリアント配列が、標的対立遺伝子というよりむしろバリアント対立遺伝子を保有することを意味し、その後の増幅サイクルも標的に優位な増幅バイアスを示す。

バリアント特異的ブロッカーの高濃度により、プライマーが結合する機会を得る前に、最初にブロッカーが標的及びバリアントの両方に結合する高い確率がもたらされる。プライマーが、ブロッカーと重複しないユニーク領域を介して標的－ブロッカー又はバリアント－ブロッカー複合体両方への結合を開始し、その後、酵素フリー鎖置換プロセスを介してブロッカーを置き換える可能性がある。

図２はプライマー及びブロッカーの熱力学的なデザインの概略図を説明する。プライマー及びブロッカーの配列は、望ましい反応熱力学を達成するため合理的にデザインされる。ここで、プライマー、ブロッカー、標的、及びバリアント核酸配列は、図２において１から８の番号で表示される、連続的なヌクレオチドを含む領域に細分される。プライマーと標的の間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー（ΔＧ°_ＰＴ）及びブロッカーと標的の間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー（ΔＧ°_ＢＴ）は、以下を満たす：
＋２ｋｃａｌ／ｍｏｌ≧ΔＧ°_ＰＴ－ΔＧ°_ＢＴ≧－８ｋｃａｌ／ｍｏｌ

上記を満足させるプライマー及びブロッカーシステムは、標的に対するプライマー結合とバリアントに対するプライマー結合の間の各サイクルにおけるハイブリダイゼーション収率において大きい差を不均等に生じ、標的特異的な増幅がもたらされる。

酵素フリー鎖置換プロセスは、プライマー結合対ブロッカー結合の相対的な熱力学により導かれる。ブロッカーは、標的（より負のΔＧ°は強い有利性を示すので、結合の標準自由エネルギーΔＧ°_ＢＴ、ΔＧ°_ＢＴ＞ΔＧ°_ＢＶ）に対するよりもバリアント（結合の標準自由エネルギーΔＧ°_ＢＶ）に対してより有利にハイブリダイズする。本発明の別の実施形態において、プライマーは、標的（結合の標準自由エネルギーΔＧ°_ＰＴ、ΔＧ°_ＰＶ＝ΔＧ°_ＰＴ）に対するのに等しく有利にバリアント（結合の標準自由エネルギーΔＧ°_ＰＶ）にハイブリダイズする。

標的と結合しているブロッカーを置き換えるプライマーの反応ＢＴ＋Ｐ＜＝＞ＰＴ＋Ｂは、標準自由エネルギーΔＧ°_ｒｘｎ１＝ΔＧ°_ＰＴ－ΔＧ°_ＢＴを有し、これは標準自由エネルギーΔＧ°_ｒｘｎ２＝ΔＧ°_ＰＶ－ΔＧ°_ＢＶを有するバリアントと結合しているブロッカーを置き換えるプライマーの反応ＢＶ＋Ｐ＜＝＞ＰＶ＋Ｂのものよりも負（より有利）である。本発明の良好な性能のために、プライマー及びブロッカーは通常ΔＧ°_ｒｘｎ１≦０及びΔＧ°_ｒｘｎ２≧０であるようにデザインされるべきである。しかし、ブロッカー及びプライマーの相対的な濃度は、反応の平衡分布及び有効な熱力学に影響を及ぼし得るので、ΔＧ°_ｒｘｎ１及びΔＧ°_ｒｘｎ２ガイドラインは絶対ではない。

図３は配列からのΔＧ°値の計算の概略図を説明する。異なる領域相互作用のΔＧ°を計算するための異なる慣例が存在する；最隣接モデルに基づく例示的なエネルギー計算が図３中に示される。ΔＧ°_１－５、ΔＧ°_４－７、及びΔＧ°_４－８の用語は、ハイブリダイゼーション開始の標準自由エネルギー（ΔＧ°_ｉｎｉｔ）及び第６の領域に隣り合ったエキストラベーススタックをさらに含む。他の方法を用いて計算される標準自由エネルギーΔＧ°は同じΔＧ°_ＰＴ、ΔＧ°_ＰＶ、ΔＧ°_ＢＴ、及びΔＧ°_ＢＶ値をもたらし得るが、個々の領域（例えば、ΔＧ°_３－６）の熱力学は異なっていてもよい。説明的な例は、本発明において使用されるΔＧ°計算の方法を示すことが意図され、アッセイに関する配列を示唆することが意図されない；リストされる配列が安定に結合するためには短過ぎる可能性がある。プライマー配列、ブロッカー配列、標的配列、バリアント配列、操作温度、及び操作上の緩衝剤条件からのΔＧ°_ＰＴ、ΔＧ°_ＰＶ、ΔＧ°_ＢＴ、及びΔＧ°_ＢＶの計算は、当業者に知られている。

図４は、本発明のプローブ及びブロッカーデザイン並びに２つのヒトリポジトリ試料ＮＡ１８５３７及びＮＡ１８５６２のＳＭＡＤ７遺伝子座周辺のサブ配列を示す。プライマー／ブロッカーセットのデザインは、ＳＭＡＤ７一塩基多型（ＳＮＰ）のＡバリアントを特異的に増幅するためデザインされた。ブロッカーは、ＳＭＡＤ７ＳＮＰのＧ－バリアントを保有するバリアントテンプレートに対して完全に相補的にデザインされ、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼによる酵素による伸長を防止する３－炭素リンカー（Ｃ３）によって３’末端で官能化される。リバースプライマーは、フォワードプライマーの３’に結合し、いずれの対立遺伝子に対しても特異的ではない。プライマー（primar）及びブロッカーの様々なサブ配列を記載するために使用される専門用語の説明のため、オリゴヌクレオチドを以下の通り記載することができる。ブロッカーオリゴヌクレオチドは、配列の残りの部分のアライメントの外に示されるシトシンヌクレオチドの、５’及び３’に対する配列を含む標的中立性サブ配列を含み、この例において、シトシンヌクレオチドはブロッカーのブロッカー可変性サブ配列を表す。プライマーオリゴヌクレオチドの重複サブ配列は、ブロッカー可変性サブ配列（シトシン）の５’側におけるブロッカー配列に対して相同な配列を含む。

図５は、５６℃～６６℃の範囲のアニーリング／伸長温度における、ヒトＳＮＰｒｓ
３７８９８０６（Ｃ／Ｇ）Ｃ対立遺伝子を標的とするプライマーブロッカーペアの性能を示す。

図６Ａ及び図６Ｂは、予期しない相互作用を回避するためのより多くのデザインスペースを有するプライマーデザインを示す。

図７Ａ及び図７Ｂは、ΔＧ°_ｒｘｎ１のデザインを介して対立遺伝子特異的ＰＣＲの挙動を制御することを示す。ΔＧ°_ｒｘｎ１がより正であるようにプライマー及びブロッカーがデザインされる場合、ΔＣｑ値がより大きいことを図７Ａのシミュレーションは示唆する。しかし、ΔＧ°_ｒｘｎ１のより正の値では、標的の増幅も遅く、Ｃｑのより大きい値をもたらす。シミュレーションは、２ｋｃａｌ／ｍｏｌの固定されたΔΔＧ°を想定する。上段部分グラフは、ハイブリダイゼーション収率における異なる値のΔＧ°_ｒｘｎ１（星印）及びΔＧ°_ｒｘｎ２（ドット）の予測される効果を示す。下段部分グラフは、各プライマー及びブロッカーペアについての標的及びバリアントのシミュレートされた増幅曲線を示す。示された全てのケースで、ブロッカーとプライマーとの濃度比は２０：１である。図７Ｂ（Ｉ）及び図７Ｂ（II）は、増幅選択性に影響するΔＧ°_ｒｘｎ１の実験結果を示す。異なるΔＧ°_ｒｘｎ１値は、ブロッカーの３’末端の延長（ｌｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇ）又は短縮を介して達成された。予想通り、より正のΔＧ°_ｒｘｎ１であることにより、標的及びバリアントの両方についてより大きいＣｑがもたらされる。本発明者らは、標的についてより大きいΔＣｑ及び相対的に小さいＣｑ遅延（Ｃｑ＜２８）がもたらされる、至適な中間ΔＧ°_ｒｘｎ１を観測した。シミュレーションと違い、ΔＣｑはΔＧ°_ｒｘｎ１ととともに単調に増加しなかった。プライマー二量体の形成及び非特異的な増幅は、Ｃｑシーリングを生じる。

ＰＣＲプロセスの動力学的なシミュレーションは、以下のように表現される：
Ｔｆｎ＋１＝Ｔｆｎ＋Ｐｎ・［Ｐｎ／（Ｐｎ＋Ｂｎ）＋Ｙ（ΔＧ°_ｒｘｎ１）・Ｂｎ／（Ｐｎ＋Ｂｎ）］・Ｔｒｎ
Ｔｒｎ＋１＝Ｔｒｎ＋Ｒｎ・Ｔｆｎ
Ｖｆｎ＋１＝Ｖｆｎ＋Ｐｎ・［Ｐｎ／（Ｐｎ＋Ｂｎ）＋Ｙ（ΔＧ°_ｒｘｎ２）・Ｂｎ／（Ｐｎ＋Ｂｎ）］・Ｖｒｎ
Ｖｒｎ＋１＝Ｖｒｎ＋Ｒｎ・Ｖｆｎ
式中、Ｔｆｎはサイクルｎでの標的のフォワード鎖の標準化濃度であり、Ｔｒｎはサイクルｎでの標的のリバース鎖の標準化濃度であり、Ｖｆｎはサイクルｎでのバリアントのフォワード鎖の標準化濃度であり、Ｖｒｎはサイクルｎでのバリアントのフォワード鎖の標準化濃度であり、Ｐｎはサイクルｎでのフォワードプライマーの標準化濃度であり、Ｂｎはサイクルｎでのブロッカーの標準化濃度であり、Ｒｎはサイクルｎでのリバースプライマーの標準化濃度であり、及びＹ（ΔＧ°）は、所与のΔＧ°反応標準自由エネルギーでの、置き換え反応のハイブリダイゼーション収率である。シミュレーション結果は、図７Ａに示される。

図８は、非伸長性の化学的な官能化より３’末端に非相同性配列を有するブロッカーを示す。非相同性配列は標的又はバリアントのいずれの下流領域にも結合しないので、非相同性領域は酵素による伸長を効果的に防止する。標的Ｃｑ及びΔＣｑ値は、実施例１に示されるものに類似し、３’末端での、３－炭素スペーサー又はジデオキシヌクレオチド、非相同性配列などの同様の官能基が、それぞれ酵素による伸長を効果的に防止できることを示す、ここでｆＰ、ｒＰ、及びＢはフォワードプライマー、リバースプライマー、及びブロッカー（フォワードプライマーに対する）を表す。

標準ブロッキングＰＣＲにおいて、フォワードプライマーのみが標的配列の増幅に偏り；リバースプライマーはおよそ等しく標的及びバリアントの両方を増幅する。フォワード及びリバースプライマー両方が標的配列のみの増幅に偏る場合、増幅特異性は（変異感受性における、およそ二次性の改善で）さらに改善され得る。二重の標的特異的な増幅を達成するため、フォワード及びリバースプライマーは短い距離によって離されるようにデザインされて、それらはバリアント特異的ブロッカーと重複する。その制限において、プライマー結合領域は、種類が標的とバリアントの間で変異する単一ヌクレオチドによって離される。フォワード及びリバースのバリアント特異的ブロッカーは、それらが標的の相補鎖に対して結合し、両方が変異領域をスパンするので、互いに対して部分的に相補的である。操作条件で部分的に相補性であるが、大多数のブロッカー分子は互いにハイブリダイズしないように、ブロッカーはデザインされる。

図９Ａ及び図９ＢはヒトＢＲＡＦｒｓ３７８９８０６及びＩＬ２３Ｒｒｓ１８８４４４４ＳＮＰｓに対してデザインされたプライマー－ブロッカーシステムを各々示し、そ
れらは同じ反応中でマルチプレックスされた。ブロッカー結合領域の対応する下流を標的化するTaqMan（登録商標）プローブがデザインされ、読み取り機構として使用された。

図１０は、他のプライマー、ブロッカー、又はテンプレートに対するプライマー又はブロッカーの非特異的な結合が非特異的な増幅をもたらすことを示す。下段の区画は、プライマー及びブロッカーの非特異的な結合を抑制するプロテクターのデザインを提供する。プロテクターオリゴヌクレオチドは、プライマー及びブロッカー配列に対して部分的に相補的である。化学量論に過剰のプロテクターの存在は、部分的に二本鎖化したプライマー及びブロッカーの両方をもたらす。ブロッカーは配列が核酸配列における領域５に対して非相補的である新しい領域１１を有し、プロテクターは配列が領域１１に対して相補的である新しい領域１０を有する。

図１１Ａ及び図１１Ｂは、欠失及び挿入を検出するためデザインされたプライマー及びブロッカーを各々示す。プライマーは非標的特異的であり、この方法は不確かな数の塩基又は不確かな位置の欠失又は挿入を検出するためにも使用することができる。

図１２は、ＳＮＰ位置の３’にプライマーを、そして該プライマーの５’にブロッカーを配置することによる本発明の下位の実施を示す。この実施は、第１のサイクルにおいてハイブリダイゼーション特異性のみを生じ、ΔＣｑは好適なデザインよりも小さい。

図１３は、大過剰の相同性ヒトＤＮＡ中の３種の病原性真菌種の真菌１８ＳＤＮＡサ
ブ配列の選択的な増幅を実証する。真菌１８Ｓサブ配列及びその相同性ヒトサブ配列は複数の領域で異なっているので、本発明者らは増幅特異性を最大にするために、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方に対応するブロッカー種をデザインした。

図１４は、一方が各プライマーに対する２セットのバリアント対立遺伝子ブロッカーを用いることによる、フォワード及びリバースプライマー両方に関する標的特異的な増幅の使用を記載する。ブロッカーは互いに対して部分的に相補的であるが、操作条件においてそれらの多くは互いにハイブリダイズしない。ブロッカー及びプライマーは、フォワードプライマーがリバースブロッカーを伸長除去できないように及びリバースプライマーがフォワードブロッカーを伸長除去できないようにデザインされる。図１４は、予備的な実験結果を示す。

プライマー及びブロッカー組合せは、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、及びローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含むが、これに限定されない、核酸のための他の酵素増幅アッセイに適用され得る。

本発明は、大過剰のバリアントで少量の標的を検出するため特に適切である。本発明のがん診断適用のため、バリアントは野生型ＤＮＡ配列を指してもよく、標的はがんＤＮＡ配列を指してもよい。本発明の感染症診断適用のため、バリアントは病原体ＤＮＡ配列を指してもよく、標的は相同性ヒトＤＮＡ配列を指してもよい。
［実施例］

図４は、プローブ及びブロッカーデザイン並びに２つのヒトリポジトリ試料ＮＡ１８５３７及びＮＡ１８５６２のＳＭＡＤ７遺伝子座周辺のサブ配列についての本発明の実施例１を示す。ＳＭＡＤ７遺伝子座中の健常ヒト単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）ｒｓ４９３９８２７（Ｃ／Ｔ）を、概念実証検証のために選択した。標的としてＴ対立遺伝子を、バリアントとしてＣ対立遺伝子を任意に指定した。ヒトリポジトリゲノムＤＮＡ試料ＮＡ１８５６２（Ｃ対立遺伝子のホモ接合）及びＮＡ１８５３７（Ｔ対立遺伝子のホモ接合）をCoriell（登録商標）から購入し、対応するヌクレオチド配列を１０００Ｇｅｎｏｍｅｓウェブサイトから取得した。意図されない重合を防止するために、ブロッカーの３’末端をＣ３スペーサーで修飾した。ｑＰＣＲ実験結果により、０％標的（１００％バリアント）から０．１％標的（９９．９％バリアント）が区別される。０．１％標的試料を、０．１％ＮＡ１８５３７を９９．９％ＮＡ１８５６２と混合することによって調製した。１００％バリアントと１００％標的の間の定量サイクル（ΔＣｑ）の平均差は１４．８であり、１００％バリアント（グラフ中で「ＷＴ」として表示される）と０．１％標的の間の平均差は４．２であった。全ての実験を、Bio-Rad CFX96（商標）ｑＰＣＲ機器中の９６ウェルプレート中で行った。各ウェルにおいて、２００ｎＭプライマー、２μΜブロッカー、及び２０ｎｇヒトゲノムＤＮＡを、Bio-rad iTaq（商標）SYBR（登録商標）Green Supermix中で混合した。９５℃での３分の開始プロセス後、９５℃で１０秒の変性ステップ及び６０℃で３０秒間のアニーリング／伸長ステップを６５サイクル行った。図５～１２に示される実施例実験は、類似するプロトコールを使用した。

表１は、１０００Ｇｅｎｏｍｅｓデータベースから得られる、ヒトゲノムＤＮＡ試料ＮＡ１８５６２及びＮＡ１８５３７中の４セットのＳＮＰペアについての対立遺伝子特異的な増幅結果の例を示す。各ＳＮＰペアについて、各対立遺伝子バリアントについてのプライマー及びブロッカーデザインを、デザインし、検査した。「ブロッカー」列中に示される塩基種類は抑制された対立遺伝子（バリアント）を表し、「－」はブロッカーを添加していないことを意味する。全てのケースで、７．１～１４．６の範囲の２つの対立遺伝子の間の大きなΔＣｑ値が観測された。全ての実験を、Bio-rad iTaq（商標）SYBR（登録商標）Green Supermix中で４００ｎＭの各プライマー及び４μΜのブロッカーを用いてトリプリケートで行った。プライマー及びブロッカー配列又は実験条件のいかなる経験的な最適化なしで、熱力学的に決定されたデザインの性能は、結果によって示された。

図５は、５６℃～６６℃の範囲のアニーリング／伸長温度での、ヒトＳＮＰｒｓ３７
８９８０６（Ｃ／Ｇ）Ｃ対立遺伝子を標的とするプライマー－ブロッカーペアの性能についての本発明の実施例２を示す。実施例２は、５６℃～６４℃の良好な対立遺伝子特異的な増幅を示し、少なくとも８℃の温度ロバスト性を表す。４００ｎＭの各プライマー及び４μΜのブロッカーを使用し、アニーリング／伸長温度以外の他の実験条件は実施例１に
記載のものと同じであった。

図６Ａ及び図６Ｂは、本発明の実施例３を示す。本発明において示されるプライマーのデザインは、予期せぬ相互作用を回避するためのより多くのデザインスペースを提供した。ヒトＳＮＰｒｓ３７８９８０６Ｃ対立遺伝子を各々特異的に増幅する４セットのプライマー及びブロッカーペアの核酸配列は、ΔＣｑ＞１１を示す。４００ｎＭの各プライマー及び４μΜのブロッカーを使用し、他の実験条件は実施例１に記載のものと同じであった。

図７Ａ、図７Ｂ（Ｉ）及び図７Ｂ（II）は、ΔＧ°_ｒｘｎ１のデザインを介して対立遺伝子特異的ＰＣＲの挙動を制御することについての本発明の実施例４を示す。ΔＧ°_ｒｘｎ１がより正であるようにプライマー及びブロッカーがデザインされる場合、ΔＣｑ値がより大きいことを図７Ａのシミュレーションは示唆した。しかし、ΔＧ°_ｒｘｎ１のより正の値では、標的の増幅は遅く、Ｃｑのより大きい値をもたらした。シミュレーションは、２ｋｃａｌ／ｍｏｌの固定されたΔΔＧ°を想定した。上段部分グラフは、ハイブリダイゼーション収率における異なる値のΔＧ°_ｒｘｎ１（星印）及びΔＧ°_ｒｘｎ２（ドット）の効果を予測した。下段部分グラフは、各プライマー及びブロッカーペアについての標的及びバリアントのシミュレートされた増幅曲線を予測した。示された全てのケースで、ブロッカーとプライマーとの濃度比は２０：１であった。図７Ｂ（Ｉ）及び図７Ｂ（II）は、増幅選択性に影響するΔＧ°_ｒｘｎ１の実験結果を示す。異なるΔＧ°_ｒｘｎ１値は、ブロッカーの３’末端の延長又は短縮を介して達成された。予想通り、より正のΔＧ°_ｒｘｎ１であることにより、標的及びバリアントの両方についてより大きいＣｑがもたらされた。至適な中間ΔＧ°_ｒｘｎ１は、標的について最も大きいΔＣｑ及び相対的に小さいＣｑ遅延（Ｃｑ＜２８）がもたらされた。プライマー二量体の形成及び非特異的な増幅がＣｑシーリングによって生じたので、シミュレーションと違いΔＣｑはΔＧ°_ｒｘｎ１ととともに単調に増加しなかった。２００ｎＭの各プライマー及び２μΜのブロッカーを使用し、他の実験条件は実施例１に記載のものと同じであった。

図８は、非伸長性の化学的な官能化ではなく３’末端に非相同性配列を有するブロッカーについての本発明の実施例５を示す。非相同性配列は標的又はバリアントのいずれの下流領域にも結合しないので、非相同性領域は酵素による伸長を効果的に防止する。４００ｎＭの各プライマー及び４μΜのブロッカーを使用し、他の実験条件は実施例１に記載のものと同じであった。標的Ｃｑ及びΔＣｑ値は、図４に示されるものに類似し、３’末端での、３－炭素スペーサー又はジデオキシヌクレオチド、非相同性配列などの同様の官能基が、酵素による伸長を効果的に防止できることを表す。図８において、ｆＰ、ｒＰ、及びＢはそれぞれ、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びブロッカー（フォワードプライマーに対する）を表す。

図９Ａ及び図９Ｂは、本発明の実施例６を示す。本発明者らの非対立遺伝子特異的プライマー及び対立遺伝子特異的ブロッカーのリアルタイムＰＣＲの実施のために、リバースプライマーも必要とされ、これは対立遺伝子特異的ではなかった。SYBR（登録商標）Green Supermix及びTaqMan（登録商標）を実験に使用したところ、２つの間で著しく異なることはないとの結果であった。ヒトＢＲＡＦｒｓ３７８９８０６及びＩＬ２３Ｒｒｓ１８８４４４４ＳＮＰｓに対してデザインされたプライマー－ブロッカーシステムは、同じ反応中でマルチプレックスされた。ブロッカー結合領域の対応する下流を標的とするTaqMan（登録商標）プローブが、デザインされ、読み取り機構として使用された。ＢＲＡＦｒｓ３７８９８０６アンプリコンに関するTaqMan（登録商標）プローブをＦＡＭフルオロフォア、Iowa Black FQ失活剤、及び内部ＺＥＮ失活剤で修飾し、ＩＬ２３Ｒｒｓ１８８４４４４アンプリコンに関するTaqMan（登録商標）プローブをＣｙ５フルオロフォア及びIowa Black RQ失活剤で修飾した。図９Ａは、ＢＲＡＦｒｓ３７８９８０６Ｇ対立遺伝子及びＩＬ２３Ｒｒｓ１８８４４４４Ｔ対立遺伝子のマルチプレックス検出の増幅結果を示す。塩基種類は、ブロッカーが抑制していた対立遺伝子（バリアント）を表示した。図９Ｂは、ＢＲＡＦｒｓ３７８９８０６Ｃ対立遺伝子及びＩＬ２３Ｒｒｓ１８８４４４４Ｇ対立遺伝子のマルチプレックス検出を示す。各実験中、ゲノムＤＮＡ試料を、４００ｎＭの各プライマー、４μΜの各ブロッカー、及び２００ｎＭの各TaqMan（登録商標）プローブとBio-rad iQ Supermix中で混合した。ｑＰＣＲプロトコールは、実施例１に示したものと同じであった。

図１０は、他のプライマー、ブロッカー、又はテンプレートに対するプライマー又はブロッカーの非特異的な結合についての本発明の実施例７を示す。実施例７は、非特異的な増幅をもたらした。下段の区画は、プライマー及びブロッカーの非特異的な結合を抑制するプロテクターのデザインを提供した。ブロッカーは配列が核酸配列における領域５に対して非相補的である新しい領域１１を有し、プロテクターは配列が領域１１に対して相補的である新しい領域１０を有していた。

図１１Ａ及び図１１Ｂは、欠失及び挿入を検出するためデザインされたプライマー及びブロッカーについての本発明の実施例８を示す。Ｄｅｌｒｓ２００８４１３３０を、概
念実証結果を示すために使用した。４００ｎＭの各プライマー及び４μΜのブロッカーを使用し、他の実験条件は実施例１に示したものと同じであった。プライマーは非対立遺伝子特異的であるので、この方法は不確かな数の塩基又は不確かな位置の欠失又は挿入を検出するためにも使用することができる。

図１２は、ＳＮＰ位置の３’にプライマーを、そして該プライマーの５’にブロッカーを配置することによる本発明の実施例９を示す。実施例９は、第１のサイクルにおいてのみハイブリダイゼーション特異性を生じ、ΔＣｑは好適なデザインよりも小さかった。プライマー濃度は４００ｎＭであり、ブロッカー濃度は４μΜであった。実験条件は、実施例１に示したものと同じであった。

図１３は、大過剰の相同性ヒトＤＮＡ中の３種の病原性真菌種の真菌１８ＳＤＮＡサ
ブ配列の選択的な増幅についての本発明の実施例１０を示す。真菌１８Ｓサブ配列及びその相同性ヒトサブ配列は複数の領域で異なっているので、増幅特異性を最大にするために、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方に対応するブロッカー種をデザインした。３種の真菌種及びヒトにおけるコンセンサス配列からの１８Ｓサブ配列のｇＢｌｏｃｋ断片（配列検証された４００ｂｐの二本鎖化したＤＮＡ、ＩＤＴ）を、実験に使用した。各真菌のＤＮＡｇＢｌｏｃｋ断片の６０，０００コピー（０．１％）、６０コピー（０．０００１％）及び０コピー（１００％ヒト）を、６０，０００，０００コピーのヒトＤＮＡと別々に混合した。全てのケースで、百万分の１以下の微量の配列を検出するとの結果であった。２００ｎＭの各プライマー及び１μΜの各ブロッカーを使用し、他の実験条件は実施例１に示したものと同じであった。

図１４は、本発明の実施例１１を示す。図１４は、一方が各プライマーに対する２セッ
トのバリアント対立遺伝子ブロッカーを使用した；フォワード及びリバースプライマー両方に関する対立遺伝子特異的な増幅の使用を記載する。ブロッカーは互いに対して部分的に相補的であるが、操作条件は多くの互いのハイブリダイゼーションをサポートしなかった。ブロッカー及びプライマーは、フォワードプライマーがリバースブロッカーを伸長除去できないように及びリバースプライマーがフォワードブロッカーを伸長除去できないようにデザインされた。図１４は、予備的な実験結果を提示した。

本開示の特定の実施形態の前出の記載は、例証及び説明の目的で提示されている。例示的な実施形態が本発明の原理及びその実際上の適用の最良の説明をするため、選択され、記載され、それによって他の当業者の本発明の最良の利用を可能にし、様々な修飾を伴う様々な実施形態は意図される特定の用途に適している。

Claims

以下のステップ（ａ）～（ｆ）を順次含む、標的配列の増幅のための方法。
（ａ）バリアント配列を含む１又は２コピー以上の第１の核酸を含み、かつ、前記標的配列を含む少なくとも１コピーの第２の核酸を含有し得る、提供された試料を得るステップであって、
前記標的配列及びバリアント配列はそれぞれ、ＤＮＡオリゴヌクレオチドに相同性を提供する相同性サブ配列及び可変性サブ配列を含み、
前記可変性サブ配列は少なくとも１つのヌクレオチドを含み、
前記標的配列の前記可変性サブ配列は標的特異的サブ配列であり、前記バリアント配列の前記可変性サブ配列は非標的特異的サブ配列である、ステップ；
（ｂ）ＤＮＡブロッカーオリゴヌクレオチドをデザインするステップであって、
前記ＤＮＡブロッカーオリゴヌクレオチドは、標的中立性サブ配列及びブロッカー可変性サブ配列を含む第１の配列を含み、
前記標的中立性サブ配列は、ステップ（ａ）の前記相同性サブ配列の第１の部分に対して相補的であり、前記ブロッカー可変性サブ配列は、ステップ（ａ）の前記非標的特異的サブ配列に対して相補的であり、
前記ブロッカー可変性サブ配列の３’及び５’末端の両方は、前記標的中立性サブ配列と隣接し、かつ連続し、
前記ＤＮＡブロッカーオリゴヌクレオチドは、前記ＤＮＡブロッカーオリゴヌクレオチドの３’末端に、前記非標的特異的サブ配列に対して相補的でない非相補的配列領域を含み、かつ前記非相補的配列領域は、増幅プロセス間にＤＮＡポリメラーゼの酵素によるＤＮＡの伸長を防止する、ステップ；
（ｃ）第１のＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドをデザインするステップであって、前記第１のＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドは、第２の配列を含み、
前記第２の配列は、ステップ（ａ）の前記相同性サブ配列の第２の部分に対して相補的であり、
前記第２の配列は、前記第２の配列が重複サブ配列及び非重複サブ配列を含むように、ステップ（ｂ）の前記ブロッカーオリゴヌクレオチドの前記標的中立性サブ配列と少なくとも５ヌクレオチド重複し、前記第２の配列は、ステップ（ｂ）の前記ブロッカー可変性サブ配列に対して相補的ないかなる配列も含まず、
前記第１のＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの前記第２の配列は、前記標的配列にハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー（ΔＧ°_ＰＴ）を生じさせるようデザインされ、前記ＤＮＡブロッカーオリゴヌクレオチドの前記第１の配列は、前記標的配列にハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー（ΔＧ°_ＢＴ）を生じさせるようデザインされ、以下の条件：
＋２ｋｃａｌ／ｍｏｌ≧ΔＧ°_ＰＴ－ΔＧ°_ＢＴ≧－８ｋｃａｌ／ｍｏｌを満たし、
前記非重複サブ配列は、前記標的配列にハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー（ΔＧ°_３）を生じさせるようデザインされ、以下の条件：
－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ≧ΔＧ°_３≧－１２ｋｃａｌ／ｍｏｌを満たす、ステップ；
（ｄ）前記ＤＮＡブロッカーオリゴヌクレオチド及び前記第１のＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドを、ステップ（ｂ）及び（ｃ）でデザインされたように提供するステップ；
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記ＤＮＡブロッカーオリゴヌクレオチド及び前記第１のＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドを、ステップ（ａ）の前記試料に導入するステップであって、前記第１のＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼの酵素によるＤＮＡの伸長を誘導する、ステップ；並びに
（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、及びＤＮＡポリメラーゼに基づく核酸増幅に必要な１又は２以上の試薬をステップ（ａ）の前記試料に導入し、核酸増幅を達成するステップ；
ＤＮＡポリメラーゼが耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであり、ステップ（ｆ）の核酸増幅が、試料を少なくとも１０増幅サイクルにかけるステップを含み、各増幅サイクルが、少なくとも２つの異なる温度曝露を含み、第１の温度曝露が少なくとも８５℃であり、第２の温度曝露が７５℃以下である、請求項１に記載の方法。
ステップ（ｄ）の後に、ステップ（ａ）の試料にニッキング酵素、リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、ＲＮＡｓｅ、及び逆転写酵素からなる群から選択される酵素を導入するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
ステップ（ｃ）の重複サブ配列が、標的中立性サブ配列の５’末端の部分を含み、前記部分が、５ヌクレオチド～４０ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
ステップ（ｅ）の試料に導入されるＤＮＡブロッカーオリゴヌクレオチドのモル濃度が、前記試料に導入される第１のＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドのモル濃度より２～１０，０００倍高い、請求項１に記載の方法。