JP7148770B2

JP7148770B2 - Inverted microscope, operating tool illumination device, and illumination method for operating tool

Info

Publication number: JP7148770B2
Application number: JP2018142887A
Authority: JP
Inventors: 昭登森; 明日美杠; 正俊片岡; 和昭梶本; 宗明橋本
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Aoi Electronics Co Ltd
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Aoi Electronics Co Ltd
Priority date: 2018-07-30
Filing date: 2018-07-30
Publication date: 2022-10-06
Anticipated expiration: 2038-07-30
Also published as: JP2020020896A

Description

本発明は、操作ツール照明装置、ナノピンセットシステムおよび操作ツールの照明方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a manipulation tool illumination device, a nanotweezers system and a manipulation tool illumination method.

細胞等の観察試料をナノピンセットやピペット等の操作ツールで操作しながら観察する場合、一般には特許文献１に記載のような倒立顕微鏡が用いられる。このような倒立顕微鏡において落射照明系を用いることで、操作ツールによる観察試料の操作が行いやすい。 When observing an observation sample such as a cell while manipulating it with a manipulation tool such as nanotweezers or a pipette, an inverted microscope as described in Patent Document 1 is generally used. By using the epi-illumination system in such an inverted microscope, it is easy to operate the observation sample with the operation tool.

特開２０１７－４９３２５号公報JP 2017-49325 A

しかしながら、蛍光色素により染色された細胞等を蛍光観察する場合には操作ツールが観察し難くいため、操作ツールの取り扱いが非常に難しい。 However, in the case of performing fluorescence observation of cells stained with a fluorescent dye, it is difficult to observe the operation tool, and handling of the operation tool is extremely difficult.

本発明の第１の態様による操作ツール照明装置は、透明基板上の観察試料中の操作対象を操作ツールで操作しつつ観察を行う倒立顕微鏡に用いられる操作ツール照明装置であって、前記透明基板を介して前記操作ツールを照明する照明光を出射する照明部と、前記透明基板に入射する前記照明光の光軸の、前記倒立顕微鏡の対物レンズの光軸に対する角度を調整する角度調整部とを備える。
本発明の第２の態様によるナノピンセットシステムは、開閉可能な一対のアームを前記操作ツールとして備えるナノピンセットと、前記操作対象を操作する前記一対のアームを前記透明基板を介して照明する前記操作ツール照明装置と、を備える。
本発明の第３の態様による操作ツールの照明方法は、倒立顕微鏡のステージ上に載置された透明基板に対して、入射した照明光の一部が前記透明基板の界面に対する全反射条件を満たすように前記照明光を入射させ、前記透明基板に入射した前記照明光を前記界面での全反射により前記透明基板上の観察試料に導き、前記観察試料の操作対象を操作する操作ツールを照明する。 A manipulation tool lighting device according to a first aspect of the present invention is a manipulation tool lighting device used in an inverted microscope in which an manipulation object in an observation sample on a transparent substrate is observed while being manipulated with a manipulation tool, the manipulation tool lighting device comprising the transparent substrate. an illumination unit that emits illumination light for illuminating the operation tool via an angle adjustment unit that adjusts the angle of the optical axis of the illumination light incident on the transparent substrate with respect to the optical axis of the objective lens of the inverted microscope; Prepare.
A nanotweezers system according to a second aspect of the present invention includes nanotweezers comprising a pair of openable and closable arms as the operation tool, and the operation of illuminating the pair of arms for operating the operation target through the transparent substrate. and a tool lighting device.
A method for illuminating an operation tool according to a third aspect of the present invention is a transparent substrate placed on a stage of an inverted microscope. and guides the illumination light incident on the transparent substrate to the observation sample on the transparent substrate by total reflection at the interface to illuminate an operation tool for operating the operation target of the observation sample. .

本発明によれば、観察試料を操作している操作ツールを容易に観察することができる。 According to the present invention, it is possible to easily observe the manipulation tool that is manipulating the observation sample.

図１は、ナノピンセットシステムが取り付けられた顕微鏡装置の側面図である。FIG. 1 is a side view of a microscope apparatus with a nanotweezers system attached. 図２は、ナノピンセットシステムを接眼レンズ方向から見た図である。FIG. 2 is a view of the nanotweezer system viewed from the direction of the eyepiece. 図３は、ナノピンセットの平面図である。FIG. 3 is a plan view of the nanotweezers. 図４は、ホルダに取り付けられたナノピンセットを示す図である。FIG. 4 shows the nanotweezers attached to the holder. 図５は、サイド照明による照明方法を説明する図である。FIG. 5 is a diagram for explaining a lighting method using side lighting. 図６は、観察画像の一例を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing an example of an observation image. 図７は、ナノピンセットシステムの概略構成を示すブロック図である。FIG. 7 is a block diagram showing a schematic configuration of the nanotweezer system. 図８は、ナノピンセットシステムを用いた細胞の捕集動作手順の一例を示すフローチャートである。FIG. 8 is a flow chart showing an example of a procedure for collecting cells using the nanotweezers system. 図９は、ナノピンセットの移動動作を説明する図である。FIG. 9 is a diagram for explaining the moving operation of the nanotweezers. 図１０は、複数の凹部が形成された透明基板の場合のナノピンセットとサイド照明との位置関係を示す図である。FIG. 10 is a diagram showing the positional relationship between the nanotweezers and the side illumination in the case of a transparent substrate having a plurality of recesses formed therein. 図１１は、操作ツール照明装置の詳細を示す図である。FIG. 11 is a diagram showing details of the operation tool illumination device. 図１２は、観察試料が保持されたスライドガラスの一例を示す図である。FIG. 12 is a diagram showing an example of a slide glass holding an observation sample. 図１３は、スライドガラスを用いた場合のナノピンセットによる操作を説明する図である。13A and 13B are diagrams for explaining the operation using nanotweezers when using a slide glass.

以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。図１はナノピンセットシステム１の一実施の形態を示す図であり、ナノピンセットシステム１が取り付けられた顕微鏡装置２の側面図である。また、図２は、ナノピンセットシステム１を接眼レンズ２３の方向から見た図である。 Embodiments for carrying out the present invention will be described below with reference to the drawings. FIG. 1 shows an embodiment of a nanotweezers system 1, and is a side view of a microscope apparatus 2 to which the nanotweezers system 1 is attached. 2 is a diagram of the nanotweezer system 1 viewed from the direction of the eyepiece 23. FIG.

顕微鏡装置２は倒立型顕微鏡であり、筐体２０には対物レンズ２１が装着されたレボルバ２２、接眼レンズ２３、落射照明用光源２４、蛍光投光管２５、ｘｙステージ２６および撮像装置２７等を備えている。対物レンズ２１を通った観察光は、不図示のリレー光学系により接眼レンズ２３および撮像装置２７に導かれる。ｘｙステージ２６上には観察試料を有するスライドガラス等の透明基板２８が載置される。撮像装置２７の撮像データは、不図示の出力端子から外部へ出力される。例えば、撮像データは顕微鏡用ソフトウェアがインストールされたＰＣ（パーソナルコンピュータ）に入力され、観察画像がＰＣの表示装置に表示される。 The microscope apparatus 2 is an inverted microscope, and a housing 20 houses a revolver 22 with an objective lens 21 attached, an eyepiece lens 23, an epi-illumination light source 24, a fluorescent floodlight tube 25, an xy stage 26, an imaging device 27, and the like. I have. Observation light that has passed through the objective lens 21 is guided to an eyepiece lens 23 and an imaging device 27 by a relay optical system (not shown). A transparent substrate 28 such as a slide glass having an observation sample is placed on the xy stage 26 . The imaging data of the imaging device 27 is output to the outside from an output terminal (not shown). For example, imaging data is input to a PC (personal computer) in which microscope software is installed, and an observed image is displayed on a display device of the PC.

図１において、ナノピンセットシステム１は、顕微鏡装置２の筐体２０に固定される支柱３０と、支柱３０の上部に設けられたｘｙ方向移動部３１と、ｘｙ方向移動部３１に取り付けられた支持アーム３２と、支持アーム３２に取り付けられたｚ方向移動部３３と、ｚ方向移動部３３に保持されるホルダ３５に設けられたナノピンセット１０と、操作ツール照明装置３４とを備えている。
In FIG. 1, the nanotweezers system 1 includes a support 30 fixed to a housing 20 of a microscope apparatus 2, an xy-direction moving unit 31 provided on the top of the support 30, and a support attached to the xy-direction moving unit 31. It comprises an arm 32 , a z-direction moving part 33 attached to the support arm 32 , a nanotweezers 10 provided on a holder 35 held by the z-direction moving part 33 , and an operation tool illumination device 34 .

図１，２では、操作ツール照明装置３４として、操作ツール照明装置３４に含まれる複数の要素の内の位置調整部３４１と、位置調整部３４１に取り付けられたサイド照明３４０と、操作ツール照明装置３４をｘｙ方向移動部３１に固定する支持アーム３４２、を示したが、操作ツール照明装置３４の詳細な構成は後述する。 1 and 2, the operation tool illumination device 34 includes a position adjustment portion 341 among a plurality of elements included in the operation tool illumination device 34, a side illumination 340 attached to the position adjustment portion 341, and an operation tool illumination device. Although a support arm 342 for fixing 34 to the xy-direction mover 31 is shown, the detailed configuration of the manipulation tool illuminator 34 will be described later.

ナノピンセット１０は、ｘｙ方向移動部３１により図示ｘ方向およびｙ方向に移動され、ｚ方向移動部３３により図示ｚ方向に移動される。また、支持アーム３４２に取り付けられたサイド照明３４０も、ｘｙ方向移動部３１によりナノピンセット１０と一体でｘ方向およびｙ方向に移動される。詳細は後述するが、支持アーム３４２に対する位置調整部３４１の固定位置をｚ方向に上下に調整することにより、透明基板２８に対するサイド照明３４０のｚ方向位置を調整することができる。このように、本実施の形態では対物レンズ２１の光軸に直交する方向に、ナノピンセット１０および操作ツール照明装置３４を一体で移動させるｘｙ方向移動部３１を備えたので、ナノピンセット１０とサイド照明３４０とのｘｙ方向の相対位置は一定に保たれる。 The nanotweezers 10 are moved in the x- and y-directions by the xy-direction moving part 31 and in the z-direction by the z-direction moving part 33 . In addition, the side illumination 340 attached to the support arm 342 is also moved in the x and y directions together with the nanotweezers 10 by the xy direction moving part 31 . Although details will be described later, the position of the side illumination 340 in the z direction relative to the transparent substrate 28 can be adjusted by vertically adjusting the fixed position of the position adjusting portion 341 relative to the support arm 342 in the z direction. As described above, in this embodiment, since the xy-direction moving unit 31 for integrally moving the nanotweezers 10 and the manipulation tool illumination device 34 is provided in the direction perpendicular to the optical axis of the objective lens 21, the nanotweezers 10 and the side The position in the xy direction relative to the illumination 340 is kept constant.

なお、本実施の形態では、サイド照明３４０を支持する支持アーム３４２をｘｙ方向移動部３１に固定することで、サイド照明３４０をナノピンセット１０と一体でｘ方向およびｙ方向に移動させるようにしたが、支持アーム３４２をｚ方向移動部３３に取り付けるようにしても良い。その場合、サイド照明３４０のｚ方向位置はナノピンセット１０の先端位置とほぼ一致する位置に設定され、ｚ方向移動部３３を駆動してナノピンセット１０をｚ方向に移動すると、サイド照明３４０もナノピンセット１０と一体にｚ方向に移動する。すなわち、ナノピンセット１０とサイド照明３４０との相対位置は一定に保たれる。 In the present embodiment, the support arm 342 that supports the side lighting 340 is fixed to the xy-direction moving part 31 so that the side lighting 340 is moved in the x direction and the y direction integrally with the nanotweezers 10. However, the support arm 342 may be attached to the z-direction moving portion 33 . In that case, the z-direction position of the side illumination 340 is set to a position that substantially coincides with the tip position of the nanotweezers 10, and when the z-direction moving unit 33 is driven to move the nanotweezers 10 in the z-direction, the side illumination 340 is also nanotweezers. It moves together with the tweezers 10 in the z direction. That is, the relative positions of the nanotweezers 10 and the side illumination 340 are kept constant.

図３は、ナノピンセット１０の平面図である。ナノピンセット１０は、例えば、ＳＯＩ(Silicon on Insulator)ウエハから一体で作製される（例えば、特開２００７－６９３２２号公報参照）。ＳＯＩウエハは、２枚のＳｉ単結晶板の一方にＳｉＯ_２層を形成し、ＳｉＯ_２層を介して貼り合わせたものである。ナノピンセット１０は、一対のアーム１３ａ，１３ｂ、一対の静電アクチュエータ１４ａ，１４ｂ、一対の支持部１７ａ，１７ｂ、一対の連結部１８ａ，１８ｂ、一対のアーム支持部１９ａ，１９ｂ、および台座１１を備えている。静電アクチュエータ１４ａには、固定電極１５ａおよび可動電極１６ａが設けられ、静電アクチュエータ１４ｂには固定電極１５ｂおよび可動電極１６ｂが設けられている。台座１１は、前述したホルダ３５に接合される。 FIG. 3 is a plan view of the nanotweezers 10. FIG. The nanotweezers 10 are, for example, integrally produced from an SOI (Silicon on Insulator) wafer (see, for example, Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2007-69322). An SOI wafer is obtained by forming a SiO ₂ layer on one of two Si single crystal plates and bonding them together via the SiO ₂ layer. The nanotweezers 10 include a pair of arms 13a and 13b, a pair of electrostatic actuators 14a and 14b, a pair of support portions 17a and 17b, a pair of connecting portions 18a and 18b, a pair of arm support portions 19a and 19b, and a base 11. I have. The electrostatic actuator 14a is provided with a fixed electrode 15a and a movable electrode 16a, and the electrostatic actuator 14b is provided with a fixed electrode 15b and a movable electrode 16b. The pedestal 11 is joined to the holder 35 described above.

左右対称形状となっているアーム１３ａに関する静電アクチュエータ１４ａとアーム１３ｂに関する静電アクチュエータ１４ｂとは、同一構造を有している。固定電極１５ａおよび可動電極１６ａは、いずれも櫛歯形状を有しており、互いの櫛歯同士が隙間を介して噛み合うような状態で対向配置されている。固定電極１５ａは台座１１上に形成されている。一方、可動電極１６ａは、細いビーム状の支持部１７ａによって台座１１に弾性的に固定されている。固定電極１５ｂおよび可動電極１６ｂも同様の構造となっている。 The electrostatic actuator 14a for the symmetrical arm 13a and the electrostatic actuator 14b for the arm 13b have the same structure. The fixed electrode 15a and the movable electrode 16a both have a comb-teeth shape, and are opposed to each other in such a manner that the comb-teeth are engaged with each other with a gap therebetween. The fixed electrode 15 a is formed on the base 11 . On the other hand, the movable electrode 16a is elastically fixed to the pedestal 11 by a thin beam-shaped support portion 17a. The fixed electrode 15b and the movable electrode 16b also have the same structure.

アーム１３ａ，１３ｂは、それぞれ細いビーム状のアーム支持部１９ａ，１９ｂを介して台座１１に弾性的に固定されている。アーム１３ａと可動電極１６ａとは連結部１８ａによって連結され、アーム１３ｂと可動電極１６ｂとは連結部１８ｂによって連結されている。 The arms 13a and 13b are elastically fixed to the pedestal 11 via thin beam-like arm support portions 19a and 19b, respectively. The arm 13a and the movable electrode 16a are connected by a connecting portion 18a, and the arm 13b and the movable electrode 16b are connected by a connecting portion 18b.

左側のアーム１３ａには端子１２ｃが接続され、固定電極１５ａには端子１２ａが接続され、可動電極１６ａには端子１２ｂが接続されている。一方、右側のアーム１３ｂには端子１２ｄが接続され、可動電極１６ｂには端子１２ｅが接続され、固定電極１５ｂには端子１２ｆが接続されている。端子１２ａ，１２ｂ，１２ｅ，１２ｆ，１２ｇは電圧を印加するための端子である。端子１２ｃ，１２ｄは、アーム１３ａ，１３ｂ間に作用する電気量などを検出するために設けられている。そのため、アーム１３ａ，１３ｂは、それぞれ可動電極１６ａ，１６ｂとは絶縁されている。また、端子１２ｇは、台座１１が浮遊電極となるのを防止するためのアース端子である。 A terminal 12c is connected to the left arm 13a, a terminal 12a is connected to the fixed electrode 15a, and a terminal 12b is connected to the movable electrode 16a. On the other hand, a terminal 12d is connected to the right arm 13b, a terminal 12e is connected to the movable electrode 16b, and a terminal 12f is connected to the fixed electrode 15b. Terminals 12a, 12b, 12e, 12f, and 12g are terminals for applying voltage. The terminals 12c and 12d are provided for detecting the amount of electricity acting between the arms 13a and 13b. Therefore, the arms 13a and 13b are insulated from the movable electrodes 16a and 16b, respectively. A terminal 12g is a ground terminal for preventing the pedestal 11 from becoming a floating electrode.

図３の固定電極１５ａと可動電極１６ａとの間に電圧を印加すると、可動電極１６ａが固定電極１５ａに近づく方向（図示右方向）に動くことにより、アーム１３ａがアーム１３ｂに近づく方向（図示右方向）に駆動される。電圧印加を解除すると、アーム１３ａは元の位置へ復帰する。右側のアーム１３ｂについては動作が反転するだけであり、同様に、可動電極１６ｂが固定電極１５ｂに近づく方向（図示左方向）に動くことにより、アーム１３ｂがアーム１３ａに近づく方向（図示左方向）に駆動される。その結果、アーム１３ａとアーム１３ｂとの間に微小物体を把持したり、微小物体の把持を解除したりすることができる。 When a voltage is applied between the fixed electrode 15a and the movable electrode 16a in FIG. 3, the movable electrode 16a moves toward the fixed electrode 15a (to the right in the drawing), causing the arm 13a to approach the arm 13b (to the right in the drawing). direction). When the voltage application is released, the arm 13a returns to its original position. The movement of the right arm 13b is only reversed. Similarly, the movable electrode 16b moves toward the fixed electrode 15b (leftward in the drawing), causing the arm 13b to approach the arm 13a (leftward in the drawing). driven by As a result, it is possible to grip a minute object between the arms 13a and 13b and release the minute object from the grip.

図４はホルダ３５に取り付けられたナノピンセット１０を示す図であり、（ａ）は正面図、（ｂ）は側面図である。ナノピンセット１０は、セラミックスなどの絶縁部材を平板状に形成したホルダ３５に接合され、ホルダ３５と一体化されている。各端子１２ａ～１２ｇは、Ａｕワイヤにより対応する配線パターン３６ａ～３６ｇに接続されている。配線パターン３６ｇはアースされている。配線パターン３６ａ～３６ｆは、過電圧印加防止用のチップ抵抗Ｒを介して配線パターン３６ｇに接続されている。チップ抵抗Ｒは、外界の電磁波による交番電界によって導線に生じる起電力が静電アクチュエータ１４ａ，１４ｂ等に印加されるのを防止する目的で設けられたものである。 FIG. 4 shows the nanotweezers 10 attached to the holder 35, where (a) is a front view and (b) is a side view. The nanotweezers 10 are joined to and integrated with a holder 35 formed by forming an insulating member such as ceramics into a flat plate. Each terminal 12a-12g is connected to a corresponding wiring pattern 36a-36g by an Au wire. The wiring pattern 36g is grounded. The wiring patterns 36a to 36f are connected to a wiring pattern 36g through chip resistors R for preventing overvoltage application. The chip resistor R is provided for the purpose of preventing the electromotive force generated in the conductor wire from being applied to the electrostatic actuators 14a, 14b and the like by an alternating electric field caused by external electromagnetic waves.

電源回路の配線長さや周囲の環境によっては、上述の交番電界による周期的に変化する起電力がアーム１３ａ，１３ｂの開閉に必要な電圧を大きく越えてしまう可能性がある。そのような過大な起電力が静電アクチュエータ１４ａ，１４ｂ等に印加されると、アーム１３ａ，１３ｂの先端が過度に振動し、互いに接触して破損をもたらしたり、ナノピンセット１０の内部で絶縁破壊を引き起こしたりするおそれがある。上記チップ抵抗Ｒは、このような過電圧が印加されるのを防止するため設けられている。 Depending on the wiring length of the power supply circuit and the surrounding environment, the periodically changing electromotive force due to the alternating electric field may greatly exceed the voltage required for opening and closing the arms 13a and 13b. If such an excessive electromotive force is applied to the electrostatic actuators 14a, 14b, etc., the tips of the arms 13a, 13b will vibrate excessively and come into contact with each other, causing damage or dielectric breakdown inside the nanotweezers 10. may cause The chip resistor R is provided to prevent such overvoltage from being applied.

配線パターン３６ａ，３６ｂ，３６ｅ，３６ｆはケーブル３９により不図示のＤＣ電源に接続されている。ケーブル３９と配線パターン３６ａ，３６ｂ，３６ｅ，３６ｆとの接続部分およびＡｕワイヤ３７による接続部分には、配線外れ防止の補強のために樹脂３８ａ，３８ｂが塗布される。なお、チップ抵抗Ｒの代わりにダイオードを用いても良く、同様に過電圧が印加されるのを防止することができる。 The wiring patterns 36a, 36b, 36e, and 36f are connected by cables 39 to a DC power supply (not shown). Resins 38a and 38b are applied to the connection portions between the cables 39 and the wiring patterns 36a, 36b, 36e, and 36f and the connection portions by the Au wires 37 to reinforce the wire disconnection prevention. It should be noted that a diode may be used instead of the chip resistor R, and it is possible to similarly prevent overvoltage from being applied.

図５は、サイド照明３４０による照明方法を説明する図である。ｘｙステージ２６上に載置された透明基板２８には、観察試料２８１を収容する凹部２８０が形成されている。凹部２８０の平面視形状（ｚ軸負方向から見た形状）は直径１ｍｍ程度の円形であるが、凹部２８０の形状は必ずしも図５に示す形状に限定されない。なお、凹部２８０は、透明基板２８に複数形成されていても良い。図５に示す例では、凹部２８０には複数の細胞２８１ａ，２８１ｂを含んだ緩衝液と呼ばれる液体２８１ｃが観察試料２８１として収容されている。細胞２８１ａは異常細胞であって蛍光物質によって染色されている。細胞２８１ｂは正常細胞である。 FIG. 5 is a diagram illustrating a lighting method using the side lighting 340. FIG. A recess 280 for accommodating an observation sample 281 is formed in the transparent substrate 28 placed on the xy stage 26 . The shape of the recess 280 in plan view (the shape viewed from the negative direction of the z-axis) is circular with a diameter of about 1 mm, but the shape of the recess 280 is not necessarily limited to the shape shown in FIG. A plurality of recesses 280 may be formed in the transparent substrate 28 . In the example shown in FIG. 5, the concave portion 280 contains a liquid 281c called a buffer containing a plurality of cells 281a and 281b as an observation sample 281. In the example shown in FIG. Cell 281a is an abnormal cell and is stained with a fluorescent substance. Cell 281b is a normal cell.

本実施の形態の顕微鏡装置２は観察試料２８１を蛍光観察する場合の構成を示している。落射照明用光源２４の照明光を励起フィルタ２００に通すと、励起フィルタ２００から励起光Ｌ１が出射される。励起光Ｌ１はダイクロイックミラー２０１により反射され、対物レンズ２１に入射して観察試料２８１に照射される。蛍光物質によって染色されている細胞２８１ａからは蛍光Ｌ２が放射され、蛍光Ｌ２は対物レンズ２１を通ってダイクロイックミラー２０１に入射する。蛍光Ｌ２はダイクロイックミラー２０１を透過し、吸収フィルタ２０２を通って接眼レンズ２３や撮像装置２７へと向かう。対物レンズ２１からの観察光には励起光Ｌ１の反射光や散乱光も含まれているので、それらを吸収フィルタ２０２で除去する。 The microscope apparatus 2 of the present embodiment has a configuration for performing fluorescence observation of an observation sample 281 . When the illumination light from the epi-illumination light source 24 is passed through the excitation filter 200, the excitation filter 200 emits excitation light L1. The excitation light L<b>1 is reflected by the dichroic mirror 201 , enters the objective lens 21 , and irradiates the observation sample 281 . Fluorescence L 2 is emitted from the cells 281 a dyed with the fluorescent substance, and the fluorescence L 2 passes through the objective lens 21 and enters the dichroic mirror 201 . The fluorescence L2 passes through the dichroic mirror 201, passes through the absorption filter 202, and travels toward the eyepiece 23 and the imaging device 27. FIG. Since the observation light from the objective lens 21 includes reflected light and scattered light of the excitation light L1, the absorption filter 202 removes them.

このようにして観察された細胞２８１ａは、ナノピンセット１０のアーム１３ａ，１３ｂでピックアップして採取され、さらに詳細な検査が行われる。そのためには、細胞２８１ａと共にアーム１３ａ，１３ｂも観察できなければならない。本実施の形態におけるナノピンセットシステム１は、アーム１３ａ，１３ｂを照明するためのサイド照明３４０を備えている。サイド照明３４０には、ＬＥＤ光源やハロゲン光源等の白色光源を用いるのが好ましい。 The cells 281a observed in this way are picked up by the arms 13a and 13b of the nanotweezers 10, and further examined in detail. For that purpose, the arms 13a and 13b must be observable together with the cell 281a. The nanotweezer system 1 according to this embodiment includes a side illumination 340 for illuminating the arms 13a and 13b. A white light source such as an LED light source or a halogen light source is preferably used for the side lighting 340 .

図５に示すように、サイド照明３４０の照明光Ｌ３は、対物レンズ２１の光軸の軸外から対物レンズ２１の光軸方向へと照射される、サイド照明３４０の光軸は透明基板２８の側面２８４の法線ｎに対して角度θ１［deg］に設定されている。凹部２８０が形成された透明基板２８は矩形の板材であって、側面２８４は表面２８２および裏面２８３に対してほぼ垂直に形成されている。そのため、サイド照明３４０の光軸は対物レンズ２１の光軸に対して９０－θ１［deg］の角度を成している。なお、ｘｙステージ２６上に載置された透明基板２８の表裏面２８２，２８３は、対物レンズ２１の光軸に対して垂直であると仮定して説明する。なお、本実施の形態では、透明基板２８をｘｙステージ２６上に載置した場合における透明基板２８のｘｙステージ２６側の面を裏面２８３と称し、透明基板２８の裏面２８３とは反対側の面を表面２８２と称することにする。 As shown in FIG. 5, the illumination light L3 of the side illumination 340 is irradiated in the direction of the optical axis of the objective lens 21 from outside the optical axis of the objective lens 21. The angle θ1 [deg] is set with respect to the normal line n of the side surface 284 . The transparent substrate 28 in which the concave portion 280 is formed is a rectangular plate material, and the side surface 284 is formed substantially perpendicular to the front surface 282 and the rear surface 283 . Therefore, the optical axis of the side illumination 340 forms an angle of 90−θ1 [deg] with respect to the optical axis of the objective lens 21 . The front and rear surfaces 282 and 283 of the transparent substrate 28 placed on the xy stage 26 are assumed to be perpendicular to the optical axis of the objective lens 21. FIG. In the present embodiment, the surface of the transparent substrate 28 on the xy stage 26 side when the transparent substrate 28 is placed on the xy stage 26 is referred to as a back surface 283, and the surface opposite to the back surface 283 of the transparent substrate 28 is referred to as a back surface 283. will be referred to as surface 282.

透明基板２８の材料にはサイド照明３４０の光を透過可能な材料であれば種々のものが使用可能であり、例えば、ガラスや透明なプラスチック材等が用いられる。プラスチック材としては、例えば、ポリスチレンやアクリル樹脂やジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ：Polydimethylsiloxane）等を使用される。各材料の屈折率は、ガラスが１．４～１．５程度、ポリスチレンが１．６程度、アクリル樹脂が１．６程度、ＰＤＭＳが１．４程度であり、水は１．３程度である。 Various materials can be used as the material of the transparent substrate 28 as long as the material can transmit the light of the side illumination 340. For example, glass, transparent plastic material, or the like is used. As the plastic material, for example, polystyrene, acrylic resin, dimethylpolysiloxane (PDMS: Polydimethylsiloxane), or the like is used. The refractive index of each material is about 1.4 to 1.5 for glass, about 1.6 for polystyrene, about 1.6 for acrylic resin, about 1.4 for PDMS, and about 1.3 for water. .

サイド照明３４０の角度θ１は、側面２８４から入射したサイド照明３４０の照明光Ｌ３が透明基板２８の表面２８２および裏面２８３で全反射される角度に設定される。例えば、透明基板２８の屈折率を１．６とした場合、全反射の臨界角θｍはsinθｍ＝１／１．６からθｍ≒３８．６８となる。よって、図５において角度θ３をθ３≧３８．７［deg］に設定すれば透明基板２８の裏面２８３で全反射される。一方、側面２８４から透明基板２８内に入射する照明光Ｌ３の角度θ２は、θ２≦θｍ（≒３８．６８［deg］）の角度となる。角度θ３はθ３＝９０－θ２なので、角度θ２がθ２＜θｍである場合には上述の条件θ３≧３８．７［deg］を自動的に満足している。 The angle θ1 of the side illumination 340 is set to an angle at which the illumination light L3 of the side illumination 340 incident from the side surface 284 is totally reflected by the front surface 282 and the rear surface 283 of the transparent substrate 28 . For example, when the refractive index of the transparent substrate 28 is 1.6, the critical angle .theta.m for total reflection is .theta.m.apprxeq.38.68 from sin .theta.m=1/1.6. Therefore, if the angle .theta.3 is set to .theta.3.gtoreq.38.7[deg] in FIG. On the other hand, the angle θ2 of the illumination light L3 entering the transparent substrate 28 from the side surface 284 is θ2≦θm (≈38.68 [deg]). Since the angle θ3 is θ3=90−θ2, the above condition θ3≧38.7 [deg] is automatically satisfied when the angle θ2 is θ2<θm.

すなわち、透明基板２８の屈折率が１．６の場合には、サイド照明３４０の角度θ１がどのような値であっても、透明基板２８に入射した照明光Ｌ３は表裏面２８２，２８３で全反射されることになる。言い換えると、サイド照明３４０を図５の破線Ｌ（側面２８４と一致する直線）よりも図示右側（側面２８４に関して対物レンズ２１の光軸とは反対の側）に配置して、透明基板２８の側面２８４に照明光Ｌ３が入射するようにすれば、照明光Ｌ３は表裏面２８２，２８３で全反射される。 In other words, when the refractive index of the transparent substrate 28 is 1.6, the illumination light L3 incident on the transparent substrate 28 is fully emitted from the front and rear surfaces 282 and 283 regardless of the angle θ1 of the side illumination 340. will be reflected. In other words, the side illumination 340 is arranged on the right side of the drawing (the side opposite to the optical axis of the objective lens 21 with respect to the side surface 284) from the dashed line L in FIG. If the illumination light L3 is made incident on 284, the illumination light L3 is totally reflected by the front and back surfaces 282,283.

次に、透明基板２８の屈折率が１．４の場合について考える。屈折率が１．４の場合の臨界角θｍはθｍ≒４５．５８［deg］となり、照明光Ｌ３が表裏面２８２，２８３で全反射されるためには、θ３＝９０－θ２≧４５．５８［deg］のように設定する必要がある。このとき、θ２≦４４．４２［deg］となるので、スネルの法則により入射角θ１にはθ１≦７８．４８［deg］という条件が課せられる。 Next, consider the case where the refractive index of the transparent substrate 28 is 1.4. The critical angle θm when the refractive index is 1.4 is θm≈45.58 [deg]. It should be set like [deg]. At this time, since θ2≦44.42 [deg], the condition θ1≦78.48 [deg] is imposed on the incident angle θ1 according to Snell's law.

このように、透明基板２８に用いられる材料の屈折率に応じて照明光Ｌ３の入射角θ１に課せられる条件は異なるが、照明光Ｌ３を対物レンズ２１の光軸の軸外から対物レンズ２１の光軸方向へと照射することで、凹部２８０の液体２８１ｃに浸かったアーム１３ａ，１３ｂの先端部分を照明することができる。なお、サイド照明３４０から出射される光が全てＬ３の方向に揃っている場合を除き、照明光Ｌ３が開き角度を有する光束である場合には、水平方向から側面２８４に対して垂直に照明した場合でも、透明基板２８内を斜めに進行して表裏面２８２，２８３で全反射される光線が存在し、アーム１３ａ，１３ｂが照明されることになる。 As described above, the condition imposed on the incident angle θ1 of the illumination light L3 varies depending on the refractive index of the material used for the transparent substrate 28. By irradiating in the direction of the optical axis, the tip portions of the arms 13a and 13b submerged in the liquid 281c of the concave portion 280 can be illuminated. Except for the case where the light emitted from the side illumination 340 is all aligned in the direction of L3, when the illumination light L3 is a light flux having an opening angle, the side surface 284 is vertically illuminated from the horizontal direction. Even in this case, there exists a light beam that travels obliquely through the transparent substrate 28 and is totally reflected by the front and back surfaces 282 and 283, thereby illuminating the arms 13a and 13b.

このように、照明光Ｌ３を透明基板２８と透明基板２８に接する空気との境界である界面（表裏面２８２，２８３）で全反射させるためには、透明基板２８に対するサイド照明３４０の配置が重要である。そのため、本実施の形態では、サイド照明３４０のｚ方向位置および角度θ１を調整できるような構成とした。 In this way, the arrangement of the side lighting 340 with respect to the transparent substrate 28 is important in order to cause the illumination light L3 to be totally reflected at the interfaces (front and back surfaces 282, 283) that are boundaries between the transparent substrate 28 and the air in contact with the transparent substrate 28. is. Therefore, in the present embodiment, the configuration is such that the z-direction position and the angle θ1 of the side illumination 340 can be adjusted.

図１１は、操作ツール照明装置３４の詳細を示す図である。操作ツール照明装置３４は、図１，２に示したサイド照明３４０、位置調整部３４１および支持アーム３４２に加えて、角度調整用のボルト３４３とｚ位置調整用のボルト３４４とを備えている。位置調整部３４１はボルト３４４により支持アーム３４２に固定されている。支持アーム３４２にはｚ軸方向に長い長穴３４２ａが形成されており、ボルト３４４は長穴３４２ａを貫通して位置調整部３４１のネジ穴３４１ａに螺合している。サイド照明３４０は、ボルト３４３により位置調整部３４１に固定されている。 FIG. 11 is a diagram showing details of the operation tool illumination device 34. As shown in FIG. The manipulation tool illumination device 34 includes an angle adjustment bolt 343 and a z position adjustment bolt 344 in addition to the side illumination 340, the position adjustment section 341 and the support arm 342 shown in FIGS. The position adjusting portion 341 is fixed to the support arm 342 with bolts 344 . A long hole 342a is formed in the support arm 342 in the z-axis direction. The side lighting 340 is fixed to the position adjusting portion 341 with bolts 343 .

サイド照明３４０の照明光Ｌ３の角度を調整する場合には、ボルト３４３を緩めてサイド照明３４０の傾き（対物レンズ２１の光軸に対する傾き）を調整する。その結果、透明基板２８の屈折率に応じて、照明光Ｌ３の入射角度θ１を最適に調整することができる。また、サイド照明３４０のｚ軸方向位置を調整する場合には、ボルト３４４を緩めて、支持アーム３４２に対する位置調整部３４１のｚ軸方向位置を調整する。その結果、ｘｙステージ２６（図２参照）の高さや透明基板２８を厚さに応じて、サイド照明３４０の高さを最適に調整することができる。 When adjusting the angle of the illumination light L3 of the side illumination 340, the bolt 343 is loosened to adjust the inclination of the side illumination 340 (inclination of the objective lens 21 with respect to the optical axis). As a result, the incident angle θ1 of the illumination light L3 can be optimally adjusted according to the refractive index of the transparent substrate . Further, when adjusting the z-axis direction position of the side lighting 340 , the bolt 344 is loosened and the z-axis direction position of the position adjusting portion 341 with respect to the support arm 342 is adjusted. As a result, the height of the side lighting 340 can be optimally adjusted according to the height of the xy stage 26 (see FIG. 2) and the thickness of the transparent substrate 28 .

なお、上述した説明では、サイド照明３４０の角度および高さを調整できるような構成としたが、一定の角度および高さで支持アーム３４２に固定する構成であっても良い。また、位置調整部３４１に角度変更用アクチュエータおよび角度検出センサを設けて、角度検出センサの検出値およびｘｙ方向移動部３１の位置検出装置の検出値に基づいて、サイド照明３４０の角度θ１を自動で所定の角度に調整するようにしても良い。 In the above description, the angle and height of the side lighting 340 are adjustable, but the side lighting 340 may be fixed to the support arm 342 at a fixed angle and height. Further, an angle changing actuator and an angle detection sensor are provided in the position adjustment section 341, and the angle θ1 of the side lighting 340 is automatically adjusted based on the detection value of the angle detection sensor and the detection value of the position detection device of the xy direction moving section 31. You may make it adjust to a predetermined angle by .

本実施の形態では、図１１に示すように角度調整部であるボルト３４３を備えたので、透明基板２８の屈折率に応じて、透明基板２８に入射する照明光Ｌ３の光軸の対物レンズ２１の光軸に対する角度を、透明基板２８に入射した照明光Ｌ３の一部が透明基板２８の界面に対する全反射条件を満たす範囲に調整することができる。また、透明基板２８のｙ軸方向の寸法が異なる場合も、ボルト３４３を緩めてサイド照明３４０の角度を調整することで、照明光Ｌ３が透明基板２８の側面２８４に確実に入射するように角度θ１を調整することができる。 In this embodiment, as shown in FIG. 11, since the bolt 343 which is the angle adjusting portion is provided, the angle of the objective lens 21 of the optical axis of the illumination light L3 incident on the transparent substrate 28 is adjusted according to the refractive index of the transparent substrate 28. with respect to the optical axis can be adjusted within a range in which a part of the illumination light L3 incident on the transparent substrate 28 satisfies the condition of total reflection with respect to the interface of the transparent substrate 28 . Further, even if the dimension of the transparent substrate 28 in the y-axis direction is different, by loosening the bolt 343 and adjusting the angle of the side illumination 340, the illumination light L3 can be reliably incident on the side surface 284 of the transparent substrate 28. θ1 can be adjusted.

上述のように図５の角度θ１を設定することで、透明基板２８内に入射した照明光Ｌ３内の全反射条件を満たすものは入射側の側面２８４から反対方向の側面側へと透明基板２８内を進行することになる。透明基板２８と液体２８１ｃとの間の屈折率差は小さいのでこれらの境界面では全反射はほぼ生じず、図５に示すように、透明基板２８内を図示左方向へ進む光は凹部２８０に収容された液体２８１ｃ内へ進入する。その結果、液体２８１ｃ内に浸かっているアーム１３ａ，１３ｂは照明光Ｌ３により照明され、アーム１３ａ，１３ｂの先端面で反射・散乱される。 By setting the angle θ1 in FIG. 5 as described above, light that satisfies the conditions for total reflection in the illumination light L3 incident on the transparent substrate 28 is transferred from the side surface 284 on the incident side to the side surface in the opposite direction to the transparent substrate 28 . It will proceed inside. Since the refractive index difference between the transparent substrate 28 and the liquid 281c is small, almost no total reflection occurs at their interface. It enters into the contained liquid 281c. As a result, the arms 13a and 13b immersed in the liquid 281c are illuminated by the illumination light L3, which is reflected and scattered by the tip surfaces of the arms 13a and 13b.

アーム１３ａ，１３ｂの先端面で反射・散乱された光Ｌ４の一部は、対物レンズ２１を通ってダイクロイックミラー２０１に入射する。上述したように、サイド照明３４０の光源には白色光源が用いられるので、光Ｌ４の内でダイクロイックミラー２０１を透過する波長成分はダイクロイックミラー２０１を透過して接眼レンズ２３および撮像装置２７に導かれる。その結果、図６に示すように、観察画像４０内に、蛍光により光っている細胞（異常細胞）２８１ａとサイド照明３４０により照明されているアーム１３ａ，１３ｂの先端面１３１の像（以下では、アーム像と称する）１３１Ａ，１３１Ｂが観察される。 Part of the light L4 reflected and scattered by the tip surfaces of the arms 13a and 13b passes through the objective lens 21 and enters the dichroic mirror 201. FIG. As described above, since a white light source is used as the light source for the side lighting 340, the wavelength component of the light L4 that passes through the dichroic mirror 201 passes through the dichroic mirror 201 and is guided to the eyepiece 23 and the imaging device 27. . As a result, as shown in FIG. 6, an observation image 40 includes an image of a cell (abnormal cell) 281a illuminated by fluorescence and an image of the tip surfaces 131 of the arms 13a and 13b illuminated by the side illumination 340 (hereinafter referred to as 131A and 131B (referred to as arm images) are observed.

上述のように、本実施の形態では、サイド照明３４０は、対物レンズ２１の光軸の軸外から、顕微鏡装置２のｘｙステージ２６上に載置された透明基板２８に照明光Ｌ３を入射する。その際、透明基板２８に対して、入射した照明光Ｌ３の一部が透明基板２８の界面に対する全反射条件を満たすように照明光Ｌ３を入射させる。透明基板２８に入射した照明光Ｌ３は、透明基板２８と透明基板２８に接する空気との境界である界面で全反射されて透明基板２８上の観察試料２８１に導かれ、観察試料２８１の操作対象である細胞２８１ａを操作する操作ツールであるアーム１３ａ，１３ｂを照明する。 As described above, in the present embodiment, the side illumination 340 causes the illumination light L3 to enter the transparent substrate 28 placed on the xy stage 26 of the microscope apparatus 2 from outside the optical axis of the objective lens 21. . At that time, the illumination light L3 is caused to enter the transparent substrate 28 so that part of the incident illumination light L3 satisfies the total reflection condition for the interface of the transparent substrate 28 . The illumination light L3 incident on the transparent substrate 28 is totally reflected at the interface, which is the boundary between the transparent substrate 28 and the air in contact with the transparent substrate 28, and guided to the observation sample 281 on the transparent substrate 28, whereupon the observation sample 281 is operated. The arms 13a and 13b, which are manipulation tools for manipulating the cell 281a, are illuminated.

観察画像４０内のアーム像は、アーム１３ａ，１３ｂの先端面で反射・散乱された照明光Ｌ３が対物レンズ２１を通ることにより観察される。そのため、アーム１３ａ，１３ｂの先端面１３１に金属膜（例えば、Ａｕの膜）を形成することで反射率が向上し、より明るいアーム像が得られる。また、視認性を確保しつつサイド照明３４０の照度を抑えることができる。金属膜は、アーム１３ａ，１３ｂの少なくとも先端面１３１を含む先端領域に形成するのが好ましい。なお、図５に示す例では、アーム１３ａ，１３ｂの先端面１３１を対物レンズ２１の光軸に垂直な面としているが、先端面１３１を傾斜面としても良い。 The arm image in the observation image 40 is observed by the illumination light L3 reflected and scattered by the tip surfaces of the arms 13a and 13b passing through the objective lens 21. FIG. Therefore, by forming a metal film (for example, an Au film) on the distal end surfaces 131 of the arms 13a and 13b, the reflectance is improved and a brighter arm image can be obtained. In addition, the illuminance of the side lighting 340 can be suppressed while ensuring visibility. It is preferable to form the metal film on the tip region including at least the tip surface 131 of the arms 13a and 13b. In the example shown in FIG. 5, the tip surfaces 131 of the arms 13a and 13b are perpendicular to the optical axis of the objective lens 21, but the tip surfaces 131 may be inclined.

顕微鏡の焦点深度は比較的浅く、顕微鏡観察時には観察試料２８１の細胞２８１ａ，２８１ｂにピントが合っている。アーム１３ａ，１３ｂの先端面１３１が焦点深度の範囲内にあればアーム像はシャープであるが、先端面１３１が液面近くであって焦点深度の範囲から外れてしまうとぼやけたアーム像となる。また、液体２８１ｃの屈折率が水の屈折率（１．３３３）と同程度であると仮定すると、液面から空気中に出射される照明光Ｌ３は少ない。そのため、アーム１３ａ，１３ｂの先端面１３１が液体２８１ｃの外へ出てしまうと、アーム１３ａ，１３ｂは非常に弱い照明光で照明されると共にぼやけたアーム像となり、アーム１３ａ，１３ｂはほとんど観察されなくなる。 The depth of focus of the microscope is relatively shallow, and the cells 281a and 281b of the observation sample 281 are in focus during microscopic observation. If the tip surfaces 131 of the arms 13a and 13b are within the range of the depth of focus, the arm images are sharp. . Further, assuming that the refractive index of the liquid 281c is approximately the same as the refractive index of water (1.333), the illumination light L3 emitted from the liquid surface into the air is small. Therefore, when the tip surfaces 131 of the arms 13a and 13b come out of the liquid 281c, the arms 13a and 13b are illuminated with very weak illumination light and become blurred arm images, and the arms 13a and 13b are hardly observed. Gone.

次に、ナノピンセットシステム１を用いた細胞２８１ａの捕集動作の手順について説明する。まず、図７のブロック図を用いて、制御部も含むナノピンセットシステム１の概略構成を説明する。なお、図７はナノピンセットシステム１の概略構成を示すブロック図であるが、捕集動作の説明に必要な他の構成も記載した。 Next, a procedure for collecting cells 281a using the nanotweezers system 1 will be described. First, with reference to the block diagram of FIG. 7, the schematic configuration of the nanotweezers system 1 including a control section will be described. Although FIG. 7 is a block diagram showing the schematic configuration of the nanotweezers system 1, other configurations necessary for explaining the collection operation are also described.

図７において、ナノピンセットシステム１は、前述した図１にも示したように、ナノピンセット１０とｘｙ方向移動部３１、ｚ方向移動部３３およびサイド照明３４０と、それらを制御する制御装置６０とを備えている。制御装置６０は、ｘｙ方向移動部３１およびｚ方向移動部３３を制御する移動制御部６００と、ナノピンセット１０のアーム１３ａ，１３ｂの開閉動作を制御する開閉制御部６０１と、サイド照明３４０のオンオフおよび照度を制御する照明制御部６０２と、外部からの指令が入力される入力部６０３を備えている。図示は省略したが、入力部６０３にはオペレータが操作して移動指令や開閉指令や照明に関する指令を入力するための操作部（スイッチやジョイスティック等）が設けられている。 In FIG. 7, the nanotweezers system 1 includes the nanotweezers 10, the xy-direction moving part 31, the z-direction moving part 33, the side illumination 340, and the controller 60 for controlling them, as shown in FIG. It has The control device 60 includes a movement control unit 600 that controls the xy-direction movement unit 31 and the z-direction movement unit 33, an opening/closing control unit 601 that controls opening/closing operations of the arms 13a and 13b of the nanotweezers 10, and a side illumination 340 on/off switch. and an illumination control unit 602 for controlling illuminance, and an input unit 603 for inputting a command from the outside. Although not shown, the input unit 603 is provided with operation units (switches, joysticks, etc.) that are operated by the operator to input movement commands, opening/closing commands, and commands relating to lighting.

図示していないが、ｘｙ方向移動部３１およびｚ方向移動部３３にはそれらの位置を検出するための位置検出装置（例えば、エンコーダ等）がそれぞれ設けられており、位置検出装置で検出された位置情報は移動制御部６００に入力される。移動制御部６００は、それらの位置情報に基づいてｘｙ方向移動部３１およびｚ方向移動部３３の位置を制御する。初期状態ではｘｙ方向移動部３１およびｚ方向移動部３３は原点位置に位置決めされており、そのときナノピンセット１０は図５に示した対物レンズ２１の光軸上に位置決めされる。 Although not shown, the xy-direction moving unit 31 and the z-direction moving unit 33 are provided with position detection devices (for example, encoders) for detecting their positions. The position information is input to movement control section 600 . The movement control section 600 controls the positions of the xy-direction moving section 31 and the z-direction moving section 33 based on the position information. In the initial state, the xy-direction moving part 31 and the z-direction moving part 33 are positioned at the origin position, and the nanotweezers 10 are positioned on the optical axis of the objective lens 21 shown in FIG.

顕微鏡装置２には、ｘｙステージ２６を駆動制御するステージ制御部２１０と、ステージ制御部２１０への移動指令を手動入力するための入力装置２１１とが設けられている。ｘｙステージ２６はステージ位置を検出する位置検出装置が設けられており、ステージ制御部２１０は位置検出装置からの位置情報に基づいてｘｙステージ２６の位置を制御する。また、顕微鏡装置２の撮像装置２７から出力される撮像データは、顕微鏡用ソフトウェアがインストールされたＰＣ（パーソナルコンピュータ）３００に入力される。ＰＣ３００は画像処理装置として機能し、ＰＣ３００に接続された表示装置３０１に観察画像を表示する。なお、顕微鏡装置２の入力装置２１１に代えて、ＰＣ３００から移動指令をステージ制御部２１０に入力するようにしても良い。 The microscope apparatus 2 is provided with a stage control section 210 that drives and controls the xy stage 26 and an input device 211 for manually inputting a movement command to the stage control section 210 . The xy stage 26 is provided with a position detection device for detecting the stage position, and the stage controller 210 controls the position of the xy stage 26 based on the position information from the position detection device. Further, imaging data output from the imaging device 27 of the microscope device 2 is input to a PC (personal computer) 300 in which microscope software is installed. The PC 300 functions as an image processing device and displays observation images on a display device 301 connected to the PC 300 . Note that the movement command may be input from the PC 300 to the stage control section 210 instead of the input device 211 of the microscope apparatus 2 .

図８は、ナノピンセットシステム１を用いた細胞２８１ａの捕集動作手順の一例を示すフローチャートである。ステップＳ１０では、ステージ制御部２１０は、透明基板２８が載置された顕微鏡装置２のｘｙステージ２６を移動して、観察試料２８１が収容されている凹部２８０を対物レンズ２１の光軸上に位置決めする。凹部２８０の位置情報は入力装置２１１により予め入力されている。ステップＳ２０では、オペレータは、観察試料２８１を蛍光観察して異常細胞である細胞２８１ａの位置を確認する。 FIG. 8 is a flow chart showing an example of a cell 281a collection operation procedure using the nanotweezers system 1. As shown in FIG. In step S10, the stage control unit 210 moves the xy stage 26 of the microscope apparatus 2 on which the transparent substrate 28 is placed, and positions the concave portion 280 containing the observation sample 281 on the optical axis of the objective lens 21. do. The position information of the concave portion 280 is input in advance by the input device 211 . In step S20, the operator performs fluorescence observation of the observation sample 281 to confirm the position of the abnormal cell 281a.

ステップＳ３０では、照明制御部６０２は入力部６０３に入力される照明点灯指令に基づいて、サイド照明３４０を点灯する。オペレータはナノピンセットシステム１の入力部６０３を操作して、照明制御部６０２に照明点灯指令を入力する。ステップＳ４０では、移動制御部６００は、入力部６０３に入力されるｚ軸正方向の移動指令に基づいてｚ方向移動部３３を移動し、ナノピンセット１０を降下させる。オペレータは、表示装置３０１に表示された観察画像４０を見ながら、または、接眼レンズ２３で観察しながら、入力部６０３を操作してｚ方向移動部３３をｚ軸正方向へ移動させる移動指令を入力する。 In step S<b>30 , the lighting control section 602 turns on the side lighting 340 based on the lighting lighting command input to the input section 603 . The operator operates the input unit 603 of the nanotweezers system 1 to input an illumination turn-on command to the illumination control unit 602 . In step S<b>40 , the movement control unit 600 moves the z-direction movement unit 33 based on the z-axis positive direction movement command input to the input unit 603 to lower the nanotweezers 10 . While watching the observation image 40 displayed on the display device 301 or observing with the eyepiece 23, the operator operates the input unit 603 to issue a movement command to move the z-direction moving unit 33 in the positive direction of the z-axis. input.

ステップＳ５０では、ナノピンセット１０のアーム１３ａ，１３ｂが視認可能となった否かを判定する。判定は、オペレータが観察画像を見て判断しても良いし、ＰＣ３００にインストールされた顕微鏡用ソフトウェアによって自動的に判定しても良い。上述したように初期状態ではナノピンセット１０は対物レンズ２１の光軸上に位置している。アーム１３ａ，１３ｂの先端部分が液体２８１ｃの液面よりも降下して液体２８１ｃに浸かると、アーム１３ａ，１３ｂの先端面１３１が照明光Ｌ３により照明されて光り、アーム像１３１Ａ，１３１Ｂが図９（ａ）のように視野中央（観察画像４０の中央）に観察されることになる。図９（ａ）では、アーム像１３１Ａ，１３１Ｂを破線で表示することで、アーム像１３１Ａ，１３１Ｂがぼけていることを表現している。 In step S50, it is determined whether or not the arms 13a and 13b of the nanotweezers 10 are visible. The determination may be made by the operator looking at the observation image, or may be automatically made by microscope software installed in the PC 300 . As described above, the nanotweezers 10 are positioned on the optical axis of the objective lens 21 in the initial state. When the tip portions of the arms 13a and 13b fall below the liquid surface of the liquid 281c and are immersed in the liquid 281c, the tip surfaces 131 of the arms 13a and 13b are illuminated by the illumination light L3, and the arm images 131A and 131B are shown in FIG. As shown in (a), it is observed in the center of the field of view (the center of the observed image 40). In FIG. 9A, by displaying the arm images 131A and 131B with dashed lines, it is expressed that the arm images 131A and 131B are blurred.

アーム１３ａ，１３ｂの先端面１３１が液面付近に浸かっている場合には、焦点深度範囲から外れているのでアーム像１３１Ａ，１３１Ｂは図９（ａ）のようにぼけているが、ナノピンセット１０が降下してアーム１３ａ，１３ｂの先端面１３１が焦点深度範囲に近づくとアーム像１３１Ａ，１３１Ｂは徐々にシャープになる。そこで、観察画像４０内におけるアーム１３ａ，１３ｂの位置が認識できる程度までアーム像１３１Ａ，１３１Ｂのぼけが低減したならば、オペレータは視認可能と判断する。 When the tip surfaces 131 of the arms 13a and 13b are immersed in the vicinity of the liquid surface, the images 131A and 131B of the arms are blurred as shown in FIG. descends and the tip surfaces 131 of the arms 13a and 13b approach the depth of focus range, the arm images 131A and 131B gradually become sharper. Therefore, when the blurring of the arm images 131A and 131B is reduced to such an extent that the positions of the arms 13a and 13b in the observation image 40 can be recognized, the operator determines that they can be visually recognized.

オペレータは、観察画像４０内におけるアーム１３ａ，１３ｂの位置が認識できる程度までアーム像１３１Ａ，１３１Ｂのボケが低減したならば、アーム１３ａ，１３ｂが視認可能と判断し、ｚ軸正方向への移動を停止する命令を入力部６０３により入力する。ステップＳ６０では、移動制御部６００は、入力部６０３により入力されたｚ軸正方向への移動を停止する命令に基づいて、ｚ方向移動部３３のｚ軸正方向への移動を停止する。その結果、ナノピンセット１０の降下が停止する。 When the blurring of the arm images 131A and 131B is reduced to such an extent that the positions of the arms 13a and 13b in the observation image 40 can be recognized, the operator determines that the arms 13a and 13b are visible, and moves the arms 13a and 13b in the positive z-axis direction. is input through the input unit 603. In step S<b>60 , the movement control section 600 stops movement of the z-direction moving section 33 in the positive z-axis direction based on the command input from the input section 603 to stop movement in the positive z-axis direction. As a result, the descent of the nanotweezers 10 stops.

ステップＳ７０では、移動制御部６００は、入力部６０３により入力されたｘｙ方向移動指令に基づいてｘｙ方向移動部３１を移動し、アーム１３ａ，１３ｂを細胞２８１ａの位置へ移動させる。オペレータは、制御装置６０の入力部６０３を操作してｘｙ方向移動指令を入力する。図９（ｂ）に示すように観察画像４０内において一対のアーム像１３１Ａ，１３１Ｂの間にピックアップすべき細胞２８１ａが位置したら、オペレータは、ｘｙ方向移動指令の入力を停止する。 In step S70, the movement control unit 600 moves the xy-direction movement unit 31 based on the xy-direction movement command input from the input unit 603 to move the arms 13a and 13b to the position of the cell 281a. The operator operates the input unit 603 of the control device 60 to input an xy direction movement command. When the cell 281a to be picked up is positioned between the pair of arm images 131A and 131B in the observation image 40 as shown in FIG. 9B, the operator stops inputting the xy direction movement command.

ステップＳ８０では、開閉制御部６０１は、入力部６０３により入力されるオペレータの閉動作指令に基づいてアーム１３ａ，１３ｂの閉動作を行わせ、アーム１３ａ，１３ｂによって細胞２８１ａを把持させる。次いで、オペレータによりピックアップ指令が入力部６０３により入力されると、ステップＳ９０において、移動制御部６００は、ｘｙ方向移動部３１およびｚ方向移動部を移動して、細胞２８１ａをアーム１３ａ，１３ｂで把持した状態のナノピンセット１０を所定位置（例えば、初期位置）まで移動させる。この所定位置は、ｘｙステージ２６を移動しても透明基板２８とナノピンセット１０とが干渉しない位置に設定される。 In step S80, the opening/closing control unit 601 closes the arms 13a and 13b based on the operator's closing operation command input by the input unit 603, and causes the arms 13a and 13b to grip the cell 281a. Next, when the operator inputs a pickup command through the input unit 603, in step S90, the movement control unit 600 moves the xy-direction moving unit 31 and the z-direction moving unit to grasp the cell 281a with the arms 13a and 13b. Then, the nanotweezers 10 are moved to a predetermined position (for example, the initial position). This predetermined position is set at a position where the transparent substrate 28 and the nanotweezers 10 do not interfere even when the xy stage 26 is moved.

ステップＳ１００では、オペレータは、顕微鏡装置２の入力装置２１１を操作して、ｘｙステージ２６上に載置された捕集容器２１２が対物レンズ２１の光軸上に位置するようにｘｙステージ２６を移動させる。ステップＳ１１０では、オペレータは、アーム１３ａ，１３ｂで把持している細胞２８１ａを捕集容器２１２（図７参照）へ移動させる。具体的には、オペレータは、入力部６０３を操作してｚ方向移動部３３を移動させてナノピンセット１０を捕集容器２１２の上方所定位置まで下げた後に、開閉制御部６０１によりアーム１３ａ，１３ｂを開動作させ、細胞２８１ａを捕集容器２１２内へリリースさせる。 In step S100, the operator operates the input device 211 of the microscope apparatus 2 to move the xy stage 26 so that the collection container 212 placed on the xy stage 26 is positioned on the optical axis of the objective lens 21. Let In step S110, the operator moves the cell 281a gripped by the arms 13a and 13b to the collection container 212 (see FIG. 7). Specifically, the operator operates the input unit 603 to move the z-direction moving unit 33 to lower the nanotweezers 10 to a predetermined position above the collection container 212, and then the opening/closing control unit 601 opens and closes the arms 13a and 13b. is opened to release the cells 281 a into the collection container 212 .

図５に示した例では、透明基板２８に凹部２８０が１つ形成されている場合を示した。図１０に示す透明基板２８のように複数の凹部２８０ａ～２８０ｌが形成されている場合、それぞれの凹部２８０ａ～２８０ｌに観察試料２８１が収容される。そして、各凹部２８０ａ～２８０ｌの観察試料２８１に含まれている細胞（異常細胞）２８１ａに対して、図８に示した捕集動作が行われることになる。 The example shown in FIG. 5 shows the case where one concave portion 280 is formed in the transparent substrate 28 . When a plurality of recesses 280a-280l are formed like the transparent substrate 28 shown in FIG. Then, the collection operation shown in FIG. 8 is performed on the cells (abnormal cells) 281a contained in the observation samples 281 of the recesses 280a to 280l.

ところで、細胞２８１ａに照明光Ｌ３が長時間照射されると細胞２８１ａの蛍光物質からの蛍光が減光されやすくなるので、照明光Ｌ３を細胞２８１ａに長時間照射するのは好ましくない。図１に示したナノピンセットシステム１では、光束の断面積が比較的小さなスポット状のサイド照明３４０をナノピンセット１０と一体で移動させて、アーム１３ａ，１３ｂの先端領域を照明するような構成としている。そのため、図１０に示すように凹部２８０ｅの観察試料２８１を操作する場合には、凹部２８０ａ～２８０ｃ，２８０ｇ～２８０ｌに収容されている観察試料２８１にサイド照明３４０の照明光Ｌ３が入射するのを低減することができる。なお、ナノピンセット１０のアーム１３ａ，１３ｂの先端部分の厚さ寸法は１～６０μｍ程度なので、照明光Ｌ３の光束の直径は１ｍｍ程度あれば十分である。 By the way, if the cell 281a is irradiated with the illumination light L3 for a long time, the fluorescence from the fluorescent substance of the cell 281a is likely to be attenuated, so it is not preferable to irradiate the cell 281a with the illumination light L3 for a long time. In the nanotweezer system 1 shown in FIG. 1, the spot-shaped side illumination 340 having a relatively small cross-sectional area of the luminous flux is moved integrally with the nanotweezers 10 to illuminate the tip regions of the arms 13a and 13b. there is Therefore, when the observation sample 281 in the recess 280e is manipulated as shown in FIG. can be reduced. Since the tip portions of the arms 13a and 13b of the nanotweezers 10 have a thickness of about 1 to 60 μm, it is sufficient if the diameter of the light flux of the illumination light L3 is about 1 mm.

さらにまた、サイド照明３４０を顕微鏡装置２のｘｙステージ２６上に設置するようにしても良い。その場合、図１０に示すように透明基板２８に複数の凹部２８０ａ～２８０ｌが形成されている場合は、凹部２８０ａ～２８０ｌのいずれにナノピンセット１０が移動しても、アーム１３ａ，１３ｂの先端領域がサイド照明により照明されるようにするために、透明基板２８の一側面全体に照明光Ｌ３を入射できるようなバー状のサイド照明３４０ａを用いるのが好ましい。 Furthermore, the side illumination 340 may be installed on the xy stage 26 of the microscope apparatus 2. In that case, when a plurality of recesses 280a to 280l are formed in the transparent substrate 28 as shown in FIG. is illuminated by the side illumination, it is preferable to use a bar-shaped side illumination 340a that allows illumination light L3 to enter the entire side surface of the transparent substrate .

図５に示す例では、透明基板２８の凹部２８０に収容された観察試料２８１をナノピンセット１０で操作する場合を例に説明したが、例えば、図１２，１３に示すようなスライドガラス２９上に保持された観察試料２８１に関しても同様に適用することができる。図１２は観察試料２８１が保持されたスライドガラス２９の一例を示す図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は断面図である。透明基板であるスライドガラス２９上には、観察試料２８１を保持するための枠２９１が設けられている。矩形リング状の枠２９１は、例えばアクリル材で形成される。もちろん、枠２９１の形状は矩形リング状に限定されず円形リング状等であっても良いし、材質についてもアクリル材に限定されない。 In the example shown in FIG. 5, the case of manipulating the observation sample 281 accommodated in the concave portion 280 of the transparent substrate 28 with the nanotweezers 10 has been described as an example. The same can be applied to the held observation sample 281 as well. 12A and 12B are diagrams showing an example of the slide glass 29 holding the observation sample 281, where (a) is a plan view and (b) is a cross-sectional view. A frame 291 for holding an observation sample 281 is provided on a slide glass 29 which is a transparent substrate. The rectangular ring-shaped frame 291 is made of, for example, an acrylic material. Of course, the shape of the frame 291 is not limited to a rectangular ring shape, and may be a circular ring shape or the like, and the material is not limited to an acrylic material.

図１２のようなスライドガラス２９を透明基板として使用する場合も、図１３に示すようにサイド照明３４０をスライドガラス２９の側方に配置し、サイド照明３４０の照明光Ｌ３を、スライドガラス２９を介してアーム１３ａ，１３ｂの先端領域を照明する。スライドガラス２９の側面２９４からスライドガラス２９内に入射した照明光Ｌ３は、スライドガラス２９の表面２９２および裏面２９３で全反射され、観察試料２８１の液体２８１ｃに進入し、アーム１３ａ，１３ｂの先端領域を照明する。 When the slide glass 29 shown in FIG. 12 is used as the transparent substrate, the side lighting 340 is arranged on the side of the slide glass 29 as shown in FIG. The tip regions of the arms 13a and 13b are illuminated through the illumination. The illumination light L3 entering the slide glass 29 from the side surface 294 of the slide glass 29 is totally reflected by the front surface 292 and the back surface 293 of the slide glass 29, enters the liquid 281c of the observation sample 281, and reaches the tip regions of the arms 13a and 13b. to illuminate the

上述した実施の形態では、観察試料２８１を操作する操作ツールがナノピンセット１０である場合について説明したが、サイド照明３４０は、ナノピンセット１０以外の操作ツールの照明にも適用することができる。例えば、操作ツールとして観察試料中の細胞を吸引するガラス製細管の場合には、細管の先端に照明光Ｌ３を反射する金属膜を形成することで、照明光Ｌ３によって照明された細管先端部を容易に観察することが可能となる。 In the above-described embodiment, the nanotweezers 10 are used as the manipulation tool for manipulating the observation sample 281, but the side illumination 340 can also be applied to illumination of manipulation tools other than the nanotweezers 10. For example, in the case of a glass capillary used as an operation tool for aspirating cells in an observation sample, a metal film that reflects the illumination light L3 is formed on the tip of the capillary so that the tip of the capillary illuminated by the illumination light L3 can be moved. It becomes possible to observe easily.

なお、上述した実施の形態では、サイド照明３４０をｘｙステージ２６の透明基板２８を載置する面（載置面）よりも上方側（ナノピンセット１０が配置される側）に配置し、透明基板２８の側面２８４に照明光Ｌ３を入射させた。しかし、ｘｙステージ２６の載置面よりも下方側（対物レンズ２１側）にサイド照明３４０を配置するスペースが確保でき、照明光Ｌ３がｘｙステージ２６により遮られない場合には、ｘｙステージ２６の載置面よりも下方側にサイド照明３４０を配置して、載置面よりも下方側から透明基板２８の側面２８４に照明光Ｌ３を入射させるようにしても良い。その場合も、載置面よりも上方側から照明光Ｌ３を入射させる場合と同様に、照明光Ｌ３を透明基板２８内で全反射させて液体２８１ｃ内のアーム１３ａ，１３ｂを照明することができる。 In the above-described embodiment, the side illumination 340 is arranged above the surface (mounting surface) of the xy stage 26 on which the transparent substrate 28 is mounted (the side on which the nanotweezers 10 are arranged). Illumination light L3 was made incident on the side surface 284 of 28 . However, if a space for arranging the side illumination 340 can be secured below the mounting surface of the xy stage 26 (on the objective lens 21 side) and the illumination light L3 is not blocked by the xy stage 26, the xy stage 26 The side illumination 340 may be arranged below the mounting surface so that the illumination light L3 is incident on the side surface 284 of the transparent substrate 28 from below the mounting surface. In this case, similarly to the case where the illumination light L3 is incident from above the mounting surface, the illumination light L3 can be totally reflected within the transparent substrate 28 to illuminate the arms 13a and 13b in the liquid 281c. .

上述のように、本実施の形態の操作ツール照明装置３４は、透明基板２８上の観察試料２８１中の操作対象である細胞２８１ａを操作ツールであるナノピンセット１０で操作しつつ観察を行う倒立型の顕微鏡装置２に用いられる。そして、透明基板２８を介してナノピンセット１０を照明する照明光Ｌ３を出射する照明部であるサイド照明３４０と、透明基板２８に入射する照明光Ｌ３の光軸の、顕微鏡装置２の対物レンズ２１の光軸に対する角度を調整する角度調整部であるボルト３４３を備える。 As described above, the manipulation tool illumination device 34 of the present embodiment is an inverted type that observes the cell 281a that is the manipulation target in the observation sample 281 on the transparent substrate 28 while manipulating it with the nanotweezers 10 that are the manipulation tool. used in the microscope device 2 of A side illumination 340, which is an illumination unit that emits illumination light L3 for illuminating the nanotweezers 10 through the transparent substrate 28, and an objective lens 21 of the microscope device 2, which is an optical axis of the illumination light L3 incident on the transparent substrate 28. A bolt 343 is provided as an angle adjuster for adjusting the angle with respect to the optical axis.

角度調整部であるボルト３４３を調整することにより、透明基板２８に入射する照明光Ｌ３の光軸の、対物レンズ２１の光軸に対する角度を、透明基板２８の屈折率に応じて適切に調整することができる。そのように調整することで、サイド照明３４０は、照明光Ｌ３を透明基板２８に入射し、透明基板２８を介してナノピンセット１０を照明する。ナノピンセット１０は、サイド照明３４０から出射された照明光Ｌ３により透明基板２８を介して照明されることにより、顕微鏡観察視野内にて光って見える。オペレータは、接眼レンズ２３を通して観察される観察像、または、ＰＣ３００にインストールされた顕微鏡用ソフトウェアにより表示装置３０１の観察画像により、観察試料２８１中の操作対象物である細胞１８１ａを操作しているナノピンセット１０のアーム１３ａ，１３ｂの識別が可能となる。 The angle of the optical axis of the illumination light L3 incident on the transparent substrate 28 with respect to the optical axis of the objective lens 21 is appropriately adjusted in accordance with the refractive index of the transparent substrate 28 by adjusting the bolt 343, which is the angle adjusting portion. be able to. With such adjustment, the side lighting 340 causes the illumination light L3 to enter the transparent substrate 28 and illuminate the nanotweezers 10 through the transparent substrate 28 . The nanotweezers 10 are illuminated through the transparent substrate 28 with the illumination light L3 emitted from the side illumination 340, so that they appear to shine within the microscope observation field. The operator manipulates the cell 181a, which is the object to be manipulated, in the observation sample 281 using the observation image observed through the eyepiece 23 or the observation image on the display device 301 using microscope software installed in the PC 300. Arms 13a and 13b of tweezers 10 can be identified.

上記では、種々の実施の形態および変形例を説明したが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。 Although various embodiments and modifications have been described above, the present invention is not limited to these contents. Other aspects conceivable within the scope of the technical idea of the present invention are also included in the scope of the present invention.

１…ナノピンセットシステム、２…顕微鏡装置、１０…ナノピンセット、１３ａ，１３ｂ…アーム、２１…対物レンズ、２６…ｘｙステージ、２８…透明基板、２９…スライドガラス、３１…ｘｙ方向移動部、３２，３４２…支持アーム、３３…ｚ方向移動部、３４…操作ツール照明装置、１３１…先端面、２８１…観察試料、２８１ａ，２８１ｂ…細胞、３４０，３４０ａ…サイド照明、３４１…位置調整部、３４３，３４４…ボルト、Ｌ３…照明光 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1... Nanotweezers system, 2... Microscope apparatus, 10... Nanotweezers, 13a, 13b... Arm, 21... Objective lens, 26... xy stage, 28... Transparent substrate, 29... Slide glass, 31... xy direction movement part, 32 , 342... Support arm 33... Z-direction moving part 34... Manipulation tool illumination device 131... Tip surface 281... Observation sample 281a, 281b... Cell 340, 340a... Side illumination 341... Position adjustment part 343 , 344... volts, L3... illumination light

Claims

An inverted microscope capable of performing observation while manipulating an operation target in an observation sample on a transparent substrate with an operation tool,
a transparent substrate on which an observation sample is arranged;
an operation tool for operating an operation target in an observation sample;
an epi-illumination unit that illuminates the observation sample from the bottom of the transparent substrate;
a side illumination unit that emits illumination light for illuminating the operation tool through the transparent substrate;
an angle adjusting unit that adjusts an angle of an optical axis of illumination light from the side illumination unit incident on a side surface of the transparent substrate with respect to an optical axis of illumination light from the epi-illumination unit incident on the transparent substrate. .

The inverted microscope of claim 1, wherein
The angle adjustment unit is an inverted microscope capable of adjusting the angle within a range in which a part of the illumination light incident on the side surface of the transparent substrate satisfies conditions for total reflection with respect to the interface of the transparent substrate.

In the inverted microscope according to claim 1 or 2,
The inverted microscope, wherein the angle adjusting section can adjust the angle according to the positional relationship between the side lighting section, the transparent substrate, and the operation tool.

In the inverted microscope according to any one of claims 1 to 3,
The inverted microscope, wherein the side illumination unit emits white light as the illumination light.

5. An inverted microscope according to any one of claims 1 to 4, wherein said manipulation tool is a nanotweezer comprising a pair of openable and closable arms.

In the inverted microscope of claim 5,
An inverted microscope, further comprising a moving device that moves the nanotweezers , the side illumination unit, and the angle adjustment unit together in a direction perpendicular to the optical axis of the illumination light from the epi-illumination unit incident on the transparent substrate.

In the inverted microscope according to claim 5 or 6,
The inverted microscope, wherein the side illumination unit emits spot light as the illumination light.

8. The inverted microscope according to any one of claims 5 to 7, wherein a metal film is formed on at least tip regions of said pair of arms.

A housing having a transparent substrate on which an observation sample is placed, an operation tool for manipulating an operation target in the observation sample, an epi-illumination section for illuminating the observation sample from the bottom of the transparent substrate, and a stage on which the transparent substrate is placed. and an operation tool illuminating device that can be attached to an inverted microscope, which includes a movement device provided in the housing via a support, and can observe the operation target while operating the operation tool,
a support arm attached to the moving device;
a position adjustment unit capable of vertically adjusting a fixed position with respect to the support arm;
a side illumination unit that emits illumination light for illuminating the operation tool through the transparent substrate;
an angle adjustment unit that adjusts an angle of an optical axis of illumination light from the side illumination unit incident on a side surface of the transparent substrate with respect to an optical axis of illumination light from the epi-illumination unit incident on the transparent substrate. lighting device.

A method for illuminating an operation tool using an inverted microscope according to any one of claims 1 to 8,
making the illumination light incident on the transparent substrate such that part of the incident illumination light from the side illumination unit satisfies conditions for total reflection with respect to the interface of the transparent substrate;
Illumination of the operation tool, which guides the illumination light from the side illumination unit incident on the transparent substrate to the observation sample on the transparent substrate by total reflection at the interface, and illuminates the operation tool for operating the operation target of the observation sample. Method.