JP7154615B2 - 単一蛍光膜色素染色およびフローサイトメトリーによる特有のスペクトル強度比分析に基づく迅速抗菌薬感受性試験 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１月９日付で出願した米国特許仮出願第６２／４４３，８５０号表題「フローサイトメトリーによる特有のペクトル強度比（ＳＩＲ）分析に基づく血液培養から直接的な迅速抗菌薬感受性試験」ならびにそれぞれ２０１７年５月１０日および２０１７年５月１１日付で出願された米国特許仮出願第６２／５０４，２０５号および同第６２／５０４，９０３号、どちらも表題「単一蛍光膜色素染色およびフローサイトメトリーによる特有のスペクトル強度比分析に基づく陽性血液培養から直接的な迅速グラム陰性抗菌薬感受性試験」の利益を主張する。
本願はさらに、２０１７年１月９日付で出願された、表題「フローサイトメトリーによる特有のスペクトル強度比（ＳＩＲ）分析に基づく臨床単離株からの迅速抗菌薬感受性試験」の米国特許仮出願第６２／４４３，８５４号、およびそれぞれ２０１７年５月１０日および２０１７年５月１１日付で出願されたどちらも表題「単一蛍光膜色素染色およびフローサイトメトリーによる特有のスペクトル強度比分析を利用した高速抗生物質感受性試験」の米国特許仮出願第６２／５０４，１５２号および同第６２，５０４，８５１号の前記利益を主張する。
前記仮出願は全体として参照により本明細書中に組み込まれる。

技術分野
細菌感染の強度は前記感染を引き起こす前記微生物および前記微生物の前記病原性に依存して変わり得る。その結果、前記微生物の特定が適切な治療には必須である。例えば、敗血症は毎年世界中で２６００万人を超える人々が罹患し、子どもの前記最大の死因であって、毎年５００万人以上が死亡している（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｅｐｓｉｓ．ｏｒｇ／ｆａｑ／“Ｓｅｐｓｉｓ Ｆａｃｔ Ｓｈｅｅｔ”を参照）。集中治療室での敗血症による死亡率は、世界中で４０％～６０％の範囲であり、死因のひとつは患者が最初に不適切な抗生物質療法で治療されたことである。
（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｉｃｉｎｅｎｅｔ．ｃｏｍ／ｓｅｐｓｉｓ／ａｒｔｉｃｌｅ．ｈｔｍ）。これは主に、病原体の型の厳密な診断を得るために最先端の臨床微生物学研究室でさえも数日かかるためである。さらに、最初に間違った治療を受けた患者は、前記疾患の過程で早期から最適の療法で治療された者よりも低い生存率を示し、平均余命が短くなり、生活の質が損なわれている可能性が高い（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｅｐｓｉｓ．ｏｒｇ／ｆａｑ／“Ｓｅｐｓｉｓ Ｆａｃｔ Ｓｈｅｅｔ”）。したがって、微生物に感染した患者における病原体の診断の前記スピードは、患者の予後に著しく影響を及ぼし得る。

前記過去３０年間本質的には主に不変のままである微生物感染の検出のための前記技術の前記現状は、病院または商業的臨床微生物学研究室で前記血液を培養することである。液体培養は１６～３０時間以内に前記流体中で成長するある種類の生物の前記存在の検出を可能にし得る。このアッセイは定量的ではなく、病原体の前記種類およびそれらの特異的抗生物質感受性の知見がなく、広域スペクトル抗生物質しかこの時点で投与することができず、これはせいぜい次善の策である。前記特定のタイプの病原体を特定するために、そして感受性試験を実施して、様々な潜在的抗生物質療法に対するそれらの応答を判定するために、液体培地中で成長する前記病原体を次いで他の成長培地（例えば、寒天プレート）に移さなければならない。完全な診断および感受性試験のための前記合計時間は、通常、３～７日であり、臨床症状に基づく経験的抗生物質治療を前記抗生物質感受性の前記結果が得られる充分前に開始する。

したがって、迅速かつ信頼性のある診断および治療方法は有効な患者のケアに必須である。残念ながら、前述のように、現行の抗菌薬感受性試験技術は概して培養（例えば、約１２～約４８時間）によって前記微生物を前もって単離することを必要とし、そのあとにさらに約６～約２４時間を要するプロセスが続く。例えば、前記タイプの感染に対する確立された診断は、伝統的には血液培養物の接種、１６～２４時間のインキュベーション、固体培地上への前記原因となる微生物の播種、さらなるインキュベーション期間、および１～２日後の最後の同定を含む微生物学的分析を必要とする。早急かつ積極的な治療でさえも、これは感染の前記タイプに応じて患者の予後に著しく影響を及ぼす可能性があり、場合によっては死に至る可能性がある。

正しい治療が施される前に失われる時間経過が患者の転帰において極めて重大な差を生じ得る。したがって、医師にとって、前記感染を引き起こす前記正確な微生物、そしてどの抗生物質が前記治療に有効であるかを迅速に決定することが重要である。現行の方法が答えを出すのに２日以上かかり得るとすると、さらに迅速な抗生物質感受性試験、好ましくは血液サンプル採取後、わずか数時間以内に特定の抗生物質感受性を特定できるものが強く必要とされている。例えば、血液サンプルを採取した後１～３時間、１～５時間、１～１０時間、２４時間未満、または２４時間後。別の例では、血液サンプルを採取し、細菌感染について陽性であると特定された２４時間後。したがって、このタイプの迅速試験によって、医師は前記最初から、次善または完全に無効な抗生物質で開始するのではなく前記最適な薬物療法を開始することが可能になり、したがって臨床応答が大幅に増大する。

細菌感染の患者の治療で直面する別の問題は、抗生物質耐性の結果である。抗菌薬（すなわち、抗菌）耐性は、微生物（すなわち、細菌および／または細菌株）が自発的または遺伝子導入によるかのいずれかで遺伝子変異を獲得すると生じ、微生物を１以上の抗菌剤、すなわち抗生物質の前記治療に対して耐性にする。薬物耐性生物は、第一選択抗生物質に対する耐性を獲得することができ、前記微生物が感受性である第二選択薬剤の前記使用を必要とする。多剤耐性を獲得したいくつかの細菌株の前記場合では、第二、さらには第三選択抗生物質に対する耐性が連続して獲得される。

耐性は自発的もしくは誘導された遺伝子変異、またはコンジュゲーション、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、または形質転換を介した水平遺伝子導入による他の細菌種からの耐性遺伝子の前記獲得の前記形態をとり得る。多くの抗生物質耐性遺伝子はそれらの移動を促進する伝播性プラスミド上にある。抗生物質耐性プラスミドは多くの場合、いくつかの異なる抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を含む。

臨床診療で見られる抗生物質耐性菌感染の前記増大する割合は、ヒトおよび獣医学の両方での抗生物質使用に起因する。抗生物質のいかなる使用も、細菌の集団において進化的選択圧を増加させる可能性があり、耐性菌を繁殖させ、非耐性菌を死滅させる。抗生物質に対して耐性がより一般的になるにつれ、代替的治療に対する多大な必要性が生じている。抗生物質耐性は公衆衛生に対する深刻かつ増え続ける地球規模の問題を引き起こす。抗生物質に対する耐性を有する細菌株の数が増加すると、医薬的支援を必要とする個人は、彼らが必要とする前記適切な治療を受けることができない。

したがって、前記適切な薬物療法の決定に加えて、施される前記薬物療法の前記濃度／投与量を決定することも重要である。したがって、前記本発明の目的は：１）微生物の抗生物質感受性の急速、迅速な決定、および２）前記微生物（複数可）の阻害に必要な前記最低濃度を提供することである。

関連技術の説明
既存の抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）技術は冗長なプロセスである。概して、抗生物質耐性遺伝子を用いてまたは用いないで細菌株を特定、単離、および分化するための最近の慣例は、多くの場合、微生物学実験室での複雑かつ冗長なプロセスを必要とする。前記現行のプロセスでは、細菌を含む、生物学的サンプルは、まず前記実験室に受理される。前記ＢＤ ＰｈｏｅｎｉｘおよびｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ Ｖｉｔｅｘ ２システムのようなシステムを使用して、前記当該技術分野で公知の方法で細菌株を検出することができる。別のプロセスでは、前記生物学的サンプルを次に、滅菌ループを使用して、栄養的にリッチな培地（例えば、溶原性ブロスまたは任意の他の好適なブロス）を含む寒天プレート上に画線した。この寒天プレートは抗生物質で処理したスポットを含む。一旦前記検体を前記プレート上に画線したら、前記寒天プレートを専用のインキュベータ中に最低１２時間入れる。前記寒天プレートを次いで細菌のコロニー成長について定期的にチェックする。当業者には理解されるように、前記生物学的サンプルが細菌を含む場合、細菌のコロニー成長は前記抗生物質を含まない前記スポット上で予想される。前記細菌が抗生物質耐性遺伝子を獲得しなかった場合、前記抗生物質を含む前記スポット上の成長は予想されない。しかしながら、前記細菌株が抗生物質耐性遺伝子を獲得した場合、コロニー成長が前記抗生物質で処理された前記スポット上で起こる。例えば、共同所有の米国特許出願公開第２００８／０２２０４６５号明細書を参照。

別のプロセスでは、生物学的サンプルを集めたら、選別し、標識し、血液寒天培地、または任意の他の好適な栄養的にリッチな成長培地（例えば、溶原性ブロス）を含むガラス製の丸底試験管に、滅菌ループを用いて接種する。前記検体を次いで専用のインキュベータ中に１２～２４時間挿入する。前記サンプルを次いで観察し、陽性（すなわち、細菌を含む）および陰性（すなわち、細菌を含まない）培養物についてスクリーニングする。前記細菌を単離し生化学的流体中に懸濁させるために、陽性培養物を含むと思われるサンプルを処理する。このプロセスは、懸濁、希釈、ボルテックス、および濁度測定を含み、生化学的廃棄物が生じる。前記培養物を次いで種の同定および抗生物質感受性試験に供し、これにより前記細菌懸濁液は複数の試薬に曝露される。さらに６～２４時間のインキュベーション期間後、実験助手が前記知見を解釈し報告する。この全プロセスは概して、検体結果を得るために少なくとも１１以上のステップと少なくとも５０時間かかり、前記プロセスは労働集約的である。

細菌種および／または株を区別し特定する他のプロセスは、様々なタイプの核酸配列決定法を含む。簡単に言うと、ＤＮＡ配列決定は、ＤＮＡ分子内のヌクレオチドの前記正確な順序を決定する前記プロセスである。それは、ＤＮＡのストランド中の前記４つの塩基－アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンの前記順序を決定するために用いられる任意の方法または技術を含む。これらの方法において、一旦生物学的サンプルが得られたら、前記生物学的サンプル中に含まれる前記細菌は、まず増幅する必要がある。言い換えると、前記生物学的サンプルをまず集め、次いで好適な細菌成長培地（例えば、血液成長培地または溶原性ブロス）を接種するために使用する。前記接種されたサンプルを次に適切な条件で１２～２４時間成長させる。成長させたら、細菌細胞を前記培養培地からペレット化し、溶解させ、処理して、前記細菌ＤＮＡを抽出する。細菌ＤＮＡを次いで洗浄し、精製し、そしてＤＮＡシーケンサーに入れる。前記細菌の前記成長および前記細菌ＤＮＡの単離は、試薬を必要とするだけでなく、バイオ廃棄物を生じ、さらに適時プロセスである。さらに、核酸配列決定法はプライマー配列の前記使用を必要とする。プライマーは、ＤＮＡ合成の出発点としての役割を果たす短い核酸配列のストランド（概して約１０塩基対）である。このプロセスを触媒する前記酵素であるＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡの既存のストランドに新しいヌクレオチドを付加することができるだけであるので、それはＤＮＡ複製にとって必要とされる。プライマー配列を必要とすることで、この方法はさらに、細菌株の前記タイプのある最小の知見を必要とする。配列決定は、示されるように、さらに時間がかかり費用が掛かり得る。

一旦前記微生物が特定されたら、前記患者を次に抗生物質で治療する。場合によっては、前記初期濃度／投与量は、抗生物質耐性などの様々な理由のために有効でない可能性がある。結果として、患者が前記適切な抗生物質を前記正しい投与量で受ける前記時間までに、予後は著しく阻害され得る。

米国特許出願公開第２００８／０２２０４６５号明細書

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したがって、以上のことから、それを必要とする患者に有効な治療を迅速に提供するために、迅速な抗菌薬感受性試験法が必要とされる。

発明の概要
前記本発明は、サンプル中の１以上の細菌の最小阻止濃度を決定するための方法であって：
ａ．複数の容器中で複数の細菌懸濁液を調製し、
ｂ．ステップａ．に様々な濃度の抗菌薬を添加し、それによって細菌と抗菌薬との組み合わせを含む複数の懸濁液を作製し、
ｃ．ステップｂ．の細菌と抗菌薬との組み合わせを含む前記複数の懸濁液を好適な温度で好適な時間インキュベートし、それによって細菌と抗菌薬との組み合わせを含む複数のインキュベートされた懸濁液を作製し、
ｄ．ステップｃの前記新しい懸濁液に単一の膜結合色素を添加し、
ｅ．ステップｄ．の前記新しい懸濁液を１以上の励起波長の入射光で照明し、
ｆ．各懸濁液の２つの発光波長の放射光の強度を測定し、
ｇ．各懸濁液のステップｆに基づいた前記スペクトル強度比を決定し、そして
ｈ．前記抗菌剤濃度の関数として前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）を決定することによって、ステップｇ．に基づいて前記最小阻止濃度を決定する、前記ステップを含む方法である。

ステップｈの前記関数は：

の前記形態のステップ関数であり得、式中、ａはスケーリングパラメータであり、ｂは前記ステップ勾配を決定し、ｃは前記ＭＩＣ値である。

前記方法は、スチリル色素またはシアニン色素である前記単一の膜結合色素を含み得、これはＦＭ１－４３であり得る。

前記方法は、３６０ｎｍ～５７０ｎｍの前記範囲内で選択される波長である前記一つの励起波長を含み得る。

前記方法は、５２０ｎｍ～８５０ｎｍの前記範囲内で選択された波長である前記一つの発光波長を含み得る。

前記方法は、体液、例えば血液、尿、または臨床単離株などである前記サンプルを含み得る。

前記方法は、３５℃～４０℃である前記好適なインキュベーション温度を含み得る。

前記方法は、３０分～５時間である前記好適なインキュベーション期間を含み得る。

前記方法は抗菌薬の濃度を変えることを含み得る。抗菌薬の濃度を変えるとは、前記抗菌薬を段階希釈により調製することを意味する。

前記方法は、前記サンプルをまずろ過して前記細菌を濃縮形態で単離し、次いで細菌の固定濃度まで希釈することを含み得る。

前記方法は、前記サンプルをまず遠心分離またはろ過によって濃縮し、次いで細菌の固定濃度まで希釈することを含み得る。

前記方法は前記希釈が液体成長培地で起こることを含み得る。

前記方法は、細菌と抗菌薬との組み合わせを含む前記複数のインキュベートされた懸濁液の各々の部分を除去し、ステップｃ後に新しい容器に前記部分を入れることを含み得る。

前記方法は、ステップｈの前記関数がステップ関数であることを含み得る。

前記本発明はまた、サンプル中の細菌が抗菌治療に対して感受性であるか、耐性であるか、または中間であるかを判定するための第二の方法であって：
ａ．複数の細菌懸濁液を複数の容器中で調製し、
ｂ．ステップａに、様々な濃度の抗菌薬を添加し、それによって細菌と抗菌薬との組み合わせを含む複数の懸濁液を作製し、
ｃ．ステップｂの細菌と抗菌薬との組み合わせを含む前記複数の懸濁液を好適な温度で好適な時間インキュベートし、それによって、細菌と抗菌薬との組み合わせを含む複数のインキュベートされた懸濁液を作製し、
ｄ．ステップｃの前記懸濁液に単一の膜結合色素を添加し、
ｅ．ステップｄの前記懸濁液を１以上の励起波長の入射光で照明し、
ｆ．一つの発光波長の放射光の強度を測定し、
ｇ．ステップｆに基づいて前記スペクトル強度比を決定し、
ｈ．前記抗菌剤濃度の関数として前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）を決定することによって、前記サンプル中の細菌がステップｇ．に基づいた抗菌治療に対して感受性であるか、耐性であるか、または中間であるかを決定する前記ステップを含む方法も含み；前記第二の方法は、細菌と抗菌薬との組み合わせを含む前記複数のインキュベートされた懸濁液の各々の部分を除去し、ステップｃ後に前記部分を新しい容器に入れる前記ステップを含み得る。

前記第二の方法はステップｈの前記関数がステップ関数であることを含み得る。

前記第一および第二の方法の両方における前記照明ステップｅは２以上の波長であり得る。前記第一および第二のステップの前記測定ステップはサイトメーターによって達成することができる。

図１は活性（活性と表示）および不活性大腸菌（不活性と表示）のフローサイトメーター散布図を示す。 図２は、ＦＭ１－４３色素で染色された活性および不活性大腸菌の前記蛍光スペクトルを示す。 図３は、ゲンタマイシンに曝露された肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）の２つの波長の蛍光散布図を示す（活性として示される部分は活性な肺炎桿菌集団を示し、不活性として示される部分は不活性な肺炎桿菌集団を示す）。 図４は、ゲンタマイシンに曝露された肺炎桿菌の抗生物質濃度の関数としてのスペクトル強度比（ＳＩＲ）を示す（円は測定されたスペクトル強度比（ＳＩＲ）を示し、実線は近似されたステップ関数を示す）。 図５はアンピシリンに曝露された肺炎桿菌の２つの波長の蛍光散布図を示す（活性として示された部分は活性な肺炎桿菌集団を意味し、不活性として示された部分は不活性な肺炎桿菌集団を意味する）。 図６は、アンピシリンに曝露された肺炎桿菌の抗生物質濃度の関数としてのスペクトル強度比（ＳＩＲ）を示す（円は測定されたスペクトル強度比（ＳＩＲ）を示し、実線は近似されたステップ関数を示す）。 図７はアンピシリンに曝露された大腸菌の２つの波長の蛍光散布図を示す。 図８は、アンピシリン治療に対して耐性の大腸菌の抗生物質濃度の関数としてのスペクトル強度比（ＳＩＲ）を示す。 図９はゲンタマイシンに曝露された大腸菌の２つの波長の蛍光散布図を示す（活性として示された部分は活性な大腸菌集団を意味し、不活性として示された部分は不活性な大腸菌集団を意味する）。 図１０は抗生物質濃度の関数としての活性および不活性な大腸菌集団を示す（線はそれぞれ活性または不活性で表示される）。 図１１は、ゲンタマイシン治療に曝露された大腸菌についての抗生物質濃度の関数としてのスペクトル強度比（ＳＩＲ）を示す（円は算出されたＳＩＲを意味し、実線は近似されたステップ関数を示す）。 図１２は、ゲンタマイシンに対して耐性のＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉの２つの波長の蛍光散布図を示す（パネル（ａ）対照（未治療）、およびパネル（ｂ）３２μｇ／ｍｌ）。 図１３はゲンタマイシンに対して耐性のＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉの抗生物質濃度の関数としてスペクトル強度比（ＳＩＲ）を示す。 図４、６、および１１は、前記ｙ軸が正規化ＳＩＲであるものを示し、前記ＳＩＲの読みは、通常、前記ＳＩＲデータに基づく前記誤差関数の計算をより簡単にするために－１～１である。

発明の詳細な説明
前記以下の説明は事実上単なる例示であり、前記発明、その応用、または使用を何ら制限するものではない。前記説明は当業者が前記発明を作成し使用することを可能にするように設計され、その最後に具体例を提示しているが、それらは全く限定的と解釈されるべきではない。前記以下に対する様々な修飾は前記添付のクレームの前記範囲内にあることは当業者には明らかであろう。前記本発明は、前記実施例で提供されているかまたは本明細書中の他の箇所で提供されているかに関わらず、前記現在開示されている態様を限定するとみなされるべきではない。

本願で特定される前記様々な範囲内の数値の前記使用は、明確に別段の指示がない限り、前記範囲内の前記最小値および最大値はどちらも「約」という前記語が先行するかのように、近似値として記載される。このようにして、前記範囲より若干上または下の変動を使用して、前記範囲内の値と実質的に前記同じ結果を達成することができる。また、別段の指示がない限り、範囲の前記開示は、前記最小値から最大値の間の各値を含む連続的範囲であることが意図される。本明細書中で使用する場合、「ａ」および「ａｎ」は１以上を指す。

本明細書中で使用する場合、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含まれている（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」という前記用語、およびその変化形は、オープンエンドであり、特定されていない他の要素の前記存在を排除しない。それに対して、「～からなる」という前記用語およびその変化形は、クローズドであることを意図し、微量以外の追加の要素を排除する。

本明細書中で使用する場合、「患者」または「対象」という前記用語は、限定されるものではないが、人間を含む前記動物界の構成要素を指し、「哺乳類」は、限定されるものではないが、人間を含むすべての哺乳類を指す。

本明細書中で使用する場合、「サンプル」という前記用語は、試験または分析される物質を指す。前記サンプルは細菌を含み、様々な供給源から得ることができる。例えば、分析される前記サンプルは液体、半液体、または乾燥サンプルであってよい。前記サンプルは、飲料水、食品もしくは飲料、医薬製品、パーソナルケア製品、または体液から得ることができる。サンプルは、都市用水システム、井戸、携帯用水、廃水、天然水源、レクリエーション水域、または土壌から入手することができる。異なる実施形態では、サンプルは医療機器から得られる。医療機器の例としては、限定されるものではないが、インプラント、貼付剤および心臓弁があげられる。他の例では、サンプルは体液から入手できる。これらには、限定されるものではないが、血液もしくは血漿、唾液、尿、咽喉サンプル、または胃腸液（これらは「生物学的サンプル」とも称される）が含まれ得る。「サンプル」はまた臨床単離株も指す。臨床単離株は、場合によっては、体液から単離され、好適な実験室手段によって保存された細菌を指す。概して、臨床単離株は単離された細菌を指す。したがって、手短に言うと、前記用語「サンプル」は最も広義には細菌の前記存在（または推測上の存在）を指す。ある場合では、前記サンプルは供給源から単離された細菌（例えば、臨床単離株）である可能性があるのに対して、他の場合では、前記サンプルは細菌／微生物剤を有する物質（例えば血液、尿、水など）を指す可能性がある。

本明細書中で使用する場合、「細菌」（ｂａｃｔｅｒｉａｌまたはｂａｃｔｅｒｉｕｍ）および「微生物」（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）という前記用語は前記同じものを指す。すなわち、それらは単細胞、原核生物、微生物を指し、それらは小さく、通常、桿菌または球菌形状であり、疾患を引き起こし得る。細菌によって引き起こされる疾患は、典型的には抗生物質で治療される。さらに、「細菌株」または「細菌単離株」は、前記同じものを指す。さらに、本明細書中で述べるように、「臨床単離株」は、「細菌単離株」と前記同じものを指す。すなわち、株／単離株は細菌の遺伝子変異体、またはサブタイプである。言い換えると、細菌種の一種は、いくつかの異なる株を含み得る。前記株は、抗生物質耐性遺伝子などのさらなる遺伝子の獲得によるなど、遺伝子変異に基づいて異なる。これらの用語は、当業者には理解されるであろう。

本明細書中で使用する場合、「抗菌」および「抗菌性」という前記用語は前記同じものを指す。すなわち、それらは細菌または微生物を殺滅および／および不活性化することができるいかなるものも指す。

本明細書中で使用する場合、「生細胞」、「生細菌」、または「活性細菌」は、成長し分裂する前記可能性を有する細菌細胞を意味する。「死滅した」および「不活性化した」は交換可能に用いられ、死滅した細菌細胞を指す。図１、３、５、７、９、および１０に関して、前記明色のドットまたは線は活性細胞を表し、前記暗色のドットまたは線は不活性細胞を表す（前記図においてそのように示す）。

本明細書中で使用する場合、創傷、欠陥、感染などの前記「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔまたはｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、任意の好適な投与量レジメン、手順および／または投与経路によって、有効なある量の組成物、デバイスまたは構造を、前駆細胞の誘引、創傷の治癒、欠陥の修正などをはじめとする望ましい臨床的／医学的エンドポイントを達成する前記目的で患者に投与することを意味する。

本明細書中で使用する場合、「投与量レジメン」は、投与間の前記時間（例えば、６時間おき）または前記用量（複数可）を投与する前記時間（例えば、毎日午前８時、および午後４時）、ならびに特定時間の各々で投与される医薬の前記量（すなわち、前記濃度）を含む、単位時間あたり、特定の濃度の治療薬の投与の前記スケジュールを意味する。

「治療上有効な量」とは、前記所望の治療結果を達成するために必要な投与量および時間で、有効な量を指す。状態の治療に「有効な量」は、決定可能なエンドポイントを達成するために有効な、本明細書中で記載する前記コアセルベート組成物などの活性剤または投与形態の量である。前記「有効な量」は、少なくとも前記不利益を治療の前記利点が上回る前記程度まで、ならびに／または前記不利益は当業者および／もしくは適切な規制機関、例えば前記米国食品医薬品局に受け入れられる程度まで、安全であることが好ましい。薬物または投与量レジメンの治療上有効な量は、前記個体の前記疾患状態、年齢、性別、体重、および薬物または投与量レジメンが前記個体において所望の応答を誘発する前記能力などの因子に応じて変わり得る。治療上有効な量はまた、薬物もしくは投与量レジメンの毒性もしくは任意の不利益の効果を前記治療上有益な効果が上回るものである。「予防上有効な量」とは、前記所望の予防的結果を達成するために必要な投与量および期間で、有効な量を指す。典型的には、予防量が疾患に先立ってまたは疾患の早期段階で対象において用いられるので、前記予防上有効な量は前記治療上有効な量未満であり得る。

投与量レジメンは、前記所望の至適応答（例えば、治療または予防応答）を提供するように調節することができる。例えば、単一ボーラスを投与することができる、複数に分割された用量を長時間にわたって投与することができる、または前記組成物を連続的またはパルス化された様式で投与することができ、用量または部分用量は一定の間隔で、例えば、１０分おき、１５分おき、２０分おき、３０分おき、４５分おき、６０分おき、９０分おき、もしくは１２０分おき、一日に２～１２時間おき、または一日おきなどで投与され、前記治療状況の前記要件によって示されるように比例して増減することができる。ある場合では、投与を容易にするため、そして投与量の均一性のために、単位投与形態で非経口組成物を処方することが特に有利であり得る。前記発明の前記単位投与形態の前記明細は、（ａ）前記活性化合物の前記独自の特徴および達成されるべき前記特定の治療または予防効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の前記治療に対するそのような活性化合物の配合の前記技術に内在する前記制限により決まり、直接依存する。

ある例では、本明細書中で提供するように、投与量レジメンは、それを必要とする患者に対する１以上の抗生物質および特定濃度および特定時間の前記投与を意味する場合がある。

蛍光分光法は、化学および生化学において分子構造および機能の研究のために広く利用されてきた。しかしながら、微生物同定および特性決定におけるその有効性は、最近になって、前記この２０年で認識されるようになったに過ぎない。

簡単に言うと、当業者には理解されるように、蛍光分光法はサンプルからの蛍光を分析する電磁気分光法の一種を指す。これは、ある特定の化合物の分子中の前記電子を励起し、それらを発光させる光線（例えば、紫外線光）；典型的には、必ずしもそうではないが、可視光を使用することを含む。

死菌と比べて生細菌の前記検出を可能にする蛍光分光法を利用し、さらに、抗生物質が細菌活性を阻害するために必要な前記最低濃度の前記決定を可能にする方法を本明細書中で提供する。

具体的には、サンプルから細菌性微生物のタイプを同定し、投与量レジメンの前記有効性を決定し、そして投与量レジメンの前記最小阻止濃度を決定するための方法を本明細書中で提供する。概して、前記ステップは：細菌を含むサンプルを得、前記サンプルを含む試験管または９６ウェルプレート（第一容器）のセットを準備し；前記サンプルを含む前記試験管またはプレートを様々な濃度範囲（段階希釈によるなど）の抗菌薬とともに好適な温度（例えば、３０℃～５０℃、３５℃～４０℃、または３７℃付近）で所与の時間（例えば、３０分～５時間または２時間～４時間）インキュベートし、インキュベーション後に、前記インキュベートしたサンプルの一部を光学カップ（ｏｐｔｉｃａｌ ｃｕｐ）またはキュベット（第二の、または新しい容器）に移し；好適な蛍光色素を前記試験管／プレートに添加することを含み；前記試験管／プレートを次いで光学分析に供し、前記光学分析はフローサイトメーターを含み、ここで、前記光学分析は、前記流体サンプルを様々な波長で励起し、収集し、前記蛍光発光を検出し；少なくとも２つの波長から発光の強度の前記比を決定し、それによって生細菌の死菌に対する前記比を決定することを含み；前記最小阻止濃度を決定する前記比に基づく。

前記サンプルが、例えば体液である場合では、前記方法はまず、前記以下のステップ：１）前記体液サンプルを得、２）前記サンプルを遠心分離し（例えば、２４×ｇで１５分）、および３）好適なブロス（例えば、カチオン調節ミュラーヒントンブロス（ＣＡＭＨＢ））で前記上清を希釈することを含み得る。

前記サンプルが、例えば臨床単離株である場合。前記方法は、まず、前記以下のステップ：１）前記臨床単離株を得；２）好適な成長培地を含む寒天プレート（例えば、血液寒天プレート）上に前記臨床単離株を画線し；３）前記プレートを一晩３７℃でインキュベートし；４）単一のコロニーを採取し、それらを好適な緩衝溶液（例えば、リン酸塩緩衝食塩水）中に懸濁させ、そして細菌の前記数を０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄ基準に調節することを含み得る。

本明細書中で提供する前記方法は、場合によっては、特定の抗菌薬が所与の微生物を不活性化するために必要な前記最低濃度を決定するために段階希釈に依存する。段階希釈は前記当該技術分野において周知であり、概して溶液中の物質の前記段階的希釈を指す。通常、各ステップでの前記希釈因子は一定であり、その結果、対数的に前記濃度の等比級数が得られる。本明細書中で提供される場合、前記抗菌薬の段階希釈は、前記抗菌薬が前記微生物の不活性化に際して有効であるかどうかを判定し、もしそうであるならば、そして前記微生物を不活性化するために必要な前記最低濃度を決定するために、前記抗菌薬の濃度の範囲の前記試験を可能にする。

本明細書中で提供するように、前記所与の濃度の抗菌薬は微生物ごと（既知の場合）、抗菌薬ごと、前記微生物中の耐性遺伝子の前記存在、または任意の他の因子によって異なり得る。前記段階希釈の各ステップにおける前記抗菌薬の前記濃度は、これらや他の因子に基づいて変わり、限定的特徴であることを意味しない。例えば、前記抗菌薬の前記濃度は、０μｇ／ｍｌ～５ｍｇ／ｍｌの範囲であり得、その間の全ての部分的範囲が含まれる。前記抗菌薬の濃度範囲の一例は、例えば：０（対照サンプル）、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、８μｇｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、３２μｇ／ｍｌ、６４μｇ／ｍｌ、１２８μｇ／ｍｌ、２５６μｇ／ｍｌであり得、その間の全ての部分的範囲を含む。また、希釈は２５６μｇ／ｍｌを上回り得る。

前記方法はさらに色素を含み得る。例えば、細菌を蛍光膜色素、例えばスチリル色素で染色すると、生細菌対不活性細菌の前記発光蛍光は弱くなり、シフトする。そのような現象は、前記生細胞対前記不活性細胞における前記親油性膜環境における前記色素の前記相互作用の前記結果であり得、この場合、前記色素は前記細胞質の前記より親水性の高い環境に挿入される。

色素には、限定されるものではないが、前記脂質二重層中に組み込まれる蛍光色素が含まれる。蛍光色素の例としては、スチリル色素およびシアニン色素が挙げられる。代表的なスチリル色素としては、ＦＭ（登録商標）１－４３、ＦＭ（登録商標）１－４３ＦＸ、ＦＭ（登録商標）４－６４およびＦＭ（登録商標）４－６４ＦＸ、ＦＭ（登録商標）２－１０色素が挙げられる。代表的なシアニン色素としては、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が挙げられる。ＦＭ１－４３は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（＃Ｔ－３５３５６）から購入した、またＳｉｇｍａによって「Ｓｙｎａｐｔｏｇｒｅｅｎ」（＃Ｓ６８１４）として販売されている、Ｎ－（３－トリエチルアンモニウムプロピル）－４－（４－（ジブチルアミノ）スチリル）ピリジニウムジブロミドである。ＦＭ４－６４は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（＃Ｔ－１３３２０）またはＳｉｇｍａから「Ｓｙｎａｐｔｏｒｅｄ」（＃Ｓ６６８９）として購入したＮ－（３－トリエチルアンモニウムプロピル）－４－（６－（４－（ジエチルアミノ）フェニル）ヘキサトリエニル）ピリジニウムジブロミドである。ＦＭ４－６４はグラム陽性色素であり、Ｓｙｎａｐｔｏｒｅｄとしても知られる。

１つより多い色素を使用することができるが、前記本発明の方法は、単一の色素を使用して実施することができる。単一色素の前記使用は前記方法を簡単にするだけでなく、２つの色素の前記存在によって生じる変異性を低減する。

ある場合では、生細菌と不活性細菌とを区別し比較する方法を本明細書中で提供する。前記方法は、スペクトル強度比分析（ＳＩＲ）を使用して実施される。ＳＩＲは、２つの波長で励起した後、放射光の前記強度を測定し、前記２つの波長間で前記放射光の前記比を得る。具体的には、特定の波長で検体が励起されると、生細菌と不活性細菌との間で前記最大発光ピークおよび発光強度の両方において測定可能な差異が明らかになる。したがって、２つの指定された波長での発光強度の前記比またはスペクトル強度比は、生細菌を不活性細菌と区別する手段として使用することができる。ＳＩＲは強度の比に依存するので、ＳＩＲの使用は、使用した色素の前記量および細胞の前記数に依存しないと考えられる。

さらに詳細には、前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）は以下のようにして決定することができる：

式中、Ｉ_λ１＝Ｉ１＝第一波長での発光強度であり、Ｉ_λ２＝I２＝例えば第二波長での発光強度である。

式中、「Ｉ」（発光強度）は各波長での前記散布図の前記平均値である。

この場合、I_{λ＝６１０}は前記６１０ｎｍ波長での前記強度であり、I_{λ＝５３０}は前記５３０ｎｍ波長での前記強度である。I_２＝I_{λ＝６１０}およびＩ_１＝I_{λ＝５３０}はグラム陰性細菌にとって好ましい。低いＳＩＲ値は活性細菌集団に相当し、一方、高い値はより大きな不活性細菌集団を示す。前記I_λは特にグラム陽性細菌について他の波長であり得、この場合、Ｉ２＝I_{λ＝７８０}およびＩ１＝I_{λ＝６７０}であり、I２＝７８０ｎｍおよびＩ１＝６７０ｎｍである。また、前記グラム陽性着色細菌は前記１つの波長、例えば４８８ｎｍ、または２つの波長、例えば、４８８ｎｍおよび５３２ｎｍで照明することができる。適切な色素がグラム陽性細菌について使用される。

前記本発明の前記方法は、前述の様に、インキュベーション後にサンプルの一部を除去し、様々な濃度の抗菌薬を有する前記インキュベートしたサンプルの前記部分をキュベットに移し；好適な蛍光色素を前記キュベットに添加し；次いで前記キュベット中に含まれるサンプルを光学分析に供してＳＩＲを得ることを含み得る。しかしながら、場合によっては、前記色素および測定は、１つの微生物因子とともにインキュベーションした後に、様々な濃度の前記微生物因子を有する前記希釈サンプル中に直接入れることができる。前記本発明の前記方法は、培養に基づいた検証ではなく、単一の細菌レベルに基づいた分析で励起／発光に依存して生細胞を不活性細胞から正確かつ迅速に区別することを可能にし、また区別を成功させるのに１つの色素の前記使用しか必要としない。したがって、前述の様に、前記方法は、場合によっては：前記サンプルを単一の膜結合色素で染色し；前記サンプルを励起において入射光で照明し；各細菌細胞について、（ｉ）波長λ１の放射光の前記強度Ｉ１；および（ｉｉ）波長λ２の放射光の前記強度Ｉ２を測定し；比I２／I１を算出する前記ステップを含み得る。一実施形態において、これは、単一の細胞に関して実施することができ、別の実施形態では、この同じプロセスを１つより多い細胞について実施することができる。さらなるそのような実施形態において、バルク強度を測定して、前記サンプルが生細菌を含むかまたは不活性細菌を含むかを判定することができる。前述の様に、光学分析を、インキュベーションに使用した前記元の試験管とは異なる試験管中で実施してもよい。また、前記励起波長は、好ましくはグラム陰性細菌の前記検体については４８８ｎｍであり、グラム陽性細菌については４８８ｎｍまたは５３２ｎｍであるが、他の励起波長を使用してもよい。

前記発明の前記方法を実施するための前記システムは、好ましくは、前記膜結合色素の励起と前記所定の波長λ１およびλ２での発光強度の測定が可能なデバイス、例えば（限定されないが）、フローサイトメーター、蛍光顕微鏡、または蛍光分析が可能な他の機器である。

前記発光スペクトルプロフィールは分光分析器または発光フィルターで測定される。前記励起波長は約３６０ｎｍ～約６００ｎｍであり、Ｉ１およびＩ２が測定される前記波長は約５２０ｎｍ～約８００ｎｍである。一実施形態において、前記色素ＦＭ１－４３について、前記励起波長は４８８ｎｍであり、Ｉ１およびＩ２が測定される前記発光波長は、それぞれ５３０ｎｍおよび６１０ｎｍである。前記色素ＦＭ４－６４について、前記励起波長は４８８～５７０ｎｍであり得、Ｉ１およびＩ２が測定される前記発光波長は、それぞれ、６７０ｎｍおよび７８０ｎｍである。

フローサイトメトリー（ＦＣＭ）は、ある時間における単一細胞を試験し、したがって、成長曲線などの群全体の効果としてではなく、単一の細菌レベルに対する前記抗生物質の効果の前記検出を可能にする。単一の試験において前記ＦＣＭ部位における前記２つの発光波長チャンネルに関して多数の前記細菌集団を測定することによって、前記抗菌治療が前記細菌状態（ｓｔａｔｅｈｏｏｄ）における変化の初期段階で成功するかどうかを判定することができる。図１は、活性および不活性細菌の前記フローサイトメトリー蛍光測定を示す蛍光ドットプロットである。前記図からわかるように、２つの波長チャンネル（５３０ｎｍおよび６１０ｎｍ）を使用することで、活性および不活性細菌間を区別することが可能になる。スペクトル強度比（ＳＩＲ）算出は、前記６１０ｎｍチャンネルの前記平均蛍光値を、前記５３０ｎｍチャンネルの前記平均蛍光値で割ることによって行われる。活性細菌についてのＳＩＲの典型的な値は０．７～２であり、一方、不活性細菌についての前記値はさらに高い（＞２．５）。

いくつかの実施形態において、前記サンプルは細菌不活化処理、例えば（限定されるものではないが）抗生物質または抗菌治療（本明細書中では抗菌薬とも称する）、塩素不活化、加熱、エタノール、および中圧によるＵＶ照射の成否について分析することができる。さらなる実施形態において、閾値は、前処理サンプルの前記Ｉ２／Ｉ１を取ることによって決定することができ、次いで前記サンプルの前記Ｉ２／Ｉ１と比較して前記細菌不活化処理の有効性を決定することができる。

本明細書中で記載する場合、「最小阻止濃度」または「ＭＩＣ」は、一晩インキュベーションした後の微生物の前記可視的成長を阻害する抗微生物（例えば抗生物質）薬物の前記最低濃度を指す。前記検体は前記試験について適切な数の細胞を確保するために前記プロセス前に培地中でインキュベートする必要があると考えられる。

本明細書中で提示するように、ＭＩＣは、前記ＳＩＲを前記抗菌剤濃度の関数としてプロットし、それを、例えば：

の前記形態のステップ関数に近似することによって算出し、式中、ａ、ｂおよびｃはパラメータであり、ｅｒｆは前記誤差関数である。前記ＭＩＣは前記パラメータｃの前記値である。

他の好適な関数、例えば前記正接関数を使用することができる。前記ＭＩＣグラフで示すような様々な濃度のＳＩＲ（例えば、図１１を参照）、ａ、ｂ、およびｃを個別的ベースで決定する。

細菌には、限定されるものではないが、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌、例えばコリフォーム細菌、腸内細菌、サルモネラ、リステリア、シゲラ、シュードモナス、スタフィロコッカスまたはメタノバクテリウムが含まれ得る。例えば、大腸菌、肺炎桿菌、アシネトバクター、プロテウス・ミラビリス、エンテロコッカス・クロアカ、アエロモナス、クレブシエラ・オキシトカ、エンテロバクター・クロアカ、プロテウス・ミラビリス、およびシトロバクター・フロインディーが含まれ得る。

抗生物質（または抗菌薬）には、限定されるものではないが、アンピシリン、ゲンタマイシン、キノロン（例えば、シプロフロキサシン）、アモキシシリン、カルバペネム（例えば、イミペネム）、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、チカルシリン、バクトリムなどが含まれ得る。

いくつかの態様では、前記サンプルをまずろ過して、前記細菌を濃縮形態で単離し、次いで細菌の固定濃度に希釈する。他の態様では、前記サンプルをまず遠心分離によって濃縮し、次いで細菌の固定濃度に希釈する。前記濃縮細菌の希釈は、液体成長培地などの好適な培地中で起こり得る。

前記本発明は、例示のみを意図する以下の前記実施例においてさらに詳細に説明される。

実施例１：
この実施例では、抗生物質曝露の２～４時間後、１５分の所要時間で血液培養物から直接ＡＳＴおよびＭＩＣを決定するための迅速な方法を提示する。

材料および方法：概して、前記方法には；血液培養遠心分離、２～４時間の細菌抗菌剤曝露、単一の蛍光色素での細菌染色、続いてフローサイトメトリー測定、および数学的解析が含まれる。

サンプル調製－マクロ希釈法
３１の陽性血液培養物は、Ｓｈｅｂａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｒａｍａｔ－Ｇａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）から入手し、ゲンタマイシンおよびアンピシリン抗生物質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を使用して抗菌薬感受性について試験した。合計６２の陽性血液サンプル－抗生物質の組み合わせを試験した。

ａ）陽性血液サンプルをＳｈｅｂａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒから受け取り、２ｍｌの各サンプルを１５分間２４×ｇで遠心分離し、上清をカチオン調節ミュラーヒントンブロス（ＣＡＭＨＢ）で１：１０００に希釈した。
ｂ）抗菌剤ストック溶液をＣＬＳＩ勧告にしたがって調製し、そしてＣＡＭＨＢ中、抗菌剤組み合わせの各々について推奨される前記最高濃度より２倍高い濃度に希釈した（「クラスＩＩ特別管理指針書：抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）システム」、２００９年８月２８日、ＦＤＡ）。
ｃ）サンプル／抗菌剤組み合わせの各々について、試験管のセットを調製し、それに対して、前記第一試験管を除いて、１ｍｌのＣＡＭＨＢ培地を添加した。
ｄ）前記セットの各第一試験管に、前記抗菌剤ストック溶液（ｂ）から２ｍｌを分配した。
ｅ）ＣＬＳＩによって前記必要最低限の濃度になるまで前記第一試験管から、１ｍｌの前記溶液を前記次の試験管に移すことによって、２倍の段階希釈を調製した。試験管の各セットの前記最後の試験管から１ｍｌを捨てた。
ｆ）前記セット中の各試験管に、１ｍｌの細菌サンプル溶液（ａ）を添加した。
ｇ）各段階希釈セットについて、２つの対照を添加した。負の対照として、２ｍｌのＣＡＭＨＢを含む試験管。正の対照として、抗菌薬を含まない細菌サンプル溶液（ａ）を含む試験管。
ｈ）すべての試験管を３７℃でインキュベートした。
ｉ）インキュベーション開始から２～４時間、各試験管からの２００μｌを新しい試験管に移し、２μｌのＳｙｎａｐｔｏｇｒｅｅｎまたはＦＭ１－４３（それぞれ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、フローサイトメーターによって測定した。前記サンプルの前記残りを１６～２０時間さらにインキュベートし、次いで成長について視覚的に評価した。

データ解釈：
ある特定の抗菌剤曝露の前記影響を定量化するために、我々は前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）を次のように定義する：

ここで、（Ｉ）は各波長での前記散布図の前記平均値である。低スペクトル強度比（ＳＩＲ）値は活性細菌集団に相当し、一方、高い値はより大きな不活性細菌集団を示す。単一色素および前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）を使用する前記主な利点は、前記色素濃度および光学効率に対する前記結果依存性の前記排除である。

前記ＭＩＣは、前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）を前記抗菌剤濃度の関数としてプロットし、それを

の前記形態でステップ関数に近似することによって算出される。

式中、ａ、ｂ、およびｃはパラメータであり、ｅｒｆは前記誤差関数である。前記パラメータを使用して前記測定されたＳＩＲをステップ関数に近似し；ａはスケーリングパラメータであり、ｂは前記ステップ勾配を決定し、ｃは前記ＭＩＣ値である。前記ＳＩＲ値は、最良適合近似によって前記ｅｒｆパラメータを決定するために用いられる。

結果：
６２のサンプル（３１の陽性血液培養と２種類の抗生物質の組み合わせ）を三連で分析した。各サンプルを前記フローサイトメーターによって測定し、前記ＭＩＣは前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）計算およびステップ関数評価を用いて算出した。前記サンプル内で同定された前記細菌は；大腸菌（１５サンプル）、肺炎桿菌（６サンプル）、Ａ．ｂａｕｍｍａｎｉｉ（４サンプル）、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ（２サンプル）、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ（２サンプル）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓ ｓｐｐ．（１サンプル）、およびＫ．ｏｘｙｔｏｃａ（１サンプル）であった。

図３は、ゲンタマイシンで処理した肺炎桿菌の蛍光散布図（典型的なフローサイトメトリー測定）を示す。前記図からわかるように、前記抗生物質濃度が前記ＭＩＣより低い限り、前記細菌集団の前記大部分は活性である（前記散布図中で活性と表示）。一旦前記抗生物質濃度が前記ＭＩＣに達したら、前記不活性細菌集団は有意に増加する（前記散布図中で不活性として表示された部分）。前記不活性細菌集団における前記増加は、図４からわかるように前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）を増加させる。抗生物質濃度の関数としての前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）はステップ関数に近似され（図４中の実線）、前記ＭＩＣは１μｇ／ｍｌであると測定される。

同様の結果（図５および６）が肺炎桿菌およびアンピシリンについて得られた。今回、前記ＭＩＣは４μｇ／ｍｌであることが判明した。

アンピシリンに対して耐性であることが判明している大腸菌の株の一例を前記図７および図８で提示する。図７からわかるように、前記フローサイトメトリー蛍光散布図は高い抗生物質濃度でも事実上前記同じのままである。これは前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）（図８）に反映され、前記勾配は負で小さい。

前記以下の表は、この研究における前記方法の前記性能をまとめる。それは９８．４％（６１／６２）の本質的一致を有し（前記ＭＩＣ結果は前記参照方法から±１抗生物質希釈以内である）、１００％カテゴリー的に一致する（「クラスＩＩ特別管理指針書：抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）システム」、２００９年８月２８日、ＦＤＡ）。

表１および表２は前記参照方法として前記マクロ希釈を使用する前記陽性血液サンプル実験の前記結果を提示する。表１からわかるように、前記本質的一致は９８．４％であり、カテゴリー的な一致は１００％である。「クラスＩＩ特別管理指針書：抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）システム」、２００９年８月２８日、ＦＤＡによって定義されるような誤差はない。

表２は、どれほど多くのサンプルが前記参照方法と前記同じＭＩＣ値を示すことによって、前記参照方法の前記ＭＩＣ値からどれほど逸脱するか、そしてどれほど希釈するかによって、前記方法の精度を提示する。表２からわかるように、前記結果の前記大部分は、前記ＭＩＣ値の＋／－１以内であり、これは前記ＦＤＡによって許容される結果である。

この研究は、陽性血液サンプルについての抗生物質感受性試験が、単一色素染色およびフローサイトメトリー測定を用いて実施できることを示す。前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）パラメータを定義し、それを前記抗生物質濃度の関数としてプロットすることによって、前記細菌ＭＩＣおよび、陽性血液サンプルに直接由来するある特定の抗生物質に対して感受性、中間、または耐性であるかを決定することが可能である。前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）法は、２～４時間の抗生物質曝露後１５分以内に実施される。

実施例２：
この実施例では、ＡＳＴの迅速な方法および臨床単離株からのＭＩＣ決定。

材料および方法：我々の方法は、２～４時間の細菌抗菌治療、単一の蛍光色素での細菌染色と、それに続くフローサイトメトリー測定、および数学的解析を含む。前記以下の段落は前記方法を詳細に記載する。

サンプル調製－マクロ希釈法：
ＪＭＩ Ｌａｂｓ（ＬＡ、ＵＳＡ）から購入した、大腸菌、肺炎桿菌、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、およびＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉの３０の臨床単離株を、ゲンタマイシン、アンピシリン、およびシプロフロキサシン抗生物質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を用いて抗菌薬感受性について試験した。合計９０の単離株－抗生物質の組み合わせを試験した。

ａ）全株を５％ヒツジ血液寒天（Ｈｙｌａｂｓ、Ｉｓｒａｅｌ）上で培養し、一夜インキュベーション後、コロニーを収集し、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中に懸濁させた。各細菌溶液を次いで０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄ標準（約１．５×ｌ０^８ＣＦＵ／ｍｌ）に調節した。
ｂ）前記調節した細菌懸濁液をカチオン調節ミュラーヒントンブロス（ＣＡＭＨＢ、Ｈｙｌａｂｓ Ｉｓｒａｅｌ）で１：１００希釈して、約１×１０^６ＣＦＵ／ｍｌの濃度にした。
ｃ）抗菌剤ストック溶液をＣＡＭＨＢ中で、ＣＬＳＩの推奨に従い、各細菌／抗菌剤の組み合わせの前記最高濃度よりも２倍高い濃度から始めて調整した（「抗菌薬感受性試験の性能基準」、Ｍ１００－Ｓ１７、Ｖ．２７、Ｎｏ．１、ＣＬＳＩ）。
ｄ）各細菌／抗菌剤組み合わせについて、１セットの試験管を調製し、それに対して、前記第一試験管を除いて、１ｍｌのＣＡＭＨＢ培地を添加した。
ｅ）前記セットの各第一試験管に、前記抗菌剤ストック溶液（ｃ）から２ｍｌを分配した。
ｆ）各細菌／抗菌剤組み合わせについてＣＬＳＩによる前記必要最低限の濃度まで、１ｍｌの前記溶液を前記次の試験管に移すことによって、前記第一試験管から、２倍希釈の段階希釈を調製した。試験管の各セットにおける前記最後の試験管から１ｍｌを廃棄した。
ｇ）各段階希釈セットについて、２つの対照を添加した。負の対照として、２ｍｌのＣＡＭＨＢを含む試験管。正の対照として、抗菌薬を含まない細菌接種材料を含む試験管。
ｈ）前記セット中の各試験管に、１ｍｌの細菌溶液（ｂ）を添加し、その結果、約５×ｌ０^５ＣＦＵ／ｍＬの最終接種材料濃度となった。
ｉ）全ての試験管を３７℃でインキュベートした。
ｊ）インキュベーション開始から２～４時間、各試験管から２００μｌを新しい試験管に移し、２μ１のＳｙｎａｐｔｏｇｒｅｅｎまたはＦＭ１－４３（それぞれＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、フローサイトメーターによって測定した。前記サンプルの前記残りを１６～２０時間さらにインキュベートし、次いで成長について視覚的に評価した。

データ解釈：
ある特定の抗菌治療の前記影響を定量化するために、我々は以下の様に前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）を定義する：

式中、（Ｉ）は各波長での前記散布図の前記平均値である。

低いスペクトル強度比（ＳＩＲ）値は活性細菌集団に相当し、一方、高い値はより大きな不活性（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅ）細菌集団を示す。単一色素および前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）を使用する前記主な利点は、前記色素濃度および光学効率に対する前記結果依存性の前記排除である。

前記ＭＩＣは、前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）を前記抗菌剤濃度の関数としてプロットし、それを

の前記形態のステップ関数に近似することによって算出される。

式中、ａ、ｂ、およびｃはパラメータであり、ｅｒｆは前記誤差関数である。前記パラメータを使用して、前記測定されたＳＩＲをステップ関数に近似させる；ａはスケーリングパラメータであり、ｂは前記ステップ勾配を決定し、そしてｃは前記ＭＩＣ値である。前記ＳＩＲ値を使用して、前記ｅｒｆパラメータを最良適合近似により決定する。

結果：
９０のサンプル（３０株および３種類の抗生物質組み合わせ）を三連で分析した。各サンプルを前記フローサイトメーターによって測定し、前記ＭＩＣは前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）計算およびステップ関数評価を用いて算出した。

図９はゲンタマイシンで処理した大腸菌の蛍光散布図（典型的なフローサイトメトリー測定）を示す。前記図からわかるように、前記抗生物質濃度が前記ＭＩＣより低い限り、前記細菌集団の前記大部分は活性である（前記散布図および図１０で活性として表示した部分）。一旦前記抗生物質濃度が前記ＭＩＣに達したら、前記不活性細菌集団は有意に増加する（前記散布図および図１０で不活性として表示した部分）。前記不活性細菌集団における前記増加は、図１１からわかるように、前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）を増加させる。抗生物質濃度の関数としての前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）はステップ関数に近似され（図１１中の実線）、前記ＭＩＣは２μｇ／ｍｌであると測定される。

図１２および図１３は、ゲンタマイシンに対して耐性である耐性株、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉの例である。図１２からわかるように、前記フローサイトメトリー蛍光散布図は、事実上、高い抗生物質濃度でも前記同じままである。これは直ちに、前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）（図１３）に反映され、ここで、前記値はほとんど一定のままである。

前記以下の表は、前記方法の前記性能をまとめる。前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）法は９７．８％（８８／９０）の本質的一致（前記ＭＩＣ結果は前記参照方法からの±１抗生物質希釈以内である）と、９２．２％のカテゴリー的な一致（「クラスＩＩ特別管理指針書：抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）システム」、２００９年８月２８日、ＦＤＡ）とを有する。前記唯一の誤差は僅かな誤差であった（「クラスＩＩ特別管理指針書：抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）システム」、２００９年８月２８日、ＦＤＡ）。

表３および表４は、前記参照方法として前記マクロ希釈を使用する前記陽性血液サンプル実験の前記結果を提示する。表３からわかるように、前記本質的一致は９８．４％であり、カテゴリー的な一致は１００％である。「クラスＩＩ特別管理指針書：抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）システム」、２００９年８月２８日、ＦＤＡによって定義されるような誤差はない。

表４は、どれほど多くのサンプルが前記参照方法と前記同じＭＩＣ値であるか、前記参照方法の前記ＭＩＣ値からどれほど逸脱するか、およびどれほど希釈したかを示すことにより前記方法の正確さを提示する。表２からわかるように、前記結果の前記大半は前記ＭＩＣ値の＋／－１以内であり、これは前記ＦＤＡにより許容される結果である。

この研究から、抗菌薬感受性試験は単一色素染色およびフローサイトメトリー測定を用いて実施できることが示される。前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）パラメータを定義し、それを前記抗生物質濃度の関数としてプロットすることによって、前記ＭＩＣおよびそれがある特定の抗生物質に対して感受性であるか、中間であったかまたは耐性であるかを決定することが可能である。前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）法は、２～４時間の抗生物質治療後１５分以内に実施される。前記例は血液培養物を含むが、尿または臨床単離株において見出されるものなど、他の細菌を決定するためにも同様に使用できる。

前記本発明の態様は、前記特定の細菌が前記ＭＩＣの前記決定前に同定される必要はない。しかしながら、前記細菌の予備分類は、参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第８，３０９，８９７号、同第８，８０４，１１４号、同第８，８０８，６４９号、および同第８，５１９，３５８号に記載されている前記Ｐｏｃａｒｅｄ Ｐ１０００などの分析器を用いて実施することができる。また、前記血液または尿の前記初期濃縮は、前記特定された特許に記載されている遠心分離により、または、これもまた参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／００９３２０７号、同第２０１２／０１９６２７１号、同第２０１４／０２４６３８９号および同第２０１５／０１５２４６７号に記載されているなどのろ過により行うことができる。

前記本発明を前記実施例および詳細な説明に関して記載してきたが、当業者は前記発明の前記主旨の範囲内で変更が可能であることを理解するであろう。したがって、前記本発明は、詳細な実施において多くの変更が可能であり、それは当業者によって本明細書中に含まれる前記記載から誘導され得る。

Claims (23)

1. 抗菌薬の、サンプル中の１以上の細菌に対する最小阻止濃度を決定する方法であって：
   ａ．複数の容器中で複数の細菌懸濁液を調製し、
   ｂ．ステップａの懸濁液に、様々な濃度の抗菌薬を添加し、それによって細菌と抗菌薬との組み合わせを含む複数の懸濁液を作製し、
   ｃ．ステップｂの細菌と抗菌薬との組み合わせを含む前記複数の懸濁液を、好適な温度で好適な時間インキュベートし、それによって細菌と抗菌薬との組み合わせを含む複数のインキュベートされた懸濁液を作製し、
   ｄ．ステップｃの懸濁液に、単一の膜結合色素を添加し、
   ｅ．ステップｄの懸濁液を１以上の励起波長の入射光で照明し、
   ｆ．各懸濁液の２つの発光波長での放射光の強度を測定し、
   ｇ．各懸濁液のステップｆに基づく前記２つの発光波長での放射光の強度比であるスペクトル強度比と抗菌薬の濃度との対応関係を決定し、
   ｈ．ステップｇにおいて決定した前記対応関係を、ステップ関数に近似できる関数で近似し、当該関数に基づいて前記最小阻止濃度を決定する方法。
2. ステップｈの前記関数が：
   

   

   の形態であり、式中、ｘは前記抗菌薬の濃度であり、ｙは前記スペクトル強度比であり、ａ、ｂ、およびｃはフィッティングにより決定される定数であり、ｃを前記最小阻止濃度として決定する、請求項１に記載の方法。
3. 前記単一の膜結合色素がスチリル色素またはシアニン色素である、請求項１に記載の方法。
4. 前記単一の膜結合色素がＦＭ１－４３である、請求項１に記載の方法。
5. 前記１つの励起波長が３６０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲で選択される波長である、請求項１に記載の方法。
6. 前記一つの発光波長が５２０ｎｍ～８５０ｎｍの範囲で選択された波長である、請求項１に記載の方法。
7. 前記サンプルが体液である、請求項１に記載の方法。
8. 前記サンプルが血液または尿である、請求項７に記載の方法。
9. 前記サンプルが臨床単離株である、請求項１に記載の方法。
10. 前記好適なインキュベーション温度が３５℃～４０℃である、請求項１に記載の方法。
11. インキュベーション時間の前記好適な期間が３０分～５時間である、請求項１に記載の方法。
12. 抗菌薬の濃度を変えることは、前記抗菌薬が段階希釈によって調製されることを意味する、請求項１に記載の方法。
13. 前記サンプルをまずろ過して濃縮形態で前記細菌を単離し、次いで細菌の固定濃度に希釈する、請求項１に記載の方法。
14. 前記サンプルをまず遠心分離によって濃縮し、次いで細菌の固定濃度に希釈する、請求項１に記載の方法。
15. 前記希釈が液体成長培地で起こる、請求項１３に記載の方法。
16. 前記希釈が液体成長培地で起こる、請求項１４に記載の方法。
17. 前記方法が、細菌と抗菌薬との組み合わせを含む前記複数のインキュベートされた懸濁液の各々の一部を除去し、前記部分をステップｃの後に新しい容器中に入れることを含む、請求項１に記載の方法。
18. サンプル中の細菌が抗菌治療に対して感受性であるか、耐性であるか、または中間であるかを判定するための方法であって：
    ａ．複数の容器中で複数の細菌懸濁液を調製し、
    ｂ．ステップａの懸濁液に様々な濃度の抗菌薬を添加し、それによって細菌と抗菌薬との組み合わせを含む複数の懸濁液を作製し、
    ｃ．ステップｂの細菌と抗菌薬との組み合わせを含む前記複数の懸濁液を、好適な温度で好適な時間インキュベートし、それによって細菌と抗菌薬との組み合わせを含む複数のインキュベートされた懸濁液を作製し、
    ｄ．ステップｃの懸濁液に、単一の膜結合色素を添加し、
    ｅ．ステップｄの懸濁液を単一励起波長の入射光で照明し、
    ｆ．２つの発光波長の放射光の強度を測定し、
    ｇ．各懸濁液のステップｆに基づく前記２つの発光波長での放射光の強度比であるスペクトル強度比と抗菌薬の濃度との対応関係を決定し、
    ｈ．ステップｇにおいて決定した前記対応関係を、ステップ関数に近似できる関数で近似し、当該関数に基づいて前記サンプル中の細菌がステップｇに基づく抗菌治療に対して感受性であるか、耐性であるか、または中間であるかを判定する前記ステップを含む、方法。
19. 前記方法が、細菌および抗菌薬の組み合わせを含む前記複数のインキュベートされた懸濁液の各々の部分を除去し、前記部分をステップｃ後に新しい容器に入れる前記ステップを含む、請求項１８に記載の方法。
20. ステップｅの前記照明が２以上の波長においてである、請求項１に記載の方法。
21. 照明ステップｅが２以上の波長においてである、請求項１８に記載の方法。
22. 測定ステップｆがサイトメーターを使用する、請求項１に記載の方法。
23. 測定ステップｆがサイトメーターを使用する、請求項１８に記載の方法。

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