JP7159055B2 - ヒト神経細胞及びグリア細胞の機能的ネットワークを形成する方法 - Google Patents

Description

本発明は、以降、ニューロンネットワークとも呼ばれる、ヒト神経細胞及びグリア細胞の機能的ネットワークを形成する方法に関する。この方法は、ニューロンネットワークの形成の監視に使用することができ、これに関連して、特に、ヒトの脳におけるニューロン及び／又はニューロンネットワークの形成に影響を与える疾患のモデリングに使用することができる。

D.Y. Kim et. al., A three-dimensional human neural cell culture model of Alzheimer’s disease, Nature 2014, 515, 274-278による最近の研究は、０．３ｍｍ以下の全軸平面を有する３次元薄層培養物を提供するために、BD BiosciencesのMatrigel（登録商標）に埋め込まれた遺伝子組換えヒト細胞を発表している。分化したニューロンは、４～１２週間生存可能で機能的であった。Dawai Zhang et. al., A 3D Alzheimer’s disease culture model and the induction of P21-activated kinase mediated sensing in iPSC derived neurons, Biomaterials 2014 Feb; 35 (5), 1420-1428による同様の研究は、ヒト人工多能性幹細胞に由来する神経上皮幹細胞株（Ｉｔ－ＮＥＳ）系統ＡＦ２２の使用及びそれらの神経系統への分化を報告した。さらに、BD BiosciencesのPuraMatrix（登録商標）から調製して、１０μｇ／ｍＬのラミニンで修飾されたヒドロゲルを使用した。この培養系は、自己組織化アルギニン－アラニン－アスパラギン酸－アラニン（ＲＡＤＡ１文字コード）ペプチドによる非共有相互作用によって架橋されたヒドロゲル系に基づいている。ヒドロゲルの機械的性質は、比較的弱い非共有結合相互作用のために限定された範囲でのみ調整可能であり、特定の酵素に感受性のある切断部位も存在しない。BD-PuraMatrix（登録商標）では細胞の分離が不可能であるため、この培養系は、細胞応答微小環境を提供しない。埋め込まれた細胞の増殖に必要なヒドロゲルの再構成は、ペプチドの非特異的分解によって、従ってヒドロゲルマトリックス全体の分解によってのみ達成することができる。従って、Zhangらによる研究によると、細胞の３Ｄ培養は、非常に短い期間、例えば２～４日間しか行うことができない。Zhangによる刊行物において、「長期培養は、材料の低い剛性により技術的に困難である」と明確に指摘されている。加えて、動物源から得られたラミニンの混合物の結果として、不純物のリスク及び製品の品質におけるバッチごとの変動を受ける十分に定義されていないタンパク質が、調製（方法）の再現性に強い疑念を生じさせ得るアッセイの構成要素となる。さらに、材料の長いゲル化時間（ゲル形成時間）（２０～３０分）の結果として、埋め込まれた細胞の局所的な分離の影響（demixing effect）及び不均一性が生じ得る。

S. Koutsopoulos et. al., Long-term three-dimensional neural tissue cultures in functionalized self-assembling peptide hydrogels, Matrigel and Collagen I, Acta Biomater. 2013, Feb; 9 (2); 5162-5169は、マウス神経細胞を培養した、PuraMatrix（登録商標）に類似した非細胞応答性自己組織化ペプチドの調製を開示している。JY Sang et. al., Simple and Novel Three Dimensional Neuronal Cell Culture Using a Micro Mesh Scaffold, Exp Neurobiol. 2011 Jun; 20 (2); 110-115による研究は、足場として合成されたナイロン繊維を使用する３次元神経培養を記載している。神経細胞をアガロースと混合し、次いで、ナイロン繊維の上にプレーティングする。このような技術は、発達中の脳のインビボ環境を再生するのに適していない細胞応答環境で細胞がカプセル化される人工環境を提供する。

米国特許第６，３０６，９２２Ａ号及び同第６，６０２，９７５Ａ号は、生分解性である光重合ヒドロゲルを記載している。しかしながら、ＵＶスペクトルに近い波長での重合は、フリーラジカルの生成により、細胞培養系において細胞死及びＤＮＡ突然変異を引き起こし得る。重合は通常の実験室条件下でＵＶ光なしで実施されるため、本発明による系では、ＵＶ波長に起因する細胞損傷は予期されない。さらに、ＵＶ誘導光重合が排除されるため、重合を生じさせる特殊な機器を必要とせず、高度に特殊化された実験室以外での本明細書に記載のヒドロゲル系の使用がはるかに容易である。

本発明の目的は、ヒト起源の細胞を用いるインビトロ系又は方法におけるモジュールを開発することにあり、この系又は方法は、上述の先行刊行物と比較して実質的に改善され、かつ３次元マトリックスにおいて機能的なニューロンネットワークを形成する。このような系の最も重要な評価基準は、中枢神経系の神経組織にインビボ状況を可能な限り再現することを目的としたニューロンネットワークの質である。さらに、この系は、取り扱いが容易であり、例えば移植手順であっても、高度に特殊化された実験室を用いずに、使用についてより安全な見通しを提供することを目的とする。

この目的は、請求項１に記載のヒト神経細胞及びグリア細胞の機能的ネットワークを形成する方法の形態で達成される。さらなる開発は、従属請求項に規定されている。さらなる請求項は、本方法の使用に関する。

本発明によると、ヒト神経細胞及びグリア細胞の機能的ネットワークを形成するための方法において、細胞が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びヘパリンの成分を含有する合成ヒドロゲル系に導入され、その中で培養された。これに関連して、細胞は、ＰＥＧ又はヘパリンのいずれかであるゲル成分の１つと共にＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲル系に導入され、この細胞が事前に混合され、この結果、３次元ヒドロゲルの重合中にヒドロゲル系中にこの細胞が既に存在する。

有利には、この方法では、ヒト神経細胞は、グリア細胞と共培養され、このヒト神経細胞は、ヒト神経幹細胞及び前駆細胞である、又はヒト不死化神経前駆細胞株に由来する、又は中脳から得られた初代ヒト神経前駆細胞である。

有利な実施形態によると、ヒト神経細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）由来のヒト神経幹細胞及び前駆細胞であるか、又は初代ヒト皮質細胞に由来する。

形成されたネットワークの機能は、特に、成熟神経皮質マーカーの発現、例えばカルシウム流入の形態の神経伝達物質に対する応答性について、及び電気生理学的活性について説明可能である。

本発明の好ましい実施形態によると、ＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲル系は、多アームポリエチレングリコール（スターＰＥＧ）含有スターＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲル系であり、このスターＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲル系は、酵素的に切断可能なペプチド配列、好ましくはマトリックスメタロプロテイナーゼによって切断可能なペプチド配列（ＭＭＰペプチド）を介して架橋され、結果として、このスターＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲル系は、切断可能であり、かつ局所的に再構成可能である。４アームポリエチレングリコール（４アームスターＰＥＧ）は、多アームポリエチレングリコールとして特に好ましい。

一実施形態では、ヒドロゲルのヒドロゲルマトリックスは、チオール末端スターＰＥＧ－ペプチドコンジュゲートとマレイミド、好ましくは４～６個のマレイミド基によって官能化されたヘパリンとの共有結合架橋によって形成される。これに関連して、ヒドロゲルマトリックスは、マイケル付加によって架橋される。

あるいは、スターＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲル系のヒドロゲルマトリックスは、自己組織化によってヘパリン及び共有結合スターＰＥＧ－ペプチドコンジュゲートから非共有結合的に形成される。これに関連して、スターＰＥＧ－ペプチドコンジュゲートは、ポリマー鎖に結合された２つ以上のペプチドのコンジュゲートを含む。ペプチド配列は、繰り返しジペプチドモチーフ（ＢＡ）_ｎを含み、Ｂは、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸であり、Ａは、アラニンであり、ｎは、５～２０の整数、好ましくは５又は７である。

本発明の特に有利な実施形態によると、ヒドロゲルは、貯蔵弾性率によって特徴付けられる可変機械的性質を有する。好ましくは、貯蔵弾性率は、３００～６００パスカルの範囲内で変更可能である。貯蔵弾性率の範囲は、例えば、２つの材料の成分の混合比率を調整することによって、すなわち架橋度を変更する（ヘパリンに対するＰＥＧのモル比を変更すると同義）ことによって、又は材料成分の固形分含有量、すなわちポリマー出発材料の濃度を変更することによって変更することができ、好ましくは振動レオメトリーによって決定される。

本発明の好ましい実施形態では、ＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲル系は、シグナル伝達分子及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のタンパク質に由来する機能性ペプチド単位、好ましくは接着ペプチドで修飾される。

本発明のさらなる実施形態によると、ヒト神経細胞及びグリア細胞は、ヒト間葉系間質細胞及び内皮細胞と一緒に共培養され、これらの細胞は、ヒト神経細胞及びグリア細胞と共局在化する。

この方法では、有利に、遺伝子組換えされていないヒト神経幹細胞を使用することが可能である。細胞は、ヒドロゲル、好ましくはスターＰＥＧヘパリンヒドロゲル中で自然に成熟して、神経マーカータンパク質に対して陽性である完全に分化した神経細胞のサブタイプ、例えばＣＴＩＰ２＋、ＳＡＴＢ２＋、及びＴＡＵ＋を形成する。さらに、培養物は、ＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲルを使用すると、１０週間を超えて生存し得る。

本発明による方法では、急速なヒドロゲル形成、すなわち３０秒から最大２分のヒドロゲル形成により、不都合な局所的な分離の影響及び不均一性が回避される。急速かつロバストなヒドロゲル形成は、本発明による方法の主な利点である。

本発明のさらなる態様は、本発明による方法によって得ることができるヒト神経の３次元機能的ネットワークに関する。この方法の使用の結果として、個々のニューロンを３次元ネットワークに連結することができ、これらのニューロンは、生理学的に関連する細胞機能を示した。例えば、０．１８ｍｍ^３の体積では、２００を超えるサブネットワークが発生し、これらのサブネットワークは、互いに連結されていた。これに関連して、各サブネットワークは、合計１２，０００を超える分岐を有していた。本発明による３次元細胞培養系では、後に例示的な実施形態で詳述されるように、強いネットワークの形成、並びに分化したニューロン及び共局在化した異なるタイプのグリア細胞を伴う神経分枝を検出することが可能であった。

ヒドロゲル系を使用する本発明による方法は、以下を可能にする：
・ヒト３次元ネットワーク構造、並びに特に形態、細胞型、及び分化に関するヒトニューロンネットワークの機能の再現、
・細胞培養物の安定性が保証され、この結果、細胞培養物がより長い培養期間にわたって生存し、特に長期間の分析中に安定性を維持する、
?ヒドロゲルマトリックス、生体分子組成、及び貯蔵弾性率などの物理的特性の正確な調節又は調整、この結果、様々な外因性細胞誘導性シグナル及びシグナル伝達物質、例えば可溶性因子、細胞外マトリックスの成分、及び機械的性質を、ニューロンの発達及び疾患のモデリングについて試験することができる、
・インビボ条件下と同様の、形成されたニューロンネットワークの活性成分に対する応答、従って費用のかかる動物実験モデルに取って代わる可能性の提供、加えて、より信頼できるアッセイ方法の治療用活性成分も提供する、
・ニューロン細胞の電気生理学的活性及び膜チャネル活性の決定、
・３次元ニューロンネットワークにおけるシグナル伝達線及び神経回路を研究することができるようにするための、例えば高解像度画像及び記録技術を用いた個々の細胞の分析、
?特にニューロンネットワークの発達過程のリアルタイム分析、
・臓器模倣薬（organ mimetic）を開発するための、例えばプリンティングなどのアレイ技術及び帯状不均一性（zonal heterogeneity）、
・患者に由来する細胞を用いたオーダーメイド医療の有用性、
・インビボ様条件下での、ニューロンネットワーク形成及び血管形成の相互作用を研究するための内皮細胞との共培養、
・単一細胞アッセイ、インビトロ細胞増殖、及び移植目的のための必要な個々の細胞の取り出し、
・非毒性の生分解性材料の移植、
?１０週間を超える長期培養、
・ニューロンネットワークの変化及び進行並びに細胞数の定量化。

本発明のさらなる態様は、ニューロンネットワークの形成を監視するための本発明による方法の使用に関する。従って、特に３次元ヒドロゲル系における細胞培養物が透明であるため、ニューロンネットワーク形成のリアルタイム監視が可能である。

本発明による方法を用いたネットワーク形成の監視は、ニューロンネットワーク内の神経細胞の細胞増殖、長さ、分岐の数と密度、及び／又は結合性、及び／又は電気生理学的活性の定量分析を可能にする。

すなわち、ヒトの脳におけるニューロン及びニューロンネットワークの形成に影響を及ぼす疾患、神経系の発達障害、又は神経変性疾患のモデリングも可能である。

これに関連して、この方法の特に有利な使用は、疾患関連タンパク質凝集体、例えばアミロイドβ４２によって引き起こされる神経毒性のモデリング及び／又は神経幹細胞の可塑性の変更における使用である。

本発明による方法を用いたネットワーク形成の監視はまた、神経活動及び／又はネットワーク形成に影響を与える分子及び／又は活性成分又は薬剤の試験にも適している。

本発明の実施形態のさらなる詳細、特徴、及び利点は、添付の図面を参照した例示的な実施形態の以下の説明によって明らかにされる。

図１は、ヒドロゲルを調製するための例示的な一実施形態の絵図を示している。 図２は、３週間にわたるニューロンネットワーク成熟の顕微鏡写真を示している。 図３は、高密度の神経細胞及びグリア細胞のネットワークを含む３週間経過したゲルの広範な３次元表現を示している。 図４は、シナプトフィジン（Ｓｙｎ）及びアセチル化チューブリン（ａＴｕｂ）に対するカプセル化ニューロンの免疫反応性を示している。 図５は、神経伝達物質グルタミン酸の添加前後の全蛍光強度の測定を示している。 図６は、様々なマーカー／色素を使用した３週間経過した細胞を含むヒドロゲルの三重染色を示している。 図７は、細胞培養の開始から１週間後の、埋め込まれた細胞と合成ヌクレオシドブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）とのインキュベーションの結果を示している。 図８は、新たに形成されたニューロンに由来する様々なニューロンのサブタイプの形成を示している。 図９は、ヒドロゲル中に埋め込まれ、増殖により新たに形成された、３週間後の神経幹細胞及び前駆細胞を示している。 図１０は、ヒト神経幹細胞及び前駆細胞（ＮＳＰＣ）の成熟分化状態のさらなる証拠としてのニューロフィラメントの発現を示している。 図１１は、初代ヒト皮質細胞（ＰＨＣＣ）におけるアミロイドβ４２ペプチドの影響を研究するためのＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲルの調製の絵図を示している。 図１２は、ニューロンの細胞質マーカータンパク質としてのアセチル化チューブリンに対する抗体、ペプチド凝集のためのマーカーとしてＡβ４２、及びグリア細胞の細胞質マーカーとしてＧＦＡＰを用いたヒドロゲルの三重免疫染色を示している。 図１３は、Ａβ４２（Ａ）を用いず、細胞内Ａβ４２（Ａ’）及び細胞外Ａβ４２（Ａ’’）を用いたヒドロゲル中の骨格結合ニューロン経路の最大強度投影を示している。 図１４は、（Ａ）人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）及び（Ｂ）初代ヒト皮質細胞（ＰＨＣＣ）に由来する、ヒドロゲル中に含まれるヒト神経幹細胞及び前駆細胞（ＮＳＰＣ）の、抗体を用いたアセチル化チューブリン（Acet. Tubulin、画像Ａ／Ｂ）及びＧＦＡＰ（画像Ａ’’／Ｂ’’）での二重免疫染色、及び核染色（ＤＡＰＩ、画像Ａ’／Ｂ’）を示している。 図１５は、顕微鏡画像及び定量的評価によるｉＰＳＣ由来のヒト神経幹細胞及び前駆細胞（ＮＳＰＣ）（Ａ）又はＰＨＣＣ由来のヒト神経幹細胞及び前駆細胞（ＮＳＰＣ）（Ｂ）のニューロン突起の最大強度投影の比較を示している。 図１６は、Ａβ４２毒性に対するインターロイキン４の効果の研究のための、スターＰＥＧ－ＨＥＰゲル及びその中に埋め込まれたＰＨＣＣの比較顕微鏡写真を示している。 図１７は、グリア細胞集団（ＧＦＡＰ）、ニューロンネットワーク形成（Acet.Tubulin）、及び幹細胞集団（ＳＯＸ２）、及び神経可塑性の能力の比較のための、埋め込まれたＰＨＣＣを含むMatrigel及びスターＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲルの顕微鏡写真を示している。

図１は、ヒドロゲルの調製のための例示的な一実施形態の概略図を示している。前記図面によると、初代ヒト皮質細胞（ＰＨＣＣ）が使用される。これらは、最初にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でヘパリンと一緒にされる。ヘパリン以外のヒドロゲルのさらなる成分として、前記図面では、４アームポリエチレングリコール（スターＰＥＧ）と酵素的に切断可能なペプチドとのコンジュゲートが使用され、このＰＥＧは、ペプチド分子と各アームでコンジュゲートしている。前記成分は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でヘパリン及び細胞と一緒にされる。ヒドロゲルのヒドロゲルマトリックスは、チオール末端（システイン側鎖、略してｃｙｓ）スターＰＥＧ－ペプチドコンジュゲートとマレイミド官能化ヘパリンとの共有結合架橋によって形成され、このヒドロゲルマトリックスは、マイケル付加によって架橋されている。

いくつかの以下の図面はそれぞれ、顕微鏡画像を示しており、どの図面でも、右下に記号を確認することが可能である。前記記号は、上方から又は側方から円筒形のヒドロゲルを見ている目である。

上方を見ている目は、記号によって印が付けられた画像がｚ軸上の一連の画像の最大強度投影の画像であることを意味する。

側方から見ている目は、記号によって印が付けられた画像がｘ軸上の一連の画像の最大強度投影の画像であることを意味する。

図２は、３週間の期間にわたるニューロンネットワークの成熟を示している。細胞質グリア細胞マーカーＧＦＡＰ（「グリア線維性酸性タンパク質」の名称に由来）の染色により、グリア細胞の細胞質を標識し、この細胞質が、ニューロンと比較して増加したことを明らかにした。ニューロンの細胞質は、アセチル化チューブリン（ａＴｕｂ）で染色される。画像Ａ～Ａ’’はそれぞれ、埋め込みの１週間後の埋め込まれた細胞の状態のｚ軸を通る最大強度投影の典型的な画像を示している。画像Ｂ～Ｂ’’はそれぞれ、埋め込みの２週間後の埋め込まれた細胞の状態のｚ軸を通る最大強度投影の典型的な画像を示している。画像Ｃ～Ｃ’’はそれぞれ、埋め込みの３週間後の埋め込まれた細胞の状態のｚ軸を通る最大強度投影の典型的な画像を示している。第１行では、ＧＦＡＰ及びａＴｕｂ陽性細胞の組み合わせ染色を確認することができる。第２行及び第３行では、それぞれの場合にマーカーａＴｕｂ及びＧＦＡＰに陽性反応する細胞を確認することができる。

図３は、高密度の神経細胞及びグリア細胞のネットワークを含む３週間経過したゲルの広範な３次元表現を示している。ＧＦＡＰで染色されたグリア細胞は、アセチル化チューブリン（ａＴｕｂ）で染色されたニューロンと密接に相互作用し、インビボ状況で生じる現象である。細胞核の色素４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（略してＤＡＰＩ）で二本鎖核ＤＮＡを標識する。ＤＡＰＩ標識細胞は、評価のために試料を固定した時点で生存していた。図３の画像Ａは、ａＴｕｂ及びＤＡＰＩに対して二重陽性であるニューロンの広範なネットワークを示している。画像Ｂは、ＧＦＡＰ及びＤＡＰＩに対して二重陽性であるグリア細胞の広範なネットワークを示している。

図４は、機能的なニューロンにおいてインビボでも生じるように、埋め込まれたニューロンの細胞間接合部及びシナプスボタンにおいて明らかに高度な免疫反応性を示している。これに関連して、画像Ａ～Ａ’及び画像Ｂ～Ｂ’は：アセチル化チューブリン（ａＴｕｂ）及びシナプトフィジン（Ｓｙｎ）で二重染色された細胞を示している。ＤＡＰＩで細胞核を染色する。画像Ａに示されているように、ａＴｕｂは、矢印で明示されているニューロン１及び２の突起を染色し、円はニューロン１と２の接合部を示している。画像Ａ’では、シナプトフィジン（Ｓｙｎ）染色は、画像Ａで標識されたニューロン１及び２の接合部における複数のシナプス点として現れる。画像Ｂは、シナプスボタンに当接しているニューロン突起を高倍率で示している。画像Ｂ’は、画像Ｂのシナプスボタンがシナプトフィジン（Ｓｙｎ）とどのように陽性反応するかを示している。

図５は、神経伝達物質グルタミン酸の添加の場合の総蛍光強度の測定結果を示している。これに関連して、画像Ａ１は、画像Ａ（Ａ２）の細胞１、２、及び３によって放出された、神経伝達物質グルタミン酸の添加の前（－グルタミン酸）と後（＋グルタミン酸）の総蛍光強度の測定結果を示している。画像Ａ２の細胞１、２、３は、添加グルタミン酸に対する応答として細胞が細胞内カルシウム流入を示したときに強い蛍光シグナルを生成するカルシウムセンサーＧｃａｍｐｆ６でトランスフェクトされた。このために、増加した蛍光シグナルが、Ａ１のグラフ上で観察することができ、これは、インビボ状況でも生じるように、トランスフェクト細胞が神経伝達物質の存在下で反応することを意味している。画像Ａ２の細胞は、神経伝達物質グルタミン酸の添加前にＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲル系に埋め込まれている。画像Ａ３及び画像Ａ４は、ＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲル系に埋め込まれたＧｃａｍｐｆ６トランスフェクト細胞を高倍率で示している。画像Ａ３は、グルタミン酸の添加の前の細胞を示している。画像Ａ４は、グルタミン酸の添加後に、カルシウムイオンの流入により強いシグナルが測定されることを示している。

図６は、ニューロン細胞質マーカーβ－ＩＩＩ－チューブリン（ＴＵＢＢ３）、細胞質グリア細胞マーカーＧＦＡＰ及びＤＮＡ色素４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）に対する免疫反応性を有する３週間経過した細胞含有ヒドロゲルの三重染色を示している。クラスター化された細胞の様々な形態学的特性：画像の左上における明確に配向された細胞突起、及び左中央におけるグリア細胞と混合された格子ニューロンネットワークを識別することが可能である。画像Ａ’～Ａ’’’は、ＴＵＢＢ３、ＧＦＡＰ、ＤＡＰＩの光チャネルの個々の画像を示している。

ＰＥＧ－ヘパリンゲルに埋め込まれた細胞の培養の開始から１週間後に、前記細胞を合成ヌクレオシドブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）と共に３時間インキュベートした。結果は、図７で確認することができ、矢印はそれぞれ、染色された細胞を指している。画像Ａは、抗ＢｒｄＵ抗体で染色された細胞（細胞核の染色）を示している。画像Ａ’は、抗ＢｒｄＵ抗体で染色された細胞も、細胞質ニューロンマーカータンパク質アセチル化チューブリン（ａＴｕｂ）に対して陽性であることを示している。図７は、ＢｒｄＵ染色を用いて、ヒドロゲルに埋め込まれた細胞が増殖し、ニューロン同一性（Ａｃｅｔ．Ｔｕｂ．染色細胞）を有することを示している。

図８は、様々なニューロンのサブタイプが、ヒドロゲルに埋め込まれて、その中で新たに形成されたニューロンから生じ、このサブタイプは、ニューロン細胞の分化の過程でインビボでも生じる細胞型に類似していることを示している。これに関連して、画像Ａは、ヒドロゲル系中の細胞が、「Achaete-scuteファミリーｂＨＬＨ転写因子１」、ＡＳＣＬ１という名称でも知られている神経前駆細胞マーカーＭＡＳＨ１、及びダブルコルチン／ＤＣＸに対して二重陽性であることを示している。画像Ａ’及び画像Ａ’’は、ＤＣＸ及びＭＡＳＨ１染色のための個々の光チャネルを示している。

図９は、ヒドロゲルに埋め込まれて、増殖により新たに生成される神経幹細胞及び前駆細胞が、３週間以内に成熟して、成熟皮質ニューロンのマーカータンパク質、例えばＣＴＩＰ２及びＳＡＴＢ２を発現する細胞を生成することを示している。

これに関連して、画像Ａは、ヒドロゲル系中の細胞が、「Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ｂ」、ＢＣＬ１１ｂという名称としても知られている核皮質マーカーＣＴＩＰ２、及びニューロン細胞質マーカーＴＵＢＢ３に対して二重陽性であることを示している。

これに関連して、画像Ａ’の矢印は、ＴＵＢＢ３陽性ニューロンのＣＴＩＰ２陽性細胞核を指している。画像Ｂは、細胞が、その名称が「特殊なＡＴリッチ配列結合タンパク質２」の略語である核皮質マーカーＳＡＴＢ２、及びニューロン細胞質マーカーＴＵＢＢ３に対して二重陽性であることを示している。画像Ｂ’では、矢印は、ＴＵＢＢ３陽性ニューロンのＳＡＴＢ２陽性細胞核を指している。

図１０は、細胞が、細胞核色素（cell nucleus dye）ＤＡＰＩ、及び成熟ニューロンで発現される細胞質ニューロンタンパク質ニューロフィラメントに対して二重陽性であることを明らかにしている。これに関連して、画像Ａ’は、画像ＡのＤＡＰＩ染色のための光チャネルを示している。ニューロフィラメントの発現は、ＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲル中への埋め込み及び成熟後のヒト神経幹細胞及び前駆細胞（ＮＳＰＣ）の成熟分化状態のさらなる証拠である。

図１１は、初代ヒト皮質細胞におけるアミロイドβ４２ペプチド（Ａβ４２）の効果を研究するためのＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲルの調製の絵図を含む。ステップ１で、第２継代細胞を、５×１０^３／ｃｍ^２の密度でペトリ皿に入れた。Ａβ４２神経毒性モデルのために、第２継代細胞を、同様に５×１０^３／ｃｍ^２の密度でペトリ皿に入れ、２μＭ Ａβ４２と共に４８時間インキュベートした（ステップ１’）。

４８時間後に、ステップ２で、細胞を回収して８×１０^６細胞／ｍｌの濃度でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。次いで、ステップ３で、同量のヘパリン溶液（ＰＢＳ中、４５μｇ／μｌ）を添加し、これら２つを４×１０^６細胞／ｍｌの最終濃度になるまで混合した。ＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲル系に埋め込まれた細胞の細胞外環境をＡβ４２で被覆する場合には、ステップ３’で、４０μＭの濃度のＡβ４２ペプチドの混合物を添加した。

ゲルを投入するために、ステップ３で、細胞溶液、ＰＢＳ、及びヘパリンを同量のスターＰＥＧと混合した。この段階で、ステップ３’に従って投入されたゲルは、２０μＭの濃度の細胞外Ａβ４２を有していた。全てのヒドロゲル中の細胞の濃度は２×１０^６細胞／ｍｌである。ゲル形成反応には２分かかる。投入後、ゲルを、各ウェルが培養培地を含む２４ウェル培養プレートに入れた。ゲルを培養してインキュベートするために、３７℃において５％ＣＯ_２／９５％空気の比率を使用した。ゲルは、所望の時点まで培養することができる。

図１２は、ニューロン細胞質マーカータンパク質としてのアセチル化チューブリンに対する抗体、ペプチドの凝集のマーカーとしてのＡβ４２、及びグリア細胞の細胞質マーカーとしてのＧＦＡＰを用いたヒドロゲルの三重免疫染色を示している。図１２は、画像Ａ～Ａ’’ではＡβ４２を含まず、画像Ｂ～Ｂ’’では細胞内Ａβ４２を含み、かつ画像Ｃ～Ｃ’’では細胞外Ａβ４２を含む、３週間経過したゲルのｙ軸を通る最大強度投影の画像を示している。画像の第１の行、すなわち画像Ａ～Ｃは、形成されたニューロンネットワークを強調するアセチル化チューブリンでの染色のためのチャネルを示している。画像（Ａ’～Ｃ’）の第２の行は、行１からのニューロンネットワーク及び形成されたＡβ４２アミロイド凝集体を示し、このＡβ４２アミロイド凝集体は、ゲルの全容積内に広がっている。有益なことは、Ａβ４２凝集体の存在下でのニューロンネットワークの喪失であり、Ａβ４２凝集体を含有しない試料（画像Ａ’を参照）と比較して、画像Ｂ’及び画像Ｃ’を参照されたい。行３は、ＧＦＡＰ染色のためのチャネルを示している。Ａβ４２凝集体に起因する細胞の喪失及びニューロンネットワークの喪失の定量化は、以下の図１３に示されている。

図１３は、Ａβ４２（Ａ）を含まず、細胞内Ａβ４２（Ａ’）を含み、かつ細胞外Ａβ４２（Ａ’’）を含む、ゲル中の骨格結合ニューロン経路の最大強度投影を示している。

画像Ａ－Ａ’’は、全ての場合、すなわち図１２のＡβ４２（Ａ）を含まない対照の場合、細胞内Ａβ４２（Ａ’）を含む対照の場合、及び細胞外Ａβ４２（Ａ’’）を含む対照の場合のａＴｕｂ陽性細胞のためのチャネルを示している。図１３の画像Ｂは、Ａβ４２を含まない、細胞内Ａβ４２を含む、細胞外Ａβ４２を含むゲル中の平均細胞数の定量化を示している。画像Ｃは、Ａβ４２を含まない、細胞内Ａβ４２を含む、細胞外Ａβ４２を含むゲル中の平均ネットワーク数の定量化を示している。画像Ｄは、Ａβ４２を含まない、細胞内Ａβ４２を含む、及び細胞外Ａβ４２を含むヒドロゲル中のネットワーク当たりの平均分枝数の定量化を示している。

ヒト神経幹細胞及び前駆細胞（ＮＳＰＣ）によってニューロンネットワークが形成される培養条件を、ＭＭＰ切断可能部位を含有する３次元ＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲルを調製することによって作り出した。この変更により、細胞がその環境を再構成することができる。ヒドロゲル合成は、Tsurkan M.V. et al. Defined Polymer-Peptide Conjugates to Form Cell-Instructive starPEG-Heparin Matrices In Situ. Advanced Materials (2013)に記載されている。

重合段階の間に、細胞が前記ＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲル中に導入されると、驚くべきことに、細胞の導入のちょうど１週間後に、このゲルが、まばらに分散した、３Ｄ分岐形態を有するＧＦＡＰ陽性グリア細胞を含むことが観察される。細胞培養の２週間後に、アセチル化チューブリンに対して陽性であるニューロンの拡散及び配置がクラスターで観察される。培養の３週間後に、細胞培養物は、グリア細胞が散在するニューロンの広範囲の複雑なネットワークを示している。さらに、ＮＳＰＣの３Ｄ培養物を、神経ノード及び節点に蓄積するシナプスマーカーシナプトフィジンで染色可能であり、２Ｄ培養物と比較して、より成熟したシナプス結合を示唆している。これとは対照的に、神経細胞及びグリア細胞を含む２Ｄ培養物では、シナプトフィジン染色をシナプスのクラスターで観察することは不可能である。

３Ｄヒドロゲル中のニューロンはまた、グルタミン酸などの神経伝達物質に応答性であり、これは、ＣＭＶプロモーター駆動カルシウムセンサーを含有するプラスミドを発現するＧＣａｍＰ６ｆのトランスフェクションによって決定される、細胞内カルシウムレベルの増加によって実証することができる。これらの結果は、ＮＳＰＣの３Ｄ培養物が、３次元配置においてニューロン及びグリア細胞の広範なネットワークを生成できることを示している。ＣＴＩＰ２及びＳＡＴＢ２などのより古い皮質サブタイプマーカー、前神経マーカーＭａｓｈ１及びＤＣＸ、並びに成熟ニューロンマーカー神経フィラメント（分化したニューロンのマーカータンパク質）もＮＳＰＣ培養物中で発現され、３Ｄ培養物中に存在する神経細胞が、支配的な条件下で発達して成熟ニューロンを生成することを示唆している。

アルツハイマー病に関連する、誤って折り畳まれたタンパク質であるアミロイドβ４２ペプチドもまた、ニューロンネットワークに対するその毒性及び影響をモデリングするために使用されてきた。培養のための３次元ヒドロゲル系を使用する本発明による方法は、このようにして、神経変性疾患のモデルとして使用することもできる。アミロイドβ４２の蓄積が、インビボ及びインビトロでのニューロンネットワークの形成及びニューロンの接続を阻害することを示すことが可能である。アミロイドβ４２（Ａβ４２）が、ニューロンネットワークに影響を与えるか否かを調べるために、ヒドロゲル系に導入する前に細胞をＡβ４２で処理して培養物を調製した（細胞内Ａβ４２）、又は細胞の導入の前にヒドロゲルをＡβ４２と共にインキュベートして培養物を調製した（細胞外Ａβ４２）。広範なネットワーク形態の形成を観察することが可能であった対照ゲルと比較して、細胞内Ａβ４２及び細胞外Ａβ４２によるネットワークの形成には有意な障害が存在した。対照ゲルと比較して、Ａβ４２処理ゲルは、細胞及びネットワークの数が著しく減少している。加えて、たとえ一部のネットワークがＡβ４２で処理されたゲルで形成されたとしても、前記ネットワークが、ネットワーク当たり有意に少ない数の分岐を含むことを観察することができる。さらに、Ａβ４２処理は、ヒトの脳と同様に軸索のジストロフィーを引き起こすことが判明した。これらの結果は、３Ｄゲルが、神経幹細胞又は神経前駆細胞の神経性能力（neurogenic capacity）にかかわらず、ニューロンネットワークの形成に対して毒性効果を与えるＡβ４２のヒト病態生理を再現できることを示している。さらに、３次元ヒドロゲル系は、たとえＡβ４２の存在下でもヒト幹細胞の神経性能力及びニューロンネットワークの形成を回復させ得る化合物を試験するための実用的なスクリーニングプラットフォームとして使用することができる。

先行技術のさらなる発展において、モジュール式に容易に制御可能なヒドロゲル材料系が使用され、Tsurkan M.V. et al. Defined Polymer-Peptide Conjugates to Form Cell-Instructive starPEG-Heparin Matrices In Situ. Advanced Materials (2013)から分かるように、このヒドロゲル材料系は、天然の細胞環境（いわゆる細胞外マトリックス（ＥＣＭ））で生じる細胞誘導性シグナル、特に、物理的なネットワークの特性（２００Ｐａ～６ｋＰａの範囲内のヒドロゲルの剛性）、分解性、及び生体分子構成（接着及びシグナルペプチド、可溶性サイトカイン、及び成長因子による官能化）を独立に調節することを可能にする。従って、複数のパラメータを、様々な材料特性において系統的に（及び互いに独立して）試験することが可能である。さらに、ヒドロゲルは、高い細胞生存率を可能にするように穏やかで細胞に優しい条件下で架橋される。さらに、細胞は、良好な生存率を有する帯状に分化した構造を生成するために、帯状の不均一性を有するマトリックス内にプリントすることができる。

使用される３次元培養物は、例えば、ＣＴＩＰ２及びＳＡＴＢ２などの成熟ニューロンのマーカータンパク質に対して陽性である神経細胞を含む。これは、培養下で生成され、インビボ条件と非常に類似した細胞の分化の程度を示す成熟皮質ニューロンの指標である。さらに、３Ｄの培養細胞における電気生理学的活性及び膜チャネル活性、すなわち本発明に従って使用される系のインビボ型の特性を同様に示す機能を測定することが可能であった。

広範なニューロンネットワークを含む培養物は、３週間で調製することができ、少なくとも１０週間生存し得る。迅速な調製及び培養条件により、例えば、臨床処置の前に患者の細胞に対する様々な活性成分の効果を試験するために、任意の脳疾患中に、ｉＰＳベースのオーダーメイド医療にヒドロゲル３Ｄ培養物を使用することが可能である。さらに、本発明による方法は、グリア及び神経前駆細胞集団の急速な増殖を容易にし、かつ多数の細胞を必要とする細胞ベースの治療に使用することができる。

本明細書に記載の３Ｄヒドロゲル細胞培養系のさらなる重要な利点はまず、細胞を取り囲むゲル材料が透明であることである。分析目的のために、３Ｄ培養物は、透明であり、かつ顕微鏡のリアルタイム記録及び組織の優れた透明度を必要とする他の分析に使用することができる。従って、３Ｄ培養物は、光学的及び顕微鏡的方法によるネットワーク形成及び神経分枝部の定量的測定を可能にし、これにより、全培養期間にわたってネットワーク形成を観察することが可能となる。既に述べたように、この系はまた、個々のニューロン及び神経回路の電気生理学的活性及び膜チャネル活性の測定も可能にする。さらに、ゲル中の細胞間結合を追跡し、統計的結果を定量的に記述するためにアルゴリズムが開発された。

現在利用可能な情報に基づくと、使用が好ましい初代ヒト皮質細胞を含むスターＰＥＧ－ヘパリン培養系は、定量化可能で広範囲のニューロンネットワークを提供する唯一の３Ｄ神経細胞培養系である。

Kimらの系では、ニューロンネットワークは、本発明に従って使用されるＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲルが提供する培養空間全体に広がる、本発明による方法によって得ることが可能な遥かに大きいニューロンネットワークと比較すると明らかに質が低い。Koutsopoulos S．らによる系では、細胞の生存率が低いことが分かり、ネットワークの質も、細胞応答性スターＰＥＧ－ヘパリン系が提供するものよりも明らかに劣っている。

さらに、２つの系（Kim／Koutsopoulosら）は、Engelbreth-Holm-Swarm（ＥＨＳ）マウス肉腫、腫瘍組織から抽出された細胞外マトリックスであるBD Matrigelに基づいている。Matrigelで知られている、結果の再現性を困難にするバッチごとの大きい変動に加えて、腫瘍に典型的なシグナル伝達物質及びこのような製品に含まれる細胞成分が、正常な分子シグナルの細胞への伝達を変更する。従って、このような製品は、インビボでの分子プロセスが腫瘍組織に存在する環境とは大きく異なっているため、脳の発達に関連した研究並びに移植及び／又は神経変性プロセスの研究には不適当である。本発明に従って使用されるヒドロゲル系は、合成ＰＥＧに基づき、生物学的に誘導体化されているが、分子量の分布及び機能性などの周知の分子特性を有する精製されたヘパリンであり、これらの分子量の分布及び機能性は、使用前に必ず試験される。従って、この系は、再現性の問題もなく、免疫原性反応も示さない。

さらに、Dawai Zhang及びKoutsopoulusらは、神経細胞の培養のために自己組織化ペプチドヒドロゲル及びＩ型コラーゲンゲルを使用した。コラーゲンの場合には、Matrigelの場合と全く同様に、バッチによってばらつきがある。これまで使用された他の全てのヒドロゲル系（例えば、PuraMatrix、自己組織化ペプチド、コラーゲンＩ、及びMatrigel）の場合、物理的特性は、むしろ定義されておらず、変動が大きく、生体分子構成と無関係に変えることができない。従って、これに関連して使用される材料は、機械的刺激及び生体分子刺激の影響を独立して研究することができず、再現性に乏しい。

細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の組成及び構成から生じるこれらの様々な刺激が、幹細胞活性の影響及び新しい組織形成の主要パラメータであるため、従来技術から知られている系は、機械的シグナルと生体分子シグナルとを互いに別々に検出することが不可能である。これに対して、インビトロアッセイは、複数の細胞外マトリックス由来シグナル及びそれらの多面的効果の間の複雑な相互作用のために、組織構造に対する外因性刺激の作用の同定が困難である。

従って、ヒドロゲルの組成を独立に設定することが可能であるため、本明細書で使用される十分に定義されたモジュール式に調整可能なＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲルは、機械的シグナル及び生体分子シグナルを互いに独立に調節するために使用することができる（Tsurkan M.V. et al. Defined Polymer-Peptide Conjugates to Form Cell-Instructive starPEG-Heparin Matrices In Situ. Advanced Materials (2013)）。さらに、本発明による３Ｄヒドロゲル系はまた、例えばＭＭＰ切断可能部位によって細胞応答性であり、これは、例えば、脳組織におけるインビボ条件との酷似を達成するために、独自のマトリックスによる細胞誘導性再構築プロセス及び置換を可能にする。３次元ニューロンネットワークのための以前に記載された既知の方法は、３Ｄ培養系の機械的性質及び生体分子特性の特定の調節並びに３Ｄヒドロゲル中の細胞外マトリックスの細胞依存性再構成を可能にする定義された組成物が欠如している。

従って、細胞で覆われた細胞外マトリックスを生成するために細胞がヒドロゲル系と動的に相互作用するのであれば、使用される３Ｄ細胞培養プラットフォームは、幹細胞活性及び分化におけるマトリックスの性質の役割を明確にするのに有利な細胞培養系として役立ち得る。加えて、使用される３Ｄヒドロゲル系は、接着若しくはシグナル伝達分子で共有結合的に、又はヘパリン結合シグナル伝達分子で非共有結合的に被覆することができる。全体として、複数の細胞誘導性外因性シグナルの影響は、ヒト神経幹細胞及び／前駆細胞の細胞増殖及びニューロンネットワーク形成に関して体系的に研究することができる。

オルガノイドを含む多くの３Ｄ系は、サイズ及び形状が再現可能な構造を形成することができない。本発明による３Ｄ培養物は、これらの２つのパラメータを調整して具体的に制御することができ、従って、３Ｄ細胞培養物についての実質的により良好に規定された条件を提供することができる。

米国特許第６，３０６，９２２Ａ号及び米国特許第６，６０２，９７５Ａ号に記載されている生分解性ヒドロゲルは、光重合ヒドロゲルである。すなわち、特定の電磁条件下での重合及びゲル形成のために、前記ヒドロゲルは、紫外光（ＵＶ光）を放出する特殊な装置を必要とする。ＵＶ光は、埋め込まれた細胞でのフリーラジカルの生成及びアポトーシスシグナル伝達経路の誘導をもたらし、これが、細胞死をもたらして、細胞の生存率に悪影響を及ぼし得る。さらに、ＵＶ光はまた、ＤＮＡ突然変異及び埋め込まれた細胞の細胞ＤＮＡの損傷を引き起こす。対照的に、本明細書に記載の革新的な３Ｄヒドロゲル系では、マトリックスは、ＵＶ光を使用せずに室温で重合される。このようにして、細胞にＤＮＡ損傷及び突然変異が起こらず、従って、細胞機能がより良好に維持される。加えて、ＵＶ誘導重合の省略により、高価な装置を使用しなくても３Ｄヒドロゲル系の使用が可能となる。この利点は、系を使用者に優しくし、従って、高度に特殊化された実験室以外での使用に理想的である。

さらに、この系は、例えば、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）又は遺伝子の非機能的なドミナントネガティブ変異体（機能の減弱又は喪失）の使用によって、プラスミドを用いることで、遺伝子の機能的なタイプを過剰発現（機能の増強）させる又は遺伝子の下方制御するために特定の遺伝子の誤発現を可能にする唯一の系である。

プラスミド発現系によって駆動されるカルシウムセンサー（ＧｃａＭＰ）の使用が説明された。誤発現系は、３Ｄゲルに合わせられたプラスミドトランスフェクション法に基づいている。

Matrigelを使用した３Ｄ培養物におけるアルツハイマー病（ＡＤ）のモデリングに関する以前の報告と比較して、ＰＥＧ－ヘパリン３Ｄゲルは、例えば活性成分のハイスループットのスクリーニングプラットフォームでの使用で利点を提供する、ネットワークの著しく迅速な発達を可能にする。

これまで、ヒトニューロンを含む３Ｄゲル系における広範囲のネットワーク形成を示すことが不可能であった。以前の３Ｄ培養物は、フローティング又はMatrigel埋め込み系を使用し、改変された細胞を使用する。

以前の３Ｄ培養物では、ネットワークの形成を定量化することが不可能であったため、ネットワーク形成の品質を評価することが不可能であった。本発明による方法で得ることができる３次元培養物は、ネットワーク形成の定量的測定、例えば、軸索及び神経突起の長さ及び数、分岐及び連結点の数、並びに神経分枝の数の測定を可能にする。これは、これまで不可能であった。さらに、本発明に従って使用される系は、細胞培養期間中のリアルタイムの記録及び埋め込み細胞の監視を可能にする。

成熟皮質ニューロンの３Ｄ培養物は、例えばＣＴＩＰ２及びＳＡＴＢ２などの皮質マーカーを発現する。

培養細胞では、プラスミドベクターを用いた遺伝子のトランスフェクションを利用して電気生理学的活性及び膜チャネル活性を３Ｄで測定することが可能であった。足場又はオルガノイドでの３Ｄ培養物を用いた以前の研究の場合には、細胞のゲノムを操作する必要があった。可能なトランスフェクション法では、細胞自体の遺伝子改変を用いずに又はウイルスを使用せずに誤発現を行うことが可能である。

拡大されたニューロンネットワークを含む培養物は、３週間で調製することができ、１６週間を超えて生存し得る。迅速な調製及び培養条件により、臨床処置の前に、患者、患者自身の細胞に対する様々な活性成分の効果を試験するために、任意の脳疾患中に、ｉＰＳベースのオーダーメイド医療に３Ｄ培養物を使用することも可能である。

培養物は、光学的に透明であり、リアルタイムの記録及び組織をはっきりと見る必要がある他の分析に使用することができる。これは、既に公知の３Ｄ足場ベース又はオルガノイドベースの系には当てはまらない。

３Ｄネットワークを形成するために細胞を遺伝子組換えする必要はない。

ヒドロゲル系を使用する本発明による方法は、グリア細胞及び神経前駆細胞集団の最速の増殖を可能にし、かつ多量の細胞が必要とされる細胞ベースの治療に使用することができる。

技術的な詳細
実施例１
実施例１では、初代ヒト皮質細胞（ＰＨＣＣ）を使用した。

ＰＨＣＣは、妊娠２１週の胎児から提供された組織の大脳皮質から単離されたものであり、ScienCell Research Laboratory（ＳＲＬ、カタログ番号１８００）から初代継代の凍結状態で入手した。細胞は、ＨＩＶ－１、ＨＢＶ、ＨＣＶ、マイコプラズマ、細菌、酵母、及び真菌について陰性であることが証明されていた。ＰＨＣＣを、従来のＴ７５フラスコ又は２４ウェルプレートに入れ、５％ウシ胎児血清（ＳＲＬ、カタログ番号００１０）、１％の星状細胞増殖剤（ＳＲＬ、カタログ番号１８５２）、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ＳＲＬ、カタログ番号０５０３）が添加された星状細胞培地（ＳＲＬ、カタログ番号１８０１）を用いて、５％ＣＯ_２／９５％空気の大気を有するインキュベーターで、３７℃で培養した。

ＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲルを、Tsurkan et al., Advanced Materials 2013, vol. 25 (18) pp. 2606-2610に記載されているように調製したが、次の変更を加えた：ＰＨＣＣは、細胞剥離培地としてAccutase（登録商標）（Invitrogen）を用いて培養容器から回収した。１２，０００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離後に、細胞を８×１０^６細胞／ｍｌの濃度でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。ヒドロゲル調製用のポリマーの出発物質（前駆体）は、Tsurkan et al., Advanced Materials 2013, vol. 25 (18) pp. 2606-2610に記載されているように、１５，０００ｇ／モルの分子量を有する６つのマレイミド基で官能化されたヘパリン（ＨＥＰ－ＨＭ６）、及び１５，５００ｇ／モルの総モル質量を有する、各アームにおける酵素的に切断可能なペプチド配列で官能化された４アームスターＰＥＧ（スターＰＥＧ－ＭＭＰ）からなっていた。ヒドロゲルは、３．９％の全固形分で、０．７５の架橋度に対応する、１モルのＨＥＰ－ＨＭ６に対して０．７５モルのスターＰＥＧ－ＭＭＰのモル比で出発物質を混合することによって調製した。このため、各ヒドロゲルのために、細胞を、最初に５マイクロリットル（μｌ）のＰＢＳ中に再懸濁し、次いで５μｌのＨＥＰ－ＨＭ６溶液（５μｌのＰＢＳ中に溶解した０．４４８ｍｇのＨＥＰ－ＨＭ６）及び１０μｌのスターＰＥＧ－ＭＭＰ溶液（１０μｌのＰＢＳ中に溶解した０．３４７ｍｇのスターＰＥＧ－ＭＭＰ）を、Tsurkan et al., Advanced Materials 2013, vol. 25 (18) pp. 2606-2610に記載されているように添加し、数秒間激しく混合し、これにより２×１０^６細胞／ｍｌの濃度の細胞を有する２０μｌの最終容量のヒドロゲルを調製した。次に、２０μｌの液滴を直ちにパラフィルムシートに適用し、続いてゲル形成が完了するまでさらに２分間待った。次いで、ゲルを２４ウェル培養プレートに入れ、各ウェルは、１つの２０μｌの液滴ヒドロゲル及び１ｍｌの培養培地量を含んでいた。次いで、ヒドロゲルを、所望の時点まで５％ＣＯ２／９５％空気下、３７℃で、ウェルで培養した。ゲル形成後、得られたヒドロゲルは、４５０±１５０Ｐａの範囲内の貯蔵弾性率を有しており、この貯蔵弾性率は、プレート直径が２５ｍｍのプレートプレート測定装置を有する回転レオメーター（ＡＲＥＳ ＬＮ２；TA Instruments, Eschborn, Germany）を使用して、２％の変形振幅を有する１０^－１～１０^２ｒａｄ／ｓのせん断周波数範囲内の２５℃での周波数依存測定によって、室温でＰＢＳ中、膨潤したヒドロゲルスライスの振動レオメトリーによって決定された。

実施例２
ＰＥＧヘパリンの調製及び細胞の埋め込み：
ＰＥＧ－ヘパリンゲルは、Tsurkan et al., Advanced Materials 2013, vol. 25 (18) pp. 2606-2610に記載されているように調製したが、以下の変更を加えた：
第２継代のＰＨＣＣを、細胞剥離培地としてAccutase（登録商標）（Invitrogen）を用いる培養容器から回収した。１２，０００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離後に、ＰＨＣＣを８×１０^６細胞／ｍｌの濃度でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。ヒドロゲル調製用のポリマーの出発物質は、Tsurkan et al., Advanced Materials 2013, vol. 25 (18) pp. 2606-2610に記載されているように、１５，０００ｇ／モルの分子量を有する６つのマレイミド基で官能化されたヘパリン（ＨＥＰ－ＨＭ６）、及び１５，５００ｇ／モルの総モル質量を有する、各アームにおける酵素的に切断可能なペプチド配列で官能化された４アームスターＰＥＧ（スターＰＥＧ－ＭＭＰ）からなっていた。ヒドロゲルは、３．９％の全固形分で（０．７５の架橋度に対応する）１モルのＨＥＰ－ＨＭ６に対して０．７５モルのスターＰＥＧ－ＭＭＰのモル比で出発物質を混合することによって調製した。このため、総容量が２０μｌの各ヒドロゲルのために、細胞を、最初に５マイクロリットル（μｌ）のＰＢＳ中に再懸濁し、次いで５μｌのＨＥＰ－ＨＭ６溶液（５μｌのＰＢＳ中に溶解した０．４４８ｍｇのＨＥＰ－ＨＭ６）及び１０μｌのスターＰＥＧ－ＭＭＰ溶液（１０μｌのＰＢＳ中に溶解した０．３４７ｍｇのスターＰＥＧ－ＭＭＰ）を、Tsurkan et al., Advanced Materials 2013, vol. 25 (18) pp. 2606-2610に記載されているように添加し、数秒間激しく混合し、これにより２×１０^６細胞／ｍｌの濃度の細胞を有する２０μｌの最終容量のヒドロゲルを調製した。次に、２０μｌの液滴を直ちにパラフィルムシートに適用し、続いてゲル形成が完了するまでさらに２分間待った。次いで、ゲルを２４ウェル培養プレートに入れ、各ウェルは、１つの２０μｌの液滴ヒドロゲル及び１ｍｌの培養培地量を含んでいた。使用した培養条件は、３７℃において５％ＣＯ２／９５％空気とした。次いで、ヒドロゲルを、所望の時点までウェルで培養した。ゲル形成後、得られたヒドロゲルは、４５０±１５０Ｐａの範囲内の貯蔵弾性率を有しており、この貯蔵弾性率は、プレート直径が２５ｍｍのプレートプレート測定装置を有する回転レオメーター（ＡＲＥＳ ＬＮ２；TA Instruments, Eschborn, Germany）を使用して、２％の変形振幅を有する１０^－１～１０^２ｒａｄ／ｓのせん断周波数範囲内の２５℃での周波数依存測定によって、室温でＰＢＳ中、膨潤したヒドロゲルスライスの振動レオメトリーによって決定された。

アミロイドβ４２（Ａβ４２）で前処理したゲルを使用するために、細胞を２μΜ Ａβ４２と共に４８時間インキュベートしてから、培養容器から細胞を回収し、この細胞をヒドロゲル中に埋め込んだ。Ａβ４２を含むゲル環境を形成するために、細胞をまず、４μｌのＰＢＳ中１００μＭ Ａβ４２ペプチドに溶解した。６μｌのヘパリン溶液（６μｌのＰＢＳに溶解した０．４４８ｍｇのＨＥＰ－ＨＭ６）及び１０μｌのスターＰＥＧ－ＭＭＰの溶液（１０μｌのＰＢＳに溶解した０．３４７ｍｇのスターＰＥＧ－ＭＭＰ）を添加し、そして上記のように混合した。このゲル混合物では、Ａβ４２の濃度は２０μＭであり、細胞の濃度は２×１０^６細胞／ｍｌである。

実施例３
アミロイドβ４２（Ａβ４２）で前処理したゲルを使用するために、細胞を２μΜ Ａβ４２と共に４８時間インキュベートしてから、培養容器から細胞を回収し、ヒドロゲル中に細胞を埋め込んだ。

免疫細胞化学：
全てのヒドロゲルを、氷冷パラホルムアルデヒドで固定し、室温で１．５時間インキュベートし、続いてＰＢＳ中で、一晩４℃で洗浄した。免疫細胞化学のために、ヒドロゲルを、ＰＢＳ中１０％正常ヤギ血清、１％ウシ血清アルブミン、０．１％Triton-Xからなるブロッキング溶液中で一晩、４時間ブロッキングした。ゲルを、時折ＰＢＳを交換して、２日間連続して４℃で洗浄した。洗浄後、ゲルを、２次抗体と共に室温で６時間インキュベートした（ブロッキング溶液中で１：５００）。２時間の３回の洗浄ステップの後、ＤＡＰＩ染色をそれぞれの場合で行った（ＰＢＳ中１：３０００、室温で２時間）。

蛍光記録
ヒドロゲルについて、蛍光記録を、Leica-SP5倒立型共焦点／多光子顕微鏡を用いて行った。ヒドロゲルをガラス底ペトリ皿に入れた。６０μｌのＰＢＳを、乾燥を防止するためにヒドロゲルの上部に加えた。Z-stackを、水浸レンズ（２５倍）を用いて捕捉した。各Z-stackは、５００μｍのｚ距離を有する。

スターＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲル中の初代ヒト皮質細胞（ＰＨＣＣ）及びｉＰＳＣ由来神経幹細胞及び前駆細胞（ＮＳＰＣ）の発達の比較
図１４は、スターＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲル中にニューロンネットワークを形成する能力についての埋め込まれたＰＨＣＣとｉＰＳＣ由来ＮＳＰＣとの比較を可能にする顕微鏡写真を示している。これに関連して、画像Ａ～Ａ’’は、アセチル化チューブリン（Acet. Tubulin、画像Ａを参照）で染色され、ＤＡＰＩで染色され（画像Ａ’）、及びＧＦＡＰによって染色された（画像Ａ’’）、ＲＧＤペプチドで修飾されたスターＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲルに埋め込まれたｉＰＳＣ由来ＮＳＰＣの５００μｍ厚Z-stackの最大強度投影を示している。画像Ｂ～Ｂ’’は、アセチル化チューブリン（画像Ｂ）で染色され、ＤＡＰＩで染色され（画像Ｂ’）、及びＧＦＡＰ抗体によって染色された（画像Ｂ’’）、スターＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲルに埋め込まれたＰＨＣＣの５００μｍ厚Z-stackの最大強度投影を示している。

図１５は、ＴＵＢＢ３染色後のヒト皮質ＮＳＰＣの神経突起の最大強度投影を画像Ａに示している。図１５の画像Ｂは、ＴＵＢＢ３染色後のｉＰＳＣ由来ＮＳＰＣの神経突起の最大強度投影を示している。画像Ｃは、グラフにおける画像Ａ及び画像Ｂのニューロンネットワーク特性の定量化及び比較を示している。

本発明に従って使用されるヒドロゲルは、ＲＧＤ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）などの様々なマトリックス由来ペプチドで共有結合的に修飾してもよいし、又は可溶性シグナル伝達分子の有効な投与に使用してもよい。このようにして、外因性シグナルの影響を、ヒト神経幹細胞及び前駆細胞の増殖及びニューロンネットワーク形成について個々に試験することができる。このスターＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲル系が複数の異なる分子で修飾され得るという事実は、使用者に、カスタマイズされた環境を作り出す可能性を提供する。例えば、ＲＧＤペプチドでのＰＥＧ－ＨＥＰ足場の調製により、図１４に示されているように、ヒトｉＰＳＣ由来神経幹細胞及び前駆細胞（ＮＳＰＣ）を培養することが可能となる。このような方法は、ＲＧＤの修飾なしでは不可能である。図１５から分かるように、最初の初代ヒト皮質細胞（ＰＨＣＣ）がニューロンネットワークを形成する能力と次のｉＰＳＣ由来の神経幹細胞及び前駆細胞（ＮＳＰＣ）がニューロンネットワークを形成する能力とを比較すると、使用されるヒドロゲル系に差異が存在しない。ネットワークの数並びに分岐の数及び長さは、特に図１５の画像Ｃに例示されているように同等である。初代ヒト皮質細胞（ＰＨＣＣ）の発達と比較したヒトｉＰＳＣ由来神経幹細胞及び前駆細胞（ＮＳＰＣ）の高度に類似した発達は、上述のヒドロゲル系が広範囲の用途に使用できることを示している。ヒドロゲル系の最も有望な用途は、オーダーメイド医療の分野で期待されている。これは、特に、修飾可能性、例えばインターロイキン４（ＩＬ－４）などでの処置に対する応答性によって、また比較的短い時間内でスターＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲルを大量に生産する能力によっても示唆される。患者由来のｉＰＳＣ由来ニューロンを培養することにより、様々な神経発達障害をより良く理解することが可能である。しかしながら、生成されるヒドロゲルは、処置戦略を決定するために使用することもできる。

ｉＰＳＣ由来の神経幹細胞及び前駆細胞（ＮＳＰＣ）を用いたＰＥＧ－ヘパリンゲルの調製
ＨＩＰ（商標）（ＢＣ１系統）と命名されたｉＰＳＣ由来のヒト神経幹細胞及び前駆細胞（ＮＳＰＣ）をAmsbio（カタログ番号：ＧＳＣ－４３１１）から購入した。これらのＮＳＣは、製造者によって指定されたように解凍し、Geltrex被覆細胞培養フラスコで培養した。細胞の増殖及びさらなる培養のために、製造者の取扱説明書に従って増殖培地を使用した。NeuralX（商標）ＮＳＣ培地は、以下の組成を有する：２％ＧＳ２２（商標）ニューロンサプリメント、１０；１×非必須アミノ酸、２ｍＭ Ｌ－アラニン／Ｌ－グルタミン；２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２。ＨＩＰ（商標）ＮＳＣを、Accutase（Invitrogen）を用いて細胞培養フラスコから分離した。１２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離後、ＨＩＰ（商標）ＮＳＣを、８×１０^６細胞／ｍｌの濃度で、ＰＢＳ中に再懸濁した。各ヒドロゲルでは、細胞を、最初に５マイクロリットル（μｌ）のＰＢＳ中に再懸濁し、次いで５μｌのヘパリン溶液（ＰＢＳ中４５μｇ／μｌ）及びＲＧＤペプチドとしての２Ｍ インテグリンリガンド（Tsurkan, Chwalek et al., 2011, Maitz, Freudenberg et al., 2013, Tsurkan, Chwalek et al. 2013, Wieduwild, Tsurkan et al. 2013）を十分にボルテックスすることによってＰＢＳに溶解し、１０μｌのＰＥＧを加えて、２×１０^６細胞／ｍｌを含む２０μｌの最終容量にした。２０μｌの液滴を、パラフィルムシートに適用した。ゲル形成には２分かかった。ゲルを２４ウェル培養プレートに入れ、各ウェルは、１ｍｌのＨＩＰ増殖培地容量を含む。ゲルを、３７℃において５％ＣＯ_２／９５％空気を使用して培養した。次いで、ゲルを所望の時点まで培養することができる。

神経可塑性及びＡβ４２媒介毒性に対する個々の因子の影響を分析するためのＰＥＧ－ＨＥＰヒドロゲルの使用
図１６は、いずれも、抗Ａβ４２抗体で染色した後（画像Ａ～Ａ’’）、ＤＡＰＩで染色した後（画像Ｂ～Ｂ’’）、抗ＧＦＡＰ抗体で染色した後（画像Ｃ～Ｃ’’）、及び抗ＳＯＸ２抗体で染色した後（画像Ｄ～Ｄ’’）の、Ａβ４２を含まない対照群（Ａ～Ｄ）、Ａβ４２を含む対照群（Ａ’～Ｄ’）、及びＡβ４２及びインターロイキン４（ＩＬ－４）を含む培養物（Ａ’’～Ｄ’’）の、埋め込まれたＰＨＣＣを含むスターＰＥＧ－ＨＥＰゲルの顕微鏡写真を示している。

例えばゼブラフィッシュの研究で以前に示すことができたのと同様の方法で、ＩＬ－４がヒトにおいて作用するか否かを試験するために、上述のＰＨＣＣを含むスターＰＥＧ－ＨＥＰヒドロゲルを使用した。このために、埋め込まれたＰＨＣＣを含むヒドロゲルを調製し、既に記載されたようにＡβ４２と共にインキュベートした。各実験設定には、陽性対照群（Ａβ４２）及び陰性対照群（Ａβ４２なし）並びにＡβ４２及びＩＬ－４を含む実験群が含まれていた。実験群では、埋め込まれたＰＨＣＣを含むスターＰＥＧ－ＨＥＰゲルをＡβ４２と共に培養し、培地中に１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４が同時に存在した。３週間の培養後、試料を固定し、神経幹細胞及び前駆細胞に対するＩＬ－４の効果を調べるために、ＧＦＡＰ及びＳＯＸ２に対して免疫染色した。全細胞を示すために、核色素ＤＡＰＩを使用した。Ａβ４２処理細胞の培養物では、ＧＦＡＰ陽性グリア細胞及びＳＯＸ２陽性ニューロンの両方が影響を受け、未処理対照培養物と比較して細胞数の大幅な減少を観察することが可能であった。Ａβ４２で処理され、同時にＩＬ－４で処理された培養物では、細胞数は、Ａβ４２で処理されていない対照培養物と完全に同等であった。この結果は、ＩＬ－４での処理がＡβ４２の神経毒性の影響を弱め得ることを示している。インターロイキン４での処理は、ＧＦＡＰ陽性細胞の増殖を刺激してより多くの神経幹細胞及び前駆細胞を生成すると結論付けることができる。従って、ＩＬ－４は、神経毒性Ａβ４２の存在にもかかわらず、埋め込まれたＰＨＣＣの神経可塑性を高める。全体として、このデータは、ゼブラフィッシュモデルで示されているように、ＩＬ－４での処理がヒト神経幹細胞の増殖を活性化することを示している。従って、ＩＬ－４は、Ａβ４２媒介性神経変性に対する将来の治療のための重要な候補である。本発明のヒドロゲルベースの３Ｄ培養物への細胞浸透性配列を有する特異的Ａβ４２ペプチドの投与は、本明細書で使用される細胞培養法が、ヒトＡβ４２毒性の病態生理を再現することができ、かつ神経保護効果を、スターＰＥＧ－ＨＥＰヒドロゲル系でも調べることができることを示している。

３Ｄ細胞培養物を調製する従来の方法とスターＰＥＧ－ＨＥＰヒドロゲル系との比較
図１７は、MatrigelとスターＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲルとを比較するためのＧＦＡＰ、ＳＯＸ２、及びアセチル化チューブリンに対する免疫染色後の顕微鏡写真を示し、いずれにも初代ヒト皮質細胞（ＰＨＣＣ）が埋め込まれている。これに関連して、画像Ａ～Ａ’’’は、Matrigelに埋め込まれたＰＨＣＣを示している。対照的に、画像Ｂ～Ｂ’’’は、スターＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲルに埋め込まれたＰＨＣＣを示している。画像Ａ及び画像Ｂはそれぞれ、グリア細胞集団を同定するためにグリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）で染色されている。画像Ａ’及び画像Ｂ’はそれぞれ、ニューロンネットワーク形成を示すためにアセチル化チューブリン（Acet. Tubulin）で染色されている。画像Ａ’’及び画像Ｂ’’は、全細胞を標識するためのＤＡＰＩ染色を含む。最後に、画像Ａ’’’と画像Ｂ’’’との相対する配置により、ＳＯＸ２染色による幹細胞集団の範囲及び神経可塑性能力の比較が可能である。

生物における３次元トポロジー構造は、従来の２次元（２Ｄ）細胞培養では再現できない構造、系統特異化、及び空間相互作用などの組織特性を付与する。結果として、３次元（３Ｄ）細胞培養系は明らかな利点を有し、広く使用されている。Matrigelベースの３Ｄ細胞培養物は、現在、コラーゲン及びラミニンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質が埋め込まれている粘性ゲル材料で神経細胞が成長するこのような技術の好ましい標準である。しかしながら、Matrigelベースの製品は、その組成が化学的に定義されておらず不均一であり、剛性、足場組成、又は生物学的応答性などの様々な特性を変更することができない。これは、結果の解釈を困難にするため、様々な外因性及び傍分泌シグナルの細胞発達に対する影響を正確に分析することがほぼ不可能である。対照的に、本発明に従って使用される、ヘパリン及びＰＥＧをベースとするヒドロゲル系は、生物物理学的及び生体分子マトリックスシグナルの独立した調整を可能にすることによって有益な利点を提供する。図１７におけるMatrigel系と本発明に従って使用される系との間の直接的な比較では、グリア細胞の細胞構成が両方のマトリックス系において非常に類似しているが、神経性能力及びヒト幹細胞のニューロンネットワークを形成する能力が、MatrigelマトリックスでよりもスターＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲルで明らかに高いことを容易に観察することができる。この時点で、両方の培養系は、さらなる添加剤を用いずに同じ増殖培地で同じ３週間の期間にわたって培養したことに留意されたい。Matrigel系ではなく、スターＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲルにおけるニューロンネットワークの観察が、Matrigel系ではニューロン間で成熟したシナプス結合を確認することがほぼ不可能であるという事実によって確認された。対照的に、スターＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲル中のニューロンは、ニューロンネットワークを形成した。Matrigel系中のＮＳＰＣが神経原性を示さず、ネットワークを形成しない理由は、恐らく、瘢痕組織と同様に機能する殆ど組織化されていないＥＣＭ環境によるものである。

Matrigel３Ｄ培養物の調製
Matrigel細胞培養物には、BD BiosciencesのMatrigel（カタログ番号：３５６２３４）を使用した。各細胞培養手順及びMatrigelの使用の前に、ピペットチップ及びエッペンドルフチューブを「濃縮ゲル法（thick gel method）」のために製造者の取扱説明書に従って－２０℃で凍結させた。Matrigelを、氷上で一晩、４℃で解凍した。第２継代のＰＨＣＣを、Accutase（Invitrogen）を用いて細胞培養フラスコから分離した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍで１０分間）後、ＰＨＣＣを２×１０^６細胞／ｍｌの密度でBD Matrigel中に再懸濁した。３７℃で固化する細胞／Matrigel混合物の液滴を調製した。その後、細胞培養培地（ＳＲＬ、カタログ番号１８０１）を添加し、ゲルを３週間培養した。これに関連して、細胞培養培地を、細胞／Matrigel混合物の調製の翌日に交換し、以降、１日おきに交換した。

略語のリスト
Ａβ４２ アミロイドβ４２
Ａｃｅｔ．Ｔｕｂ アセチル化チューブリン
ａＴｕｂ アセチル化チューブリン
ＢｒｄＵ ブロモデオキシウリジン
ＣＴＩＰ２ 「Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ｂ」、ＢＣＬ１１ｂという名称でも知られている成熟皮質ニューロンのマーカータンパク質
ＤＡＰＩ ４’、６－ジアミジノ－２－フェニルインドール、細胞核色素
ＧＦＡＰ グリア線維性酸性タンパク質、グリア細胞の細胞質マーカー
Ｇｃａｍｐ カルシウムセンサー
ＨＥＰ－ＨＭ６ ６つのマレイミド基とコンジュゲートしたヘパリン
ＩＬ－４ インターロイキン４
ｉＰＳＣ 人工多能性幹細胞
ＭＭＰ マトリックスメタロプロテアーゼ
ＮＳＰＣ ヒト神経幹細胞及び前駆細胞；用語：神経幹細胞及び前駆細胞の略語
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ＰＨＣＣ 初代ヒト皮質細胞；用語：初代ヒト皮質細胞の略語
ＨＥＰ ヘパリン
ＳＡＴＢ２ 成熟皮質ニューロンのマーカータンパク質、用語「特殊なＡＴリッチ配列結合タンパク質２」の略語
ＳＯＸ２ 転写因子、「性決定領域Ｙボックス２」の略語
ＳｔａｒＰＥＧ－ＭＭＰ 酵素的に（マトリックスメタロプロテアーゼ）切断可能なペプチドリンカーで末端が官能化された星形（４アーム）ポリエチレングリコール
Ｓｙｎ シナプトフィジン
ＴＵＢＢ３ β－ＩＩＩ－チューブリン、ニューロン細胞質マーカー

Claims (18)

1. ヒト神経細胞とヒトグリア細胞のヒト神経三次元機能的ネットワークを形成する方法であって、
   前記ヒト神経細胞とヒトグリア細胞を、ゲル成分であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びヘパリンを含有する合成ヒドロゲル系に導入することであって、前記合成ヒドロゲル系は三次元ヒドロゲルの形成のためのものである、導入することと、
   前記ヒト神経細胞とヒトグリア細胞を、前記合成ヒドロゲル系で培養することとであって、それによって、前記ヒト神経細胞とヒトグリア細胞のヒト神経三次元機能的ネットワークを形成する、培養することと、を含み、
   前記導入することにおいて、前記ヒト神経細胞とヒトグリア細胞を、ＰＥＧ又はヘパリンのいずれかである前記ゲル成分の１つと事前に混合して、前記ゲル成分と共に前記合成ヒドロゲル系に導入し、それによって、三次元ヒドロゲルの形成中に前記合成ヒドロゲル系中に前記ヒト神経細胞とヒトグリア細胞が既に存在する、方法。
2. 前記ヒト神経細胞が、ヒトグリア細胞と共培養されることを特徴とし、かつ前記ヒト神経細胞が、ヒト神経幹細胞及び前駆細胞である、又はヒト不死化神経前駆細胞株に由来する、又は中脳から得られた初代ヒト神経前駆細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記ヒト神経細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のヒト神経幹細胞及び前駆細胞であるか、又は初代ヒト皮質細胞に由来することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
4. 形成された前記ヒト神経三次元機能的ネットワークの機能性が、成熟神経皮質マーカーが発現していることについて、神経伝達物質に対する応答性について、及び電気生理学的活性について実証可能であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記合成ヒドロゲル系が、スターＰＥＧを含有するスターＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲル系であり、ここで、スターＰＥＧは、多アームポリエチレングリコールであり、
   前記スターＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲル系が、酵素的に切断可能なペプチド配列を介して架橋され、それによって、前記スターＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲル系が、切断可能であり、かつ局所的に再構成可能であることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記三次元ヒドロゲルが形成された前記合成ヒドロゲル系のヒドロゲルマトリックスが、チオール末端スターＰＥＧ－ペプチドコンジュゲートとマレイミドによって官能化されたヘパリンとの共有結合架橋によって形成され、前記ヒドロゲルマトリックスが、マイケル付加によって架橋されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. 前記スターＰＥＧ－ヘパリンヒドロゲル系のヒドロゲルマトリックスが、自己組織化によってヘパリン及び共有結合スターＰＥＧ－ペプチドコンジュゲートから非共有結合的に形成され、前記共有結合スターＰＥＧ－ペプチドコンジュゲートが、ポリマー鎖に結合された２つ以上のペプチドのコンジュゲートを含み、前記ペプチド配列が、繰り返しジペプチドモチーフ（ＢＡ）ｎを含み、式中、Ｂが正に荷電した側鎖を有するアミノ酸であり、Ａが、アラニンであり、ｎが、５～２０の数であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
8. 前記三次元ヒドロゲルが形成された前記合成ヒドロゲル系が、貯蔵弾性率によって特徴付けられる、可変機械的性質を有することを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記貯蔵弾性率が、３００～６００パスカルの範囲内にあることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
10. 前記合成ヒドロゲル系が、シグナル伝達分子及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のタンパク質に由来する機能性ペプチド単位で修飾されることを特徴とする、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記ヒト神経細胞とヒトグリア細胞が、ヒト間葉系間質細胞及びヒト内皮細胞と一緒に共培養され、これらの細胞が、前記ヒト神経細胞とヒトグリア細胞と共局在化することを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法によって得られた、ニューロンネットワークとして機能する、前記合成ヒドロゲル系内に形成された状態にあるヒト神経三次元機能的ネットワーク。
13. ニューロンネットワークの形成を監視するための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法の使用。
14. ニューロンネットワークの形成をリアルタイムで監視するための、請求項１３に記載の使用。
15. ニューロンネットワーク内の神経細胞の細胞増殖、長さ、分岐の数及び密度、並びに／又は結合性、並びに／又は電気生理学的活性の定量分析が行われることを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の使用。
16. 「ヒトの脳におけるニューロン及び／又はニューロンネットワークの形成に影響を及ぼす疾患のモデリング」のための、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の使用。
17. 疾患関連タンパク質凝集体によって引き起こされる神経毒性のモデリング及び／又は神経幹細胞可塑性の変化のための、請求項１６に記載の使用。
18. 神経活動及び／又はネットワーク形成に影響を及ぼす分子及び／又は活性成分を試験するための、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の使用。

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