JP7190376B2

JP7190376B2 - 角層メラニン観察方法

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Publication number: JP7190376B2
Application number: JP2019042612A
Authority: JP
Inventors: 潮路石渡
Original assignee: Fancl Corp
Current assignee: Fancl Corp
Priority date: 2019-03-08
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2022-12-15
Anticipated expiration: 2039-03-08
Also published as: JP2020144070A

Description

本発明は、皮膚角層中のメラニンの観察方法に関する。

皮膚の色調は、美容上重要な因子の１つである。皮膚の色味や色むらを評価した結果から、推奨する化粧料を選択する美容カウンセリングが行われている。皮膚の色味や色むらを評価するための測定方法として、機器による肌色の測定に加え、皮膚色を決定する要因である、角層中のメラニンの量や、存在状態、その分布を確認する手法がとられている（特許文献１、２、３）。

角層は、皮膚を構成する４層のうち、最外層に位置し、角質、角質層ともいう。この角層中のメラニンの量や、存在状態、その分布を評価するには、粘着性のテープで角層を剥離させて採取し、この角層をそのまま、もしくは採取した角層をスライドガラスに転写して、メラニンを観察する方法が行われている（特許文献１、４、５、６）。メラニンの観察は、角層試料を染色して行なうが、硝酸銀などの銀塩を用いたメラニン染色法で行なわれる。しかし、硝酸銀によるメラニン染色方法は、染色に一昼夜要する時間と煩雑な操作が必要であった。また銀塩を用いることから特別の廃液処理が必要であった。

また、銀塩を使用しない角層の染色方法も提案されている。特許文献７には、青色１号、紫色４０１号、緑色２０１号、黄色４号、黄色５号、黄色４０７号、赤色１０２号、橙色２０５号、ブリリアントグリーン、ヘマトキシリンなどの色素と有機酸とアルコールを用いた染色法と角層の観察法が記載されている。
特許文献８には、コンゴレッド色素で染色し、染色した角層細胞を偏光顕微鏡によって鑑別する皮膚の鑑別方法が記載されている。

特開平１１－３３２８３６号公報特開２０００－２１２０３６号公報特開２０００－２１２０３７号公報特許第３１７９８８７号公報特許第３２１２５５８号公報特許第３２１２５５９号公報特開２００６－０５３１１７号公報特開２００７－２６３６５５号公報

本発明者は、角層のメラニンを研究対象としている。この研究の過程で、角層中のメラニン顆粒のみを選択的に顕微鏡観察するための方法を検討した結果、本発明をなした。
すなわち、本発明は角層中のメラニン顆粒のみを観察可能な、角層試料の調製方法及び調製した試料を用いた皮膚角層のメラニンの状態を評価する方法、及びその観察結果を用いた、ヒト皮膚のメラニン量を測定する方法を提供することを課題とする。

本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）角層試料を、次亜塩素酸化合物及び／または界面活性剤の溶液で処理し、メラニン以外の角層成分を透明化することを特徴とする顕微鏡観察用角層試料の調製方法。
（２）角層試料がテープストリッピング法によって採取されたものである（１）に記載の調製方法。
（３）次亜塩素酸化合物が次亜塩素酸ナトリウムである（１）または（２）に記載の調製方法。
（４）界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである（１）～（３）のいずれかに記載の調製方法。
（５）次亜塩素酸ナトリウムの濃度が０．４質量％以上である（３）に記載の調製方法。
（６）ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が２．５～２０質量％である（４）に記載の調製方法。
（７）（１）～（６）に記載のいずれかの方法で調製された角層試料を顕微鏡観察することによって皮膚角層のメラニン顆粒の状態を評価する評価方法。
（８）（１）～（６）に記載のいずれかの方法で調製された角層試料の顕微鏡観察画像を白黒の二値データ化し、黒のデータの画素（ピクセル）数値を求めることにより角層中メラニン量を測定する方法。
（９）（１）～（６）に記載のいずれかの方法で調製された角層試料の顕微鏡観察試料から得たメラニン顆粒量のデータに基づき、皮膚の状態を解析する方法。

本発明により、メラニン顆粒のみを観察可能な、角層試料の調製方法及び調製した試料を用いた皮膚角層のメラニンの状態を評価する方法、及びその観察結果を用いたメラニン量を測定する方法が提供される。本発明の方法は、角層試料の染色に銀塩を使用しないため、廃液処理の問題がない。そして極めて短時間でメラニンの顕微鏡観察試料が作成可能となる。
また本発明の方法で得られた顕微鏡観察用試料は、角層中のメラニン顆粒のみが原型を保っており、その他の組織は均一化され、また透明化されているため、メラニン顆粒の観察が極めて容易である。したがって、角層中におけるメラニンの状態を容易に観察可能であり、正確に評価できる。また観察画像を二値化することで、メラニンのみを画素数として容易に計測でき、これを基準として角層中のメラニン量を測定し、解析することができる。

次亜塩素酸塩処理をした角層試料の観察画像（右）と未処理の角層試料の観察画像（左）である。次亜塩素酸塩処理をした角層試料をさらにフォンタナマッソン法により染色した角層試料の観察画像（右）、フォンタナマッソン法により染色した角層試料の観察画像（左）を示す。４名の被験者の角層を直接観察した顕微鏡観察画像である。４名の被験者の角層を本発明の方法により観察試料に調製した顕微鏡観察画像である。４名の被験者の角層を本発明の方法により観察試料に調製した顕微鏡観察画像を、さらに二値データに変換し、メラニンを黒画素で表した画像である。蒸留水（Ｈ_２Ｏ）、４０％尿素水溶液（Ｕｒｅａ：ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、３０質量％過酸化水素水（Ｈ_２Ｏ_２：富士フィルム和光純薬株式会社）、６質量％次亜塩素酸ナトリウム溶液（塩素系漂白剤）、１０質量％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、１Ｎ水酸化ナトリウム（富士フィルム和光純薬株式会社）、１２Ｍ塩酸（富士フィルム和光純薬株式会社）で角層の処理をした場合の顕微鏡観察画像である。ＳＤＳ及び次亜塩素酸ナトリウムが有効であったことを示す。ＳＤＳの有効濃度を試験した角層試料の顕微鏡観察画像である。次亜塩素酸ナトリウムの有効濃度を試験した角層試料の顕微鏡観察画像である。

本発明は、皮膚より採取した角層試料を、次亜塩素酸化合物または界面活性剤の溶液で処理し、メラニン以外の角層成分を透明化し、メラニン顆粒のみを観察可能な状態とした角層試料を調製する。この試料によって皮膚角層のメラニン顆粒の状態を観察して、評価することを特徴としている。また観察画像のデータを二値化してメラニン顆粒量を測定するものである。以下に、更に詳細に説明を加える。

前記皮膚角層試料の採取、角層試料の処理及び角層試料の調製、顕微鏡観察のための観察試料の調製工程、二値データ取得と解析は、以下のように行うことが好ましい。
（工程１）角層剥離手段を用いて、皮膚より角層試料を採取する。
（工程２）工程１で採取した角層試料を、剥離面を上方にして透明板に貼り付けたのち、次亜塩素酸類溶液または界面活性剤溶液を滴下した後、一定時間静置する。
（工程３）工程２で得られた角層試料を水によって洗浄する。
（工程４）工程３で洗浄した角層試料を風乾後顕微鏡観察試料とする。
（工程５）工程４で得られた顕微鏡観察試料を顕微鏡観察して目視評価する。
（工程６）デジタルカメラで撮影した観察画像をデータとして取得する。
（工程７）工程６で取得した観察画像を、画像処理によって白黒の二値化データに変換し、白黒の面積データを取得する。
（工程８）黒データのピクセル値をメラニン顆粒データとする。

工程１の角層剥離手段は、バイオプシーや粘着テープを用いる方法のいずれであっても良い。被験者の負担を考慮すると粘着テープを用いる方法が好ましい。粘着テープを用いる方法は、テープストリッピング法と呼ばれる。
テープストリッピング法は、粘着性テープを皮膚に貼り付けた後、剥がして皮膚の表層を回収する方法である。
粘着剤としては、天然ゴム、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、シリコーンゴム、ポリイソプレン、スチレン－イソプレン－スチレンブロック共重合体等の合成ゴム、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル酸エステル共重合体等の合成樹脂等が用いられている。テープストリッピング法に用いる粘着テープは市販されており、これを使用しても良い。

工程２において、剥離した角層試料を、剥離面を上方にして透明板に貼り付ける場合の透明板は、顕微鏡観察に適したガラス製あるいはアクリル製のものを用いることが好ましい。

工程２で用いる次亜塩素酸塩としては、次亜塩素酸アルカリ金属塩、特に次亜塩素酸ナトリウムが好ましい。次亜塩素酸塩は水溶液として用いる。水溶液中の次亜塩素酸塩濃度は、０．４～１００質量％、好ましくは４～７質量％、特に好ましくは６質量％である。前記次亜塩素酸塩は、水溶液が好ましいが、適宜界面活性剤を含有しても良い。水溶液の媒体としては、純水、イオン交換水、蒸留水、水道水等が挙げられるが、純水が好ましい。
なお、本発明に使用する次亜塩素酸塩含有水溶液は、市販の洗濯用塩素系漂白剤溶液を使用することもできる。

本発明で用いる次亜塩素酸塩水溶液のｐＨは、適宜決定すればよいが、角層試料の透明化を促進するためにはｐＨ８～１２、特に好ましくはｐＨ１０以上である。次亜塩素酸塩水溶液の温度は、特に限定はないが、好ましくは、室温であることが好ましい。

なお、次亜塩素酸塩水溶液の使用量は、角層試料の全面が次亜塩素酸塩水溶液で充分に濡れるように滴下する必要がある。通常試験試料当たり０．５～１ｍｌを滴下し、試験試料が次亜塩素酸塩水溶液に充分浸潤させる。

前記工程２で用いる界面活性剤は、タンパク質の変性作用を有する界面活性剤が好ましい。ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４，ＮＰ－４０，Ｂｒｉｊ－３５，Ｂｒｉｊ－５８，Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｗｅｅｎ８０，Ｏｃｔｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ，Ｏｃｔｙｌｔｈｉｏｇｌｕｃｏｓｉｄｅ，ＣＨＡＰＳ，ＣＨＡＰＳＯ、ソジウムドデシルベンゼンスルフォン酸を例示できる。中でも生化学分野で多用されているソジウムドデシルベンゼンスルフォン酸（ＳＤＳ、別名ラウリル硫酸ナトリウム）が適している。
ＳＤＳは水溶液又はＰＢＳ等の緩衝液に溶解させて用いる。水溶液中のＳＤＳ濃度は、２．５～２０質量％、好ましくは５～１５質量％、特に好ましくは１０質量％である。前記次亜塩素酸塩水溶液と混合した混合溶液であっても良い。水溶液の媒体としては、純水、イオン交換水、蒸留水、水道水、生理食塩水、ＰＢＳ等が挙げられる。
なお、ＳＤＳ水溶液の使用量は、角層試料の全面がＳＤＳ水溶液で濡れるように滴下する必要がある。通常試験試料当たり０．５～１ｍｌを滴下し、試験試料がＳＤＳ水溶液に充分浸潤させる。

工程３における洗浄は、工程２で用いた次亜塩素酸塩及び／または界面活性剤を除去するために行なうものである。充分量の水を用いて少なくとも１０回程度繰り返し洗浄するか、流水で洗浄する。洗浄に用いる水は、純水、イオン交換水、蒸留水、水道水等が挙げられるが、純水が好ましい。

工程４においては、前記工程３終了後、試料の水分を風乾させた後、顕微鏡観察用の試料（標本）とする。なお、長期間試料を保存する場合に用いるバルサムやパラフィンによって封入標本としても良い。

工程５においては、標本を光学顕微鏡により観察し、あるいは標本をビデオスコープ等でモニターに写し出し、剥離採取した角層試料に含まれているメラニンの量、形態、大きさ、均一性、均質性、集合度等を調べる。前記工程１～４により得られた剥離角層試料は、顕微鏡観察した場合、メラニンのみが黒色のスポットとして観察することができる。この黒色のスポットがメラニンであることは、試験例において示すように従来のメラニン染色法で確認することができる。
こうして、肌の状態の指標となるメラニンを直接観察することで、肌性、肌質、肌色、シミの状態等を評価することができる。

工程６において、上記顕微鏡観察によって確認評価した標本の観察画像を選択して、デジタルカメラ等を用いて画像データとしてコンピュータに取り込む。

工程７では、工程６で取得した観察画像の取り込みデータを、画像処理によって白黒の二値化データに変換し、白黒の面積データを取得する。画像処理は、公知の画像処理システムであればどのようなシステムであっても使用可能である。このような画像処理システムとしては、本発明にあっては、「ＩｍａｇｅＪ」が適切な画像処理システムとして使用可能である。ＩｍａｇｅＪは、オープンソースでパブリックドメインの画像処理ソフトウェアである。当業者であれば、容易に入手可能であり、システムの操作手順に従って容易に画像の白黒の二値化されたデータを取得できる。取り込んだ画像は一定の範囲を解析対象として選択し、選択範囲の画素数を確認しておくことで、全画素数あたりのメラニン面積率を算出することができる。二値化にあたっては、顆粒以外の背景部分を削除して面積を求めるために、あらかじめ背景の諧調を測定し、その値を基準として二値化のしきい値を決定することが好ましい。

工程８では、黒データの画素をカウントし、黒の面積として画素数（ピクセル数）を表示させ、これをメラニン量とする。

以上の工程を経ることで、短時間でかつ安全に、メラニン顆粒のみを選択的に観察できる角層試料の調製方法、及び調製した試料を用いた皮膚角層のメラニンの状態、並びにメラニン量を測定評価する方法が提供される。さらに観察画像を二値化することで、容易に角層中のメラニン量を測定することができる。

以下に試験例を示し、本発明を具体的に説明する。
＜試験１＞
本試験においては、本発明の方法によって角層中のメラニンを直接観察した試験例を示す。
１．試験方法
皮膚の角層剥離用粘着テープとして２．５ｃｍ×２．５ｃｍの角質チェッカー（アサヒバイオメッド社）を用いた。
被験者の女性頸部より前記の角質チェッカーを用いて、テープストリッピング法により角層を採取した。
採取した角層を透明スライドガラス上にメンディングテープを用いて貼り付け、次亜塩素酸塩水溶液として市販の塩素系漂白剤（キッチンハイター：次亜塩素酸ナトリウム６質量％含有）を滴下した。室温で５分間静置した後に精製水洗浄後、風乾させ、これを観察試料として４０倍の対物レンズを用いて顕微鏡で観察を行った。また比較のため、採取した角層試料（次亜塩素酸塩処理を行なわなかった試料）を同様の条件で顕微鏡観察を行った。

２．結果
次亜塩素酸塩水溶液を滴下した角層試料は、メラニンの黒点以外、観察画面の背景が均一の状態に変化し、メラニン顆粒以外は透明化した。一方比較対照の角層試料は、角層を構成する細胞壁や細胞構造が画面全体様々な濃淡で観察されて、メラニン顆粒の判別が困難であった。
図１に、採取した角層の観察画像（処理前）および次亜塩素酸塩水溶液（塩素系漂白剤）を滴下した処理を行った角層試料（処理後）の観察画像を示す。右図（処理後）の画像中で、周囲の均一な背景中より濃く出現している顆粒状のスポットは、下記の試験２で確認したようにメラニン顆粒であった。

＜試験２＞
試験１で観察された顆粒がメラニン顆粒であるか同定するために、角層中のメラニン顆粒をフォンタナマッソン法により染色した。
１．試験方法
試験１と同様に採取した角層試料に、メラニン染色のため５％硝酸銀を含むフォンタナアンモニア銀液（武藤化学株式会社）を滴下した。１２時間室温に静置して、メラニン顆粒を選択的に染色した。染色後、精製水で洗浄し、顕微鏡観察を行い、メラニン顆粒の観察画像を撮影した。
顕微鏡観察を行った後、さらにこの角層試料に上記試験１と同様に次亜塩素酸塩水溶液を滴下した。室温で５分間静置した後に精製水洗浄後、風乾させ、これを観察試料として再度顕微鏡で観察を行った。

２．結果
図２に示すとおり、フォンタナアンモニア銀液によりメラニン顆粒が黒色に染色される。しかし同時に角層試料中のタンパク質や細胞壁なども染色された（図２処理前画像）。
一方、この試料を、これに次亜塩素酸塩水溶液を滴下処理することで、メラニン顆粒がより顕著に確認できるようになった（図２の処理画像参照）。次亜塩素酸塩水溶液処理は、メラニン顆粒には影響がないことが確認された。
したがって、試験１で確認された顆粒はメラニン顆粒であると考えられた。

＜試験３＞
本発明の適用性を確認するため、複数の被験者を対象に試験を行った。
１．試験方法
粘着テープとして２．５ｃｍ×２．５ｃｍの角質チェッカー（アサヒバイオメッド社）を用いて、肌の色調や状態の異なる４名の被験者から、前腕内側部よりテープストリッピングにより角層試料を採取、観察用に透明スライドグラスに試料を貼り付けた。
採取した４名の被験者の角層の観察用スライドグラスを、それぞれＩＤ：１、ＩＤ：２、ＩＤ：３、ＩＤ：４と試料名を付した。この試料について、顕微鏡で観察しデジタルカメラで観察画像を撮影した。ついで、この観察試料に上記試験１と同様に次亜塩素酸塩水溶液を滴下した。室温で５分間静置した後に精製水洗浄後、風乾させ、これをメラニン顆粒観察試料とした。

２．顕微鏡観察
メラニン顆粒観察試料を用いて顕微鏡観察を行なうと同時に、デジタルカメラで撮影を行った。

３．画像データの取り込みと二値化データ処理
デジタルカメラで撮影した画像データをコンピュータに取り込み、ＩｍａｇｅＪを用いて、画像処理を行った。
取得した画像をＩｍａｇｅＪにてグレースケール画像（０～２５６諧調）に変換した。このうち顆粒以外の背景部分を削除して面積を求めるために、背景の諧調を測定した。その結果４画像の平均は１４７であった。より厳密に背景ノイズを排除するために、しきい値を１３５に設定し画像を２値化し、メラニン顆粒の画像のみを抽出した。本抽出画像より、１５００×１５００ｐｉｘｅｌｓの画像に含まれるメラニン顆粒の総画素数（ｐｉｘｅｌｓ）を求めた。
この画素数出力をメラニン量とした。

４．結果
採取した角層試料の顕微鏡観察画像を図３、次亜塩素酸塩水溶液で処理した角層試料の観察画像を図４、二値化データ処理後の観察画像を図５に示した。図３では顆粒以外の角層構造部分も観察されるが、図４に示す次亜塩素酸塩水溶液処理後では角層構造はわずかに観察されるものの、メラニン顆粒が主に観察され、ＩＤ１、４、２、３の順にメラニン顆粒が多いことがわかった。さらに、図５に示すように、しきい値を設定して画像を二値化することで、角層構造は認識されず、メラニン顆粒のみが抽出された画像を得た。

二値化した画像から出力された各被験者のメラニン量（画素量ｐｉｘｅｌｓ）ならびにメラニン面積率（％）は次のとおりであった。
ＩＤ：１１１０８６ｐｉｘｅｌｓ、０．４９％
ＩＤ：２１４８９ｐｉｘｅｌｓ、０．０７％
ＩＤ：３１２０３ｐｉｘｅｌｓ、０．０５％
ＩＤ：４３２０１ｐｉｘｅｌｓ、０．１４％

次亜塩素酸塩水溶液処理後の画像観察結果と、二値化画像から算出したメラニン量ならびにメラニン面積率の順位は良く一致し、個人個人で異なるメラニン量の違いを検出することができた。

＜試験４＞
次亜塩素酸塩水溶液とその他水溶液による比較試験
１．試験方法
試験１で採取した角層試料を用いて、その他の水溶液の効果を比較した。
・試験に用いた水溶液
蒸留水（Ｈ_２Ｏ）、４０％尿素水溶液（Ｕｒｅａ：ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、３０質量％過酸化水素水（Ｈ_２Ｏ_２：富士フィルム和光純薬株式会社）、次亜塩素酸ナトリウム溶液（塩素系漂白剤）、１０質量％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、１Ｎ水酸化ナトリウム（富士フィルム和光純薬株式会社）、１２Ｍ塩酸（富士フィルム和光純薬株式会社）をそれぞれ角層試料に滴下し、室温で１５分静置した。その後、精製水で洗浄し、風乾後顕微鏡観察を行った。

２．結果
図６に観察画像を示した。次亜塩素酸ナトリウム溶液（塩素系漂白剤）、ＳＤＳ１０質量％水溶液を滴下した試料画像が、メラニンの黒点以外、観察画面の背景が均一の状態に変化し、メラニン顆粒以外は透明化した。一方他の角層試料は、角層を構成する細胞壁や細胞構造が画面全体様々な濃淡で観察されて、メラニン顆粒の判別が困難であった。

＜試験５＞
試験４で効果が確認されたＳＤＳならびに次亜塩素酸塩の適切な濃度を検討した。
１．試験方法
試験１で採取した角層試料を用いて、次亜塩素酸塩及びＳＤＳの最適濃度を検討した。
次亜塩素酸塩として、次亜塩素酸ナトリウム水溶液（富士フィルム和光純薬株式会社）を濃度１００質量％より精製水にて３倍公比にて希釈した７段階の濃度の水溶液、ＳＤＳ水溶液を２０％より精製水にて２倍公比にて希釈した７段階の濃度の水溶液を調製した。これらの水溶液及び精製水を、それぞれ角層に滴下し、室温で１５分静置後、精製水にて洗浄し、顕微鏡下にて観察を行った。

２．結果
図７にＳＤＳを用いた場合の画像、図８に次亜塩素酸ナトリウムの顕微鏡観察画像を示した。ＳＤＳは５質量％以上の濃度で、次亜塩素酸ナトリムは１．２質量％以上の濃度で、メラニン顆粒が観察しやすい状態になった。
なお、ＳＤＳ２．５質量％、次亜塩素酸ナトリウム０．４質量％では、やや観察しにくいものの、メラニン顆粒が明瞭に観察された。この濃度以下では効果がなかった。
したがって、ＳＤＳの濃度は２．５質量％、次亜塩素酸ナトリウムの濃度は０．４質量％が境界値であると考えられた。

Claims

角層試料を、次亜塩素酸化合物及び／またはドデシル硫酸ナトリウムの溶液で処理し、メラニン以外の角層成分を透明化することを特徴とする顕微鏡観察用角層試料の調製方法。
角層試料がテープストリッピング法によって採取されたものである請求項１に記載の調製方法。
次亜塩素酸化合物が次亜塩素酸ナトリウムである請求項１または２に記載の調製方法。
次亜塩素酸ナトリウムの濃度が０．４質量％以上である請求項３記載の調製方法。
ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が２．５～２０質量％である請求項１～４のいずれかに記載の調製方法。
請求項１～５に記載のいずれかの方法で調製された角層試料を顕微鏡観察することによって皮膚角層のメラニン顆粒の状態を評価する評価方法。
請求項１～５に記載のいずれかの方法で調製された角層試料の顕微鏡観察画像を白黒の二値データ化し、黒のデータの画素（ピクセル）数値を求めることにより角層中メラニン量を測定する方法。
請求項１～５に記載のいずれかの方法で調製された角層試料の顕微鏡観察用試料から得たメラニン顆粒量のデータに基づき、皮膚の状態を解析する方法。