JP7226926B2

JP7226926B2 - ｃＤＮＡの合成方法、標的ＲＮＡの検出方法及び試薬キット

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Publication number: JP7226926B2
Application number: JP2018103590A
Authority: JP
Inventors: 佳那子増本; 祐希相原
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2023-02-21
Anticipated expiration: 2038-05-30
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Description

本発明は、cDNAを合成する方法に関する。また、本発明は、標的RNAを検出する方法に関する。さらに、本発明は、これらの方法に用いられる試薬キットに関する。

近年、マイクロRNA(miRNA)に代表される低分子のノンコーディングRNAが、発生、分化、細胞増殖、アポトーシスなどの様々な生物学的プロセスに重要な役割を果たしていることが明らかとなりつつある。このような機能的低分子RNAを検出及び定量することは、生命現象を解明する上で非常に重要である。一般に、RNAの検出には、逆転写反応によりRNAからcDNAを合成し、該cDNAをPCR法により増幅及び検出する方法がよく用いられる。しかし、miRNAの塩基長は20塩基程度と短いので、逆転写反応により得られたcDNAの両端にハイブリダイズするプライマーを設計することが困難である。

miRNAからcDNAを合成して増幅する方法として、例えば、特許文献１及び２に記載の方法が知られている。特許文献１には、miRNAとハイブリダイズしない領域を5’側に有するプライマーを用いてmiRNAの逆転写反応を行うことにより、miRNAよりも長いcDNAを合成することが開示されている(特許文献１の図１参照)。また、特許文献２には、miRNAとハイブリダイズする領域をオーバーハング部分として有するステム・ループ構造のプライマーを用いて、miRNAの逆転写反応を行うことが開示されている(特許文献２の図４参照)。特許文献２の方法では、逆転写反応後、プライマーのステム部分を解離することにより、miRNAよりも長いcDNAが得られる。特許文献１及び２の方法では、得られたcDNAを鋳型として用いることで、PCRによるcDNAの増幅が容易となる。

欧州特許第1851336号明細書米国特許第7575863号明細書

本発明者らは、特許文献１及び２の方法には、低分子RNAからのcDNAの合成及び増幅における感度及び特異性の点で改善の余地があることを見出した。本発明は、標的RNAからのcDNAの合成及び増幅をより高い精度で行うことのできる手段の開発を目的とする。

よって、本発明は、標的RNAと、第１オリゴヌクレオチド分子と、第２オリゴヌクレオチド分子と、逆転写酵素とを混合し、該標的RNAを鋳型としてcDNAを合成する方法を提供する。この方法において、第１オリゴヌクレオチド分子は、標的RNAとハイブリダイズする第１領域を3’末端に有し、第２オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズする第２領域を第１領域の5’側に有する。

本発明は、標的RNAと、第１オリゴヌクレオチド分子と、第２オリゴヌクレオチド分子と、逆転写酵素とを混合し、該標的RNAを鋳型としてcDNAを合成する工程と、該cDNAを増幅し、増幅産物を検出する工程とを含む、標的RNAを検出する方法を提供する。この方法において、第１オリゴヌクレオチド分子は、標的RNAとハイブリダイズする第１領域を3’末端に有し、第２オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズする第２領域を第１領域の5’側に有する。

本発明は、標的RNAとハイブリダイズする第１オリゴヌクレオチド分子と、該第１オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチド分子とを含む、試薬キットを提供する。この試薬キットにおいて、第１オリゴヌクレオチド分子は、標的RNAとハイブリダイズする第１領域を3’末端に有し、第２オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズする第２領域を第１領域の5’側に有する。

本発明によれば、標的RNAからのcDNAの合成及び増幅をより高い精度で行うことできる。

本実施形態の合成方法によるcDNAの合成及び増幅における反応原理を示した模式図である。本実施形態に係る試薬キットの外観の一例を示す図である。本実施形態に係る試薬キットの外観の一例を示す図である。本実施形態に係る試薬キットの外観の一例を示す図である。本実施形態に係る試薬キットの外観の一例を示す図である。特許文献１の方法により合成したcDNAをリアルタイムPCRで増幅したときの増幅プロットである。特許文献２の方法により合成したcDNAをリアルタイムPCRで増幅したときの増幅プロットである。本実施形態のcDNAの合成方法により合成したcDNAをリアルタイムPCRで増幅したときの増幅プロットである。第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域の塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有する第２オリゴヌクレオチド分子を用いた本実施形態のcDNAの合成方法により合成したcDNAをリアルタイムPCRで増幅したときの増幅プロットである。第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域の塩基配列に対して相補的でない塩基を含む第２オリゴヌクレオチド分子を用いた本実施形態のcDNAの合成方法により合成したcDNAをリアルタイムPCRで増幅したときの増幅プロットである。第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域の塩基配列に対して相補的でない塩基を含む第２オリゴヌクレオチド分子を用いた本実施形態のcDNAの合成方法により合成したcDNAをリアルタイムPCRで増幅したときの増幅プロットである。第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域の塩基配列に対して相補的でない塩基を含む第２オリゴヌクレオチド分子を用いた本実施形態のcDNAの合成方法により合成したcDNAをリアルタイムPCRで増幅したときの増幅プロットである。第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域の塩基配列に対して相補的でない塩基を含む第２オリゴヌクレオチド分子を用いた本実施形態のcDNAの合成方法により合成したcDNAをリアルタイムPCRで増幅したときの増幅プロットである。 3'末端にキャップ構造を導入した第２オリゴヌクレオチド分子を用いた本実施形態のcDNAの合成方法により合成したcDNAをリアルタイムPCRで増幅したときの増幅プロットである。 3'末端にキャップ構造を導入した第２オリゴヌクレオチド分子を用いた本実施形態のcDNAの合成方法により合成したcDNAをリアルタイムPCRで増幅したときの増幅プロットである。

本明細書において、「ハイブリダイズする」との表現は、所定のオリゴヌクレオチド(又はポリヌクレオチド)の全部又は一部分が、ストリンジェントな条件下で、別のオリゴヌクレオチド(又はポリヌクレオチド)の全部又は一部分と水素結合を介して二重鎖を形成することをいう。「ストリンジェントな条件」は、オリゴヌクレオチド(又はポリヌクレオチド)のハイブリダイゼーションを行う際に当業者が一般的に用いる条件であればよい。例えば、２つのオリゴヌクレオチド分子の間に少なくとも50%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも90%の配列同一性があるときに、一方のオリゴヌクレオチド分子が他方のオリゴヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズすることができる条件が挙げられる。ハイブリダイゼーションでのストリンジェンシーは、温度、塩濃度、オリゴヌクレオチドの塩基長及びGC含量、並びにハイブリダイゼーション緩衝液に含まれるカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件として、例えば、Sambrook, J.ら, 1998, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第２編), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載された条件などを用いることができる。

本明細書において、「完全に相補的な塩基配列」とは、所定のオリゴヌクレオチド(又はポリヌクレオチド)の全部又は一部分の塩基配列における全ての塩基に対して、ワトソン・クリックモデルの相補的塩基対を形成する塩基配列をいう。本明細書において、「ミスマッチ部位」とは、２つのオリゴヌクレオチド分子(又はポリヌクレオチド分子)がハイブリダイズしたときに、一方のオリゴヌクレオチド分子(又はポリヌクレオチド分子)の塩基配列中の所定の塩基に対して相補的でない塩基が、他方のオリゴヌクレオチド分子(又はポリヌクレオチド分子)の塩基配列の対応する位置に存在することにより、ワトソン・クリックモデルの相補的塩基対を形成できない部位をいう。

本明細書において、「反応系」とは、逆転写反応及び/又は核酸増幅反応に必要な成分が存在し、該反応が起こる限定された環境を意味する。例えば、逆転写反応の反応系としては、標的RNAと、第１オリゴヌクレオチド分子と、第２オリゴヌクレオチド分子と、逆転写酵素とを含む、チューブなどの容器に収められた反応液又はエマルションのような微小液滴が挙げられる。「逆転写酵素」は、「RNA依存性DNAポリメラーゼ」と同義である。

[１．cDNAの合成方法]
本実施形態のcDNAを合成する方法(以下、「合成方法」ともいう)では、標的RNAと、第１オリゴヌクレオチド分子と、第２オリゴヌクレオチド分子と、逆転写酵素とを混合し、該標的RNAを鋳型としてcDNAを合成する。

図１を参照して、本実施形態の合成方法における望ましい反応の一例について説明する。この合成方法において、第１オリゴヌクレオチド分子は、逆転写用プライマー(以下、「RTプライマー」ともいう)として機能する。第１オリゴヌクレオチド分子は、標的RNAとハイブリダイズする第１領域を3’末端に有し、第２オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズする第２領域を第１領域の5’側に有する。標的RNAと、第１オリゴヌクレオチド分子と、第２オリゴヌクレオチド分子と、逆転写酵素とを混合すると、図１の左側(１)に示されるように、第１オリゴヌクレオチド分子が、第１領域を介して標的RNAとハイブリダイズし、且つ第２領域を介して第２オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズする。図１の例では、第１領域は、標的RNAの3'末端を含む部分の塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有する。また、この例では、第２オリゴヌクレオチド分子は、第２領域と同じ塩基長であって、第２領域の塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有する。

上記の混合物を逆転写反応に適した温度条件下に置くことにより、図１の左側(２)に示されるように、逆転写酵素の作用により、標的RNA及び第２オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズした第１オリゴヌクレオチド分子の3’末端が伸長されて、cDNAが合成される。なお、cDNAは、厳密には標的RNAの相補鎖の部分であるが、本明細書においては、cDNAは、標的RNAの相補鎖だけではなく、第２領域も含むオリゴヌクレオチドをいう。すなわち、本明細書では、cDNAは、標的RNAを鋳型として伸長された第１オリゴヌクレオチド分子をいう。合成されたcDNAは、標的RNA及び／又は第２オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズしている場合があるが、熱変性などにより、標的RNA及び第２オリゴヌクレオチド分子は容易に除去できる。

図１に示されるように、第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域は、標的RNAとハイブリダイズしない領域であるので、標的RNAよりも長いcDNAを得ることができる。これにより、後に行うcDNA増幅に用いるプライマーの設計が容易となる。本実施形態の合成方法は、理論又は作用機序によって拘束されるものではないが、第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域と第２オリゴヌクレオチド分子との二重鎖が形成された状態で、第１オリゴヌクレオチド分子の3'末端を伸長することが、cDNA合成及びその後のcDNA増幅の精度及び特異性の向上に寄与していると推測される。

本実施形態の合成方法では、得られたcDNAを、PCR法などのDNA増幅法により増幅してもよい。この場合、鋳型として、cDNAを含む逆転写反応後の混合物をそのまま用いることができる。図１の例では、cDNAにハイブリダイズするプライマー(以下、「フォワードプライマー」という)、該cDNAの相補鎖にハイブリダイズするプライマー(以下、「リバースプライマー」という)及びポリメラーゼを用いる通常のPCR法によりcDNAを増幅する。PCRの１回目のサイクルでは、図１の右側(３)に示されるように、フォワードプライマーがcDNAにハイブリダイズする。そして、ポリメラーゼの作用によりフォワードプライマーが伸長されて、cDNAの相補鎖が合成される。

２回目のサイクルでは、図１の右側(４)に示されるように、フォワードプライマーがcDNAにハイブリダイズし、リバースプライマーがcDNAの相補鎖にハイブリダイズする。そして、ポリメラーゼの作用により各プライマーが伸長して、二本鎖DNAが得られる。ここで、逆転写反応後の混合物をそのままPCRに用いた場合、図１の例では、リバースプライマーは、該混合物に残存する第２オリゴヌクレオチド分子ともハイブリダイズし得る。しかし、第２オリゴヌクレオチド分子よりも十分に多い量のリバースプライマーを用いれば、増幅反応への影響はほとんどない。３回目以降のサイクルでは、図１の右側(５)に示されるように、二本鎖DNAを鋳型として指数関数的に増幅産物が得られる。

以下、本実施形態の合成方法に用いられる各成分について説明する。

標的RNAは特に限定されず、cDNAの合成を所望する任意のRNAから適宜選択できる。本実施形態では、RTプライマーとしての第１オリゴヌクレオチド分子を作製するため、標的RNAは、塩基配列が既知のRNAであることが好ましい。RNAの塩基配列の情報は、当該技術分野において公知のデータベース、例えばGenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)、miRBase (http://www.mirbase.org/search.shtml)などから得ることができる。

本実施形態の合成方法は、特にスモールRNAからのcDNA合成に適している。スモールRNAとは、塩基長が200未満であるノンコーディングRNAである。スモールRNAとしては、例えば、miRNA、核内低分子RNA(small nuclear RNA：snRNA)、核小体低分子RNA(small nucleolar RNA：snoRNA)、piwi相互作用RNA(piwi-interacting RNA：piRNA)、プライマリmiRNA(primary miRNA：pri-miRNA)、前駆体miRNA(precursor miRNA：pre-miRNA)、低分子干渉RNA(short interfering RNA：siRN)、低分子ヘアピンRNA(short hairpin RNA：shRNA)などが挙げられる。好ましい実施形態では、標的RNAは、15以上200未満の塩基長を有する一本鎖RNAである。

標的RNAの由来は特に限定されないが、生体又は生体試料から取得したRNAであってもよいし、人工的に合成されたRNAであってもよい。生体は、標的RNAを有する限り特に限定されず、真核生物であってもよいし、原核生物であってもよい。好ましい生体は、ヒトを含む哺乳動物である。生体試料としては、例えば、生体から採取した臓器、組織、細胞、体液などが挙げられる。体液としては、例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、唾液、尿などが挙げられる。また、生体試料は、培養細胞、細菌などの微生物及びウイルスの培養物、培養上清、可溶化物、抽出物などであってもよい。近年、エクソソーム中にmiRNAなどのスモールRNAが多量に含まれていることが知られている。本実施形態では、生体試料は、生体の体液などから単離したエクソソームであってもよい。

生体試料からRNAを抽出する方法自体は公知である。例えば、生体試料が細胞又は組織である場合、RNAの抽出は次にようにして行うことができる。まず、生体試料と、チオシアン酸グアニジン及び界面活性剤を含む可溶化液とを混合する。得られた混合液に物理的処理(撹拌、ホモジナイズ、超音波破砕など)を行い、生体試料に含まれるRNAを該混合液中に遊離させる。これにより、生体試料からRNAを抽出できる。抽出したRNAを精製してもよい。例えば、RNAを含む混合液を遠心分離して上清を回収し、この上清をフェノール／クロロホルム抽出することにより、RNAを精製できる。生体試料からのRNAの抽出及び精製は、市販のRNA抽出キットを用いて行ってもよい。

第１オリゴヌクレオチド分子は、第１領域を3’末端に有し、第２領域を該第１領域の5’側に有するオリゴヌクレオチド分子である。上述のように、第１オリゴヌクレオチド分子は、本実施形態の合成方法においてRTプライマーの役割を果たす。第１領域は、標的RNAとハイブリダイズする領域であり、第２領域は、第２オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズする領域である。本実施形態において、第１オリゴヌクレオチド分子は、逆転写反応による3'末端の伸長が可能である限り、第１領域及び第２領域に加えて、別の領域を有してもよい。好ましい実施形態では、第１オリゴヌクレオチド分子は、第１領域及び第２領域からなる。以下に、第１領域及び第２領域について説明する。

第１領域は、第１オリゴヌクレオチド分子の3’末端を含む領域である。第１オリゴヌクレオチド分子は、第１領域を介して標的RNAとハイブリダイズし、3'末端が伸長されることによりRTプライマーとして機能する。第１領域の塩基長は、逆転写反応の間、標的RNAとのハイブリダイゼーションを維持できる長さであれば、特に限定されない。第１領域は、例えば３以上15以下の塩基長、好ましくは４以上12以下の塩基長、より好ましくは６以上10以下の塩基長を有する。第１領域の塩基配列は、標的RNAとハイブリダイズすることができる塩基配列であれば、特に限定されない。好ましくは、第１領域の塩基配列は、標的RNAの一部分の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列である。標的RNAにおける第１領域がハイブリダイズする部分は、特に限定されないが、好ましくは標的RNAの3'末端を含む部分である。

第２領域は、第１領域の5’側に位置する領域である。第２領域は、第１オリゴヌクレオチド分子の5’末端を含む領域であってもよい。上述のように、第１オリゴヌクレオチド分子は、第２領域を介して第２オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズする。本実施形態では、第２領域の全部が、第２オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズしてもよい。あるいは、第２領域の一部分が、第２オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズしてもよい。したがって、第２領域の全部又は一部分が、第２オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズすることができる塩基配列を有する。好ましくは、第２領域の全部又は一部分の塩基配列は、第２オリゴヌクレオチド分子の全部の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列である。第２領域の塩基長は特に限定されないが、例えば10以上40以下の塩基長、好ましくは17以上40以下の塩基長、より好ましくは20以上40以下の塩基長である。

本実施形態の合成方法において、第２領域は、逆転写反応により合成される標的RNAの相補鎖に長さを付与する付加配列である。したがって、第２領域は、第２オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズするが、標的RNAとはハイブリダイズしない領域であることが好ましい。そのような第２領域の塩基配列は、標的RNAの塩基配列に応じて適宜決定できる。第２領域の塩基配列は、後に行うcDNAの増幅の効率にも影響し得るので、Tm値、GC含量などを考慮して塩基配列を決定することが好ましい。

第１オリゴヌクレオチド分子自体は、当該技術分野において公知のオリゴヌクレオチド合成方法により作製できる。第１オリゴヌクレオチド分子は、逆転写反応による3'末端の伸長が可能である限り、架橋型核酸(Bridged Nucleic Acid：BNA)、ホスホロチオエート(PS)-オリゴ、ペプチド核酸(Peptide Nucleic Acid：PNA)、モルホリノオリゴ、2’-Ｏ-置換RNAなどの従来公知の人工核酸を含んでいてもよい。

第２オリゴヌクレオチド分子は、第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域の全部又は一部分とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド分子である。本実施形態では、第２オリゴヌクレオチド分子は、第１オリゴヌクレオチド分子の第１領域とハイブリダイズしないことが好ましい。本実施形態の合成方法は、理論又は作用機序によって拘束されるものではないが、第２オリゴヌクレオチド分子は、第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域にハイブリダイズすることにより、該第２領域への予期せぬポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション及び非特異的結合を防止する役割を果たすと推測される。

第２オリゴヌクレオチド分子の塩基長は、第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域と同じ長さであってもよいし、第２領域よりも短くてもよい。例えば、第２オリゴヌクレオチド分子は、第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域の塩基長の35%以上100%以下、好ましくは35%以上95%以下、より好ましくは35%以上90%以下の塩基長を有する。

第２オリゴヌクレオチド分子が、第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域よりも短い塩基長を有する場合、複数の第２オリゴヌクレオチド分子、好ましくは２つ又は３つの第２オリゴヌクレオチド分子を用いてもよい。各第２オリゴヌクレオチド分子は、第２領域中の互いに異なる部分にハイブリダイズする。各第２オリゴヌクレオチド分子がハイブリダイズする第２領域中の部分は、隣接していてもよいし、離れていてもよい。

第２オリゴヌクレオチド分子の塩基配列は、第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域の塩基配列に応じて適宜決定できる。第２オリゴヌクレオチド分子の塩基配列は、第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域の全部又は一部分と完全に相補的な塩基配列であってもよい。あるいは、第２オリゴヌクレオチド分子の塩基配列は、第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域とハイブリダイズしたときにミスマッチ部位を生じる塩基(以下、「ミスマッチ塩基」ともいう)を含んでもよい。例えば、第２オリゴヌクレオチド分子におけるミスマッチ塩基の数の割合(以下、「ミスマッチ率」ともいう)は、50%以下、好ましくは40%以下、より好ましくは12%以下である。なお、ミスマッチ率は、下記の式により算出される。

(ミスマッチ率)＝｛(第２オリゴヌクレオチド分子におけるミスマッチ塩基の数)／(第２オリゴヌクレオチド分子の塩基長)｝×100

第２オリゴヌクレオチド分子がミスマッチ塩基を含む場合、第２オリゴヌクレオチド分子の塩基長は、第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域の塩基長の35%以上の塩基長を有することが好ましく、100%の塩基長を有することがより好ましい。

第２オリゴヌクレオチド分子は、塩基配列中にウラシルを含んでいてもよい。ウラシルを含む第２オリゴヌクレオチド分子を用いて本実施形態の合成方法を行った場合、合成されたcDNAにハイブリダイズしている第２オリゴヌクレオチド分子の一部又は全部を、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)により分解して除去することができる。

第２オリゴヌクレオチド分子自体は、当該技術分野において公知のオリゴヌクレオチド合成方法により作製できる。第２オリゴヌクレオチド分子は、BNA、PS-オリゴ、PNA、モルホリノオリゴ、2’-Ｏ-置換RNAなど従来公知の人工核酸を含んでいてもよい。

本実施形態では、第２オリゴヌクレオチド分子の3’末端は、伸長しないように修飾されてもよい。そのような修飾としては、例えばリン酸化、ビオチン化などが挙げられる。また、第２オリゴヌクレオチド分子の3’末端に、ジデオキシリボヌクオチド、アミノリンカーなどの修飾基を導入することによっても、3’末端が伸長しないようにすることができる。

本実施形態では、第２オリゴヌクレオチド分子は、第２領域との結合の安定性が向上するように修飾されてもよい。そのような修飾としては、例えば5’末端又は3’末端へのキャップ構造の導入が挙げられる。5’末端へ導入するキャップ構造としては、例えばピレン基、トリメトキシスチルベン基などが挙げられる。3’末端へ導入するキャップ構造としては、例えば2'-(アントラキノン-2-イル-カルボキシアミド)-2'-デオキシウリジン基(以下、「Uaq」ともいう)などが挙げられる。キャップ構造の導入によりTm値が向上するので、相補鎖との結合が安定することが知られている。

逆転写酵素は特に限定されず、公知の逆転写酵素から適宜選択できる。逆転写酵素としては、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)逆転写酵素などが挙げられる。また、市販の逆転写反応キットに含まれる酵素を用いてもよい。

本実施形態では、例えば、標的RNAと、第１オリゴヌクレオチド分子と、第２オリゴヌクレオチド分子と、逆転写酵素とを水(好ましくはヌクレアーゼフリーの水)中に混合し、得られた混合物(以下、「RT用組成物」ともいう)を逆転写反応に適した温度条件下に置くことにより、cDNAが合成される。RT用組成物には、緩衝液(例えばTris-HClなど)、dNTP(dATP、dCTP、dGTP及びdTTPの混合物)、無機塩(例えばNaCl、KClなど)、RNaseインヒビターなどの一般的な逆転写反応に用いられる試薬類をさらに加えてもよい。そのような試薬類は、市販の逆転写反応キットにも含まれる。上記の各成分を混合する順序は、特に限定されない。本実施形態では、第１オリゴヌクレオチド分子と第２オリゴヌクレオチド分子とをあらかじめ混合して用いてもよい。しかし、第１オリゴヌクレオチド分子と第２オリゴヌクレオチド分子とをあらかじめハイブリダイズしておく必要はない。これらのオリゴヌクレオチド分子は、逆転写反応に適した温度条件下で自発的にハイブリダイズする。

第１オリゴヌクレオチド分子及び第２オリゴヌクレオチド分子の添加量は、特に限定されない。RT用組成物における第１オリゴヌクレオチド分子及び第２オリゴヌクレオチド分子の終濃度はそれぞれ、10 nM以上1000 nM以下、好ましくは10 nM以上250 nM以下の範囲から適宜決定できる。RT用組成物における第２オリゴヌクレオチド分子の終濃度は、第１オリゴヌクレオチド分子の終濃度と同じであってもよいし、異なっていてもよい。

本実施形態の合成方法における温度条件は、通常の逆転写反応の条件と特に変わるところはない。用いる逆転写酵素の種類などに応じて、公知の逆転写反応の温度条件から適宜選択できる。本実施形態では、市販のサーマルサイクラーを用いて逆転写反応を行うことができる。

合成されたcDNAには、第２オリゴヌクレオチド分子がハイブリダイズしている場合がある。本実施形態の合成方法では、必要に応じて、cDNAの合成後に、第２オリゴヌクレオチド分子の少なくとも一部を除去する工程を含んでもよい。例えば、逆転写反応後のRT用組成物を90℃～99℃で加熱すると、熱変性により第２オリゴヌクレオチド分子はcDNAから解離する。第２オリゴヌクレオチド分子がウラシルを含む場合、cDNAの合成後に、UNGにより第２オリゴヌクレオチド分子の少なくとも一部を分解できる。例えば、逆転写反応後のRT用組成物にUNGを添加して所定の温度(例えば25℃)でインキュベートすることにより、cDNAにハイブリダイズしている第２オリゴヌクレオチド分子のウラシルが除去される。ウラシルを失った部分は構造的に不安定であるので、RT用組成物を90℃～99℃で加熱すると、第２オリゴヌクレオチド分子は、ウラシルを失った部分で切断される。これにより、第２オリゴヌクレオチド分子の一部又は全部が分解される。

本実施形態では、同一の反応系において、塩基配列の異なる２種以上の標的RNAを鋳型としてcDNAを合成してもよい。この場合、各標的RNAの塩基配列に応じた第１領域を有する複数の第１オリゴヌクレオチド分子を用いることで、マルチプレックスの逆転写反応を行うことができる。第２領域の塩基配列は、複数の第１オリゴヌクレオチド分子の間で同じであってもよいし、互いに異なっていてもよい。第２オリゴヌクレオチド分子は、第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域の塩基配列に応じて適宜設計できる。

本実施形態の合成方法は、cDNAを増幅する工程をさらに含んでもよい。cDNAの増幅自体は、PCR法、リアルタイムPCR法などの当該技術分野において公知のDNA増幅法により行うことができる。cDNAの増幅は、例えば、cDNAと、該cDNAにハイブリダイズするフォワードプライマーと、該cDNAの相補鎖にハイブリダイズするリバースプライマーと、ポリメラーゼとを混合するにより行われる。第１オリゴヌクレオチド分子もcDNAの相補鎖にハイブリダイズできるので、cDNAの増幅のために、リバースプライマーに替えて、第１オリゴヌクレオチド分子を用いてもよい。

フォワードプライマー及びリバースプライマーは、cDNAの塩基配列、すなわち標的RNA及び第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域の塩基配列に基づいて適宜設計できる。各プライマーの塩基長は、通常５以上50以下、好ましくは10以上40以下である。なお、プライマー自体は、当該技術分野において公知のオリゴヌクレオチド合成方法により作製できる。

フォワードプライマー及びリバースプライマーの添加量は、特に限定されない。PCR用組成物におけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの終濃度はそれぞれ、0.1μM以上1.5μM以下、好ましくは0.35μM以上1.5μM以下の範囲から適宜決定できる。PCR用組成物におけるリバースプライマーの終濃度は、フォワードプライマーの終濃度と同じであってもよいし、異なっていてもよい。

フォワードプライマー及びリバースプライマーは、BNA、PS-オリゴ、PNA、モルホリノオリゴ、2’-Ｏ-置換RNAなど従来公知の人工核酸を含んでいてもよい。また、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、公知の標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、放射性同位元素(例えば³²P、³⁵S、³H、¹⁴Cなど)、蛍光色素(例えばFITC、Texas Red(商標)、Alexa Fluor(商標)、6-FAM、TAMRAなど)、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。

ポリメラーゼは、DNA増幅に適するポリメラーゼであれば特に限定されない。そのようなポリメラーゼは、公知の耐熱性DNAポリメラーゼから適宜選択でき、例えばTaq、Pfu、Tth、KODなどが挙げられる。また、市販のPCRキットに含まれるポリメラーゼを用いてもよい。

本実施形態では、cDNAと、フォワードプライマーと、リバースプライマー及び／又は第１オリゴヌクレオチド分子と、ポリメラーゼとを水中に混合し、得られた混合物(以下、「PCR用組成物」ともいう)をDNA増幅に適した温度条件下に置くことにより、cDNAを鋳型として二本鎖DNAが得られる。PCR用組成物には、緩衝液(例えばTris-HClなど)、dNTP、無機塩(例えばNaCl、KClなど)などの一般的なDNA増幅反応に用いられる試薬類をさらに加えてもよい。そのような試薬類は、市販のPCRキットなどにも含まれる。上記の各成分を混合の順序は、特に限定されない。本実施形態では、フォワードプライマーと、リバースプライマー及び／又は第１オリゴヌクレオチド分子とをあらかじめ混合して用いてもよい。

リアルタイムPCR法によりcDNAを増幅する場合は、PCR用組成物に、蛍光を発するインターカレーター(例えばSYBR(登録商標)Greenなど)、5'末端が蛍光物質で修飾され且つ3'末端がクエンチャー物質で修飾された蛍光標識プローブ(例えばTaqMan(商標)プローブなど)をさらに加えてもよい。

cDNAの増幅おける温度条件は、通常のPCR法又はリアルタイムPCR法の条件と特に変わるところはない。用いるポリメラーゼの種類、プライマーのTm値などに応じて、公知のDNA増幅反応の温度条件から適宜選択できる。本実施形態では、市販のサーマルサイクラー又はリアルタイムPCR装置を用いてcDNAの増幅を行うことができる。

本実施形態では、鋳型となるcDNAとして、逆転写反応後のRT用組成物をそのまま用いてもよい。該組成物中のcDNAは、第２オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズしている場合があるが、DNA増幅における熱変性工程により、第２オリゴヌクレオチド分子はcDNAから解離する。第２オリゴヌクレオチド分子がウラシルを含む場合、逆転写反応後のRT用組成物にUNGを添加して所定の温度(例えば25℃)でインキュベートしてからDNA増幅を行うことにより、cDNAにハイブリダイズしている第２オリゴヌクレオチド分子の一部又は全部を分解して除去することができる。

本実施形態では、cDNAの合成工程と、cDNAの増幅工程とを同一の反応系で行ってもよい。この場合、例えば、標的RNAと、第１オリゴヌクレオチド分子と、第２オリゴヌクレオチド分子と、逆転写酵素と、フォワードプライマーと、リバースプライマーと、ポリメラーゼとを混合する。得られた混合物を、まず逆転写反応に適した温度条件下に置き、cDNAの合成を行う。次いで、該混合物をDNAの増幅反応に適した温度条件下に置き、cDNAの増幅を行う。逆転写反応とcDNAの増幅反応との間に、混合物を別の容器に移し替える必要はない。これにより、逆転写反応とcDNAの増幅反応とを同一の反応系で行うことができる。逆転写酵素及びポリメラーゼに替えて、逆転写活性とDNAポリメラーゼ活性の両方を有する酵素(例えばTthなど)を用いてもよい。上記の混合物には、緩衝液(例えばTris-HClなど)、dNTP、無機塩(例えばNaCl、KClなど)、RNaseインヒビターなどの一般的な逆転写反応及びDNA増幅反応に用いられる試薬類をさらに加えてもよい。

[２．標的RNAの検出方法]
本発明の範囲には、標的RNAを検出する方法(以下、「検出方法」ともいう)も含まれる。本実施形態の検出方法では、まず、標的RNAと、第１オリゴヌクレオチド分子と、第２オリゴヌクレオチド分子と、逆転写酵素とを混合し、該標的RNAを鋳型としてcDNAを合成する。cDNAの合成(逆転写反応)に用いられる各成分及び逆転写反応の条件などに関する詳細は、上記の本実施形態の合成方法について述べたことと同じである。

次に、実施形態の検出方法では、合成したcDNAを増幅し、該cDNAの増幅産物を検出する。cDNAの増幅に用いられる各成分及び増幅反応の条件などに関する詳細は、上記の本実施形態の合成方法について述べたことと同じである。本明細書において、「検出する」とは、増幅産物の存否を定性的に判定すること、増幅産物を定量すること、及び増幅産物の存在量を半定量的に検出することを含む。半定量的検出とは、増幅産物の存在量を「-」、「＋」、「＋＋」(陰性、弱陽性、強陽性)などのように段階的に示すことをいう。例えば、増幅産物が検出されたという結果が得られた場合、その結果は、標的RNAの存在を示す。

増幅産物を検出する手段は特に限定されず、公知の方法から適宜選択できる。例えば、増幅産物を電気泳動により検出してもよい。具体的には、増幅反応後の反応液を、エチジウムブロミドを含むアガロースゲルに電気泳動することで、増幅産物の有無、存在する場合はその量を確認できる。また、増幅反応後の反応液から、蛍光強度、濁度、吸光度などの光学的情報を取得することにより、増幅産物を検出してもよい。例えば、SYBR(商標) Greenなどの二本鎖DNAに結合可能な蛍光物質を用いるインターカレーター法により蛍光強度を測定することで、増幅産物を検出してもよい。

あるいは、5'末端が蛍光物質で修飾され且つ3'末端がクエンチャー物質で修飾された蛍光標識プローブ(例えばTaqMan(商標)プローブなど)を用いる方法により、該プローブから生じた蛍光を検出することで、増幅産物を検出してもよい。そのようなプローブは、検出対象の増幅産物において上記のフォワードプライマー及び/又はリバースプライマーがハイブリダイズする領域とは異なる領域にハイブリダイズするように設計される。PCR用組成物における蛍光標識プローブの終濃度は、特に限定されず、例えば0.1μM以上５μM以下、好ましくは0.2μM以上0.8μM以下の範囲から適宜決定できる。

[３．試薬キット]
本発明の範囲には、試薬キットも含まれる。この試薬キットは、本実施形態の合成方法及び本実施形態の検出方法を実施するために用いることができる。本実施形態の試薬キットは、標的RNAとハイブリダイズする第１オリゴヌクレオチド分子と、該第１オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチド分子とを含む。第１オリゴヌクレオチド分子及び第２オリゴヌクレオチド分子の詳細は、上記の本実施形態の合成方法について述べたことと同じである。

第１オリゴヌクレオチド分子及び第２オリゴヌクレオチド分子をそれぞれ収容した容器は、箱に収容されてユーザに提供されてもよい。この箱は、上記の容器を全て同梱してもよいし、一部の容器を収容してもよい。この箱には、第１オリゴヌクレオチド分子及び第２オリゴヌクレオチド分子の使用方法などを記載した添付文書が同梱されてもよい。図２Ａに、本実施形態の試薬キットの一例を示す。図中、１０は、試薬キットを示し、１１は、第１オリゴヌクレオチド分子を収容した第１容器を示し、１２は、第２オリゴヌクレオチド分子を収容した第２容器を示し、１３は、梱包箱を示し、１４は、添付文書を示す。

第１容器中の第１オリゴヌクレオチド分子の濃度は、RT用組成物の調製に用いた場合に上記の終濃度に調整できる濃度であればよい。したがって、該容器中の第１オリゴヌクレオチド分子の濃度は、RT用組成物の総量と、第１オリゴヌクレオチド分子の添加量との体積比から適宜決定できる。本実施形態では、第１容器中の第１オリゴヌクレオチド分子の濃度は、例えば0.05μM以上100μM以下、好ましくは0.25μM以上10μM以下である。

第２容器中の第２オリゴヌクレオチド分子の濃度も、第１オリゴヌクレオチド分子の濃度と同様に決定できる。本実施形態では、第２容器中の第２オリゴヌクレオチド分子の濃度は、例えば0.05μM以上100μM以下、好ましくは0.25μM以上10μM以下である。第２容器中の第２オリゴヌクレオチド分子の濃度は、第１容器中の第１オリゴヌクレオチド分子の濃度と同じであってもよいし、異なっていてもよい。

本実施形態の試薬キットは、逆転写酵素をさらに備えてもよい。また、本実施形態の試薬キットは、dNTPをさらに備えてもよい。逆転写酵素自体は当該技術分野において公知であり、例えばAMV、MMLVなどのレトロウイルスに由来する酵素などから適宜選択できる。dNTPは、dATP、dCTP、dGTP及びdTTPの混合物であればよい。図２Ｂに、逆転写酵素及びdNTPをさらに備える試薬キットの一例を示す。図中、２０は、試薬キットを示し、２１は、第１オリゴヌクレオチド分子を収容した第１容器を示し、２２は、第２オリゴヌクレオチド分子を収容した第２容器を示し、２３は、逆転写酵素を収容した第３容器を示し、２４は、dNTPを収容した第４容器を示し、２５は、梱包箱を示し、２６は、添付文書を示す。図示しないが、本実施形態の試薬キットは、逆転写反応に適した緩衝液をさらに備えてもよい。

本実施形態の試薬キットは、第１オリゴヌクレオチド分子の伸長により合成されるcDNAにハイブリダイズするフォワードプライマーと、該cDNAの相補鎖にハイブリダイズするリバースプライマーとをさらに備えてもよい。フォワードプライマー及びリバースプライマーの詳細は、上記の本実施形態の合成方法について述べたことと同じである。図２Ｃに、フォワードプライマー及びリバースプライマーをさらに備える試薬キットの一例を示す。図中、３０は、試薬キットを示し、３１は、第１オリゴヌクレオチド分子を収容した第１容器を示し、３２は、第２オリゴヌクレオチド分子を収容した第２容器を示し、３３は、逆転写酵素を収容した第３容器を示し、３４は、dNTPを収容した第４容器を示し、３５は、フォワードプライマーを収容した第５容器を示し、３６は、リバースプライマーを収容した第６容器を示し、３７は、梱包箱を示し、３８は、添付文書を示す。図示しないが、本実施形態の試薬キットは、逆転写反応に適した緩衝液をさらに備えてもよい。

第５容器中のフォワードプライマーの濃度は、PCR用組成物の調製に用いた場合に上記の終濃度に調整できる濃度であればよい。したがって、該容器中のフォワードプライマーの濃度は、PCR用組成物の総量と、フォワードプライマーの添加量との体積比から適宜決定できる。本実施形態では、第５容器中のフォワードプライマーの濃度は、例えば６μM以上100μM以下、好ましくは15μM以上100μM以下である。

第６容器中のリバースプライマーの濃度も、フォワードプライマーの濃度と同様に決定できる。本実施形態では、第６容器中のリバースプライマーの濃度は、例えば３μM以上100μM以下、好ましくは15μM以上100μM以下である。第６容器中のリバースプライマーの濃度は、第５容器中のフォワードプライマーの濃度と同じであってもよいし、異なっていてもよい。

本実施形態の試薬キットは、ポリメラーゼをさらに備えてもよい。また、本実施形態の試薬キットは、蛍光標識プローブをさらに備えてもよい。ポリメラーゼ及び蛍光標識プローブの詳細は、上記の本実施形態の合成方法及び検出方法について述べたことと同じである。図２Ｄに、ポリメラーゼ及び蛍光標識プローブをさらに備える試薬キットの一例を示す。図中、４０は、試薬キットを示し、４１は、第１オリゴヌクレオチド分子を収容した第１容器を示し、４２は、第２オリゴヌクレオチド分子を収容した第２容器を示し、４３は、逆転写酵素を収容した第３容器を示し、４４は、dNTPを収容した第４容器を示し、４５は、フォワードプライマーを収容した第５容器を示し、４６は、リバースプライマーを収容した第６容器を示し、４７は、ポリメラーゼを収容した第７容器を示し、４８は、蛍光標識プローブを収容した第８容器を示し、４９は、梱包箱を示し、５０は、添付文書を示す。図示しないが、本実施形態の試薬キットは、逆転写反応に適した緩衝液及びDNA増幅反応に適した緩衝液をさらに備えてもよい。

第８容器中の蛍光標識プローブの濃度は、PCR用組成物の調製に用いた場合に上記の終濃度に調整できる濃度であればよい。したがって、該容器中の蛍光標識プローブの濃度は、PCR用組成物の総量と、蛍光標識プローブの添加量との体積比から適宜決定できる。本実施形態では、第８容器中の蛍光標識プローブの濃度は、例えば２μM以上25μM以下、好ましくは２μM以上10μM以下である。

本実施形態では、第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド、フォワードプライマー及びリバースプライマーのうちの少なくとも２種が、同一の容器に収容されてもよい。好ましくは、第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドが、同一の容器に収容される。あるいは、フォワードプライマー及びリバースプライマーが、同一の容器に収容される。より好ましくは、第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドが、同一の容器に収容され、且つ、フォワードプライマー及びリバースプライマーが、別の同一の容器に収容される。

以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１
実施例１では、特許文献１の方法、特許文献２の方法及び本実施形態の合成方法によって標的RNA(miRNA)からcDNAを合成し、該cDNAをリアルタイムPCRにより増幅及び検出した。そして、増幅産物の検出下限及び定量下限を比較した。実施例１では、実験をトリプリケートで行った。

(１) cDNAの合成
(1.1) 標的RNA及び逆転写用プライマー
標的RNAとして、配列番号１で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた。この塩基配列は、miR302aの塩基配列である。逆転写用プライマー(以下、「RTプライマー」と呼ぶ)として、配列番号２で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた。このオリゴヌクレオチドは、特許文献１の方法に用いられるRTプライマーであると同時に、本実施形態の合成方法で用いられる第１オリゴヌクレオチド分子でもある。配列番号２で示される塩基配列において、5'側から数えて１番目から24番目までの塩基配列は、標的RNAとハイブリダイズしない領域(第２領域)であり、25番目から34番目までの塩基配列は、標的RNAとハイブリダイズする領域(第１領域)である。特許文献２の方法に用いられるステム・ループ型RTプライマーとして、配列番号３で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた。本実施形態の合成方法で用いられる第２オリゴヌクレオチド分子として、配列番号４で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた。この塩基配列は、配列番号２で示される塩基配列の5'側から数えて１番目から24番目までの塩基配列と完全に相補的である。各オリゴヌクレオチドの塩基配列を以下に示す。なお、下線部は、標的RNAと各RTプライマーとがハイブリダイズする領域を示す。

・標的RNA(miR302a)：5'- UAAGUGCUUCCAUGUUUUGGUGA -3'(配列番号１)
・RTプライマー：5'- CGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACCAAAAC -3'(配列番号２)
・ステム・ループ型RTプライマー：5'- GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACCAAAAC -3'(配列番号３)
・第２オリゴヌクレオチド分子：5'- GTCGTATCCAGTGCGAATACCTCG -3'(配列番号４)

(1.2) 逆転写反応
上記のオリゴヌクレオチド及びTaqMan(商標) MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems社、製品番号4366597)を用いて、下記の組成の混合物を調製した。当該キットには、100 mM dNTP、10×バッファー、RNaseインヒビター及び逆転写酵素が含まれていた。本実施形態の合成方法では、配列番号２のRTプライマー及び第２オリゴヌクレオチド分子をあらかじめ混合して、250 nMのRTプライマーとして調製した。標的RNAの濃度をヌクレアーゼフリーの水で調整して、１μL当たり500、10³、10⁴、10⁵、10⁶又は10⁷コピーのmiRNAを含む溶液を得た。本実施形態の合成方法及び特許文献１の方法では、標的RNAとして、１μL当たり10³、10⁵及び10⁷コピーのmiRNAを含む溶液を用いた。特許文献２の方法では、標的RNAとして、１μL当たり500、10³、10⁴、10⁵及び10⁶コピーのmiRNAを含む溶液を用いた。また、標的RNAに替えて酵母tRNAを用いたこと以外は同様に混合物を調製して、ネガティブコントロールを得た。

＜１ウェル当たりの組成＞
ヌクレアーゼフリーの水 8.16μL
100 mM dNTP 0.15μL
10×バッファー 1.5μL
RNaseインヒビター 0.19μL
逆転写酵素 1μL
250 nM RTプライマー 3μL
標的RNA 1μL
トータル 15μL

調製した混合物をGeneAmp PCRSystem 9700 (Applied Biosystems社)にセットし、16℃で30分、42℃で30分、85℃で５分の温度条件で逆転写反応を行った。

(２) リアルタイムPCRによるcDNAの増幅及び検出
(2.1) PCR用プライマーセット及びプローブ
フォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブとして、それぞれ配列番号５、６及び７で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた。各オリゴヌクレオチドの塩基配列を以下に示す。フォワードプライマー及びリバースプライマーを混合して、プライマーミックスを調製した。プライマーミックスにおけるフォワードプライマーの濃度は30μMであり、リバースプライマーの濃度は15μMであった。プローブは、5'末端が蛍光物質で修飾され、3'末端がクエンチャー物質で修飾されたTaqMan(商標)プローブであった。

・フォワードプライマー：5'- TAAGTGCTTCCATGTTT -3'(配列番号５)
・リバースプライマー：5'- CGAGGTATTCGCA -3'(配列番号６)
・TaqMan(商標)プローブ：5'- ATACGACTCACCA -3'(配列番号７)

(2.2) リアルタイムPCR
上記の逆転写産物、プライマーミックス及びプローブ、並びにTaqMan(商標) Universal Master Mix II, with UNG (Applied Biosystems社、製品番号4440038)を用いて、下の組
成の混合物を調製した。

＜１ウェル当たりの組成＞
プライマーミックス 1μL
8μMプローブ 2μL
マスターミックスII 10μL
逆転写産物 1.33μL
蒸留水 5.67μL
トータル 20μL

調製した混合物を7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems社)にセットし、下記の温度条件でPCRを行った。なお、加熱及び冷却は、1.6℃/秒の速度で行った。
＜温度条件＞
95℃で10分、
95℃で15秒、55℃で60秒を40サイクル。

(３) 解析及び結果
特許文献１の方法、特許文献２の方法及び本実施形態の合成方法で得られた増幅プロットを、それぞれ図３～５に示す。これらのプロットにおいて、横軸はサイクル数を示し、縦軸は蛍光強度の変化(ΔRn)を示す。図中、「10^3」、「10^5」、「10^6」及び「10^7」は、それぞれ10³、10⁵、10⁶及び10⁷コピーの標的RNAを含む検体に由来するcDNA増幅産物を示す。「NC」は、ネガティブコントロールを示す。特許文献１及び特許文献２の方法で得られた増幅プロットでは、ΔRnの閾値を0.1に設定し、本実施形態の合成方法で得られた増幅プロットでは、ΔRnの閾値を0.03に設定して、各増幅曲線との接点からCt(Threshold Cycle)値を取得した。上記(1.2)の混合物における標的RNAのコピー数を初期鋳型量とし、Ct値及び初期鋳型量の対数から検量線を作成した(図示せず)。

検量線に基づいて、各方法の検出下限及び定量下限を求めた。結果を、表１に示す。なお、定量下限(1)は、検量線の相関係数(R²)の値が0.98より大きくなる範囲から決定した。定量下限(2)は、検量線の傾きが-3.91以上-2.92以下となる範囲(増幅効率±20%以内)から決定した。検出下限は、ネガティブコントロール(酵母tRNA)のCt値に対してＴ検定(両側検定)を行ったときにp値が0.01より小さくなる値である。なお、Ｔ検定は、Excel(商標)の関数T.TESTを用いた。

表１に示されるように、本実施形態の合成方法は、先行技術である特許文献１及び２の方法よりも、増幅産物の検出及び定量の性能が高いことが分かった。また、図４より、特許文献２の方法では、ネガティブコントロールも増幅されており、非特異的増幅が認められた。これに対して、図５より、本実施形態の合成方法では、非特異的増幅はほとんど見られなかった。よって、本実施形態の合成方法は、先行技術に比べて、低分子RNAからのcDNAの合成及び増幅における感度及び特異性が高いことが示された。

実施例２
実施例２では、塩基長の異なる第２オリゴヌクレオチド分子を用いた本実施形態の合成方法によって標的RNAからcDNAを合成し、該cDNAをリアルタイムPCRにより増幅及び検出した。そして、増幅産物の検出下限及び定量下限を比較した。実施例２では、実験をトリプリケートで行った。

(１) 標的RNA及び逆転写用プライマー
標的RNA及びRTプライマーとして、それぞれ配列番号１及び２で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた。第２オリゴヌクレオチド分子として、以下に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた。以下、これらの第２オリゴヌクレオチド分子を、それぞれ「Lid」、「Lid-S1」、「Lid-S2」及び「Lid-S3」とも呼ぶ。各第２オリゴヌクレオチド分子の塩基配列を以下に示す。また、RTプライマーの第２領域の塩基長(24塩基)に対する各第２オリゴヌクレオチド分子の塩基長の比率を表２に示した。

・Lid ：5'- GTCGTATCCAGTGCGAATACCTCG -3'(配列番号４)
・Lid-S1：5'- GTCGTATCCAGTGCGAATACC -3'(配列番号８)
・Lid-S2：5'- GTCGTATCCAGTGCGAAT -3'(配列番号９)
・Lid-S3：5'- GTCGTATCC -3'

(２) cDNAの合成、増幅及び検出
上記の第２オリゴヌクレオチド分子を用いたこと以外は実施例１と同様にして、逆転写反応を行ってcDNAを合成した。また、実施例１と同様にして、得られたcDNAをリアルタイムPCRにより増幅及び検出し、増幅プロットを得た(図示せず)。

(３) 解析及び結果
ΔRnの閾値を0.05として、各増幅プロットから検量線を作成した。得られた検量線に基づいて、実施例１と同様にして検出下限及び定量下限を求めた。結果を、表３に示す。

表３に示されるように、いずれの塩基長の第２オリゴヌクレオチド分子を用いても、増幅産物の検出及び定量の性能が高いことが分かった。また、増幅プロットより、いずれの塩基長の第２オリゴヌクレオチド分子を用いても、非特異的増幅はほとんど見られなかった。

実施例３
実施例３では、RTプライマーの第２領域とハイブリダイズしたときにミスマッチ部位を生じる第２オリゴヌクレオチド分子を用いた本実施形態の合成方法によって標的RNAからcDNAを合成し、該cDNAをリアルタイムPCRにより増幅及び検出した。そして、増幅産物の検出下限及び定量下限を比較した。実施例３では、実験をトリプリケートで行った。

(１) 標的RNA及び逆転写用プライマー
標的RNA及びRTプライマーとして、それぞれ配列番号１及び２で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた。第２オリゴヌクレオチド分子として、配列番号４及び10～13で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた。配列番号10～13で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを、それぞれ「Lid-M1」、「Lid-M2」、「Lid-M3」及び「Lid-M4」とも呼ぶ。各第２オリゴヌクレオチド分子の塩基配列を以下に示す。下線部は、第２オリゴヌクレオチド分子におけるミスマッチ塩基を示す。また、第２オリゴヌクレオチド分子のミスマッチ率を表４に示した。

・Lid ：5'- GTCGTATCCAGTGCGAATACCTCG -3'(配列番号４)
・Lid-M1：5'- GTCGTATCCATTGCTAATACCTCG -3'(配列番号10)
・Lid-M2：5'- GTCGTATCCATTACTAATACCTCG -3'(配列番号11)
・Lid-M3：5'- GTTGTGTTCGGTGTGGATGCTTTG -3'(配列番号12)
・Lid-M4：5'- GTTGTGTTTGGTGTGGGTGTTTTG -3'(配列番号13)

(２) cDNAの合成、増幅及び検出
上記の第２オリゴヌクレオチド分子を用いたこと以外は実施例１と同様にして、逆転写反応を行ってcDNAを合成した。また、実施例１と同様にして、得られたcDNAをリアルタイムPCRにより増幅及び検出した。得られた増幅プロットを、図６Ａ～Ｅに示す。

(３) 解析及び結果
ΔRnの閾値を0.05として、各増幅プロットから検量線を作成した。得られた検量線に基づいて、実施例１と同様にして検出下限及び定量下限を求めた。結果を、表５に示す。

表５に示されるように、ミスマッチ塩基を有する第２オリゴヌクレオチド分子を用いても、増幅産物の検出及び定量の性能が高いことが分かった。また、図６Ａ～Ｅより、RTプライマーの第２領域と第２オリゴヌクレオチド分子との間に50%程度のミスマッチが存在していても、非特異的増幅はほとんど見られなかった。

実施例４
実施例４では、3'末端にCAP構造を付加した第２オリゴヌクレオチド分子を用いた本実施形態の合成方法によって標的RNAからcDNAを合成し、該cDNAをリアルタイムPCRにより増幅及び検出した。そして、増幅産物の検出下限及び定量下限を比較した。実施例４では、実験をトリプリケートで行った。

(１) 標的RNA及び逆転写用プライマー
標的RNAとして、配列番号１で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた。RTプライマーとして、配列番号２及び14で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた。以下、これらのRTプライマーを、それぞれ「RT-primer 1」及び「RT-primer 2」とも呼ぶ。第２オリゴヌクレオチド分子として、配列番号４及び15で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた。実施例４では、これらのオリゴヌクレオチドの3'末端にキャップ構造としてUaqを付加した。3'-Uaq CAPの付加によりTm値が向上して、相補鎖との結合の安定性が向上することが期待される。以下、3'-Uaq CAPを付加した第２オリゴヌクレオチド分子を、それぞれ「Lid-Cap1」及び「Lid-Cap2」とも呼ぶ。3'-Uaq CAPの化学構造を以下に示す。また、RTプライマー及び第２オリゴヌクレオチド分子の塩基配列を以下に示す。

・RT-primer 1：5’- CGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACCAAAAC -3’(配列番号２)
・RT-primer 2：5’- GTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACCAAAAC -3’(配列番号14)
・Lid ：5'- GTCGTATCCAGTGCGAATACCTCG -3'(配列番号４)
・Lid-Cap 1：5'- GTCGTATCCAGTGCGAATACCTCG-Uaq -3'(配列番号４)
・Lid-Cap 2：5'- GTCGTATCCAGTGCGAATACCTCGGAC-Uaq -3'(配列番号15)

(２) cDNAの合成、増幅及び検出
上記のRTプライマー及び第２オリゴヌクレオチド分子を用いたこと以外は実施例１と同様にして、逆転写反応を行ってcDNAを合成した。RT-primer 1に対する第２オリゴヌクレオチド分子としてLid又はLid-Cap 1を用い、RT-primer 2に対する第２オリゴヌクレオチド分子としてLid-Cap 2を用いた。また、実施例１と同様にして、得られたcDNAをリアルタイムPCRにより増幅及び検出した。なお、RT-primer 2を用いて合成されたcDNAの増幅では、配列番号６で示される塩基配列のリバースプライマーに替えて、下記の配列番号16で示される塩基配列のリバースプライマーを用いた。Lid-Cap 1及びLid-Cap 2を用いた場合の増幅プロットを、それぞれ図７Ａ及びＢに示す。

・リバースプライマー：5'- CCGAGGTATTCGCACTG -3'(配列番号16)

(３) 解析及び結果
ΔRnの閾値を0.1として、各増幅プロットから検量線を作成した。得られた検量線に基づいて、実施例１と同様にして検出下限及び定量下限を求めた。結果を、表６に示す。

表６に示されるように、3'末端にCAP構造を付加した第２オリゴヌクレオチド分子を用いた場合も、未修飾の第２オリゴヌクレオチド分子を用いた場合と同様に、増幅産物の検出及び定量の性能が高いことが分かった。また、図７Ａ及びＢより3'末端にCAP構造を付加した第２オリゴヌクレオチド分子を用いた場合、非特異的増幅が抑えられていることが示された。よって、第２オリゴヌクレオチド分子の3'末端へのCAP構造の付加には、非特異的増幅の抑制効果があることが示唆された。

１０、２０、３０、４０：試薬キット
１１、２１、３１、４１：第１容器
１２、２２、３２、４２：第２容器
２３、３３、４３：第３容器
２４、３４、４４：第４容器
３５、４５：第５容器
３６、４６：第６容器
４７：第７容器
４８：第８容器
１３、２５、３７、４９：梱包箱
１４、２６、３８、５０：添付文書

Claims

標的RNAと、第１オリゴヌクレオチド分子と、第２オリゴヌクレオチド分子と、逆転写酵素とを混合し、前記標的RNAを鋳型としてcDNAを合成する方法であって、
前記第１オリゴヌクレオチド分子が、前記標的RNAとハイブリダイズする第１領域を3’末端に有し、前記第２オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズする第２領域を前記第１領域の5’側に有し、
前記第２オリゴヌクレオチド分子が、以下の１)及び２)の要件：
１) 前記第２オリゴヌクレオチド分子の塩基長が、前記第２領域の塩基長の35%以上90%以下である；及び
２) 前記第２オリゴヌクレオチド分子の塩基配列が、前記第２領域とハイブリダイズしたときにミスマッチ部位を生じる塩基を含む；
の少なくとも一方を満たし、
前記第２オリゴヌクレオチド分子が前記２)の要件を満たす場合、前記第２オリゴヌクレオチド分子における、前記第２領域とハイブリダイズしたときにミスマッチ部位を生じる塩基の数の割合であるミスマッチ率が50%以下であり、前記ミスマッチ率が、以下の式：
(ミスマッチ率)＝｛(第２オリゴヌクレオチド分子におけるミスマッチ塩基の数)／(第２オリゴヌクレオチド分子の塩基長)｝×100
により算出され、
前記標的RNAが、スモールRNAである、
cDNAの合成方法。
前記第１オリゴヌクレオチド分子が、前記第１領域を介して前記標的RNAとハイブリダイズし、且つ前記第２領域を介して前記第２オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズし、
前記逆転写酵素が、前記標的RNA及び前記第２オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズした前記第１オリゴヌクレオチド分子の3’末端を伸長して、cDNAが合成される、
請求項１に記載の方法。
前記スモールRNAが、miRNA、snRNA、snoRNA、piRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、siRNA及びshRNAからなる群より選択されるいずれか１種である請求項１又は２に記載の方法。
前記第１オリゴヌクレオチド分子の第１領域の塩基長が、３以上15以下である請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
前記第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域の塩基長が、10以上40以下である請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
前記第２オリゴヌクレオチド分子の3’末端が、伸長しないように修飾されている請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
前記cDNAを増幅する工程をさらに含む請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
前記cDNAの増幅工程が、前記cDNAと、前記cDNAにハイブリダイズするフォワードプライマーと、前記cDNAの相補鎖にハイブリダイズするリバースプライマー及び／又は第１オリゴヌクレオチド分子と、ポリメラーゼとを混合することを含む請求項７に記載の方法。
前記cDNAの増幅工程が、リアルタイムPCRによって行われる請求項７又は８に記載の方法。
前記cDNAの合成と、前記cDNAの増幅とを同一の反応系で行う請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
前記cDNAの合成後に、前記第２オリゴヌクレオチド分子の少なくとも一部を除去する工程をさらに含む請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
前記第２オリゴヌクレオチド分子が、ウラシルを含む請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
前記cDNAの合成後に、ウラシルＮグリコシラーゼにより前記第２オリゴヌクレオチド分子の少なくとも一部を分解する工程をさらに含む請求項１２に記載の方法。
標的RNAと、第１オリゴヌクレオチド分子と、第２オリゴヌクレオチド分子と、逆転写酵素とを混合し、前記標的RNAを鋳型としてcDNAを合成する工程と、
前記cDNAを増幅し、増幅産物を検出する工程と
を含む、標的RNAを検出する方法であって、
前記第１オリゴヌクレオチド分子が、前記標的RNAとハイブリダイズする第１領域を3’末端に有し、前記第２オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズする第２領域を前記第１領域の5’側に有し、
前記第２オリゴヌクレオチド分子が、以下の１)及び２)の要件：
１) 前記第２オリゴヌクレオチド分子の塩基長が、前記第２領域の塩基長の35%以上90%以下である；及び
２) 前記第２オリゴヌクレオチド分子の塩基配列が、前記第２領域とハイブリダイズしたときにミスマッチ部位を生じる塩基を含む；
の少なくとも一方を満たし、
前記第２オリゴヌクレオチド分子が前記２)の要件を満たす場合、前記第２オリゴヌクレオチド分子における、前記第２領域とハイブリダイズしたときにミスマッチ部位を生じる塩基の数の割合であるミスマッチ率が50%以下であり、前記ミスマッチ率が、以下の式：
(ミスマッチ率)＝｛(第２オリゴヌクレオチド分子におけるミスマッチ塩基の数)／(第２オリゴヌクレオチド分子の塩基長)｝×100
により算出され、
前記標的RNAが、スモールRNAである、
標的RNAの検出方法。
前記検出工程において、前記増幅及び検出がリアルタイムPCRによって実行され、前記標的RNAが定量される請求項１４に記載の方法。
前記第１オリゴヌクレオチド分子の第１領域の塩基長が、３以上15以下である請求項１４又は１５のいずれか１項に記載の方法。
前記第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域の塩基長が、10以上40以下である請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。
標的RNAとハイブリダイズする第１オリゴヌクレオチド分子と、前記第１オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチド分子とを含み、
前記第１オリゴヌクレオチド分子が、前記標的RNAとハイブリダイズする第１領域を3’末端に有し、前記第２オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズする第２領域を前記第１領域の5’側に有し、
前記第２オリゴヌクレオチド分子が、以下の１)及び２)の要件：
１) 前記第２オリゴヌクレオチド分子の塩基長が、前記第２領域の塩基長の35%以上90%以下である；及び
２) 前記第２オリゴヌクレオチド分子の塩基配列が、前記第２領域とハイブリダイズしたときにミスマッチ部位を生じる塩基を含む；
の少なくとも一方を満たし、
前記第２オリゴヌクレオチド分子が前記２)の要件を満たす場合、前記第２オリゴヌクレオチド分子における、前記第２領域とハイブリダイズしたときにミスマッチ部位を生じる塩基の数の割合であるミスマッチ率が50%以下であり、前記ミスマッチ率が、以下の式：
(ミスマッチ率)＝｛(第２オリゴヌクレオチド分子におけるミスマッチ塩基の数)／(第２オリゴヌクレオチド分子の塩基長)｝×100
により算出され、
前記標的RNAが、スモールRNAである、
試薬キット。
前記第１オリゴヌクレオチド分子の第１領域の塩基長が、３以上15以下である請求項１８に記載の試薬キット。
前記第１オリゴヌクレオチド分子の第２領域の塩基長が、10以上40以下である請求項１８又は１９に記載の試薬キット。
逆転写酵素をさらに含む請求項１８～２０のいずれか１項に記載の試薬キット。
dNTPをさらに含む請求項１８～２１のいずれか１項に記載の試薬キット。
第１オリゴヌクレオチド分子の伸長により合成されるcDNAにハイブリダイズするフォワードプライマーと、前記cDNAの相補鎖にハイブリダイズするリバースプライマーとをさらに含む請求項１８～２２のいずれか１項に記載の試薬キット。
ポリメラーゼをさらに含む請求項１８～２３のいずれか１項に記載の試薬キット。
蛍光標識プローブをさらに含む請求項１８～２４のいずれか１項に記載の試薬キット。