JP7277571B2 - イノトジオール化合物を有効成分として含む、アレルギー疾患の予防又は治療用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）化合物を有効成分として含有するカバノアナタケ抽出物又はイノトジオール化合物を含む、アレルギー疾患の予防又は治療用組成物に関する。

アレルギー（ａｌｌｅｒｇｙ）とは、過敏反応（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）という意味で、生物が、ある外来性物質に接し、抗原抗体反応により生体内で急激な反応が起こる現象をいう。アレルギー反応を誘発する抗原をアレルゲン（ａｌｌｅｒｇｅｎ）といい、典型的なアレルゲンは、花粉、薬物、植物繊維、細菌、食物、染毛剤、化学物質などである。

現代文明の発達とともに、各種アレルゲンにさらされる機会が多くなり、アレルギー症状を訴える患者が急増している。アレルギー患者は、先進化した国であるほど、その程度が激しいと把握されており、韓国の場合にも、正確な統計データはないが、毎年、その患者数が増加しており、特に小児患者の数が急増していることが知られている。これらの理由から、国内外の有数の製薬会社や研究機関などで、アレルギー疾患による経済的、生理的、心理的負担を軽減させることができる原因的治療薬の開発に多くの財源を投資しているものの、根本的治療薬の開発には未だ至っていない。

これまで知られている免疫過敏反応は、大きく４つの形態に分類される。Ｉ型過敏反応は、特異ＩｇＥ抗体によって媒介されるアレルギー性過敏反応であり、特異ＩｇＥ抗体が肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）又は好塩基性細胞（ｂａｓｏｐｈｉｌ）の表面受容体と結合し、細胞内の様々な媒介物質が細胞外に分泌され、喘息、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーなどの即時型過敏反応が引き起こされる。ＩＩ型過敏反応は、特異ＩｇＧ抗体による媒介性反応であり、細胞の表面にある抗原成分と反応する抗体によって開始される。ＩＩＩ型過敏反応は、抗原が多い状態で抗原と抗体が複合体を形成して補体を活性化させ、細胞毒性が現れる反応であり、最後に、ＩＶ型過敏反応は、Ｔ細胞によって媒介される細胞媒介性過敏反応である。

肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）は、アレルギー反応を引き起こす主な細胞であり、ＩｇＥ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ）とアレルゲンの結合により活性化され、様々な媒介物質を分泌して粘膜浮腫、気管支平滑筋収縮、粘液分泌の増加などを引き起こすことによってアレルギー反応に寄与する。これらの肥満細胞は、呼吸器、消化器、泌尿生殖器、真皮、血管を取り囲んでいる組織に位置しており、人体における免疫系の維持及び防御に重要な役割を果たすことが知られている（Ｒｉｖｅｒａ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，２００８：Ｍｏｏｎ，Ｔ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｂｌａｎｋ，Ｕ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｂｏｙｃｅ，Ｊ．Ａ．，２００４）。

肥満細胞は、外部からの刺激によってアレルギー炎症反応を引き起こす媒介物質を産生・分泌するようになる。これらの媒介物質は、刺激を受ける前にすでに生成され、顆粒に貯蔵されている物質（ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）と、刺激を受けた後に新たに生成・遊離される物質（ｎｅｗｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）がある（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｌ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９９８）。

肥満細胞の顆粒内には、ヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、プロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）、セリンプロテアーゼ（ｓｅｒｉｎｅ－ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）、カルボキシペプチダーゼＡ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ａ）、スルファターゼ（ｓｕｌｆａｔａｓｅ）、エキソグリコシダーゼ（ｅｘｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ）などがすでに生成され、存在しており、刺激を受けると、これらの物質が細胞外に遊離される。肥満細胞が刺激を受けた後、新たに生成・分泌される最も重要な物質は、アラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）由来の代謝産物であり、プロスタグランジンＤ２（ｐｒｏｓｔａｇｌｉａｄｉｎ Ｄ２、ＰＧＤ２）、ロイコトリエンＣ４（ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ Ｃ４、ＬＴＣ４）、ＬＴＤ４、ＬＴＥ４などがある。そのほか、血小板活性化因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ；ＰＡＦ）がある（アン・ガンモ，２００４）。

肥満細胞は、アレルギーの早期反応に限って作用するのではなく、後期反応や慢性アレルギー反応にも深く関係していることが明らかになった。つまり、肥満細胞から生成・分泌されるＴＮＦ－α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α）は、血管内皮細胞の接着分子（ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の発現を増加させて好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ）及びＴリンパ球（Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）の標的器官への流入を促進させる。また、肥満細胞から産生されるＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）－４、ＩＬ－１３、ＩＬ－６などは、Ｔｈ２（Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｔｙｐｅ ２）細胞の反応を増加させ、最終的にはＩｇＥの産生を増加させることによって慢性アレルギー反応に寄与する。このように、肥満細胞は、アレルギー炎症反応を引き起こし、持続させることに中心的な役割を果たしている（アン・ガンモ，２００４）。

伝統的に、アレルギー疾患の治療として、アレルギー誘発物質（アレルゲン）に対する回避用法、薬物療法、アレルゲン免疫療法の３つの治療が主な治療法として知られている。実際に、アレルギー疾患の治療のために、現在の臨床において最も一般的に用いられている薬物療法の場合、アレルギー反応に関与する化学媒介物質（ヒスタミン、ロイコトリエンなど）に対する抑制薬（抗ヒスタミン薬、抗ロイコトリエン薬など）、あるいはアレルギー反応による組織の炎症を抑える抗炎症薬（ステロイド薬、免疫抑制薬など）が主に使用されている。しかし、これらの薬物療法は、薬物を継続的に投与する場合にのみ、臨床症状が好転した状態に維持させることができるという欠点がある（Ｎａｈｍ，Ｄ．Ｈ．，２０１５）。ステロイド薬は、長期間使用した場合、様々な副作用を起こすということがよく知られており、使用に多くの注意が要求される。

近年、アレルギー疾患の治療薬として、肥満細胞の脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）を抑制する肥満細胞安定化薬（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）への関心が高まっている。肥満細胞安定化薬は、肥満細胞の脱顆粒を抑制し、抗ヒスタミン薬と抗ロイコトリエン薬の効果を同時に得ることができるという利点を持っているが、他の医薬品に比べて開発は未だに不十分な状態である。クロモグリケート（ｃｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ）、ネドクロミル（ｎｅｄｏｃｒｏｍｉｌ）などのクロモン（ｃｈｒｏｍｏｎｅ）系物質が肥満細胞安定化薬として開発されているが、経口投与時の低いバイオアベイラビリティによる使用の不便さと機序の曖昧さのため、使用は限定的である（Ｆｉｎｎ，Ｄ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３）。したがって、肥満細胞に選択的であり、効果的かつ安全な、新しい概念の肥満細胞安定化薬の開発が求められている。

カバノアナタケ（Ｉｎｏｔｏｔｕｓ ｏｂｌｉｑｕｕｓ、Ｃｈａｇａ ｍｕｓｈｒｏｏｍ）は、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）のヒダナシタケ目（Ａｐｈｙｌｌｏｐｈｏｒａｌｅｓ）、タバコウロコタケ科（Ｈｙｍｅｎｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ）に属し、ロシアのシベリア、フィンランド、ノルウェー、ウクライナ、日本の北海道及び韓国の五台山などの寒冷多湿な北半球でカバノキ、ハンノキ、ナナカマドなどの幹や切り株に自生するキノコである。カバノアナタケは、リグニン（ｌｉｇｎｉｎ）、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ヘミセルロース（ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）などを分解する白色腐朽菌（ｗｈｉｔｅ ｒｏｔ ｆｕｎｇｕｓ）であり、野生で黒色の菌核をカバノキなどの寄主の幹に形成して寄生すると知られている（Ｇｕｋ Ｍ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

１９５０年代末から、ロシアで研究が開始され、カバノアナタケの子実体（ｆｒｕｉｔ ｂｏｄｙ）から抽出したβ－グルカン（β－ｇｌｕｃａｎ）、ポリフェノール（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ）、ステロール（ｓｔｅｒｏｌ）などの物質が人体に生理活性効果を与えることが報告された。これまで明らかになったカバノアナタケの効果としては、抗がん作用（Ｙｏｕｎ Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，２００８； Ｎｏｍｕｒａ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，２００８）だけでなく、抗酸化作用（Ｐａｒｋ Ｙ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，２００４）、抗高脂血症、抗糖尿（Ｋｉｍ Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２００９）、抗真菌、抗ウイルス、抗炎症、鎮痛作用などがある。

これらの様々な生理活性を持つカバノアナタケから有用な化合物を分離するための研究が進められてきており、イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）、トラメテノール酸（ｔｒａｍｅｔｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ラノステロール（ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌ）、イノノツリド（ｉｎｏｎｏｔｓｕｌｉｄｅ）などの様々な化合物が分離された（Ｍａ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３）。 このうち、イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）化合物の場合には、抗がん、抗炎症、メラニン形成阻害などの活性があることが明らかになっている。

そこで、本発明者らは、カバノアナタケ抽出物から分離したイノトジオール化合物又はこれを有効成分として含有するカバノアナタケ抽出物が、食物アレルギーを誘導したマウスモデルにおいて、アレルギーによる症状を改善・治療し、かつ肥満細胞の免疫活性を抑制する効果があることを確認し、本発明を完成するに至った。

先行技術として、日本公開特許第２００６－３４７９９１号には、カバノアナタケを含むキノコ菌糸体由来物質がアレルギー誘発物質であるヒスタミンの放出を抑制することが記載されており、本発明の構成と類似しているが、本発明のイノトジオール化合物は記載されていない。また、韓国登録特許第１３５１０５４号には、カバノアナタケを含む生薬組成物のアトピー性皮膚炎の治療効果、及びカバノアナタケが全体的な免疫力を強化し、アトピー性皮膚炎の根本的な治療に役立つことが記載されているが、本発明のイノトジオール化合物は記載されていない。韓国公開特許第２０１８－０００３００２号には、カバノアナタケ抽出物から分離したイノトジオール化合物が炎症の予防又は治療に効果があることが記載されているが、本発明のアレルギー予防又は治療、及び肥満細胞の免疫活性抑制効果は全く記載又は暗示されていない。

本発明の目的は、イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）化合物を有効成分として含有するカバノアナタケ抽出物又はイノトジオール化合物を含む、有効かつ安全で経口投与可能なアレルギー疾患の予防又は治療用組成物を提供することにある。

本発明は、下記化学式１のイノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）化合物を有効成分として含有するカバノアナタケ（Ｉｎｏｔｏｔｕｓ ｏｂｌｉｑｕｕｓ）抽出物を含む、アレルギー疾患の予防又は治療用医薬組成物に関する。

前記カバノアナタケ抽出物は、カバノアナタケを７０％エタノールを溶媒として抽出した抽出物に、ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）又はクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）を加えて分画したジクロロメタン画分又はクロロホルム画分からなる群から選択される１種以上であり得る。

また、本発明は、前記化学式１のイノトジオール化合物を有効成分として含む、アレルギー疾患の予防又は治療用医薬組成物に関する。

前記医薬組成物は、肥満細胞の脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）を抑制することができる。

前記アレルギーは、花粉、薬物、植物繊維、細菌、食物、染毛剤、化学物質からなる群から選択される１種以上のアレルゲンによって誘導されるものであり得、好ましくは、食物によって誘導されるアレルギーである。

前記アレルギー疾患は、蕁麻疹、アナフィラキシー（ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ）、アレルギー性鼻炎、気管支喘息及びアトピー性皮膚炎からなる群から選択される１種以上であり得る。

別の一面において、本発明は、前記化学式１のイノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）化合物を有効成分として含有するカバノアナタケ（Ｉｎｏｔｏｔｕｓ ｏｂｌｉｑｕｕｓ）抽出物を含む、アレルギー疾患の予防又は改善用健康機能食品組成物に関する。

また、本発明は、前記化学式１のイノトジオール化合物を有効成分として含む、アレルギー疾患の予防又は改善用健康機能食品組成物に関する。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、前記化学式１のイノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）化合物を有効成分として含有するカバノアナタケ（Ｉｎｏｔｏｔｕｓ ｏｂｌｉｑｕｕｓ）抽出物を含む、アレルギー疾患の予防又は治療用組成物に関する。

前記カバノアナタケ抽出物は、カバノアナタケを７０％エタノールを溶媒として抽出した抽出物に、有機溶媒を加えて分画した画分であり得る。

前記有機溶媒は、Ｃ１～Ｃ４の低級アルコール、ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）、クロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）、酢酸エチル（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）、ジ酢酸エチル（ｄｉｅｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅ）、ジエチルエーテル（ｄｉｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ）、アセトン（ａｃｅｔｏｎｅ）、ヘキサン（ｈｅｘａｎｅ）からなる群から選択される１種以上であり得る。しかし、これに限定されるものではない。前記Ｃ１～Ｃ４の低級アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールなどであり得る。

前記カバノアナタケ抽出物は、好ましくは、カバノアナタケを７０％エタノールを溶媒として抽出した抽出物に、ジクロロメタン又はクロロホルムを加えて分画したジクロロメタン画分又はクロロホルム画分からなる群から選択される１種以上である。

また、本発明は、イノトジオール化合物を有効成分として含む、アレルギー疾患の予防又は治療用組成物に関する。

前記イノトジオール化合物は、通常の方法によって合成することができ、薬学的に許容可能な塩から製造してもよく、又はカバノアナタケ抽出物から分離・精製してもよい。

前記カバノアナタケから分離されたイノトジオール化合物は、カラムクロマトグラフィーを用いて精製することができる。前記カラムクロマトグラフィーは、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、ＨＰ－２０カラムクロマトグラフィー（ＨＰ－２０ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、ＲＰ－１８カラムクロマトグラフィー（ＲＰ－１８ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、ＬＨ－２０カラムクロマトグラフィー（ ＬＨ－２０ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、高性能液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などから選択することができる。

前記アレルギーとは、アレルギー誘発物質であるアレルゲンと接触した後、抗原抗体反応により生体内で急激な反応が起こる現象を意味するものであり、前記アレルゲンは、花粉、薬物、植物繊維、細菌、食物、染毛剤、化学物質からなる群から選択される１種以上であり得、好ましくは食物である。しかし、これに限定されるものではない。

また、前記アレルギー疾患は、アレルギーによって生じる疾患であり、主な疾患としては、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、食物アレルギー、薬疹、薬剤アレルギー、血清病などがあり、かつアレルゲンの種類やアレルギー反応を引き起こす組織に応じて様々な症状が現れる。

前記アレルギー疾患は、蕁麻疹、アナフィラキシー、アレルギー性鼻炎、気管支喘息及びアトピー性皮膚炎からなる群から選択される１種以上であり得る。しかし、これに限定されるものではない。

前記イノトジオール化合物又はこれを有効成分として含有するカバノアナタケ抽出物は、肥満細胞の脱顆粒を抑制することができる。

前記肥満細胞は、アレルゲンによって刺激を受けると、ヒスタミン、セリンプロテアーゼ、プロテオグリカン、プロスタグランジンＤ２、ロイコトリエンなどのアレルギー炎症反応誘発物質を細胞外に遊離し、このような反応を「肥満細胞の脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）反応」という。 したがって、前記イノトジオール化合物又はこれを有効成分として含有するカバノアナタケ抽出物の肥満細胞の脱顆粒抑制は、アレルゲン刺激によるアレルギー炎症反応誘発物質の分泌を抑制することによって、アレルギーを予防又は治療することができ、これを「 肥満細胞安定化薬（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）」という。

特に、本発明のイノトジオール化合物は、アレルギーの治療と関連しているＣＤ４⁺Ｔ細胞、ＣＤ８⁺細胞、Ｂ細胞、マクロファージと肥満細胞のうち、ＣＤ４⁺Ｔ細胞、ＣＤ８⁺細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージ活性の調節には全く影響を与えない反面、肥満細胞の脱顆粒のみを選択的に抑制する。

また、本発明は、イノトジオール化合物又はこれを有効成分として含有するカバノアナタケ抽出物を含む、アレルギー疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供する。

前記医薬組成物は、イノトジオール化合物又はイノトジオール化合物を有効成分として含有するカバノアナタケ抽出物を０．００１重量％～１００重量％含むことができる。

前記医薬組成物は、それぞれ通常の方法に従って散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤、及び滅菌注射溶液の形態に製剤化して用いることができる。前記医薬組成物に含んでもよい担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアガム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油が挙げられる。製剤化する場合には、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製する。経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などがあり、これらの固形製剤は、本発明のイノトジオール化合物又はイノトジオール化合物を有効成分として含有するカバノアナタケ抽出物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混合して調剤する。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用できる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などがあり、通常使用される単純希釈剤である水、流動パラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含んでもよい。非経口投与のための製剤としては、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤がある。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが用いられる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トゥイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられる。

本発明の医薬組成物の投与量は、治療を受ける対象の年齢、性別、体重、治療する特定の疾患又は病理状態、疾患又は病理状態の深刻度、投与経路、及び処方者の判断に応じて異なるであろう。これらの因子に基づいた投与量の決定は、当業者のレベル内にあり、通常の投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～２０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。より好ましい投与量は、１ｍｇ／ｋｇ／日～５００ｍｇ／ｋｇ／日である。投与は、一日一回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。前記投与量は、いかなる面においても本発明の範囲を限定するものではない。

本発明の医薬組成物は、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に多様な経路で投与することができる。投与のすべての方式は予想でき、例えば、経口、直腸、又は静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜、脳血管内注射によって投与することができる。本発明の化合物は、毒性や副作用がほとんどないため、予防目的で長期間服用する場合にも安心して使用できる薬剤である。

また、本発明は、イノトジオール化合物又はイノトジオール化合物を有効成分として含有するカバノアナタケ抽出物及び食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含む、アレルギー疾患の予防又は改善用健康機能食品組成物を提供する。

前記イノトジオール化合物又はイノトジオール化合物を有効成分として含有するカバノアナタケ抽出物は、本発明の健康機能食品組成物に０．００１～１００重量％で添加することができる。

本発明の健康機能食品は、錠剤、カプセル剤、丸剤又は液剤などの形態であり、本発明の抽出物を添加できる食品としては、例えば、各種食品類、飲料、ガム、お茶、ビタミン複合剤などがある。

本発明は、イノトジオール化合物又はこれを有効成分として含有するカバノアナタケ抽出物を含む、アレルギー疾患の予防又は治療用組成物に関し、食物アレルギーが誘導されたマウスモデルに、イノトジオール化合物又はイノトジオール化合物を有効成分として含有するカバノアナタケ抽出物を投与することによって、アレルギーによる症状が緩和又は治療され、かつ肥満細胞の免疫活性を抑制することを確認した。

これにより、本発明のイノトジオール化合物とイノトジオール化合物を有効成分として含有するカバノアナタケ抽出物は、アレルギー疾患の予防又は治療組成物として有用であることが期待される。

食物アレルギー誘導、並びに、イノトジオール化合物及びこれを含むカバノアナタケ画分処理によるアレルギー症状の改善効果を示す図である。図１（Ａ）は、直腸の温度変化を、図１（Ｂ）は、アナフィラキシー症状の緩和又は治療の程度を、図１（Ｃ）は、下痢症状のスコアをそれぞれ示す。 食物アレルギー誘導、並びに、イノトジオール化合物及びこれを含むカバノアナタケ画分処理による小腸に浸潤した好酸球数（図２（Ａ））及び小腸における肥満細胞数（図２（Ｂ））の変化を示す。 食物アレルギー誘導、並びに、イノトジオール化合物及びこれを含むカバノアナタケ画分処理によるアレルギー関連ＩｇＥ（図３（Ａ））及びＭＣＰＴ－１（図３（Ｂ））の血清中濃度の変化を示す。 食物アレルギー誘導、並びに、イノトジオール化合物及びこれを含むカバノアナタケ画分のＣＤ４⁺Ｔ細胞の免疫活性を確認した結果を示す図であり、（図４（Ａ））は、Ｔｈ２ ＣＤ４⁺Ｔ細胞によって生成されるサイトカインであるＩＬ－１３、ＩＬ－５及びＩＦＮ－γの発現量の変化を、（図４（Ｂ））は、卵白アルブミン由来ペプチドに特異的なＴ細胞受容体であるＤＯ１１．００ ＴＣＲが発現されるＣＤ４⁺Ｔ細胞の卵白アルブミンによる活性化及びそれに伴う細胞分裂程度を確認した結果をそれぞれ示す。 食物アレルギー誘導、並びに、イノトジオール化合物及びこれを含むカバノアナタケ画分の肥満細胞の免疫活性を確認した結果を示す図であり、受動全身アナフィラキシー（ｐａｓｓｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ）によって肥満細胞の脱顆粒を誘導したマウスにおける直腸内の温度（図５（Ａ））及び血中ＭＣＰＴ－１（図５（Ｂ））の変化を確認した結果を示す。

以下、本発明の好ましい実施例を詳細に説明する。しかし、本発明は、ここで説明する実施例に限定されるものではなく、他の形態に具体化されてもよい。むしろ、ここで紹介する内容が徹底かつ完全になるように、そして当業者に本発明の思想を十分に伝達するために提供するものである。

＜実施例１． イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）化合物の分離＞
実施例１－１． カバノアナタケ抽出物の製造及びイノトジオール化合物の含有量の確認
本発明のイノトジオール化合物は、カバノアナタケ（Ｉｎｏｎｏｔｕｓ ｏｂｌｉｑｕｕｓ）抽出物から分離した。

カバノアナタケ６３０ｇを微細粒子に粉砕し、７０％（ｖ／ｖ）エタノール３，０００ｍｌを加え、４０℃、９０Ｈｚの超音波攪拌下で抽出することを３回繰り返して７０％エタノール抽出物（３×３．０Ｌ）を得た後、これをロータリーエバポレーター（ｒｏｔａｒｙ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）を用いて乾燥した褐色の７０％エタノール抽出物５８ｇを得た。

カバノアナタケの７０％エタノール抽出物５８ｇを水に溶かし、ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ；ＣＨ_２Ｃｌ_２）を加えてジクロロメタン画分６．０ｇを得、ジクロロメタン画分を分離して残った画分に、再び酢酸エチル（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ；ＥｔＯＡｃ）を加えて酢酸エチル画分３．２ｇと水画分４８．５ｇとを得た。

上記で得られたカバノアナタケ抽出物及び画分に含まれているイノトジオール化合物の含有量を確認するために、高性能液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＨＰＬＣ）を行った。ＨＰＬＣは、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）の濃度勾配（０～３０分；６０→９５％（ｖ／ｖ）、３０～６０分；９５％（ｖ／ｖ）保持）条件で、ＬＣ－１０ＡＤ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏ．Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて行い、それぞれのカバノアナタケ抽出物及び画分の濃度が２ｍｇ／ｍｌになるようにメタノールで溶解し、０．２μｍシリンジフィルター（ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ）でろ過した後、１０μｌずつ注入した。カラムは、ＨＥＣＴＯＲ－ＭＣ１８（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ粒子サイズ、ＲＳｔｅｃｈ、Ｋｏｒｅａ）を用いて行い、流速１ｍｌ／分、ＵＶ検出（２１０ｎｍ）でイノトジオール化合物の含有量を確認した結果、７０％エタノール抽出物（ＥｔＯＨ Ｅｘｔ．）に約１％、ジクロロメタン画分（ＣＨ_２Ｃｌ_２ Ｆｒａｃ．）に７．８％、酢酸エチル画分（ＥｔＯＡｃ Ｆｒａｃ．）に０．９％、水画分（Ｈ_２Ｏ Ｆｒａｃ．）に０．０５％と、水画分のイノトジオール化合物の含有量が最も低いことを確認した。

前記分画溶媒のうち、ジクロロメタンの代わりにクロロホルムを用いて分画したクロロホルム画分の場合にも、ジクロロメタン画分と同様の量のイノトジオール化合物が含有されていることを確認した。

実施例１－２． イノトジオール化合物の分離
前記実施例１－１で得られたカバノアナタケのジクロロメタン画分からイノトジオール化合物を分離した。

ジクロロメタン画分２．５ｇを、ｎ－ヘキサン：酢酸エチルが２０：１、９：１、４：１、２：１及び１：２（ｖ／ｖ）の割合で混合された混合溶媒をそれぞれ１Ｌずつ用いて濃度勾配溶出条件によるシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で分画して１３個の小画分を得た（Ｆｒａｃ．Ｃ１～Ｃ１３）。前記小画分のうち、Ｆｒａｃ． Ｃ６及びＦｒａｃ． Ｃ７を混合した後、ｎ－ヘキサン：酢酸エチルが２０：１（ｖ／ｖ）で混合された混合溶液のアイソクラティック条件によるシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、イノトジオール化合物２１０ｍｇを分離した。

＜実施例２． イノトジオール化合物の物理化学的構造の確認＞
Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ；
白色アモルファス粉末；
ＥＳＩ―ＭＳ：[Ｍ+ Ｎａ]⁺ ４６５．３７ｍ／ｚ（Ｃ_３０Ｈ_５０Ｏ_２：４４２．２７）；
^１Ｈ ＮＭＲ及び^１３Ｃ ＮＭＲデータは表１参照；
ＥＳＩ―ＭＳ分析の結果と^１３Ｃ ＮＭＲデータによって分子式がＣ_３０Ｈ_５０Ｏ_２であることが確認された。

イノトジオールの^１３Ｃ―ＮＭＲで炭素３０個のピーク（ｐｅａｋ）が確認でき、δ_Ｃ１２１．２、１３４．０、１３４．４、１３４．８ピークで２つの二重結合（ｄｏｕｂｌｅ ｂｏｎｄ）があり、δ_Ｃ７３．２、７８．７ピークによって２つのヒドロキシル基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）があると推定することができた（表２参照）。 また、^１Ｈ―ＮＭＲスペクトル（表２参照）において、δ_Ｈ０．６７、０．７６、０．８２、０．８８、０．９３、１．６０、１．６９（３Ｈ、ｓ）における一重項（ｓｉｎｇｌｅｔ）のメチルピーク（ｍｅｔｈｙｌ ｐｅａｋ）と、δ_Ｈ０．８８における二重項（ｄｏｕｂｌｅｔ ）のメチルピークを確認することができた。また、δ_Ｈ５．１６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）でＨ－２４に該当するオレフィン（ｏｌｅｆｉｎｉｃ）のピークが現れ、δ_Ｈ３．１８（１Ｈ，ｍ，Ｈ－３）とδ_Ｈ３．６５（１Ｈ，Ｈ－２２）で酸素に結合しているオキシメチン（ｏｘｙｍｅｔｈｉｎｅ）のピークが現れることを確認した。
以上の結果を論文に報告されたデータ（Ｄｕ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，２０１１）と比較してイノトジオール化合物の構造を確証することができた。

＜実験例１． アレルギーマウスモデルの作製及び抽出物の投与＞
アレルギーマウスモデルを作製するために、５週齢の雄ＢＡＬＢ／Ｃマウスを用いた。アレルギー誘導物質（アレルゲン、ａｌｌｅｒｇｅｎ）として鶏の卵白アルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）を用いて食物アレルギーモデルを作製した。

マウスの免疫を誘導（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）するために２０μｇの卵白アルブミンを２ｍｇのミョウバン（ａｌｕｍ）と混合し、２週間間隔で２回、マウスの腹腔内に注射した。食物アレルギー誘導は、２回免疫誘導物質を注射してから２週間後に５０ｍｇの卵白アルブミンを３日間隔で５回経口投与することにより、アレルギー反応が起こるようにした。また、アレルギーの治療効果を確認するために、前記実施例１で得られたカバノアナタケの抽出物、画分及びイノトジオール化合物を卵白アルブミンを投与する間、毎日、マウスに経口投与した。このとき、陽性対照群としてデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）を毎日投与したマウス群を用いた。５０ｍｇの卵白アルブミンを単独又はカバノアナタケ抽出物、画分又はイノトジオール化合物を最後に投与し、１時間後にアレルギーによる症状を観察した。実験群当たり６匹のマウスを用い、それぞれの実験群を下記の表２に示す。

＜実験例２． アレルギー症状の改善効果の確認＞
実験例２－１． 直腸（ｒｅｃｔａｌ）温度変化の確認
食物アレルギー誘発及び薬物処理による直腸の温度変化を確認するために、各群のマウスを用いて直腸の温度を測定した。直腸の温度は、直腸体温計のセンサーの先端を直腸に挿入して測定し、その結果を図１（Ａ）に示す。

図１（Ａ）に示すように、アレルギー誘導群（ａｌｌｅｒｇｙ）の場合には、正常群（Ｎｏｒｍａｌ）に比べて、直腸の温度が低くなることを確認した。一方、デキサメタゾン（Ｄｅｘａ．）又は本発明のカバノアナタケから分離したイノトジオール化合物（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）とこれを含むカバノアナタケのエタノール抽出物（ＥｔＯＨ Ｅｘｔ．）及びジクロロメタン画分（ＣＨ _２Ｃｌ_２ Ｆｒａｃ．）を処理した群では、食物アレルギー誘導群（ａｌｌｅｒｇｙ）に比べて、直腸の温度が高いことを確認し、特に、イノトジオール化合物及びカバノアナタケのジクロロメタン画分を処理した群の場合には、正常群と同様のレベルの直腸温度を示すことを確認した。一方、カバノアナタケの水画分（Ｈ_２Ｏ Ｆｒａｃ．）を処理した場合の直腸温度は、食物アレルギー誘導群と同様のレベルの直腸温度を示した。

これにより、本発明のイノトジオール化合物及びこれを含むカバノアナタケのジクロロメタン画分が、アレルギー誘発によって現れる症状の一つである、直腸の温度低下を改善するということが分かった。

実験例２－２． アナフィラキシー（ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ）の観察
本発明のカバノアナタケから分離したイノトジオール化合物及びこれを含むカバノアナタケのジクロロメタン画分の食物アレルギーによるアナフィラキシー症状の改善又は治療効果を確認するために、各実験群のマウスの反応を観察し、下記表３に基づいてアナフィラキシー症状を点数化し、その結果を図１（Ｂ）に示す。

図１（Ｂ）に示すように、食物アレルギー誘導群（ａｌｌｅｒｇｙ）の場合には、正常群（Ｎｏｒｍａｌ）に比べてアナフィラキシースコアが高い反面、デキサメタゾン（Ｄｅｘａ．）、カバノアナタケのエタノール抽出物（ＥｔＯＨ Ｅｘｔ．）、ジクロロメタン画分（ＣＨ_２Ｃｌ_２ Ｆｒａｃ．）及びイノトジオール化合物（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）を処理した群のアナフィラキシースコアは、食物アレルギー誘導群に比べて低くなることを確認した。特に、カバノアナタケのジクロロメタン画分及びイノトジオール化合物を処理した群のアナフィラキシースコアがより低くなることを確認した。一方、カバノアナタケの水画分（Ｈ_２Ｏ Ｆｒａｃ．）の場合には、食物アレルギーの誘導群と同様のレベルのアナフィラキシースコアを示した。

これにより、本発明のイノトジオール化合物及びこれを含むカバノアナタケのジクロロメタン画分がアレルギー誘発によるアナフィラキシー症状を改善するということが分かった。

実験例２－３． 大腸における糞便（ｓｔｏｏｌ）の観察
本発明のカバノアナタケから分離したイノトジオール化合物及びこれを含むカバノアナタケのジクロロメタン画分の食物アレルギーによる糞便の形態変化を観察した。各実験群のマウスの大腸内便の形を肉眼で観察し、下記の表４に基づいて下痢症状を点数化し、その結果を図１（Ｃ）に示す。

図１（Ｃ）に示すように、食物アレルギー誘導群（ａｌｌｅｒｇｙ）の場合には、正常群（Ｎｏｒｍａｌ）に比べて下痢症状のスコアが高いことを確認した。しかし、デキサメタゾン（Ｄｅｘａ．）又はカバノアナタケから分離したイノトジオール化合物（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）及びこれを含むカバノアナタケのジクロロメタン画分（ＣＨ_２Ｃｌ_２ Ｆｒａｃ．）を処理した群の下痢症状のスコアは、食物アレルギー誘導群に比べて低いことを確認した。一方、カバノアナタケのエタノール抽出物（ＥｔＯＨ Ｅｘｔ．）及び水画分（Ｈ_２Ｏ Ｆｒａｃ．）を処理した群は、下痢症状の緩和効果がカバノアナタケのジクロロメタン画分に比べて低く、水画分の場合には、アレルギー誘導群と同様のレベルであることを確認した。

これにより、本発明のカバノアナタケから分離したイノトジオール化合物及びこれを含むカバノアナタケのジクロロメタン画分がアレルギー誘発による下痢症状を改善するということが分かった。

また、図１には示していないが、カバノアナタケのクロロホルム画分を処理した場合にも、本発明のジクロロメタン画分を処理した場合と同様の直腸温度、アナフィラキシースコア及び糞便の症状のスコアを示すことを確認した。一方、イノトジオール化合物と類似の構造式を有するコレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏ）２０ｍｇ／ｋｇを処理した場合には、イノトジオール化合物とは異なり、アレルギー誘導群と同様のレベルの直腸温度、アナフィラキシースコア及び糞便の症状のスコアを示すことを確認した。

したがって、前記直腸温度、アナフィラキシー症状及び糞便の観察によりカバノアナタケから分離したイノトジオール化合物がアレルギー症状を緩和する主要有効成分の一つであるということが分かり、さらに、イノトジオール化合物を有効成分の一部として含有しているカバノアナタケのジクロロメタン画分及びクロロホルム画分の場合にも、アレルギー症状を緩和する効果に優れていることが分かった。

＜実験例３． 食物アレルギーによる小腸の細胞変化の観察＞
実験例３－１． 小腸の好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ）の観察
好酸球は、食物アレルギーに重要な役割を果たすと知られている。つまり、好酸球は、小腸でアレルギー性炎症を引き起こす。そこで、小腸における好酸球の変化を観察することによって、本発明のイノトジオール化合物及びこれを含むカバノアナタケのジクロロメタン画分のアレルギー予防及び治療効果を確認した。

上記実験例１における各実験群のマウスを麻酔した後、開腹して小腸を取り出てから、ホルマリン（ｆｏｒｍａｌｉｎ）で固定した後、パラフィン（ｐａｒａｆｆｉｎ）で処理して組織にパラフィンを浸透させ、包埋した後、ミクロトームで薄切することによって組織切片を得た。得られた小腸の組織切片を用いてＨ＆Ｅ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ）染色を行った後、好酸球細胞を観察した。その結果を図２（Ａ）に示す。

図２（Ａ）の組織染色を用いて染色された好酸球の細胞数を測定した結果から分かるように、食物アレルギー誘導群（ａｌｌｅｒｇｙ）が正常群（Ｎｏｒｍａｌ）に比べて小腸内の好酸球の浸潤が増加し、デキサメタゾン（Ｄｅｘａ．）とカバノアナタケから分離したイノトジオール化合物（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）及びこれを含むカバノアナタケのジクロロメタン画分（ＣＨ_２Ｃｌ_２ Ｆｒａｃ．）を処理した群の場合には、好酸球の浸潤が減少した。一方、カバノアナタケの水画分（Ｈ_２Ｏ Ｆｒａｃ．）の場合には、その減少効果がほとんどないことが分かった。

これにより、本発明のカバノアナタケから分離したイノトジオール化合物及びこれを含むカバノアナタケのジクロロメタン画分がアレルギーによる炎症を緩和させることで、アレルギーを予防又は治療するということが分かった。

実験例３－２． 小腸の肥満細胞の観察
アレルギー反応を誘発すると知られている肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）を観察することによって、本発明のイノトジオール化合物及びこれを含むカバノアナタケのジクロロメタン画分のアレルギー予防及び治療効果を確認した。

上記実験例３－１で得られた小腸の組織切片を用いて肥満細胞を観察するために、トルイジン（ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ）で染色した後、顕微鏡で観察し、肥満細胞数を測定し、その結果を図２（Ｂ）に示す。

図２（Ｂ）のトルイジンで染色された肥満細胞の数を測定した結果から分かるように、食物アレルギー誘導群（ａｌｌｅｒｇｙ）が正常群（Ｎｏｒｍａｌ）に比べて小腸内の肥満細胞の数が増加し、デキサメタゾン（Ｄｅｘａ．）とカバノアナタケから分離したイノトジオール化合物（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）及びこれを含むカバノアナタケのジクロロメタン画分（ＣＨ_２Ｃｌ_２ Ｆｒａｃ．）を処理した場合には、肥満細胞の数が減少した。一方、水画分（Ｈ_２Ｏ Ｆｒａｃ．）の場合には、その減少効果がほとんどないことが分かった。

また、図２には示していないが、カバノアナタケのクロロホルム画分を処理した場合にも、本発明のカバノアナタケのジクロロメタン画分を処理した場合と同様に、好酸球、及び肥満細胞の減少効果があることを確認した。一方、イノトジオール化合物と類似の構造式を有するコレステロール２０ｍｇ／ｋｇを処理した場合には、イノトジオール化合物とは異なり、好酸球と肥満細胞の減少効果がないことを確認した。

これにより、本発明のカバノアナタケから分離したイノトジオール化合物及びこれを含むカバノアナタケのジクロロメタン画分及びクロロホルム画分がアレルギーの予防又は治療効果があるということが分かった。

＜実験例４． アレルギーによるＩｇＥ及びＭＣＰＴ－１発現量の確認＞
アレルギー反応は、アレルゲンに反応するＩｇＥの発現に起因してアレルゲンとＩｇＥの結合により、肥満細胞がヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、セリンプロテアーゼ（ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ）、プロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）などのアレルギー炎症に関連する顆粒物質を分泌するようになる。したがって、本発明のイノトジオール化合物及びこれを含むカバノアナタケのジクロロメタン画分のアレルギー予防及び治療効果を確認するために、マウスの血清中のＩｇＥ及び肥満細胞の特異的セリンプロテアーゼであるＭＣＰＴ－１（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ－ １）の濃度を測定した。

血清は、上記実験例１において５０ｍｇの卵白アルブミンを単独又はカバノアナタケ抽出物、画分又はイノトジオール化合物を最後に投与し、１日後にマウスの血液を採取することにより得た。得られた血清を１００倍希釈して用いた。

血清中のＩｇＥ濃度は、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）キットを用いて測定した。９６ウェルプレートに２μｇ／ｍｌの卵白アルブミンが含まれている炭酸塩コーティングバッファー（ｃａｒｂｏｎａｔｅ ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ９．５）をウェル当たり１００μｌずつ入れ、４℃で一晩反応させてコーティングした。反応後の洗浄バッファー（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（０．０５％ ｔｗｅｅｎ ２０ ｉｎ ＰＢＳ）で３回洗浄した後、１％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）が含まれているＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）をウェル当たり２００μｌずつ入れ、室温で１時間処理してブロッキングさせた後、洗浄バッファーで３回洗浄した。洗浄後、血清をウェル当たり１００μｌずつ添加し、室温で２時間反応させて洗浄バッファーで洗浄した。１μｇ／ｍｌのビオチンで標識された抗－マウスＩｇＥ（ｂｉｏｔｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＥ）を、ウェル当たり１００μｌずつ入れて１時間反応させた後、洗浄バッファーで洗浄し、再びＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が付いているストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ）を３０分間処理した。プレートを洗浄バッファーで５回洗浄した後、テトラメチレンベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）１００μｌを処理して呈色させた。呈色すると、２Ｎ硫酸（Ｈ_２ＳＯ_４）を１００μｌずつ処理して呈色反応を停止させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定し、血清中のＩｇＥの濃度を分析し、その結果を図３（Ａ）に示す。

また、セリンプロテアーゼであるＭＣＰＴ－１（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ－１）の濃度は、ｍＭＣＰ－１ ＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用い、メーカーから提供される方法に従って実験を行うことで測定し、その結果を図３（Ｂ）に示す。

図３に示すように、食物アレルギー誘導群（ａｌｌｅｒｇｙ）が正常群（Ｎｏｒｍａｌ）に比べて血清中の卵白タンパク質に特異的なＩｇＥ（図３（Ａ））及びＭＣＰＴ－１（図３（Ｂ））の濃度が増加し、カバノアナタケのエタノール抽出物（ＥｔＯＨ Ｅｘｔ．）とジクロロメタン画分（ＣＨ_２Ｃｌ_２ Ｆｒａｃ．）を処理した群の場合には、ＩｇＥ及びＭＣＰＴ－１の濃度が両方とも大幅に減少した。 カバノアナタケの水画分（Ｈ_２Ｏ Ｆｒａｃ．）を処理した場合には、ＩｇＥ及びＭＣＰＴ－１の濃度の変化がほとんどないことが分かった。一方、デキサメタゾン（Ｄｅｘａ．）とイノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）を処理した場合には、ＩｇＥの濃度はほぼ変わらなかったが、ＭＣＰＴ－１の濃度は大幅に減少することが分かった。

また、図３には示していないが、カバノアナタケのクロロホルム画分を処理した場合にも、本発明のカバノアナタケのジクロロメタン画分を処理した場合と同様に、血清中のＩｇＥ及びＭＣＰＴ－１の濃度を減少させることを確認した。

これらの結果は、アレルゲンに特異的なＩｇＥ発現の低減効果よりも、肥満細胞の活性調節・抑制効果がアレルギー症状の予防又は治療と、より直接的な関係があることを示していると言える。

＜実験例５． 肥満細胞特異的抑制効果の確認＞
実験例５－１． ＣＤ４⁺Ｔ細胞活性調節効果の確認
Ｔｈ２（Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ２）ＣＤ４⁺Ｔ細胞によって生成されるサイトカインがＩｇＥの生成を増進し、かつ肥満細胞と好酸球の分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を促進し、アレルギー症状を深めると知られている。また、抗アレルギー効果があると報告されている植物抽出物の場合、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の活性化とＴｈ２ ＣＤ４⁺Ｔ細胞のサイトカイン生成を抑制する効果を同時に持つと多数報告されている。

そこで、本発明のイノトジオール化合物又はイノトジオール化合物を含有するカバノアナタケ抽出物のＣＤ４⁺Ｔ細胞活性調節の効果を確認するために、Ｔｈ２ ＣＤ４⁺Ｔ細胞によって生成されるサイトカインの発現量分析実験と卵白アルブミン由来ペプチドに特異的なＴ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＣＲ）のＤＯ１１．００ ＴＣＲを発現するＣＤ４⁺ ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ）を用いた養子移入（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）実験を行った。

サイトカインの発現分析のために、上記実験例１の方法と同様の方法で試料を処理し、１日後に各群のマウスの腸間膜リンパ節（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ；ｍＬＮ）から細胞を分離した。このとき、デキサメタゾンは１０ｍｇ／ｋｇを処理し、肥満細胞増多症の治療薬として用いられているイマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ；グリベック）２０ｍｇ／ｋｇと、イノトジオール化合物と類似の構造式を有するコレステロール２０ｍｇ／ｋｇとを処理した群を追加した。分離した細胞を、９６ウェルプレートにウェル当たり１×１０^６個ずつ分注した後、卵白アルブミンが含まれているＲＰＭＩ完全培地（１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びグルタミンが含まれているＲＰＭＩ培地）又は１００μｇ／ｍｌの卵白アルブミンが含まれているＲＰＭＩ完全培地を入れ、３７℃、５％ＣＯ_２の条件の細胞培養器で３日間培養した。３日経過後に細胞培養液を集めた後、細胞培養液に分泌されたＩＬ－５、ＩＬ－１３及びＩＦＮ－γの量を、それぞれのサイトカインに該当するＥＬＩＳＡキットとメーカーから提供された実験方法を用いて分析し、その結果を図４（Ａ）に示す。

卵白アルブミン由来ペプチドに特異的なＴ細胞免疫反応の程度を、動物実験によって測定するための実験を以下のように行った。ＤＯ１１．１０ ＴＣＲを発現するトランスジェニックマウス（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ）のリンパ節からの細胞を分離した。分離した細胞をＣＦＳＥ（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）という蛍光物質で染色した後、２×１０^６個の細胞をＢＡＬＢ／Ｃマウスに静脈注射した。細胞注射一日後に卵白アルブミン５０μｇをミョウバンと共に腹腔内注射してＤＯ１１．００ ＴＣＲ発現ＣＤ４⁺Ｔ細胞の分裂を誘導した。卵白アルブミン注射１日後から４日間、１日１回、イノトジオール化合物２０ｍｇ／ｋｇ、カバノアナタケのエタノール抽出物３２０ｍｇ／ｋｇ、デキサメタゾン１０ｍｇ／ｋｇ、イマチニブ１０ｍｇ／ｋｇ又はコレステロール２０ｍｇ／ｋｇを経口投与した。卵白アルブミン注射５日後にＢＡＬＢ／Ｃのリンパ節から細胞を分離した後、抗－ＣＤ４抗体及び抗－ＤＯ１１．１０抗体を用いて細胞を染色し、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて、ＤＯ１１．００ ＴＣＲが発現されるＣＤ４⁺Ｔ細胞におけるＣＦＳＦ蛍光強度を測定して細胞分裂の程度を決定し、かつ細胞数を測定し、その結果を図４（Ｂ）にそれぞれ示す。このとき、細胞の分裂が増加するほど、ＣＦＳＦ蛍光強度は減少する。

図４（Ａ）に示すように、卵白アルブミンが含まれていないＲＰＭＩ完全培地で培養した細胞（Ｎｏ ＯＶＡ）の場合には、すべての群において、ＩＬ－５、ＩＬ－１３及びＩＦＮ－γの発現がないか、又は同様に現れた。一方、卵白アルブミンが含まれているＲＰＭＩ完全培地で培養した細胞（ＯＶＡ）の場合には、ＩＬ－５、ＩＬ－１３及びＩＦＮ－γがすべてアレルギー誘導群（ａｌｌｅｒｇｙ）で顕著に増加した。しかし、カバノアナタケのエタノール抽出物を処理した群（ＥｔＯＨ Ｅｘｔ．）の場合には、サイトカインの量が正常群（Ｎｏｒｍａｌ）と同様のレベルであることを確認した。しかし、イノトジオール化合物を処理した群（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）の場合には、ＩＬ－５、ＩＬ－１３及びＩＦＮ－γ発現量がすべてアレルギー誘導群の発現量と有意差がないことを確認した。

また、図４（Ｂ）の卵白アルブミン由来ペプチドに特異的なＴＣＲであるＤＯ１１．００ ＴＣＲ発現ＣＤ４⁺Ｔ細胞を分析した結果から分かるように、卵白アルブミンを投与した群（ａｌｌｅｒｇｙ）におけるＤＯ１１．００ ＴＣＲを発現するＣＤ４⁺Ｔ細胞のＣＦＳＥ蛍光強度が卵白アルブミン非免疫群（Ｎｏｒｍａｌ）の細胞と比較して格段に減少すると共に、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の数が顕著に増加したが、カバノアナタケのエタノール抽出物（ＥｔＯＨ Ｅｘｔ．）及びイマチニブ（Ｉｍａｔ．）を処理した場合には、ＣＦＳＥの蛍光強度が非免疫群と比較して差がないだけでなく、細胞の数も増加しなかった。一方、イノトジオール化合物を処理した群（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）の場合には、ＤＯ１１．００ ＴＣＲが発現されたＣＤ４+Ｔ細胞のＣＦＳＥ蛍光強度が、卵白アルブミンのみを注射した群と同様のレベルで減少し、ＣＤ４⁺Ｔ細胞数も著しく増加することを確認した。

また、図４には示していないが、本発明のカバノアナタケのジクロロメタン画分及びクロロホルム画分を処理した場合にも、カバノアナタケ抽出物のようにＴｈ２ ＣＤ４⁺Ｔ細胞によるサイトカイン発現を抑制することを確認した。

上記の結果により、本発明のカバノアナタケのジクロロメタン画分及びクロロホルム画分は、アレルゲンによって誘導される格段のＴｈ２ ＣＤ４⁺Ｔ細胞活性調節能を持つ反面、イノトジオールは、そのような効能がないことが分かった。

実験例５－２． 肥満細胞の免疫活性調節効果の確認
上記実験例４におけるイノトジオール化合物又はこれを含有するカバノアナタケ抽出物のＭＣＰＴ－１発現の減少は、イノトジオール化合物による肥満細胞の免疫活性抑制と関連していることが分かった。

そこで、本発明のイノトジオール化合物又はイノトジオール化合物を含有するカバノアナタケ抽出物の肥満細胞の脱顆粒抑制効果を直接確認するために、受動全身アナフィラキシー（ｐａｓｓｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ）実験を行った。

上記実験例１における５週齢の雄ＢＡＬＢ／Ｃマウスにイノトジオール化合物（２０ｍｇ／ｋｇ）、カバノアナタケのエタノール抽出物（３２０ｍｇ／ｋｇ）、イノトジオール化合物の対照群として類似の構造式を有するコレステロール２０ｍｇ／ｋｇ、陽性対照群としてデキサメタゾン１０ｍｇ／ｋｇ及びイマチニブ２０ｍｇ／ｋｇを１日１回、３日間経口投与した。経口投与して３日目に、抗－ＤＮＰ（ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）－ＩｇＥ３μｇを静脈注射してから、２４時間後に、抗原としてＤＮＰが結合されたＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）８０μｇを静脈注射し、肥満細胞の脱顆粒を誘導した。肥満細胞の脱顆粒を誘導したマウスの直腸温度を測定し、血中ＭＣＰＴ－１の量を分析し、その結果を図５に示す。

図５に示すように、マウスの直腸温度を測定した結果（図５（Ａ））において、肥満細胞の脱顆粒を誘導した場合（ＤＮＰ－ＢＳＡ処理）には、直腸の温度が低下している反面、イノトジオール化合物（ Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）及びカバノアナタケのエタノール抽出物（ＥｔＯＨ Ｅｘｔ．）を処理した場合には、直腸の温度が低下していないことを確認した。

また、肥満細胞の脱顆粒過程で排出されるＭＣＰＴ－１の量を分析した結果（図５（Ｂ））においては、肥満細胞の脱顆粒を誘導した場合（ＤＮＰ－ＢＳＡ処理）には、マウスの血中ＭＣＰＴ－１の濃度が増加され、デキサメタゾン（Ｄｅｘａ．）、イマチニブ（Ｉｍａｔ．）、イノトジオール化合物（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）及びカバノアナタケのエタノール抽出物（ＥｔＯＨ Ｅｘｔ．）を処理した場合には、ＭＣＰＴ－１の濃度の増加が顕著に減少することを確認した。一方、イノトジオール化合物と類似の構造式を有するコレステロール（Ｃｈｏｌ．）を処理した場合には、イノトジオール化合物とは異なり、ＭＣＰＴ－１の減少効果がないことを確認した。

図５にはその結果を示していないが、本発明のカバノアナタケのジクロロメタン画分及びクロロホルム画分の場合にも、イノトジオール化合物と同様にＭＣＰＴ－１の量を減少させることを確認した。

これにより、本発明のカバノアナタケのジクロロメタン画分、クロロホルム画分及びイノトジオール化合物が肥満細胞の脱顆粒を抑制することを確認した。

上記の結果により、本発明のカバノアナタケのジクロロメタン画分及びクロロホルム画分の場合には、ＣＤ４⁺Ｔ細胞活性を調節すると共に、肥満細胞の脱顆粒を抑制することにより、複合的な免疫阻害機能を持っている反面、本発明のイノトジオール化合物は、複合的な免疫阻害機能を持っているデキサメタゾンやジクロロメタン画分及びクロロホルム画分とは異なり、肥満細胞の脱顆粒のみを選択的に抑制する効能によって、より選択的かつ安全にアレルギー疾患を治療できることが分かった。

＜製剤例１． 薬学的製剤＞
製剤例１－１． 錠剤の製造
本発明のカバノアナタケのジクロロメタン画分２００ｇを、ラクトース１７５．９ｇ、ジャガイモデンプン１８０ｇ及びコロイド性ケイ酸３２ｇと混合した。この混合物に１０％ゼラチン溶液を添加した後、粉砕して１４メッシュのふるいに通した。これを乾燥させ、ここにジャガイモデンプン１６０ｇ、タルク５０ｇ及びステアリン酸マグネシウム５ｇを添加して得られた混合物を錠剤にした。

製剤例１－２． 注射液の製造
本発明のイノトジオール化合物１ｇ、塩化ナトリウム０．６ｇ及びアスコルビン酸０．１ｇを蒸留水に溶解させて１００ｍｌを作った。この溶液を瓶に入れて２０℃で３０分間加熱して滅菌した。

＜製剤例２． 食品の製造＞
製剤例２－１． 調理用調味料の製造
本発明のイノトジオール化合物を調理用調味料の１重量％で添加して健康増進のための調理用調味料を製造した。

製剤例２－２． 小麦粉食品の製造
本発明のイノトジオール化合物を小麦粉に０．１重量％で添加し、この混合物を用いてパン、ケーキ、クッキー、クラッカー及び麺類を作ることのよって健康増進用食品を製造した。

製剤例２－３． スープ及び肉汁（ｇｒａｖｉｅｓ）の製造
本発明のイノトジオール化合物をスープ及び肉汁に０．１重量％で添加して健康増進用スープと肉汁を製造した。

製剤例２－４． 乳製品（ｄａｉｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の製造
本発明のイノトジオール化合物を牛乳に０．１重量％で添加し、前記牛乳を用いてバター、アイスクリームなどの様々な乳製品を製造した。

製剤例２－５． 野菜ジュースの製造
本発明のイノトジオール化合物０．５ｇをトマトジュース又はニンジンジュース１，０００ｍｌに加え、健康増進用野菜ジュースを製造した。

製剤例２－６． フルーツジュースの製造
本発明のイノトジオール化合物０．１ｇをリンゴジュース又はグレープジュース１，０００ｍｌに加え、健康増進用フルーツジュースを製造した。

Claims (8)

1. 下記化学式１のイノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）化合物を有効成分として含む、血清中のＩｇＥ濃度を低下させずＴｈ２ ＣＤ４ ^＋ Ｔ細胞の活性を調節しないアレルギー疾患の予防又は治療用医薬組成物であって、
   前記アレルギー疾患は、気管支喘息又はアトピー性皮膚炎であることを特徴とする、アレルギー疾患の予防又は治療用医薬組成物。
   
   

   
2. 前記医薬組成物は、肥満細胞の脱顆粒を抑制することを特徴とする、請求項１に記載のアレルギー疾患の予防又は治療用医薬組成物。
3. 前記アレルギーは、花粉、薬物、植物繊維、細菌、食物、染毛剤、化学物質からなる群から選択される１種以上によって誘導されることを特徴とする、請求項１に記載のアレルギー疾患の予防又は治療用医薬組成物。
4. 前記アレルギーは、食物によって誘導されるアレルギーであることを特徴とする、請求項３に記載のアレルギー疾患の予防又は治療用医薬組成物。
5. 下記化学式１のイノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）化合物を有効成分として含む、血清中のＩｇＥ濃度を低下させずＴｈ２ ＣＤ４ ^＋ Ｔ細胞の活性を調節しないアレルギー疾患の予防又は改善用健康機能食品組成物であって、
   前記アレルギー疾患は、気管支喘息又はアトピー性皮膚炎であることを特徴とする、アレルギー疾患の予防又は改善用健康機能食品組成物。
   
   

   
6. 前記健康機能食品組成物は、肥満細胞の脱顆粒を抑制することを特徴とする、請求項５に記載のアレルギー疾患の予防又は改善用健康機能食品組成物。
7. 前記アレルギーは、花粉、薬物、植物繊維、細菌、食物、染毛剤、化学物質からなる群から選択される１種以上によって誘導されることを特徴とする、請求項５に記載のアレルギー疾患の予防又は改善用健康機能食品組成物。
8. 前記アレルギーは、食物によって誘導されるアレルギーであることを特徴とする、請求項７に記載のアレルギー疾患の予防又は改善用健康機能食品組成物。

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