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JP7285332B2 - 高分子量レドックスポリマー及びそれを用いたバイオセンサ - Google Patents
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JP7285332B2 - 高分子量レドックスポリマー及びそれを用いたバイオセンサ - Google Patents

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Description

本開示は、高分子量レドックスポリマー及びそれを用いたバイオセンサに関する。より詳しくは、本発明は、生体内への埋め込み型のバイオセンサに関する。
酵素を用いた電気化学式バイオセンサの代表例として、自己血糖測定に用いられる電気化学式グルコースセンサが挙げられる。電気化学式グルコースセンサには、グルコース酸化還元酵素が用いられている。このグルコース酸化還元酵素には、グルコース酸化酵素（Glucose Oxidase；Gox）やグルコース脱水素酵素（Glucose Dehydrogenase；GDH）がある。
一方、近年、生体内のグルコース濃度を連続的又は半連続的に測定する埋め込み型電気化学式グルコースセンサが開発されている。このような埋め込み型電気化学式グルコースセンサは、図１及び図２に示すように、本体10を生体2に装着してプローブ11を生体内に挿入して連続的又は半連続的に血液中又は間質液中のグルコース濃度の測定を行う。
このような埋め込み型電気化学式グルコースセンサに代表される埋め込み型電気化学式バイオセンサは、そのプローブを長時間（一般的には数日～数週間）、生体内に挿入する。それゆえ、電極上に設けられた、酸化還元酵素及びレドックスメディエータ（電子伝達体）を含む試薬層は、保護膜で被覆されている。そのような構造により、酸化還元酵素やレドックスメディエータがセンサ外部に流出する機会は防止又は抑制されている。酸化還元酵素やレドックスメディエータがセンサ外部に流出すれば、測定感度が劣化するのみならず、生体に対して好ましくない場合もあり、またセンサの耐久性も低下するからである。
例えば、特許文献１は、酵素電気化学センサ用イオン型親水性高分子量レドックスポリマーを開示する。特許文献２～６は、バイオセンサの電子メディエータとして、例えばフェナジンの５位または１位に置換基を有するフェナジン系化合物（1-メトキシ-5-メチルフェナジニウム塩等）を開示する。特許文献７は、フェナジンの５位等に置換基を有するフェナジン系化合物を開示する。
特開2006-131893号公報 特開2014-194411号公報 特開2016-122519号公報 特開2013-164426号公報 特開2011-515686号公報 特開昭61-87676号公報 特開平10-291368号公報
前述したように、埋め込み型の電気化学式バイオセンサにとって、酸化還元酵素やレドックスメディエータが試薬層から保護層を透過して流出することを防止又は抑制する対策が重要である。本開示は、埋め込み型バイオセンサのプローブにおいて、試薬層を構成するレドックスメディエータの流出をより防止又は抑制でき、アナライト（グルコース等）の測定感度を維持しつつ、保存安定性（耐久性）を向上させることのできる手段を提供することを課題とする。
本発明者らは、レドックスメディエータとしてフェナジン系化合物を選択した場合、そのフェナジン系化合物の５位の窒素原子にリンカーを導入した（誘導体化した）場合、フェナジン系化合物のレドックスメディエータとしての優れた性能を保持したまま、そのリンカーを介して各種の高分子量ポリマー（合成樹脂、タンパク質等）を連結させることができること、そのようにして得られる高分子量レドックスポリマーを試薬層に含ませることにより、フェナジン系化合物を単独で試薬層に含ませた場合より流出を防止または抑制できることなどを見出した。
すなわち、本発明は少なくとも下記の事項を包含する。
［１］
一般式（Ａ１）：
Figure 0007285332000001
 ［式中、X-は陰イオン種を示し、Lはリンカーを示し、Polyは高分子量ポリマーを示し、R1～R8は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、カルボキシル基、置換基を有していてもよいアミノ基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和の炭化水素基、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、または置換基を有していてもよいフェニル基を示す。］
で表される高分子量レドックスポリマー。
［２］
前記高分子量レドックスポリマーが、一般式（Ｂ１）：
Figure 0007285332000002
 ［式中、X-は陰イオン種を示し、Lはリンカーを示し、Polyは高分子量ポリマーを示し、R1は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、カルボキシル基、置換基を有していてもよいアミノ基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和の炭化水素基、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、または置換基を有していてもよいフェニル基を示す。］
で表される、項１に記載の高分子量レドックスポリマー。
［３］
前記高分子量レドックスポリマーが、一般式（１）：
Figure 0007285332000003
 ［式中、X-は陰イオン種を示し、Lはリンカーを示し、Polyは高分子量ポリマーを示す。］
で表される、項１または２に記載の高分子量レドックスポリマー。
［４］
前記リンカーは、炭素原子、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子からなる群から選択される少なくとも１つの原子が、鎖状に複数結合して主鎖を構成する、項１～３のいずれか一項に記載の高分子量レドックスポリマー。
［５］
前記高分子量レドックスポリマーが、一般式（２）：
Figure 0007285332000004
 ［式中、X-は陰イオン種を示し、L1は第１リンカーを示し、L2は第２リンカーを示し、Polyは高分子量ポリマーを示す。］
で表される、項１～４のいずれか一項に記載の高分子量レドックスポリマー。
［６］
前記第１リンカーと前記第２リンカーとの結合は、共有結合である、項５に記載の高分子量レドックスポリマー。
［７］
前記第１リンカーは、ポリエチレングリコール鎖及び炭化水素鎖の少なくとも一方を含む、項５又は６に記載の高分子量レドックスポリマー。
［８］
前記高分子量レドックスポリマーが、一般式（３）：
Figure 0007285332000005
 ［式中、X-は陰イオン種を示し、
L3は存在しないか、又は-O-、-C(=O)-NH-もしくは-NH-C(=O)-であり、
L2は前記第２リンカーを示し、
Polyは高分子量ポリマーを示し、
p、q及びsは、それぞれ、独立して、１～１５の整数であり、
rは０～８０の整数である。］
で表される高分子量レドックスポリマーである、項７に記載の高分子量レドックスポリマー。
［９］
前記高分子量レドックスポリマーが、一般式（４）：
Figure 0007285332000006
 ［式中、X-は陰イオン種を示し、L2は前記第２リンカーを示し、Polyは高分子量ポリマーを示す。］
又は、一般式（５）：
Figure 0007285332000007
 ［式中、X-は陰イオン種を示し、L2は前記第２リンカーを示し、Polyは高分子量ポリマーを示す。］
又は、一般式（６）：
Figure 0007285332000008
 ［式中、X-は陰イオン種を示し、L2は前記第２リンカーを示し、Polyは高分子量ポリマーを示す。］
又は、一般式（７）：
Figure 0007285332000009
 ［式中、X-は陰イオン種を示し、L2は前記第２リンカーを示し、Polyは高分子量ポリマーを示す。］
又は、一般式（８）：
Figure 0007285332000010
 ［式中、X-は陰イオン種を示し、L2は前記第２リンカーを示し、Polyは高分子量ポリマーを示す。］
又は、一般式（９）：
Figure 0007285332000011
 ［式中、X-は陰イオン種を示し、L2は前記第２リンカーを示し、Polyは高分子量ポリマーを示し、ｎは１～８０までの整数を示す。］
で表される高分子量レドックスポリマーである、項８に記載の高分子量レドックスポリマー。
［１０］
前記高分子量ポリマーは、炭素原子、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子からなる群から選択される少なくとも１つの原子が、鎖状に複数結合して主鎖を構成している、項１～９のいずれか一項に記載の高分子量レドックスポリマー。
［１１］
前記高分子ポリマーは、その主鎖を構成する原子間の結合に、炭素－炭素結合、アミド結合及びエーテル結合からなる群から選択される少なくとも１つを含んでいる、項１０に記載の高分子量レドックスポリマー。
［１２］
前記高分子量ポリマーは、ポリアミノ酸ポリマー、ポリイミン系ポリマー、又はエチレン系ポリマーである、項１０又は１１に記載の高分子量レドックスポリマー。
［１３］
前記高分子量ポリマーは、タンパク質、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである、項１０又は１１に記載の高分子量レドックスポリマー。
［１４］
前記陰イオン種は、ハロゲンイオン、ハロゲンを含む化合物のイオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、酢酸イオン、炭酸水素イオン、リン酸二水素イオン、硫酸水素イオン、アルキルスルホン酸イオン、硫化水素イオン、シュウ酸水素イオン、シアン酸イオン、及びチオシアン酸イオンからなる群から選択されるいずれか１つである、項１～１３のいずれか一項に記載の高分子量レドックスポリマー。
［１５］
前記高分子量レドックスポリマーは、親水性である、項１～１４のいずれか一項に記載の高分子量レドックスポリマー。
［１６］
複数の種類の、項１～１５のいずれか一項に記載の高分子量レドックスポリマーを含む、高分子量レドックスポリマー混合物。
［１７］
アナライトを検出又は定量するバイオセンサであって、
作用電極、対極、前記作用電極上に配置された試薬層、及び、少なくとも前記試薬層を被覆する保護膜とを有し、
前記試薬層は、前記アナライトを酸化又は脱水素化する酸化還元酵素と、項１～１５のいずれか一項に記載の高分子量レドックスポリマーまたは項１６の高分子量レドックスポリマー混合物とを含む、バイオセンサ。
［１８］
参照電極を有する、項１７に記載のバイオセンサ。
［１９］
前記酸化還元酵素は、補酵素結合型酵素である、項１７または１８に記載のバイオセンサ。
［２０］
前記アナライトがグルコースであって、前記酸化還元酵素がグルコース酸化酵素又はグルコース脱水素酵素である、項１７～１９のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
［２１］
前記グルコース脱水素酵素は、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）結合型グルコース脱水素酵素である、項２０に記載のバイオセンサ。
［２２］
前記グルコース脱水素酵素は、前記グルコースに対する酵素活性を１００％とした場合のマルトースに対する酵素活性が５％以下である、項２０又は２１に記載のバイオセンサ。
［２３］
前記グルコース脱水素酵素は、前記グルコースに対する酵素活性を１００％とした場合のマルトースに対する酵素活性が３％以下である、項２０又は２１に記載のバイオセンサ。
［２４］
前記酸化還元酵素は、前記高分子量レドックスポリマーと架橋結合されている、項１９～２３のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
［２５］
前記保護膜は、前記保護膜外に存在するアナライトが前記保護膜内に透過可能な孔を有する、項１７～２４のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
本開示の高分子量レドックスポリマー及びそれを用いたバイオセンサは、レドックスメディエータ（フェナジン誘導体）が高分子量ポリマーに結合しているため、レドックスメディエータの保護膜外への流出（バイオセンサを生体内に埋め込んだときの生体内への流出）をより防止又は抑制することができる。その結果、測定感度を維持しつつ、保存安定性（耐久性）を向上させることができる。
埋め込み型バイオセンサが生体（人体）に取り付けられた状態を示す図の一例である。 生体（人体）に取り付けられた状態の埋め込み型バイオセンサの断面図の一例である。 本開示の一例である埋め込み型バイオセンサプローブの表側の上面図である。 図３におけるA-A’切断線における断面図である。 図４におけるB-B’切断線における断面図である。 図４におけるC-C’切断線における断面図である。 本開示のフェナジン誘導体が共有結合した高分子量ポリマーのサイクリックボルタモグラムの一例である。 本開示のフェナジン誘導体が共有結合した高分子量ポリマーのサイクリックボルタモグラムの一例である。 本開示のフェナジン誘導体が共有結合したタンパク質のサイクリックボルタモグラムの一例である。 比較としてのフェナジン誘導体のサイクリックボルタモグラムの一例である。 本開示のフェナジン誘導体が共有結合した高分子量ポリマーの吸光スペクトルである。 本開示のフェナジン誘導体が共有結合した高分子量ポリマーを用いたプローブのグルコース応答特性を示すグラフである。 本開示のフェナジン誘導体が共有結合した高分子量ポリマーを用いたプローブの耐久性を示すグラフである。
本開示の高分子量レドックスポリマー及びそれを用いたバイオセンサの実施形態について、以下さらに詳細に説明する。
― 高分子量レドックスポリマー ―
本開示の高分子量レドックスポリマーは、レドックスメディエータであるフェナジン系化合物が、その５位の窒素原子に結合しているリンカーを介して、高分子量ポリマーと連結している化合物である。
本開示において「レドックスメディエータ」とは、電子伝達を仲介する酸化還元物質を意味し、バイオセンサにおいては、酸化還元酵素によるアナライトの酸化還元反応によって生じる電子の伝達を担う物質を指す。本開示においては、レドックスメディエータとして、このような機能を有する「フェナジン系化合物」、特にその５位の窒素原子にリンカーが導入されている「フェナジン誘導体」を用いる。レドックスメディエータとしては、フェリシアン化物やフェロセン等の種々の化合物があるが、フェナジン系化合物は、酸化還元電位が０Vよりも負（vs.Ag/AgCl 飽和KCl）と低く、生体試料中のアスコルビン酸（ビタミンC）、尿酸等の電気化学測定の夾雑物の影響を受け難いため、特に好ましいレドックスメディエータである。
「フェナジン系化合物」は、フェナジン骨格（下記式参照）を有し、１～４および６～９位の炭素原子は置換されていてもよい化合物であって、レドックスメディエータとして機能するものであれば特に限定されるものではない。そのようなフェナジン系化合物としては様々な種類のものが公知になっており、本発明においても高分子量レドックスポリマーを作製するために用いることができる。
Figure 0007285332000012
より具体的には、本開示の高分子量レドックスポリマーは、一般式（Ａ１）で表すことができる。
Figure 0007285332000013
 一般式（Ａ１）において、X-は陰イオン種を示し、Lはリンカーを示し、Polyは高分子量ポリマーを示す。
また、一般式（Ａ１）において、R1～R8は、それぞれ独立して、例えば（i）水素原子、（ii）ハロゲン原子、（iii）ヒドロキシル基、（iv）カルボキシル基、（v）置換基を有していてもよいアミノ基、（vi）置換基を有していてもよいＣ１－６（炭素数１～６個、低級アルキル）の直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和の炭化水素基、（vii）置換基を有していてもよいアシル基（例えばＣ１－６アルキル－カルボニル基）、（viii）置換基を有していてもよいアルコキシ基（例えばＣ１－６アルコキシ基）、（ix）置換基を有していてもよいフェニル基を示す。上記（v）、（vi）、（vii）、（viii）および（ix）それぞれが有していてもよい置換基としては、例えば、（a）ハロゲン原子、（b）ヒドロキシル基、（c）カルボキシル基、（d）アミノ基、（e）Ｃ１－６（炭素数１～６個、低級アルキル）の直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和の炭化水素基、（f）アシル基（例えばＣ１－６アルキル－カルボニル基）、（g）アルコキシ基（例えばＣ１－６アルコキシ基）、（h）カルボキシル－アルキル基（例えばカルボキシル－Ｃ１－６アルキル基）、（i）メシル基、（k）フェニル基が挙げられる。上記（v）、（vi）、（vii）、（viii）および（ix）それぞれが有していてもよい置換基の数は特に限定されるものではなく、例えば１個、２個または３個であってもよく、また一つの原子（例えば、アルキル基の炭素原子、アミノ基の窒素原子）に複数の置換基が結合していてもよい。R1～R8は、上記の置換基に限らず、公知のフェナジン系化合物が各部位に有する置換基であってもよい。
ここで、一般式（Ａ１）は見かけ上、１つの高分子量ポリマー（Poly）に対してフェナジン誘導体が１つだけ結合しているように表されているが、そのように限定的に解釈されるものではなく、１つの高分子量ポリマーに対して少なくとも１つの、通常は複数のフェナジン誘導体が結合していると解釈されるべきものである。また、本明細書に記載するような、フェナジン誘導体と高分子量ポリマーとを反応させて高分子量レドックスポリマーを生成させる製造方法では、１つの高分子量ポリマーに対するフェナジン誘導体の結合数について分布を有する、高分子量ポリマー組成物が得られる。高分子量ポリマー組成物が有するフェナジン誘導体の結合数についての分布の仕方や、１つの高分子量ポリマーに対して結合するフェナジン誘導体の数（の平均）は特に限定されるものでなく、用途や性能などを考慮しながら、また高分子量レドックスポリマーを製造する際の原料（高分子量ポリマーまたはそれを構成しているモノマー）や反応条件などによって、適宜調整することができる。例えば、高分子量ポリマーの原料として用いるモノマー１分子中（第２’リンカーの部分など）に含まれる、後記表１に示す第１または第２反応基の数を増減させたり、モノマー全体に含まれるそれらの反応基のうち、フェナジン誘導体（第１’リンカーの部分など）に含まれる対応する反応基と実際に反応させるものの割合を反応条件によって、フェナジン誘導体の結合数（の平均）を増減させたり、その分布の仕方を変化させたりすることができ、所望の数のフェナジン誘導体が高分子量ポリマーに結合している、所望の性状を有する高分子量レドックスポリマー（の組成物）を製造することができる。
陰イオン種は、特に限定されるものではないが、例えば、ハロゲンイオン、ハロゲンを含む化合物のイオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、酢酸イオン、炭酸水素イオン、リン酸二水素イオン、硫酸水素イオン、アルキルスルホン酸イオン、硫化水素イオン、シュウ酸水素イオン、シアン酸イオン、及びチオシアン酸イオンからなる群から選択されるいずれか１つが挙げられる。
本開示の高分子量レドックスポリマーは、親水性である。ここでいう親水性を有する高分子量レドックスポリマーとは、水に対して親和性が高く、水及び極性溶媒中に溶解、混和しやすいポリマー、好ましくはフェナジン誘導体との反応溶媒として用いられるものに対して、反応の進行に支障が無い程度に溶解、混和しやすいポリマーを指す。極性溶媒の種類としては、メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、1－ブタノール、2-ブタノール、2-メチル-1-プロパノール、2-メチル-2-プロパノール、ギ酸、酢酸、テトラヒドロフラン、アセトン、ジオキサン、メチルチルケトン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。高分子量レドックスポリマーは、フェナジン誘導体と高分子量ポリマーとがリンカーを介して結合したものであるが、フェナジン誘導体（後述する第１’リンカー部分も含む）及び高分子量ポリマー（後述する第２’リンカー部分も含む）のいずれか一方は、疎水性であってもよい。すなわち、最終的に合成された高分子量レドックスポリマーが親水性であればよい。
本開示のリンカーは、炭素原子、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子からなる群から選択される少なくとも１つの原子が、鎖状に複数結合して主鎖を構成する。例えば、途中にエーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合など（ヘテロ原子を含む結合）が、後述する第１反応基および第２反応基の反応により生成した基として、またはそうではなくあらかじめ形成された基として含まれていてもよい、炭化水素基が挙げられる。
ここでいう「炭素原子、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子からなる群から選択される少なくとも１つの原子が、鎖状に複数結合して」構成した主鎖とは、直線状で環（環式化合物から誘導される構造、環状構造）が一つもない分子構造の化合物を指す鎖式化合物（非環式化合物）によって構成されている場合だけでなく、部分的に環を有する化合物によって構成されている場合も含まれる。環を含む主鎖としては、例えば、環の一方（例えばベンゼン環の１つの炭素原子上）に鎖式化合物から誘導される基（例えばアルキル基）を有し、もう一方（例えば前記直鎖状の基が結合している炭素原子に対してオルト位、メタ位またはパラ位の炭素原子上）にも鎖式化合物から誘導される基を有するものが挙げられる。この場合、一方の鎖式化合物側でフェナジン誘導体と結合し（例えばアルキル基はアルキレン基となり）、もう一方の鎖式化合物側で高分子量ポリマーと結合する。環を挟んで結合している、鎖式化合物から誘導される上記２つの基の一方または両方は、部分的に環を有する化合物から誘導される基に置き換えることもできる。また、リンカーは、主鎖に側鎖が結合するものであってもよい。
上記の「リンカー」に関する記載は、一般式（Ａ１）における「L」の説明としてのみならず、以下に記載する一般式（Ａ２）における「L1」（第１リンカー）および「L2」（第２リンカー）のそれぞれおよびそれらが結合した「L1-L2」の説明として、さらに一般式（Ａ３）～（Ａ９）における「L2」（第２リンカー）の説明としても適用される。但し、L1とL２は、互いに異なる種類のリンカー、例えば繰り返し単位の異なるリンカーである。
レドックスメディエータ（フェナジン誘導体）の生体内環境における熱安定性を向上させる観点からは、リンカー（一般式（Ａ１）における「L」、または一般式（Ａ２）における「L1-L2」全体、あるいは実施例（Ａ３）～（Ａ９）におけるそれらに相当する部位など）を構成する主鎖を構成する原子数（炭素原子、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子の合計）は、１０以上が好ましく、３１以上が好ましく、５５以上がさらに好ましい。リンカーを構成する主鎖を構成する原子数は、７２０未満が好ましく、３４０未満が好ましく、２４０未満がさらに好ましい。
一般式（Ａ１）で表される高分子量レドックスポリマーは、好ましくは、一般式（Ｂ１）で表されるものである。
Figure 0007285332000014
一般式（Ｂ１）中の各記号は、一般式（Ａ１）中の対応する各記号と同義である。一般式（Ｂ１）は、換言すれば、一般式（Ａ１）において、R７～R8はすべて水素原子であり（無置換であり）、R１のみ、水素原子（無置換）であっても、所定の置換基であってもよいことが規定されている実施形態に相当する。
一般式（Ａ１）または（Ｂ１）で表される高分子量レドックスポリマーは、特に好ましくは、一般式（１）で表されるものである。
Figure 0007285332000015
一般式（１）中の各記号は、一般式（Ａ１）中の対応する各記号と同義である。一般式（１）は、換言すれば、一般式（Ａ１）において、R7～R8はすべて水素原子であり（無置換であり）、R1はメトキシ基（アルコキシ基）であることが規定されている実施形態に相当する。
本開示の高分子量レドックスポリマーに含まれるリンカーは、好ましくは、２種類のリンカー、第１リンカーおよび第２リンカーが結合しているものである。
そのようなリンカーを有する高分子量レドックスポリマーは、例えば一般式（Ａ１）において、リンカー（L）を、第１リンカーおよび第２リンカーが結合したもの（-L1-L2-）に置き換えた、一般式（Ａ２）として表すことができる。
Figure 0007285332000016
一般式（Ａ２）においてL１は第１リンカーを示し、L2は第２リンカーを示し、それ以外の各記号は一般式（Ａ１）中の対応する各記号と同義である。
一般式（Ａ２）において第１リンカーおよび第２リンカーが結合している部位（L1-L2）は、一般式（Ａ１）におけるリンカー（L）に相当する部位である。
本開示において、第１リンカーと第２リンカーは、好ましくは共有結合により結合している。しかしながら本発明の作用効果が奏される範囲で、第１リンカーと第２リンカーは、非共有結合（例えば静電的相互作用）により結合していてもよい。
第１リンカーと第２リンカーとの結合部位に形成される共有結合は、特に限定されないが、例えば、以下の表１に示されている、第１反応基（表中にされているアミン等の化合物から誘導される１価の基、特にその末端のアミノ基等）と第２反応基（表中に示されているカルボン酸等の化合物から誘導される１価の基、特にその末端のカルボキシル基等）の反応により形成される共有結合が挙げられる。このような共有結合およびそれを形成するための反応基は、当業者にとって周知慣用である（例えば、特表2003-514924号公報）。表１に示す第１反応基および第２反応基は、結合前の第１リンカー（以下「第１’リンカー」と呼ぶことがある。）および結合前の第２リンカー（以下「第２’リンカー」と呼ぶことがある。）の末端部を構成しており、第１’リンカーおよび第２’リンカーの一方が第１反応基を有し、もう一方が第２反応基を有する。前記一般式（２）、および後記一般式（３）～（９）における第２リンカー（L2）は、第１反応基および第２反応基の反応により生成した結合部位の原子と、その反応によって変化していない部位の原子を含んでいる。例えば、フェナジン誘導体が有する第１’リンカーの末端に第１反応基としてアミン（アミノ基：－ＮＨ２）が存在しており、高分子量ポリマーが有する第２’リンカーの末端に第２反応基としてカルボン酸（カルボキシル基：－ＣＯＯＨ）が存在しており、それらが反応してアミド結合（－ＮＨ－ＣＯ－）が生成した場合、一般式（３）中のL2で示される第２リンカーは、－ＮＨ－ＣＯ－の原子を含んでいる。
Figure 0007285332000017
本開示の高分子量レドックスポリマーの一態様において、フェナジン誘導体と高分子量ポリマーとは、アミド結合によって連結されている、すなわちフェナジン誘導体が有する第１’リンカーまたはその他の部位と高分子量ポリマーが有する第２’リンカーまたはその他の部位とが、表１中の「アミド」に対応する第１反応基（アミン）と第２反応基（カルボン酸、活性化エステル等）との反応により生成するアミド結合によって連結されている。
本開示の高分子量レドックスポリマーの一態様において、フェナジン誘導体と高分子量ポリマーとは、アミド結合以外の共有結合によって連結されている、すなわちフェナジン誘導体が有する第１’リンカーまたはその他の部位と高分子量ポリマーが有する第２’リンカーまたはその他の部位とが、表１中の「エーテル」、「チオエーテル」、「エステル」、「チオエステル」、「ヒドラゾン」、「尿素」、「チオ尿素」、「オキシム」、「アミジン」、「アルキルアミン」、「ウレタン」、「イミダゾリウム」、「ピリジニウム」、「スルホンアミド」、「スルホン酸エステル」のそれぞれに対応する第１反応基と第２反応基との反応により生成する共有結合によって連結されている。
高分子量ポリマーとしてタンパク質またはポリペプチド、あるいはポリアミノ酸を用いる場合、表１に示す第１反応基および第２反応基は、そのタンパク質等を構成しているアミノ酸残基の側鎖が有するものであってもよいし、タンパク質に別途導入したリンカー（第２’リンカー）が有するものであってもよい。例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジンは、上記「第１反応基」として「アミン」（アミノ基）を有し、アスパラギン酸およびグルタミン酸は、上記「第１反応基」または「第２反応基」として「カルボン酸」（カルボキシル基）を有し、システインは上記「第１反応基」として「チオール」（スルファニル基）を有するアミノ酸に相当する。したがって、それらのアミノ酸残基を含むタンパク質またはポリペプチドはそれぞれの第１反応基または第２反応基を有するものであり、フェナジン誘導体が有する所定の対応する反応基と所定の反応条件下で反応して共有結合を形成することができる。さらに、高分子量ポリマーとしてポリヌクレオチドを用いる場合も、それを構成しているヌクレオチドの一部として用いられる非天然の修飾されたヌクレオチドが有するものであってもよいし、その他の手段により別途ポリヌクレオチドに導入したリンカー（第２’リンカー）が有するものであってもよい。タンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが有する（導入された）反応基を介して他の化合物（本開示におけるフェナジン誘導体）が有する他の反応基と共有結合を形成させる方法も、当業者にとって周知慣用である。
第１リンカーは、前述のような主鎖を構成するものが好ましく、例えば、ポリエチレングリコール鎖及び炭化水素鎖の少なくとも一方を含むものが挙げられる。例えば、一般式（２）における第１リンカーは、下記の一般式（３）～（９）における第１リンカーに相当する部位に表されているようなリンカーとすることができる。
一般式（Ａ２）で表される高分子量レドックスポリマーの具体例としては、一般式（Ａ３）で表されるものが挙げられる。
Figure 0007285332000018
一般式（Ａ３）中、
L3は存在しないか、又は-O-、-C(=O)-NH-もしくは-NH-C(=O)-であり、
L2は前記第２リンカーを示し、
p、q及びsは、それぞれ、独立して、１～１５の整数であり、
rは０～８０、例えば０～３０の整数であり、
それ以外の各記号は一般式（Ａ１）中の対応する各記号と同義である。
一般式（Ａ３）で表される高分子量レドックスポリマーの具体例としては、一般式（Ａ４）～（Ａ９）のいずれかで表されるものが挙げられる。
Figure 0007285332000019
 一般式（Ａ４）中、L2は前記第２リンカーを示し、それ以外の各記号は一般式（Ａ１）中の対応する各記号と同義である。
Figure 0007285332000020
 一般式（Ａ５）中、L2は前記第２リンカーを示し、それ以外の各記号は一般式（Ａ１）中の対応する各記号と同義である。
Figure 0007285332000021
 一般式（Ａ６）中、L2は前記第２リンカーを示し、それ以外の各記号は一般式（Ａ１）中の対応する各記号と同義である。
Figure 0007285332000022
 一般式（Ａ７）中、L2は前記第２リンカーを示し、それ以外の各記号は一般式（Ａ１）中の対応する各記号と同義である。
Figure 0007285332000023
 一般式（Ａ８）中、L2は前記第２リンカーを示し、それ以外の各記号は一般式（Ａ１）中の対応する各記号と同義である。
Figure 0007285332000024
 一般式（Ａ９）中、L2は前記第２リンカーを示し、ｎは１～８０、例えば１～３０までの整数を示し、それ以外の各記号は一般式（Ａ１）中の対応する各記号と同義である。
なお、一般式（Ｂ）および一般式（１）からも同様に、それぞれのリンカー（L）を、第１リンカーおよび第２リンカーが結合したもの（-L1-L2-）に置き換えることにより、一般式（Ａ２）に対応する高分子量レドックスポリマーとして一般式（Ｂ２）および（２）を規定することができる。さらに、一般式（Ａ２）の具体例として挙げた一般式（Ａ３）や、一般式（Ａ３）の具体例として挙げた一般式（Ａ４）～（Ａ９）に対応する高分子レドックスポリマーも、上記一般式（Ｂ２）および（２）から同様にして、一般式（Ｂ３）～（Ｂ９）および一般式（３）～（９）として規定することができる。一般式（Ｂ２）～（Ｂ９）および（２）～（９）において、フェナジン系化合物の置換基R1～R8は一般式（Ａ１）および（Ａ２）と同義であり、それ以外の記号は対応する一般式（Ａ２）～（Ａ９）と同義である。
Figure 0007285332000025
Figure 0007285332000026
Figure 0007285332000027
Figure 0007285332000028
本開示における高分子量ポリマーは、保護膜からレドックスメディエータ（フェナジン誘導体）の流出を防止又は抑制するために、レドックスメディエータと結合される。そのため、高分子量ポリマーとしては一定の水準以上の分子量（重量平均分子量）を有するポリマー、通常は１００００以上、好ましくは５００００以上、より好ましくは１０００００以上の重量平均分子量を有するポリマーが用いられる。この高分子量ポリマーの重量平均分子量は、通常１０００００００未満、好ましくは１００００００未満である。高分子量ポリマーの分子量（重量平均分子量）や分子量分布は、高分子量ポリマーの種類に応じて公知の手段によって測定することが可能であり、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）や、高分子量ポリマーがタンパク質であればＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）法などを用いることができる。また、高分子量ポリマーとして市販されているものを購入して用いる場合は、そのカタログ値等に示されている数値を分子量（重量平均分子量）などとみなすことができる。
高分子量ポリマーは、ホモポリマー（単独重合体）、コポリマー（共重合体）、およびそれらが結合および／または混合されたポリマーのいずれであってもよく、またランダムポリマー又はブロックポリマーのいずれであってもよい。
高分子量ポリマーは、フェナジン誘導体に、すなわちリンカーを介してレドックスメディエータ（フェナジン系化合物、特にその５位の窒素原子）に結合させることができる構造を有し、また作用電極上にそれを含む試薬層を形成することのできる高分子量ポリマーであれば、特に限定されるものではない。高分子量ポリマーとしては、例えば、炭素原子、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子からなる群から選択される少なくとも１つの原子が、鎖状に複数結合して主鎖を構成しているもの、代表的には、その主鎖を構成する原子間の結合に、炭素－炭素結合、アミド結合及びエーテル結合からなる群から選択される少なくとも１つを含んでいるものが挙げられる。高分子量ポリマーは、上記のような主鎖に側鎖が結合していてもよい。高分子量ポリマーの主鎖（長手方向の末端部）および／または側鎖において、少なくとも１つのフェナジン誘導体と連結できればよい。炭素－炭素結合は、代表的には後記エチレン系ポリマーに含まれる、エチレン性炭素－炭素二重結合に由来する結合である。アミド結合は、代表的には後記ポリアミノ酸系ポリマーに含まれる結合（ペプチド結合）である。
好ましい実施形態において、高分子量ポリマーは、側鎖において複数の（多数の）フェナジン誘導体と連結する。例えば、フェナジン誘導体が有する第１’リンカーと反応して共有結合を形成することが可能な、前述の表１に示したような第１反応基または第２反応基を有する第２’リンカーを側鎖として複数（多数）有する高分子量ポリマーが好ましい。第１反応基または第２反応基は、例えば主鎖への付加反応によって導入された比較的多数の原子によって構成されている第２’リンカーの末端に位置していてもよいし、主鎖を形成するために用いたモノマーが元来有していたことにより、主鎖に直接結合していても、または比較的少数の原子によって構成されている第２’リンカーの末端に位置していてもよい。
本開示における高分子量ポリマーの具体例としては、ポリアミノ酸系ポリマー（例えばポリ(L-グルタミン酸ナトリウム)、ポリ(L-リジン)）；ポリイミン系ポリマー（例えばポリ(エチレンイミン)）；又はエチレン系ポリマー（例えばポリアリルアミン塩酸塩、アリルアミン塩酸塩・ジアリルアミン塩酸塩共重合体、アリルアミン・ジアリルジメチルアンモニウムクロリド共重合体）などであって、側鎖等に第１反応基または第２反応基を有するものが挙げられる。なお、エチレン系ポリマーには、ラジカル重合が可能な「エチレン性炭素－炭素二重結合」、例えばビニル基（CH2=CH-）、アリル基（CH2=CH-CH2-）、アクリロイル基（CH2=CH-C(O)-）、メタクリロイル基（CH2=C(CH3)-C(O)-）などを含むモノマー同士（それらのモノマーの中から選ばれる１種または２種以上のモノマー）による、ホモポリマーおよびコポリマーならびにそれらの修飾物（例えば酢酸ビニルに由来する単位をケン化によりビニルアルコール化したものや、親水性を賦与するような処理をしたもの）が包含される。エチレン性炭素－炭素二重結合を含むモノマーとしては、例えば、エチレン、プロピレン、ブタジエン、イソブテン、テトラフルオロエチレン、ビニルアルコール、酢酸ビニル、塩化ビニル、塩化ビニリデン、スチレン、メチルスチレン、アリルアミン、ジアリルアミン、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、アクリロニトリル等が挙げられる。その他にも、一般的に生体適合性ポリマーとして知られている各種の高分子量ポリマー、例えばポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系ポリマーを用いることができる。
また、高分子量ポリマーは、アミノ酸をモノマーとするポリマーといえる（但し、概念として前記ポリアミノ酸とは区別される）、天然のアミノ酸配列または改変された（置換、欠失、付加等された）アミノ酸配列を有するタンパク質やポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質としては、例えば、ブロッキング剤として周知慣用のＢＳＡ等や、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ等の本開示における酸化還元酵素が挙げられる。また、高分子量ポリマーは、ヌクレオチドをモノマーとし、リン酸基を介して連結したポリマーといえる、天然の塩基配列または改変された（置換、欠失、付加等された）塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
高分子量ポリマーは、親水性を有するものであることが望ましい。前述の通り、高分子量レドックスポリマーは親水性である必要がある一方、高分子量ポリマーは必ずしも親水性でなくてもよい。親水性でない高分子量ポリマーであっても、親水性のフェナジン誘導体と結合させた結果、全体として親水性である高分子量レドックスポリマーが生成すればよいからである。しかしながら、高分子量ポリマーとフェナジン誘導体は、典型的にはフェナジン誘導体が溶解する水又は極性溶媒を含む反応溶媒中で結合させる（例えば第１反応基と第２反応基を反応させる）ことを鑑みると、高分子ポリマーは親水性であることが望ましい。
本開示による高分子量レドックスポリマーは、当業者の技術水準に基づいて製造することができる。一般的には、目的とする高分子量レドックスポリマーに応じて、それぞれあらかじめ合成されたフェナジン誘導体と高分子量ポリマーとを反応させることにより、高分子量レドックスポリマーが得られる。
フェナジン誘導体は、選択されたフェナジン系化合物と、所望の反応基を有するリンカーを構成することができる化合物（例えばＮ－アルキル化剤）とを、適切な条件下（温度、時間、補助剤等）で反応させることにより、フェナジン系化合物の５位の窒素原子にリンカー（第１’リンカー）を導入することにより得られる。
高分子量ポリマーについても、選択されたモノマーを適切な方法（反応、条件、補助剤等）で重合させることにより、あるいはタンパク質または核酸として合成することにより、所望の反応基を有する高分子量ポリマーが得られる。
フェナジン誘導体と高分子量ポリマーとは、それぞれが有する反応基（前記表１中の第１反応基および第２反応基）に応じた適切な条件下で反応させることにより、目的とする高分子量レドックスポリマーが得られる。得られた高分子量レドックスポリマーは、必要に応じてゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過等により精製してもよい。
一般式（Ａ１）～（Ａ９）、（Ｂ１）～（Ｂ９）、（１）～（９）等で表される、本開示による高分子量レドックスポリマーは、いずれか１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて、例えば混合して用いてもよい。本発明の態様において、複数の種類の本開示の高分子量レドックスポリマー（例えば、高分子量ポリマーの種類が異なるものや、リンカーの種類が異なるもの、フェナジン系化合物の種類（置換基の位置、数、種類など）が異なるものなど）を含む、高分子量レドックスポリマー混合物が提供される。
― バイオセンサ ―
本開示のアナライトを検出又は定量するバイオセンサは、基本的に埋め込み型のものであって、作用電極、対極、前記作用電極上に配置された試薬層、及び、少なくとも前記試薬層を被覆する保護膜とを有し、前記試薬層は、前記アナライトを酸化又は脱水素化する酸化還元酵素と、本開示による高分子量レドックスポリマーまたはその混合物、代表的には一般式（Ａ１）：
Figure 0007285332000029
 ［一般式（Ａ１）中の各記号の説明は前述した通りである。］
で表される高分子量レドックスポリマーまたは一般式（Ａ１）で表される高分子量レドックスポリマーの複数の種類を含む混合物とを含む。
バイオセンサの試薬層に含まれる高分子量レドックスポリマーの詳細（より具体的な実施形態、好ましい実施形態、例えば一般式（Ａ２）～（Ａ９）、（Ｂ１）～（Ｂ９）および（１）～（９）等）は、前述した通りである。バイオセンサの試薬層は、いずれか１種の高分子量レドックスポリマーを単独で含んでいてもよいし、２種以上の高分子量レドックスポリマーを、混合したり、積層した状態などで（例えば高分子量レドックスポリマー混合物として）、含んでいてもよい。
本開示のバイオセンサは、さらに参照電極を含むことができる。
本開示において、「酸化還元酵素」とは、アナライトを酸化又は脱水素化することができる酵素を指す。この酸化還元酵素は、補酵素結合型酵素であることが望ましい。
本開示において、アナライトがグルコースである場合、酸化還元酵素は、グルコース酸化酵素（グルコースオキシダーゼ）又はグルコース脱水素酵素（グルコースデヒドロゲナーゼ；ＧＤＨ）となる。また、このような補酵素結合型のグルコース脱水素酵素としては、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）結合型ＧＤＨやフラビンアデニンヌクレオチド（ＦＡＤ）結合型ＧＤＨが挙げられる。また、生体内中のマルトースの影響を考慮すると、ＧＤＨは、グルコースに対する酵素活性を１００％とした場合のマルトースに対する酵素活性が５％以下であることが望ましい。より好ましくは、マルトースに対する酵素活性が３％以下であることが望ましい。このような酵素活性を有する酵素の例として、ＦＡＤ結合型ＧＤＨが挙げられる。このようなＦＡＤ結合型ＧＤＨの例としては、アスペルギルス属（オリゼやテレウス）由来、ムコール属由来のものが挙げられる（例えば、WO2004/058958号公報、特開2008-228740号公報、WO2010/140431号公報を参照）。
また、本開示における酸化還元酵素は、高分子量レドックスポリマーと、例えば、グルタルアルデヒドのような架橋剤を用いて、架橋結合することもできる。両者を結合させることで、分子量が大きくなり、よりレドックスメディエータの保護膜外への流出を抑制することができる。ただし、架橋結合させたとしても、酸化還元酵素がアナライトを測定可能な活性を維持していることが必要である。高分子量レドックスポリマーと架橋結合させない場合は、酸化還元酵素は、高分子量レドックスポリマーと混合した状態で、試薬層中に含まれていればよい。
本開示において、「保護膜」とは、試薬層に含まれる物質（主にレドックスメディエータ）の保護膜外への漏出を防止又は抑制するものであり、かつ、保護膜外に存在するアナライトが試薬層の存在する保護膜内に透過可能な孔を有するものである。そして、保護膜は、プローブ上では少なくとも試薬層を被覆できるように配置される必要がある。
埋め込み型のバイオセンサが備える、試薬層が形成されているプローブは、生体内に挿入して使用されるため、その表面を被覆する保護膜は、タンパク質や細胞が吸着しない又はし難い生体適合性を有すること、一般的にはそのような性質を有するポリマーによって形成されることが好ましい。このような保護膜を形成できるポリマーとしては、例えば、メタクリル酸メチルとヒドロキシエチルメタクリレートとのコポリマー、ブチルメタクリレートとヒドロキシエチルメタクリレートとのコポリマー、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン－コ－ｎ－ブチルメタクリレート）等が挙げられる。なお、これらの例示されたポリマーと同様の主鎖を有する（メタ）アクリレート系化合物であって、リンカーと反応することができる反応基（表１に示す第１反応基または第２反応基）を側鎖に有するものを、高分子量ポリマーの具体例として挙げたメタクリロイル基またはアクリロイル基を有する「エチレン系ポリマー」として用いることも可能である。
本開示の高分子量レドックスポリマーが適用される、埋め込み型バイオセンサのプローブの内部構造の一例を図３～６に示す。図３～６に示す構成は、例示的なものであって、本開示の高分子量レドックスポリマーの適用対象を限定するものではない。
図２に示したように、埋め込み型バイオセンサ1は、本体10とプローブ11を含む。図３は、プローブ11を表側から見た上面図を示している。ここでいう表側とは、後述する作用電極及び参照電極を有する側の面を指す。図３に示すようにプローブ11は、概略、生体内に挿入するセンシング部分121及びバイオセンサ本体10の内部回路と電気的に接続するための端子部分122から構成される。センシング部分121は、生体内に挿入できるように細く形成される。センシング部分は、体内に挿入するものであって、概ね、長手方向の長さは２０～３ｍｍ（好ましくは１０～３ｍｍ）、短手方向の長さは１ｍｍ～５０μｍ（好ましくは５００μｍ～５０μｍ）で構成されることが好ましい。
プローブ11のより具体的な構成を、図４を用いて説明する。図４は、図３のA-A’切断線でのプローブ11の断面図を示している。
まず、絶縁性基板111の両面に、炭素又は金、銀、白金もしくはパラジウムなどの金属よりなる群から選択される導電性金属材料をスパッタ法、蒸着法、イオンプレーティングなどで金属薄膜を形成することによって導電性薄膜112を形成する。そして、絶縁性基板111の一方の面（表側）に形成した導電性薄膜112にレーザー描写することによって絶縁性基板111の表面に達する深さの溝113を形成して、作用電極領域112aと参照電極領域112bに分離することで電気的に絶縁する。
次に、絶縁性基板111の両面に、参照電極領域112bの所定の位置に開口（参照電極用の開口）を有するように絶縁性レジスト膜116a,116bを形成する。ただし、図４から理解されるように、センシング部分112の端部から一定距離離れた部分までは、絶縁性レジスト膜116a,116bを形成しない。そして、この作用電極領域112aの端部側の絶縁性をレジスト膜が形成されていない領域が、作用電極114となり、その反対側（ここでいう裏側）の絶縁性をレジスト膜が形成されていない領域が、対極117となる。参照電極115は、絶縁性基板111の表側に形成した絶縁性レジスト膜116aの参照電極用の開口にAg/AgClをスクリーン印刷法やインクジェット法により形成される。なお、ここでは、作用電極、対極、参照電極の３電極式の例を示しているが、作用電極と対極の２電極式であってもよい。
試薬層118は、少なくとも高分子量ポリマーとレドックスメディエータが結合した高分子量レドックスポリマーと酸化還元酵素を含み、作用電極114上に形成される。試薬層118は、例えば、高分子量レドックスポリマーとアナライト（例えばグルコース）の酸化還元酵素を含む溶液を作用電極上114に塗布・乾燥させることで形成される。なお、試薬層118には、カーボン粒子等の導電性粒子や緩衝液成分等、他の成分も含むことができる。この場合、例えば、高分子量レドックスポリマーと酸化還元酵素を含む溶液にさらに他の成分を含有させ、これを塗布・乾燥させることで試薬層118を形成することができる。高分子量レドックスポリマーは、アナライトの酸化還元酵素を高分子量ポリマー（タンパク質）としてレドックスメディエータと結合させたものであってもよい。また、高分子量レドックスポリマー（そこに含まれる高分子量ポリマーがアナライトの酸化還元酵素でないもの）は、アナライトの酸化還元酵素と架橋されたものであってもよい。これらの場合、試薬層118には、少なくとも高分子量レドックスポリマーが含まれていればよく、さらなる酸化還元酵素を別途含む必要はないことになる。
最終的に、センシング部分121を、保護膜用ポリマー含む溶液に浸漬し、乾燥させることで、センシング部分121の両面・側面及び先端部分に保護膜119を形成することができ、これをバイオセンサのプローブ11として用いることができる。
図５は、図４におけるB-B’切断線における断面図を示し、図６は、図４におけるC-C’切断線における断面図を示している。図５で示すように、表側から裏面に向けて順に（図中の矢印方向）、保護膜119、試薬層118、作用電極114、絶縁性基板111、対極117及び保護膜119となる。また、図６に示すように、表側から裏面に向けて順に（図中の矢印方向）、保護膜119、参照電極115（絶縁性レジスト膜116a）、作用電極領域112a、絶縁性基板111、対極領域112c、絶縁性レジスト膜116b及び保護膜119となる。なお、図６で示す作用電極領域112a及び対極領域112cは、その上面に絶縁性レジスト膜116a,116bを備えているため、作用電極及び対極として機能しないこととなる。
以下、実施例（合成例、比較例、評価試験等を含む。）を通じて、本開示の高分子量レドックスポリマーおよびバイオセンサの態様の一例をさらに具体的に説明する。本実施例では、本発明の実施形態として、一般式（１）～（９）で表されるフェナジン誘導体を用いているが、それら以外の一般式（Ａ１）に包含される化合物全般を用いても、同様にして本発明を実施することができると理解される。
なお、実施例中に示す、高分子量レドックスポリマーやその製造に用いられる高分子量ポリマーの一般式は、高分子量ポリマーを構成する各モノマーに由来する繰り返し単位（括弧で囲まれた構造）の全てにフェナジン誘導体が結合しているように表現されている。しかしながら、この表現は便宜上の措置であり、実際の高分子量レドックスポリマーは、製造時反応条件により、高分子量ポリマーを構成する各モノマーに由来する繰り返し単位の全てに必ずしもフェナジン誘導体が結合していなくてもよい。実施例で製造した各種の高分子量レドックスポリマーが、本開示に係る発明を実施することができるものであることは「評価試験」の結果により認められる。
［実施例１：PGA-C24-Phの製造］
フェナジン誘導体として、5-{12-[(12-アンモニオドデシル)オキシ]ドデシル}-1-メトキシフェナジン-5-イウム二硝酸塩（Ph-C24-NH3+）（東京化成工業株式会社製）を6.47 mg計り取り、エタノール500 μLに溶解した。
一方、ポリアミノ酸系ポリマーである高分子量ポリマーとして、一般式（１１ａ）で表されるポリ(L-グルタミン酸ナトリウム)（株式会社ペプチド研究所 Code 3063; M.W.>12000, 透析によるカットオフ）を11.86 mg計り取り、100 mM 2-モルホリノエタンスルホン酸 (MES)緩衝液（pH 6.0）1.5 mLに溶解した。別途、水溶性カルボジイミド (WSC）（同仁化学）を8.8 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）500 μLに溶解した。上記3つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
Figure 0007285332000030
反応溶液は、溶出バッファーとしてリン酸緩衝生理食塩水（PBS, pH7.4）を用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 10k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。上記の手順により、一般式（５ａ）で表されるポリ(L-グルタミン酸ナトリウム)にフェナジンが共有結合した高分子量レドックスポリマー（PGA-C24-Ph）を得た。
Figure 0007285332000031
得られたPGA-C24-Phの溶液を２０倍希釈し、その希釈液をマイクロプレート（greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN）及びプレートリーダー（TECAN infinite M200 PRO）を用いて386nmの吸光度を測定した。そして、PGA-C24-Phの溶液を２０倍希釈した際に、386nmの吸光度が約0.55となるように、PGA-C24-Phの溶液の濃度をPBSで調整した。386nmの吸光度で現れるピークは、フェナジン誘導体由来のピークである（フェナジン誘導体由来のピークは、概ね384～386nmに最大ピークを有している）。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
［実施例２：PLL-C11-Phの製造］
フェナジン誘導体として5-{11-[(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ]-11-オキソウンデシル}-1-メトキシフェナジン-5-イウム硝酸塩（Ph-C11-Su）（東京化成工業株式会社製）を0.70mg計り取り、100 mM 2-モルホリノエタンスルホン酸（MES）緩衝液（pH 6.0）500 μLに溶解した。一方、ポリアミノ酸系ポリマーである高分子量ポリマーとして、一般式（１１ｂ）で表されるポリ（L-リジン）塩酸塩（株式会社ペプチド研究所 Code 3075; M.W.>12000, 透析によるカットオフ）を3.34mg 計り取り、100ｍM MES緩衝液（pH6.0） 500 μLに溶解させた。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
Figure 0007285332000032
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、一般式（８ａ）で表されるポリ(L-リジン）塩酸塩にフェナジンが共有結合した高分子量レドックスポリマー（PLL-C11-Ph）を得た。
Figure 0007285332000033
得られたPLL-C11-Phの溶液を２０倍希釈し、その希釈液をマイクロプレート（greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN）及びプレートリーダー（TECAN infinite M200 PRO）を用いて386nmの吸光度を測定した。そして、PLL-C11-Phの溶液を２０倍希釈した際に、386nmの吸光度が約0.55となるように、PLL-C11-Phの溶液の濃度をPBSで調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
［実施例３：PLL-C5-Ph_1の製造］
フェナジン誘導体として、5-{[(2,5-ジオキソピリジン-1-イル)オキシ]-5-オキソペンチル}-1-メトキシフェナジニウム硝酸塩（Ph-C5-Su）（東京化成工業株式会社製）を0.6 mg計り取り、100 mM 2-モルホリノエタンスルホン酸（MES）緩衝液（pH 6.0）120 μLに溶解した。一方、高分子量ポリマーとして、実施例２と同じポリ(L-リジン)塩酸塩（株式会社ペプチド研究所 Code 3075; M.W.>12000, 透析によるカットオフ）を5 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH 6.0）1 mLに溶解した。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、一般式（８ｂ）で表されるポリ(L-リジン）塩酸塩にフェナジンが共有結合した高分子量レドックスポリマー（PLL-C5-Ph_1）を得た。
Figure 0007285332000034
得られたPLL-C5-Ph_1の溶液を２０倍希釈し、その希釈液をマイクロプレート（greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN）及びプレートリーダー（TECAN infinite M200 PRO）を用いて386nmの吸光度を測定した。そして、PLL-C5-Ph_1の溶液を２０倍希釈した際に、386nmの吸光度が約0.55となるように、PLL-C5-Ph_1の溶液の濃度をPBSで調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
［実施例４：PAA-C5-Phの製造］
フェナジン誘導体としてPh-C5-Su（東京化成工業株式会社製）を2 mg計り取り、100 mM 2-モルホリノエタンスルホン酸（MES）緩衝液（pH 6.0）500 μLに溶解した。一方、エチレン系ポリマーである高分子量ポリマーとして、一般式（１１ｃ）で表されるポリアリルアミン塩酸塩（SIGMA-ALDRICH 製品番号283215；GPC測定による重量平均分子量（ＰＥＧ換算）Mw ~17,500）を3.31 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH 6.0）500 μLに溶解した。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
Figure 0007285332000035
反応溶液は、溶出バッファーとしてリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）10mMを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 10k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、一般式（８ｃ）で表されるポリアリルアミン塩酸塩にフェナジンが共有結合した高分子量レドックスポリマー（PAA-C5-Ph）を得た。
Figure 0007285332000036
得られたPAA-C5-Phの溶液を２０倍希釈し、その希釈液をマイクロプレート（greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN）及びプレートリーダー（TECAN infinite M200 PRO）を用いて386nmの吸光度を測定した。そして、PAA-C5-Phの溶液を２０倍希釈した際に、386nmの吸光度が約0.55となるように、PAA-C5-Phの溶液の濃度をPBSで調整した。また、吸光度はリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）10mMの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
［実施例５：PEI-C5-Phの製造］
フェナジン誘導体として、5-[[(2,5-ジオキソピリジン-1-イル)オキシ]-5-オキソペンチル]-1-メトキシフェナジニウム硝酸塩（Ph-C5-Su）（東京化成工業株式会社製）を2.38 mg計り取り、100 mM 2-モルホリノエタンスルホン酸（MES）緩衝液（pH 6.0）1 mLに溶解した。一方、ポリイミン系ポリマーである高分子量ポリマーとして、一般式（１１ｄ）で表されるポリ(エチレンイミン)溶液（SIGMA-ALDRICH 製品番号181978; GPC測定による数平均分子量 Mn ~60,000、LS測定による重量平均分子量 Mw ~750,000、H 2 O中50重量%）を5mg測り取り、100 mM MES緩衝液（pH 6.0）1.5mLに溶解した。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
Figure 0007285332000037
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、一般式（８ｄ）で表されるポリエチレンイミンにフェナジンが共有結合した高分子量レドックスポリマー（PEI-C5-Ph）を得た。
Figure 0007285332000038
得られたPEI-C5-Phの溶液を２０倍希釈し、その希釈液をマイクロプレート（greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN）及びプレートリーダー（TECAN infinite M200 PRO）を用いて386nmの吸光度を測定した。そして、PEI-C5-Phの溶液を２０倍希釈した際に、386nmの吸光度が約0.55となるように、PEI-C5-Phの溶液の濃度をPBSで調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
［実施例６：PAA-DAA-C5-Phの製造］
フェナジン誘導体として、Ph-C5-Su（東京化成工業株式会社製）を0.91 mg計り取り、100 mM 2-モルホリノエタンスルホン酸（MES）緩衝液（pH 6.0）1 mLに溶解した。一方、エチレン系ポリマー（コポリマー）である高分子量ポリマーとして、一般式（１１ｅ）で表されるアリルアミン塩酸塩・ジアリルアミン塩酸塩共重合体水溶液（ニットーボーメディカル PAA-D11-HCL；重量平均分子量Mw=100,000, 濃度40%、pH (5%ゾル)=2-3, 粘度 600 mPa・s）を8.75 mg測り取り、100 mM MES緩衝液（pH 6.0） 1.5 mLに溶解した。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
Figure 0007285332000039
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、一般式（８ｅ）で表されるアリルアミン塩酸塩・ジアリルアミン塩酸塩共重合体にフェナジンが共有結合した高分子量レドックスポリマー（PAA-DAA-C5-Ph）を得た。
Figure 0007285332000040
得られたPAA-DAA-C5-Phの溶液を２０倍希釈し、その希釈液をマイクロプレート（greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN）及びプレートリーダー（TECAN infinite M200 PRO）を用いて386nmの吸光度を測定した。そして、PAA-DAA-C5-Phの溶液を２０倍希釈した際に、386nmの吸光度が約0.55となるように、PAA-DAA-C5-Phの溶液の濃度をPBSで調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
［実施例７：PAA-DADMA-C5-Phの製造］
フェナジン誘導体として、Ph-C5-Su（東京化成工業株式会社製）を2.04mg計り取り、100 mM 2-モルホリノエタンスルホン酸 (MES)緩衝液（pH 6.0）1 mLに溶解した。一方、エチレン系ポリマー（コポリマー）である高分子量ポリマーとして、一般式（１１ｆ）で表されるアリルアミン・ジアリルジメチルアンモニウムクロリド共重合体水溶液（ニットーボーメディカル PAA-1123；重量平均分子量Mw=18,000, 濃度15%、pH (5%ゾル)=11, 粘度 14 mPa・s）を6.88mg測り取り、100 mM MES緩衝液（pH 6.0）1.5mLに溶解した。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
Figure 0007285332000041
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 10k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、一般式（８ｆ）で表されるアリルアミンジアリルジメチルアンモニウムクロリド共重合にフェナジンが共有結合した高分子量レドックスポリマー（PAA-DADMA-C5-Ph）を得た。
Figure 0007285332000042
得られたPAA-DADMA-C5-Phの溶液を２０倍希釈し、その希釈液をマイクロプレート（greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN）及びプレートリーダー（TECAN infinite M200 PRO）を用いて386nmの吸光度を測定した。そして、PAA-DADMA-C5-Phの溶液を２０倍希釈した際に、386nmの吸光度が約0.55となるように、PAA-DADMA-C5-Phの溶液の濃度をPBSで調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
［実施例８：BSA-C5-Phの製造］
フェナジン誘導体として、Ph-C5-Su（東京化成工業株式会社製）を0.43 mg計り取り、100 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）緩衝液（pH 7.0）300 μLに溶解した。一方、タンパク質である高分子量ポリマーとして、ウシ血清アルブミン（BSA）（ナカライテスク商品コード01860-65；一般グレードpH7.0）を0.6 mg 計り取り、100ｍM HEPES緩衝液（pH7.0）200 μLに溶解させた。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD MiniTrap G-25（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、高分子量レドックスポリマーとして、BSA中のアミノ基にフェナジンが共有結合したタンパク質（BSA-C5-Ph）を得た。
得られたBSA-C5-Phの溶液を２０倍希釈し、その希釈液をマイクロプレート（greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN）及びプレートリーダー（TECAN infinite M200 PRO）を用いて386nmの吸光度を測定した。そして、BSA-C5-Phの溶液を２０倍希釈した際に、386nmの吸光度が約0.55となるように、BSA-C5-Phの溶液の濃度をPBSで調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
［実施例９：GDH-C5-Phの製造］
フェナジン誘導体として、Ph-C5-Su（東京化成工業株式会社製）を0.86 mg計り取り、100 mM HEPES緩衝液（pH 7.0）300 μLに溶解した。一方、タンパク質である高分子量ポリマーとして、アスペルギス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-依存性）(BBI International GDH GLD1)を1.37 mg 計り取り、100ｍM HEPES緩衝液（pH7.0）200 μLに溶解させた。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD MiniTrap G-25（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、高分子量レドックスポリマーとして、グルコースデヒドロゲナーゼにフェナジンが共有結合したタンパク質（GDH-C5-Ph）を得た。
得られたGDH-C5-Phの溶液を２０倍希釈し、その希釈液をマイクロプレート（greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN）及びプレートリーダー（TECAN infinite M200 PRO）を用いて386nmの吸光度を測定した。そして、GDH-C5-Phの溶液を２０倍希釈した際に、386nmの吸光度が約0.55となるように、GDH-C5-Phの溶液の濃度をPBSで調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
［実施例１０：GDH-C22-Phの製造］
フェナジン誘導体として、5-{11-[11-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イルオキシ)-11-オキソウンデシルアミノ]-11-オキソウンデシル}-1-メトキシフェナジン-5-イウム硝酸塩（Ph-C22-Su）（東京化成工業株式会社製）を2.78mg計り取り、エタノール500 μLに溶解した。一方、タンパク質である高分子量ポリマーとして、グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-依存性）(BBI International GDH GLD1)を15mg 計り取り、100ｍM HEPES緩衝液（pH7.0）2mLに溶解させた。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、高分子量レドックスポリマーとして、グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ基にフェナジンが共有結合したタンパク質（GDH-C22-Ph）を得た。
得られたGDH-C22-Phの溶液を２０倍希釈し、その希釈液をマイクロプレート（greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN）及びプレートリーダー（TECAN infinite M200 PRO）を用いて386nmの吸光度を測定した。そして、GDH-C22-Phの溶液を２０倍希釈した際に、386nmの吸光度が約0.55となるように、GDH-C22-Phの溶液の濃度をPBSで調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
［実施例１１：PLL-C5-Ph_2の製造］
フェナジン誘導体として、Ph-C5-Su（東京化成工業株式会社製）を2mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）500 μLに溶解した。一方、ポリアミノ酸系ポリマーである高分子量ポリマーとして、ポリ(L-リジン)塩酸塩（株式会社ペプチド研究所 Code 3075; M.W.>12000, 透析によるカットオフ）を11.33mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）500 μLに溶解した。上記の２つの溶液を混合し、４時間、室温にて攪拌させながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、一般式（８ｇ）で表されるポリ(L-リジン)塩酸塩にフェナジンが共有結合した高分子量レドックスポリマー（PLL-C5-Ph_2）を得た。
Figure 0007285332000043
得られたPLL-C5-Ph_2の溶液は、マイクロプレート（greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN）及びプレートリーダー（TECAN infinite M200 PRO）により測定しながら、PBSで386nmの吸光度を0.52～0.57の範囲に調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
［実施例１２：PLL-PEG5-Ph］
5-(6-アミノヘキシル)-1-メトキシフェナジニウム硝酸塩（Ph-C6-NH2）（東京化成工業株式会社製）を2mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）300 μLに溶解した。別途、Acid-PEG5-NHSエステル (BROADPHARM)を1.8mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）300 μLに溶解した。上記の２つの溶液を混合し、約20時間、室温にて攪拌させながら反応させて、フェナジン誘導体として、一般式（１０ｆ）で表されるPEG鎖結合フェナジニウム硝酸塩を含む溶液Ａを得た。
Figure 0007285332000044
一方、ポリアミノ酸系ポリマーである高分子量ポリマーとして、ポリ(L-リジン)塩酸塩（株式会社ペプチド研究所 Code 3075; M.W.>12000, 透析によるカットオフ）を11.02 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）300 μLに溶解した。別途、水溶性カルボジイミド（WSC）（同仁化学）を4 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）100 μLに溶解した。溶液Ａに上記のポリ（L-リジン）塩酸塩、WSC溶液を順次混合し、４時間、室温で攪拌させながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、一般式（９ｂ）で表されるエチレングリコール５単位のポリエチレングリコール（PEG）鎖を付加したポリ(L-リジン)塩酸塩にフェナジンが共有結合した高分子量レドックスポリマー（PLL-PEG5-Ph）を得た。
Figure 0007285332000045
得られたPLL-PEG5-Phの溶液は、マイクロプレート（greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN）及びプレートリーダー（TECAN infinite M200 PRO）により測定しながら、PBSで386nmの吸光度を0.52～0.57の範囲に調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
［実施例１３：PLL-PEG13-Phの製造］
Ph-C6-NH2（東京化成工業株式会社製）を2mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）300 μLに溶解した。別途、Acid-PEG13-NHSエステル（BROADPHARM）を3.26mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）300 μLに溶解した。上記の２つの溶液を混合し、約20時間、室温にて攪拌させながら反応させて、フェナジン誘導体として、一般式（１０ｇ）で表されるPEG鎖結合フェナジニウム硝酸塩を含む溶液Ｂを得た。
Figure 0007285332000046
一方、ポリアミノ酸系ポリマーである高分子量ポリマーとして、ポリ(L-リジン)塩酸塩（株式会社ペプチド研究所 Code 3075; M.W.>12000, 透析によるカットオフ）を11.02 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）300 μLに溶解した。別途、水溶性カルボジイミド (WSC）（同仁化学）を4 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）100 μLに溶解した。溶液Ｂに上記のポリ(L-リジン)塩酸塩、WSC溶液を順次混合し、４時間、室温で攪拌させながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、一般式（９ｃ）で表されるエチレングリコール１３単位のポリエチレングリコール（PEG）鎖を付加したポリ（L-リジン）塩酸塩にフェナジンが共有結合した高分子量レドックスポリマー（PLL-PEG13-Ph）を得た。
Figure 0007285332000047
得られたPLL-PEG13-Phの溶液は、マイクロプレート（greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN）及びプレートリーダー（TECAN infinite M200 PRO）により測定しながら、PBSで386nmの吸光度を0.52～0.57の範囲に調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
［実施例１４：PLL-PEG25-Phの製造］
Ph-C6-NH2（東京化成工業株式会社製）を2mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）300 μLに溶解した。別途、Acid-PEG25-NHSエステル（BROADPHARM）を5.44mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）300 μLに溶解した。上記の２つの溶液を混合し、約20時間、室温にて攪拌させながら反応させて、フェナジン誘導体として、一般式（１０ｈ）で表されるPEG鎖結合フェナジニウム硝酸塩を含む溶液Ｃを得た。
Figure 0007285332000048
一方、ポリアミノ酸系ポリマーであるポリ(L-リジン)塩酸塩（株式会社ペプチド研究所 Code 3075; M.W.>12000, 透析によるカットオフ）を11.02 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）300 μLに溶解した。別途、水溶性カルボジイミド（WSC）（同仁化学）を4 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）100 μLに溶解した。溶液Ｃに上記のポリ(L-リジン)塩酸塩、WSC溶液を順次混合し、４時間、室温で攪拌させながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、一般式（９ｄ）で表されるエチレングリコール２５単位のポリエチレングリコール（PEG）鎖を付加したポリ(L-リジン)塩酸塩にフェナジンが共有結合した高分子量レドックスポリマー（PLL-PEG25-Ph）を得た。
Figure 0007285332000049
得られたPLL-PEG25-Phの溶液は、マイクロプレート（greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN）及び、プレートリーダー（TECAN infinite M200 PRO）により測定しながら、PBSで386nmの吸光度を0.52～0.57の範囲に調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
［比較例１］
Ph-C6-NH2（東京化成工業株式会社製）を0.63 mg計り取り、PBS 500 μLに溶解して、Ph-C6-NH2溶液を得た。
得られたPh-C6-NH2の溶液を２０倍希釈し、その希釈液をマイクロプレート（greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN）及びプレートリーダー（TECAN infinite M200 PRO）を用いて386nmの吸光度を測定した。そして、Ph-C6-NH2の溶液を２０倍希釈した際に、386nmの吸光度が約0.55となるように、Ph-C6-NH2の溶液の濃度をPBSで調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
Ｃ．評価試験
（１）メディエータ流出性
作用電極及び対極に金電極、参照電極にAg/AgCl（飽和塩化カリウム）（ビー・エー・エス株式会社）の三電極式でポテンショスタット（ビー・エー・エス株式会社）を用いて、掃引速度10 mV/秒にてサイクリックボルタンメトリーを行った。
作用電極上の試薬層は、下記（i）～（iii）のいずれかにより形成した。
（i）作用電極上に実施例１～７で得られた合成高分子量ポリマーが結合している各種のフェナジン誘導体結合高分子量レドックスポリマーの溶液を、それぞれ、10 μL塗布し、乾燥させた。
（ii）作用電極上にケッチェンブラック懸濁液を0.6 μL塗布し、約10分乾燥させた。その後実施例８～１０で得られたタンパク質が結合している各種のフェナジン誘導体結合タンパク質の溶液を0.6 μL塗布し、約1時間乾燥させた。
（iii）作用電極上に比較例１で得られたPh-C6-NH2溶液を10 μL塗布し、乾燥させた。
これらの電極をPBSに浸漬し、初期電位において１０秒間静止した後に電位の掃引を開始した。得られたサイクリックボルタモグラムを図７～９に示す。
比較例１の、高分子量ポリマーと結合していないフェナジン誘導体（第１’リンカーのみを有する低分子量フェナジン誘導体）Ph-C6-NH2を用いた電極では、３サイクル目に酸化ピークがほぼ消失してしまった。一方、実施例１～７で得られた、フェナジン誘導体と各種の合成高分子量ポリマーとが結合した高分子量レドックスポリマーを用いた電極では、３サイクル後でも酸化ピークが維持され、実施例８～１０で得られた、フェナジン誘導体と各種のタンパク質とが結合した高分子量レドックスポリマーを用いた電極では、５サイクル後でも酸化ピークが維持されていた。
このことは、低分子量のフェナジン誘導体は電極から流出するが、高分子量ポリマー又はタンパク質に結合することによって、電極からの流出が抑制されたことを示している。
（２）メディエータ保存安定性
実施例１１～１４で得られた高分子量レドックスポリマーにつき、合成初期及び３７℃で１日間及び３日間保管後に吸収スペクトルを測定した。測定は、各高分子量レドックスポリマー溶液100 μLをマイクロプレート（greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN）に分注し、プレートリーダー（TECAN infinite M200 PRO）により測定した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。得られた吸収スペクトルを図１１に示す。
２８０ｎｍ及び３８５ｎｍ付近の吸収ピークの変動から、PLL-C5-Ph_2（実施例１１：リンカーの主鎖を構成する原子数は１０）と比較して、PLL-PEG5-Ph（実施例１２：同原子数は３１）、PLL-PEG13-Ph（実施例１３：同原子数は５５）、PLL-PEG25-Ph（実施例１４：同原子数は９１）と、リンカー（特に一般式（３）および一般式（９）に含まれているPEG鎖）が長くなるにしたがって、吸収ピークの変化が少なくなっていることがわかる。
このことは、フェナジン部分と高分子量ポリマーとの間に位置するリンカーの距離を延長することによって、レドックスメディエータの生体内環境における熱安定性が向上することを示している。
（３）プローブ特性の測定
金電極上に以下の組成及び手順で作製したセンサのグルコース応答性及び耐久性を評価した。
＜溶液調製＞
（ａ）酵素／メディエータ溶液
グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-依存性）(BBI International GDH GLD1)、グルタルアルデヒド 20%溶液（和光純薬工業株式会社製）及び実施例１４と同様に合成したPLL-PEG25-Phの各試薬を以下表２に示す終濃度となるように混合し、約２時間反応させた。これにより、グルコースデヒドロゲナーゼとPLL-PEG2-Phが架橋結合した高分子量レドックスポリマーが得られる。
Figure 0007285332000050
（ｂ）炭素微粒子懸濁液
ケッチェンブラックEC600JD（ライオン・スペシャリティ・ケミカルズ株式会社）をMilliQ水に2mg/mLになるように懸濁させ、超音波ホモジナイザーで10分以上処理した。また、懸濁液調製後、数時間経過した場合は使用前に再度超音波ホモジナイザーで約10分処理した。
（ｃ）保護膜用ポリマー溶液
ポリ(4-ビニルピリジン)（Mw=160,000）(SIGMA-ALDRICH)［P4VP］を１０％（重量/体積）になるようにエタノールに溶解して、P4VPエタノール溶液を調製した。
＜センサ作製＞
ケッチェンブラック懸濁液を金作用電極上に0.5 μL塗布し、約5分乾燥させた。さらに塗布、乾燥を２回繰り返し、計３回ケッチェンブラック懸濁液の塗布を行った。２時間反応後の酵素／メディエータ溶液を0.5 μL塗布し、約30分乾燥させた。さらに、P4VPエタノール溶液に浸漬し、10分乾燥後に再度浸漬し、30分以上乾燥して、保護膜を形成し、センサを作製した。
＜電気化学測定＞
作用電極に上記のセンサ、対極に金電極、参照電極にAg/AgCl（飽和塩化カリウム）（ビー・エー・エス株式会社）の三電極式でポテンショスタット（ビー・エー・エス株式会社）を用いて、作製したセンサPBSに浸漬し、アンペロメトリックi-tカーブを用いた測定を行った。測定開始1000秒後から500秒ごとに、50、150、300、500 mg/dLになるようにグルコースを添加して、継続的に電流応答値を測定した。測定後はセンサを37℃のPBS中に保存し、１日保存後、３日保存後においても同様に測定した。測定結果を、それぞれ、図１２及び１３に示し、表３にまとめた。なお、図１３及び表３に示す各測定データは、図１２において、測定対象となるグルコースを添加後から次のグルコース添加直前から１０秒前、２０秒前、３０秒前、４０秒前及び５０秒前の５点の測定値の平均値である。
Figure 0007285332000051
グルコース濃度0～500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。
３７℃にて３日保存後においても、グルコース濃度0～500 mg/dLにおいて高い直線性を示し、初期の応答に比べて、電流値の減少が見られず、耐久性は良好であった。
本開示の高分子量レドックスポリマー及びそれを用いたバイオセンサは、レドックスメディエータ（フェナジン誘導体）が高分子量ポリマーに結合しているため、レドックスメディエータの保護膜外への流出をより防止又は抑制することができる。その結果、測定感度を維持しつつ、保存安定性（耐久性）を向上させることができる。
1 埋め込み型電気化学式グルコースセンサ
10 本体
11 プローブ
111 絶縁性基板
112 導電性薄膜
112a 作用電極領域
112b 参照電極領域
112c 対極領域
113 溝
114 作用電極
115 参照電極
116a,116b 絶縁性レジスト
117 対極
118 試薬層
119 保護膜
121 センシング部分
122 端子部分
2 生体

Claims (25)

  1. 一般式（Ａ１）：
    Figure 0007285332000052
     ［式中、X-は陰イオン種を示し、Lはリンカーを示し、Polyは数平均分子量が１００００以上１０００００００未満の高分子量ポリマーを示し、R1～R8は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、カルボキシル基、置換基を有していてもよいアミノ基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和の炭化水素基、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、または置換基を有していてもよいフェニル基を示す。］
    で表される高分子量レドックスポリマー。
  2. 前記高分子量レドックスポリマーが、一般式（Ｂ１）：
    Figure 0007285332000053
     ［式中、X-は陰イオン種を示し、Lはリンカーを示し、Polyは数平均分子量が１００００以上１０００００００未満の高分子量ポリマーを示し、R1は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、カルボキシル基、置換基を有していてもよいアミノ基、置換基を有していてもよい炭素数１～６の直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和の炭化水素基、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、または置換基を有していてもよいフェニル基を示す。］
    で表される、請求項１に記載の高分子量レドックスポリマー。
  3. 前記高分子量レドックスポリマーが、一般式（１）：
    Figure 0007285332000054
     ［式中、X-は陰イオン種を示し、Lはリンカーを示し、Polyは数平均分子量が１００００以上１０００００００未満の高分子量ポリマーを示す。］
    で表される、請求項１または２に記載の高分子量レドックスポリマー。
  4. 前記リンカーは、炭素原子、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子からなる群から選択される少なくとも１つの原子が、鎖状に複数結合して主鎖を構成する、請求項１～３のいずれか一項に記載の高分子量レドックスポリマー。
  5. 前記高分子量レドックスポリマーが、一般式（２）：
    Figure 0007285332000055
     ［式中、X-は陰イオン種を示し、L1は第１リンカーを示し、L2は第２リンカーを示し、Polyは数平均分子量が１００００以上１０００００００未満の高分子量ポリマーを示す。］
    で表される、請求項１～４のいずれか一項に記載の高分子量レドックスポリマー。
  6. 前記第１リンカーと前記第２リンカーとの結合は、共有結合である、請求項５に記載の高分子量レドックスポリマー。
  7. 前記第１リンカーは、ポリエチレングリコール鎖及び炭化水素鎖の少なくとも一方を含む、請求項５又は６に記載の高分子量レドックスポリマー。
  8. 前記高分子量レドックスポリマーが、一般式（３）：
    Figure 0007285332000056
     ［式中、X-は陰イオン種を示し、
    L3は存在しないか、又は-O-、-C(=O)-NH-もしくは-NH-C(=O)-であり、
    L2は前記第２リンカーを示し、
    Polyは数平均分子量が１００００以上１０００００００未満の高分子量ポリマーを示し、
    p、q及びsは、それぞれ、独立して、１～１５の整数であり、
    rは０～８０の整数である。］
    で表される高分子量レドックスポリマーである、請求項７に記載の高分子量レドックスポリマー。
  9. 前記高分子量レドックスポリマーが、一般式（４）：
    Figure 0007285332000057
     ［式中、X-は陰イオン種を示し、L2は前記第２リンカーを示し、Polyは数平均分子量が１００００以上１０００００００未満の高分子量ポリマーを示す。］
    又は、一般式（５）：
    Figure 0007285332000058
     ［式中、X-は陰イオン種を示し、L2は前記第２リンカーを示し、Polyは数平均分子量が１００００以上１０００００００未満の高分子量ポリマーを示す。］
    又は、一般式（６）：
    Figure 0007285332000059
     ［式中、X-は陰イオン種を示し、L2は前記第２リンカーを示し、Polyは数平均分子量が１００００以上１０００００００未満の高分子量ポリマーを示す。］
    又は、一般式（７）：
    Figure 0007285332000060
     ［式中、X-は陰イオン種を示し、L2は前記第２リンカーを示し、Polyは数平均分子量が１００００以上１０００００００未満の高分子量ポリマーを示す。］
    又は、一般式（８）：
    Figure 0007285332000061
     ［式中、X-は陰イオン種を示し、L2は前記第２リンカーを示し、Polyは数平均分子量が１００００以上１０００００００未満の高分子量ポリマーを示す。］
    又は、一般式（９）：
    Figure 0007285332000062
     ［式中、X-は陰イオン種を示し、L2は前記第２リンカーを示し、Polyは数平均分子量が１００００以上１０００００００未満の高分子量ポリマーを示し、ｎは１～８０までの整数を示す。］
    で表される高分子量レドックスポリマーである、請求項８に記載の高分子量レドックスポリマー。
  10. 前記高分子量ポリマーは、炭素原子、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子からなる群から選択される少なくとも１つの原子が、鎖状に複数結合して主鎖を構成している、請求項１～９のいずれか一項に記載の高分子量レドックスポリマー。
  11. 前記高分子量ポリマーは、その主鎖を構成する原子間の結合に、炭素－炭素結合、アミド結合及びエーテル結合からなる群から選択される少なくとも１つを含んでいる、請求項１０に記載の高分子量レドックスポリマー。
  12. 前記高分子量ポリマーは、ポリアミノ酸系ポリマー、ポリイミン系ポリマー、又はエチレン系ポリマーである、請求項１０又は１１に記載の高分子量レドックスポリマー。
  13. 前記高分子量ポリマーは、タンパク質、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである、請求項１０又は１１に記載の高分子量レドックスポリマー。
  14. 前記陰イオン種は、ハロゲンイオン、ハロゲンを含む化合物のイオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、酢酸イオン、炭酸水素イオン、リン酸二水素イオン、硫酸水素イオン、アルキルスルホン酸イオン、硫化水素イオン、シュウ酸水素イオン、シアン酸イオン、及びチオシアン酸イオンからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の高分子量レドックスポリマー。
  15. 前記高分子量レドックスポリマーは、親水性である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の高分子量レドックスポリマー。
  16. 複数の種類の、請求項１～１５のいずれか一項に記載の高分子量レドックスポリマーを含む、高分子量レドックスポリマー混合物。
  17. アナライトを検出又は定量するバイオセンサであって、
    作用電極、対極、前記作用電極上に配置された試薬層、及び、少なくとも前記試薬層を被覆する保護膜とを有し、
    前記試薬層は、前記アナライトを酸化又は脱水素化する酸化還元酵素と、請求項１～１５のいずれか一項に記載の高分子量レドックスポリマーまたは請求項１６に記載の高分子量レドックスポリマー混合物とを含む、バイオセンサ。
  18. 参照電極を有する、請求項１７に記載のバイオセンサ。
  19. 前記酸化還元酵素は、補酵素結合型酵素である、請求項１７または１８に記載のバイオセンサ。
  20. 前記アナライトがグルコースであって、前記酸化還元酵素がグルコース酸化酵素又はグルコース脱水素酵素である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
  21. 前記グルコース脱水素酵素は、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）結合型グルコース脱水素酵素である、請求項２０に記載のバイオセンサ。
  22. 前記グルコース脱水素酵素は、前記グルコースに対する酵素活性を１００％とした場合のマルトースに対する酵素活性が５％以下である、請求項２０又は２１に記載のバイオセンサ。
  23. 前記グルコース脱水素酵素は、前記グルコースに対する酵素活性を１００％とした場合のマルトースに対する酵素活性が３％以下である、請求項２０又は２１に記載のバイオセンサ。
  24. 前記酸化還元酵素は、前記高分子量レドックスポリマーと架橋結合されている、請求項１９～２３のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
  25. 前記保護膜は、前記保護膜外に存在するアナライトが前記保護膜内に透過可能な孔を有する、請求項１７～２４のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013164426A (ja) 2008-03-27 2013-08-22 F. Hoffmann-La Roche Ag 改善された分析物特異性を有するバイオセンサー
JP2014194411A (ja) 2013-02-28 2014-10-09 Aisin Seiki Co Ltd 修飾電極、当該修飾電極の製造方法、当該修飾電極を備えるバイオ電池並びにバイオセンサー
JP2016122519A (ja) 2014-12-24 2016-07-07 アイシン精機株式会社 修飾電極、当該修飾電極を備えるバイオ電池並びにバイオセンサー

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6187676A (ja) 1984-10-08 1986-05-06 Yatoron:Kk アルキルアンモニウム性ポリカチオン型５−アルキルフエナジニウム及びその電子伝達体としての使用方法
JP3776201B2 (ja) 1997-04-17 2006-05-17 株式会社リコー 光記録媒体
CA2391423A1 (en) 1999-11-15 2001-05-25 Therasense, Inc. Polymeric transition metal complexes and uses thereof
GB0211449D0 (en) 2002-05-17 2002-06-26 Oxford Biosensors Ltd Analyte measurement
CA2511656A1 (en) 2002-12-24 2004-07-15 Ikeda Food Research Co., Ltd. Coenzyme-binding glucose dehydrogenase
ITRM20030556A1 (it) * 2003-11-28 2005-05-29 Uni Degli Studi Di Roma To R Vergata Metodo per la determinazione quantitativa e semiquantitativa di l-fenilalanina, l-tirosina, l-3,4-diidrossifenilalanina e dei loro corrispondenti chetoacidi nei fluidi biologici e relativo kit diagnostico.
US7351770B2 (en) 2004-09-30 2008-04-01 Lifescan, Inc. Ionic hydrophilic high molecular weight redox polymers for use in enzymatic electrochemical-based sensors
JP4292486B2 (ja) 2006-03-31 2009-07-08 東洋紡績株式会社 アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ
EP2348108B1 (en) 2009-06-04 2014-02-12 Kikkoman Corporation Flavin-bound glucose dehydrogenase
CA2945612C (en) 2014-04-14 2019-09-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Phenazinium mediators
WO2018062542A1 (ja) * 2016-09-30 2018-04-05 有限会社アルティザイム・インターナショナル 電子メディエーター修飾酵素並びにそれを用いた酵素電極、分光学的分析キット及び酵素試験紙
EP3777683A1 (en) * 2018-03-30 2021-02-17 PHC Holdings Corporation Sensor using phenazine derivative or high molecular weight redox polymer containing phenazine derivative

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013164426A (ja) 2008-03-27 2013-08-22 F. Hoffmann-La Roche Ag 改善された分析物特異性を有するバイオセンサー
JP2014194411A (ja) 2013-02-28 2014-10-09 Aisin Seiki Co Ltd 修飾電極、当該修飾電極の製造方法、当該修飾電極を備えるバイオ電池並びにバイオセンサー
JP2016122519A (ja) 2014-12-24 2016-07-07 アイシン精機株式会社 修飾電極、当該修飾電極を備えるバイオ電池並びにバイオセンサー

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