JP7295708B2 - Hydrogen Peroxide Sensing Dyes, Dye Particle Complexes, and Hydrogen Peroxide Sensing Structures - Google Patents
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Description
本発明は、過酸化水素検出を目的とする染料、染料粒子複合体、および過酸化水素検出用構造体に関する。 The present invention relates to dyes, dye particle conjugates, and structures for detecting hydrogen peroxide for the purpose of detecting hydrogen peroxide.
過酸化水素の検出については、過酸化水素そのものの検出のみならず、酵素反応の生成物としての過酸化水素の検出の需要がある。 As for the detection of hydrogen peroxide, there is a demand for detecting not only hydrogen peroxide itself but also hydrogen peroxide as a product of an enzymatic reaction.
例えば、グルコース、尿酸、コレステロール、クレアチニン等の検出や定量においては、オキシダーゼなど、それぞれに特異的な酵素と反応させ、発生する過酸化水素の量から求めることができる。このような場合過酸化水素の検出、定量が必要である。 For example, in the detection and quantification of glucose, uric acid, cholesterol, creatinine, etc., they can be reacted with specific enzymes such as oxidase, and determined from the amount of hydrogen peroxide generated. In such cases, it is necessary to detect and quantify hydrogen peroxide.
過酸化水素を検出するための物質としては、オキシダーゼやペルオキシダーゼのような酵素を用いる場合と、過酸化水素の存在下で検出可能な色変化（吸収や発光）を受ける機能性色素を用いる場合、あるいはそれらの組み合わせによる場合とがある。機能性色素として代表的なものとして、４－アミノアンチピリンとフェノール系化合物またはアニリン系化合物を組み合わせた被酸化性呈色試薬、３－メチル－２－ベンゾチアゾリンヒドラゾンとアニリン系化合物の組み合わせ試薬、２，２’－アジノビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）、トリアリールメタン系色素、ベンゾジン誘導体、ｏ－トリアジン誘導体、ｏ－フェニレンジアミン等が挙げられる。この中でもトリアリールメタン系色素は、最大吸収波長が６５０ｎｍ付近にありヘモグロビンの吸収波長領域との重なりが少なく、分子吸光係数も１０５前後で非常に視認性が高いことから有用なものとして知られている（特許文献１～７）。 As a substance for detecting hydrogen peroxide, when using an enzyme such as oxidase or peroxidase, when using a functional dye that undergoes a detectable color change (absorption or light emission) in the presence of hydrogen peroxide, Or it may be due to a combination of them. Representative examples of functional dyes include an oxidizable coloring reagent combining 4-aminoantipyrine and a phenolic compound or an aniline compound, a reagent combining 3-methyl-2-benzothiazoline hydrazone and an aniline compound; , 2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), triarylmethane dyes, benzodine derivatives, o-triazine derivatives, o-phenylenediamine and the like. Among these, triarylmethane-based dyes are known to be useful because they have a maximum absorption wavelength around 650 nm, which has little overlap with the absorption wavelength region of hemoglobin, and have a molecular extinction coefficient of around 10 5 , which is very highly visible. (Patent Documents 1 to 7).
過酸化水素を検知する染料を使用したデバイスの研究は近年盛んに行われている（非特許文献１）。 Research on devices using dyes for detecting hydrogen peroxide has been actively conducted in recent years (Non-Patent Document 1).
発明者らは生体サンプル中の対象物の検出を目的とし、タンパク質（アルブミン等）夾雑物の存在下で色素を用いた過酸化水素の検出が可能か確認したところ、色素が夾雑物に吸着しデバイス表面より剥離溶出してしまうため、安定した過酸化水素の検出は困難であった。 The inventors aimed to detect an object in a biological sample, and confirmed whether hydrogen peroxide can be detected using a dye in the presence of protein (albumin, etc.) contaminants. It was difficult to stably detect hydrogen peroxide because it peeled off and eluted from the device surface.
また、公知の染料では、過酸化水素反応性が十分でなく、この点においても、安定した過酸化水素検出は困難であった。従って、安定して過酸化水素を検出するデバイスを作製するためには、より高感度のトリアリールメタン染料を何らかの形で固定化する必要があるという認識に至った。 In addition, known dyes do not have sufficient reactivity to hydrogen peroxide, which also makes it difficult to stably detect hydrogen peroxide. Therefore, in order to produce a device that stably detects hydrogen peroxide, we have come to realize that it is necessary to immobilize a more highly sensitive triarylmethane dye in some form.
一方で、上記特徴を有するトリアリールメタン系色素をポリビニルアルコールに練りこんだものが、近年テロ等に用いられる過酸化アセトン（ＴＡＰＡ）の検知に使用されることが報告されている（非特許文献２）。非特許文献２によると、過酸化水素によるトリアリールメタンの分解反応（非特許文献３）を応用し、トリアリールメタン蒸気を感知することができると報告されている。しかしながら我々の検討では、色素を単純に樹脂に練りこむだけでは、夾雑物による、染料の剥離溶出を抑制することは困難であり、仮に高感度の染料があったとしても、生体サンプル中の過酸化水素を安定して検出することは困難であった。 On the other hand, it has been reported that polyvinyl alcohol kneaded with a triarylmethane-based dye having the above characteristics is used for detecting acetone peroxide (TAPA), which is used for terrorist attacks in recent years (non-patent literature). 2). According to Non-Patent Document 2, it is reported that triarylmethane vapor can be detected by applying the decomposition reaction of triarylmethane with hydrogen peroxide (Non-Patent Document 3). However, in our study, it was difficult to suppress the separation and elution of the dye due to contaminants simply by kneading the dye into the resin. It was difficult to stably detect hydrogen oxide.
本発明は、生体サンプル中に存在する（または生体サンプル中で生成されて存在する）過酸化水素を、タンパク質等夾雑物の存在下でも安定して高感度で検出することが可能な、染料、染料粒子複合体および検出用構造体を提供する。 The present invention provides dyes that are capable of stably and highly sensitively detecting hydrogen peroxide present in a biological sample (or produced and present in a biological sample) even in the presence of contaminants such as proteins, Dye particle conjugates and sensing structures are provided.
発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、下記構造式１で表される構造を有する染料を用い、過酸化水素を有効に検出できることを見出した。
また、粒子と、前記粒子の表層に吸着した染料とを含む染料粒子複合体であって、粒子が正帯電性の粒子であり、染料が、上記構造式１の構造で表され、中心電荷が正の値であることを特徴とする、染料粒子複合体の発明に至った。 Further, a dye-particle complex containing particles and a dye adsorbed on the surface layer of the particles, wherein the particles are positively charged particles, the dye is represented by the structure of the above structural formula 1, and the central charge is The present inventors have invented a dye particle complex characterized by a positive value.
本発明により、タンパク質等夾雑物の存在下でも安定した過酸化水素検出が高感度で可能な、染料、染料粒子複合体および検出用構造体の提供が可能となった。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it has become possible to provide a dye, a dye particle complex, and a structure for detection that can stably detect hydrogen peroxide with high sensitivity even in the presence of contaminants such as proteins.
本発明は、第一の実施形態として、下記構造式１で表される構造を有する染料を提供する。
染料はさらに好ましくは、下記構造式２、３または４で表される構造を有する。
本発明の第一の実施形態に係る染料は、過酸化水素の存在下で退色するという性質を有し、過酸化水素の検出に好ましく用いられる。すなわち、本発明は、さらなる実施形態として、過酸化水素検出用染料を提供する。 The dye according to the first embodiment of the present invention has the property of fading in the presence of hydrogen peroxide, and is preferably used for detecting hydrogen peroxide. That is, the present invention provides, as a further embodiment, a dye for detecting hydrogen peroxide.
本実施形態における構造式１で表される染料の合成方法は特に限定されないが、例えば下記の合成スキームに示す公知の方法に基づいて合成することができる。
上記合成スキームでは、まず、化合物（Ａ）、化合物（Ｂ）および化合物（Ｃ）を、溶媒および縮合剤の存在下で縮合する縮合工程で化合物（Ｄ）を得た後、化合物（Ｄ）を、溶媒および酸化剤の存在下で酸化する酸化工程を経ることで、構造式５で表される化合物が得られる。ただし、化合物（Ａ）～（Ｄ）の構造式および構造式５中Ｒ１からＲ４はそれぞれ独立に水素原子または末端にベンゼン環を有してもよい炭素数が１から８の炭化水素鎖のいずれかであり、Ａ１からＡ５の少なくともいずれかはσ値が正の置換基を示す。 In the above synthesis scheme, first, compound (A), compound (B) and compound (C) are condensed in the presence of a solvent and a condensing agent to obtain compound (D) in a condensation step, and then compound (D) is obtained. , in the presence of a solvent and an oxidizing agent, the compound represented by Structural Formula 5 is obtained. However, R 1 to R 4 in the structural formulas of compounds (A) to (D) and structural formula 5 are each independently a hydrogen atom or a hydrocarbon chain having 1 to 8 carbon atoms which may have a benzene ring at the end. and at least one of A 1 to A 5 represents a substituent with a positive σ value.
初めに、上記合成スキームの縮合工程に用いる溶媒について説明する。上記縮合工程では、無溶媒で反応させることもできるが、溶媒を用いて反応することもでき、その場合溶媒は特に限定はないが、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、エチレングリコール、グリセリン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、ジメチルスルホキシド、クロロベンゼン、１，２－ジクロロベンゼン、ニトロメタン、ニトロベンゼンなどを単独または混合して用いることが好ましい。 First, the solvent used in the condensation step of the above synthetic scheme will be described. In the condensation step, the reaction can be carried out without a solvent, or can be carried out using a solvent. In that case, the solvent is not particularly limited, but examples include water, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, tert -butanol, ethylene glycol, glycerin, N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, dimethylsulfoxide, chlorobenzene, 1,2 -It is preferable to use dichlorobenzene, nitromethane, nitrobenzene, etc. singly or in combination.
上記合成スキームの縮合工程に用いる縮合剤について説明する。上記縮合工程における縮合剤としては、特に限定はないが、例えば、硫酸、塩酸、リン酸、酢酸、蟻酸、塩化アルミニウム、塩化亜鉛などを単独または混合して用いることが好ましい。 The condensing agent used in the condensation step of the above synthetic scheme will be described. The condensing agent in the condensation step is not particularly limited, but it is preferable to use, for example, sulfuric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, acetic acid, formic acid, aluminum chloride, zinc chloride, etc. singly or in combination.
構造式５において、Ｒ１とＲ３、Ｒ２とＲ４が、それぞれ同一の基である化合物を合成する場合には、上記合成スキーム中の化合物（Ｂ）と化合物（Ｃ）は同じ種類のものを使うことができる。 In structural formula 5, when synthesizing a compound in which R 1 and R 3 and R 2 and R 4 are the same group, compound (B) and compound (C) in the above synthesis scheme are of the same type. can use things.
次に、上記合成スキームの酸化工程に用いる溶媒について説明する。上記酸化工程では、無溶媒で反応させることもできるが、溶媒を用いて反応することもでき、その場合溶媒は特に限定はないが、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、エチレングリコール、グリセリン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、ジメチルスルホキシド、クロロベンゼン、１，２－ジクロロベンゼン、ニトロメタン、ニトロベンゼンなどを単独または混合して用いることが好ましい。 Next, the solvent used in the oxidation step of the above synthetic scheme will be described. In the oxidation step, the reaction can be carried out without a solvent, but the reaction can also be carried out using a solvent. In that case, the solvent is not particularly limited, but examples include water, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, tert. -butanol, ethylene glycol, glycerin, N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, dimethylsulfoxide, chlorobenzene, 1,2 -It is preferable to use dichlorobenzene, nitromethane, nitrobenzene, etc. singly or in combination.
上記合成スキームの酸化工程に用いる酸化剤について説明する。上記酸化工程における酸化剤は特に限定はなく、例えば、酸化鉛、酸化亜鉛、酸化鉄、酸化マンガン、過酸化水素、クロラニル、酸素などを単独または混合して用いることが好ましい。 The oxidizing agent used in the oxidation step of the above synthetic scheme will be described. The oxidizing agent in the oxidation step is not particularly limited, and for example, lead oxide, zinc oxide, iron oxide, manganese oxide, hydrogen peroxide, chloranil, oxygen and the like are preferably used singly or in combination.
本実施形態に係る染料の具体例として化合物（１）から化合物（５１）を以下に示す。
本発明の第一の実施形態に係る染料は過酸化水素の存在下で退色が起こる。これは、主に、非特許文献３に記載されている機構による。すなわちトリアリールメタンの中心炭素（＋）部分に過酸化水素が結合することを開始反応とし、アリール基の脱離が起きる、染料の分解による不可逆反応と考えられる。 The dye according to the first embodiment of the present invention fades in the presence of hydrogen peroxide. This is mainly due to the mechanism described in Non-Patent Document 3. That is, it is considered to be an irreversible reaction due to the decomposition of the dye, in which hydrogen peroxide binds to the central carbon (+) portion of triarylmethane as an initiation reaction and detachment of the aryl group occurs.
上記機構を有するため、本実施形態に係る染料を過酸化水素検出に用いる際、従来のトリアリールメタン系染料を用いた検知材料（ロイコ染料）とは異なり、ｐＨの変動等による色の復活等は起きえないため、ロイコ染料と比較して環境の変動を受けにくいという長所を有している。 Because of the above mechanism, when the dye according to the present embodiment is used for detecting hydrogen peroxide, unlike conventional detection materials (leuco dyes) using triarylmethane-based dyes, color restoration due to pH fluctuations, etc. Therefore, compared with leuco dyes, it has the advantage of being less susceptible to environmental fluctuations.
本発明は第二の実施形態として、粒子と、前記粒子の表層に吸着した染料とを含む染料粒子複合体であって、粒子が正帯電性の粒子であり、染料が、本発明の第一の実施形態に係る染料であることを特徴とする、染料粒子複合体を提供する。 A second embodiment of the present invention is a dye particle composite containing particles and a dye adsorbed on the surface layer of the particles, wherein the particles are positively charged particles, and the dye is the first dye of the present invention. A dye particle complex characterized by being the dye according to the embodiment of .
粒子の形状は特に問わないが、球形またはそれに類した形状の粒子が入手の容易さから好ましい。粒子の直径（粒径）は、特に限定はないが、好ましくは０．０１μｍ～１０μｍ、さらに好ましくは０．０５μｍ～０．２０μｍである。粒径が小さすぎる場合、夾雑物による剥離溶解が起きやすく、粒径が大きすぎる場合、発色性に問題を生じる場合がある。粒子は、有機、無機、有機－無機ハイブリッド材料等を挙げられる。粒子は、正帯電性のものが好ましいが、負帯電性または事実上帯電のない粒子表面を、シランカップリング剤や界面活性剤等で処理した粒子や、負帯電性の粒子をレイヤーバイレイヤー法により正帯電性とすることで、正帯電性の粒子として用いることができる。具体的には、ベンゾグアナミン・ホルムアルデヒド縮合物、ベンゾグアナミン・メラミン・ホルムアルデヒド縮合物、メラミン・ホルムアルデヒド縮合物、カチオン変性ポリアクリルアミド樹脂、カチオン変性ポリアミン樹脂、カチオン変性脂肪アミド樹脂、カチオン変性ポリアミドポリアミン樹脂、カチオン変性ポリアクリル酸エステル樹脂、カチオン変性ポリメタクリル酸エステル樹脂、ポリエチルイミン樹脂によるナノ粒子または、これら樹脂により表面修飾されたナノ粒子、Ｎ－２－（アミノエチル）－３－アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ－２－（アミノエチル）－３－アミノプロピルトリメトキシシラン、３－アミノプロピルトリメトキシシラン、３－アミノプロピルトリエトキシシラン、３－トリエトキシシリル－Ｎ－（１，３－ジメチル－ブチリデン）プロピルアミン、Ｎ－フェニル－３－アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ－（ビニルベンジル）－２－アミノエチル－３－アミノプロピルトリメトキシシランの塩酸塩等で表面処理された、シリカ、アルミナ、アパタイト等の無機粒子が挙げられるが、これら粒子に限定されるものではない。本発明の実施形態において、中心電荷とは、ＤＦＴ計算で得られる、構造式中の＋で示される位置のマリケンチャージの計算値を中心電荷とした値である。中心電荷の値は構造式中、Ａ１からＡ６で記載される置換基構造のいわゆるハメットのσ値と相関があることが、我々の鋭意検討により判明している。本発明の実施形態において、σ値とは、非特許文献４記載のσｐ＋またはσｐ－の値を参考とした値である。σ値が正である置換基構造のより好ましい例としては、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、Ｉ、ＮＯ２、ＳＯ３ －、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＦ３，ＯＣＦ３、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２（ＣＦ３）、ＳＣＦ３，ＳｅＣＦ３，ＣＮ、ＣＯＯ－，ＣＯＯＲ（Ｒは炭化水素鎖）、ＣＯＯＨ，ＳＯ３Ｈ、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＮ，Ｃ６Ｆ５，ピリジルなどが挙げられ、感度上より好ましくは、ＮＯ２、ＳＯ２ＮＨ２、ＣＦ３，ＣＮ，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲが挙げられる。Ｒは、炭素数１以上３以下の炭化水素基であることが好ましい。なかでも、σ値が正である置換基は、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、及びＣＮからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。 The shape of the particles is not particularly limited, but spherical particles or particles having a similar shape are preferred because of their easy availability. The diameter (particle size) of the particles is not particularly limited, but is preferably 0.01 μm to 10 μm, more preferably 0.05 μm to 0.20 μm. If the particle size is too small, the particles are likely to be exfoliated and dissolved due to contaminants. Particles can include organic, inorganic, organic-inorganic hybrid materials, and the like. Particles are preferably positively charged, but the layer-by-layer method can be applied to negatively charged particles or particles whose surfaces are treated with a silane coupling agent or a surfactant, etc., or negatively charged particles. By making it positively chargeable, it can be used as positively chargeable particles. Specifically, benzoguanamine-formaldehyde condensate, benzoguanamine-melamine-formaldehyde condensate, melamine-formaldehyde condensate, cation-modified polyacrylamide resin, cation-modified polyamine resin, cation-modified fatty amide resin, cation-modified polyamidepolyamine resin, cation-modified Nanoparticles of polyacrylate resin, cation-modified polymethacrylate resin, polyethylimine resin, or nanoparticles surface-modified with these resins, N-2-(aminoethyl)-3-aminopropylmethyldimethoxysilane, N-2-(aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane, 3-aminopropyltrimethoxysilane, 3-aminopropyltriethoxysilane, 3-triethoxysilyl-N-(1,3-dimethyl-butylidene) Silica, alumina, apatite, etc. surface-treated with propylamine, N-phenyl-3-aminopropyltrimethoxysilane, hydrochloride of N-(vinylbenzyl)-2-aminoethyl-3-aminopropyltrimethoxysilane, etc. inorganic particles, but is not limited to these particles. In the embodiment of the present invention, the central charge is a value whose central charge is the calculated value of the Mulliken charge at the position indicated by + in the structural formula, which is obtained by DFT calculation. Our extensive research has revealed that the value of the central charge has a correlation with the so-called Hammett's σ value of the substituent structures represented by A 1 to A 6 in the structural formula. In the embodiment of the present invention, the σ value refers to the value of σp+ or σp− described in Non-Patent Document 4 as a reference. More preferred examples of substituent structures with positive σ values include Br, Cl, F, I, NO 2 , SO 3 − , B(OH) 2 , CF 3 , OCF 3 , SO 2 NH 2 , SO 2 (CF 3 ), SCF 3 , SeCF 3 , CN, COO − , COOR (R is a hydrocarbon chain), COOH, SO 3 H, CF 2 CF 3 , CH 2 CN, C 6 F 5 , pyridyl and the like. , NO 2 , SO 2 NH 2 , CF 3 , CN, COOH and COOR are more preferable in terms of sensitivity. R is preferably a hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms. Among them, the substituent having a positive σ value is preferably at least one selected from the group consisting of COOH, COOCH 3 and CN.
本実施形態における染料粒子複合体は、粒子表面に染料をイオン性結合で吸着するため、粒子から染料が脱離しづらい。 Since the dye-particle complex of the present embodiment adsorbs the dye on the particle surface through ionic bonding, the dye is less likely to detach from the particles.
本実施形態における染料粒子複合体は、正帯電性の粒子表面に対して、イオン性置換基を有する、本発明の実施形態に係る染料を吸着させることにより製造できる。具体的には、水性溶剤中に正帯電性の粒子を超音波分散機等で分散し、得られる分散液と、水性溶剤に溶解した染料水溶液を混合する。１０分間ほど撹拌した後、遠心分離機等で固液分離を行い、必要に応じて水洗することで、目的とする染料が表面に吸着した染料粒子複合体が形成される。 The dye-particle complex in this embodiment can be produced by adsorbing the dye according to the embodiment of the invention having an ionic substituent on the surface of positively charged particles. Specifically, positively charged particles are dispersed in an aqueous solvent using an ultrasonic disperser or the like, and the resulting dispersion is mixed with an aqueous dye solution dissolved in the aqueous solvent. After stirring for about 10 minutes, solid-liquid separation is performed using a centrifuge or the like, and if necessary, washing with water forms a dye particle composite having the desired dye adsorbed on the surface.
本実施形態に係る染料粒子複合体は、目視で識別できる色を有するが、過酸化水素存在下では脱色が起こるため、過酸化水素の検出に好ましく用いられる。 The dye particle complex according to the present embodiment has a visually discernable color, but decolorizes in the presence of hydrogen peroxide, so it is preferably used for detecting hydrogen peroxide.
また、本実施形態に係る染料粒子複合体は、過酸化水素検出に用いる際、染料単独で用いるよりも、感度が高く、また、夾雑物の影響も受けにくい。また、染料粒子複合体自体に重量があるため、染料単独で用いるよりも、基材に定着させやすい。 In addition, when the dye particle complex according to the present embodiment is used for detecting hydrogen peroxide, the sensitivity is higher than when the dye is used alone, and it is less susceptible to contaminants. In addition, since the dye particle composite itself has weight, it is easier to fix to the substrate than when the dye is used alone.
また、たとえば、染料を、ＰＶＡに直接練りこむような形態をとると、過酸化水素がしみこみづらいが、本実施形態に係る染料粒子複合体は、過酸化水素と接触しやすく、感度が高い。 Further, for example, if a dye is directly kneaded into PVA, hydrogen peroxide is difficult to permeate, but the dye particle composite according to the present embodiment easily comes into contact with hydrogen peroxide and has high sensitivity.
本発明は第三の実施形態として、本発明の第二の実施形態に係る染料粒子複合体と基材とを含む、過酸化水素検出用構造体を提供する。 As a third embodiment, the present invention provides a structure for detecting hydrogen peroxide, comprising the dye particle composite according to the second embodiment of the present invention and a substrate.
本実施形態の構造体においては、基材上の感知領域に本発明の第二の実施形態に係る染料粒子複合体が含有されることが好ましい。基材とは自立した材料を意味し、過酸化酸素に対する反応性が低ければ特に材質を選ばない。しかしながら染料粒子複合体を基材上に固定することが好ましく、粘着性の接着層を有するか、セルロースまたはμファイバー等を用いた紙、フェルト、編み物、不織布、または多孔質材料が望ましく、容易に入手可能なことから紙が推奨される。 In the structure of this embodiment, it is preferable that the dye particle complex according to the second embodiment of the present invention is contained in the sensing region on the substrate. The base material means a self-supporting material, and any material can be used as long as the reactivity to oxygen peroxide is low. However, it is preferred to fix the dye particle composite on a substrate, preferably paper, felt, knitted fabric, non-woven fabric, or porous material having a tacky adhesive layer or using cellulose or μ-fibers or the like, which can be easily Paper is recommended due to availability.
本発明の第二の実施形態に係る染料粒子複合体は、本実施形態の過酸化水素検出用構造体に好ましく用いることができる。 The dye particle complex according to the second embodiment of the present invention can be preferably used in the structure for detecting hydrogen peroxide of this embodiment.
また、本実施形態の過酸化水素検出用構造体は、必要に応じて代謝物を基質として過酸化水素を発生する酵素を併用することができる。酵素を併用した場合、本質的には酵素の生成物である過酸化水素を検出する構造体であるものの、様々な検出対象を検出することが可能となる。 In addition, the structure for detecting hydrogen peroxide of the present embodiment can be used in combination with an enzyme that generates hydrogen peroxide using a metabolite as a substrate, if necessary. When used in combination with an enzyme, it is essentially a structure that detects hydrogen peroxide, which is a product of the enzyme, but it is possible to detect various detection targets.
本実施形態において併用することができる酵素として、グルコースオキシダーゼ（glucose oxidase）、ヘキソースオキシダーゼ（hexose oxidase）、コレステロールオキシダーゼ（cholesterol oxidase）、アリールアルコールオキシダーゼ（aryl-alcohol oxidase）、Ｌ－グロノラクトンオキシダーゼ（L-gulonolactone oxidase）、ガラクトースオキシダーゼ（galactose oxidase）、ピラノースオキシダーゼ（pyranose oxidase）、Ｌ－ソルボースオキシダーゼ（L-sorbose oxidase）、ピリドキシン４－オキシダーゼ（pyridoxine 4-oxidase）、アルコールオキシダーゼ（alcohol oxidase）、カテコールオキシダーゼ（catechol oxidase）、（Ｓ）－２－ヒドロキシ酸オキシダーゼ（(S)-2-hydroxy-acid oxidase）、エクジソンオキシダーゼ（ecdysone oxidase）、コリンオキシダーゼ（choline oxidase）、第二級アルコールオキシダーゼ（secondary-alcohol oxidase）、４－ヒドロキシマンデル酸オキシダーゼ（4-hydroxymandelate oxidase）、長鎖アルコールオキシダーゼ（long-chain-alcohol oxidase）、グリセロール－３－リン酸オキシダーゼ（glycerol-3-phosphate oxidase）、チアミンオキシダーゼ（thiamin oxidase）、ヒドロキシフィタン酸オキシダーゼ（hydroxyphytanate oxidase）、ヌクレオシドオキシダーゼ（nucleoside oxidase）、Ｎ－アシルヘキサソミンオキシダーゼ（N-acylhexosamine oxidase）、ポリビニルアルコールオキシダーゼ（polyvinyl-alcohol oxidase）、Ｄ－アラビノノ－１，４－ラクトンオキシダーゼ（D-arabinono-1,4-lactone oxidase）、バニリルアルコールオキシダーゼ（vanillyl-alcohol oxidase）、ヌクレオシドオキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２形成）（nucleoside oxidase (H2O2-forming)）、Ｄ－マンニトールオキシダーゼ（D-mannitol oxidase）、アルジトールオキシダーゼ（alditol oxidase）、プロソラナピロン－ＩＩオキシダーゼ（prosolanapyrone-II oxidase）、パロマミン６’－オキシダーゼ（paromamine 6'-oxidase）、６’’’－ヒドロキシネオマイシンＣオキシダーゼ（６′′′-hydroxyneomycin C oxidase）、アクラシノマイシン－Ｎオキシダーゼ（aclacinomycin-N oxidase）、５－（ヒドロキシメチル）フルフラールオキシダーゼ（5-(hydroxymethyl)furfural oxidase）、３－デオキシ－α－Ｄ－マンノ－オクツロソン酸８－オキシダーゼ（3-deoxy-α-D-manno-octulosonate 8-oxidase）、（Ｒ）－マンデロニトリルオキシダーゼ（(R)-mandelonitrile oxidase）、アルデヒドオキシダーゼ（aldehyde oxidase）、ピルビン酸オキシダーゼ（pyruvate oxidase）、シュウ酸オキシダーゼ（oxalate oxidase）、グリオキシル酸オキシダーゼ（glyoxylate oxidase）、インドール－３－アセトアルデヒドオキシダーゼ（indole-3-acetaldehyde oxidase）、ピリドキサールオキシダーゼ（pyridoxal oxidase）、アリールアルデヒドオキシダーゼ（aryl-aldehyde oxidase）、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸オキシダーゼ（4-hydroxyphenylpyruvate oxidase）、アブシシンアルデヒドオキシダーゼ（abscisic aldehyde oxidase）、（メチル）グリオキサールオキシダーゼ（(methyl)glyoxal oxidase）、コプロポルフィリノーゲンオキシダーゼ（coproporphyrinogen oxidase）、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（protoporphyrinogen oxidase）、ビリルビンオキシダーゼ（bilirubin oxidase）、アシルＣｏＡオキシダーゼ（acyl-CoA oxidase）、ジヒドロウラシルオキシダーゼ（dihydrouracil oxidase）、テトラヒドロベルベリンオキシダーゼ（tetrahydroberberine oxidase）、セコロガニンシンターゼ（secologanin synthase）、トリプトファンα，β－オキシダーゼ（tryptophan α,β-oxidase）、ピロロキノリンキノンシンターゼ（pyrroloquinoline-quinone synthase）、Ｌ－ガラクトノラクトンオキシダーゼ（L-galactonolactone oxidase）、アルボノウルシンシンターゼ（albonoursin synthase）、アクラシノマイシン－Ａオキシダーゼ（aclacinomycin-A oxidase）、コプロポルフィリノーゲンＩＩＩオキシダーゼ（コプロポルフィリン形成）（coproporphyrinogen III oxidase (coproporphyrin-forming)）、Ｄ－アスパラギン酸オキシダーゼ（D-aspartate oxidase）、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（L-amino-acid oxidase）、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（D-amino-acid oxidase）、アミンオキシダーゼピロドキサール５’－リン酸シンターゼ（amine oxidase、pyridoxal 5'-phosphate synthase）、Ｄ－グルタミン酸オキシダーゼ（D-glutamate oxidase）、エタノールアミンオキシダーゼ（ethanolamine oxidase）、プトレシンオキシダーゼ（putrescine oxidase）、Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼ（L-glutamate oxidase）、シクロヘキシルアミンオキシダーゼ（cyclohexylamine oxidase）、タンパク質－リジン６－オキシダーゼ（protein-lysine 6-oxidase）、Ｌ－リジンオキシダーゼ（L-lysine oxidase）、Ｄ－グルタミン酸（Ｄ－アスパラギン酸）オキシダーゼ（D-glutamate(D-aspartate) oxidase）、Ｌ－アスパラギン酸オキシダーゼ（L-aspartate oxidase）、グリシンオキシダーゼ（glycine oxidase）、Ｌ－リジン６－オキシダーゼ（L-lysine 6-oxidase）、第一級アミンオキシダーゼ（primary-amine oxidase）、ジアミンオキシダーゼ（diamine oxidase）、７－クロロ－Ｌ－トリプトファンオキシダーゼ（7-chloro-L-tryptophan oxidase）、プソイドオキシニコチンオキシダーゼ（pseudooxynicotine oxidase）、Ｌ－アルギニンオキシダーゼ（L-arginine oxidase）、サルコシンオキシダーゼ（sarcosine oxidase）、Ｎ－メチル－Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（N-methyl-L-amino-acid oxidase）、Ｎ６－メチル－リジンオキシダーゼ（N6-methyl-lysine oxidase）、（Ｓ）－６－ヒドロキシニコチンオキシダーゼ（(S)-6-hydroxynicotine oxidase）、（Ｒ）－６－ヒドロキシニコチンオキシダーゼ（(R)-6-hydroxynicotine oxidase）、Ｌ－ピペコリン酸オキシダーゼ（L-pipecolate oxidase）、ジメチルグリシンオキシダーゼ（dimethylglycine oxidase）、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ（dihydrobenzophenanthridine oxidase）、Ｎ１－アセチルポリアミンオキシダーゼ（N1-acetylpolyamine oxidase）、ポリアミンオキシダーゼ（プロパン－１，３－ジアミン形成）（polyamine oxidase (propane-1,3-diamine-forming)）、Ｎ８－アセチルスペルミジンオキシダーゼ（プロパン－１，３－ジアミン形成）（N8-acetylspermidine oxidase (propane-1,3-diamine -forming)）、スペルミンオキシダーゼ（spermine oxidase）、非特異的ポリアミンオキシダーゼ（non-specific polyamine oxidase）、Ｌ－サッカロピンオキシダーゼ（L-saccharopine oxidase）、４－メチルアミノブタン酸オキシダーゼ（ホルムアルデヒド形成）（4-methylaminobutanoate oxidase (formaldehyde-forming)）、Ｎ－アルキルグリシンオキシダーゼ（N-alkylglycine oxidase）、４－メチルアミノブタン酸オキシダーゼ（メチルアミン形成）（4-methylaminobutanoate oxidase (methylamine-forming)）、コエンザイムＦ４２０Ｈ２オキシダーゼ（coenzyme F420H2 oxidase）、グリホサートオキシドレダクターゼ（glyphosate oxidoreductase）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２形成）NAD(P)H oxidase (H2O2-forming)、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ（Ｈ２Ｏ形成）（NAD(P)H oxidase (H2O-forming)）、ＮＡＤＨオキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２形成）（NADH oxidase (H2O2-forming)）、ＮＡＤＨオキシダーゼ（Ｈ２Ｏ形成）（NADH oxidase (H2O-forming)）、レナラーゼ（renalase）、ニトロアルカンオキシダーゼ（nitroalkane oxidase）、アセチルインドキシルオキシダーゼ（acetylindoxyl oxidase）、因子非依存性尿酸ヒドロキシラーゼ（factor-independent urate hydroxylase）、３－ａｃｉ－ニトロプロパン酸オキシダーゼ（3-aci-nitropropanoate oxidase）、ヒドロキシルアミンオキシダーゼ（シトクロム）（hydroxylamine oxidase (cytochrome)）、亜硫酸オキシダーゼ（sulfite oxidase）、チオールオキシダーゼ（thiol oxidase）、グルタチオンオキシダーゼ（glutathione oxidase）、メタンチオールオキシダーゼ（methanethiol oxidase）、プレニルシステインオキシダーゼ（prenylcysteine oxidase）、ファルネシルシステインリアーゼ（farnesylcysteine lyase）、シトクロム－ｃオキシダーゼ（cytochrome-c oxidase）、ラッカーゼ（laccase）、Ｌ－アスコルビン酸オキシダーゼ（L-ascorbate oxidase）、ｏ－アミノフェノールオキシダーゼ（o-aminophenol oxidase）、３－ヒドロキシアントラニル酸オキシダーゼ（3-hydroxyanthranilate oxidase）、リファマイシン－Ｂオキシダーゼ（rifamycin-B oxidase）、フォトシステムＩＩ（photosystem II）、ユビキノールオキシダーゼ（Ｈ＋輸送）（ubiquinol oxidase (H+-transporting)）、ユビキノールオキシダーゼ（電位不形成型）（ubiquinol oxidase (non-electrogenic)）、メナキノールオキシダーゼ（Ｈ＋輸送）（menaquinol oxidase (H+-transporting)）、カルダリエラキノールオキシダーゼ（Ｈ＋輸送）（caldariellaquinol oxidase (H+-transporting)）、ユビキノールオキシダーゼ（電位形成型、非Ｈ＋輸送）（ubiquinol oxidase (electrogenic, non H+-transporting)）、グリキサゾンシンターゼ（grixazone synthase）、ジヒドロフェナジンジカルボン酸シンターゼ（dihydrophenazinedicarboxylate synthase）、フェロキシダーゼ（ferroxidase）、細菌性非ヘムフェリチン（bacterial non-heme ferritin）、プテリジンオキシダーゼ（pteridine oxidase）、キサンチンオキシダーゼ（xanthine oxidase）、６－ヒドロキシニコチン酸デヒドロゲナーゼ（6-hydroxynicotinate dehydrogenase）、ジュグロン３－ヒドロキシラーゼ（juglone 3-hydroxylase）、イソペニシリン－Ｎシンターゼ（isopenicillin-N synthase）、コルンバミンオキシダーゼ（columbamine oxidase）、レチクリンオキシダーゼ（reticuline oxidase）、スロクリンオキシダーゼ［（＋）－ビスデクロロゲオジン形成］（sulochrin oxidase [(+)-bisdechlorogeodin-forming]）、スロクリンオキシダーゼ［（－）－ビスデクロロゲオジン形成］（sulochrin oxidase [(-)-bisdechlorogeodin-forming]）、オーロイシジンシンターゼ（aureusidin synthase）、テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ（tetrahydrocannabinolic acid synthase）、カンナビジオール酸シンターゼ（cannabidiolic acid synthase）、スーパーオキシドジスムターゼ（superoxide dismutase）、スーパーオキシドレダクターゼ（superoxide reductase）、ＮＡＤＨペルオキシダーゼ（NADH peroxidase）、ＮＡＤＰＨペルオキシダーゼ（NADPH peroxidase）、脂肪酸ペルオキシダーゼ（fatty-acid peroxidase）、シトクロム－ｃペルオキシダーゼ（cytochrome-c peroxidase）、カタラーゼ（catalase）、ペルオキシダーゼ（peroxidase）、ヨージドペルオキシダーゼ（iodide peroxidase）、グルタチオンペルオキシダーゼ（glutathione peroxidase）、クロリドペルオキシダーゼ（chloride peroxidase）、Ｌ－アスコルビン酸ペルオキシダーゼ（L-ascorbate peroxidase）、リン脂質－ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼ（phospholipid-hydroperoxide glutathione peroxidase）、マンガンペルオキシダーゼ（manganese peroxidase）、リグニンペルオキシダーゼ（lignin peroxidase）、ペルオキシレドキシン（peroxiredoxin）、万能ペルオキシダーゼ（versatile peroxidase）、グルタチオンアミド依存性ペルオキシダーゼ（glutathione amide-dependent peroxidase）、ブロミドペルオキシダーゼ（bromide peroxidase）、
色素脱色型ペルオキシダーゼ（dye decolorizing peroxidase）（Ｄｙｅ decolorizing peroxidase）、プロスタミド／プロスタグランジンＦ２αシンターゼ（prostamide/prostaglandin F2α synthase）、カタラーゼ－ペルオキシダーゼ（catalase-peroxidase）、ヒドロペルオキシ脂肪酸レダクターゼ（hydroperoxy fatty acid reductase）、（Ｓ）－２－ヒドロキシプロピルホスホン酸エポキシダーゼ（(S)-2-hydroxypropylphosphonic acid epoxidase）、フルクトシル－アミノ酸オキシダーゼ（Fructosyl-amino Acid Oxidase）、乳酸オキシダーゼ（Lactate Oxidase）、Ｌ－アルギニンオキシダーゼ（L -arginine oxidase）、Ｌ－ヒスチジンオキシダーゼ（L- histidine oxidase）、Ｌ－システインオキシダーゼ（L- cysteine oxidase）が挙げられるが、本実施形態において併用可能な酵素は上記酵素に限定されるものではない。
Enzymes that can be used in combination in this embodiment include glucose oxidase, hexose oxidase, cholesterol oxidase, aryl-alcohol oxidase, L-gulonolactone oxidase ( L-gulonolactone oxidase, galactose oxidase, pyranose oxidase, L-sorbose oxidase, pyridoxine 4-oxidase, alcohol oxidase, catechol catechol oxidase, (S)-2-hydroxy-acid oxidase, ecdysone oxidase, choline oxidase, secondary alcohol oxidase 4-hydroxymandelate oxidase, long-chain-alcohol oxidase, glycerol-3-phosphate oxidase, thiamin oxidase, hydroxyphytanate oxidase, nucleoside oxidase, N-acylhexosamine oxidase, polyvinyl-alcohol oxidase, D-arabinono-1,4 - lactone oxidase (D-arabinono-1,4-lactone oxidase), vanillyl-alcohol oxidase , nucleoside oxidase (H 2 O 2 -forming), D - D-mannitol oxidase, alditol oxidase, prosolanapyrone-II oxidase, paromamine 6'-oxidase, 6'''-hydroxy Neomycin C oxidase (6'''-hydroxyneomycin C oxidase), aclacinomycin-N oxidase, 5-(hydroxymethyl)furfural oxidase (5-(hydroxymethyl)furfural oxidase), 3-deoxy-α - D-manno-octulosonate 8-oxidase (3-deoxy-α-D-manno-octulosonate 8-oxidase), (R)-mandelonitrile oxidase (R)-mandelonitrile oxidase, aldehyde oxidase , pyruvate oxidase, oxalate oxidase, glyoxylate oxidase, indole-3-acetaldehyde oxidase, pyridoxal oxidase, arylaldehyde oxidase (aryl-aldehyde oxidase), 4-hydroxyphenylpyruvate oxidase, abscisic aldehyde oxidase, (methyl)glyoxal oxidase, coproporphyrinogen oxidase oxidase, protoporphyrinogen oxidase, bilirubin oxidase, acyl-CoA oxidase, dihydrouracil oxidase, tetrahydroberberine oxidase, secoroganin synthase secologanin synthase, tryptophan α,β-oxidase, pyrroloquinoline-quinone synthase, L-galactonolactone oxidase, albonoursin synthase), aclacinomycin-A oxidase, coproporphyrinogen III oxidase (coproporphyrin-forming), D-aspartate oxidase, L-amino-acid oxidase, D-amino-acid oxidase, amine oxidase, pyridoxal 5'-phosphate synthase, D - D-glutamate oxidase, ethanolamine oxidase, putrescine oxidase, L-glutamate oxidase, cyclohexylamine oxidase, protein-lysine 6-oxidase (protein-lysine 6-oxidase), L-lysine oxidase, D-glutamate (D-aspartate) oxidase, L-aspartate oxidase (L- aspartate oxidase, glycine oxidase, L-lysine 6-oxidase, primary-amine oxidase, diamine oxidase, 7-chloro-L - tryptophan oxidase (7-chloro-L-tryptophan oxidase), pseudooxynicotine oxidase, L-arginine oxidase, sarcosine oxidase, N-methyl-L-amino acid oxidase (N-methyl-L-amino-acid oxidase), N 6 -methyl-lysine oxidase, (S)-6-hydroxynicotine oxidase , (S)-6-hydroxynicotine oxidase, (R)-6-hydroxynicotine oxidase, L-pipecolate oxidase, dimethylglycine oxidase, dihydrobenzophenanthridine oxidase , N 1 -acetylpolyamine oxidase, polyamine oxidase (propane-1,3-diamine-forming ) , N 8 -acetylspermidine oxidase ( N 8 -acetylspermidine oxidase (propane-1,3-diamine -forming), spermine oxidase, non-specific polyamine oxidase, L- L-saccharopine oxidase, 4-methylaminobutanoate oxidase (formaldehyde-forming), N-alkylglycine oxidase, 4-methylaminobutane acid oxidase (methylamine-forming), coenzyme F 420 H 2 oxidase, glyphosate oxidoreductase , NAD(P) H oxidase (H 2O2 - forming) NAD(P)H oxidase ( H2O2 - forming ), NAD(P)H oxidase (H2O - forming), NADH oxidase (H 2 O 2 -forming) (NADH oxidase (H 2 O 2 -forming)), NADH oxidase (H 2 O-forming) (NADH oxidase (H 2 O-forming)), renalase, nitroalkane oxidase, acetylindoxyl oxidase, factor-independent urate hydroxylase, 3-aci-nitropropanoate oxidase, hydroxylamine oxidase (cytochrome) (hydroxylamine oxidase (cytochrome), sulfite oxidase, thiol oxidase, glutathione oxidase, methanethiol oxidase, prenylcysteine oxidase, farnesylcysteine lyase), cytochrome-c oxidase, laccase, L-ascorbate oxidase, o-aminophenol oxidase, 3-hydroxyanthranilate oxidase ( 3-hydroxyanthranilate oxidase, rifamycin -B oxidase, photosystem II, ubiquinol oxidase (H + -transporting ), ubiquinol oxidase (potential non-forming ubiquinol oxidase (non-electrogenic), menaquinol oxidase ( H + -transporting), caldariellaquinol oxidase (H + -transporting) , ubiquinol oxidase (electrogenic , non H + -transporting), grixazone synthase, dihydrophenazinedicarboxylate synthase, ferroxidase ), bacterial non-heme ferritin, pteridine oxidase, xanthine oxidase, 6-hydroxynicotinate dehydrogenase, juglone 3-hydroxylase -hydroxylase), isopenicillin-N synthase, columbamine oxidase, reticuline oxidase, sulocrin oxidase [(+)-bisdechlorogeozin formation] (sulochrin oxidase [ (+)-bisdechlorogeodin-forming], sulochrin oxidase [(-)-bisdechlorogeodin-forming], aureusidin synthase, tetrahydrocannabinolic acid synthase, cannabidiolic acid synthase, superoxide dismutase, superoxide reductase, NADH peroxidase, NADPH peroxidase, fatty acid peroxidase ( cytochrome-c peroxidase, catalase, peroxidase, iodide peroxidase, glutathione peroxidase, chloride peroxidase, L - ascorbate peroxidase, phospholipid-hydroperoxide glutathione peroxidase, manganese peroxidase, lignin peroxidase, peroxiredoxin, universal peroxidase ( versatile peroxidase, glutathione amide-dependent peroxidase, bromide peroxidase,
dye decolorizing peroxidase, prostamide/prostaglandin F2α synthase, catalase-peroxidase, hydroperoxy fatty acid reductase, (S)-2-hydroxypropylphosphonic acid epoxidase, fructosyl-amino acid oxidase, lactate oxidase, L-arginine oxidase (L- arginine oxidase, L-histidine oxidase, and L-cysteine oxidase, but enzymes that can be used in combination in this embodiment are not limited to the above enzymes.
＜過酸化水素の検出方法＞
生体サンプル中に含まれる過酸化水素の検出方法は、以下の工程を有する。染料粒子複合体としては、上述に記載の複合体を用いる。発色量とは、色強度または蛍光強度の信号強度のことを指す：
（１）染料粒子複合体が基材に塗布された過酸化水素検出用構造体に、生体サンプルを接触させる工程；及び
（２）構造体に前記生体サンプルを接触させた後、前記染料粒子複合体を前記基材に塗布した領域の染料粒子複合体の発色量を測定する工程。
また、生体サンプル中に含まれる過酸化水素の検出方法は、（１）、（２）の他に以下の（３）の工程を有することが好ましい：
（３）構造体に生体サンプルを接触させた後、染料粒子複合体を基材に塗布した領域から漏出した染料粒子複合体の発色量を測定する工程。
<Method for detecting hydrogen peroxide>
A method for detecting hydrogen peroxide contained in a biological sample has the following steps. As the dye particle composite, the composite described above is used. Chromogenic intensity refers to the signal intensity of color intensity or fluorescence intensity:
(1) a step of contacting a biological sample with a structure for detecting hydrogen peroxide in which a dye particle complex is applied to a substrate; and (2) contacting the biological sample with the structure, and then a step of measuring the amount of coloring of the dye particle composite in the area where the body is applied to the substrate;
Further, the method for detecting hydrogen peroxide contained in a biological sample preferably includes the following step (3) in addition to (1) and (2):
(3) A step of contacting the biological sample with the structure and then measuring the amount of coloring of the dye-particle complex leaking from the region where the dye-particle complex is applied to the base material.
＜代謝物の検出方法＞
生体サンプル中に含まれる代謝物の検出方法は、以下の工程を有する。染料粒子複合体としては、上述に記載の複合体を用いる：
（１）生体サンプルに、検出対象である代謝物を基質として過酸化水素を発生する酵素を加える工程；
（２）染料粒子複合体が基材に塗布された過酸化水素検出用構造体に、生体サンプルを接触させる工程；及び
（３）構造体に生体サンプルを接触させた後、染料粒子複合体を基材に塗布した領域の染料粒子複合体の発色量を測定する工程。
他の代謝物の検出方法は、代謝物の検出方法における（１）の工程ではなく、（１’）の工程を有する。染料粒子複合体としては、上述に記載の複合体を用いる：
（１’）基材と、染料粒子複合体と、検出対象とする代謝物を基質として過酸化水素を発生する酵素を含有する過酸化水素検出用構造体に生体サンプルを接触させる工程。
<Method for detecting metabolites>
A method for detecting metabolites contained in a biological sample has the following steps. As the dye particle conjugate, the conjugate described above is used:
(1) adding to the biological sample an enzyme that generates hydrogen peroxide using the metabolite to be detected as a substrate;
(2) a step of contacting a biological sample with a structure for detecting hydrogen peroxide in which a dye particle complex is applied to a substrate; A step of measuring the amount of coloring of the dye particle composite in the area applied to the base material.
Other metabolite detection methods have step (1′) instead of step (1) in the metabolite detection method. As the dye particle conjugate, the conjugate described above is used:
(1′) A step of contacting a biological sample with a hydrogen peroxide detection structure containing a substrate, a dye particle complex, and an enzyme that generates hydrogen peroxide using a metabolite to be detected as a substrate.
＜検出キット＞
本実施形態に係る過酸化水素検出用構造体を用いた生体サンプル中の過酸化水素または代謝物の検出キットを提供することができる。本実施形態に係る検出キットは、少なくとも染料粒子複合体が基材に固定されていればよく、染料粒子複合体が支持体上の基材に固定されていてもよい。過酸化水素を含んでいると思われる生体サンプルを構造体に直接滴下することで過酸化水素の量や濃度を測ることができる。また、生体サンプルに構造体を浸透させるための別体の容器を設けてもよい。別体の容器を設けることで、生体サンプルを構造体に対して均一に浸透させることができる。酵素及び酵素の水溶液を別体の容器内に予め内包していてもよい。その容器内に生体サンプルを添加すると同時に構造体を浸透させることもできる。また、その容器内に生体サンプルを添加し一定時間経過させて過酸化水素を発生させた後に、構造体を浸透させることもできる。
<Detection kit>
A kit for detecting hydrogen peroxide or a metabolite in a biological sample using the structure for detecting hydrogen peroxide according to this embodiment can be provided. In the detection kit according to this embodiment, at least the dye-particle complex is immobilized on the substrate, and the dye-particle complex may be immobilized on the substrate on the support. By dropping a biological sample that is suspected to contain hydrogen peroxide directly onto the structure, the amount and concentration of hydrogen peroxide can be measured. A separate container may also be provided for infiltrating the structure into the biological sample. By providing a separate container, the biological sample can be uniformly permeated into the structure. The enzyme and the aqueous solution of the enzyme may be enclosed in a separate container in advance. The structure can be infiltrated at the same time as the biological sample is added into the container. Alternatively, a biological sample may be added to the container, and after a certain period of time has elapsed to generate hydrogen peroxide, the structure may be permeated.
検出キットは、過酸化水素または代謝物の、量または濃度に応じた構造体の色（蛍光）変化をみるための、色相、明度や彩度を表した色見本を備えていてもよい。紙やプラスチック板などの別体に印刷されたものでもよい。構造体の変化後の色と色見本との比較により目視観察によって、生体サンプルに含まれる過酸化水素や代謝物の量または濃度を半定量的に判定することもできる。 The detection kit may include a color sample representing hue, brightness and saturation for observing the color (fluorescence) change of the structure according to the amount or concentration of hydrogen peroxide or metabolites. It may be printed on a separate material such as paper or a plastic plate. It is also possible to semi-quantitatively determine the amount or concentration of hydrogen peroxide or metabolites contained in the biological sample by visual observation by comparing the color after the structural change with a color sample.
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、これらの実施例によって限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the present invention is not limited by these examples as long as the gist thereof is not exceeded.
＜化合物の同定＞
下記で合成した化合物は、下記の分析手法により同定を行った。
ＬＣ／ＭＳ質量分析：ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ（ＬＣ／ＭＳＤ ＴＯＦ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）。なお、イオン化法としては、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）を利用した。
<Identification of compound>
The compounds synthesized below were identified by the following analytical methods.
LC/MS mass spectrometry: LC/TOF MS (LC/MSD TOF; manufactured by Agilent Technologies). Electrospray ionization (ESI) was used as the ionization method.
＜合成例＞
＜合成実施例１：化合物（１）の合成＞
Ｎ－エチル－Ｎ－（３－カルボキシベンジル）アニリン２．６０ｇおよびテレフタルアルデヒド酸０．７９ｇを、水１５ｍＬ中、硫酸５．０ｇの存在下において、７０℃で２４時間加熱して反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、氷１００ｇ上に排出し、クロロホルムを加えて分液して水層を抽出した。ここに酸化マンガン２．００ｇを加え、室温で２４時間撹拌した。反応液をろ過し、ろ液に２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ７．０に中和した後、塩化ナトリウムを加えて塩析し、ろ過して塩析物を回収した。塩析物をメタノール１００ｍＬに分散してろ過し、ろ液を減圧濃縮した後、カラムクロマトグラフィーにより精製することで、化合物（１）０．９６ｇを得た。得られた化合物が目的とする化合物の構造を持つことを、ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ質量分析で確認した。ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ質量分析の結果は以下のとおりであった。ｍ／ｚ＝６４２．２６３３（Ｍ＋）
<Synthesis example>
<Synthesis Example 1: Synthesis of Compound (1)>
2.60 g of N-ethyl-N-(3-carboxybenzyl)aniline and 0.79 g of terephthalaldehyde acid were reacted in 15 mL of water in the presence of 5.0 g of sulfuric acid by heating at 70° C. for 24 hours. After the reaction solution was cooled to room temperature, it was discharged onto 100 g of ice, and chloroform was added to separate the solution to extract the aqueous layer. 2.00 g of manganese oxide was added thereto and stirred at room temperature for 24 hours. The reaction solution was filtered, and the filtrate was neutralized to pH 7.0 by adding a 2 mol/L sodium hydroxide aqueous solution, and then salted out by adding sodium chloride and filtered to recover the salted out product. The salted-out product was dispersed in 100 mL of methanol and filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure and purified by column chromatography to obtain 0.96 g of compound (1). It was confirmed by LC/TOF MS mass spectrometry that the obtained compound had the structure of the target compound. The results of LC/TOF MS mass spectrometry were as follows. m/z = 642.2633 (M + )
＜合成実施例２：化合物（２）の合成＞
合成実施例１でのＮ－エチル－Ｎ－（３－カルボキシベンジル）アニリンを４－［（エチルフェニルアミノ）メチル］ベンゼンスルホン酸に換えた他は同様の方法で化合物（２）を０．８０ｇ得た。得られた化合物が目的とする化合物の構造を持つことを、ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ質量分析で確認した。ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ質量分析の結果は以下のとおりであった。ｍ／ｚ＝７１２．１８６８（Ｍ＋）
<Synthesis Example 2: Synthesis of compound (2)>
0.80 g of compound (2) was obtained in the same manner except that N-ethyl-N-(3-carboxybenzyl)aniline in Synthesis Example 1 was replaced with 4-[(ethylphenylamino)methyl]benzenesulfonic acid. Obtained. It was confirmed by LC/TOF MS mass spectrometry that the obtained compound had the structure of the target compound. The results of LC/TOF MS mass spectrometry were as follows. m/z = 712.1868 (M + )
＜合成実施例３：化合物（９）の合成＞
合成実施例１でのテレフタルアルデヒド酸をイソフタルアルデヒド酸に換えた他は同様の方法で化合物（９）を０．８５ｇ得た。得られた化合物が目的とする化合物の構造を持つことを、ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ質量分析で確認した。ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ質量分析の結果は以下のとおりであった。ｍ／ｚ＝６４２．１６２９（Ｍ＋）
<Synthesis Example 3: Synthesis of compound (9)>
0.85 g of compound (9) was obtained in the same manner except that terephthalaldehyde acid in Synthesis Example 1 was replaced with isophthalaldehyde acid. It was confirmed by LC/TOF MS mass spectrometry that the obtained compound had the structure of the target compound. The results of LC/TOF MS mass spectrometry were as follows. m/z = 642.1629 (M + )
＜合成実施例４：化合物（１０）の合成＞
合成実施例２でのテレフタルアルデヒド酸をイソフタルアルデヒド酸に換えた他は同様の方法で化合物（１０）を０．９５ｇ得た。得られた化合物が目的とする化合物の構造を持つことを、ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ質量分析で確認した。ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ質量分析の結果は以下のとおりであった。ｍ／ｚ＝７１２．１９８７（Ｍ＋）
<Synthesis Example 4: Synthesis of Compound (10)>
0.95 g of compound (10) was obtained in the same manner except that terephthalaldehyde acid in Synthesis Example 2 was replaced with isophthalaldehyde acid. It was confirmed by LC/TOF MS mass spectrometry that the obtained compound had the structure of the target compound. The results of LC/TOF MS mass spectrometry were as follows. m/z = 712.1987 (M + )
＜合成実施例５：化合物（１３）の合成＞
合成実施例２でのテレフタルアルデヒド酸をテレフタルアルデヒド酸メチルに換えた他は同様の方法で化合物（１３）を０．７５ｇ得た。得られた化合物が目的とする化合物の構造を持つことを、ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ質量分析で確認した。ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ質量分析の結果は以下のとおりであった。ｍ／ｚ＝７２６．２００７（Ｍ＋）
<Synthesis Example 5: Synthesis of Compound (13)>
0.75 g of compound (13) was obtained in the same manner except that terephthalaldehyde acid in Synthesis Example 2 was replaced with methyl terephthalaldehyde. It was confirmed by LC/TOF MS mass spectrometry that the obtained compound had the structure of the target compound. The results of LC/TOF MS mass spectrometry were as follows. m/z = 726.2007 (M + )
＜合成実施例６：化合物（４９）の合成＞
合成実施例１でのテレフタルアルデヒド酸を４－ホルミルベンゾニトリルに換えた他は同様の方法で化合物（４９）を０．８０ｇ得た。得られた化合物が目的とする化合物の構造を持つことを、ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ質量分析で確認した。ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ質量分析の結果は以下のとおりであった。ｍ／ｚ＝５６８．２１７８（Ｍ＋）
<Synthesis Example 6: Synthesis of Compound (49)>
0.80 g of compound (49) was obtained in the same manner except that terephthalaldehyde acid in Synthesis Example 1 was replaced with 4-formylbenzonitrile. It was confirmed by LC/TOF MS mass spectrometry that the obtained compound had the structure of the target compound. The results of LC/TOF MS mass spectrometry were as follows. m/z = 568.2178 (M + )
＜合成実施例７：化合物（５０）の合成＞
合成実施例１でのテレフタルアルデヒド酸を３－ホルミルベンゾニトリルに換えた他は同様の方法で化合物（５０）を０．７１ｇ得た。得られた化合物が目的とする化合物の構造を持つことを、ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ質量分析で確認した。ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ質量分析の結果は以下のとおりであった。ｍ／ｚ＝５６８．２２０２（Ｍ＋）
<Synthesis Example 7: Synthesis of Compound (50)>
0.71 g of compound (50) was obtained in the same manner except that terephthalaldehyde acid in Synthesis Example 1 was replaced with 3-formylbenzonitrile. It was confirmed by LC/TOF MS mass spectrometry that the obtained compound had the structure of the target compound. The results of LC/TOF MS mass spectrometry were as follows. m/z = 568.2202 (M + )
＜合成実施例８：化合物（５１）の合成＞
合成実施例１でのテレフタルアルデヒド酸を３－ホルミルベンゾニトリルに換えた他は同様の方法で化合物（５１）を０．６４ｇ得た。得られた化合物が目的とする化合物の構造を持つことを、ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ質量分析で確認した。ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ質量分析の結果は以下のとおりであった。ｍ／ｚ＝５６８．２１８９（Ｍ＋）
<Synthesis Example 8: Synthesis of Compound (51)>
0.64 g of compound (51) was obtained in the same manner except that terephthalaldehyde acid in Synthesis Example 1 was replaced with 3-formylbenzonitrile. It was confirmed by LC/TOF MS mass spectrometry that the obtained compound had the structure of the target compound. The results of LC/TOF MS mass spectrometry were as follows. m/z = 568.2189 (M + )
＜表面処理正帯電性粒子の作製例＞
本発明における表面処理による正帯電性粒子の作製方法を示すが、本発明はその要旨を超えない限り、これらの実施例によって限定されるものではない。
<Preparation example of surface-treated positively-chargeable particles>
A method for producing positively chargeable particles by surface treatment in the present invention will be described, but the present invention is not limited by these examples as long as the gist thereof is not exceeded.
＜表面処理正帯電性粒子の作製例１＞
シリカ粒子（スノーテックＳＴＺＬ 日産化学製）をメタノールで１０ｗ％に希釈、次いでシリカ粒子の固形分量と同量のＮ－２－（アミノエチル）－３－アミノプロピルトリメトキシシラン（ＫＢＭ－６０３ 信越シリコーン製）を滴下し、１２時間室温で撹拌を行った。撹拌終了後、メタノールを減圧除去、次いで２４時間加熱還流を行った。加熱還流終了後遠心処理、上澄み除去、イオン交換水での洗浄を行うことで目的とする表面処理正帯電粒子を作製した。
<Preparation Example 1 of Surface-Treated Positively-Chargeable Particles>
Silica particles (Snowtech STZL, manufactured by Nissan Chemical Industries) are diluted with methanol to 10 w%, and then the same amount of N-2-(aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane (KBM-603 Shin-Etsu Silicone product) was added dropwise, and the mixture was stirred at room temperature for 12 hours. After stirring was completed, methanol was removed under reduced pressure, and the mixture was heated under reflux for 24 hours. After completion of heating under reflux, centrifugation, removal of the supernatant, and washing with deionized water were carried out to prepare the desired surface-treated positively charged particles.
＜樹脂被覆正帯電性粒子の作製例２＞
シリカ粒子（スノーテックＳＴＺＬ 日産化学製）を水で１０ｗ％に希釈し、特許文献８と同様の方法で表層にポリ（ジアリールジメチルアンモニウムクロライド）（ＰＤＤＡ：シグマアルドリッチ製）を理論上１層被覆した樹脂被覆正帯電性粒子を作製した。
<Preparation Example 2 of Resin-Coated Positively-Chargeable Particles>
Silica particles (Snowtech STZL, manufactured by Nissan Chemical Industries) are diluted with water to 10% by weight, and the surface layer is theoretically coated with poly (diaryldimethylammonium chloride) (PDDA: manufactured by Sigma-Aldrich) in the same manner as in Patent Document 8. Resin-coated positively chargeable particles were produced.
＜染料粒子複合体１の調製＞
２０ｗ％の正帯電性の粒子（エポスターＳＳ 日本触媒製）の水溶液に、１ｗ％の化合物（１）分子水溶液を滴下し、その後、１０分間超音波処理（Ｗ－１３３サンパ（本多電子製））を行なった。次いで遠心処理、上澄み液除去、イオン交換水を投入し、１０分間超音波処理し、上澄み液の電子吸収スペクトルを測定した。上澄み液の電子吸収スペクトルのピークトップ高さ（ａｂｓ）が０．１以下となるまで、超音波、遠心処理の工程を繰り返すことで、染料粒子複合体１を得た。
<Preparation of dye particle composite 1>
To an aqueous solution of 20w% positively charged particles (Eposter SS, manufactured by Nippon Shokubai Co., Ltd.), 1w% compound (1) molecule aqueous solution is dropped, and then ultrasonicated for 10 minutes (W-133 Sampa (manufactured by Honda Electronics). ) was performed. Next, centrifugation was performed, the supernatant was removed, ion-exchanged water was added, ultrasonic treatment was performed for 10 minutes, and the electronic absorption spectrum of the supernatant was measured. A dye particle composite 1 was obtained by repeating the steps of ultrasonic wave and centrifugation until the peak top height (abs) of the electronic absorption spectrum of the supernatant became 0.1 or less.
＜染料粒子複合体２の調製＞
正帯電性の粒子をエポスターＳ（日本触媒製）とした以外は、染料粒子複合体１の調製と同様の方法で染料粒子複合体２を得た。
<Preparation of Dye Particle Complex 2>
A dye particle composite 2 was obtained in the same manner as the dye particle composite 1, except that Eposter S (manufactured by Nippon Shokubai Co., Ltd.) was used as the positively charged particles.
＜染料粒子複合体３の調製＞
正帯電性の粒子をエポスターＳ６（日本触媒製）とした以外は、染料粒子複合体１の調製と同様の方法で染料粒子複合体３を得た。
<Preparation of dye particle composite 3>
Dye Particle Composite 3 was obtained in the same manner as for Dye Particle Composite 1, except that Eposter S6 (Nippon Shokubai Co., Ltd.) was used as the positively charged particles.
＜染料粒子複合体４の調製＞
正帯電性の粒子をエポスターＳ１２（日本触媒製）とした以外は、染料粒子複合体１の調製と同様の方法で染料粒子複合体４を得た。
<Preparation of Dye Particle Complex 4>
A dye particle composite 4 was obtained in the same manner as the dye particle composite 1, except that Eposter S12 (manufactured by Nippon Shokubai Co., Ltd.) was used as the positively charged particles.
＜染料粒子複合体５の調製＞
正帯電性の粒子をエポスターＭＳ（日本触媒製）とした以外は、染料粒子複合体１の調製と同様の方法で染料粒子複合体５を得た。
<Preparation of Dye Particle Complex 5>
A dye particle composite 5 was obtained in the same manner as the dye particle composite 1, except that Eposter MS (manufactured by Nippon Shokubai Co., Ltd.) was used as the positively charged particles.
＜染料粒子複合体６の調製＞
正帯電性の粒子を表面処理正帯電粒子とした以外は、染料粒子複合体１の調製と同様の方法で染料粒子複合体６を得た。
<Preparation of Dye Particle Complex 6>
A dye particle composite 6 was obtained in the same manner as the dye particle composite 1, except that the positively charged particles were surface-treated positively charged particles.
＜染料粒子複合体７の調製＞
正帯電性の粒子を樹脂被覆正帯電粒子とした以外は、染料粒子複合体１の調製と同様の方法で染料粒子複合体７を得た。
<Preparation of Dye Particle Complex 7>
A dye particle composite 7 was obtained in the same manner as the dye particle composite 1, except that resin-coated positively charged particles were used as the positively charged particles.
＜染料粒子複合体８の調製＞
化合物（１）を化合物（２）とした以外は、染料粒子複合体１の調製と同様の方法で染料粒子複合体８を得た。
<Preparation of Dye Particle Complex 8>
A dye particle composite 8 was obtained in the same manner as the preparation of the dye particle composite 1, except that the compound (1) was changed to the compound (2).
＜染料粒子複合体９の調製＞
化合物（１）を化合物（９）とした以外は、染料粒子複合体１の調製と同様の方法で染料粒子複合体９を得た。
<Preparation of dye particle composite 9>
Dye Particle Complex 9 was obtained in the same manner as for Dye Particle Complex 1, except that Compound (1) was changed to Compound (9).
＜染料粒子複合体１０の調製＞
化合物（１）を化合物（１０）とした以外は、染料粒子複合体１の調製と同様の方法で染料粒子複合体１０を得た。
<Preparation of dye particle composite 10>
A dye particle composite 10 was obtained in the same manner as the preparation of the dye particle composite 1, except that the compound (1) was changed to the compound (10).
＜染料粒子複合体１１の調製＞
化合物（１）を化合物（１３）とした以外は、染料粒子複合体１の調製と同様の方法で染料粒子複合体１１を得た。
<Preparation of dye particle composite 11>
Dye-particle composite 11 was obtained in the same manner as preparation of dye-particle composite 1, except that compound (1) was changed to compound (13).
＜染料粒子複合体１２の調製＞
化合物（１）を化合物（４９）とした以外は、染料粒子複合体１の調製と同様の方法で染料粒子複合体１２を得た。
<Preparation of dye particle composite 12>
A dye-particle composite 12 was obtained in the same manner as the dye-particle composite 1, except that compound (1) was changed to compound (49).
＜染料粒子複合体１３の調製＞
化合物（１）を化合物（５０）とした以外は、染料粒子複合体１の調製と同様の方法で染料粒子複合体１３を得た。
<Preparation of Dye Particle Complex 13>
A dye particle composite 13 was obtained in the same manner as the preparation of the dye particle composite 1, except that the compound (1) was changed to the compound (50).
＜染料粒子複合体１４の調製＞
化合物（１）を化合物（５１）とした以外は、染料粒子複合体１の調製と同様の方法で染料粒子複合体１４を得た。
<Preparation of Dye Particle Complex 14>
A dye particle composite 14 was obtained in the same manner as the dye particle composite 1, except that the compound (1) was changed to the compound (51).
＜検知紙の製造方法＞
＜サンプル紙１＞
濾紙（Ａｄｖａｎｔｅｃ製）に染料粒子複合体１の水分散液（１０－４ｇ／Ｌ、１μＬ）を塗布し、乾燥させることで、サンプル紙１を得た。
<Manufacturing method of detection paper>
<Sample paper 1>
A sample paper 1 was obtained by applying an aqueous dispersion of the dye particle composite 1 (10 −4 g/L, 1 μL) to a filter paper (manufactured by Advantec) and drying it.
＜サンプル紙２～１４＞
染料粒子複合体１をそれぞれ染料粒子複合体２～１４に替える以外は、サンプル紙１と同様の方法でサンプル紙２～１４を得た。
<Sample paper 2 to 14>
Sample papers 2 to 14 were obtained in the same manner as sample paper 1, except that dye particle composite 1 was replaced with dye particle composites 2 to 14, respectively.
＜比較サンプル紙＞
濾紙（Ａｄｖａｎｔｅｃ製）に染料１（化合物（１）からなる染料）の０．５ｍＭ水溶液１ｍＬを塗布し、乾燥させることで、比較サンプル紙を得た。
<Comparison sample paper>
A filter paper (manufactured by Advantec) was coated with 1 mL of a 0.5 mM aqueous solution of Dye 1 (a dye composed of compound (1)) and dried to obtain a comparative sample paper.
［実施例１］
サンプル紙１を、５ｍＭ過酸化水素および１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含む１×リン酸緩衝生理食塩水（２００μＬ）（反応漕）に室温で２時間浸透させることで評価した。反射濃度計ＳｐｅｃｔｒｏＬｉｎｏ（Ｇｒｅｔａｇ Ｍａｃｂｅｔｈ製）にて、評価前後でのサンプル紙１の光学濃度（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ、以下ＯＤ値）を測定した。評価前のサンプル紙のＯＤ値をＯＤ０、評価後のサンプル紙のＯＤ値をＯＤ１とした。サンプル紙１を１０回作製し同様に評価を行い、１－ＯＤ１／ＯＤ０の平均値（ΔＯＤ）および、標準偏差（以下ＳＤ）を算出したところ、それぞれ０．７３と０．０３であった。
[Example 1]
Sample paper 1 was evaluated by soaking in 1× phosphate buffered saline (200 μL) containing 5 mM hydrogen peroxide and 10% (v/v) fetal bovine serum (reaction vessel) for 2 hours at room temperature. Using a reflection densitometer SpectroLino (manufactured by Gretag Macbeth), the optical density (hereinafter referred to as OD value) of the sample paper 1 was measured before and after the evaluation. The OD value of the sample paper before evaluation was OD0, and the OD value of the sample paper after evaluation was OD1. Sample paper 1 was prepared 10 times and evaluated in the same manner, and the average value (ΔOD) and standard deviation (hereinafter referred to as SD) of 1-OD1/OD0 were calculated to be 0.73 and 0.03, respectively.
［実施例２］
サンプル紙１をサンプル紙２に替えた以外は実施例１と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．５３と０．０２であった。
[Example 2]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 1, except that sample paper 1 was replaced with sample paper 2. ΔOD and SD were 0.53 and 0.02, respectively.
［実施例３］
サンプル紙１をサンプル紙３に替えた以外は実施例１と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．４２と０．０２であった。
[Example 3]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 1, except that sample paper 1 was replaced with sample paper 3. ΔOD and SD were 0.42 and 0.02, respectively.
［実施例４］
サンプル紙１をサンプル紙４に替えた以外は実施例１と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．３２と０．０３であった。
[Example 4]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 1, except that sample paper 1 was replaced with sample paper 4. ΔOD and SD were 0.32 and 0.03, respectively.
［実施例５］
サンプル紙１をサンプル紙６に替えた以外は実施例１と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．２６と０．０２であった。
[Example 5]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 1, except that sample paper 1 was replaced with sample paper 6. ΔOD and SD were 0.26 and 0.02, respectively.
［実施例６］
サンプル紙１をサンプル紙６に替えた以外は実施例１と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．７２と０．０８であった。
[Example 6]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 1, except that sample paper 1 was replaced with sample paper 6. ΔOD and SD were 0.72 and 0.08, respectively.
［実施例７］
サンプル紙１をサンプル紙７に替えた以外は実施例１と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．７５と０．１１であった。
[Example 7]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 1, except that sample paper 1 was replaced with sample paper 7. ΔOD and SD were 0.75 and 0.11, respectively.
［実施例８］
サンプル紙１をサンプル紙８に替えた以外は実施例１と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．７１と０．０３であった。
[Example 8]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 1, except that sample paper 1 was replaced with sample paper 8. ΔOD and SD were 0.71 and 0.03, respectively.
［実施例９］
サンプル紙１をサンプル紙９に替えた以外は実施例１と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．６９と０．０１であった。
[Example 9]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 1, except that sample paper 1 was replaced with sample paper 9. ΔOD and SD were 0.69 and 0.01, respectively.
［実施例１０］
サンプル紙１をサンプル紙１０に替えた以外は実施例１と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．７２と０．０１であった。
[Example 10]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 1, except that sample paper 1 was replaced with sample paper 10. ΔOD and SD were 0.72 and 0.01, respectively.
［実施例１１］
サンプル紙１をサンプル紙１１に替えた以外は実施例１と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．６３と０．０２であった。
[Example 11]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 1, except that sample paper 1 was replaced with sample paper 11. ΔOD and SD were 0.63 and 0.02, respectively.
［実施例１２］
過酸化水素濃度を０．１ｍＭに替えた以外は実施例１と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．２０と０．０７であった。
[Example 12]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 1, except that the hydrogen peroxide concentration was changed to 0.1 mM. ΔOD and SD were 0.20 and 0.07, respectively.
［実施例１３］
過酸化水素濃度を２０ｍＭに替えた以外は実施例１と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．８７と０．０２であった。
[Example 13]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 1, except that the hydrogen peroxide concentration was changed to 20 mM. ΔOD and SD were 0.87 and 0.02, respectively.
［実施例１４］
ウシ胎児血清を除いた以外は実施例１と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．７６と０．０３であった。
[Example 14]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 1, except that fetal bovine serum was omitted. ΔOD and SD were 0.76 and 0.03, respectively.
［実施例１５］
１．０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を用いた以外は実施例１と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．７５と０．０４であった。
[Example 15]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 1, except that 1.0% (v/v) fetal bovine serum was used. ΔOD and SD were 0.75 and 0.04, respectively.
［実施例１６］
９９％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を用いた以外は実施例１と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．６１と０．０９であった。
[Example 16]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 1, except that 99% (v/v) fetal bovine serum was used. ΔOD and SD were 0.61 and 0.09, respectively.
［実施例１７］
サンプル紙１をサンプル紙１２に替えた以外は実施例１と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．７０と０．０３であった。
[Example 17]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 1, except that sample paper 1 was replaced with sample paper 12. ΔOD and SD were 0.70 and 0.03, respectively.
［実施例１８］
サンプル紙１をサンプル紙１３に替えた以外は実施例１と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．５４と０．０２であった。
[Example 18]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 1, except that sample paper 1 was replaced with sample paper 13. ΔOD and SD were 0.54 and 0.02, respectively.
［実施例１９］
サンプル紙１をサンプル紙１４に替えた以外は実施例１と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．６１と０．０２であった。
[Example 19]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 1, except that sample paper 1 was replaced with sample paper 14. ΔOD and SD were 0.61 and 0.02, respectively.
［比較例１］
比較サンプル紙を用いた以外は実施例１２と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．８２と０．２３であったが、反応漕が染料１で染色されてしまう現象が観測された。
[Comparative Example 1]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 12, except that the comparative sample paper was used. Although ΔOD and SD were 0.82 and 0.23, respectively, a phenomenon that the reaction vessel was dyed with Dye 1 was observed.
［比較例２］
比較サンプル紙を用いた以外は実施例１３と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．８１と０．２２であったが、反応漕が染料１で染色されてしまう現象が観測された。
[Comparative Example 2]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 13, except that the comparative sample paper was used. ΔOD and SD were 0.81 and 0.22, respectively, but a phenomenon that the reaction vessel was dyed with Dye 1 was observed.
［比較例３］
比較サンプル紙を用いた以外は実施例１４と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．８８と０．２１であったが、反応漕が染料１で染色されてしまう現象が観測された。
[Comparative Example 3]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 14, except that the comparative sample paper was used. Although ΔOD and SD were 0.88 and 0.21, respectively, a phenomenon that the reaction vessel was dyed with Dye 1 was observed.
［比較例４］
比較サンプル紙を用いた以外は実施例１５と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．８３と０．２６であったが、反応漕が染料１で染色されてしまう現象が観測された。
[Comparative Example 4]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 15, except that the comparative sample paper was used. Although ΔOD and SD were 0.83 and 0.26, respectively, a phenomenon that the reaction vessel was dyed with Dye 1 was observed.
［比較例５］
比較サンプル紙を用いた以外は実施例１６と同様の方法で評価を行った。ΔＯＤおよびＳＤはそれぞれ０．８６と０．３３であったが、反応漕が染料１で染色されてしまう現象が観測された。
[Comparative Example 5]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 16, except that the comparative sample paper was used. Although ΔOD and SD were 0.86 and 0.33, respectively, a phenomenon that the reaction vessel was dyed with Dye 1 was observed.
評価としては、下記の基準とし、Ａ～Ｃまでを許容レベル、Ｄを許容できないレベルとした。
Ａ：ＳＤ値が０．０５未満
Ｂ：ＳＤ値が０．０５以上、０．１未満
Ｃ：ＳＤ値が０．１以上、０．２未満
Ｄ：ＳＤ値が０．２以上
The evaluation was based on the following criteria, with A to C being acceptable levels and D being unacceptable levels.
A: SD value less than 0.05 B: SD value 0.05 or more and less than 0.1 C: SD value 0.1 or more and less than 0.2 D: SD value 0.2 or more
以下に本発明の実施例で得られたサンプル紙の評価結果を表１に記載する。
Claims (23)
前記粒子が正帯電性の粒子であり、
前記染料が下記構造式１で表される構造を有することを特徴とする染料粒子複合体。
the particles are positively charged particles,
A dye particle composite, wherein the dye has a structure represented by the following structural formula 1.
染料粒子複合体が基材に塗布された過酸化水素検出用構造体に、生体サンプルを接触させる工程、および前記構造体に前記生体サンプルを接触させた後、前記染料粒子複合体を前記基材に塗布した領域の染料粒子複合体の発色量を測定する工程と、を有し、
前記染料粒子複合体が、粒子と、前記粒子の表層に吸着した染料とを含み、
前記粒子が正帯電性の粒子であり、
前記染料が下記構造式１で表される構造を有することを特徴とする過酸化水素の検出方法。
a step of contacting a biological sample with a structure for detecting hydrogen peroxide in which a dye particle complex is applied to a substrate; and measuring the amount of color development of the dye particle complex in the area applied to
The dye particle complex contains particles and a dye adsorbed on the surface of the particles,
the particles are positively charged particles,
A method for detecting hydrogen peroxide, wherein the dye has a structure represented by the following structural formula 1.
生体サンプルに、検出対象である代謝物を基質として過酸化水素を発生する酵素を加える工程と、染料粒子複合体が基材に塗布された過酸化水素検出用構造体に、前記生体サンプルを接触させる工程と、および前記構造体に前記生体サンプルを接触させた後、前記染料粒子複合体を前記基材に塗布した領域の染料粒子複合体の発色量を測定する工程と、を有し、
前記染料粒子複合体が、粒子と、前記粒子の表層に吸着した染料とを含み、
前記粒子が正帯電性の粒子であり、
前記染料が下記構造式１で表される構造を有することを特徴とする代謝物の検出方法。
a step of adding an enzyme that generates hydrogen peroxide using a metabolite to be detected as a substrate to a biological sample; and measuring the amount of coloring of the dye-particle complex in the region where the dye-particle complex is applied to the substrate after the biological sample is brought into contact with the structure,
The dye particle complex contains particles and a dye adsorbed on the surface of the particles,
the particles are positively charged particles,
A method for detecting a metabolite, wherein the dye has a structure represented by the following structural formula 1.
基材と、染料粒子複合体と、検出対象とする代謝物を基質として過酸化水素を発生する酵素を含有する過酸化水素検出用構造体に前記生体サンプルを接触させる工程と、前記構造体に前記生体サンプルを接触させた後、前記染料粒子複合体を前記基材に塗布した領域の染料粒子複合体の発色量を測定する工程と、を有し、
前記染料粒子複合体が、粒子と、該粒子の表層に吸着した染料とを含み、
前記粒子が正帯電性の粒子であり、
前記染料が下記構造式１で表される構造を有することを特徴とする代謝物の検出方法。
a step of contacting the biological sample with a hydrogen peroxide detection structure containing a substrate, a dye particle complex, and an enzyme that generates hydrogen peroxide using a metabolite to be detected as a substrate; After contacting the biological sample, measuring the amount of coloring of the dye particle complex in the area where the dye particle complex is applied to the base material,
The dye-particle complex contains particles and a dye adsorbed on the surface of the particles,
the particles are positively charged particles,
A method for detecting a metabolite, wherein the dye has a structure represented by the following structural formula 1.
前記検出キットが、基材と染料粒子複合体を含有する過酸化水素検出用構造体を含み、
前記染料粒子複合体が、粒子と、該粒子の表層に吸着した染料とを含み、
前記粒子が正帯電性の粒子であり、
前記染料が下記構造式１で表される構造を有することを特徴とする検出キット。
The detection kit includes a structure for detecting hydrogen peroxide containing a substrate and a dye particle complex,
The dye-particle complex contains particles and a dye adsorbed on the surface of the particles,
the particles are positively charged particles,
A detection kit, wherein the dye has a structure represented by the following structural formula 1.
前記検出キットが、基材と、染料粒子複合体と、検出対象とする代謝物を基質として過酸化水素を発生する酵素を含有する過酸化水素検出用構造体を含み、
前記染料粒子複合体が、粒子と、前記粒子の表層に吸着した染料とを含み、
前記粒子が正帯電性の粒子であり、
前記染料が下記構造式１で表される構造を有することを特徴とする検出キット。
The detection kit comprises a substrate, a dye particle complex, and a structure for detecting hydrogen peroxide containing an enzyme that generates hydrogen peroxide using a metabolite to be detected as a substrate,
The dye particle complex contains particles and a dye adsorbed on the surface of the particles,
the particles are positively charged particles,
A detection kit, wherein the dye has a structure represented by the following structural formula 1.
前記キットが、基材と染料粒子複合体を含有する過酸化水素検出用構造体、および前記代謝物を基質として過酸化水素を発生する酵素、又は前記酵素の水溶液が内包されている別体の容器を備え、
前記染料粒子複合体が、粒子と、前記粒子の表層に吸着した染料とを含み、
前記粒子が正帯電性の粒子であり、
前記染料が下記構造式１で表される構造を有することを特徴とする検出キット。
The kit comprises a structure for detecting hydrogen peroxide containing a substrate and a dye particle complex, an enzyme that generates hydrogen peroxide using the metabolite as a substrate, or a separate body containing an aqueous solution of the enzyme. with a container,
The dye particle complex contains particles and a dye adsorbed on the surface of the particles,
the particles are positively charged particles,
A detection kit, wherein the dye has a structure represented by the following structural formula 1.
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