JP7296136B2 - タウオパチーの治療薬または予防薬のスクリーニング方法およびタウオパチーの診断方法 - Google Patents

Description

本発明は、タウオパチーの治療薬または予防薬のスクリーニング方法およびタウオパチーの診断方法に関する。

現在、高齢化人口の増加に伴い、認知症患者の数が増えつつあり、その治療方法の確立が急務とされている。認知症とは、一旦正常に発達した高次脳機能が何らかの後天的な理由により不可逆的に低下し、日常生活や社会生活に持続的に支障を来す状態をいう。認知症の多くは、アルツハイマー病（ＡＤ）や前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）などの神経変性疾患である。神経変性疾患における認知機能の障害の程度と高い相関性がある一貫した特徴として、神経原線維変化（ＮＦＴ）が知られる（非特許文献１）。ＮＦＴの主たる構成要素は微小管結合タンパク質（ＭＡＰ）の１つであるタウタンパク質であり、タウタンパク質が過剰リン酸化を受けると、微小管結合能を失い、凝集してＮＦＴを形成する。

ＮＦＴの形成は、認知症症状と深い関連があるものと考えられている。実際に、ＡＤ患者の死後脳の解析によれば、患者の認知能力は、大脳皮質や海馬におけるＮＦＴの頻度と逆相関を示すとともに（非特許文献２）、シナプス密度とも逆相関を示すことが確認されている（非特許文献３）。一方で、条件付きでタウタンパク質を過剰発現させたモデル動物実験によれば、ＮＦＴそのものにはシナプスの抑圧／消失または神経細胞死の誘導などの強いシナプス毒性や神経毒性は無いことが明らかにされている（非特許文献４）。これらの知見から、ＮＦＴの形成過程で神経毒性が発現するものと考えられている。

これまで、ＮＦＴの形成を阻害することによるタウオパチーの治療が種々試みられており（非特許文献５）、それらは（１）タウタンパク質のリン酸化阻害、（２）タウタンパク質の重合阻害、および（３）タウ免疫療法に大別される。（１）のアプローチでは、例えばグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）などのキナーゼに対する阻害剤の使用が提案されている。しかし、タウタンパク質のリン酸化に関与するキナーゼは、タウタンパク質以外の様々なタンパク質のリン酸化にも関与しているため、それらを持続的に阻害すると副作用が生じることが問題となる。（２）のアプローチでは、メチレンブルーなどのジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合を修飾する化合物をタウタンパク質の重合阻害剤として用いる。しかし、Ｓ－Ｓ結合は種々のタンパク質における二次構造を決定するものであるため、やはり副作用が生じやすいという問題がある。さらに、Ｓ－Ｓ結合を修飾する化合物は酸化還元活性を有するため、ラジカルを生成して毒性を示す可能性も高い。（３）のアプローチでは、合成したリン酸化タウタンパク質により免疫し、抗体を生成させることにより、ＮＦＴの形成を阻害する。しかし、タウ免疫療法の効果は、変異タウタンパク質を発現するトランスジェニックマウスでしか確認されていない。また、抗体は血液脳関門の移行率が低いため（０．１～０．２％程度）、臨床において十分な効果を得にくいという問題がある。さらに、タウタンパク質には非常に多くのリン酸化部位が含まれており（非特許文献６）、どの部位のリン酸化を標的とすることがタウオパチーの治療に有効であるかは、現時点で明らかにされていない。

最近、ヒトの脳脊髄液（ＣＳＦ）中のリン酸化タウタンパク質およびタウオリゴマーの量が、ＡＤの病態の進行とともに増大することが報告された（非特許文献７）。また、動物実験において、細胞外のタウオリゴマーが、記憶や学習のメカニズムと考えられている長期増強（ＬＴＰ）の形成を障害することが報告された（非特許文献８）。これらの研究は、タウオリゴマーがシナプス毒性や神経毒性に何らかの関連を有することを示唆するが、タウオリゴマーがどのようなメカニズムにより神経毒性の発現に関与しているのかについては、依然として明らかにされていない。

Ｂｕｒｎｓ Ａ，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ Ｊ，Ａｍｅｓ Ｄ編、２００５年、Ｄｅｍｅｎｔｉａ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐｐ．４０８－４６４ Ｎｅｌｓｏｎ ＰＴ，Ｂｒｅａｋ Ｈ，Ｍａｒｋｂｅｒｙ ＷＲ，（２００９），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ＆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６８，ｐｐ．１－１４ Ｃａｌｌａｈａｎ ＬＭ，Ｃｏｌｅｍａｎ ＰＤ，（１９９５），Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ，Ｖｏｌ．１６，ｐｐ．３１１－３１４ Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｋ，Ｌｅｗｉｓ Ｊ，Ｓｐｉｒｅｓ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２００５），Ｖｏｌ．３０９，ｐｐ．ｐ４７６－４８１ Ｎｏｂｌｅ Ｗ，Ｐｏｏｌｅｒ ＡＭ，Ｈａｎｇｅｒ ＤＰ， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，（２０１１），Ｖｏｌ．６，ｐｐ．７９７－８１０ Ｓｕｎｄｅｒｍａｎｎ Ｆ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＭＰ，Ｍｏｒｇａｎ ＲＯ，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，（２０１６），Ｖｏｌ．１７，ｐ．２６４ Ｈｕ ＹＹ，Ｈｅ ＳＳ，Ｗａｎｇ Ｘ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，（２００２），Ｖｏｌ．１６０，ｐｐ．１２６９－１２７８ Ｆａ Ｍ，Ｐｕｚｚｏ Ｄ，Ｐｉａｃｅｎｔｉｎｉ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，（２０１６），Ｖｏｌ．６，１９３９３

一方、認知症における主たる症状は記憶障害である。脳生理学的には、記憶はシナプス可塑性と関連するとされる。シナプスの可塑性には多くの種類があるが、スパイクタイミング依存性可塑性（ＳＴＤＰ）が記憶や認知に関連した重要なシナプス可塑性であると考えられている（Ｓｏｎｇ Ｓ，Ｍｉｌｌｅｒ ＫＤ，Ａｂｂｏｔｔ ＬＦ，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，（２０００），Ｖｏｌ．３，ｐｐ９１９－９２６）。ＳＴＤＰは、シナプス前細胞の興奮とシナプス後細胞の興奮のタイミングに依存して誘導され、これにはＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体が深く関与していることが明らかにされている（Ｃａｐｏｒａｌｅ Ｎ，Ｄａｎ Ｙ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，（２００８），Ｖｏｌ．３１，ｐｐ．２５－４６）。

本発明は、タウオリゴマーとシナプス毒性の発現メカニズムとの関係を明らかにすることにより、これまでにない認知症の治療薬および精度の高い診断方法を提供することを目的としてなされたものである。

本発明者らは、鋭意研究の結果、タウオリゴマーがＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に結合し、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を直接的に刺激することによってシナプス毒性を引き起こすことを見出した。

すなわち、本発明は、一実施形態によれば、（１）候補化合物の存在下または非存在下でタウオリゴマーとＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体とを接触させるステップと、（２）前記タウオリゴマーの前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に対する直接的な結合を評価するステップとを含む、タウオパチーの治療薬または予防薬のスクリーニング方法を提供するものである。

また、本発明は、一実施形態によれば、（１）被験者から単離された試料とＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体とを接触させるステップと、（２）ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に直接的に結合したタウオリゴマーを定量するステップとを含む、タウオパチーの検査方法を提供するものである。

前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、生理機能を維持した状態で細胞膜またはリポソーム膜上に含まれることが好ましい。

前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、４次構造を維持した状態で細胞膜またはリポソーム膜から分離されていることが好ましい。

あるいは、前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、生理機能を維持した状態で細胞膜またはリポソーム膜上に含まれることが好ましい。

前記タウオリゴマーまたは前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、固体支持体に固定されていることが好ましい。

前記ステップ（２）は、ＥＬＩＳＡ、プロテインアレイまたは表面プラズモン共鳴分析により行われることが好ましい。

上記方法は、（３）前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を介した細胞またはリポソームへのカルシウム流入を測定するステップをさらに含むことが好ましい。

上記方法は、（４）細胞またはリポソームへの膜タンパク質の取り込みを測定するステップをさらに含むことが好ましい。

前記タウオリゴマーは、２～４０個のタウタンパク質により構成されることが好ましく、３～２０個のタウタンパク質により構成されることがより好ましい。

前記タウオリゴマーは、２Ｎ４Ｒ型アイソフォームの番号付けで、３７３番目の位置に対応するアミノ酸以降のＣ末端領域にリン酸化されたアミノ酸を含むタウタンパク質を、構成成分として含むことが好ましい。

前記タウオリゴマーは、２Ｎ４Ｒ型アイソフォームの番号付けで、４０９番目、４１２番目、４１３番目および／または４１６番目の位置に対応するセリンがリン酸化されたタウタンパク質を、構成成分として含むことが好ましい。

前記タウオパチーは、アルツハイマー病、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症、認知症を伴う多系統タウオパチー（ＭＳＴＤ）、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ－１７）、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー（ＷＭＴ－ＧＧＩ）、またはタウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－ｔａｕ）であることが好ましい。

本発明に係る方法によれば、タウオリゴマーがＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に直接的に結合し、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を刺激することによって引き起こされるシナプス毒性を低減する化合物を取得することができ、それらは、認知症の新規な治療薬または予防薬となり得るものであり、有用である。

また、被験者から単離された試料中に存在する、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に直接的に結合するタウオリゴマーを定量することにより、高い精度でタウオパチーを検出することが可能となる。

図１は、タウオリゴマーを曝露した加齢マウス脳スライス標本におけるシナプス伝達効率の低下を示す図である。 図２は、タウオリゴマーを曝露した加齢マウス脳スライス標本におけるシナプス後部のＮＭＤＡＲおよびＡＭＰＡＲの量変化を示すグラフである。 図３は、タウオリゴマーを曝露した加齢タウノックアウトマウス脳スライス標本におけるシナプス後部のＮＭＤＡＲおよびＡＭＰＡＲの量変化を示すグラフである。 図４は、タウオリゴマーを曝露した加齢タウノックアウトマウス脳スライス標本から調製された膜タンパク質画分についての、抗タウ抗体を用いたタウおよびＮＭＤＡＲの共免疫沈降の結果を示す図である。 図５は、タウオリゴマーを投与したＮＴ２－Ｎ細胞におけるＮＭＤＡＲを介したカルシウム流入を示す図である。 図６は、タウオリゴマーを投与したＮＴ２－Ｎ細胞におけるＮＭＤＡＲを介したカルシウム流入を定量解析した結果を示すグラフである。 図７は、タウオリゴマーのＮＴ２－Ｎ細胞表面への付着を確認した蛍光顕微鏡像を示す図である。 図８は、タウオリゴマーのＮＴ２－Ｎ細胞内への取り込みを計測した結果を示すグラフである。 図９は、タウノックアウトマウス脳スライス標本から調製された膜タンパク質画分とＨＴタウオリゴマーとを用いたプルダウンアッセイの結果を示す図である。 図１０は、タウノックアウトマウス脳スライス標本から精製されたＮＭＤＡＲ複合体とＨＴタウオリゴマーサンプルとを用いたファーウエスタンブロットの結果を示す図である。 図１１は、ゲルろ過されたタウオリゴマー画分６～１０のＮＭＤＡＲに対する結合能を比較したドットブロットの結果を示す図である。 図１２は、ゲルろ過されたタウオリゴマー画分６および８についてのブルーネイティブＰＡＧＥ／ウエスタンブロットの結果を示す図である。 図１３は、膜タンパク質とタウオリゴマーとの結合を検出および定量したサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す図である。 図１４は、ＮＭＤＡ受容体とタウオリゴマーとの結合を検出および定量したサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す図である。 図１５は、コナントキンＧの存在下または非存在下においてＮＭＤＡ受容体とタウオリゴマーの結合を検出および定量したサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す図である。 図１６は、タウオリゴマーの形成の時間的経過を確認したチオフラビンＴアッセイの結果を示す図である。 図１７は、タウモノマーから再構成されたタウオリゴマーと膜タンパク質との結合を検出および定量したサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。

本発明は、第一の実施形態によれば、（１）候補化合物の存在下または非存在下でタウオリゴマーとＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体とを接触させるステップと、（２）前記タウオリゴマーの前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に対する直接的な結合を評価するステップとを含む、タウオパチーの治療薬または予防薬のスクリーニング方法である。

「タウオパチー」とは、神経変性疾患のうち、神経細胞内に凝集したタウタンパク質の異常蓄積が特徴的に認められる神経変性疾患の総称である。タウオパチーとしては、以下に限定されるものではないが、例えば、アルツハイマー病、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症、認知症を伴う多系統タウオパチー（ＭＳＴＤ）、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ－１７）、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー（ＷＭＴ－ＧＧＩ）、またはタウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－ｔａｕ）などが挙げられる。

本実施形態において、「治療」とは、タウオパチーに罹患した動物において、その疾患の病態の進行および悪化を阻止または緩和することを意味し、その疾患を完全に治癒することのみならず、その疾患の諸症状を緩和することをも含む。また、「予防」とは、タウオパチーに罹患するおそれのある動物において、その罹患を未然に防ぐことを意味する。

本実施形態のスクリーニング方法では、候補化合物の存在下または非存在下でタウオリゴマーとＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体とを接触させる。

本実施形態において、「タウオリゴマー」とは、２個以上のタウタンパク質（モノマー）の重合体を意味する。本実施形態におけるタウオリゴマーは、好ましくは２～４０個、特に好ましくは３～２０個のタウにより構成される。なお、本実施形態におけるタウオリゴマーには、タウオリゴマーが互いに結合して形成されたタウ線維は含まれない。

本実施形態におけるタウオリゴマーを構成する「タウタンパク質」（本明細書では単に「タウ」とも記載する）には、ヒトタウ遺伝子から発現される６種類の野生型タウのスプライスバリアント、すなわち、０Ｎ３Ｒ型アイソフォーム、１Ｎ３Ｒ型アイソフォーム、２Ｎ３Ｒ型アイソフォーム、０Ｎ４Ｒ型アイソフォーム、１Ｎ４Ｒ型アイソフォームおよび２Ｎ４Ｒ型アイソフォームの他、これらと同等の生理機能が維持されていることを限度として、これらの変異体やホモログなどが含まれる。また、本実施形態におけるタウオリゴマーを構成するタウタンパク質は、リン酸化されていてもよいし、リン酸化されていなくてもよい。

本実施形態におけるタウオリゴマーは、リン酸化された、またはリン酸化されていない上記から選ばれる１種類または２種類以上のタウタンパク質から構成されてよい。好ましくは、本実施形態におけるタウオリゴマーは、リン酸化されたタウタンパク質を構成成分として含む。本実施形態におけるタウオリゴマーに含まれるリン酸化されたタウタンパク質の割合は、好ましくは８０％以上であり、特に好ましくは９０％以上である。また、タウタンパク質においてリン酸化されるアミノ酸は、任意の位置のアミノ酸であってよいが、好ましくは、２Ｎ４Ｒ型アイソフォームの番号付けで３７３番目の位置に対応するアミノ酸以降のＣ末端領域に含まれる１つまたは複数のアミノ酸であり、特に好ましくは、２Ｎ４Ｒ型アイソフォームの番号付けで４０９番目、４１２番目、４１３番目および／または４１６番目の位置に対応するセリンである。

本実施形態におけるタウオリゴマーは、タウタンパク質（モノマー）を重合させることにより調製することができる。タウタンパク質は生合成により調製することができ、例えば、タウタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを宿主細胞に導入してタウタンパク質を発現させることにより調製することができる。タウタンパク質を発現させる宿主細胞としては、例えば、菌、酵母、哺乳動物細胞などを使用することができ、好ましくは、ＢＬ２１やＲｏｓｅｔｔａなどの大腸菌を用いることができる。発現ベクターには、用いる宿主細胞の種類に応じて適切な発現ベクターを選択して用いることができ、例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、ｐＴ７ベクターやｐＥＴベクターなどの大腸菌発現プラスミドを用いることができ、哺乳動物細胞を宿主細胞とする場合には、ｐｃＤＮＡ３．１などの動物細胞発現プラスミドや、レトロウイルスやアデノウイルスなどのウイルスベクターなどを用いることができる。発現ベクターの宿主細胞への導入は、宿主細胞に適した周知の方法により行うことができ、例えば、エレクトロポレーションやリポフェクションなどにより行うことができる。発現させたタウタンパク質は、従来公知の手法により精製でき、例えば、カラムクロマトグラフィーなどにより精製されてよい。また、本実施形態におけるタウオリゴマーを構成するタウタンパク質は、Ｎ末端および／またはＣ末端に、６×Ｈｉｓ、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、ＨａｌｏＴａｇなどのタグや、ＧＦＰなどのマーカータンパク質が付加されたものであってもよく、この場合には、タグまたはマーカータンパク質に対する抗体を用いてタウタンパク質をアフィニティー精製することができる。

タウオリゴマーは、脳組織の抽出液にタウタンパク質を添加し、重合させることにより調製することができる。脳組織が由来する動物は任意の哺乳動物であってよく、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、非ヒト霊長類、ヒトなどであってよく、好ましくは、ヒトである。脳組織の抽出液は、脳組織を物理的に破砕する方法や、ＣＨＡＰＳなどの界面活性剤により脳組織を溶解する方法など、従来公知の方法により調製することができる。あるいは、タウオリゴマーは、脳組織の抽出液の組成に準じて調製された人工的な反応溶液にタウタンパク質を添加し、重合させることにより調製することもできる。人工的な反応溶液は、例えば、２～５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０～８．０）または２～５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．０～８．０）などの緩衝液および／または塩（例えば、１００～５００ｍＭのＮａＣｌ、０～４ｍＭのＫＣｌ、０～６ｍＭのＭｇＣｌ_２など）に、適切な成分、好ましくは、ＧＳＫ３β、ＭＡＰキナーゼ、ＣＡＭキナーゼなどのキナーゼおよびＡＴＰまたはＧＴＰなどのリン酸供与体などを混合して調製することができる。重合反応は、タウタンパク質を添加した脳組織の抽出液または人工的な反応溶液を一定時間インキュベートすればよく、例えば、３７℃で１～３日間インキュベートすればよい。

「ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体」（本明細書では「ＮＭＤＡ受容体」または「ＮＭＤＡＲ」とも記載する）とは、主に中枢神経系のシナプス前細胞および後細胞の膜上に存在し、シナプス可塑性をはじめとする種々の神経活動において重要な役割を担う、陽イオン透過性のイオンチャネル共役型受容体である。ＮＭＤＡ受容体を構成するサブユニットとしては、ＮＲ１、ＮＲ２ａ、ＮＲ２ｂ、ＮＲ２ｃ、ＮＲ２ｄ、ＮＲ３ａ、およびＮＲ３ｂが知られるが、本実施形態におけるＮＭＤＡ受容体は、上記から選ばれる１種類または２種類以上のサブユニットにより構成されたものであってもよい。好ましくは、本実施形態におけるＮＭＤＡ受容体は、ＮＲ１と、単一または複数種のＮＲ２とにより構成されたヘテロ４量体である。

本実施形態におけるＮＭＤＡ受容体は、ＮＭＤＡ受容体を発現する細胞から調製することができる。ＮＭＤＡ受容体を発現する細胞は、例えば、哺乳動物から単離された脳組織切片や神経細胞、ＮＴ２－Ｎなどの神経系の細胞株、ｉＰＳ細胞を分化させた神経細胞、ＮＭＤＡ受容体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを導入し発現させたＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ７などの細胞株などであってもよい。ＮＭＤＡ受容体は、一般的な膜受容体の精製方法にしたがって調製することができ、例えば、上記細胞の破砕液をショ糖密度勾配超遠心分離し、ＮＭＤＡ受容体を含む膜小胞画分を分取すればよい。これにより、ＮＭＤＡ受容体は、リポソーム膜上に含まれた状態で、生理機能を維持したまま精製されることができる。ここで、ＮＭＤＡ受容体が「生理機能を維持する」とは、ＮＭＤＡ受容体が、神経伝達物質依存的および／または電位依存的なイオンチャネル活性を維持していることをいう。好ましくは、ＮＭＤＡ受容体を含む膜小胞画分は、シナプトソームおよび／またはシナプトニューロソーム画分である。

さらに、本実施形態におけるＮＭＤＡ受容体は、４次構造を維持した状態で細胞膜またはリポソーム膜から分離されてもよい。ここで、ＮＭＤＡ受容体が「４次構造を維持する」とは、ＮＭＤＡ受容体が、サブユニットによって構成される全体構造を維持しており、場合により、ＰＳＤ９５などの足場タンパク質との結合をさらに維持していることをいう。ＮＭＤＡ受容体は、例えば、１％のコール酸ナトリウム、０．３８％のデオキシコール酸ナトリウム、１％のｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（ＤＤＭ）などの界面活性剤により細胞膜またはリポソーム膜を溶解することによって可溶化され、４次構造を維持した状態で分離されることができる。

タウオリゴマーとＮＭＤＡ受容体との接触は、例えば、候補化合物を添加した、または添加していないＨＥＰＥＳ緩衝人工脳脊髄液などの緩衝液中で両者を共存させ、一定時間インキュベートすることにより行うことができる。候補化合物は、特に限定されず、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、非ペプチド性化合物、合成化合物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。候補化合物の濃度は、化合物の種類により異なるが、例えば、０．０１ｎＭ～１００μＭの範囲で適宜選択することができる。タウオリゴマーおよびＮＭＤＡ受容体の濃度ならびにインキュベート時間は、採用する結合解析手法に応じて適宜決定されてよく、例えば、タウオリゴマーは、０．０１～１ｎＭの範囲であってよく、ＮＭＤＡ受容体は、０．０１～１ｎＭの範囲であってよく、インキュベートは、１０分～５時間の範囲であってよい。なお、上記のタウオリゴマーおよびＮＭＤＡ受容体の濃度は、それぞれの４次構造体を１分子として規定したものである。

次いで、タウオリゴマーとＮＭＤＡ受容体との直接的な結合を評価する。タウオリゴマーとＮＭＤＡ受容体との結合は、タンパク質間相互作用を解析するための任意の手法により評価することができ、そのような手法としては、例えば、共免疫沈降、プルダウンアッセイ、ＥＬＩＳＡ、プロテインアレイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態の方法における結合解析手法は、好ましくはＥＬＩＳＡ、プロテインアレイまたはＳＰＲであり、それぞれに適した分析システムを用いて実施することが可能である。

ここで、タウオリゴマーおよびＮＭＤＡ受容体のいずれか一方または両方は、固体支持体上に固定されてよい。固体支持体は、例えば、シリコンなどの半導体、ガラスなどの無機物、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ＰＶＤＦなどの高分子物質を主成分とするものであってよく、結合解析手法に応じて適切に選択されてよい。また、固体支持体の形状は、分析システムでの使用に適した任意の形状であってよく、例えば、メンブレン、ビーズ、スライドガラス、マルチウェルプレート、マイクロタイタープレート、マルチアレイチップ、センサーチップなどであってよい。タウオリゴマーまたはＮＭＤＡ受容体の固体支持体上への固定化は、すでに確立された一般的なリガンドの固定化方法により行うことができ、例えば、共有結合により固体支持体表面に直接的にカップリングしてもよいし、ビオチン化したタウオリゴマーまたはＮＭＤＡ受容体をストレプトアビジンでコートした固体支持体に間接的にカップリングしてもよい。なお、ＮＭＤＡ受容体を固体支持体表面に固定する場合には、リポソーム膜上で生理機能を維持した状態で精製されたＮＭＤＡ受容体であれば、リポソームを固体支持体に固定すればよく、４次構造を維持した状態で脂質膜から分離されたＮＭＤＡ受容体であれば、ＮＭＤＡ受容体自体を直接または抗ＮＭＤＡ受容体抗体を介して固体支持体に固定すればよい。

タウオリゴマーまたはＮＭＤＡ受容体は、結合を検出するために蛍光標識されていていることが好ましい。蛍光色素の種類は、特に限定されず、例えば、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、カルボシアニン色素、インドシアニングリーン色素、フタロシアニン色素、スクアリリウム色素、ＢＯＤＩＰＹ、Ｃｙ５．５、ダンシルなどを用いることができる。タンパク質の標識方法はすでに確立されており、例えばタウオリゴマーまたはＮＭＤＡ受容体のアミノ基などに対して標識を導入すればよい。リポソーム膜上で生理機能を維持した状態で精製されたＮＭＤＡ受容体を蛍光標識する場合には、リポソーム膜または内部のいずれが蛍光標識されてもよいが、リポソーム内に蛍光色素を封入することにより標識されることが好ましい。

本実施形態のスクリーニング方法において、候補化合物の存在下でのタウオリゴマーとＮＭＤＡ受容体との直接的な結合が、候補化合物の非存在下における結合と比較して有意に減少した場合は、当該候補化合物は、タウオパチーの治療薬または予防薬として有望であると判断することができる。一方、候補化合物の存在下でのタウオリゴマーとＮＭＤＡ受容体との直接的な結合が、候補化合物の非存在下における結合と同等またはそれ以上に増加した場合は、当該候補化合物は、タウオパチーの治療薬または予防薬として有望ではないと判断することができる。

本実施形態のスクリーニング方法は、（３）ＮＭＤＡ受容体を介した細胞またはリポソームへのカルシウム流入を測定するステップをさらに含んでもよい。細胞またはリポソームへのカルシウム流入は、例えば、細胞またはリポソーム内に蛍光カルシウム指示薬をロードし、細胞またはリポソーム内のカルシウム濃度変化を検出することにより、測定することができる。蛍光カルシウム指示薬は、Ｆｌｕｏ－３、Ｆｌｕｏ－４、Ｉｎｄｏ－１などの１波長励起－１波長蛍光指示薬であってもよいし、Ｆｕｒａ－２などの２波長励起－１波長蛍光指示薬であってもよい。なお、ＮＭＤＡ受容体が生理機能を維持した状態でリポソーム膜上に含まれている場合には、タウオリゴマーとの結合を検出するための蛍光色素とは励起波長／蛍光波長が異なる蛍光カルシウム指示薬を用いることにより、ＮＭＤＡ受容体とタウオリゴマーとの結合と、ＭＤＡ受容体を介したリポソームへのカルシウム流入とを、同時に評価することができる。あるいは、Ｆｕｒａ－２のようなレシオメトリック蛍光色素を用いれば、カルシウム濃度変化を測定するための蛍光（Ｆｕｒａ－２であれば３４０ｎｍおよび３８０ｎｍ励起による蛍光）に加え、カルシウム濃度変化の影響を受けない蛍光（Ｆｕｒａ－２であれば３６０ｎｍ励起による蛍光）を測定することにより、追加の蛍光標識を使用せずとも、ＮＭＤＡ受容体とタウオリゴマーとの結合と、ＮＭＤＡ受容体を介したリポソームへのカルシウム流入とを、同時に評価することができる。

本実施形態のスクリーニング方法において、候補化合物の存在下でのＮＭＤＡ受容体を介したカルシウム流入が、候補化合物の非存在下におけるカルシウム流入と比較して有意に減少した場合は、当該候補化合物は、タウオパチーの治療薬または予防薬として有望であると判断することができる。一方、候補化合物の存在下でのＮＭＤＡ受容体を介したカルシウム流入が、候補化合物の非存在下におけるカルシウム流入と同等またはそれ以上に増加した場合は、当該候補化合物は、タウオパチーの治療薬または予防薬として有望ではないと判断することができる。

本実施形態のスクリーニング方法は、（４）細胞またはリポソームへの膜タンパク質の取り込みを測定するステップをさらに含んでもよい。膜タンパク質の取り込みは、例えば、膜タンパク質をｐＨ応答性の蛍光プローブで標識し、取り込みに伴う膜タンパク質周囲のｐＨ変化を検出することにより、測定することができる。ｐＨ応答性の蛍光プローブは、ＡｃｉｄｉＦｌｕｏｒ（商標）ＯＲＡＮＧＥなどの蛍光色素であってもよいし、ｐＨｌｕｏｒｉｎまたはｐＨｌｕｏｒｉｎ２などの蛍光タンパク質であってもよい。ｐＨ応答性の蛍光プローブにより標識される膜タンパク質は、特に限定されないが、例えばＮＭＤＡ受容体やＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体（ＡＭＰＡ受容体）であってよい。ｐＨ応答性の蛍光プローブは、公知の化学的手法または遺伝子工学的手法により、膜タンパク質に付加することができる。あるいは、タウオリゴマーはＮＭＤＡ受容体と安定的に結合するため、タウオリゴマーをｐＨ応答性の蛍光プローブで標識することにより、間接的にＮＭＤＡ受容体を標識することもできる。

あるいは、ＮＭＤＡ受容体やＡＭＰＡ受容体などの、シナプス伝達に関与する受容体タンパク質の細胞またはリポソームへの取り込みを測定するためには、シナプス伝達強度の変化を測定することもできる。シナプス伝達強度は、例えば、局所場電位（ＬＦＰ）を計測することによる細胞外電位の測定、パッチクランプ法などによる細胞内電位の測定、Ｄｉ－３－ＡＮＥＰＰＤＨＱなどの膜電位感受性色素を用いた膜電位変化の測定などにより評価することができる。

本実施形態のスクリーニング方法において、細胞またはリポソームへの膜タンパク質の取り込みが、候補化合物の非存在下における膜タンパク質の取り込みと比較して有意に減少した場合は、当該候補化合物は、タウオパチーの治療薬または予防薬として有望であると判断することができる。一方、候補化合物の存在下での細胞またはリポソームへの膜タンパク質の取り込みが、候補化合物の非存在下における膜タンパク質の取り込みと同等またはそれ以上に増加した場合は、当該候補化合物は、タウオパチーの治療薬または予防薬として有望ではないと判断することができる。

本発明の方法は、認知症の治療薬または予防薬の候補化合物のスクリーニングに有用である。

本発明は、第二の実施形態によれば、（１）被験者から単離された試料とＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体とを接触させるステップと、（２）ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に直接的に結合したタウオリゴマーを定量するステップとを含む、タウオパチーの検査方法である。本実施形態における「ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体」、「タウオリゴマー」、および「タウオパチー」は、第一の実施形態で定義したものと同様である。

本実施形態において「検査」とは、ＮＭＤＡ受容体に直接的に結合したタウオリゴマーを指標として、数値的に定量またはその有無を検出することを意味する。この検査結果に基づけば、医師は、被験者がタウオパチーに罹患しているか否かを判定・診断し、適切な治療方針を決定し得る。

本実施形態において「被験者」とは、タウオパチーに罹患し得る動物個体である。動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、非ヒト霊長類、ヒトなどの哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。

本実施形態における「試料」は、被験者から採取し得る生体試料であり、例えば被験者由来の組織、細胞または体液などであってよいが、特に限定されない。本実施形態における好ましい試料は、例えば脳組織や脳脊髄液（ＣＳＦ）であってよく、特に好ましくはＣＳＦである。試料は、当業者に周知の方法により被験者から得ることができる。

本実施形態では、被験者から単離された試料とＮＭＤＡ受容体とを接触させる。試料とＮＭＤＡ受容体との接触は、例えば、試料とＮＭＤＡ受容体とをＨＥＰＥＳ緩衝人工脳脊髄液などの緩衝液中で両者を共存させ、一定時間インキュベートすることにより行うことができる。試料およびＮＭＤＡ受容体の濃度ならびにインキュベート時間は、第一の実施形態で定義したものと同様であってよく、採用する結合解析手法に応じて適宜決定されてよい。

次いで、ＮＭＤＡ受容体に直接的に結合したタウオリゴマーを定量する。タウオリゴマーとＮＭＤＡ受容体との結合を定量するための手法は、第一の実施形態の実施形態で定義したタウオリゴマーとＮＭＤＡ受容体との結合の評価手法と同様である。

本実施形態のタウオパチーの検査方法は、（３）ＮＭＤＡ受容体を介した細胞またはリポソームへのカルシウム流入を測定するステップ、および／または（４）細胞またはリポソームへの膜タンパク質の取り込みを測定するステップをさらに含んでもよい。これらの測定手順は、第一の実施形態で定義したものと同様であってよい。

本実施形態のタウオパチーの検査方法は、上記定量の結果を、タウオパチーに罹患していない対照由来の試料（正常対照試料）について予め決定されたタウオリゴマープロファイルと比較するステップをさらに含んでもよい。この比較の結果に基づいて、被験者由来の試料におけるタウオリゴマーが、正常値よりも有意に増加していることが示された場合には、被験者がタウオパチーに罹患している可能性があると判定され得る。すなわち、本実施形態のタウオパチーの検査方法において、タウオリゴマーとＮＭＤＡ受容体との直接的な結合、ＮＭＤＡ受容体を介したカルシウム流入、および／または細胞またはリポソームへの膜タンパク質の取り込みが、正常値よりも有意に増加していることが示された場合には、被験者がタウオパチーに罹患している可能性があると判定されてよい。その意味で、本実施形態によるタウオパチーの検査方法は、被験者がタウオパチーに罹患しているかどうかを評価判別する方法、すなわち診断方法であり得る。また、例えばタウオパチー治療薬の投与の前後において同一人から得た試料に含まれるタウオリゴマーの量を本実施形態の方法により比較すれば、治療効果を評価することもできる。

本実施形態のタウオパチーの検査方法は、高い精度でのタウオパチーの検出を可能とするものであり、極めて有用である。

以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。

＜１．タウオリゴマーの調製＞
（１－１）タウモノマーの調製
ヒトタウ２Ｎ４Ｒ型アイソフォームのモノマー（以下、「タウモノマー」と記載する）を、以下の手順により調製した。ヒトタウ２Ｎ４Ｒ型アイソフォームをコードする配列を含むｔａｕ／ｐＥＴ２９ｂプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃１６３１６）を鋳型として、以下のプライマーセットを用いてタウ遺伝子をコードするＤＮＡ断片を調製した。

得られたＤＮＡ断片を、Ｈｉｓ×６タグをコードする配列を含む発現ベクターであるｐＥＴ４７ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、＃７１４６１－３）のＸｈｏＩ／ＫｐｎＩ制限酵素部位に挿入し、Ｈｉｓ６－タウモノマー発現ベクターｐＥＴ４７ｂ－Ｈｉｓ６－Ｔａｕを得た。ｐＥＴ４７ｂ－Ｈ６－Ｔａｕにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、カナマイシン耐性株を得た。得られた菌株をカナマイシン含有ＬＢ培地中で前培養し、ＯＤ６００＝０．６～１．０に達した後、０．６ｍＭのＩＰＴＧを添加してタンパク質の発現を誘導し、さらに２時間培養した。培養液を４℃、６０００×ｇで遠心し、菌体を回収し、精製するまで－８０℃で保存した。

氷上で、１％のプロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ・アルドリッチ）、０．２ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（和光純薬）、１μＭのＰＭＳＦ（ナカライテスク）、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ナカライテスク）、および０．５ｍＭのＤＴＴを含む結合バッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）に菌体を懸濁し、超音波処理により破砕後、４℃、２０，０００×ｇで３０分間遠心し、上清を回収した。上清を０．２μｍフィルターで濾過した後、予め結合バッファーにより平衡化したＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア）に供した。その後、溶出バッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、４００ｍＭのイミダゾール）をカラムに供し、吸着物を溶出した。得られた溶出液について透析を行い、イミダゾールを除去し、ＨＥＰＥＳバッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）を交換した。その後、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ（タカラバイオ）によりＨｉｓタグを切断し、タウモノマーの粗精製液を得た。

得られた粗精製液をＨｉｓＴｒａｐ ＳＰカラム（ＧＥヘルスケア）に供した後、０～１ＭのＮａＣｌ濃度勾配により吸着物を溶出し、３００ｍＭ付近で溶出される画分を回収した。得られた画分中のタウモノマーの純度をウエスタンブロットとＣＢＢ染色により確認した後、透析により脱塩し、アミコンウルトラ１０Ｋ遠心式フィルター（メルクミリポア）による濃縮およびＨＥＰＥＳバッファー（４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）によるバッファー交換を行い、タウモノマーサンプルを得た。

（１－２）ＨａｌｏＴａｇ融合タウモノマーの調製
ＨａｌｏＴａｇをＮ末端に付加したヒトタウ２Ｎ４Ｒ型アイソフォームのモノマー（以下、「ＨＴタウモノマー」と記載する）を、以下の手順により調製した。ＨａｌｏＴａｇをコードする配列を含むｐＥＮＴＲ４－ＨａｌｏＴａｇプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃２９６４４）を鋳型として、以下のプライマーセットを用いてＨａｌｏＴａｇをコードするＤＮＡ断片を調製した。

得られたＤＮＡ断片を、上記（１－１）で作製したｐＥＴ４７ｂ－Ｈｉｓ６－ＴａｕのＡｃｃ６５Ｉ制限酵素部位に挿入し、Ｈｉｓ６－ＨＴタウモノマー発現ベクターｐＥＴ４７ｂ－Ｈｉｓ６－ＨＴ－Ｔａｕを得た。ｐＥＴ４７ｂ－Ｈ６－Ｔａｕに代えてｐＥＴ４７ｂ－Ｈｉｓ６－ＨＴ－Ｔａｕを用いた以外は上記（１－１）と同様の手順により、タンパク質の発現および精製を行い、ＨＴタウモノマーサンプルを得た。

（１－３）タウオリゴマーの調製
上記（１－１）で調製したタウモノマーサンプルを用いて、以下の手順によりタウオリゴマーサンプルを調製した。生後３週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスから脳を摘出し、脳組織重量の５倍量の溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ_３ＶＯ_４、１％のプロテアーゼインヒビターカクテル、１μＭのＰＭＳＦ）を加えてホモジナイズした。得られたホモジネートを、４℃、６０００×ｇで１５分間遠心して上清を回収し、４００，０００×ｇで６０分間の超遠心を行い、マウス脳抽出液を得た。

反応バッファー（４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３ｍＭのＭｇＣｌ_２、５ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのＤＴＴ、２μＭのオカダ酸、５０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ_３ＶＯ_４、１％のプロテアーゼインヒビターカクテル、２ｍＭのＡＴＰ、ｐＨ７．２）にタウモノマーサンプル（終濃度２００～２５０μｇ／ｍｌ）およびマウス脳抽出液（終濃度５０～１００μｇ／ｍｌ）を添加し、弱く撹拌しながら３７℃でインキュベートした。１２～２４時間後に２ｍＭのＡＴＰを追加し、６０時間後の反応液を、４℃、４００，０００×ｇで１時間超遠心してペレットを回収した。得られたペレットを０．５ｍｌのＨＥＰＥＳ－ａＣＳＦ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１３２ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１．３ｍＭのＭｇＣｌ_２、２．２ｍＭのＣａＣｌ_２、１０ｍＭのＧｌｕｃｏｓｅ）に溶解し、タウオリゴマーサンプルとした。ブルーネイティブＰＡＧＥおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウエスタンブロットにより、タウオリゴマーを確認し、定量した。

（１－４）ＨａｌｏＴａｇ含有タウオリゴマーの調製
上記（１－１）で調製したタウモノマーサンプルに代えて、上記（１－１）および（１－２）で調製したタウモノマーサンプルおよびＨＴタウモノマーサンプルを４：１の比率で混合したサンプルを用いた以外は上記（１－３）と同様の手順により、ＨａｌｏＴａｇを含有するタウオリゴマーサンプル（以下、「ＨＴタウオリゴマーサンプル」と記載する）を調製した。

＜２．タウオリゴマーサンプルの生理活性の同定＞
（２－１）脳スライス標本の作製
タウオリゴマーのシナプス伝達効率への影響を評価するために、マウスの脳スライス標本を以下の手順により調製した。２０～２３月齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＪまたはＣ５７ＢＬ／６Ｎ、オス）を頚椎脱臼、断頭し、脳を摘出した。得られた脳を、９５％Ｏ_２／５％ＣＯ_２混合ガスによりバブリングされたａＣＳＦ（１２４ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、２６ｍＭのＮａＨＣＯ_３、１．２５ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、２ｍＭのＣａＣｌ_２、１ｍＭのＭｇＳＯ_４、１０ｍＭのＤ－ｇｌｕｃｏｓｅ）中で十分に冷却した後、大脳中央で冠状面に沿って切断し、さらに、切断された後側の脳部を、水平断面に沿って、ビブラトーム（ライカ、ＶＴ－１２００Ｓ）を用いて厚さ３５０μｍにスライスした。得られた切片を、実体顕微鏡下で海馬／嗅内野複合体を含む領域とそれ以外に切り分け、海馬／嗅内野複合体を含む領域を脳スライス標本とした。

（２－２）脳スライス標本へのタウオリゴマーの曝露
得られた脳スライス標本を、ａＣＳＦ中の多孔質メンブレンフィルター（８μｍ、サーモフィッシャー・サイエンティフィック、＃１４０６５４）の上に移し、脳スライス標本を気液界面に維持した。この際、９５％Ｏ_２／５％ＣＯ_２混合ガスにより、ａＣＳＦを常にバブリングした。２時間後、上記（１－３）で調製したタウオリゴマーサンプル（１０μｇ／ｍｌ、ａＣＳＦ中）を脳スライス標本に曝露した。２～３時間後、新たなａＣＳＦで脳スライス標本を洗浄し、その後３０分以上保持し、以下の測定に用いた。また、タウオリゴマーサンプルを曝露しない以外は同様の手順により調製した脳スライス標本を陰性対照とした。タウオリゴマーサンプルを曝露した脳スライス標本およびタウオリゴマーサンプルを曝露していない脳スライス標本を、それぞれ３個体のマウスから調製した。

（２－３）シナプス伝達効率の測定
ａＣＳＦを灌流した測定用チャンバーに脳スライス標本を移し、ＣＡ１からＣＡ３へのシナプス強度を計測するために、１．５、２、３、または４ｎＡの電気パルス刺激を与えることにより誘導される電位変化を記録した。記録電極には、電極抵抗５００Ωのガラス微小電極を用いた。記録された波形を自作の解析ソフトにより解析し、電気パルス刺激ごとの線維斉射（ｆｉｂｅｒ－ｖｏｌｌｅｙ）の振幅および興奮性シナプス後電位（ｆＥＰＳＰ）の振幅を算出した。

結果を図１に示す。図中、「ｐＴａｕＯ」はタウオリゴマーサンプルを曝露した脳スライス標本、「ａＣＳＦ」は陰性対照の結果を示す。ｆｉｂｅｒ－ｖｏｌｌｅｙは、シナプス前膜の活動（すなわちシナプス入力強度）を反映し、ｆＥＰＳＰはシナプス後膜の活動（すなわちシナプス出力強度）を反映する。ｆｉｂｅｒ－ｖｏｌｌｅｙ／ｆＥＰＳＰ比によりシナプス伝達効率を評価すると、タウオリゴマーサンプルを曝露した脳スライス標本では、陰性対照と比較してシナプス伝達効率が有意に低下していることが明らかになった（ｐ＜０．０００１、Ｅｘｔｒａ ｓｕｍ－ｏｆ－ｓｑｕａｒｅｓ Ｔｅｓｔ）。この結果から、タウオリゴマーがシナプスの長期抑圧（ＬＴＤ）を誘導することが示された。

＜３．タウオリゴマーの標的分子の同定＞
次いで、上記で確認されたタウオリゴマーにより誘導されたＬＴＤが、ＮＭＤＡ受容体依存性ＬＴＤ（以下、「ＮＭＤＡＲ－ＬＴＤ」と記載する）であるか否かを確認するために、以下の試験を行った。

（３－１）シナプス表面におけるＮＭＤＡ受容体およびＡＭＰＡ受容体の量変化
ＮＭＤＡＲ－ＬＴＤの分子機構として、ＮＭＤＡ受容体の活性化によって引き起こされる、シナプス後膜におけるエンドサイトーシスによるＡＭＰＡ受容体（以下、「ＡＭＰＡＲ」と記載する）および／またはＮＭＤＡ受容体（ＮＭＤＡＲ）の細胞内への取り込みが知られている。そこで、上記（２－１）および（２－２）の手順により得られたタウオリゴマーサンプルを曝露した脳スライス標本およびタウオリゴマーサンプルを曝露していない脳スライス標本における、シナプス上のＮＭＤＡＲおよびＡＭＰＡＲの量変化を解析した。

脳スライス標本を凍結し、５０倍容量のホモジナイズバッファー（４ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＥＧＴＡ、０．３２Ｍのショ糖、ｐＨ７．４）中で、テフロン（登録商標）ホモジナイザーを用いて破砕した。得られた破砕液を、４℃、１，０００×ｇで１５分間遠心分離して上清を回収し、上清をさらに４℃、１２，０００×ｇで１５分間遠心分離して膜画分（ペレット）を回収した。得られた膜画分を、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含有するトリス緩衝生理食塩水（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、４℃、２０，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００可溶性膜画分サンプルとし、ペレットを０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００不溶性膜画分サンプルとした。０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００不溶性膜画分サンプルについてウエスタンブロットを行い、ＡＭＰＡ受容体（ＧｌｕＡ２サブユニット）およびＮＭＤＡ受容体（ＮＲ２ａおよびＮＲ２ｂサブユニット）を定量した。抗体には、抗Ｇｌｕ２抗体（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ、＃ＡＧＣ－０７３）（１：１０００希釈）、抗ＮＲ２Ａ抗体（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ、＃ＡＧＣ－００２）（１：１０００希釈）、抗ＮＲ２Ｂ抗体（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ、＃ＡＧＣ－００３）（１：１０００希釈）を用いた。

結果を図２に示す。図中、「ｐＴａｕＯ」はタウオリゴマーサンプルを曝露した脳スライス標本、「ａＣＳＦ」は陰性対照を示し、グラフは、ａＣＳＦにおける受容体量を１として標準化した結果を示す。タウオリゴマーサンプルの曝露により、シナプス後部におけるＮＭＤＡＲおよびＡＭＰＡＲが減少することが示された（＊：ｐ＜０．０５、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ； ＊＊：ｐ＜０．０１、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ； ｅｒｒｏｒ ｂａｒ：ＳＥＭ）。この結果から、タウオリゴマーサンプルの曝露により誘導されたＬＴＤが、ＮＭＤＡＲ－ＬＴＤであることが示唆された。

さらに、ＮＭＤＡＲ－ＬＴＤが障害されることが報告されているタウノックアウトマウス（Ｂ６．１２９Ｘ１－Ｍａｐｔ^{ｔｍ１Ｈｎｄ}／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から、上記（２－１）および（２－２）の手順により脳スライス標本を調製し、同様の解析を行った結果を図３に示す。タウノックアウトマウスでは、タウオリゴマーサンプルの曝露によるシナプスにおけるＮＭＤＡＲおよびＡＭＰＡＲの減少はみられなかった。ＮＭＤＡＲ－ＬＴＤは、細胞内のタウ依存性であることが知られており、以上の結果からも、タウオリゴマーサンプルの曝露により誘導されたＬＴＤが、ＮＭＤＡＲ－ＬＴＤであることが示唆された。

（３－２）タウオリゴマーとＮＭＤＡＲとの直接的相互作用の検証
タウオリゴマーとＮＭＤＡＲとが直接的に結合し相互作用しているか否かを、共免疫沈降により試験した。上記（２－１）および（２－２）の手順により得られたタウオリゴマーサンプルを曝露したタウノックアウト脳スライス標本を、５０倍容量の溶解バッファー（４ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＥＧＴＡ、０．３２Ｍのショ糖、１％のプロテアーゼインヒビターカクテル、１％のホスファターゼインヒビターカクテル（ナカライテスク、＃０７５７５－５１））中でホモジナイズし、４℃、１２，０００×ｇで１５分間遠心してペレットを回収した。得られたペレットを、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＴＢＳ溶液（２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ－４０、５％のグリセロール、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ｐＨ７．４）に溶解し、膜タンパク質溶液とした。得られた膜タンパク質溶液について、抗タウ抗体（ＴａｕＣ）（Ｄａｋｏ、＃Ａ００２４）（１：２０００希釈）およびＰｉｅｒｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＩＰ／Ｃｏ－ＩＰ Ｋｉｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック、＃８８８２８）を用いて、キットの推奨プロトコールにしたがって共免疫沈降を行った。回収された共免疫沈降サンプルを泳動後、ウエスタンブロットによりＮＭＤＡＲを検出した。抗体には、抗ＮＲ１サブユニット抗体（メルクミリポア、＃ＭＡＮ３６３）（１：２０００希釈）を用いた。

結果を図４に示す。図中、「Ｉｎｐｕｔ」は共免疫沈降を行う前の膜タンパク質溶液（陽性対照）を示し、「ＩＰ：ＴａｕＣ」は抗タウ抗体（ＴａｕＣ）による共免疫沈降サンプルの結果を示す。タウオリゴマーサンプルを曝露していない脳スライス標本由来のサンプルからはＮＲ１サブユニットは検出されなかったのに対し、タウオリゴマーサンプルを曝露した脳スライス標本由来のサンプルでは、明確なＮＲ１サブユニットのバンドが検出された。この結果から、タウオリゴマーがＮＭＤＡＲに直接的に結合することが明らかになった。

＜４．タウオリゴマーのＮＭＤＡＲ活性化能の検証＞
（４－１）機能的ＮＭＤＡＲ発現細胞の調製
タウオリゴマーのＮＭＤＡＲ活性化能を評価するために、生理的に機能する状態でＮＭＤＡＲを発現する培養神経細胞を以下の手順により調製した。ヒト多能性胎生期癌由来であるＮＴＥＲＡ－２ ｃｌ．Ｄ１［ＮＴ２／Ｄ１］細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１９７３）（以下、「ＮＴ２細胞」と記載する）を、維持培養培地（高グルコースＤＭＥＭ（シグマ・アルドリッチ、Ｄ６４２９）、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン）中、３７℃、５％ＣＯ_２条件下、３～４日間、１０ｃｍプラスチックディッシュ上でコンフルエントになるまで接着培養した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃ＡＴ１０４）によりＮＴ２細胞を剥離し、継代し、５０日間にわたり維持培養した。培地は、週に３回交換した。

維持培養されたＮＴ２細胞を、１．５×１０^６～２．５×１０^６／ディッシュの濃度で低付着微生物用ペトリディッシュ（ＳＴＡＲ ＳＤｉｓｈ９０１５、理科研）に分散し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下、振動機上で（１００ｒｐｍ）浮遊培養し、１日後に１μＭのａｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノイン酸（アブカム）を添加して分化を誘導し、スフェロイドを形成させた。１４日後、スフェロイドを回収し、５μｇ／ｍｌのポリ－Ｄ－リジン（ＰＤＬ）（シグマ・アルドリッチ）／ラミニン（ＬＡＭ）（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１、ニッピ）によりコートされた１０ｃｍディッシュに播き、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で接着培養した。翌日から、３種類の細胞分裂阻害剤（１０μＭのウリジン、１０μＭのフロクスウリジン、１μＭのＡｒａＣ）を添加して培養し、３日後に細胞を剥離し、０．１×１０^６／ディッシュの濃度でＰＤＬ／ＬＡＭコートされた３５ｍｍディッシュに播きなおし、３種類の細胞分裂阻害剤の存在下で４日間培養することにより、神経細胞への分化誘導を行った。

分化誘導後の細胞を、０．２％ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ（商標）ＳＭ１ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ含有ＢｒａｉｎＰｈｙｓ（商標）Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、３７℃、５％ＣＯ_２条件下、２～３ヶ月維持培養した。培地は、週に３回、半量交換した。これにより、神経細胞マーカーＭＡＰ２陽性の細胞が得られ、これをＮＴ２－Ｎ細胞とした。さらに、ＮＴ２－Ｎ細胞から調製された膜タンパク質画分から、ＰＳＤ－９５およびＧｌｕＮ１の発現が確認されたことから（データは省略）、ＮＴ２－Ｎ細胞が中枢神経細胞の特徴を有し、かつ、グルタミン酸を介する化学シナプスを形成していることが確認された。

（４－２）ＮＭＤＡＲを介したカルシウム流入の測定
蛍光カルシウム指示薬Ｃａｌ－５２０ ＡＭ（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）またはＦｌｕｏ－８ ＡＭ（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）を、０．１μＭグリシン含有ＭｇフリーＨＨＢＳ（Ｈｅｐｅｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｈａｎｋｓ’ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１．２６ｍＭのＣａＣｌ_２、５．３３ｍＭのＫＣｌ、０．４４ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、４．１７ｍＭのＮａＨＣＯ_３、１３７．９３ｍＭのＮａＣｌ、０．３４ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、５．５６ｍＭのＤ－グルコース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４））に溶解した（それぞれ４μＭ、２μＭ）。この溶液（１ｍｌ）を、３７℃、５％ＣＯ_２条件下、ＮＴ２－Ｎ細胞にロードした（それぞれ２時間、３０分間）。その後、ＨＨＢＳにより３回洗浄し、生細胞タイムラプスイメージング装置（ＢｉｏＳｔａｔｉｏｎ ＩＭ－Ｑ、ニコン）のインキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ_２）に１時間以上放置したものを以下の測定に用いた。

装置内に配置したＮＴ２－Ｎ細胞について、解析を行う５～１０視野を手動で設定し、各視野につき、Ｃａｌ－５２０については、励起波長４８０ｎｍ／蛍光波長５２０ｎｍで、１分ごとに連続して１時間、Ｆｌｕｏ－８については、励起波長４８０ｎｍ／蛍光波長５２０ｎｍで、２秒ごとに連続して５分間、蛍光強度を記録した。また、記録開始から一定時間経過後（Ｃａｌ－５２０については３０分後、Ｆｌｕｏ－８については１２０秒後）に、上記（１－３）で調製したタウオリゴマーサンプル（０．０３μｇ／ｍｌ、ＨＨＢＳ中）を１００μｌ投与した。

Ｆｌｕｏ－８による測定結果を図５に示す。図中、「Ｆ ｉｍａｇｅ」は蛍光像を示し、「ΔＦ／Ｆ ｉｍａｇｅ」は蛍光強度の変化を示す。また、数字は、タウオリゴマーサンプル投与時を０としたイメージ取得時間（秒）を示す。タウオリゴマーサンプルを投与した後、時間が経過するにしたがって細胞内カルシウム濃度が増大していることが確認された。なお、上記（１－３）でタウオリゴマーサンプルの調製に用いた（タウを含まない）反応液を同量投与しても、細胞内カルシウム濃度の増大は見られなかった。

また、Ｃａｌ－５２０による測定結果を図６に示す。図中、「ｐＴａｕＯ」は、タウオリゴマーサンプル、「ＡＰ５＋ｐＴａｕＯ」は、ＮＭＤＡＲに対するアンタゴニストである２－アミノ－５－ホスホノペンタン酸（ＡＰ５）（５０μＭ）＋タウオリゴマーサンプル、「ｐＴａｕＯ（Ｃ－）」は、Ｃ末端（３７３番目のアミノ酸以降）を削除したタウモノマーを用いて、上記（１－３）と同様の手順により調製したタウオリゴマーサンプル、「ｐＴａｕＭ」は、リン酸化したタウモノマーサンプルを示す。図６Ａは、タウサンプル投与3分後の時点で顕著なカルシウム濃度の増大（ΔＦ／Ｆ＞０．４）がみられたゾーンの数を示す。図６Ｂは、前記ゾーンのタウサンプル投与３分後の時点での蛍光強度変化を示す。タウオリゴマーによって誘導される細胞内カルシウム濃度の増大が、ＡＰ５により消失したことから、タウオリゴマーがＮＭＤＡＲ活性化能を有することが確認された。また、リン酸化されたタウモノマーおよびＣ末端が削除されたタウにより構成されたオリゴマーでは、細胞内カルシウム濃度の増大がみられなかったことから、タウオリゴマーのＮＭＤＡＲ活性化能には、タウの３７３番目のアミノ酸以降のＣ末端部分が必要であることが明らかになった。

リン酸化したタウモノマーは、上記（１－４）で調製されたＨＴタウオリゴマーサンプルから、Ｍａｇｎｅ（商標）ＨａｌｏＴａｇビーズ（プロメガ、＃Ｇ７２８Ａ）（５０ｍｇ）により回収した。その後、ＴＥＶプロテアーゼ（シグマ・アルドリッチ、＃Ｔ４４５５－１０ＫＵ）によりＨａｌｏＴａｇを切断し、タウモノマーをビーズより分離させた。その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア）を用いて精製し（溶出液はＨＥＰＥＳ－ａＣＳＦ、流速０．５ｍｌ／分）、回収されたものをリン酸化したタウモノマーサンプルとした。また、Ｃ末端を削除したタウモノマーは、以下のプライマーセットを用いた以外は、上記（１－１）と同様の手順により調製した。

＜５．タウオリゴマーの細胞表面への付着活性の評価＞
（５－１）蛍光免疫染色によるタウオリゴマーの細胞表面への付着活性の評価
上記（４－１）で調製したＮＴ２－Ｎ細胞に、上記（４－２）の手順によりＣａｌ－５２０ ＡＭをロードした後、上記（１－３）で調製したタウオリゴマーサンプル（１０μｌ／ｍｌ）を曝露し、氷上で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＤＰＢＳ（－）（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．６８ｍＭのＫＣｌ、１．４７ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、８．０６ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４）により３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドにより室温で１５分間固定した。ＤＰＢＳ（－）により十分に洗浄後（１０分×３回）、１％ＢＳＡ、３％ロバ血清／ＤＰＢＳにより、３０分間ブロッキングした。その後、一次抗体として抗リン酸化タウ抗体（ａｎｔｉ－ｐＴａｕ（ｐａｉｒｅｄ ｐＳ４０９，ｐＳ４１２，ｐＳ４１３）、ＡｎａＳｐｅｃ、＃ＡＳ－５５４１６）（１：１５００希釈）を室温で１時間、二次抗体としてＡｌｅｘａ５９４標識抗マウスＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃７１１－５８５－１５２）（１：１５００希釈）を室温で３０分間反応させることにより、免疫染色を行った。染色後の細胞を、蛍光顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７１０、キーエンス）により観察した。

結果を図７に示す。上記手順では、膜透過処理を行わずに細胞を固定しているため、抗体は細胞内には浸潤せず、細胞表面に付着したタウオリゴマーが染色される。蛍光顕微鏡観察の結果、細胞体部分および神経突起部分の細胞表面にパッチ状にタウオリゴマーが付着していることが明らかになった。この結果から、タウオリゴマーが細胞膜に付着する活性を有することが示された。

（５－２）蛍光標識ＨＴタウオリゴマーサンプルを用いたタウオリゴマーの細胞表面への付着活性の評価
上記（１－３）で調製したタウオリゴマーサンプルに代えて、上記（１－４）で調製したＨＴタウオリゴマーサンプルを、上記（５－１）と同様の手順によりＮＴ２－Ｎ細胞に曝露した。十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡により観察した。その結果、蛍光免疫染色の結果と同様に、細胞体部分および神経突起部分の細胞表面において蛍光がパッチ状に観察された（データは省略）。

＜６．タウオリゴマーの細胞内への取り込みの計測＞
（６－１）ｐＨセンサー標識ＨＴタウオリゴマーの調製
上記（１－３）で調製した０．５ｍｌのタウオリゴマーサンプル（推定タウ濃度：３００ｎｇ／ｍｌ）と、２μＭのＨａｌｏＴａｇ ＡｃｉｄｉＦｌｕｏｒ ＯＲＡＮＧＥ Ｌｉｇａｎｄ（五稜化薬）とを室温で２０分間反応させ、ＨＴタウオリゴマーをｐＨ感受性蛍光プローブＡｃｉｄｉＦｌｕｏｒ ＯＲＡＮＧＥにより標識した。その後、反応液を４℃、４００，０００×ｇで１時間超遠心した。得られたペレットを０．５ｍｌのＨＨＢＳに再懸濁し、ＡｃｉｄｉＦｌｕｏｒ ＯＲＡＮＧＥにより標識されたＨＴタウオリゴマーサンプル（ｐＨセンサー標識ＨＴタウオリゴマーサンプル）を得た。

（６－２）ｐＨセンサー標識ＨＴタウオリゴマーを用いたエンドサイトーシスの計測
上記（１－３）で調製したタウオリゴマーサンプルに代えて、ｐＨセンサー標識ＨＴタウオリゴマーサンプルを、上記（５－１）と同様の手順によりＮＴ２－Ｎ細胞に曝露した。十分に洗浄した後、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ２２００（ＧＥヘルスケア）により蛍光顕微鏡観察を行った。また、ｐＨセンサー標識ＨＴタウオリゴマーサンプルと同時に、１０μｌの抗リン酸化タウ抗体（ａｎｔｉ－ｐＴａｕ（ｐａｉｒｅｄ ｐＳ４０９，ｐＳ４１２，ｐＳ４１３）、ＡｎａＳｐｅｃ、＃ＡＳ－５５４１６、（１：１５００希釈）；およびａｎｔｉ－ｐＴａｕ（ｐＳ４１６）、ＧｅｎｅＴｅｘ、＃ＧＴＸ３１１２１、（１：１５００希釈））または抗レクチン抗体１１Ｆ１１（アブカム、ａｂ２３４６１、（１：１５００希釈））（陰性対照）を添加した以外は同様にしてｐＨセンサー標識ＨＴタウオリゴマーサンプルを曝露したＮＴ２－Ｎ細胞を調製し、同様に蛍光顕微鏡観察を行った。

結果を図８に示す。ｐＨセンサー標識ＨＴタウオリゴマーがエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれると、ｐＨの変化に伴って蛍光強度が増大する。図中、「ｐｒｅ」はタウオリゴマーサンプル曝露前のＮＴ２－Ｎ細胞の結果、「ＴａｕＯ」はタウオリゴマーサンプルを曝露したＮＴ２－Ｎ細胞の結果を示す。タウオリゴマーサンプルを曝露したＮＴ２－Ｎ細胞ではエンドサイトーシスによるタウオリゴマーの細胞内取り込みが確認されたのに対し、２種類の抗タウ抗体はいずれもこれを阻害することが明らかになった。これらの結果から、タウオリゴマーがエンドサイトーシスを誘導すること、および、その阻害のためにはタウのＣ末端部分のリン酸化を認識する抗体が有効であることが示唆された。また、これらの結果は、上記４で確認されたタウオリゴマーのＮＭＤＡＲ活性化能の検証結果とも一致するものであった。

＜７．タウオリゴマーとＮＭＤＡＲとの直接的相互作用＞
（７－１）プルダウンアッセイによるタウオリゴマーとＮＭＤＡＲとの直接的相互作用の評価
タウオリゴマーとＮＭＤＡＲとが直接的に結合し相互作用しているか否かを、ＨＴタウオリゴマーを用いたプルダウンアッセイにより確認した。上記（１－４）で調製したＨＴタウオリゴマーサンプル（１００μｌ）にＭａｇｎｅ（商標）ＨａｌｏＴａｇビーズ（プロメガ、＃Ｇ７２８Ａ）（５０ｍｇ）を加え、４℃で１２時間の結合反応を行い、ＨＴタウオリゴマーをビーズ上に固定した。また、タウノックアウトマウス（Ｂ６．１２９Ｘ１－Ｍａｐｔ^{ｔｍ１Ｈｎｄ}／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から、上記（２－１）と同様の手順により脳スライス標本を調製し、５０倍容量の溶解バッファー（４ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＥＧＴＡ、０．３２Ｍのショ糖、１％のプロテアーゼインヒビターカクテル、１％のホスファターゼインヒビターカクテル（ナカライテスク、＃０７５７５－５１））中でホモジナイズし、４℃、１２，０００×ｇで１５分間遠心してペレットを回収した。得られたペレットを、２％コール酸または１％デオキシコール酸／ＴＢＳ溶液（２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、膜タンパク質溶液とした。膜タンパク質溶液（１００μｌ）を、１ｍｌの０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００溶液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で、ＨＴタウオリゴマーを固定したビーズと混合し、４℃で１２時間反応させた。その後、ＴＥＶプロテアーゼによりＨａｌｏＴａｇからタウオリゴマーを切り離し、タウオリゴマー－膜タンパク質複合体を回収した。得られたタウオリゴマー－膜タンパク質複合体をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動し、ウエスタンブロットにより、ＮＭＤＡＲを検出した。抗体には、抗ＮＲ１サブユニット抗体（メルクミリポア、＃ＭＡＮ３６３）（１：２０００希釈）を用いた。

結果を図９に示す。図中、「Ｉｎｐｕｔ」は、共免疫沈降を行う前の膜タンパク質溶液（陽性対照）の結果を示し、「ＦＴ」は、共免疫沈降後の膜タンパク質溶液の結果を示す。共免疫沈降により、膜タンパク質溶液中のＮＭＤＡＲ量が減少していることが確認された。「ＴＥＶ」は、共免疫沈降により回収されたタウオリゴマー－膜タンパク質複合体の結果を示す。この結果から、タウオリゴマーにＮＭＤＡＲが直接的に結合していたことが明らかになった。

（７－２）ファーウエスタンブロットによるタウオリゴマーとＮＭＤＡＲとの直接的相互作用の評価
上記（７－１）の手順により調製された膜タンパク質をブルーネイティブＰＡＧＥ（ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ（商標）３－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ（サーモフィッシャー、＃ＢＮ１００３ＢＯＸ）；ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ（商標）Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（サーモフィッシャー、＃ＢＮ２００８）；およびＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ（商標）Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｋｉｔ（サーモフィッシャー、＃ＢＮ２００７）を使用）に供し、粗精製状態のＮＭＤＡＲ（ＮＭＤＡＲ４量体とＰＳＤ９５などの足場タンパク質との複合体、以下、単に「ＮＭＤＡＲ複合体」と記載する）を得た。泳動後のゲルからＮＭＤＡＲ複合体をＰＶＤＦ膜（メルクミリポア、＃ＩＰＶＨ０００１０）に転写した（転写バッファー：２５ｍＭのＴｒｉｓ、１９２ｍＭのグリシン、０．１％ＳＤＳ、１０％Ｍｅｔｈａｎｏｌ、ｐＨ８．０）。転写後のＰＶＤＦ膜を、０．１％のｎ－Ｄｏｄｅｃｙｌ－β－Ｄ－ｍａｌｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＤＤＭ）／５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）溶液中、室温で３０分間インキュベートし、ＰＶＤＦ膜上に固定されたＮＭＤＡＲ複合体を再構成した。その後、ＰＶＤＦ膜を十分に洗浄し（洗浄バッファー：５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％ＤＤＭ、ｐＨ７．４）、５％スキムミルク／洗浄バッファーによりブロッキングした。その後、ＰＶＤＦ膜を洗浄し、上記（１－４）で調製したＨＴタウオリゴマーサンプルに曝露した（室温、３０分間）。その後、洗浄し、抗ＨａｌｏＴａｇ抗体（プロメガ、＃Ｇ９２８Ａ）（１：１５００希釈）およびＨＲＰ標識２次抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１１１－０３５－１４４）により、ＰＶＤＦ膜に吸着したタウオリゴマーを検出した。また、並行して実施した複製実験では、タウオリゴマーを作用させることなく、抗ＨａｌｏＴａｇ抗体に代えて抗ＮＲ１抗体（メルクミリポア、＃ＭＡＢ３６３）（１：２０００希釈）を用いて同様の手順により、ＮＭＤＡＲ複合体を検出した。

結果を図１０に示す。図中、「ＷＢ／ＮＲ１」は、ウエスタンブロットによって検出されたＮＭＤＡＲ複合体を、「ＦＷＢ／Ｈａｌｏ」は、ファーウエスタンブロットによって検出されたＨＴタウオリゴマーを示す。ＮＭＤＡＲ複合体は、８００ｋＤａ付近と１１００ｋＤａ付近に検出され、そのどちらにもＨＴタウオリゴマーが相互作用していることが確認された。この結果から、タウオリゴマーがＮＭＤＡＲに高い選択性により直接的に相互作用することが示唆された。

（７－３）ＮＭＤＡＲに直接的に相互作用するタウオリゴマーの特定
上記（７－１）の手順により調製された膜タンパク質溶液を上記洗浄バッファーにより１６倍希釈したものを、ニトロセルロース膜にスポットした（１．５μｌ／スポット）。その後、膜を十分に乾燥させ、ＮＭＤＡＲを含む膜タンパク質を固定したニトロセルロース膜を得た。一方で、上記（１－４）のＨＴタウオリゴマーサンプルの調製過程で得られる超遠心前の反応液を、ゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ ｃｏｌｕｍｎ、ＧＥヘルスケア）により分画し（流速０．５ｍｌ／分、１ｍｌずつ分画）、種々のサイズのタウオリゴマー画分を得た。得られたタウオリゴマー画分のそれぞれを、ＮＭＤＡＲを含む膜タンパク質を固定したニトロセルロース膜に曝露し、上記（７－２）におけるタウオリゴマーの検出手順と同様にして、ニトロセルロース膜に吸着したタウオリゴマーを検出した。

結果を図１１および１２に示す。図１１（ａ）は、タウオリゴマー画分６～１０についてのドットブロットの結果を示し、（ｂ）は、（ａ）の結果を定量化したグラフを示し、（ｃ）は、２８０ｎｍの吸光度から推定された各画分のタウオリゴマーの相対度数に対して（ｂ）の結果を標準化したグラフを示す。この結果から、画分７および８に含まれる比較的小型のタウオリゴマー（ＬＭＷ ＴａｕＯ）が、画分６に含まれるより大きなタウオリゴマー（ＨＭＷ ＴａｕＯ）や、画分９および１０に含まれるタウモノマーおよびダイマーと比較して、ＮＭＤＡＲに対する結合活性が高いことが示された。また、図１２は、画分６および８についてのブルーネイティブＰＡＧＥ／ウエスタンブロット（一次抗体：ＴａｕＣ（Ｄａｋｏ、＃Ａ００２４）（１：２０００希釈））の結果を示す。画分６においては１３０００ｋＤａ以上の、画分８においては８００ｋＤａ付近に、強いシグナルが確認された。８００ｋＤａのタウオリゴマーは、タウモノマーおよびＨＴタウモノマーの平均分子量に基づいて、約１０マーであると推定された。

（７－４）膜タンパク質ベースのサンドイッチＥＬＩＳＡによるタウオリゴマーとＮＭＤＡＲとの直接的相互作用の評価
上記（７－１）の手順により、タウノックアウト脳より得られた膜タンパク質のペレットを、２％コール酸または１％デオキシコール酸／バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、４℃、１５０，０００×ｇで３０分間遠心し、上清を回収し、膜タンパク質溶液とした。得られた膜タンパク質溶液をＥＬＩＳＡ用プレート（住友ベークライト株式会社、ＭＳ－８５９６Ｆ）に供し、４℃で６０分間インキュベートし、プレートを膜タンパク質によりコートした。洗浄液（０．００４～０．００８％のＭＮＧ－３、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）により洗浄後、１％ＦＢＳ含有洗浄液を加え、４℃で６０分間インキュベートすることによりブロッキングした。タンパク質コンセントレータ（１０Ｋ ＭＷＣＯ、Ｐｉｅｒｃｅ、８８５２６）用いて、上記（１－４）で調製したＨＴタウオリゴマーサンプルの溶媒を洗浄液に交換し、１０^－１６～１０^－６ｇ／ｍｌのタウオリゴマー溶液を調製した。これらの溶液をプレートに供し、４℃で１５～６０分間インキュベートした。その後、洗浄液によりよく洗浄し、５％脱脂粉乳含有洗浄液を加え、室温で３０分間インキュベートすることによりブロッキングした。洗浄液を用いて洗浄後、抗ＨａｌｏＴａｇ抗体／洗浄液（１：１０００希釈）を加え、室温で３０分間インキュベートした。その後、洗浄液により洗浄し、ＨＲＰ標識２次抗体／洗浄液（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２７０３６）（１：５０００希釈）を加え、室温で３０分間インキュベートした。その後、Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ溶液（サーモフィッシャー・サイエンティフィック、３４０２８）を用いて発色反応を行い、膜タンパク質に結合したタウオリゴマーを検出した。

結果を図１３に示す。タウオリゴマーの結合は、１０^－１１ｇ／ｍｌ以下の低濃度のタウオリゴマー溶液を供した場合でも検出され、さらに、１０^－８ｇ／ｍｌ以上のタウオリゴマー溶液を供した場合には、濃度依存的にタウオリゴマーの結合量が増加することが確認された。なお、ＮＭＤＡＲリガンド（グルタミン酸およびグリシン）の存在下では低濃度のタウオリゴマーの結合が減少したことから（データは省略）、タウオリゴマーはＮＭＤＡＲに結合しているものと推定された。

（７－５）ＮＭＤＡＲベースのサンドイッチＥＬＩＳＡによるタウオリゴマーとＮＭＤＡＲとの直接的相互作用の評価
ＮＭＤＡ受容体のＮＲ２ａおよびＮＲ２ｂの各サブユニットのＣ末端を認識する抗体溶液（抗ＮＲ２Ａ抗体（ＢＤバイオサイエンス、＃６１２２８６）／ＰＢＳ、および抗ＮＲ２Ｂ抗体（ＢＤバイオサイエンス、＃６１０４１６）／ＰＢＳ、各１：５００希釈）をＥＬＩＳＡ用プレートに供し、４℃で６０分間インキュベートし、プレートを抗体によりコートした。１％ＦＢＳ含有洗浄液を加え、４℃で６０分間インキュベートすることによりブロッキングした。タンパク質コンセントレータ（１００Ｋ ＭＷＣＯ、Ｐｉｅｒｃｅ、８８５２３）用いて上記（７－４）と同様の手順により溶媒を洗浄液に交換した膜タンパク質溶液をプレートに供し、４℃で１５～６０分間インキュベートすることにより、プレートにＮＭＤＡ受容体を固定した。ＨＴタウオリゴマーサンプルに代えて上記（１－３）で調製したタウオリゴマーサンプル、および抗ＨａｌｏＴａｇ抗体に代えて抗タウ抗体（ＴａｕＣ）を用いた以外は、上記（７－４）と同様の手順により、ＮＭＤＡ受容体に結合したタウオリゴマーを検出した。

結果を図１４に示す。１０^－１１ｇ／ｍｌ以下のタウオリゴマー溶液を供した場合に、タウオリゴマーのＮＭＤＡ受容体に対する結合が濃度依存的に増加した。

次いで、ＮＭＤＡ受容体のリガンド結合部位をブロックするペプチドであるコナントキンＧ（１０μＭ、ペプチド研究所）をタウオリゴマー溶液に添加した以外は、上記と同様にしてＮＭＤＡ受容体に対するタウオリゴマーの結合を検出した。結果を図１５に示す。図中、「ｐＴａｕＯ」は、タウオリゴマーのみの溶液、「ｐＴａｕＯ＋ＣｏｎＧ」は、コナントキンＧを添加したタウオリゴマー溶液を用いた場合の結果を示す。コナントキンＧがＮＭＤＡ受容体に対するタウオリゴマーの結合を阻害したことが示された。この結果から、タウオリゴマーはＮＭＤＡ受容体のリガンド結合部位に結合していることが確認された。

以上の結果から、タウオリゴマーはＮＭＤＡ受容体に特異的かつ直接的に結合するものであることが確認された。また、実際に、アルツハイマー病患者（男性、７５歳）および正常高齢者（男性、７１歳）由来の脳脊髄液サンプル（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社より入手、各１検体）を上記（７－５）と同様の手順により解析し、サンプル中のタウオリゴマーを定量したところ、アルツハイマー病患者のサンプルには３０ｐｇ／ｍｌ、正常高齢者のサンプルには１ｐｇ／ｍｌのタウオリゴマーが含まれることが確認された。この結果から、ＮＭＤＡ受容体に直接的に結合したタウオリゴマーを定量することにより、アルツハイマー病などのタウオパチーの診断が可能であることが示された。

（７－６）ＮＭＤＡＲ結合性タウオリゴマーの単離精製
上記（１－３）で調製したタウオリゴマーサンプルを４℃、１００，０００ｒｐｍで１時間超遠心し、種々のタウオリゴマーおよび繊維状重合体の混合物をペレットとして得た。得られたペレットに１００％ギ酸（ナカライテスク）を加え（終濃度８８％）、４℃で１時間インキュベートした。溶出されたリン酸化タウモノマーを、４℃、５０，０００ｒｐｍの遠心により回収し、凍結乾燥させた後、バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に溶解した。０．００２５ｍＭのチオフラビンＴ（シグマ・アルドリッチ、＃Ｔ３５１６－５Ｇ）を加えた以外は上記（１－３）と同様の手順によりタウオリゴマーを調製し、チオフラビンＴの取り込みを指標にタウの再オリゴマー化を確認した。

結果を図１６に示す。図中、「Ｔａｕ」はリン酸化タウモノマー＋チオフラビンＴ溶液、「ｎｏ－Ｔａｕ」はチオフラビンＴのみの溶液について同様の手順を行った結果（陰性対照）を示す。タウオリゴマーが再構成されたことが確認された。

また、タウオリゴマー溶液に代えて上記リン酸化タウモノマー溶液（２×１０^９ｇ／ｍｌに調製）を用いた以外は上記（７－４）と同様の手順により、タウオリゴマーのＮＭＤＡ受容体に対する結合を検出した。結果を図１７に示す。図１６で示されたオリゴマー化の経時変化に照らし合わせると、タウの高度な線維化の直前にタウオリゴマーの結合活性のピークがみられることが確認された。この結果から、ＮＭＤＡＲに対する結合性を指標として、強い神経毒性を発現するタウオリゴマーを単離精製できる可能性が示唆された。

Claims (24)

1. （１）候補化合物の存在下または非存在下でタウオリゴマーとＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体とを接触させるステップと、
   （２）前記タウオリゴマーの前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に対する直接的な結合を評価するステップと
   を含む、タウオパチーの治療薬または予防薬のスクリーニング方法。
2. 前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体が、４次構造を維持した状態で細胞膜またはリポソーム膜から分離されている、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体が、生理機能を維持した状態で細胞膜またはリポソーム膜上に含まれる、請求項１に記載の方法。
4. 前記タウオリゴマーまたは前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体が、固体支持体に固定されている、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記ステップ（２）が、ＥＬＩＳＡ、プロテインアレイまたは表面プラズモン共鳴分析により行われる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. （３）前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を介した細胞またはリポソームへのカルシウム流入を測定するステップをさらに含む、請求項３～５のいずれか１項に記載の方法。
7. （４）細胞またはリポソームへの膜タンパク質の取り込みを測定するステップをさらに含む、請求項３～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記タウオリゴマーが、２～４０個のタウタンパク質により構成される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記タウオリゴマーが、３～２０個のタウタンパク質により構成される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記タウオリゴマーが、２Ｎ４Ｒ型アイソフォームの番号付けで、３７３番目の位置に対応するアミノ酸以降のＣ末端領域にリン酸化されたアミノ酸を含むタウタンパク質を構成成分として含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記タウオリゴマーが、２Ｎ４Ｒ型アイソフォームの番号付けで、４０９番目、４１２番目、４１３番目および／または４１６番目の位置に対応するセリンがリン酸化されたタウタンパク質を構成成分として含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記タウオパチーが、アルツハイマー病、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症、認知症を伴う多系統タウオパチー（ＭＳＴＤ）、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ－１７）、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー（ＷＭＴ－ＧＧＩ）、またはタウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－ｔａｕ）である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. （１）被験者から単離された試料とＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体とを接触させるステップと、
    （２）ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に直接的に結合したタウオリゴマーを定量するステップとを含む、タウオパチーの検査方法。
14. 前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体が、４次構造を維持した状態で細胞膜またはリポソーム膜から分離されている、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体が、生理機能を維持した状態で細胞膜またはリポソーム膜上に含まれる、請求項１３に記載の方法。
16. 前記タウオリゴマーまたは前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体が、固体支持体に固定されている、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記ステップ（２）が、ＥＬＩＳＡ、プロテインアレイまたは表面プラズモン共鳴分析により行われる、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の方法。
18. （３）前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を介した細胞またはリポソームへのカルシウム流入を測定するステップをさらに含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。
19. （４）細胞またはリポソームへの膜タンパク質の取り込みを測定するステップをさらに含む、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記タウオリゴマーが、２～４０個のタウタンパク質により構成される、請求項１３～１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記タウオリゴマーが、３～２０個のタウタンパク質により構成される、請求項１３～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記タウオリゴマーが、２Ｎ４Ｒ型アイソフォームの番号付けで、３７３番目の位置に対応するアミノ酸以降のＣ末端領域にリン酸化されたアミノ酸を含むタウタンパク質を構成成分として含む、請求項１３～２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記タウオリゴマーが、２Ｎ４Ｒ型アイソフォームの番号付けで、４０９番目、４１２番目、４１３番目および／または４１６番目の位置に対応するセリンがリン酸化されたタウタンパク質を構成成分として含む、請求項１３～２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記タウオパチーが、アルツハイマー病、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症、認知症を伴う多系統タウオパチー（ＭＳＴＤ）、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ－１７）、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー（ＷＭＴ－ＧＧＩ）、またはタウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－ｔａｕ）である、請求項１３～２３のいずれか１項に記載の方法。

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