JP7315683B2 - Ｇｉｐ／ｇｌｐ１デュアルアゴニストを調製するためのプロセス - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

本発明は、ＧＩＰ／ＧＬＰ１デュアルアゴニストペプチド、チルゼパチド、またはそれらの薬学的に許容される塩を作製するためのプロセスおよび中間体を提供する。

糖尿病は、インスリン分泌、インスリン作用、またはその両方の欠陥に起因する高血糖症を特徴とする慢性疾患である。２型糖尿病（「Ｔ２Ｄ」）では、インスリン分泌不全およびインスリン抵抗性の組み合わされた効果は、上昇した血糖値と関連している。ＧＩＰ／ＧＬＰ１デュアルアゴニストであるチルゼパチドは、米国特許第９４７４７８０号（「７８０特許」）に記載され、請求されている。チルゼパチドは、Ｔ２Ｄの治療に役立ち得る。

ＵＳ９４７４７８０は、一般に、ペプチドおよびＧＩＰ／ＧＬＰ１デュアルアゴニストを作製するための方法を記載している。

商業的に望ましい純度を含む利点の組み合わせを有するチルゼパチドの生成のための改善された技術を可能にするためのプロセスおよび中間体が必要である。同様に、より少ない精製ステップでチルゼパチドを提供するための安定した中間体を含む、効率的で環境的に「グリーン」なプロセスが必要である。環境とオペレーターの両方の安全性を高めるために廃棄物の流れを最小限に抑えるチルゼパチド製造プロセスを提供するには、改善された技術も必要である。薬学上優れたチルゼパチドの大規模調製は、全体的な収率と純度に影響を与え得るいくつかの技術的課題を提示する。遷移金属の使用および／またはペプチド合成と不適合である過酷な反応条件を回避するためのプロセスが必要である。

本発明は、チルゼパチド（配列番号１）、またはその薬学的に許容される塩の製造に有用な新規の中間体およびプロセスを提供することによって、これらの必要性を満たすことを目指している。本発明の改善されたチルゼパチド製造プロセスは、高品質および純度を維持しながら、より少ないステップを有する効率的な経路を含む、進歩の組み合わせを具体化する中間体およびプロセス反応を提供する。重要なのは、改善されたプロセスと中間体が資源強度を減少させ、廃棄物の流れを最小限に抑えることである。

本明細書に記載の改善されたプロセスは、チルゼピチドの生成に有用な中間体の様々な実施形態を提供する。

本発明は、配列番号１７の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、配列番号１１の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、配列番号２２の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、配列番号２１の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、配列番号２０の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、配列番号２の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、配列番号４の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、配列番号７の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、配列番号１４の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、配列番号３３の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、配列番号３２の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、配列番号３４の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、配列番号３５の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、配列番号３６の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、配列番号３８の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、配列番号３９の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。

以下の式の化合物：

またはその薬学的に許容される塩を提供する。

以下の式の化合物：

またはその薬学的に許容される塩を提供する。

本発明は、ナノろ過を使用してチルゼパチドを調製するプロセスを提供する。

本発明は、配列番号２２の化合物の化合物、または薬学的に許容される塩を脱保護することを含む、チルゼパチドを調製するためのプロセスを提供する。

リシンアミノ酸およびＮ末端が保護されているリシンアミノ酸を選択的にアシル化するプロセスを提供する。樹脂に結合したペプチド－リジン－ＮＨ_２をｔ－ブチル－エイコサンジオイル－Ｇｌｕ－（Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチル）－（８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸）－（８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸）－ＯＨ）とカップリングさせることを含む、ペプチド中のリジンアミノ酸を選択的にアシル化するプロセスを提供する。配列番号２２の化合物またはその薬学的に許容される塩を脱保護することを含む、チルゼパチドを調製するためのプロセスを提供する。

脱保護溶液がジチオスレイトール、トリイソプロピルシラン、およびトリフルオロ酢酸を含む、チルゼパチドを脱保護するためのプロセスを提供する。

樹脂に結合したペプチド－リジン－ＮＨ_２が、以下の式の化合物：

またはその薬学的に許容される塩である、リジンアミノ酸を選択的にアシル化するプロセスを提供する。

デプシペプチド異性体を約ｐＨ７～約ｐＨ１０の間のｐＨに調整することと、デプシペプチド異性体をｐＨ７～ｐＨ１０で少なくとも１時間インキュベートすることとを含む、デプシペプチド異性体を所望のペプチドに変換するプロセスを提供する。

デプシペプチド異性体を約ｐＨ８．５～約ｐＨ９．５に調整する、デプシペプチド異性体を変換するプロセスを提供する。

デプシペプチド異性体が配列番号４０の化合物、またはその薬学的に許容される塩である、デプシペプチド異性体を変換するプロセスを提供する。

ペプチドをラジカル開始剤と接触させることを含むラジカルベースの脱硫を提供する。一実施形態では、脱硫は、脱硫に適したペプチドを水溶性ラジカル開始剤と接触させることを含む。一実施形態では、ラジカル開始剤は、アゾ開始剤である。一実施形態では、ラジカル開始剤は、２，２’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］二塩酸塩（ＶＡ－０４４）および２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＶＡ－０５０）からなる群から選択される。

本明細書で提供されるラジカルベースの脱硫法は、環境的に望ましく、遷移金属を含まず、ペプチド合成と適合する条件である。

本明細書で使用する場合、以下の略語は本明細書に記載の意味を有する：「ＳＰＰＳ」は固相ペプチド合成を意味し、「Ｆｍｏｃ」はフルオレニルメチルオキシカルボニルクロリドを意味し、「Ｐｉｐ」はピペリジンを意味し、「ＤＩＣ」はジイソプロピルカルボジイミドを意味し、「Ｏｘｙｍａ」はエチルシアノヒドロキシイミノアセテートを意味し、「ＤＣＭ」はジクロロメタンを意味し、「ＩＰＡ」はイソプロパノールを意味し、「ＭＴＢＥ」はメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルを意味し、「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸を意味し、「ＴＩＰＳ」はトリイソプロピルシランを意味し、「ＤＴＴ」はジチオスレイトールを意味し、「ＵＰＬＣ」は超高速液体クロマトグラフィーを意味し、「ＨＦＩＰ」はヘキサフルオロイソプロパノールを意味し、「ＣＴＣ」はクロロトリチルを意味し、「ＨＡＴＵ」は（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェートを意味し、「ＴＦＥＴ」は２，２，２－トリフルオロエタンチオールを意味し、「ＤＩＥＡ」はＮ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを意味し、「ＡＥＥＡ」は１７－アミノ－１０－オキソ－３，６，１２，１５テトラオキサ－９－アザヘプタデカン酸を意味し、「ＴＣＥＰ」はトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンを意味し、「ＤＣＵ」はジシクリヘキシル尿素を意味し、「ＤＣＣ」はジシクロヘキシルカルボジイミドを意味し、「ＴＭＳＡ」はトリメチルシリルアミドを意味し、「ＨＯＢｔ」はヒドロキシベンゾトリアゾールを意味し、「ＨＲＭＳ」は高分解能質量分析を意味し、「ＬＰＰＳ」は液相ペプチド合成を意味し、「ＭＳＭＰＲ」は混合生成物混合懸濁反応器を意味し、「ＭＰＡ」は移動相Ａを意味し、「ＭＰＢ」は移動相Ｂを意味し、「Ｌ－ＧＳＨ」はＬ－グルタチオン還元溶液を意味し、「ＴＺＰ」はチルゼパチドを意味し、「ＡＰ」は医薬品有効成分を意味し、「ＡＰＩ」は活性医薬品成分を意味し、「ＰｙＢＯＰ」は（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを意味し、「ＤＥＡ」はジエチルアミンを意味し、「ＴＢＴＵ」は２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルアミニウムテトラフルオロボレートを意味し、「ＴＮＴＵ」は２－（５－ノルボルネン－２，３－ジカルボキシイミド）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートを意味し、「ＰｙＯｘｉｍ」は１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを意味し、「ＰｙＣｌｏｃｋ」は６－クロロ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリス－ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを意味する。本明細書に示すように、アミノ酸の１文字の略語は、太字で示され、原子は、１文字のアミノ酸の略語と区別するために、太字ではないテキストとして、通常は小さいフォントで示される。本明細書で使用する場合、アミノ酸の略語がアミノ酸より上の番号で現れる場合、その番号は、最終的なチルゼパチド生成物中の対応するアミノ酸の位置を指す。番号は利便性のために提供されており、配列におけるそのような番号の出現または非出現は、そのような配列に示されるアミノ酸配列またはペプチドに影響を与えない。本明細書で使用する場合、「保護された」という用語は、保護基が示された位置に結合していることを意味する。当業者は、様々な保護基がよく知られており、代替の保護基が特定のプロセスに適している可能性があることを認識するであろう。

当業者は、本明細書に提示されるペプチドを構築するための代替樹脂が存在することを理解するであろう。例えば、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂およびＲｉｎｋアミド樹脂は、本明細書に開示されるペプチドを調製するために当業者によく知られているが、本明細書に記載のペプチドの調製のために代替の樹脂を選択してもよい。例えば、これに限定されないが、２－ＣＴＣおよび関連する樹脂を使用して、目標ペプチドを調製し、続いてＣ末端アミド化ステップを行うことができる。

固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）ビルドは、自動ペプチドシンセサイザーとのシーケンシャルカップリングを利用した標準的なフルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド（Ｆｍｏｃ）ペプチド化学技術を使用して実現される。樹脂をＤＭＦで膨潤させた後、２０％ピペリジン（Ｐｉｐ）／ＤＭＦを使用して脱保護する（３ｘ３０分間）。その後のＦｍｏｃ脱保護では、２０％Ｐｉｐ／ＤＭＦの３ｘ３０分間の処理が使用され、より困難なカップリングの場合、４ｘ３０分間の処理が使用される。脱保護後、樹脂を１０倍量のＤＭＦ洗浄液で５ｘ２分間、洗浄する。アミノ酸の予備活性化では、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）／シアノヒドロキシイミノ酢酸エチル（Ｏｘｙｍａ）ＤＭＦ溶液を室温で３０分間使用する。活性化アミノ酸の樹脂結合ペプチドへのカップリングは、個々のアミノ酸ごとに指定された時間発生する。各カップリングの後に、１０体積のＤＭＦによる溶媒洗浄を５ｘ２分間行なう。最終生成物を単離するために、樹脂結合生成物を１０体積のＤＣＭで５ｘ２分間洗浄して、ＤＭＦを除去する。樹脂を１０体積のＩＰＡで２ｘ２分間洗浄してＤＣＭを除去し、１０体積のメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で５ｘ２分間洗浄した後、生成物を４０℃で真空乾燥する。樹脂結合生成物は、冷蔵保存する（－２０℃）。分析のために、ペプチドを、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ_２Ｏ／ＴＩＰＳ（トリイソプロピルシラン）／ＤＴＴ（ジチオスレイトール）からなる酸性カクテルを使用して、以下の比率（０．９３ｖ／０．０４ｖ／０．０３ｖ／０．０３ｗ）で樹脂から切断する。樹脂をＤＣＭで膨潤させ（４～５ｍＬ、３ｘ３０分間）、ドレーンさせる。事前に膨潤させた樹脂に切断カクテル（４～５ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で２時間撹拌する。溶液をろ過し、次いで樹脂を少量のＤＣＭで洗浄し、切断溶液と混合する。得られた溶液を７～１０倍量の冷（０℃）メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）に注ぐ。懸濁液を０℃で３０分間熟成させ、次いで得られた沈殿物を遠心分離し、透明な溶液をデカントする。残留物を同量のＭＴＢＥに懸濁し、得られた懸濁液を再度遠心分離してデカントする。沈殿したペプチドの透明なＭＴＢＥ溶液をデカントした後、４０℃で一晩真空乾燥させる。

調製物１の合成：
配列番号２
合成では、０．７１ｍｍｏｌ／ｇの負荷でＦｍｏｃ－Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂を使用する。一般的なＳＰＰＳ手順を、以下の変更を加えて使用する。

調製物１ソフト切断：１０個の同一の脱保護反応を、以下のプロトコルを使用して、それぞれ約０．５ｍｍｏｌスケールの樹脂結合調製物１に対して並行して行う。１）４０ｍＬフリットリアクターに、１．５５ｇ（約０．５ｍｍｏｌ）の樹脂結合調製物１を加える。２）３ｘ１５ｍＬのＤＭＦ（各１５分間）で膨潤させる。３）３ｘ１５ｍＬ（各３０分間）の２０％Ｐｉｐ／ＤＭＦで処理する。４）４ｘ１５ｍＬのＤＭＦ、続いて４ｘ１５ｍＬのＤＣＭで洗浄する。５）５つの４０ｍＬ反応バイアルのそれぞれに１．５ｍＬのＴＦＡと２８．５ｍＬのＤＣＭを添加する。６）各ＴＦＡ溶液バイアルに調製物１樹脂結合（２．７５ｇ）の５分の１を添加してバイアルにふたをかぶせ、ロータリーホイールで５分間混合する。７）混合物をろ過し、１００ｍＬのＤＣＭで洗浄して、ろ液の総量を５００ｍＬにする。８）ろ液を合わせ、１０００ｍＬのＭＴＢＥが入っている丸底フラスコに移す。９）得られた懸濁液を淡黄色の油に濃縮し、２００ｍＬのＭＴＢＥで粉砕し、氷浴で３０分間冷却する。１０）固体をろ過し、５０ｍＬの冷ＭＴＢＥで洗浄し、３３℃の真空オーブンで一晩乾燥させて、５．３５ｇ（９１％収率）の白色固体を生成する。ＵＰＬＣを使用する分離した固体の分析（９８．５７面積％、合せたｔ－Ｂｕ脱保護副産物０．９９％）。

調製物２の合成：
配列番号３
合成では、０．６１ｍｍｏｌ／ｇの負荷でＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ２－ＣＴＣ樹脂を使用する。一般的なＳＰＰＳ手順を、以下の変更を加えて使用する。

調製物２ソフト切断：４０ｍＬのガラスシンチレーションバイアルに、樹脂に結合した調製物２（３．０６ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）と３０ｍＬの３０％ＨＦＩＰ ＤＣＭ溶液を添加すると、溶液が赤色に変化するのが観察される。バイアルを周囲温度で、ロータリーホイール上で１時間回転させて、撹拌する。樹脂をろ過して取り除き、３ｘ１０ｍＬのＤＣＭで洗浄する。真空下で溶媒を除去してガラス状の泡（３５℃浴、１０トル、２．３４ｇ）を形成し、少量のＩＰＡ（２４ｍＬ）と交換してから、室温で水（２４ｍＬ）を２５分かけて滴下する。得られた溶液を３０分間撹拌し、次いでろ過する。３ｘ１０ｍＬのＨ_２Ｏケーキを洗浄し、次いで洗浄したものを２５トル、３５℃の真空オーブンで一晩乾燥させる。これにより、調製物２が白色の固体（１．８１ｇ）として生成される。

調製物４の合成：
配列番号４
合成では、０．６８ｍｍｏｌ／ｇの負荷でＦｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ２－ＣＴＣ樹脂を使用する。一般的なＳＰＰＳ手順を、以下の変更を加えて使用する。

調製物４ソフト切断：２０ｍＬのガラスシンチレーションバイアルに、樹脂に結合した調製物４（２．０ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）と１０ｍＬの３０％ＨＦＩＰ ＤＣＭ溶液を添加すると、溶液が赤色に変化するのが観察される。周囲温度でバイアルをロータリーホイール上で回転させて攪拌し、次いで樹脂をろ過して取り除き、３ｘ２ｍＬのＤＣＭで洗浄し、真空下で溶媒を除去してガラス状の粘着性のある泡を形成する。泡を５．２ｍＬのＤＭＳＯに溶解する。この溶液に６ｍＬの水を等流量（温度約１５℃）で４５分間かけて添加し、１ｍＬの水を添加する。ペプチド溶液を完全に添加したら、４５分間かけてさらに６ｍＬの水を添加する。添加すると白色の固体が沈殿する。得られたスラリーを１５℃で３０分間撹拌する。固体をろ過し、６ｍＬの水で洗浄し、次いで３５℃、２５トルの真空オーブンに移す。これにより、調製物４（Ｂｏｃ－１－１４－ＯＨ、１．０７６３ｇ）が白色のふわふわした固体として得られる。

ＬＰＰＳによる調製物３の合成：
配列番号５
２０ｍＬのガラスシンチレーションバイアルに、調製物２（５００ｍｇ、０．１８３ｍｍｏｌ）、調製物１（１７９ｍｇ、０．１７５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＳＯ（１０ｍＬ）を入れる。この溶液にＤＩＥＡ（４６μＬ、０．２６５ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）（１２３ｍｇ、０．２３０ｍｍｏｌ）を添加する。反応物を２時間撹拌し、次いでジエチルアミン（ＤＥＡ）（１８３マイクロリットル、１．７７ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を２時間撹拌する。反応の内容物を注射器に引き入れ、攪拌した５０ｍＬフラスコに添加し、同時に水（１２ｍＬ）を１時間かけて滴下する。添加が完了したら、沈殿した生成物をろ過によって収集し、続いて水（２ｘ４ｍＬ）で洗浄する。ウェットケーキを真空下、３５℃で１８時間乾燥させて、調製物３を白色固体として得た（０．６００３ｇ、８８％収率、Ｃ_１８４Ｈ_２６１Ｎ_３１Ｏ_３８のＨＲＭＳ計算予測値３５１２．９４４４、実測値３５１２．９４３０）。

ＬＰＰＳによる調製物５の合成：
配列番号６

２０ｍＬのガラスシンチレーションバイアルに、調製物３（３３８．８ｍｇ、０．０９１ｍｍｏｌ）、調製物４（１９２．１ｍｇ、０．０９１ｍｍｏｌ）およびＤＭＳＯ（１０ｍＬ）を入れる。この溶液に、ＰｙＢＯＰ（６３．５ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ）、続いてＤＩＥＡ（７９マイクロリットル、０．４５４ｍｍｏｌ）を添加する。反応液を２．５時間攪拌する。反応の内容物を注射器に引き込み、撹拌された５０ｍＬフラスコに内容物を添加し、同時に水（１２ｍＬ）を１時間かけて滴下する。添加が完了したら、沈殿した生成物をろ過によって収集し、続いて水（２ｘ４ｍＬ）で洗浄する。ウェットケーキを真空下、３５℃で１８時間乾燥させて、調製物５を白色固体として得た（０．３５６８ｇ、７０％収率、Ｃ_２９３Ｈ_４３５Ｎ_４５Ｏ_６４のＨＲＭＳ計算予測値５６０８．２１６８、実測値５６０８．２０６６）。

方法１による調製物６の合成（ＬＰＰＳ）

エイコサン二酸、モノ（１，１－ジメチルエチル）エステル（１５．０ｋｇ、限定反応物質）およびＮ－ヒドロキシ－スクシンイミド（１．２当量）を酢酸エチルに２７℃で溶解する。酢酸エチルに溶解したＤＣＣ（１．２５当量）の溶液を添加し、反応物を２２℃で２４時間撹拌する。得られたＤＣＵ副産物をろ過して取り除き、５％ＮａＣｌ水溶液で有機相を３回抽出する。抽出後、有機相を濃縮し、イソプロパノールと共蒸発させ、ヘプタンを添加することにより結晶化する。ろ過後、ろ過ケーキをヘプタンですすぎ、２５℃で乾燥させて、１７．０ｋｇのＩＮＴ１を８７％の収率および９９％の純度で得る。

Ｈ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ（７．７ｋｇ、１．１当量）をＤＣＭ（５４Ｌ）に２０℃で溶解し、次いでＤＣＭ（７Ｌ）に溶解したＴＭＳＡ（１１．３ｋｇ）の溶液を添加し、反応混合物を４０℃で１時間撹拌する。ＩＮＴ１（１７．０ｋｇ）ＤＣＭ溶液を室温で添加し、８時間攪拌する。反応が完了した後、ＤＣＭを蒸留により酢酸エチルに交換する。有機相を２％水溶液で３回洗浄する。次いで２％ＮａＣｌ水溶液とともにＫＨＳＯ_４／ＮａＣｌ水溶液で４回洗浄する。水相を分離、除去した後、有機相をイソプロパノールで濃縮し、イソプロパノールで希釈し、水を添加することにより結晶化する。ろ過後、ろ過ケーキを水／イソプロパノールの混合物で洗浄し、３０℃で乾燥させて、１７．３ｋｇのＩＮＴ２を８６％の収率と９９％の純度で生成する。

ＩＮＴ２（１７．３ｋｇ）およびＮ－ヒドロキシ－スクシンイミド（４．１ｋｇ、１．２当量）を酢酸エチル（３３６ｋｇ）に２７℃で溶解する。酢酸エチルにＤＣＣ（８．３３ｋｇ、１．２５当量）の溶液を添加し、反応物を２２℃で２４時間撹拌する。結果として生じるＤＣＵ副産物をろ過して取り除く。有機相を濃縮し、イソプロパノールと共蒸発させ、次いでイソプロパノール溶液（約１２５Ｌ）を冷却することにより結晶化する。その後、ろ過ケーキを冷イソプロパノールですすぎ、２５℃で乾燥させて、８１％の収率と９６％の純度で１６．３ｋｇのＩＮＴ３を得る。

１７－アミノ－１０－オキソ－３，６，１２，１５テトラオキサ－９－アザヘプタデカン酸（ＡＥＥＡ２）（８．１ｋｇ、２６．３ｍｏｌ）をＤＣＭ（５４Ｌ）に２２℃で懸濁し、ＴＭＳＡ（７．６８ｋｇ、５９．９ｍｏｌ）をＤＣＭ（６．２Ｌ）に溶解し、反応混合物を４０℃で１時間撹拌する。ＩＮＴ３（１６ｋｇ）をＤＣＭ（３１Ｌ）に３５℃で懸濁し、ＴＭＳ保護（ＡＥＥＡ２）混合物に２２℃で添加する。反応物を１２時間撹拌し、反応完了後、混合物を濃縮し、次いで酢酸エチルに交換する。有機相を２％水溶液で３回洗浄する。ＫＨＳＯ_４／ＮａＣｌ水溶液（約２００Ｌ）、次いで２％ＮａＣｌ水溶液（約２００Ｌ）で４回洗浄し、目標ｐＨを４．５にする。有機相を濃縮し、アセトニトリルに交換する。アセトニトリル溶液を－２０℃に冷却し、得られた懸濁液を－２０℃で１５時間熟成させる。混合物をろ過し、ろ過ケーキを冷アセトニトリルですすぎ、０℃未満で乾燥させて、１８．４ｋｇの調製物６（８８％収率）を９６％純度で得る。全体の収率＝５３％。

方法２による調製物６の合成（ＳＰＰＳ）
あるいは、調製物６は、ペプチドシンセサイザーを使用する固相ペプチド合成を使用して調製され得る。

標準のカップリング手順を利用する。

標準のカップリング条件：
０．１３３Ｍ、２．０当量のＨＡＴＵ、５．０当量のＤＩＥＡ、周囲温度、３時間、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３ｘ１５分間脱保護。

樹脂充填：
２－ＣＴＣ樹脂上のＦｍｏｃＮＨ－ＡＥＥＡ（０．９９ｍｍｏｌ／ｇ）：各並行反応で１．０１ｇ。

ＤＭＦ膨潤、それに続くＰｉｐ／ＤＭＦ；ＤＭＦ洗浄；アミノ酸、ＤＩＥＡ、ＨＡＴＵ混合；およびＤＭＦ洗浄サイクルとそれに続く乾燥を使用する自動プログラム。

合わせたロットを３０％ＨＦＩＰ／ＤＣＭ（２４０ｍＬ）で１．５時間撹拌することにより、樹脂を切断する。樹脂をろ過、洗浄し、溶媒をろ液から真空下で除去する。得られた油をアセトニトリルに溶解し、溶媒を再び除去する。この操作により、３０．４７ｇ（理論収率の１４６％）の粘稠な黄色の油が得られ、ＵＰＬＣ分析により５２．３面積％の所望の生成物が含まれる。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（５００グラムのシリカゲル、８５％ＤＣＭ／１０％メタノール／５％酢酸で溶出、３８×１００ｍＬの画分を収集する）によって精製する。以前にクロマトグラフィーにかけられた濃縮物（１７．９４ｇ）を、結晶化して、９１．６５面積％のＵＰＬＣ純度で、１３．４ｇ（７４．７％の収率）を得る。

実施例１

合成例１
配列番号１
第１のＨＰＬＣバイアルに、調製物５（１０．５ｍｇ、０．００１８７ｍｍｏｌ）とＤＣＭ（２００μＬ、２０Ｌ／ｋｇ）を入れる。この溶液に、フェニルシラン（ＤＣＭに溶解した０．８１Ｍ、２２．１μＬ、０．０１７８ｍｍｏｌ）とテトラキス（トリフェニルホスフィン）－パラジウム（０）（ＤＣＭに溶解した０．８Ｍ、２２．１μＬ、０．０００６４ｍｍｏｌ）の溶液を添加する。溶液を２４℃で１時間撹拌して、調製物７の非単離溶液（配列番号７）を得る。２番目のＨＰＬＣバイアルに、ＤＣＭ（１５０μＬ）、続いて調製物６（ＤＣＭで０．１１８Ｍ、１６μＬ、０．００１８９ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（ＤＣＭで０．１８６Ｍ、１６μＬ、０．００２９８ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（ＤＣＭで０．５７３Ｍ、５当量）を添加する。第２のバイアルの内容物を第１のバイアルに加え、反応物を１時間撹拌して、調製物８（配列番号８）の非単離溶液を得る。調製物８の溶液を真空下で濃縮し、得られた固体に、トリフルオロ酢酸（４．６５ｍＬ）、トリイソプロピルシラン（２０μＬ）およびＤＴＴ（２０ｍｇ）の溶液５０μＬを添加する。スラリーを１８時間撹拌し、ＨＰＬＣでモニターして、実施例１の形成を確認する（Ｃ_２２５Ｈ_３４８Ｎ_４８Ｏ_６８のＨＲＭＳ計算予測値４８１０．５２４９、実測値４８１０．５２５７）。

調製物９の合成
配列番号９
Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂（１３．４２ｇ、０．７５ｍｍｏｌ／ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１３０ｍＬ、１０ｖｏｌ）に約２０分間懸濁し、次いでドレーンさせる。得られた樹脂をＤＭＦ（８０ｍＬ、６ｖｏｌ）で約５分間洗浄する。Ｆｍｏｃアミノ酸樹脂を５ｖｏｌ％ピペリジン、１．２５ｖｏｌ％ＤＢＵ、１．０ｗｔ％ＨＯＢｔ／ＤＭＦ溶液（８０ｍＬ、６ｖｏｌ）でそれぞれ２回、１０分間、２０分間処理してＦｍｏｃ基を除去する。脱Ｆｍｏｃ溶液をドレーンさせた後、ＤＭＦ（８０ｍＬ、６ｖｏｌ）で２回、ＭＴＢＥ（８０ｍＬ、６ｖｏｌ）で２回、再びＤＭＦ（８０ｍＬ、６ｖｏｌ）で２回洗浄する。

標準のＦｍｏｃ化学を使用して、アミノ酸鎖集合を行う。一般に、１．５当量のＦｍｏｃ－アミノ酸とＨＯＢｔ（２．４７ｇ、２０％水湿、１４．６ｍｍｏｌ、１．４６当量）をＤＭＦ（６０ｍＬ、４．５ｖｏｌ）に溶解し、続いてＤＩＥＡ（１．９４ｍＬ、１１．１ｍｍｏｌ、１．１１当量）を添加する。得られた溶液を氷浴で５℃未満に冷却し、ＴＢＴＵ（４．８３ｇ、１５．０ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加して活性化する。０℃～５℃で約５分間放置する。ＤＣＭ（６０ｍＬ、１．５ｖｏｌ）を樹脂に添加し、続いて活性化Ｆｍｏｃ－アミノ酸溶液を添加する。得られた混合物をほぼ周囲温度で２時間撹拌する。脱Ｆｍｏｃ手順を繰り返し、残りのアミノ酸と順番にカップリングする。最後の脱Ｆｍｏｃ手順が完了したら、樹脂を２－プロパノール（１３０ｍＬ、１０ｖｏｌ）で５分間２回洗浄し、続いてＭＴＢＥ（１３０ｍＬ、１０ｖｏｌ）で６回洗浄する。樹脂を３５℃で真空乾燥させ、調製物９－Ｓｅｉｂｅｒ（２１．２１ｇ、０．４３５ｍｍｏｌ／ｇ理論、質量増加に基づいて９１．７％の収率）が得られる。

調製物９樹脂複合体の一部（１０．１５ｇ、０．４３５ｍｍｏｌ／ｇ、４．４１ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１０１ｍＬ、１０ｖｏｌ）溶液中の５ｖｏｌ％ＴＦＡおよびＤＣＭの洗浄ステップで処理する。切断画分および洗浄液をＤＩＥＡ（２６．２９ｇ、３５．５ｍＬ、ＴＦＡに対して１．０１：１のモル比）で中和する。画分を合わせ、真空下で元の体積の５０％まで濃縮する。飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２×９４ｍＬ）でＤＣＭ溶液を洗浄する。得られた溶液を無水ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ガム状固体を得るまで濃縮乾固させる。このガム状の固体を５℃未満のＭＴＢＥ（１００ｍＬ）で再スラリー化してガムを分解し、白色のスラリー生成物を得る。調製物９で得られた白色粉末のスラリーをろ過、洗浄して、乾燥させて、白色の粉末を得る（３．８４ｇ、９２．３面積％、３７．８ｗｔ％ＤＩＥＡ・ＴＦＡ、５７．４ｗｔ％、２．２９ｍｍｏｌ、５１．９％収率、Ｃ_４６Ｈ_７８Ｎ_１０Ｏ_１２のＨＲＭＳ計算予測値９６２．５８０１、実測値９６２．５８０６）。

調製物１０の合成
配列番号１０
Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｏ－２ＣＴＣ樹脂複合体（１８．０９ｇ、０．５７ｍｍｏｌ／ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１８０ｍＬ、１０ｖｏｌ）に２０分間懸濁し、次いでドレーンさせる。得られた樹脂をＤＭＦ（１０８ｍＬ、６ｖｏｌ）で５分間洗浄する。Ｆｍｏｃアミノ酸樹脂を５ｖｏｌ％ピペリジン、１．２５ｖｏｌ％ＤＢＵ、１．０ｗｔ％ＨＯＢｔ／ＤＭＦ溶液（１０８ｍＬ、６ｖｏｌ）でそれぞれ２回、１０分間、２０分間処理してＦｍｏｃ基を除去する。脱Ｆｍｏｃ溶液をドレーンさせ、樹脂をＤＭＦ（１１０ｍＬ、６ｖｏｌ）で２回、ＭＴＢＥ（１１０ｍＬ、６ｖｏｌ）で２回、ＤＭＦ（１１０ｍＬ、６ｖｏｌ）で２回洗浄する。標準のＦｍｏｃ化学により鎖集合を行う。

アミノ酸のカップリングのために、一般に１．５当量のＦｍｏｃ－アミノ酸とＨＯＢｔ（２．５４ｇ、２０％水湿、１５．０ｍｍｏｌ、１．５当量）をＤＭＦ（８０ｍＬ、４．４ｖｏｌ）に溶解し、続いてＤＩＥＡ（１．９４ｇ、１５．０ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加してアミノ酸のカップリングをもたらす。得られた溶液を氷浴で０～５℃に冷却し、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルアミニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）（４．８４ｇ、１５．１ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加して活性化する。０～５℃で５分間放置する。次いで、ＤＣＭ（３５ｇ、１．５ｖｏｌ）を樹脂に添加し、続いて活性化Ｆｍｏｃ－アミノ酸溶液を添加する。得られた混合物を室温で２時間撹拌する。合成ステップの完了後、ペプチド樹脂を２－プロパノール（１８０ｍＬ、１０ｖｏｌ）で５分間２回洗浄し、次いでＭＴＢＥ（１８０ｍＬ、各１０ｖｏｌ、６回）で洗浄した後、３５℃で乾燥させ、調物製１０樹脂複合体を得る（２５．５２ｇ、０．２１６ｍｍｏｌ／ｇ、５３．６％収率）。

調製物１０樹脂複合体の一部（１０．０７５ｇ、０．２１６ｍｍｏｌ／ｇ、２．１８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１００ｍＬ、１０ｖｏｌ）溶液中の１ｖｏｌ％ＴＦＡで３回処理し、ＤＣＭ（７５ｍＬ、７．５ｖｏｌ）で洗浄する。切断画分を中和し、ピリジンで洗浄する（３．１８ｇ、ＴＦＡに対して１．０１：１のモル比）。真空下で画分を合わせて濃縮し、３５℃以下で乾燥させる。エタノール（４０ｍＬ、合わせたろ液の１０％ｖｏｌ）で再構成を行い、続いて濃縮乾固する。最終的に、ペプチドを脱イオン水（１５０ｍＬ、合わせたろ液の４０％ｖｏｌ）中で撹拌しながら粉砕する。遠心分離により固体の粗ペプチド沈殿物を収集し、脱イオン水で２回（各１５０ｍＬ）洗浄する。固体をｎ－ヘプタンで２回（各１００ｍＬ）洗浄し、単離し、真空下、４０℃で乾燥させて、調製物１０（配列番号１０）をカリカリの淡黄色固体として得る（４．１０ｇ、７２．４面積％、３．０ｗｔ％ピリジン・ＴＦＡ、７０．２ｗｔ％、１．８５ｍｍｏｌ、８５．１％収率、Ｃ_８８Ｈ_１０３Ｎ_１１Ｏ_１５のＨＲＭＳ計算予測値１５５３．７６３５、実測値１５５３．７６５６）。

調製物１１の合成
配列番号１１
Ｈ－アラニン－Ｏ－２ＣＴＣ樹脂複合体（４０．３９ｇ、０．５ｍｍｏｌ／ｇ、２０．２０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（４００ｍＬ、１０ｖｏｌ）に約２０分間懸濁し、次いでドレーンさせる。得られた樹脂をＤＭＦ（４００ｍＬ、１０ｖｏｌ）で５分間２回洗浄する。標準のＦｍｏｃ化学を使用してアミノ酸鎖集合を行う。一般に、１．５当量のＦｍｏｃ－アミノ酸とＨＯＢｔ（５．５１ｇ、８０ｗｔ％、３２．６ｍｍｏｌ、１．６当量）をＤＭＦ（１５０ｍＬ、３．７ｖｏｌ）に溶解し、続いてＤＩＥＡ（４．２２ｇ、３２．７ｍｍｏｌ、１．６当量）を添加する。得られた溶液を氷浴で約５℃未満に冷却し、ＴＢＴＵ（１０．３９ｇ、３２．４ｍｍｏｌ、１．６当量）を添加して活性化させる。０～５℃で約５分間攪拌する。ＤＣＭ（８０ｍＬ、２ｖｏｌ）を樹脂に添加し、続いて活性化Ｆｍｏｃ－アミノ酸溶液を添加する。得られた混合物をほぼ周囲温度で２時間撹拌する。

Ｆｍｏｃアミノ酸樹脂を５ｖｏｌ％ピペリジン、１．２５ｖｏｌ％ＤＢＵ、１．０ｗｔ％ＨＯＢｔ／ＤＭＦ溶液（２４０ｍＬ、６ｖｏｌ）でそれぞれ２回、１０分間、２０分間処理してＦｍｏｃ基を除去する。脱Ｆｍｏｃ溶液をドレーンさせ、樹脂をＤＭＦ（２４０ｍＬ、６ｖｏｌ）で２回、ＭＴＢＥ（２４０ｍＬ、６ｖｏｌ）で２回、ＤＭＦ（２４０ｍＬ、６ｖｏｌ）で２回洗浄する。合成ステップの完了後、ペプチド樹脂を２－プロパノール（４００ｍＬ、１０ｖｏｌ）で２回、ＭＴＢＥ（各４００ｍＬ、１０ｖｏｌで６回）で完全に洗浄した後、真空下、３５℃で乾燥させて、最後のアミノ酸を差し引いた充填樹脂を得る（７４．８２ｇ、０．１５９ｍｍｏｌ／ｇ、１１．９０ｍｍｏｌ、５８．９％収率）。最後のアミノ酸であるＦｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨを樹脂の一部に別々に添加する（１３．６１ｇ、０．１５９ｍｍｏｌ／ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）。この樹脂をＤＭＦ（１３０ｍＬ、１０ｖｏｌ、３回）でそれぞれ５分以上膨潤させ、次いで（５．６ｇのピペリジン、１．６７ｇのＤＢＵ、１．３ｇのＨＯＢｔを１２０ｍＬのＤＭＦに溶解させて調製した１３０ｍＬ、１０ｖｏｌの脱保護混合物を２回）１０分間と２０分間脱保護する。樹脂をＤＭＦ（８０ｍＬ、６ｖｏｌ、２回）、ＭＴＢＥ（８０ｍＬ、６ｖｏｌ、２回）、ＤＭＦ（８０ｍＬ、６ｖｏｌ、２回）でそれぞれ５分間洗浄する。ＤＭＦ（５０ｍＬ、３．７ｖｏｌ）に溶解し、続いてＤＩＥＡ（０．５４ｇ、４．２ｍｍｏｌ、１．９当量をＦｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ（１．４７ｇ、４．１６ｍｍｏｌ、１．９当量）およびＨＯＢｔ（０．７０４ｇ、８０ｗｔ％、４．１７ｍｍｏｌ、１．９当量）のカップリングために）を添加する。得られた溶液を氷浴で５℃未満に冷却し、ＴＢＴＵ（１．３４ｇ、４．１７ｍｍｏｌ、１．９当量）を添加して活性化し、０～５℃で５分間撹拌する。ＤＣＭ（２０ｍＬ、１．５ｖｏｌ）を樹脂に添加し、続いて活性化Ｆｍｏｃ－アミノ酸溶液を添加する。得られた混合物をほぼ周囲温度で２時間撹拌する。この樹脂をＤＭＦ（１８０ｍＬ、１３ｖｏｌ、２回）、ＭＴＢＥ（１８０ｍＬ、１３ｖｏｌ、２回）、およびＤＭＦ（１８０ｍＬ、１３ｖｏｌ、２回）でそれぞれ５分間洗浄する。樹脂をＤＣＭ（１３０ｍＬ、１０ｖｏｌ、６回、各５分間）で洗浄してから、樹脂を真空下、３５℃で乾燥させ、充填樹脂を得る（１２．９０ｇ、０．２０３ｍｍｏｌ／ｇ、２．６２ｍｍｏｌ、１２１％収率）。

樹脂の一部（７．０９ｇ、０．２０３ｍｍｏｌ／ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ溶液（７０ｍＬ、１０ｖｏｌ）中の１ｖｏｌ％ＴＦＡで、ほぼ周囲温度でそれぞれ１０分間、３回処理した後、ＤＣＭ（５５ｍＬ、７．５ｖｏｌ）で洗浄する。切断画分を中和し、ピリジンで洗浄する（３．０２ｇ、ＴＦＡに対して１．０２：１のモル比）。真空下で画分を合わせて濃縮し、３５℃以下で乾燥させる。エタノール（２８ｍＬ、合わせたろ液の１１％ｖｏｌ）で再構成を行い、続いて濃縮乾固する。最終的に、ペプチドを脱イオン水（１０５ｍＬ、合わせたろ液の４０％ｖｏｌ）中で攪拌する。ろ過により固体の粗ペプチド沈殿物を収集し、脱イオン水（４ｘ５０ｍＬ）で洗浄する。固体をｎ－ヘプタン（３ｘ１００ｍＬ）で洗浄し、単離して真空下、４０℃で乾燥させて、調製物１１を白色粉末として得る（４．５４ｇ、８７．６面積％、４４．４ｗｔ％ピリジン・ＴＦＡ、４８．７ｗｔ％、０．９３６ｍｍｏｌ、６５．０％収率、Ｃ_１２７Ｈ_１９２Ｎ_１４Ｏ_２８のＨＲＭＳ計算予測値２３６１．４０３１、実測値２３６１．４０２１）。樹脂上での調製物１１の調製の全体的な収率は７１．３％である。

調製物１２の合成
配列番号１２
Ｆｍｏｃ－Ａｉｂ－Ｏ－ＣＴＣ樹脂複合体（１９．１６ｇ、０．５４ｍｍｏｌ／ｇ、１０．３５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１９０ｍＬ、１０ｖｏｌ）に２０分間懸濁し、次いで、ドレーンさせる。得られた樹脂をＤＭＦ（１９０ｍＬ、１０ｖｏｌ）で５分間洗浄し、次いで、ドレーンさせる。ピペリジン（７７．８２ｇ）、ＤＢＵ（２３．１６ｇ）、ＨＯＢｔ（１８．０９ｇ、８０ｗｔ％）、およびＤＭＦ（１８００ｍＬ）を混合し、脱保護溶液として５％ピペリジン、１．２５％ＤＢＵ、１．０％ＨＯＢｔ／ＤＭＦの溶液をもたらす。Ｆｍｏｃ－アミノ酸樹脂を脱保護溶液（１９０ｍＬ、１０ｖｏｌ）でそれぞれ２回、１０分間、２０分間処理して、Ｆｍｏｃ基を除去する。脱Ｆｍｏｃ溶液をドレーンさせ、樹脂をＤＭＦで２回、ＭＴＢＥで２回、ＤＭＦで２回洗浄する（各洗浄で１９０ｍＬ、１０ｖｏｌ）。

Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ（７．１１ｇ、１０．１ｍｍｏｌ、２．０当量）のＤＭＦ（８５ｍＬ）溶液にＤＩＥＡ（２．６２ｇ、２０．３ｍｍｏｌ、２．０当量）を添加する。得られた溶液を０～５℃に冷却し、６－クロロ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリス－ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＣｌｏｃｋ）（１１．３６ｇ、２０．０６ｍｍｏｌ、２．０当量）を添加し、完全に溶解する。３～５分間静置した後、ＤＣＭ（３０ｍＬ、１．５ｖｏｌ）であらかじめ膨潤させたＨ－Ａｉｂ－Ｏ－ＣＴＣ樹脂複合体に活性化溶液を添加する。反応を周囲温度まで昇温させ、２時間撹拌する。アッセイ評価で示されるように、未反応の物質は約１８％である。ＤＭＦで２回、ＭＴＢＥで２回、ＤＭＦで２回洗浄する（各１９０ｍＬ、１０ｖｏｌ）。ＤＭＦ（１６５ｍＬ）に溶解したＦｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ（１０．６３ｇ、３０．０８ｍｍｏｌ、６当量）溶液をＯｘｙｍａ（５０ｍＬ、ＤＭＦ中０．６Ｍ、３０ｍｍｏｌ、６当量）およびＤＩＣ（５０ｍＬ、ＤＭＦ中０．６６Ｍ、３３ｍｍｏｌ、６．６当量）に添加する。ほぼ周囲温度で５分間攪拌し、次いで樹脂に添加して、１８時間攪拌する。ピリジン、無水酢酸、ＤＭＦの混合物を樹脂に加え、０．５時間攪拌する。樹脂をＤＭＦ（５ｘ１４０ｍＬ、７ｖｏｌ）、さらにＤＭＦ（２ｘ１８０ｍＬ、９ｖｏｌ）、ＭＴＢＥ（２ｘ１８０ｍＬ、９ｖｏｌ）、次いでＤＭＦ（２ｘ１８０ｍＬ、９ｖｏｌ）で洗浄する。

残りのアミノ酸について、標準のＦｍｏｃ化学を使用して鎖集合の残りの部分を順番に行う。一般に、Ｆｍｏｃ－アミノ酸（２．０当量）、ＨＯＢｔ（３．４２ｇ、８０ｗｔ％、２．０当量）をＤＭＦ（８５ｍＬ）に溶解し、続いてＤＩＥＡ（２．６４ｇ、２．０当量）を添加する。得られた溶液を氷浴で０～５℃に冷却し、ＴＢＴＵ（６．４５ｇ、２．０当量）を添加して活性化し、０～５℃で３～５分間放置する。樹脂にＤＣＭ（３０ｍＬ）を添加し、続いて活性化Ｆｍｏｃ－アミノ酸溶液を添加する。得られた混合物を室温で２時間撹拌する。得られた樹脂をＤＭＦで２回、ＭＴＢＥで２回、ＤＭＦで２回洗浄する（各洗浄で１９０ｍＬ、１０ｖｏｌ）。Ｆｍｏｃ－アミノ酸樹脂を脱保護溶液（１９０ｍＬ、１０ｖｏｌ）でそれぞれ２回、１０分間、２０分間処理して、Ｆｍｏｃ基を除去する。脱Ｆｍｏｃ溶液をドレーンさせた後、樹脂をＤＭＦで２回、ＭＴＢＥで２回、ＤＭＦで２回（各洗浄で１９０ｍＬ、１０ｖｏｌ）洗浄する。

ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の四量体Ｂｏｃ－Ｙ－Ａｉｂ－Ｅ（ｔＢｕ）Ｇ－ＯＨ（１２．２５ｇ、２．０当量）をＯｘｙｍａ（ＤＭＦ中０．６Ｍを３０ｍＬ、２０ｍｍｏｌ、２当量）およびＤＩＣ（０．６６Ｍを３３ｍＬ、２２ｍｍｏｌ、２．１当量）で５分間活性化して、最後の４つのアミノ酸を四量体として添加する。この混合物を樹脂に添加し、１８時間カップリングを行う。１８時間後、混合物をドレーンさせ、樹脂をＤＭＦで洗浄する（各１９０ｍＬ、５分間を５回）。ＤＭＦ（４０ｍＬ）に四量体（６．２１ｇ、１．０当量）を追加し、ＰｙＢＯＰ（５．７７ｇ、１．１当量）およびＤＩＥＡ（３．３２ｇ、２．６当量）で５分間活性化してから、この混合物を樹脂に加え、４時間撹拌する。４時間後に混合物をドレーンさせ、ＤＭＦ（各１９０ｍＬ、５分間を５回）で洗浄する。ＤＭＦ（１０５ｍＬ）、ピリジン（１３．４８ｇ、１７当量）、および無水酢酸（１４．２７ｇ、１４当量）の混合物を添加して樹脂にキャッピングをして、１時間撹拌する。鎖集合の完了後、ペプチド樹脂を各５分間、ＤＭＦで５回（各１９０ｍＬ）、ＤＣＭで６回（各１９０ｍＬ）洗浄し、次いで真空下、３５℃で乾燥させて、調製物１２樹脂複合体（３１．０３ｇ、０．２５９５ｇ／ｍｍｏｌ理論値、８．０５ｍｍｏｌ、収率７７．８％）を得る。調製物１２樹脂複合体の一部（１５．９７５ｇ、０．２５９５ｍｍｏｌ／ｇ、４．１４６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ溶液（１６０ｍＬ、１０ｖｏｌ）中１ｖｏｌ％ＴＦＡで３回、周囲温度でそれぞれ１０分間処理した後、ＤＣＭ（１２０ｍＬ、７．５ｖｏｌ）で洗浄する。切断画分を中和し、ピリジンで洗浄する（４．７４ｇ、ＴＦＡに対して０．９４：１のモル比）。真空下で画分を合わせて濃縮し、３５℃以下で乾燥させる。エタノール（３０ｍＬ、合わせたろ液の５％ｖｏｌ）で再構成を行い、続いて濃縮乾固する。ペプチドを脱イオン水（２４２ｍＬ、合わせたろ液の４０％ｖｏｌ）で１０分間機械的に攪拌する。ろ過により固体の粗ペプチドを収集し、脱イオン水（４ｘ１００ｍＬ）で洗浄する。固体をｎ－ヘプタン（４ｘ１００ｍＬ）で洗浄し、単離し、真空下、３５℃で乾燥させて、調製物１２を白色粉末として得る（９．３８ｇ、８２．２面積％、０．２ｗｔ％ピリジン・ＴＦＡ、８２．１ｗｔ％、３．８５ｍｍｏｌ、９２．８％収率、Ｃ_１０３Ｈ_１６５Ｎ_１３Ｏ_２６のＨＲＭＳ計算予測値２０００．１９８９、実測値２０００．１９６８）。

調製物１３の合成
配列番号１３
Ｎ_２下のフラスコに調製物９（２．８８７ｇ、７０．２ｗｔ％、１．３０ｍｍｏｌ）、調製１０（３．５７６ｇ、５７．４ｗｔ％、２．１３ｍｍｏｌ、１．６３当量）、ＤＭＳＯ（１８．１ｇ、１６．４ｍＬ）、ＤＭＦ（１５．８ｇ、１６．７ｍＬ）、およびＤＩＥＡ（６５５ｍｇ、５．０７ｍｍｏｌ、３．８９当量）を添加し、黄金色の溶液が得られるまで撹拌する。ＰｙＢＯＰ（１．４１４ｇ、２．７２ｍｍｏｌ、２．０８当量）を添加する前に、溶液を氷水で冷却する。氷浴を外して、混合物を周囲温度まで昇温させる。適切な変換を確実にするために約５時間反応をモニターする。ジエチルアミンのアリコート（２．１１６ｇ、２８．９ｍｍｏｌ、２２．２当量）を周囲温度の反応混合物に加える。混合物を約１時間撹拌して、調製物１３への約９９％を超える変換をもたらす。飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（５０ｍＬ）および脱イオン水（５０ｍＬ）を含む４℃未満の混合物を反応混合物に加えることにより、生成物を沈殿させる。混合物を低温条件下で少なくとも約１５分間撹拌する。泥状の白いスラリーをろ過する。ウェットケーキを脱イオン水（３×５０ｍＬ）に続いてＭＴＢＥ（６×５０ｍＬ）で洗浄し、次いで約６２時間Ｎ_２パージしながら真空下、４０℃で乾燥させる。このプロセスにより、調製物１３（４．４５ｇ、６０．４面積％、１６．４面積％ジベンゾフルベン、１．１８ｍｍｏｌ、９０．５％収率、Ｃ_１１９Ｈ_１６９Ｎ_２１Ｏ_２４のＨＲＭＳ計算予測値２２７６．２６４９、実測値２２７６．２５５０）が淡黄色の固体として得られる。

調製物１４の合成
配列番号１４
調製物１１のアリコート（３．０１２ｇ、４８．７ｗｔ％、０．６２１ｍｍｏｌ、１．００当量）を、調製物１３（３．９５１ｇ、６０．４ｗｔ％、１．０５ｍｍｏｌ、１．６９当量）、ＤＭＳＯ（９．８ｇ、８．９ｍＬ）、ＤＭＦ（５２．０ｇ、５５．０ｍＬ）、およびＤＩＥＡ（３７２ｍｇ、２．８８ｍｍｏｌ、４．６３当量）とともに、Ｎ_２下のフラスコに入れる。金色の溶液が得られるまで混合物を撹拌する。氷水は混合物を１０℃未満までに冷却する。ＰｙＢＯＰのアリコート（７４２ｍｇ、１．４２ｍｍｏｌ、２．３０当量）を混合物に添加する。氷浴を外して、混合物をほぼ周囲温度まで昇温させる。調製物１４への変換について反応を約２２時間モニターする。これにより、約９６％を超える変換がもたらされる。温度が１０℃未満の場合、冷却した反応混合物にピペリジン（５３０ｍｇ、６．２２ｍｍｏｌ、１０．０当量）を添加する。混合物を周囲温度で約２時間撹拌して、調製物１４への約９９％超の変換をもたらす。反応混合物を、４℃未満の０．５ＮのＨＣｌ水溶液（１２．７２ｇ、６．２３ｍｍｏｌ、１０．０当量）および脱イオン水（１６．７１ｇ）を含む別のフラスコに加えて、調製物１４の沈殿をもたらす。冷スラリーを約１５分間撹拌して、白色スラリーをろ過する。ウェットケーキを脱イオン水（２ｘ３０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２ｘ３０ｍＬ）、脱イオン水（３ｘ３０ｍＬ）、ＭＴＢＥ（４ｘ４５ｍＬ）で洗浄し、次いで約１７時間Ｎ_２パージしながら真空下、４０℃で乾燥させる。生成物、調製物１４を白色粉末として得る（５．４１８ｇ、４８．９面積％、０．６０３ｍｍｏｌ、９７．０％収率、Ｃ_２３１Ｈ_３４９Ｎ_３５Ｏ_４９のＨＲＭＳ計算予測値４３９７．５８９３、実測値４３９７．６０５７）。

調製物１５の合成
配列番号１５
調製物１２のアリコート（６７１ｍｇ、８２．１ｗｔ％、０．２７５ｍｍｏｌ、１．２３当量）を、Ｎ_２下のフラスコに加える。調製物１４（２．００９ｇ、４８．９面積％、１０．７面積％異性体、０．２２３ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＤＭＳＯ（１１．１ｇ、１０．０ｍＬ）、ＤＭＦ（１９．０ｇ、２０．１ｍＬ）、およびＤＩＥＡ（７６ｍｇ、０．５８８ｍｍｏｌ、２．６３当量）を攪拌しながらフラスコに加えると、黄金色の溶液が得られる。－５℃に冷却する前に、０．６ＭのＨＯＡｔ（６１９ｍｇ、０．３８４ｍｍｏｌ、１．７２当量）のアリコートを添加する。ＰｙＣｌｏｃｋのサンプル（２２０ｍｇ、０．３９７ｍｍｏｌ、１．７８当量）を添加する。混合物をほぼ周囲温度まで昇温させ、調製物１５への約８４％の変換をもたらす。反応混合物を氷冷した脱イオン水（５４８ｍＬ）に１０分間かけて添加して生成物を単離し、生成物を沈殿させる。反応フラスコをＤＭＦ（５ｍＬ）ですすぎ、スラリーに加える。スラリーを約１５分間撹拌し、ほぼ周囲温度まで昇温させ、ろ過する。ウェットケーキを脱イオン水（３ｘ８０ｍＬ）で洗浄し、白いワックス状の固体を真空下、３５℃で３．５日間乾燥させて、調製物１５を白色粉末として得る（２．５０６ｇ、４１．６面積％、０．１６３ｍｍｏｌ、７３．１％収率、Ｃ_３３４Ｈ_５１２Ｎ_４８Ｏ_７４のＨＲＭＳ計算予測値６３７９．７７７７、実測値６３７９．８６５２）。

実施例２
実施例２の合成
配列番号１
ＴＦＡのサンプル（１９．６５６ｇ、１３．０３ｍＬ）を、ＤＣＭ（８１５ｍｇ、０．６２ｍＬ）、ＤＴＴ（４３４ｍｇ）、およびＴＩＰＳ（３６２ｍｇ、０．４７ｍＬ）とともにＮ_２下でフラスコに添加する。水（４６８ｍｇ、０．４７ｍＬ）を加える前に、混合物を氷水で冷却する。調製物１５のサンプル（１０１６ｍｇ、３９．０面積％、０．０６２０ｍｍｏｌ）を２℃でこの混合物に加えて、溶液をもたらす。混合物をほぼ周囲温度まで温め、約２時間攪拌する。反応混合物を－１５℃のＭＴＢＥ（１５０ｍＬ）に添加し、反応器をＭＴＢＥ（３ｍＬ）ですすぐ。約１０分後にスラリーを遠心分離し、上澄みをデカントする。ウェットケーキをＭＴＢＥ（３ｘ５０ｍＬ）で再スラリー化し、洗浄ごとに遠心分離し、上澄みをデカントする。ウェットケーキを真空下、３５℃で乾燥させて、実施例２を白色固体として得る（７８４ｍｇ、２６．５面積％、０．０４３２ｍｍｏｌ、６９．７％収率、Ｃ_２２５Ｈ_３４８Ｎ_４８Ｏ_６８のＨＲＭＳ計算予測値４８１０．５２４９、実測値４８１０．５６４２）。

調製物１６の合成
配列番号１６
合成では、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ２－クロロトリチル樹脂を０．６１ｍｍｏｌ／ｇの負荷で使用する。一般的なＳＰＰＳの手順は、実質的に本書に記載のとおりである。調製物１６は、当業者に知られている方法を使用して、本明細書に記載の樹脂上のペプチドのソフト切断から生じる。濃縮された材料の再構成は、エタノール（合わせたろ液の５％ｖｏｌ）および濃縮乾固で行われる。ペプチドを水中で撹拌しながら粉砕する（合わせたろ液の４０％ｖｏｌ）。固体を単離し、真空下、４０℃で一定重量まで乾燥させて、５．２４ｇ（９９％）の調製物１６を白色粉末として得る。

調製物１８の合成
配列番号１７
合成では、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ２－クロロトリチル樹脂を０．５０ｍｍｏｌ／ｇの負荷で使用する。一般的なＳＰＰＳ手順を、以下の変更を加えて、実質的に本明細書に記載のように使用する。

調製物１８ソフト切断：
樹脂中間体上のペプチドの４２．１３ｇサンプルをフラスコに入れ、１０倍量（４００ｍＬ）の１％ＴＦＡ／ＤＣＭでそれぞれ１０分間、３回処理した後、ＤＣＭで洗浄する。各処理は、４．４ｍＬのピリジンを添加することによってクエンチする。得られた溶液を合わせて真空下で濃縮する。再構成はエタノール（２５ｍＬ）で行い、続いて濃縮乾固して５６．６ｇの泡状半固体を得る。４００ｍＬの水を１０回加えてスラリーを生成する。スラリーをろ過し、水で洗浄する。固体を単離し、真空下、４０℃で一定重量まで乾燥させて、２３．３ｇの調製物１８を白色粉末として得る。

調製物１７の合成
（（５２Ｓ）－５２－（（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－２５－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－２，２－ジメチル－４，２３，２８，３７，４６－ペンタオキソ－３，３２，３５，４１，４４－ペンタオキサ－２４，２９，３８，４７－テトラアザトリペンタコンタン－５３－酸）
調製物６（８０ｇ、９２ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１７．５３ｍＬ、１０１ｍｍｏｌ）、ＴＳＴＵ（３０．３ｇ、１０１ｍｍｏｌ）およびアセトニトリル（１Ｌ）を容器に入れ、２３℃で１７時間撹拌する。溶液を濃縮し、次いで得られたオレンジ色の残留物をＥｔＯＡＣ（１．６Ｌ）に再溶解し、次いで０．１ＭのＨＣｌ（２×１Ｌ）で洗浄する。有機層を水（２×１Ｌ）で洗浄し、次いでＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、真空下で濃縮して、オレンジ色の油（８３ｇ）を残す。第２のバッチを同じ規模で行ない、合わせて１２３ｇの粗油をもたらす。中間体エステル（１２３ｇ、１１０ｇ活性、１１３ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（７００ｍＬ）に溶解し、次いでＦｍｏｃ－リジン（４５．９ｇ、１２５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２１．７０ｍＬ、１２５ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を１７時間撹拌する。反応の完了後、ＥｔＯＨを真空下で除去しオレンジ色の油（２０１ｇ）を残す。残留物をＥｔＯＡｃ（１．１Ｌ）に溶解し、０．１ＭのＨＣｌ溶液（３×４００ｍＬ）、次いでＮａＨＣＯ_３水溶液（４００ｍＬ）で洗浄する。層を分離し、次いで有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液（１ｘ４００ｍＬ）で洗浄する。有機物を濃縮してオレンジ色の油（約１９０ｇ）をもたらす。アセトン（４００ｍＬ）を添加し、次いで得られた懸濁液をろ過して無機物を除去する。混合物を濃縮し、順相クロマトグラフィー（６０／４０ヘプタン／アセトンで調製した１．１ｋｇのシリカ）で精製し、極性溶離液を増やして溶出する（約３Ｌの画分を収集）。少なくとも９５ＨＰＬＣ面積％の画分を合わせて濃縮して、調製物１７の濃黄色の油（７０ｇ）をもたらす。

調製物１９Ａの合成
配列番号１８
合成では、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ２－クロロトリチル樹脂を０．６５ｍｍｏｌ／ｇの負荷で使用する。一般的なＳＰＰＳ手順を、以下の変更を加えて使用する。

シュードプロリン由来の調製物１９Ａは、本明細書に記載のように、調製物１９Ｂと同様の方法で実施例３に対して処理することができる。

調製物１９Ｂの合成
配列番号１９
合成では、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ２－クロロトリチル樹脂を０．６５ｍｍｏｌ／ｇの負荷で使用する。調製物１９Ｂは、実質的に本明細書に記載のように、ＳＰＰＳ手順を使用して調製される。

調製物１９Ｂソフト切断：
調製物１９Ｂは、当業者に知られている方法を使用して、実質的に本明細書に記載のように、樹脂に結合した１９Ｂのソフト切断を使用して調製される。たとえば、調製物１８の方法を参照されたい。得られた固体を単離し、真空下、３０～４０℃で一定重量まで乾燥させて、２．９４ｇの生成物を淡黄色の粉末として得る。

調製物２０の合成
配列番号２０
ＤＭＳＯ／ＤＭＦ（１：１、２００ｍＬ）中の調製物１（４．２５ｇ、４．１６６ｍｍｏｌ）および調製物１６（５．００ｇ、３．３４０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰｙＢＯＰ（２．６０ｇ、５．００ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１．７５ｍＬ、１０．０ｍｍｏｌ）を周囲温度で添加する。溶液を１８時間撹拌し、水で過剰のジエチルアミン（１０．０ｍＬ）を添加することによりクエンチする。クエンチした溶液を２時間撹拌し、次いで０℃で飽和重炭酸ナトリウム水溶液／水（１：１、３００ｍＬ）の溶液にゆっくりと加える。得られた沈殿物を１０分間撹拌し、次いでろ過により収集する。ろ液を水（３ｘ１５０ｍＬ）、続いてメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（３ｘ１５０ｍＬ）で連続して洗浄する。固体を真空下、４０℃で乾燥させて、調製物２０を白色固体として得る（５．３０ｇ、６９％収率、Ｃ_１１９Ｈ_１６９Ｎ_２１Ｏ_２４のＨＲＭＳ計算予測値２２７６．２６４９、実測値２２７６．２６５２）。

調製物２１の合成
配列番号：２１
ＤＭＳＯ／ＤＭＦ（１：１、２０ｍＬ）中の調製物２０（１．００ｇ、０．４４ｍｍｏｌ）および調製物１８（０．９０ｇ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰｙＢＯＰ（３１４ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．２１ｍＬ、１．２０ｍｍｏｌ）を周囲温度で添加する。溶液を１８時間撹拌し、次いでピペリジン（０．７９ｍＬ、４．００ｍｍｏｌ）でクエンチする。クエンチした溶液を２時間撹拌し、次いで０℃に冷却し、ＨＣｌの希薄溶液（５０ｍＬ）でクエンチする。得られたスラリーを１０分間撹拌し、固体をろ過により収集する。ろ液を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２ｘ５０ｍＬ）、水（３ｘ５０ｍＬ）、続いてメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（３ｘ５０ｍＬ）で連続して洗浄する。固体を真空下、４０℃で１８時間乾燥して、調製物２１を白色固体として得る（１．８０ｇ、１０６％収率、Ｃ_２２５Ｈ_３３８Ｎ_３４Ｏ_４８のＨＲＭＳ計算値４２８４．５０５３、実測値４２８４．５０６２）。

調製物２２の合成
配列番号：２２
ＤＭＳＯ／ＤＭＦ（１：１、３ｍＬ）中の調製物２１（２１４ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）および調製物１９Ｂ（１１６ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰｙＢＯＰ（５７ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（５８μＬ、０．３３ｍｍｏｌ）を周囲温度で添加する。溶液を１８時間撹拌し、次いで飽和重炭酸ナトリウム水溶液と水（１０ｍＬ）の１：１混合物でクエンチする。混合物を１０分間撹拌し、得られた固体を収集する。固体を水（３ｘ１０ｍＬ）で洗浄し、固体を真空下、４０℃で乾燥させて、調製物２２を得る（２８５ｍｇ、８９％収率、Ｃ_３３４Ｈ_５１２Ｎ_４８Ｏ_７４のＨＲＭＳ計算予測値６３７９．７７７７、実測値６３７９．７７３０）。

実施例３
実施例３の合成
配列番号１
ＴＦＡ（２．３ｍＬ）、水（０．１ｍＬ）、トリイソプロピルシラン（０．１ｍＬ）、およびＤＴＴ（７５ｍｇ）の溶液を０℃に冷却する。溶液に調製物２２（１００ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を満たし、反応混合物を周囲温度まで昇温させ、２時間撹拌する。得られた混合物を、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２５ｍＬ）の予冷（－２０℃）溶液に注ぐ。得られた沈殿物を－２０℃で１５分間１５分間維持し、スラリーを遠心分離して、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２ｘ２５ｍＬ）で洗浄する。固体を真空下、３５℃で１８時間乾燥させて、実施例３を白色固体として得る（７１ｍｇ、９３％収率、Ｃ_２２５Ｈ_３４８Ｎ_４６Ｏ_６８のＨＲＭＳ計算予測値４８１０．５２４９、実測値４８１０．５０３６）。

ステップ１
ステップ１：調製物２５（１．０５当量）の供給液を５ｖｏｌのＤＭＳＯ／ＡＣＮ（９０：１０ｖｏｌ／ｖｏｌ）で調製する。調製物２６の第２の供給液を、２０ｖｏｌのＤＭＳＯ／ＡＣＮ（９０：１０ｖｏｌ／ｖｏｌ）で調製する。第３の供給液は、３ｖｏｌのＡＣＮ中のＰｙＯｘｉｍ（１．５当量）から調製される。ＡＣＮ中のＤＩＥＡの第４の流れ（４当量）が調製される。最初の３つの流れは、ミキサーにポンプで送られ、ミキサーの出口でＤＩＥＡが混合され、混合物は別のミキサーおよび栓流反応器を介して２０℃の恒温槽に送られ、そこで２時間滞留する。反応器の出口で、酢酸を加えて残りのＰｙＯｘｉｍ（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）を消費することができる。２時間超後、原液のジエチルアミン（１０当量）を加え、ミキサーで混合する。この流れは、第２の栓流反応器に至り、２０℃の恒温槽に１時間滞留する。調製物２７の生成物溶液を収集し、７０／３０ＤＭＳＯ／ＡＣＮ溶液を用いたナノろ過に送られ、１０～２０ダイアボリュームの試薬を除去する。

調製物２５、２．４０ｋｇ、９６．７ｗｔ％、２．２７４ｍｏｌ）の供給溶液は、固体をＤＭＳＯ（１３．８８ｋｇ、１２．６２Ｌ）に溶解し、溶液をＡＣＮ（１．０９ｋｇ、１．３９Ｌ）で希釈することによって調製され、調製物２５（１１４．３ｍｇ／ｍＬ、０．１１２Ｍ）溶液が９０：１０ｖｏｌ／ｖｏｌのＤＭＳＯ：ＡＣＮで作成される。調製物２６の第２の供給溶液（配列番号２６、２．７９ｋｇ、９８．６ｗｔ％、１．８３６ｍｏｌ）は、固体をＤＭＳＯ（５４．８ｋｇ、４９．８Ｌ）に溶解し、ＡＣＮ（４．３ｋｇ、５．４７Ｌ）で希釈することによって調製され、調製物２６（４５．５ｍｇ／ｍＬ、０．０３０Ｍ）の溶液が９０：１０ｖｏｌ／ｖｏｌのＤＭＳＯ：ＡＣＮで作成される。第３の供給溶液は、ＡＣＮ（４７．３３ｋｇ、６０．２２Ｌ）中のＰｙＯｘｉｍ（４．５ｋｇ、８．５３モル）で調製され、０．１３２Ｍの溶液を生成する。ＤＩＥＡは、原液で添加する。調製物２５の溶液の流れ（１４．９１Ｌ、１．７０４ｋｇ、１．６７０ｍｏｌ、０．９５当量、５．９ｇ／分）、調製物２６の流れ（５８．４６Ｌ、２．６６０ｋｇ、１．７５０ｍｏｌ、１．００当量、２２．５ｇ／分）、およびＰｙＯｘｉｍの流れ（１．４当量、５．４ｇ／分）は、２０℃で原液のＤＩＥＡ（４．０当量、０．４４６ｍＬ／分）と混合されてミキサーにポンプで送られる。混合物は、別のミキサーと栓流反応器を介して、２０℃恒温槽にポンプで送られ、３時間の滞留後、４２．９時間にわたる収集により、８８．６ｋｇの生成物溶液がもたらされる。

ナノろ過は、サイズと分子量の違いに基づいて化学種を分離するために使用される膜ベースのろ過プロセスである。調製物２７の生成物溶液には、次のステップに進む前に除去する必要のある試薬（ジエチルアミン、ＰｙＯｘｉｍ、ＤＩＥＡなど）と不要な副生成物（例えば、ジベンゾフルベン）が含まれている。ナノろ過は、望ましくない種（分子量５００Ｄａ未満）を除去するために適用される。

調製物２７の生成物溶液は、ＮＦ供給タンクに充填され、熱交換器と、所望の分離を引き起こすための適切な膜（セラミックまたはポリマー）を含むナノろ過ユニットとを介して再循環ループ内をポンプで回される。望ましくない種は、透過液から除去され、別々に収集されるか、または廃棄される。ＮＦタンク内の一定体積を維持するために、新しい溶媒、すなわち７０：３０ｖｏｌ／ｖｏｌのＤＭＳＯ／ＡＣＮは、引き出される透過速度に一致するように継続的にポンプで送られる。調製２７生成物溶液は、ナノろ過によって精製され、ステップ２に直接運ばれる。

ＤＭＳＯ／ＡＣＮ（８８．６ｋｇ）およびジエチルアミン（１．３４ｋｇ）中のＦｍｏｃ保護調製物２７溶液を反応器に加える。混合物を２０℃で２時間撹拌して、調製物２７（８７．６Ｌ、３８．４５ｍｇ／ｍＬ、３．３７ｋｇ、１．４８ｍｏｌ）をもたらす。調製物２７の生成物溶液は、ナノろ過供給タンクに充填され、次いで、熱交換器と、所望の分離を引き起こすための適切な膜（セラミックまたはポリマー）を含むナノろ過ユニットとを介して再循環ループ内をポンプで回される。望ましくない種は、透過側で除去され、別々に収集されるか、または廃棄される。この操作は、望ましくない不純物を十分に除去するまで継続される。ナノろ過タンク内の一定体積を維持するために、新しい７０：３０ｖｏｌ／ｖｏｌのＤＭＳＯ／ＡＣＮは、引き出される透過速度に一致するように継続的にポンプで送られる。これにより、ＤＭＳＯ／ＡＣＮで調製物２７が得られる（７２．４Ｌ、４０．８ｍｇ／ｍＬ、２．９５ｋｇ、１．３０ｍｏｌ、カップリング、脱Ｆｍｏｃ、およびナノろ過全体で７８．１％の収率）。

ステップ１例示－分析結果。
ＨＰＬＣにより、調製物２５および調製物２６の調製物２７形成への変換が確認される。分析方法では、６５℃で（内径２．１ｍｍｘ１５０ｍｍｘ１．７ミクロンの粒径）フェニルヘキシル固定相カラムを使用し、水およびアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡの２～９８％Ｂ勾配を１２分間にわたり用いる。この材料には２１４ｎｍでのＵＶ検出が使用される。

表Ａ．１は、ステップ１のカップリング反応の生成物（Ｆｍｏｃ保護調製物２７）とステップ１の脱保護反応の生成物（調製物２７）について収集された高分解能質量分析データを示す。質量精度は、測定される種と予測される種の一致を確認するために使用される測定基準である。

表Ａ．１測定されたＦｍｏｃ保護調製物２７の確認および高分解能質量分析データを使用して計算された質量精度による調製物２７。

ステップ２

模式図Ａ．２フラグメント調製物２７（配列番号２７）および調製物２８（配列番号２８）からの調製物２９（配列番号２９）の合成。

ステップ２：調製物２８（１．１５当量）の供給溶液を１０ｖｏｌのＤＭＳＯ／ＡＣＮ（９０：１０ｖｏｌ／ｖｏｌ）で調製する。第２の供給溶液を１ｖｏｌのＡＣＮ中のＰｙＯｘｉｍ（２当量）で調製する。ＡＣＮ中のＤＩＥＡ（３当量）の第３の流れを調製する（５ｗｔ％溶液）。ステップ１からの調製物２７溶液の流れ、調製物２８の流れ、およびＰｙＯｘｉｍの流れは、ミキサーにポンプで送られ、ミキサーの出口でＤＩＥＡと混合され、混合物は、別のミキサーと栓流反応器を介して２０℃の恒温槽にポンプで送られ、そこで２時間滞留する。反応器の出口で、酢酸を加えて残留ＰｙＯｘｉｍを消費することができる。２時間超後、原液のジエチルアミン（１０当量）を加え、ミキサーで混合する。この流れは、第２の栓流反応器に至り、２０℃の恒温槽で１時間滞留する。調製物２９の生成物溶液を収集し、ＤＭＦ溶液をダイアフィルトラントとしてナノろ過に送って、１０～２０ダイアボリュームの試薬を除去する。

調製物２８（４．６８ｋｇ、９８．９ｗｔ％、２．０５８ｍｏｌ）の供給溶液は、固体をＤＭＳＯ（４１．７５ｋｇ、３７．９５Ｌ）に溶解し、溶液をＡＣＮ（３．３ｋｇ、４．２０Ｌ）で希釈することによって調製され、調製物２８（９４．７ｍｇ／ｍＬ、０．０４２１Ｍ）の溶液が９０：１０ｖｏｌ／ｖｏｌのＤＭＳＯ：ＡＣＮで作成される。第２の供給溶液は、ＡＣＮ（１１．８１ｋｇ、１５．０３Ｌ）中のＰｙＯｘｉｍ（３．０ｋｇ、５．６９ｍｏｌ）で調製され、０．３２７Ｍの溶液を生成する。ＤＩＥＡは、原液で添加する。ステップ１からの調製物２７の溶液の流れ（７３．８６Ｌ、４１．２ｍｇ／ｍＬ、３．０４ｋｇ、１．３３６ｍｏｌ、０．０１８１Ｍ、１．０当量、２９．９ｇ／分）、調製２８の流れ（１．３当量、１７．７ｇ／分）、およびＰｙＯｘｉｍの流れ（２．１当量、２．９ｇ／分）は、ミキサーにポンプで送られ、ミキサーの出口で流れは、２０℃に調整され、２０℃で原液のＤＩＥＡ（４．０当量、０．３７４ｍＬ／分）と混合される。混合物は、別のミキサーおよび栓流反応器を介して、２０℃の恒温槽にポンプで送られ、３時間の滞留後、４３．２時間にわたる収集により、１２９．３５ｋｇの調製物２９生成物溶液がもたらされる。

実質的に上記のナノろ過プロセスでは、調製物２７の生成物溶液の代わりに、調製物２９の生成物溶液が使用される。

ＤＭＳＯ／ＡＣＮ中のＦｍｏｃ保護調製物２９溶液を使用するナノろ過プロセスは、実質的に本明細書に記載のように行われる。Ｆｍｏｃ保護調製物２９（１２９．３５ｋｇ）およびジエチルアミン（２．０ｋｇ）を、ナノろ過のために反応器に入れる。ナノろ過プロセスにより、ＤＭＦ中の調製物２９がもたらされる（９８．８５Ｌ、４２．２４ｍｇ／ｍＬ、４．１８ｋｇ、０．９７４ｍｏｌ、カップリング、脱Ｆｍｏｃ、およびナノろ過全体で７３．１％の収率）。

ＨＰＬＣにより、調製物２８および調製物２７からの調製物２９の合成が確認される。分析方法では、６５℃で（内径２．１ｍｍｘ１５０ｍｍｘ１．７ミクロンの粒径）Ｃ４固定相カラムを使用し、水およびアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡの２５～９８％のＢ勾配を１２分間にわたり用いる。この材料には２１４ｎｍでのＵＶ検出が使用される。

表Ａ．３は、ステップ２のカップリング反応の生成物（Ｆｍｏｃ保護調製物２９）およびステップ２の脱保護反応の生成物（調製物２９）について収集された高分解能質量分析データを示す。質量精度により、測定された種の生成物、中性種のモノアイソトピック質量が確認される。

表Ａ．３高分解能質量分析データを使用して計算された質量精度による測定されたＦｍｏｃ保護調製物２９および調製物２９の確認。

ステップ３
模式図Ａ．３フラグメント調製物３０（配列番号３０）および調製物２９（配列番号２９）からの調製物３１（配列番号３１）の合成。

ステップ３ バッチプロセスの説明：ＤＭＦ（０．３０６８ｇ、０．３２５ｍＬ）中の調製物２９（２．２４９ｇ、４６．５ｍｇ／ｇ、１０４．６ｂｍｇ、０．０２４４ｍｍｏｌ）および調製物３０（７１．５ｍｇ、９０．６面積％、０．０３０６ｍｍｏｌ）の－５℃でのナノフィルターＤＭＦ溶液に、ＤＭＦ中の５．０ｗｔ％ＤＩＥＡ溶液（１１４．０ｍｇ、５．７０ｍｇのＤＩＥＡ、０．０４４１ｍｍｏｌ、１．８当量）と、ＤＭＦ中の１０．１ｗｔ％溶液（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）（１５４．９ｍｇ、１５．５９ｍｇのＨＡＴＵ、０．０４１０ｍｍｏｌ、１．７当量）とを添加する。溶液を－５℃で４時間撹拌し、次いで周囲温度で５ｗｔ％重炭酸ナトリウム水溶液（５．２９５ｇ、４．８ｍＬ）を１５分間かけて添加して、クエンチする。得られたスラリーを０℃で１５分間撹拌し、得られた固体をろ過により収集する。固体を水（４ｘ２ｍＬ）で洗浄し、次いでＭＴＢＥ（４ｘ２ｍＬ）で洗浄する。粘着性固体を真空下３５℃で乾燥させて、調製物３１（２１９．７ｍｇ、４７．６面積％、０．０１６４ｍｍｏｌ、６７．１％収率）を得る。

調製物３０の供給溶液を、１０体積のＤＭＦで調製する。第２の供給溶液を、ＡＣＮを含む１０ｗｔ％溶液中のＨＡＴＵ（１．８当量）で調製する。ＤＭＦ中のＤＩＥＡの第３の流れ（２．５当量）を調製する（５ｗｔ％溶液）。ステップ２からの調製物２９の溶液の流れ、調製物３０の流れ、およびＤＩＥＡの流れは、ミキサーにポンプで送られ、ミキサーの出口で流れは冷却され、冷却されたＨＡＴＵ溶液と混合される。混合物は別のミキサーと栓流反応器を介して、－５℃の恒温槽にポンプで送られ、３時間の滞留後に、収集される。塩水／炭酸水素塩の溶液（１７ｗｔ％塩化ナトリウム水溶液、０．５ｗｔ％重炭酸ナトリウム溶液）１９ｗｔ％の塩分負荷を調製する。次いで、ＤＭＦ中の調製物３１の生成物溶液を、塩溶液とともに混合生成物混合懸濁反応器（ＭＳＭＰＲ）にポンプ輸送して、沈殿物を形成する。混合生成物混合懸濁反応器のタウは１時間である。第２のＭＳＭＰＲを１時間タウの間低温で行ない、このスラリーを断続的にフィルタに充填する。スラリーを水で洗浄し、真空下３５℃で乾燥させる。

調製物３０（９．４２ｋｇ、８３．６ｗｔ％、３．７２ｍｏｌ）の供給溶液をＤＭＦ（５４．１２ｋｇ）で調製し、０．０５６３Ｍの供給を作成する。第２の供給溶液は、ＡＣＮ（１０．４ｋｇ）中のＨＡＴＵ（１．１５ｋｇ、３．０２ｍｏｌ）で調製し、０．２１５Ｍの供給を作成する。ＤＩＥＡは原液で添加する。ステップ２からの調製物２９の溶液の流れ（９８．８５Ｌ、４２．２４ｍｇ／ｍＬ、４．１８ｋｇ、０．９７５ｍｏｌ、０．００９９Ｍ、１．０当量、４０．２ｇ／分）、調製物３０の流れ（１．３当量、９．２ｇ／分）、およびＤＩＥＡの流れ（２．１当量、０．１５２ｍＬ／分）は、ミキサーにポンプで送られる。ミキサーの出口で、流れは０℃に冷却され、０℃で冷却されたＨＡＴＵ溶液（２．０当量、３．２ｇ／分）と混合される。混合物は、別のミキサーおよびプ栓流反応器を介して、０℃の恒温槽浴にポンプで送られ、４時間の滞留後、４２時間かけて収集され、１３１．８ｋｇの生成物溶液がもたらされる。生成物溶液を２つのセクションに沈殿させる。１７ｗｔ％ＮａＣｌ水溶液／０．５ｗｔ％ＮａＨＣＯ_３水溶液（２９ｋｇ）を不活性化反応器中でＤＭＦ（１３．２ｋｇ）と混合させ、２０以下℃に冷却する。次いで、ＤＭＦ（６６．６ｋｇ）中の生成物溶液を、１７ｗｔ％ＮａＣｌ水溶液／０．５ｗｔ％ＮａＨＣＯ_３水溶液（３４．４ｋｇ）と１時間かけて反応器に共添加し、２０℃に維持され、生成物の沈殿、調製物３１をもたらす。スラリーを１時間かけて５℃に冷却してから、水を２回に分けて加える（合計３２．２ｋｇ）。スラリーをろ過する前に、５℃のスラリーを０．５時間撹拌する。ウェットケーキを水（６３．９ｋｇ）で０．５時間再スラリー化し、ろ過する。生成物溶液の第２のセクションを同等の方法で沈殿させる。１７ｗｔ％ＮａＣｌ水溶液／０．５ｗｔ％ＮａＨＣＯ_３水溶液（２９ｋｇ）とＤＭＦ（１３．５５ｋｇ）との溶液を反応器で混合し、２０℃以下に冷却する。ＤＭＦ（６５．２ｋｇ）中の生成物溶液の第２のセクションを、１７ｗｔ％ＮａＣｌ水溶液／０．５ｗｔ％ＮａＨＣＯ_３水溶液（３６．８ｋｇ）と１時間かけて反応器に共添加し、２０℃で維持し、生成物の沈殿、調製物３１をもたらす。スラリーを１．２５時間かけて５℃に冷却してから、水を２回に分けて加える（合計３２．１ｋｇ）。スラリーを０．５時間撹拌し、第１のウェットケーキ上でろ過する。合わせたウェットケーキを水で２回（各６４ｋｇ）各０．５時間再スラリー化し、ろ過する。これに続いて、水で２回置換洗浄する（各６４ｋｇ）。合わせた洗浄ウェットケーキにＮ_２を吹き込み、次いで真空下３８℃で、ＫＦが４ｗｔ％未満になるまで乾燥させ、調製物３１をもたらす（１０．３４ｋｇ、推定効力６０％、０．９７２ｍｏｌ、推定収率１００％）。

実施例３
チルゼパチド（配列番号１）

ＴＦＡ（２．３ｍＬ）、水（０．１ｍＬ）、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ、０．１ｍＬ）およびジチオスレイトール（ＤＴＴ、７５ｍｇ）の溶液を０℃に冷却する。この溶液に調製物３１（１００ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を入れ、反応混合物を周囲温度まで昇温させ、２時間撹拌する。得られた混合物を、予冷した（－２０℃）ＭＴＢＥ溶液（２５ｍＬ）に注ぐ。得られた沈殿物を－２０℃で１５分間１５分間維持し、スラリーを遠心分離して、ＭＴＢＥで洗浄する（２ｘ２５ｍＬ）。固体を真空下、３５℃で１８時間乾燥させて、実施例３を白色固体として得る（７１ｍｇ、９３％収率、Ｃ_２２５Ｈ_３４８Ｎ_４６Ｏ_６８のＨＲＭＳ計算予測値４８１０．５２４９、実測値４８１０．５０３６）。

１５℃の不活性化反応器に、ＤＣＭ（２７．３ｋｇ、２０．６Ｌ）、水（４．１ｋｇ）、調製物３１（１０．３４ｋｇ、推定効力６０％、０．９７２ｍｏｌ）、およびＤＴＴ（３．１０ｋｇ）を入れる。別の不活性化反応器に、ＴＦＡ（１５４．１ｋｇ、１０３．４Ｌ）およびＴＩＰＳ（３．２ｋｇ、４．２Ｌ）を入れる。ＴＦＡ／ＴＩＰＳ溶液を調製物３１、ＤＣＭ、水、およびＤＴＴのスラリーに０．２５時間以内に添加し、無色の溶液を形成し、温め、２０℃で３時間保持する。２０℃で３時間後、反応器を－１０℃に冷却する。別の反応器にＭＴＢＥ（３８２．４ｋｇ、５１６．８Ｌ）を加え、－２０℃に冷却する。この冷ＭＴＢＥの一部（９１．８ｋｇ、１２４．１Ｌ）を、－５℃～－１８℃に維持しながら、２時間かけて冷たい反応溶液に加える。残りの冷ＭＴＢＥ（２９４．３ｋｇ、３９７．７Ｌ）を、－５℃～－１８℃に維持しながら１．５時間にわたって添加し、実施例３の沈殿をもたらす。スラリーを０℃に調整し、０．５時間超保持してから、３つのセクションにろ過する。ウェットケーキを合わせて、ＭＴＢＥ（１１４．７ｋｇ、１５５Ｌ）で２回再スラリー化し、ろ過してから最終的なＭＴＢＥ置換洗浄（１１４．７ｋｇ、１５５Ｌ）を行う。ウェットケーキは、４．５ｗｔ％未満のＭＴＢＥが測定されるまで、２８℃で乾燥させる。これにより、実施例３（７．７７ｋｇ、４６．８ｗｔ％、０．７５５ｍｏｌ、７７．７％の収率）が得られる。

実施例４Ａ（線形ＳＰＰＳ）
チルゼパチド（配列番号１）

Ｆｍｏｃ Ｓｉｅｂｅｒ樹脂（１７ｋｇ、０．７６ｍｍｏｌ／ｇ）を反応器に充填する。樹脂をＤＭＦで膨潤させ、２時間撹拌し、次いで樹脂をろ過してＤＭＦを除去する。次いで、樹脂をＤＭＦで合計２回洗浄する。次いで、Ｆｍｏｃ保護樹脂を２０％ＰＩＰ／ＮＭＰ処理を使用して脱保護する。Ｆｍｏｃ除去を確認するためのサンプリングは、最終的なＰＩＰ／ＮＭＰ処理の後に行い、ＵＶ分析によって９９％超Ｆｍｏｃ除去を確認する（ＩＰＣ目標残留Ｆｍｏｃ１％未満）。最終的な２０％ｗ／ｗのＰＩＰ／ＮＭＰ処理後、樹脂床をＤＭＦで複数回洗浄する。次いで、各アミノ酸のカップリングおよび脱保護について以下の一般的な条件を使用して、ペプチド骨格を構築する。

Ｆｍｏｃ脱保護：ペプチド反応器内の樹脂は、２０％ｖ／ｖのＰＩＰ／ＮＭＰ溶液を３回または４回充填して処理する。各処理を樹脂上で３０分間撹拌した後、ろ過してＦｍｏｃ保護基の除去を完了する。最終的な２０％ｖ／ｖのＰＩＰ／ＮＭＰ処理後、樹脂床を事前に指定されたＤＭＦ体積充填のＤＭＦで最低６回洗浄する。

アミノ酸活性化：１２％ｗ／ｗのＯｘｙｍａ Ｐｕｒｅ／ＮＭＰの事前に調製された溶液を反応器に充填する。次いで、選択したＦｍｏｃアミノ酸を添加する。Ｆｍｏｃアミノ酸が完全に溶解するまで混合物を２０±５℃で撹拌する。次いで、わずかな発熱活性化反応を確実に制御するために、Ｆｍｏｃ－ＡＡ／Ｏｘｙｍａ Ｐｕｒｅ／ＮＭＰ溶液を活性化の前に１５±３℃に冷却し、結果として生じる溶液温度を２０±５℃の指定範囲に維持する。次いで、アミノ酸溶液をＤＩＣ添加によって活性化させる。次いで、樹脂中間体上のペプチドを含む反応器に溶液を移す前に、活性化エステル溶液を２０～３０分間撹拌する。

カップリング：前活性化ステップが完了すると、活性化エステル溶液を樹脂上の脱保護されたペプチドを含む反応器に移し、カップリング反応を開始する。ペプチドカップリング反応を２０±５℃で少なくとも４時間撹拌する。必要な攪拌時間の後、カップリング完了（ＩＰＣ）のために樹脂スラリーをサンプリングする。合格するＩＰＣ結果が得られるまで、必要に応じて特定の間隔でサンプリングを繰り返す。必要に応じて、再カップリング操作を行う。カップリングが完了したら、ペプチド反応器溶液の内容物をろ過し、樹脂中間体上のペプチドをＤＭＦで数回洗浄して、次のカップリングの準備を行う。

Ｉｌｅ（１２）のＡｉｂ（１３）へのカップリング：Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ（１２）のＡｉｂ（１３）へのカップリングは、６当量のＦｍｏｃ－ＡＡ、３当量のＤＩＣを利用する対称性無水物アプローチを使用して行う。活性化された対称性無水物種の形成を確実にするために、このシーケンスの活性化時間を４０～６０分間延長する。ＨＰＬＣ分析で決定した反応完了（１％未満の非カップリング）を達成するには、カップリング攪拌時間を延長（１８時間）する必要がある。

Ｌｙｓ（２０）ｉｖＤｅ脱保護（調製物２３）：樹脂Ｂｏｃ－Ｔｙｒ（１）－Ｓｅｒ（３９）ペプチド骨格で完全に保護された３９アミノ酸のＬｙｓ（２０）ｉｖＤｄｅグループの選択的脱保護を行う。脱保護は、ＤＭＦ溶液中の８％ｗ／ｗのヒドラジン水和物を使用し、周囲温度で４時間撹拌することで達成される。脱保護反応をＨＰＬＣでモニターし、脱保護後に残存するＬｙｓ（ｉｖＤｄｅ）成分の１％未満のＩＰＣ限度を目標とする。得られたペプチドフラグメント（調製物２３）をＤＭＦで繰り返し洗浄（８回）して、残留ヒドラジンを完全に除去する。完全に構築された調製物２３フラグメントをＩＰＡで４回洗浄し、ＬＯＤが１％以下になるまで４０℃以下で乾燥させる。調製物２３は、調製物６とカップリングする前に、パッケージ化し、冷蔵保存する（－２０℃）。

調製物６の調製物２３へのカップリング：調製物６（１．５当量）およびＰｙＢＯＰ（１．５当量）の固体を反応器に充填し、続いてＤＭＦを加え、溶解が起こるまで混合物を撹拌する。次いで、コリジンを充填して、活性エステル種の形成を開始する。活性化エステル溶液を６０分間撹拌してから、調製物２３中間体を含む反応器に移す。反応スラリーを２５℃で１８時間撹拌する。スラリーをカップリング完了（ＩＰＣ）についてサンプリングし、必要に応じて、合格ＩＰＣ結果（１％以下の調製物２３）を達成するために必要に応じて特定の間隔でサンプリングを繰り返す。カップリングが完了すると、溶液の内容物をろ過して廃棄する。完全に構築された調製物２４中間体をＤＭＦ、次いでＩＰＡで複数回洗浄する。調製物２４をＬＯＤ１％以下が達成されるまで４０℃以下で乾燥させる。調製物２４を樹脂から切断する前にパッケージ化して冷蔵保存する（－２０℃）。

樹脂切断および実施例４Ａ粗分離：トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、ジチオテリトール（ＤＴＴ）、ＤＣＭおよび水からなる切断カクテルを調製する。切断カクテルは１５±５℃に冷却する。試薬の充填を以下の表に示す。

調製物２４を反応器に充填し、続いて切断カクテルを充填する。反応物を２３℃で３時間撹拌する。混合物をろ過し、次いで使用済み樹脂をＤＣＭで洗浄する。ＤＣＭ洗浄ろ液をバルク脱保護溶液と混合し、内容物を－１０℃以下に冷却する。ＭＴＢＥを－１３℃以下に冷却し、次いで、冷ＭＴＢＥを低温ろ液の２つの部分に供給する。ＭＴＢＥの供給速度を制御して、粗溶液の内部温度を５℃以下に維持する。最初のＭＴＢＥ充填は、ＭＴＢＥの総充填量の約４５％を構成する。ＭＴＢＥ添加の終わり近くに柔らかい沈殿物が形成されるが、溶液に容易に再溶解する。次いで、沈殿溶液を－１５±５℃の内部温度に再冷却する。２回目のＭＴＢＥ添加を、最初のＭＴＢＥ供給速度の約５～１０倍の速度で供給し、ＭＴＢＥの総充填量の約５５％を構成する。添加中、沈殿スラリーの内部温度を０℃以下に維持する。得られたスラリーを－８±３℃で最低６時間熟成させた後、０±３℃に温め、さらに２時間熟成させてから単離する。

冷粗ペプチドスラリーをろ過し、次いで得られたウェットケーキをＭＴＢＥで洗浄する。次いで、実施例４Ａの粗製ウェットケーキを、ＩＰＣ目標ＬＯＤ値が１％以下になるまで乾燥させる。実施例４Ａの粗生成物をパッケージ化して、保存する。粗中間体は精製するまで冷蔵保存する（－２０℃）。全体として、４５．３９ｋｇの粗製の実施例４Ａは、４５ｗｔ％および６４％のＨＰＬＣ面積パーセントの純度で生成される。Ｓｉｅｂｅｒ樹脂に基づく含有収率＝４７％。

実施例４Ａ精製：
移動相：
移動相Ａ（ＭＰＡ）
９０％水、０．１％ＴＦＡ、および１０％ＡＣＮ
移動相Ｂ（ＭＰＢ）
１０％水、０．１％ＴＦＡ、および９０％ＡＣＮ

逆相精製１（ＲＰ１）：実施例４Ａの粗製物を９０ｗｔ％のＭＰＡおよび１０ｗｔ％のＭＰＢに溶解する。溶液を少なくとも７時間撹拌して、トリプトファンの脱炭酸を完了する。熟成した粗溶液をろ過し、事前に平衡化したＫｒｏｍａｓｉｌ １００－１０－Ｃ８充填カラムに充填する。カラムをＡバッファー（９０％水、０．１％ＴＦＡ、１０％ＡＣＮ）およびＢバッファー（１０％水、０．１％ＴＦＡ、９０％ＡＣＮ）の混合液で洗浄し、２カラム体積の３０％ＡＣＮになり、１カラム体積に対してＡＣＮの混合濃度を３０％から３５％に増加することにより、溶出の準備をする。溶出が完了するまで、カラム体積あたり１．５％のＡＣＮを増加して、チルゼパチドをカラムから溶出させる。溶出液を分画し、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して純度をアッセイする。１カラム体積に対してＡＣＮを４７％から６５％に増加し、３カラム体積の６５％ＡＣＮを流し続けることでカラムを再生する。次の注入シーケンスの前に、２カラム体積の３０％ＡＣＮを使用してカラムを再平衡化する。

主流の包含に適格な画分をプールする。すべての一次注入が完了した後、純度基準を満たしていないが純度が５０％を超える画分をリサイクル注入のために混合させることができる。リサイクル画分を表側画分と裏側画分に分け、バッファーＡで希釈して冷蔵保存する。リサイクル注入分を、一次注入基準を使用して処理し、プールするが、しかし主要ピーク画分のみを順方向に処理し、それ以上のリサイクルを行わない。主流のプールが完了すると、中間体の濃度および純度をアッセイする。ＲＰ２処理の前に、材料を希釈し、ｐＨをｐＨ８に調整する。ＲＰ１プロセスでは３７ｋｇの粗生成物、および９０．９％の平均プール純度を有する１４２７７ｇの含有生成物がもたらされる。

逆相精製２：実施例４ＡのＲＰ１溶液を、事前に平衡化したＫｒｏｍａｓｉｌ １００－１０－Ｃ８充填カラムに充填する。カラムをバッファーＣ（９０％ＮＨ_４ＯＡｃ水溶液、ｐＨ８．０、１０％ＡＣＮ）およびバッファーＤ（１０％ＮＨ_４ＯＡｃ水溶液、ｐＨ８．０、９０％ＡＣＮ）の混合液で洗浄し、２カラム体積の２０％ＡＣＮ溶液になる。溶出が完了するまで、カラムあたり３．５％のＡＣＮを増加して、チルゼパチドをカラムから溶出させる。溶出液を分画し、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して純度をアッセイする。溶出後、ＡＣＮを１カラム体積に対して８０％に増加し、３カラム体積の８０％ＡＣＮを流し続けることでカラムを再生する。次の注入シーケンスの前に、２カラム体積の２０％ＡＣＮを使用してカラムを再平衡化する。

主流の包含に適格な画分をプールする。すべての一次注入が完了した後、純度基準を満たしていないが純度が６０％を超える画分をリサイクル注入のために混合させることができる。リサイクル画分を表側プールと裏側プールに分け、バッファーＣで希釈して、冷蔵保存する。リサイクル注入分を、一次注入基準を使用して処理し、プールするが、しかし主要ピーク画分のみを順方向に処理し、それ以上のリサイクルを行わない。主流のプールが完了すると、中間体の濃度および純度をアッセイする。ＴＦＦステップの準備として材料のｐＨを８．０に調整することができる。１４．２ｋｇから開始するＲＰ２プロセスでは、１０．９ｋｇの含有生成物が７６．７％の収率でもたらされる。

イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）：実施例４ＡのＲＰ２溶液をろ過し、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ－３００Ｍカラムに充填する。２つの画分を、移動相Ｅ（１０％酢酸アンモニウム水溶液、５％ＩＰＡ、ｐＨ８）および移動相Ｆ（イソプロパノール）を使用して溶出する。画分をペプチド含有量について分析し、３ｍｇ／ｍＬ未満のものは廃棄する。濃縮物のプールされた画分は、沈殿前に２０℃で保存される。ＩＥＸプロセスは、１０．９ｋｇのＲＰ２から開始し、９７．８％プール純度の純度を有する１４．３ｋｇの実施例４Ａ材料含有生成物をもたらす。

沈殿：実施例４ＡのＩＥＸ溶液（３３３ｋｇ）をろ過し、次いでイソプロパノール（８５０Ｌ）を充填して、含水量を１０％ｗ／ｗ以下の水に減少させる。ＭＴＢＥの充填と沈殿に備えて、希釈した溶液を０±３℃に冷却する。ＭＴＢＥ（２３０４Ｌ、１７０８ｋｇ）を０±３℃に冷却する。冷ＭＴＢＥを、ＭＴＢＥ充填の最初の約３７％まで、約０．６９ｋｇ／分の速度でＩＥＸ溶液に供給する。次いで、供給速度を平均約２．３ｋｇ／分に上げて、ＭＴＢＥ充填の残りの約６３％を完了する。供給中の温度は、５℃未満に維持する。得られた沈殿スラリーを冷ろ過し（－１０℃以下）、次いでろ過ケーキをＭＴＢＥで洗浄する。ろ過ケーキをＬＯＤ２％以下まで乾燥させる。

加湿４Ａ：湿った窒素をフィルタ乾燥機に通すことによって実施例４Ａを加湿する。フィルタの出口から出るガス流の湿度を６０分ごとにモニターする。０．５％以下のＭＴＢＥおよび０．２％以下のＩＰＡがウェットケーキに残るまで加湿を継続する。加湿プロセスの完了後、実施例４Ａの純粋な生成物ケーキを通して乾燥窒素が流れるように窒素の流れを切り替える。特定のＩＰＣ目標に対して水および残留溶媒について材料をサンプリングし、乾燥窒素を使用する乾燥は、５～７％ｗ／ｗの所望の目標含水量が満たされるまで続ける。合計１２．９ｋｇの実施例４Ａが、ペプチド含有量が９５％超の純度で単離される。Ｓｉｅｂｅｒ樹脂充填に基づく全体的な収率＝３１％。

実施例４Ｂ（線形ＳＰＰＳ）
チルゼパチド（配列番号１）

調製物２３
調製物２３を生成するためのプロセスは、ＮＭＰがすべてのカップリングおよび脱保護のために全体的にＤＭＦに置き換えられることを除いて、実質的に実施例４Ａに記載の通りである。さらに、アミノ酸：Ｏｘｙｍａ：ＤＩＣへの化学量を、Ｓｉｂｅｒ樹脂に基づいて２．５：２．５：２．７モル当量に減少させる。ＤＭＦの使用に関連する唯一の例外は、ＮＭＰが保持されるＩｌｅ１２のＡｉｂ１３へのカップリングである。この例では、１７．６ｋｇのＳｉｅｂｅｒ樹脂の樹脂中間体上に９２．２ｋｇの調製物２３ペプチドまでのプロセスを示す。

調製物２４
実施例４Ａによって実質的に記載されるプロセスは、９２．１ｋｇの調製物２３を調製し、さらに、樹脂中間体で９７．３ｋｇの調製物２４ペプチドが処理される。調製物２４を樹脂から切断する前にパッケージ化して冷蔵保存する（－２０℃）。

樹脂切断および実施例４Ｂ粗単離：実施例４Ａに実質的に記載の条件を使用して、２つのバッチを３２ｋｇスケールの調製物２４で行ない、２４．４ｋｇの実施例４Ｂ、６９．５％のＨＰＬＣ純度、５２．６％の収率、および２１．３ｋｇの実施例４Ｂ、８８．３％のＨＰＬＣ純度、４５．２％の収率を送達する。粗中間体は、精製するまで冷保存する（－２０℃）。

実施例４Ｂ精製：粗溶解：チルゼパチド実施例４Ｂ粗を溶解容器に充填し、１：１のアセトニトリル：水溶液に溶解して、溶液の最終濃度を２５ｇ固体／Ｌにする。得られた溶液のｐＨを水酸化アンモニウムで８．５～９．５に調整して、デプシペプチド異性体（１０～１５％）のチルゼパチド実施例４Ｂへの変換を開始する。ｐＨ調整された混合物を少なくとも１時間撹拌して、デプシ変換を起こさせる。次いで、トリフルオロ酢酸を添加してｐＨを１．５～２．５に調整し、クロマトグラフィーの準備として３０％のアセトニトリル含有量に希釈する。合計で、粗溶液を少なくとも７時間撹拌して、Ｔｒｐ ＣＯ_２塩をチルゼパチド実施例４Ｂに変換する。

チルゼパチド（ＴＺＰ）のデプシペプチドへの変換：

デプシペプチドのＡＰＩへの変換：

逆相精製１（ＲＰ１）：実質的に実施例４Ａによって提示されるようなＲＰ１プロセスを使用して、デプシペプチドをＡＰＩに変換することができる。ＲＰ１精製プロセスは、例４Ａで説明したものと実質的に同じである。ただし、上記の粗溶解ステップは、ＲＰ１クロマトグラフィーステップの機能を強化する。これにより、Ｌ樹脂負荷あたりのｇ Ｔｉｒｚｅｐａｔｉｄｅを高くすることができ、実施例４で説明した条件下で粗Ｔｉｒｚｅｐａｔｉｄｅを精製するために必要な注入回数を減らすことができる。この例示では、２３．７ｋｇの含有量補正された粗製の実施例４Ｂは、ＲＰ１の後に２５．４ｋｇの実施例４Ｂ（１０７％）を生成する。総溶液量＝２９１０Ｌ＠８．７２ｇ／Ｌで、すべてのプール画分が収集されたら、混合物を攪拌、サンプリングし、逆相精製２（ＲＰ２）の前に保持する。

逆相精製２（ＲＰ２）：実施例４Ａに記載されたものと実質的に同じ精製プロセスであり、当業者に知られている方法を使用して、逆相精製２（ＲＰ２）に使用される。この実施例では、ＲＰ１からの実施例４Ｂを含む１５．２ｋｇは、ＲＰ２の後に約９８％の純度で１３．８ｋｇの実施例４Ｂに精製される。総溶液量＝８０８Ｌ＠１７．０ｇ／Ｌ。タンジェント流ろ過の前に混合物を保存する。

タンジェント流ろ過（ＴＦＦ）：ＴＦＦ膜を設置し、水で洗い流す。酢酸アンモニウムバッファーを、低エンドトキシン精製水、酢酸、水酸化アンモニウムを使用して調製する。次いで、イソプロパノールを充填して、５：９５の１００ｍＭのＮＨ_４ＯＡｃ ｐＨ８．０：ＩＰＡバッファーを供給する。実施例４Ｂの１７ｇ／ＬのＲＰ２溶液は、ＴＦＦを通して約１２５ｇ／Ｌに濃縮される。ＲＰ２溶液は再循環され、溶媒が膜の保持液側のペプチド溶液を溶液中に保持しながら膜を透過できるようにする。濃縮後、透過液を継続的に収集しながら、ダイアフィルトレーションバッファーを保持液保持タンクに供給する。バッファーの交換は、目的の溶媒組成とペプチド濃度が満たされるまで続ける。溶液をシステムから空にし、得られた分極層を膜から洗い流し、ペプチド濃縮物と一緒にプールする。ＲＰ２溶液の２つのセクション（４０３．９Ｌ＠１７ｇ／Ｌ、９．８７ｋｇ ＡＰＩ）はＴＦＦを介して処理される。

同時供給沈殿：ＴＦＦセクションを合わせ（１３８．２ｋｇ、７８．３ｇ／Ｌ）、ＫＦを測定（８．９％）して、水が１０％未満であることを確認する。ＭＴＢＥ（２４３ｋｇ）を別の容器に入れ、０℃に冷却する。ＩＰＡ（４８ｋｇ）、水（６ｋｇ）、ＭＴＢＥ（１００ｋｇ）を沈殿容器に加え、溶液を０℃に冷却する。ＴＦＦおよびＭＴＢＥプロセスの流れは、それぞれ１．６～１．８および２．９～３．１ｋｇ／分の速度で沈殿容器に同時供給される。得られたスラリーを０℃でさらに０．７時間熟成させ、次いで１５℃に温める。スラリーを１５℃で１時間熟成させた後、ＭＴＢＥ（１１８ｋｇ）を添加する。スラリーを１５℃で１時間熟成させた後、２．５℃に冷却する。スラリーを冷ろ過し、ろ過ケーキをＭＴＢＥ（５７３ｋｇ）で洗浄する。ろ過ケーキをＬＯＤ２％未満まで乾燥させる。

加湿：実質的に実施例４Ａによって示されるような加湿は、当業者に知られている方法を使用して、実施例４Ｂの材料に適用される。合計１４．５ｋｇの実施例４Ｂ（配列番号１）が、９７．７％超のＨＰＬＣ純度および８８．４％のペプチド含有量で単離される。Ｓｉｅｂｅｒ樹脂充填に基づく全体的な収率＝４６％。

実施例５
流れ内の収束化学を使用した調製物３１の連続合成
ペプチドフラグメントからの調製物３１の合成は、化学へのバッチアプローチと、管状フローリアクターでのフラグメントの連続添加の両方を使用して行う。合成への一般化されたアプローチは、２つの溶液をカップリング剤とともに管式反応器にブレンドすることによる２つのフラグメントのカップリングを含み、その後、塩基が添加され、ＦＭＯＣ保護基の除去を行うために管式反応器での滞留時間が長くなる。これにより、次のフラグメントを追加するためのカップリングされた種を準備する。過剰な試薬、塩基、および溶媒は、ペプチドを保持し、低分子量の不純物に浸透するサイズのメンブレンを備えたナノフィルターを使用して、連続するカップリング反応の間に除去される。ダイアフィルトレーションは、後続のカップリングステップの前に、低分子量の不純物を完全に除去するために使用される。これらの変換の例からの説明および分析結果を以下に示す。

ＨＰＬＣを使用して、調製物２９および調製物３０からの調製物３１の合成を確認する。分析方法では、６５℃で（内径２．１ｍｍｘ１５０ｍｍｘ１．７ミクロンの粒径）Ｃ４固定相カラムを使用し、水およびアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡの６０～９８％Ｂ勾配を１２分間にわたり用いる。この材料には２１４ｎｍでのＵＶ検出が使用される。

表Ａ．５は、流れの中で作成されたステップ３のカップリング反応の生成物（調製物３１）について収集された高分解能質量分析データを示す。質量精度により、目的の種が確認される。

表Ａ．５高分解能質量分析データを使用して計算された質量精度による測定された調製物３１の確認。

ネイティブケミカルライゲーションは、システインまたはアラニンを配列に含む完全長ペプチドを調製するのに有用なプロセスである。このプロセスでは、２つの非保護ペプチドセグメントの化学選択的反応を利用して、一時的なチオエステル結合中間体を生成する。チオエステル結合中間体は、再編成して、ライゲーション部位に天然のペプチド結合を有する完全長のライゲーション産物を提供する。当業者は、ネイティブケミカルライゲーションの技術が、システインまたはアラニンを含む完全長ペプチドの化学合成に有用であり得ることを理解されよう。

実施例６
ネイティブケミカルライゲーションプロセス
配列番号１

Ｆｍｏｃ－ヒドラジン－ＣＴＣ樹脂の合成（調製物３２）
２－ＣＴＣ樹脂（１０．７ｇ、１７．７ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのＤＣＭで０℃で２０分間膨潤させる。９－フルオレニルメチルカルバゼート（１５．６ｇ、６１．４ｍｍｏｌ、３．５当量）を２１０ｍＬの２：１のＤＭＦ：ＤＣＭに溶解する。ＤＩＥＡ（３１ｍＬ、１７８ｍｍｏｌ、１０．１当量）を９－フルオレニルメチルカルバゼート溶液に添加する。次いで、この溶液を０℃でゆっくりと樹脂に添加する。０℃で約１時間攪拌し、室温まで昇温させる。反応混合物を室温で１６時間にわたって撹拌する。次いで、メタノール（１０ｍＬ）を加えて、残りの２－ＣＴＣ樹脂をクエンチし、１５分間撹拌する。樹脂を２００ｍＬのＤＭＦ、続いてＤＭＦ（２ｘ１００ｍＬ）、水（３ｘ１００ｍＬ）、ＤＭＦ（３ｘ１００ｍＬ）、メタノール（３ｘ１００ｍＬ）、最終的にＤＣＭ（３ｘ１００ｍＬ）ですすぐ。樹脂を２７℃の真空オーブン内で１６時間乾燥させる。樹脂の負荷は、定量的ＮＭＲにより０．７４ｍｍｏｌ／ｇと測定される。

ペプチドヒドラジド（１７－ｍｅｒ）の合成（調製物３３
配列番号３２
ヒドラジン－ＣＴＣ樹脂（１．０１ｇ、負荷値：０．６５ｍｍｏｌ／ｇ）を４０ｍＬの反応容器に入れ、ペプチドシンセサイザー上で３ｘ４ｍＬのＤＣＭ（各３０秒）で膨潤させた後、２ｘ１０ｍＬのＤＭＦ（各２０分）で膨潤させる。Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ（０．９１９ｇ、２．６０ｍｍｏｌ、４当量）およびＨＢＴＵ（０．９９ｇ、２．６１ｍｍｏｌ、４当量）を７ｍＬのＤＭＦに溶解する。ＤＩＰＥＡ（０．９１ｍＬ、５．２２ｍｍｏｌ、８当量）をアミノ酸溶液に添加し、ＤＭＦで体積を１０ｍＬにする。活性化アミノ酸溶液を樹脂に添加する。スラリーを窒素と８時間混合する。８時間後、樹脂を５ｘ１０ｍＬのＤＭＦ、５ｘ１０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、１２時間乾燥させる。得られた樹脂の負荷は、定量的ＮＭＲにより０．５４ｍｍｏｌ／ｇと測定される。この樹脂０．９１ｇを調製物３３（配列番号３２）の合成に使用する。

脱保護：ＤＭＦ中の２０％ｖ／ｖピペリジン４ｘ９ｍＬ、各３０分。

カップリング：３当量のアミノ酸、３当量のＯＸＹＭＡおよび３．３当量のＤＩＣをアミノ酸カップリングに使用する。各カップリングおよび脱保護の最終的な反復の後に、Ｎ_２混合とともに１分間、５×９ｍＬのＤＭＦで樹脂を洗浄する。ペプチドヒドラジド合成後に、Ｎ_２混合とともにＤＣＭで樹脂を洗浄する。樹脂をシンセサイザー上で乾燥させる。

脱保護および切断：５％ｗ／ｖジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２．５％ｖ／ｖ水、２．５％ｖ／ｖトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、および９０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で作成された２５ｍＬの切断カクテルを乾燥した樹脂（２．３７ｇ）に添加して、ロータリーミキサーで３時間混合する。樹脂をろ過し、２ｘ２．５ｍＬのＴＦＡで洗浄する。ろ液を１７５ｍＬの冷ＭＴＢＥに注ぎ、ペプチドを直ちに沈殿させる。ろ過フラスコを２ｘ２．０ｍＬのＴＦＡで洗浄し、冷ＭＴＢＥに注ぐ。－２０℃まで３０分冷却した後、遠心分離する。次いで、ペプチド沈殿物を１５０ｍＬのＭＴＢＥで２回洗浄し、遠心分離する。ペプチド沈殿物を２７℃の真空オーブン内で１６時間乾燥させる。粗調製物３３の１．２５ｇのサンプルを乾燥後に得る［予測値（質量＋２Ｈ^＋）／２＝９６８．４８８３、観測値（質量＋２Ｈ^＋）／２＝９６８．４８７９］。

約０．６２ｍｍｏｌの調製物３４を標準的なＳＰＰＳプロトコルによってＳｉｅｂｅｒアミド樹脂上で合成する。Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）－ＯＨを直交脱保護およびリジンアシル化に使用する。

ｉｖＤｄｅの脱保護：ヒドラジン一水和物（６４％ｗ／ｗ）（１．９８ｇ、２５．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦで２４．４ｇに希釈し、２０ｇを樹脂に添加する。スラリーを窒素流で撹拌させる。約２時間後に５ｘ９ｍＬのＤＭＦで洗浄する。もう一度繰り返す。

２－［２－［２－［［２－［２－［２－［［（４Ｓ）－５－ｔｅｒｔ－ブトキシ－４－［（２０－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２０－オキソ－イコサノイル）アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］アミノ］エトキシ］エトキシ］酢酸（１０９４．４ｍｇ、１．２５２ｍｍｏｌ、２当量）を１０ｍＬの無水ＤＭＦに溶解する。ＴＮＴＵ（５０６．９ｍｇ、１．３６０ｍｍｏｌ、２．２当量）およびＤＩＥＡ（０．２４ｍＬ、１．４ｍｍｏｌ、２．２当量）を添加する。体積を無水ＤＭＦで１５ｍＬにする。ロータリーミキサーで３０分間混合する。次いで、調製物６の活性化エステルを樹脂に加え、窒素流と１２時間混合させる。１２時間後、溶液をドレーンさせ、Ｎ_２混合とともに１分間、５×１０ｍＬのＤＭＦ、および７×１０ｍＬのＤＣＭで樹脂を洗浄する。樹脂をシンセサイザー上で８時間乾燥させる。

脱保護および切断：５％ｗ／ｖジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２．５％ｖ／ｖ水、２．５％ｖ／ｖトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）および９０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で作成された２０ｍＬの切断カクテルを乾燥した樹脂（２．４２ｇ）に添加して、ロータリーミキサーで３時間混合する。樹脂をろ過し、２ｘ２．０ｍＬのＴＦＡで洗浄する。ろ液を２００ｍＬの冷ＭＴＢＥに注ぎ、ペプチドを直ちに沈殿させる。ろ過フラスコを２ｘ２ｍＬのＴＦＡで洗浄し、冷ＭＴＢＥに注ぐ。－２０℃に３０分間冷却した後、遠心分離する。ペプチド沈殿物を２４０ｍＬのＭＴＢＥで２回洗浄し、遠心分離する。ペプチド沈殿物を２７℃の真空オーブン内で１４時間乾燥させる。乾燥後、１．８５３ｇの粗調製物３４が得られる。Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００－１０－Ｃ８ １０μｍカラム（３０ｍｍｘ２５０ｍｍ）上、周囲温度でＲＰ－ＨＰＬＣにより精製する。最初の５分間の水中１５％アセトニトリル後に、２５分間にわたる水中３０～５５％のアセトニトリル、３０分間の一定の０．１％ＴＦＡでの直線勾配を使用する。１．２８ｇの精製された調製物３４（配列番号３３）が得られる［予測値（質量＋２Ｈ^＋）／２＝１４７０．７９２９、観測値（質量＋２Ｈ^＋）／２＝１４７０．７８８５］。

チオエステル合成（調製物３３から調製物３５への変換）
粗ペプチドヒドラジド（調製物３３、２．４２２ｇ、１．２５１ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのライゲーションバッファー（６Ｍの塩酸グアニジンおよび０．２Ｍのリン酸水素二ナトリウム一塩基、ｐＨ３．３５）に溶解し、アセトン－氷浴で－１５℃に冷却する。９．４ｍＬの１Ｍの亜硝酸ナトリウム溶液（９．４ｍｍｏｌ、７．５当量）をペプチドヒドラジド溶液に添加し、－１５℃で２０分間撹拌する。一方、１ｍＬの２，２，２－トリフルオロエタンチオール（ＴＦＥＴ）を、ライゲーションバッファー（６Ｍの塩酸グアニジンおよび０．２Ｍのリン酸水素二ナトリウム一塩基、ｐＨ７．０）で最大１０ｍＬにする。２０分後、１０ｍＬのＴＦＥＴ混合物をペプチドヒドラジド溶液に添加して、調製物３３から生成されたペプチジルアジドのｉｎ－ｓｉｔｕ加チオール分解を引き起こす。

反応混合物のｐＨを、５Ｎの水酸化ナトリウム溶液で約６．９５に調整する。ペプチジルアジドの加チオール分解を４５分間行ない、ライゲーションバッファー（ｐＨ７．０）で体積を１００ｍＬにする。粗チオエステル混合物を、Ｗａｔｅｒｓ Ｘ－ＢｒｉｄｇｅＣ１８ １０μｍカラム（１０ｍｍｘ２５０ｍｍ）上、周囲温度でＲＰ－ＨＰＬＣにより精製する。最初の２．８分間の水中１０％アセトニトリル後に、２５分間にわたる水中２５～４２％のアセトニトリル、２８分間の精製中一定の０．１％ＴＦＡでの直線勾配を使用する。これにより、１．０３ｇのＴＦＥＴチオエステルが得られる（調製物３５（配列番号３４））［予測値（質量＋２Ｈ^＋）／２＝１０１０．４６５０、観測値（質量＋２Ｈ^＋）／２＝１０１０．４６２０］。

ネイティブケミカルライゲーション：６Ｍの塩酸グアニジンと０．３Ｍのリン酸水素二ナトリウム一塩基（ｐＨ７．０）の水溶液は、ネイティブケミカルライゲーションで使用されるライゲーションバッファーである。すべての溶液は、このライゲーションバッファーで作成される。３５０．４ｍｇ（０．１７４ｍｍｏｌ）のペプチドチオエステル調製物３５（配列番号３４）を５０ｍＬのライゲーションバッファーに溶解する。０．５Ｍの４－メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）溶液８．０ｍＬをペプチドチオエステル溶液に添加する。Ｎ末端システイン含有ペプチド（調製物３４（配列番号３３）、５２４．６ｍｇ、０．１７８ｍｍｏｌ、１．０３当量）を、５０ｍＬの遠心分離管中の４８ｍＬのライゲーションバッファーに溶解する。調製物３４の溶液をチオエステル溶液に添加する。遠心分離管を２ｘ８ｍＬのライゲーションバッファー（約ｐＨ７．０）ですすぎ、反応混合物に加える。反応混合物のｐＨを５ＮのＮａＯＨ溶液で約７に調整する。８．０ｍＬのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、０．５Ｍ、ｐＨ７．０）を反応混合物に加え、０．２ｍＬの５Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨを７．０に再度調整する。反応物を室温で２４時間撹拌し、次いで冷凍庫に保存する。精製前に、さらに３ｍＬの０．５ＭのＴＣＥＰ溶液を添加する。調製物３６（配列番号３５）の精製を、周囲温度で、Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８ １０μｍカラム（１０ｍｍ×２５０ｍｍ）で、２８分間の精製中、最初の４分間の水中１０％アセトニトリル、２３分間にわたる水中２０～５０％アセトニトリル（０．１％酢酸およびｐＨ９．０に滴定）の直線勾配によるＲＰ－ＨＰＬＣで行う。約３７２ｍｇ（４４．３％）のチルゼパチドシステイン類似体調製物３６が精製後に得られる［予測値（質量＋３Ｈ^＋）／３＝１６１５．１７２６３、観測値（質量＋３Ｈ^＋）／３＝１６１５．１６８６］。

脱硫：６グアニジン塩酸塩と０．３Ｍリン酸水素二ナトリウム一塩基（ｐＨ７．０）の水溶液は、脱硫に使用されるバッファーである。すべての溶液はこのバッファーで作成される。２，２’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］二塩酸塩（調製物３７、８０８．２ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのバッファーに溶解し、５ＮのＮａＯＨでｐＨを約７．０に調整する。体積をバッファーで１５ｍＬにする。チルゼパチドシステイン類似体調製物３６（１０５．２ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を３０ｍＬのバッファーに溶解して、６ｍＬの調製物３７溶液をそれに加える。５ｍＬの０．３ＭＬ－グルタチオン還元溶液（Ｌ－ＧＳＨ、ｐＨ７．０）と７．５ｍＬの０．５ＭのＴＣＥＰ溶液（ｐＨ７．０）を添加する。溶液を４４℃で４．５時間加熱すると、ＵＰＬＣ分析によって反応が完了したことがわかる［予測値（質量＋３Ｈ^＋）／３＝１６０４．５１５３、観測値（質量＋３Ｈ^＋）／３＝１６０４．５１２２］。脱硫収率を、チルゼパチド（配列番号１）参照標準を使用するＵＰＬＣによって計算する。収率を４７％と推定する。

ネイティブケミカルライゲーション（アプローチ２）：ペプチドヒドラジド調製物３９の合成
配列番号：３６
ヒドラジン－ＣＴＣ樹脂（２．０３ｇ、１．３２ｍｍｏｌ、負荷値：０．６５ｍｍｏｌ／ｇ）を４０ｍＬの反応容器に入れ、Ｓｙｍｐｈｏｎｙシンセサイザー上で３ｘ１０ｍＬのＤＣＭ（各３０秒）に続いて、２ｘ１０ｍＬのＤＭＦ（各２０分）で膨潤させる。ＨＢＴＵ（１．４８ｇ、３．９０ｍｍｏｌ、３．０当量）を１３．１ｍＬの（２５Ｓ、５２Ｓ）－５２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－２５－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－２，２－ジメチル－４，２３，２８，３７，４６－ペンタオキソ－３，３２，３５，４１，４４－ペンタオキサ－２４，２９，３８，４７－テトラアザトリペンタコンタン－５３－酸（調製物１７、ＤＭＦ中３６５ｍｇ／ｍＬ）溶液（３．９１ｍｍｏｌ、３．０当量）に溶解する。ＤＩＰＥＡ（１．４ｍＬ、８．０４ｍｍｏｌ、６．１当量）を上記の溶液に加え、ＤＭＦで体積を１９ｍＬにする。溶液をロータリーミキサー上、室温で３０分間混合する。調製物１７の活性化エステル溶液を樹脂に添加する。スラリーを窒素と８時間混合させる。８時間後、樹脂を５ｘ１０ｍＬのＤＭＦ、５ｘ１０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、１２時間乾燥させる。得られた樹脂の負荷は、定量的ＮＭＲにより０．２６ｍｍｏｌ／ｇと測定される。１．８２ｇのこの樹脂を、ペプチドヒドラジド調製物３９（配列番号３６）の合成に使用する。

脱保護：ＤＭＦ中の２０％ｖ／ｖピペリジン４ｘ９ｍＬ、各３０分。

カップリング：３当量のアミノ酸、３当量のＯＸＹＭＡおよび３．３当量のＤＩＣをアミノ酸カップリングに使用する。

各カップリングおよび脱保護の最終的な反復の後に、Ｎ_２混合とともに１分間、５×９ｍＬのＤＭＦで樹脂を洗浄する。ペプチドヒドラジド合成後に、Ｎ_２混合とともに１分間、７×１０ｍＬのＤＣＭで樹脂を洗浄する。次いで、樹脂をシンセサイザー上で約１２時間乾燥させる。

脱保護および切断：５％ｗ／ｖジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２．５％ｖ／ｖ水、２．５％ｖ／ｖトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、および９０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で作成された２５ｍＬの切断カクテルを乾燥した樹脂に添加して、ロータリーミキサーで混合する。樹脂をろ過し、ＴＦＡ（２ｘ２．５ｍＬ）で洗浄し、ろ液を１７５ｍＬの冷ＭＴＢＥに注ぐ。ろ過フラスコをＴＦＡ（２ｘ２．５ｍＬ）で洗浄し、洗浄液を冷ＭＴＢＥに注ぐ。－２０℃に３０分間冷却した後、遠心分離する。次いで、ペプチド沈殿物を１５０ｍＬのＭＴＢＥで２回洗浄し、遠心分離する。ペプチド沈殿物を２７℃の真空オーブン内で１６時間乾燥させる。乾燥後、１．７０ｇの粗ペプチドヒドラジド調製物３９（配列番号３６）が得られる。粗ペプチドヒドラジド、調製物３９をＷａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔＣＳＨＣ１８ １０μｍカラム（１０ｍｍｘ２５０ｍｍ）上、周囲温度でＲＰ－ＨＰＬＣにより精製する。最初の３分間の水中１０％アセトニトリル後に、２３分間にわたる水中２０～５５％アセトニトリル、２８分間の精製中一定の０．１％ＴＦＡでの直線勾配を使用する。約１１０ｍｇの部分的に精製されたヒドラジド調製物３９が得られる。

脱保護および切断：５％ｗ／ｖジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２．５％ｖ／ｖ水、２．５％ｖ／ｖトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、および９０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で作成された２５ｍＬの切断カクテルを乾燥した樹脂（２．９２ｇ）をロータリーミキサーで混合する。樹脂をろ過し、２ｘ２．５ｍＬのＴＦＡで洗浄する。ろ液を２００ｍＬの冷ＭＴＢＥに注ぎ、ペプチドを直ちに沈殿させる。次いで、ろ過フラスコを２ｘ２ｍＬのＴＦＡで洗浄し、洗浄液を冷ＭＴＢＥに注ぐ。－２０℃に３０分間冷却した後、遠心分離する。次いで、ペプチド沈殿物を２４０ｍＬのＭＴＢＥで２回洗浄し、遠心分離する。次いで、ペプチド沈殿物を真空オーブン内２７℃で１６時間乾燥させる。約１．７ｇの粗製１９量体調製物４０（配列番号３７）が得られる。

ネイティブケミカルライゲーション：６Ｍの塩酸グアニジンと０．３Ｍのリン酸水素二ナトリウム一塩基（ｐＨ７．０）の水溶液は、ネイティブケミカルライゲーションで使用されるライゲーションバッファーである。すべての溶液は、このライゲーションバッファーで作成される。部分的に精製されたペプチドヒドラジド（調製物３９、５６ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）を５ｍＬのライゲーションバッファー（６Ｍの塩酸グアニジンおよび０．３Ｍのリン酸水素二ナトリウム一塩基、ｐＨ３．３５）に溶解し、アセトン－氷浴で－１５℃に冷却する。０．２５ｍＬの１Ｍの亜硝酸ナトリウム溶液（０．２５ｍｍｏｌ、１３．２当量）をペプチドヒドラジド溶液に加え、－１５℃で１０分間撹拌する。１０分後、０．８ｍＬの０．５Ｍの４－メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）溶液をペプチドヒドラジド溶液に添加して、調製物３９から生成されたペプチジルアジドのｉｎ－ｓｉｔｕ加チオール分解を引き起こす。反応混合物のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で約７．０に調整される。ペプチジルアジドの加チオール分解を３０分間行なう。

標準的なＳＰＰＳプロトコルを使用して、Ｓｉｅｂｅｒミド樹脂上で約０．６２ｍｍｏｌの調製物４０（配列番号３７）を合成する。Ｎ末端システイン含有調製物４０（２６．１ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ、０．７４ｑｕｉｖ）を１ｍＬのライゲーションバッファーに溶解する。調製物４０の溶液をチオエステル溶液に加える。調製物４０を含むバイアルを１ｍＬのライゲーションバッファー（ｐＨ７．０）ですすぎ、反応混合物に添加する。１５分後、１．０ｍＬのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、０．５Ｍ、ｐＨ７．０）を反応混合物に加え、５Ｎの水酸化ナトリウム溶液でｐＨを７．０に調整する。反応物を室温で１時間撹拌する。チルゼパチドシステイン類似体調製物４２が反応混合物中に観察される。

配列
配列番号１
チルゼパチド
ＹＸ１ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＸ２ＬＤＫＩＡＱＫＡＦＶＱＷＬＩＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ
式中、Ｘ_１は、Ａｉｂであり、Ｘ_２は、Ａｉｂであり、２０位のＫは、（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）_２－（γＧｌｕ）_１－ＣＯ－（ＣＨ_２）_１８－ＣＯ_２ＨのＫ側鎖のイプシロン－アミノ基への結合を通して化学的に修飾され、Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第一級アミドとしてアミド化される
配列番号２

配列番号３

配列番号４

配列番号５

配列番号６

配列番号７

配列番号８

配列番号９

配列番号１０

配列番号１１

配列番号１２

配列番号１３

配列番号１４

配列番号１５

配列番号１６

配列番号１７

配列番号１８

配列番号１９

配列番号２０

配列番号２１

配列番号２２

配列番号２３

配列番号２４

配列番号２５

配列番号２６

配列番号２７

配列番号２８

配列番号２９

配列番号３０

配列番号３１

配列番号３２

配列番号３３

配列番号３４

配列番号３５

配列番号３６

配列番号３７

配列番号３８

配列番号３９

配列番号４０

Claims (1)

1. 以下の式の化合物、
   

   

   またはその薬学的に許容される塩。