JP7317466B2

JP7317466B2 - 細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置

Info

Publication number: JP7317466B2
Application number: JP2017238091A
Authority: JP
Inventors: 啓介渋谷; 憲一郎岡; 健之近藤
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2017-12-12
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2023-07-31
Anticipated expiration: 2037-12-12
Also published as: WO2019116772A1; US12091700B2; US20210189452A1; JP2019103447A

Description

本発明は、細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置に関する。

微生物、動物細胞、植物などの細胞の生命活動によって自然界で微量に作られる有用物質を、合成生物学の適用により大量製造が可能となっている。これら有用物質の大量製造では、目的とする有用物質（以下、「目的物質」という）を産生する細胞を適切な培養環境で培養し、産生された目的物質を精製等で回収することで製造される。細胞を利用して製造した目的物質は、食品・飲料、化学・繊維、医薬品、化粧品、エネルギーを中心とする産業分野やそれを支える研究支援分野（研究用機器・試薬、ＤＮＡ合成など）に適用されている。

目的物質の大量生産のための製造プロセス構築では、合成生物学的手法として分子生物学アプローチによる高効率生産可能な新規細胞株の創成や、代謝システムの人工的構築が行われる。細胞のスクリーニングによって新奇な二次代謝産物を作る細胞が発見されると、その化合物を生産する遺伝子クラスターを発見し、クラスター内の各遺伝子の機能を明らかにした上で、生産性を上げるために、細胞に遺伝子組換えを行う。すなわち、（１）発見⇒（２）解析⇒（３）設計⇒（４）遺伝子組換え⇒（５）試験⇒（６）学習⇒（３）設計⇒…というサイクルを繰り返す。その後、前記により選定された細胞株候補に対して培養方式や培養条件等の最適化により、製造プロセスを構築する。

細胞培養の培養方式は、回分培養、流加培養（若しくは半回分培養）、連続培養（若しくは灌流培養）に分類される。
回分培養は、一回ごとに新たな培地を用意し、そこに細胞株を植えて収穫まで培地を加えない培養法である。回分培養には、培養ごとに品質はバラつくが、コンタミネーションのリスクを分散・低減できるという特徴がある。
流加培養は、培養中に、培地自体や培地中の特定の成分を添加し、培養終了時まで生産物を抜き取らない培養法である。
連続培養は、培養系に連続的に培地を供給すると同時に、供給した培地と同じ量の培養液を抜き取る培養法である。連続培養には、培養環境を一定に保ち易く、生産性が安定するという特徴がある。

前記した製造プロセスの構築にあたっては、前記培養方式に対して、生産性が高くなる温度、溶存酸素濃度などの培養条件を決定する。しかし、細胞内での有用物質の合成メカニズムは非常に複雑であり、充分に解明されていない。そのため、従来の適切な培養条件のスクリーニングは、生産性や品質に影響する培養細胞の状態を把握し、培養条件と細胞の状態の因果関係を把握して、生産性や品質を最適とする培養条件を探索する必要があった。また、そのため、従来の適切な培養条件のスクリーニングは、様々な培養条件で実際に細胞を培養するという試行錯誤でなされる。検討すべき培養環境のパラメータは、温度、ｐＨ、溶存酸素濃度など多数あり、それぞれのパラメータに対して条件を変えた場合、パラメータの組合せによる培養環境の条件数は指数的に増える。従って、製造プロセスを構築するにあたって非常に多くの培養実験を行う必要があり、培養条件のスクリーニングのために膨大な時間とコストを必要としていた。

なお、細胞株候補の選定に関して、例えば、特許文献１に記載の方法が提案されている。この特許文献１には、リアルタイム代謝フラックス分析を用いた新規又は改変表現型の全細胞操作の方法が記載されている。当該方法は、（ａ）細胞の遺伝子構成を改変することによって、改変細胞を作成する工程を含んでいる。（ｂ）前記改変細胞を培養して、複数の改変細胞を生成する工程を含んでいる。（ｃ）工程（ｂ）の細胞培養をリアルタイムでモニタリングすることによって、前記細胞の代謝パラメータの少なくとも一つを測定する工程を含んでいる。そして、（ｄ）工程（ｃ）のデータを分析して、測定したパラメータと同様な条件下の非改変細胞における比較可能な測定値とが異なるかどうかを決定することによって、リアルタイム代謝フラックス分析を用いて前記細胞における操作された表現型を同定する工程を含んでいる。

特表２００５－５０６８４０号公報

特許文献１に記載の方法によれば、改変細胞の選定を効率的に行い得る。しかしながら、前記したように培養環境の条件数が非常に多く、製造プロセスを構築するために非常に多くの培養実験を行う必要がある。そのため、培養条件のスクリーニングのために膨大な時間とコストを必要とするという状況は変わっていない。つまり、特許文献１に記載の方法では、最適な培養条件のスクリーニングを行うことはできない。

本発明は前記状況に鑑みてなされたものであり、細胞株及び培養条件のスクリーニングを簡便に行うことができる細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置を提供することを課題とする。

前記課題を解決するため本発明者等が鋭意検討した結果、次のようにすることで、前記目標に近い細胞内代謝反応を実現することができ、目的物質の生産について生産性が高く、且つ品質が安定した目的物質を得ることができることを見出した。すなわち、目標とする細胞内代謝反応を設定し、使用する細胞において、培養条件（温度、ｐＨなどの培養環境因子）と各代謝反応速度との相関モデルを構築する。そして、この相関モデルを用いて、設定した細胞内代謝反応モデル（すなわち、目標値）に最も近くなる培養条件を計算することで、前記目標に近い細胞内代謝反応を実現することができる。そして、これにより、目的物質について生産性が高く、且つ安定した品質を得ることができることを見出した。本発明はこれらの知見を見出すことにより完成するに至ったものである。なお、本発明における「相関モデル」とは、代謝反応と、当該代謝反応に関する代謝反応速度式と、代謝反応や代謝反応速度式に影響を与える培養環境因子との相関を表したモデルをいう。つまり、相関モデルは、解明している代謝反応の数に応じた代謝反応速度式を有する。

本発明に係る前記課題は以下の手段により解決される。
本発明に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング方法は、培養細胞の代謝反応に関する目標値を設定する目標値設定工程と、予め設定されている培養条件で培養細胞を培養する第１培養工程と、培養した前記培養細胞を含む培養液を分析する分析工程と、前記分析工程で得られた分析結果に基づいて代謝解析を行い、解析値を算出する解析値算出工程と、相関モデルを用いて前記解析値から前記目標値に最も近くなる培養条件を計算し、前記第１培養工程で設定されている培養条件を前記計算した培養条件に変更する培養条件計算工程と、前記変更した培養条件で前記培養細胞と同じ細胞株の培養細胞を培養し、得られた培養液を前記分析工程に送る第２培養工程と、を含み、前記分析工程から前記第２培養工程までを複数の培養細胞及び培養条件について繰り返し実施し、繰り返し実施して得られた複数の前記解析値の中から前記目標値の±２０％となる解析値に係る細胞株及び培養条件をスクリーニングするスクリーニング工程を含み、前記第１培養工程及び前記第２培養工程における前記培養細胞の培養が、複数の培養槽で同時に行われ、複数の前記培養槽はそれぞれ培地添加手段及び細胞分離手段と配管により接続されており、また、前記細胞分離手段と回収容器とが配管により接続されており、複数の前記培養槽はそれぞれに、培養制御パラメータとして、それぞれの前記培養槽から前記細胞分離手段を経由してそれぞれの前記培養槽に戻る循環速度、前記細胞分離手段から前記回収容器に送液する送液速度、前記培地添加手段からそれぞれの前記培養槽内に新鮮な培地を添加する添加速度及び当該培地の培地組成を測定して培養を制御し、前記解析値算出工程と培養条件計算工程との間に、前記解析値算出工程で得られた解析値で補正する相関モデル補正工程を含んでいる。

本発明に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング装置は、培養細胞の代謝反応に関する目標値を設定する目標値設定手段と、設定又は変更された培養条件で培養細胞を培養する培養手段と、前記培養手段で培養した培養細胞を含む培養液を分析する分析手段と、前記分析手段で得られた分析結果に基づいて代謝解析を行い、解析値を算出する解析値算出手段と、相関モデルを用いて前記解析値から前記目標値に最も近くなる培養条件を計算し、前記培養手段で設定されている培養条件を前記計算した培養条件に変更する培養条件計算手段と、複数の培養細胞及び培養条件で繰り返し実施して得られた複数の前記解析値の中から前記目標値の±２０％となる解析値に係る細胞株及び培養条件をスクリーニングするスクリーニング手段と、前記相関モデルを前記解析値算出手段で得られた解析値で補正する相関モデル補正手段と、を有し、前記培養手段における前記培養細胞の培養が、複数の培養槽で同時に行われ、複数の前記培養槽はそれぞれ培地添加手段及び細胞分離手段と配管により接続されており、また、前記細胞分離手段と回収容器とが配管により接続されており、複数の前記培養槽はそれぞれに、培養制御パラメータとして、それぞれの前記培養槽から前記細胞分離手段を経由してそれぞれの前記培養槽に戻る循環速度、前記細胞分離手段から前記回収容器に送液する送液速度、前記培地添加手段からそれぞれの前記培養槽内に新鮮な培地を添加する添加速度及び当該培地の培地組成を測定して培養を制御する。

本発明によれば、細胞株及び培養条件のスクリーニングを簡便に行うことができる細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置を提供できる。

遺伝情報の伝達・発現と細胞機能の発現を説明するフローチャートである。細胞内代謝により目的物質を生産する細胞株を示す概念図である。遺伝子組換えを行う前の細胞内代謝の一例を示す概念図である。遺伝子組換えを行った後の細胞内代謝の一例を示す概念図である。遺伝子組換えを行う前の細胞内代謝の他の一例を示す概念図である。遺伝子組換えを行った後の細胞内代謝の他の一例を示す概念図である。 Chinese Hamster Ovary（ＣＨＯ）細胞の代謝経路の一部を示す図である。本実施形態に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング装置の一例を示す概略図である。回分培養型培養装置の概略図である。流加培養型培養装置の概略図である。連続培養型培養装置の概略図である。培養槽を複数備えたスクリーニング装置を示す概略図である。前処理手段で行われる前処理の一例を示すフローチャートである。前処理手段で行われる前処理の一例を示すフローチャートである。前処理手段で行われる前処理の一例を示すフローチャートである。前処理手段で行われる前処理の一例を示すフローチャートである。代謝フラックスの分析方法の概念を示す説明図である。本実施形態に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング方法の内容を説明するフローチャートである。本実施形態に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング方法のより詳しい一態様の内容を説明するフローチャートである。本実施形態に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング方法のさらに詳しい一態様の内容を説明するフローチャートである。

以下、適宜図面を参照して本発明に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置（以下、それぞれ単に「スクリーニング方法」及び「スクリーニング装置」ということがある）の一実施形態について詳細に説明する。以下の説明では、まず、目的物質の生産で必要とされる細胞株の特性について説明し、次いで、培養条件と代謝反応速度との相関モデルの構築について説明する。その後、スクリーニング装置の実施形態について説明し、次いで、スクリーニング方法の実施形態について説明する。

［１．目的物質の生産で必要とされる細胞株の特性］
図１は、遺伝情報の伝達・発現（セントラルドグマ）と細胞機能の発現を説明するフローチャートである。図２は、細胞内代謝により目的物質を生産する細胞株を示す概念図である。図３Ａは、遺伝子組換えを行う前の細胞内代謝の一例を示す概念図である。図３Ｂは、遺伝子組換えを行った後の細胞内代謝の一例を示す概念図である。図３Ｃは、遺伝子組換えを行う前の細胞内代謝の他の一例を示す概念図である。図３Ｄは、遺伝子組換えを行った後の細胞内代謝の他の一例を示す概念図である。

細胞は、栄養成分となる原料を細胞内に取り込み、細胞内の代謝経路で合成、修飾を行って目的物質を生産する。目的物質の生産効率は細胞機能の１つである代謝反応速度が関与し、代謝反応速度は培養条件に依存する。物質生産では細胞内における代謝反応を促進する酵素タンパク質が全ての代謝経路で発現している必要がある。図１を参照して、酵素タンパク質が発現し、細胞機能として働くまでの流れを説明すると次のようになる。細胞内のゲノムＤＮＡに酵素タンパク質の遺伝子がコードされている。ゲノムＤＮＡからｍＲＮＡが転写され、ｍＲＮＡから酵素タンパク質などのプロテインが翻訳され、発現する。そして、このようにして発現した酵素タンパク質が高次構造を形成したり、修飾を受けたりするなどして活性化され、細胞機能として働くことで代謝反応速度が向上する。これらｍＲＮＡや酵素タンパク質の活性及び代謝反応に関与する因子は培養条件に依存するため、代謝反応速度及び物質生産の生産性も培養条件に依存することになる。なお、ゲノムＤＮＡからｍＲＮＡへの転写量や動態などは、トランスクリプトーム解析を行うことによって把握することができる。また、ゲノムＤＮＡやｍＲＮＡから発現するプロテインの発現量や動態などは、プロテオーム解析を行うことによって把握することができる。

また、細胞が栄養成分となる原料を取り込み、細胞内の代謝経路で合成、修飾を行って目的物質を生産するまでの流れを図に示すと図２のようになる。図２に示すように、目的物質ＯＳは、目的物質ＯＳを生産する細胞Ｃが培養液Ｍ中の栄養成分ＮＣを原料として細胞Ｃ内の代謝Ｍｅ（合成反応）を経由して産生される。なお、このとき、目的物質ＯＳの産生にあたって副生成物ＢＰが産生されることがある。図１中の矢印「→」は、代謝経路を示している。

本実施形態で用いることのできる細胞Ｃとしては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ベイビーハムスター腎臓細胞、マウス骨髄腫細胞などが挙げられる。細胞Ｃが付着性細胞である場合は、マイクロキャリアなどの担体に付着させて浮遊化させることで撹拌培養を行うことができる。また、本実施形態で用いることのできる細胞Ｃとしては、動物由来の細胞だけでなく、植物細胞、光合成細菌、微細藻類、ラン藻類、昆虫細胞、細菌、酵母、真菌、藻類、大腸菌などが挙げられる。なお、本実施形態においては、目的物質ＯＳを生産できるものであればどのような細胞も用いることができ、前記したものに限定されない。

また、目的物質ＯＳとしては、例えば、生理活性物質が挙げられ、特に抗体が挙げられる。抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、免疫グロブリンを含む。また、生理活性物質は抗体に限らず、血栓溶解剤として利用される組織型プラスミノーゲン活性化因子やエリスロポエチン、インターフェロンなどのバイオ医薬品、その他工業的に有用なタンパク質も対象となり、β－カロテンやアスタキサンチンなどのカロチノイド、クロロフィルやバクテリオクロロフィルなどの色素を結合したタンパク質も対象となる。さらに、目的物質ＯＳとしては、例えば、食品や化粧品などの着色等に使用されるフィコシアニンなどのフィコビリンタンパク質なども挙げることができる。また、培養に用いる培地については特に限定されるものではなく、培養対象とする細胞Ｃの増殖、目的物質ＯＳの生産に有効なものであれば、従来のあらゆる培地が使用可能である。目的物質ＯＳとしては、タンパク質以外に抗生物質のような２次代謝物であってもよく、細胞Ｃ内の代謝で産生されるものであれば、特に限定されない。

細胞Ｃは、目的物質ＯＳの生産性を高めるため、遺伝子組換えが行われることが多い。遺伝子組換えを行う場合、細胞Ｃに対して目的物質ＯＳの合成に必要な代謝経路の追加や、元の細胞株（例えば、天然細胞株）の代謝経路の反応速度を増大又は減少させて目的物質の生産性を高めるように設計する。なお、本実施形態における天然細胞株とは、目的物質を生産する遺伝子を導入する遺伝子組換えを行っていない細胞株をいい、具体的には、限界希釈法などにより自然界や生体から単離（クローニング）された細胞株をいう。遺伝子組換えでは、代謝反応に関与する酵素タンパク質などを増加又は減少させることで、代謝反応速度を制御する。

なお、遺伝子組換えは、例えば、図３Ａに示すように、目的物質ＯＳを生産しない細胞Ｃ_０に、他の細胞由来の目的物質ＯＳを生産する代謝経路ＭＰに係る遺伝子（例えば、酵素タンパク質の遺伝子）を導入する。このようにすると、図３Ｂに示すように、遺伝子組換えによって作出された目的物質ＯＳを生産することのできる細胞Ｃは、導入された遺伝子によって細胞内代謝が改変され、栄養成分ＮＣから目的物質ＯＳを生産できるようになる。

また、遺伝子組換えは、例えば、図３Ｃに示すように、目的物質ＯＳを生産する能力を有する細胞Ｃ_１に対して、図３Ｄに示すように、効率の悪い代謝経路に関する遺伝子を欠失させたり、そのような代謝経路を阻害する物質を生産する遺伝子を導入したりする。このようにすると、図３Ｄに示すように、効率の悪い代謝経路が阻害されるので、栄養成分ＮＣから目的物質ＯＳを生産する能力が高まった細胞Ｃを作出することができる。なお、図３Ｄにおいて矢印が太く表示されている。これは、生産性が高まっている様子を示している。また、図３Ｄにおいて代謝経路に「×」が付されている。これは、代謝経路が阻害されていることを示している。また、図３Ｄにおいて○が破線で表示されているものがある。これは、生産されていた副生成物ＢＰの産生が阻害され、生成されなくなったり、生成量が低下したりしたことを示している。

ここで、培養中の細胞内の各代謝反応速度は、例えば、温度、ｐＨ、溶存酸素、溶存二酸化炭素、液中通気による気泡、攪拌によるせん断応力などの培養環境因子によっても変化する。これは、細胞Ｃ内で発現した酵素タンパク質や補酵素などの活性が、前記培養環境各因子によって影響を受けるためである。

そのため、目的物質ＯＳの生産で必要とされる細胞株は以下の２つの特性が必要であると言われている。
（１）目的物質ＯＳを生産できる適切な代謝経路（過不足のない代謝経路）が存在すること。
（２）各代謝経路において反応を促進する酵素タンパク質、又は反応を阻害する阻害因子の活性が代謝経路全体で適正化されていること。

前記（１）に関しては、前記したような遺伝子組換えやゲノム編集により行うことができ、（２）に関しては、培養条件の最適化により行うことができる。なお、ゲノム編集とは、ゲノム上で任意の遺伝子を改変する（切断し、編集する）技術をいう。

目的物質ＯＳの大量生産においては、前記（１）と（２）を同時に最適化することが重要である。そのためには、遺伝子組換えやゲノム編集を行った複数の細胞株の候補それぞれに対して細胞内代謝反応が培養条件（培養環境因子）に対して、どのような相関があるかを把握し、代謝反応速度と培養環境因子の相関を定式化（モデル化）するのが好適であると考えられる。そして、それぞれの細胞株で前記モデル化を行った相関モデルを構築し、その相関モデルを用いて、最適化された培養条件での生産性を比較することで、最適な細胞株及び培養条件の組合せを提供することが可能となる。

［２．培養条件と代謝反応速度との相関モデルの構築］
図４は、Chinese Hamster Ovary（ＣＨＯ）細胞の代謝経路の一部を示す図である。なお、ＣＨＯ細胞は、抗体医薬品製造でよく使用される細胞の一つである。
目的物質ＯＳは、図４に示すような代謝経路に従って生産される。目的物質ＯＳの生産効率を上げるためには、原則、原料となる栄養成分ＮＣから目的物質ＯＳまでの代謝経路の代謝反応速度が高く、分岐する代謝経路（副生成物ＢＰ）の代謝反応速度が低くなることが望ましい。

下記に、図４に示すＣＨＯ細胞の代謝経路における反応Ｎｏ．（例えば、Ｒ１など）及び代謝反応式を示す。なお、下記の例示の中で、「＝」は主に酵素タンパク質によって可逆的に、又は不可逆的に代謝されることを示している。
＜図４に示す反応Ｎｏ．及び代謝反応式＞
反応Ｎｏ．：代謝反応式
Ｒ１：Ｇｌｕｃ_ext＝Ｇ６Ｐ
Ｒ２：Ｇ６Ｐ＝Ｆ６Ｐ
Ｒ３：Ｆ６Ｐ＝ＤＨＡＰ＋ＧＡＰ
Ｒ４：ＤＨＡＰ＝ＧＡＰ
Ｒ５：ＧＡＰ＝３ＰＧ
Ｒ６：３ＰＧ＝Ｐｙｒ
Ｒ７：Ｐｙｒ＝Ｌａｃ
Ｒ８：Ｌａｃ＝Ｌａｃ_ext
Ｒ９：Ｇ６Ｐ＝Ｐ５Ｐ＋ＣＯ２
Ｒ１０：Ｐ５Ｐ＝Ｘ５Ｐ
Ｒ１１：Ｐ５Ｐ＝Ｒ５Ｐ
Ｒ１２：Ｘ５Ｐ＝ＥＣ２＋ＧＡＰ
Ｒ１３：Ｆ６Ｐ＝ＥＣ２＋Ｅ４Ｐ
Ｒ１４：Ｓ７Ｐ＝ＥＣ２＋Ｒ５Ｐ
Ｒ１５：Ｆ６Ｐ＝ＥＣ３＋ＧＡＰ
Ｒ１６：Ｓ７Ｐ＝ＥＣ３＋Ｅ４Ｐ
Ｒ１７：Ｐｙｒ＋ＣＯ２＝ＯＡＡ
Ｒ１８：ＭＡＬ＝Ｐｙｒ＋ＣＯ２
Ｒ１９：Ｇｌｕ＝Ａｋｇ
Ｒ２０：ＯＡＡ＝Ａｓｐ
Ｒ２１：Ｐｙｒ＝ＡｃＣｏＡ＋ＣＯ２
Ｒ２２：ＯＡＡ＋ＡｃＣｏＡ＝Ｃｉｔ
Ｒ２３：Ｃｉｔ＝Ａｋｇ＋ＣＯ２
Ｒ２４：Ａｋｇ＝０．５Ｓｕｃ＋０．５Ｓｕｃ＋ＣＯ２
Ｒ２５：Ｓｕｃ＝Ｆｕｍ
Ｒ２６：Ｆｕｍ＝ＭＡＬ
Ｒ２７：ＭＡＬ＝ＯＡＡ
Ｒ２８：Ｃｉｔ＝ＯＡＡ＋ＡｃＣｏＡ_Cyt
Ｒ２９：ＡｃＣｏＡ_Cyt＝ＦＡＭ
Ｒ３０：Ｓｅｒ＝Ｐｙｒ
Ｒ３１：Ｓｅｒ＝Ｇｌｙ＋ＭＥＥＴＨＦ
Ｒ３２：Ｐｙｒ＝Ａｌａ
Ｒ３３：Ｇｌｎ_ext＝Ｇｌｎ
Ｒ３４：Ｇｌｎ＝Ｇｌｕ
Ｒ３５：Ｇｌｕ＝Ｇｌｕ_ext
Ｒ３６：Ｐ５Ｐ＝ＮＴＰ
Ｒ３７：ＤＨＡＰ＝ＧＬＰ
Ｒ３８：ＡＳＰ_prot＝Ａｓｐ
Ｒ３９：Ｓｅｒ＝ＳＥＲ＿ＤＩＬ

また、下記に図４で用いた略語の説明を示す。
＜図４で用いた略語の説明＞
Ｇｌｕｃ：Glucose（グルコース）
Ｇ６Ｐ：Glucose-6-phosphate（グルコースー６－リン酸）
Ｆ６Ｐ：Fructose-6-phosphate（フルクトース－６－リン酸）
ＤＨＡＰ：Dihydroxyacetone phosphate（ジヒドロキシアセトンリン酸）
ＧＡＰ：Glyceraldehyde-3-phosphate（グリセルアルデヒド－３－リン酸）
３ＰＧ：3-phosphoglycerate（３－ホスホグリセリン酸）
Ｐｙｒ：Pyruvate（ピルビン酸）
Ｌａｃ：Lactic acid（乳酸）
Ｐ５Ｐ：Pyridoxyl-5-phosphate（ピリドキシル－５－リン酸）
Ｘ５Ｐ：Xylulose-5-phosphate（キシルロース－５－リン酸）
Ｒ５Ｐ：Ribose-5-phosphate（リボース－５－リン酸）
ＥＣ２：2 enzyme-bound carbons
ＣＯ２：Carbon dioxide（二酸化炭素）
Ｅ４Ｐ：Erythrose-4-phosphate（エリトロース－４－リン酸）
ＯＡＡ：Oxaloacetate（オキサロ酢酸）
Ｓ７Ｐ：Sedoheptulose-7-phosphate（セドヘプツロース－７－リン酸）
ＭＡＬ：Malate（リンゴ酸）
Ａｋｇ：α-Ketoglutarate（α－ケトグルタル酸）
Ａｓｐ：Aspartic acid（アスパラギン酸）
ＡＳＰ_prot ：Aspartic acid protein（タンパク質由来アスパラギン酸）
ＡｃＣｏＡ：Acetyl-CoA（アセチルコエンザイムＡ）
ＡｃＣｏＡ_cyt ：Acetyl-CoA cytosol（細胞質基質アセチルコエンザイムＡ）
ＦＡＭ：Fatty acid metabolism（脂肪酸代謝）
Ｃｉｔ：Citric acid（クエン酸）
Ｓｕｃ：Succinate（コハク酸）
Ｆｕｍ：Fumarate（フマル酸）
Ｓｅｒ：Serine（セリン）
ＳＥＲ＿ＤＩＬ：Serine dilution（希釈セリン）
Ｇｌｙ：Glycine（グリシン）
ＭＥＥＴＨＦ：Methylenetetrahydrofolate（メチレンテトラヒドロ葉酸）
Ａｌａ：Alanine（アラニン）
Ｇｌｎ：Glutamine（グルタミン）
Ｇｌｎ_ext ：External Glutamine（細胞外グルタミン）
Ｇｌｕ：Glutamic acid（グルタミン酸）
Ｇｌｕ_ext ：External Glutamic acid（細胞外グルタミン酸）
ＮＴＰ：Nucleoside tri-phosphate（ヌクレオシド三リン酸）
ＧＬＰ：Glycerol 3-phosphate（グリセロール３－リン酸）

図４に示す代謝経路に関する各代謝反応式は、培養条件（培養環境因子：温度（Ｔｅｍ）、ｐＨ、溶存酸素（ＤＯ）、溶存二酸化炭素、液中通気による気泡、攪拌によるせん断応力など）の影響を受ける。そのため、各代謝反応速度がどの培養環境因子の影響を受けるか知る必要がある。培養条件による影響は、論文、雑誌、書籍、実験データなどの公開された文献・知見や、実験で得られた条件などを反映させることができる。つまり、前記した反応Ｎｏ．及び代謝反応式、さらに、これまでに公開された知見を相関関係で表すことができ、当該相関関係から、各代謝反応速度を培養環境因子による関数で表現することができる。これらの一例を下記に示す。

＜前記した反応Ｎｏ．及び代謝反応式、さらにこれまでに公開された知見の相関関係の一例＞
相関関係としては、例えば、
Ｒ１∝ＤＯ，Ｔｅｍ（文献ａ、ｂ）
Ｒ２∝Ｔｅｍ（文献ｃ）
Ｒ３∝ｐＨ，ＤＯ（文献ｄ、ｅ）
・
・
・
Ｒ５３∝ｐＨ，Ｔｅｍ（文献ｆ、ｇ）
などが挙げられる（但し、ＤＯ：溶存酸素濃度、Ｔｅｍ：温度）。
つまり、反応Ｎｏ．Ｒ１は、文献ａ、ｂによればＤＯ及びＴｅｍと相関関係があり、反応Ｎｏ．Ｒ２は、文献ｃによればＴｅｍと相関関係があり、反応Ｎｏ．Ｒ３は、文献ｄ、ｅによればｐＨ及びＤＯと相関関係があり、反応Ｎｏ．Ｒ５３は、文献ｆ、ｇによればｐＨ及びＴｅｍと相関関係があると表すことができる。

＜培養環境因子による関数で表現した代謝反応速度の一例＞
そして、前記相関関係から、各代謝反応速度は培養環境因子による関数で表現することができる。培養環境因子による関数で表現した代謝反応速度は、例えば、
ｆＲ１（ｐＨ，ＤＯ，Ｔｅｍ・・・）
ｆＲ２（ｐＨ，ＤＯ，Ｔｅｍ・・・）
ｆＲ３（ｐＨ，ＤＯ，Ｔｅｍ・・・）
・
・
・
ｆＲ５３（ｐＨ，ＤＯ，Ｔｅｍ，・・・）
などと表すことができる。なお、本実施形態においては後述するように設定を変更して複数回培養を行う。言うまでもなく、前記各関数ｆＲ１…ｆＲ５３におけるｐＨ，ＤＯ，Ｔｅｍ・・・などの培養環境因子は、各回において同一の条件があてはまることになる。

そして、前記代謝反応速度と物質収支のバランスより、設定した培養条件における栄養基質消費速度及び目的物質の生産速度を推定することができる。
但し、前記相関関係及び関数（相関モデル）は細胞ごとに異なり、またこれまでの知見だけでは情報が不足する場合がある。

そこで、本実施形態では後述するように、使用する細胞を特定の培養条件で培養し、代謝解析を行う。そして、培養実験結果と相関モデルを比較し、一致しない場合、培養実験結果に近づくように相関モデルのパラメータを補正する。そして、補正後の相関モデルを用いて、目標値（例えば、目標とする代謝反応速度）となる培養条件を計算する。そして、計算によって求めた培養条件で培養を行い、培養による代謝反応速度と先ほど計算で求めていた反応速度とを比較し、一致しなければ相関モデルのパラメータを再度補正する。
この一連の操作を繰り返すと、実験による代謝反応速度と計算による代謝反応速度が一致するようになる。実験による代謝反応速度と計算による代謝反応速度が一致したときの相関モデルの精度は高く、同時に最適な培養条件となる。なお、ここでいう一致とは、対比する数値等が同一になることだけでなく、同等の効果を得ることができると考えられる範囲内になることを含む。同等の効果を得ると考えられる範囲としては、例えば、目標値±２０％、より好ましくは目標値±１０％などとすることができるが、これらに限定されず、任意に設定することができる。

このように、本実施形態によれば前記した操作を行うことによって、より確実かつ着実に最適な培養条件を得ることができるので、経験則に基づいて行っていた従来の手法と比較して、培養実験数を大幅に削減できる。また、後述するように、培養手段３を複数有していれば（図９の培養槽３７ａ～３７ｈ参照）、本実施形態に係るスクリーニング方法によって一度に多くの培養条件を評価することができる。従って、このようにした場合は、従来に比して、より短期間で最適な培養条件をスクリーニングすることができる。

［３．スクリーニング装置の実施形態］
図５は、本実施形態に係るスクリーニング装置の一例を示す概略図である。
図５に示すように、スクリーニング装置１は、目標値設定手段２と、培養手段３と、分析手段４と、解析値算出手段５と、培養条件計算手段６１と、スクリーニング手段６２とを有する。また、スクリーニング装置１は、制御手段７及び代謝データベースＤＢを有する。以下、各手段について述べる。

（目標値設定手段２）
目標値設定手段２は、培養細胞の代謝反応に関する目標値を設定する装置である。目標値設定手段２は入力手段と出力手段を備えている（いずれも図示せず）。入力手段は、目的物質を効率的に生産するための目標とする代謝反応に関する目標値を入力する機器である。入力手段としては、例えば、データ入力用のキーボードやマウスなどが挙げられる。入力データは図６中の培養条件計算手段６１に設けられたハードディスクドライブなどの記憶装置に保存される。また、出力手段は、入力手段で入力された入力値などを視認できるように表示するものである。出力手段としては、例えば、モニタや紙媒体に出力する装置（プリンタ）などが挙げられる。
前記目標値は、培養細胞の代謝反応に関するものであればどのようなものでもよく、特に限定されないが、例えば、目的物質を効率よく生産するための代謝経路モデルや代謝反応速度などが挙げられる。代謝経路モデルは、生化学的に解明・提唱されている代謝経路などに基づいて構築されたモデルなどを適用することができる。代謝経路としては、例えば、解糖系、糖新生、クエン酸回路、グリオキシル酸回路、酸化的リン酸化、ペントースリン酸回路、還元的ペントースリン酸回路、尿素回路、β酸化、アミノ酸生合成、ヌクレオチド代謝、グリコーゲン合成、脂質生合成、脂肪酸生合成、コレステロール生合成、プリン合成系、ピリミジン合成系、シキミ酸経路などが挙げられるが、これらに限定されない。

（培養手段３）
培養手段３は、設定又は変更された培養条件で培養細胞を培養する装置（培養槽）である。培養手段３は、後述する第１培養工程Ｓ２０及び第２培養工程Ｓ６０を行う（図１２参照）。なお、変更された培養条件については後述する。培養手段３が採用し得る培養方式としては、例えば、回分培養、流加培養、連続培養の３種類が挙げられる。回分培養は、一回ごとに新たな培地を用意し、そこへ細胞株を植えて収穫まで培地を加えない培養法である。流加培養は、培養中に、培地自体や培地中の特定の成分を添加し、培養終了時までその生成物を抜き取らない培養方法である。連続培養は、連続的に培養系に培地を供給すると同時に、供給した培地と同じ量の培養液Ｍを抜き取る培養法である。いずれの培養方式においても、培養環境のパラメータ（培養環境因子）として、温度、ｐＨ、溶存酸素濃度（ＤＯ）、溶存二酸化炭素濃度（ＤＣＯ_２）、液中通気による気泡、攪拌によるせん断応力などが挙げられるが、これらに限定されない。以下、各培養方式における培養装置を説明する。

（i．回分培養型培養装置）
図６は、回分培養型培養装置の概略図である。図６に示すように、培養手段３の一例である回分培養型培養装置３Ａはオンラインモニタリング手段３１により、培養液ＭのｐＨ、ＤＯ、温度などの培養環境因子の計測を行う。モニタリングされた各培養環境因子はそれぞれの計測値に基づいて予め定めた目標値に収束させるために、気相酸素濃度調節手段３２、ｐＨ調節手段３３、溶存酸素濃度調節手段３４、攪拌手段３５、温度調節手段３６などの手段ごとに独立して制御手段７により制御が行われる。制御手段７による各目標値への制御フローの各ステップにおける動作を以下に説明する。

（１）培養槽３７に設置したｐＨ、ＤＯ、温度などの各計測手段（オンラインモニタリング手段３１）により、それぞれの計測値を得る。
（２）制御手段７において、それぞれの計測値が予め設定された制御値に一致するかどうか判定する。一致する場合は（１）に戻る。一致しない場合は（３）に進む。
（３）前記（２）において、制御値に一致していないと判断された場合には、制御値に収束するよう、制御手段７により前記手段３２～３６のそれぞれに対して動作信号を伝達し、操作量を変更する。前記手段３２～３６に対する制御手法としては特に限定するものではなく、ＯＮ／ＯＦＦ制御法、比例制御法、ＰＩＤ制御法などの公知の手法を用いることができる。操作量変更後、（１）に戻る。

なお、前記手段３２～３６での操作量としては、例えば、下記（ａ）～（ｃ）が用いられる。
（ａ）ｐＨ：通気ガス中の炭酸ガス供給量の増減、及び酸性溶液又はアルカリ性溶液の注入量。
（ｂ）溶存酸素濃度及び気相酸素濃度：通気ガス中の酸素供給量の増減、培養液攪拌速度の増減、培養槽圧力の増減。
（ｃ）温度：温度調節手段３６がウォータージャケットなどの場合は、供給水温度の増減、冷却水供給速度の増減、温度調節手段３６が加熱用電気ヒーターなどの場合は、加熱用電気ヒーター供給電力量の増減、温度調節手段３６が加熱用蒸気を用いる場合は、加熱用蒸気供給量の増減。

前記（１）～（３）は、スクリーニング方法の終了命令が発せられるまで反復して実行される。反復の周期は培養する細胞Ｃの特性、及び培養手段３の動特性をもとに適宜決定されるが、概ね１秒～１０分の範囲で実施される。

（ii．流加培養型培養装置）
図７は、流加培養型培養装置の概略図である。図７に示すように、培養手段３の一例である流加培養型培養装置３Ｂは、前記した回分培養型培養装置３Ａに新鮮な培地を添加する培地添加手段３８が加わった構成となる。流加培養型培養装置３Ｂは、回分培養型培養装置３Ａと同様にｐＨ、ＤＯ、温度などをオンラインモニタリング手段３１で計測し、それぞれの計測値に基づいて予め定めた制御値に収束させるために、手段３２～３６ごとに独立して制御手段７により制御が行われる。また、培地添加手段３８に関しては、新鮮な培地が入った添加培地槽（図示せず）から培養槽３７にペリスタポンプや圧送により新鮮培地の流量や流速を制御しながら培養液Ｍに新鮮な培地を添加する。上記流量や流速は、制御手段７が設定し、調整される。

（iii．連続培養型培養装置）
図８は、連続培養型培養装置の概略図である。図８に示すように、培養手段３の一例である連続培養型培養装置３Ｃは、例えば、培養槽３７、培地添加手段３８、細胞分離手段３９を有する。連続培養型培養装置３Ｃは、流加培養型培養装置３Ｂに細胞分離手段３９が加わった構成となる。培地添加手段３８から培養槽３７へはバルブＶを介して配管Ｔ１で、培養槽３７から細胞分離手段３９へは配管Ｔ２で、細胞分離手段３９から回収容器４０へは配管Ｔ３で、細胞分離手段３９から培養槽３７へは配管Ｔ４でそれぞれ接続されている。また、これらの配管のうち、配管Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３の任意の箇所にポンプＰ１～Ｐ３が設置されている。

連続培養型培養装置３Ｃの培養槽３７には、回分培養型培養装置３Ａ、流加培養型培養装置３Ｂと同様、培養液Ｍを攪拌する攪拌手段３５が設けられている。また、培養槽３７には、液中通気のための散気管３４ａ、温度調節手段３６、及びｐＨ、ＤＯ、ＤＣＯ_２、温度などを計測するオンラインモニタリング手段３１が設けられている。なお、オンラインモニタリング手段３１のセンサは、計測対象ごとに個別に備えられている。また、図８において図示はしないが、培養槽３７は、ｐＨ、ＤＯを設定値に制御するためにアルカリ溶液添加用の配管を備えている。また、同じく図８において図示はしないが、培養槽３７は、前記したセンサで得られた値に基づいて前記培養環境を所定の設定範囲に維持するためにアルカリ添加やガス通気を制御するための装置も備えている。モニタリングされた前記各培養環境因子はそれぞれの計測値に基づいて予め定めた目標値に収束させるために、気相酸素濃度調節手段（図８に図示せず）、ｐＨ調節手段（図８に図示せず）、溶存酸素濃度調節手段（図８に図示せず）、攪拌手段３５、温度調節手段３６などの手段ごとに独立して制御手段７により制御が行われる。
培養手段３として、このような連続培養型培養装置３Ｃを用いると、培養環境を常に一定に保ち易く、生産性を安定させることができる。

なお、図８に示す培地添加手段３８は、培養槽３７内において細胞Ｃが消費した液体培地中の栄養成分ＮＣを補うため、新鮮な液体培地を培養槽３７に添加する装置である。培地添加手段３８は、新鮮な培地を一時的に貯留しておくことができる槽（容器）を有している。当該槽は、新鮮な培地を一時的に保存できる容器であればどのようなものも用いることができる。新鮮な培地は、培養しようとする細胞Ｃに応じて適宜に選択・調製することができる。

図８に図示している細胞分離手段３９は、培養槽３７の培養液Ｍから培養細胞と、抗体タンパク質などの目的物質及び老廃物を含む溶液とを分離する装置である。細胞分離手段３９は、配管Ｔ４を通じて培養細胞を培養槽３７に戻し、配管Ｔ３を通じて生産物及び老廃物を回収容器４０へ移送する。細胞分離手段３９としては、例えば、重力沈降法、遠心分離法、超音波凝集法、ろ過分離法などが挙げられ、本実施形態ではいずれの手法を用いてもよい。

図８に図示している回収容器４０は、細胞分離手段３９で分離された生産物及び老廃物を一時的に貯留しておく槽である。回収容器４０は、生産物及び老廃物を一時的に貯留しておくことができる槽（容器）であればどのようなものも用いることができる。

（複数の培養槽３７）
図６から図８は、培養槽３７を１つだけ備えている様子を図示している。一般的に、遺伝子組換えを行った細胞は複数の候補細胞株（細胞株プール）として保存される。そのため、図５に示すスクリーニング装置１は、培養槽３７を複数備え、異なる培養条件で同時に培養できるようにするのが望ましい。なお、図９は、培養槽を複数備えたスクリーニング装置を示す概略図である。図９に示すスクリーニング装置１Ａは培養手段３として、例えば、容量が１００ｍＬである培養槽３７ａ～３７ｈを備えている。なお、図９において図示はしないが、スクリーニング装置１Ａは、培養槽３７ａ～３７ｈと個別に接続された培地添加手段、細胞分離手段及び回収容器などをそれぞれ備えている。

図９に示す培養槽３７ａ～３７ｈは、図６、図７及び図８のうちのいずれかに示す構成の培養手段３を有している。従って、培養槽３７ａ～３７ｈはそれぞれが培養制御パラメータとして、攪拌回転数、温度、ｐＨ、ＤＯ、ＤＣＯ_２などを用いることができ、これらを測定して制御することが可能である。また、培養槽３７ａ～３７ｈはそれぞれが培養制御パラメータとして、培養槽３７ａ～３７ｈから細胞分離手段を経由して培養槽３７ａ～３７ｈに戻る循環速度、細胞分離手段から回収容器に送液する送液速度、培地添加手段から培養槽３７ａ～３７ｈ内に新鮮な培地を添加する添加速度及び当該培地の培地組成などが挙げられ、これらを測定して制御することが可能である。

また、培養槽３７ａ～３７ｈは、これらの培養制御パラメータを培養条件のスクリーニング対象とすることができる。生産性の高い細胞株を選別するには、候補細胞株とその細胞株に適した培養条件とをセットで検討する必要がある。そのため、本実施形態においては、図６～図８に示す培養槽３７は、１つの系統で１つの候補細胞株を種々の条件で培養することが望ましい。他方、図９に示すスクリーニング装置１Ａは、８つの培養槽３７ａ～３７ｈのそれぞれで１つの系統の細胞株を培養できるだけでなく、前記１つの系統の細胞株の培養条件の制御値を変えて種々の培養条件で培養することができる。

（分析手段４）
図５に示す分析手段４は、培養手段３で培養した培養細胞を含む培養液Ｍを分析する装置である。分析手段４による分析は、後述する解析値算出手段５で代謝解析を行うのに必要なデータ（分析結果）を得るために行う。また、分析手段４による分析は、細胞の状態が安定しているか否かを確認するために行う。

図５に示すように、分析手段４は、分析を行うにあたり、培養手段３で培養している細胞を含む培養液Ｍを無菌的にサンプリングする。培養液Ｍの無菌的なサンプリングは、図５～図８に示すサンプリング手段４１によって行うことができる。サンプリング手段４１は、図６～図８に示すように、培養槽３７に備えられたサンプリング用のポート４１ａを介して、ペリスタポンプなどのポンプＰ２（図８参照）などで吸引することによって行うことができる。培養槽３７、ポート４１ａ、後記する前処理手段４２、これらを結ぶ各種配管が耐圧ガラスやステンレスなどの耐圧性及び耐熱性を有する材料であれば、サンプリングの前後でこれらの内部を蒸気滅菌（１２１℃、２０分以上）するのが好ましい。シングルユース培養槽、シングルユースチューブなどを使用する場合は、ポート４１ａとして例えば無菌接続コネクタを使用し、サンプルごとにサンプリング用の配管を接続してもよい。培養槽３７から前処理手段４２への培養液Ｍの移送は、ペリスタポンプなどのポンプＰ２（図８参照）又は圧送で行うことができる。

図５に示す前処理手段４２は、分析手段４で培養液Ｍの成分や培養細胞の状態を分析するにあたり、分析手段４で行われる各種の分析法に適した前処理を行う装置である。前処理手段４２は、対象とする細胞や分析法により前処理方法が異なる。前処理手段４２で行われる前処理の一例（フローチャート）を図１０Ａから図１０Ｄに示す。

図１０Ａは、酵母細胞抽出物を得て分析を行うまでに実施される前処理の一例を示している。図１０Ａに示すように、まず、培養液Ｍからサンプリングを行う（ステップＳ１０１１）。サンプリングは、例えば、乾燥バイオマス５ｍｇ分を採取する。次いで、クエンチングを行う（ステップＳ１０１２）。クエンチングは、例えば、サンプリングしたものを－５０℃のメタノール（例えば、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（4-(2-HydroxyEthyl)-1-PiperazineEthaneSulfonic acid）中に６０％メタノール、ｐＨ７．５）へ注入することで行う。次いで、細胞の回収を行う（ステップＳ１０１３）。細胞の回収は、例えば、－２０℃中、１００００×ｇで５分遠心して行う。次いで、代謝産物の抽出を行う（ステップＳ１０１４）。代謝産物の抽出は、例えば、２ｍＬの沸騰水（１００℃）中で１５分間、インキュベートして行う。次いで、固形物の除去を行う（ステップＳ１０１５）。固形物の除去は、例えば、１００００×ｇで５分遠心して行う。次いで、凍結乾燥を行う（ステップＳ１０１６）。凍結乾燥は、例えば、８時間行う。次いで、誘導体化を行う（ステップＳ１０１７）。誘導体化は、例えば、５０μＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（０．１％ピリジン）と５０μＬのＮ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－Ｎ－メチル－トリフルオロアセトアミド（ＭＢＤＳＴＦＡ）を用いて、３０分、８０℃で接触させることにより行う。次いで、固形物の除去を行う（ステップＳ１０１８）。固形物の除去は、例えば、１００００×ｇで５分遠心して行う。次いで、分析を行う（ステップＳ１０１９）。分析は、例えば、ガスクロマトグラフ質量分析計などを用いて行うが、分析対象に応じて任意の手法で行うことができる。

また、図１０Ｂは、細菌性細胞抽出物を得て分析を行うまでに実施される前処理の一例を示している。図１０Ｂに示すように、まず、培養液Ｍからサンプリングを行う（ステップＳ１０２１）。サンプリングは、例えば、乾燥バイオマス５ｍｇ分を採取する。次いで、急速ろ過を行う（ステップＳ１０２２）。急速ろ過は、例えば、ニトロセルロースメンブレンフィルター（ポアサイズ０．２μｍ）を用いて２回洗浄することにより行う。そして、代謝産物の抽出（ステップＳ１０２３）、固形物の除去（ステップＳ１０２４）、凍結乾燥（ステップＳ１０２５）、誘導体化（ステップＳ１０２６）、固形物の除去（ステップＳ１０２７）、分析（ステップＳ１０２８）を順次行う。なお、代謝産物の抽出（ステップＳ１０２３）から分析（ステップＳ１０２８）は、図１０Ａを参照して説明した代謝産物の抽出（ステップＳ１０１４）から分析（ステップＳ１０１９）と同様にして行うことができる。

図１０Ｃは、培養液Ｍの培養上清から分析を行うまでに実施される前処理の一例を示している。図１０Ｃに示すように、まず、培養液Ｍからサンプリングを行う（ステップＳ１０３１）。サンプリングは、例えば、培養液５０μＬを採取する。次いで、培養液Ｍの回収を行う（ステップＳ１０３２）。培養液Ｍの回収は、例えば、１００００×ｇで５分遠心して行う。そして、凍結乾燥（ステップＳ１０３３）、誘導体化（ステップＳ１０３４）、固形物の除去（ステップＳ１０３５）、分析（ステップＳ１０３６）を順次行う。なお、凍結乾燥（ステップＳ１０３３）から分析（ステップＳ１０３６）は、図１０Ａを参照して説明した凍結乾燥（ステップＳ１０１６）から分析（ステップＳ１０１９）と同様にして行うことができる。

図１０Ｄは、バイオマス（タンパク質）加水分解物を得て分析を行うまでに実施される前処理の一例を示している。図１０Ｄに示すように、まず、培養液Ｍからサンプリングを行う（ステップＳ１０４１）。サンプリングは、例えば、乾燥バイオマス１ｍｇ分を採取する。次いで、細胞の回収を行う（ステップＳ１０４２）。細胞の回収は、例えば、１００００×ｇで５分遠心して行う。次いで、細胞の洗浄を行う（ステップＳ１０４３）。細胞の洗浄は、例えば、蒸留水を用いて１００００×ｇで５分、２回遠心して行う。次いで、細胞の加水分解を行う（ステップＳ１０４４）。細胞の加水分解は、例えば、遠心して得られた沈殿物（ペレット）と６ＭＨＣｌ溶液５０μＬとをチューブに入れ、２４時間、１０５℃で処理する。次いで、中和反応を行う（ステップＳ１０４５）。中和反応は、例えば、６ＭＮａＯＨ溶液を用いて行う。次いで、ろ過を行う（ステップＳ１０４６）。ろ過は、例えば、ポアサイズ０．２μｍの遠心式限外ろ過フィルターを用い、１００００×ｇで５分遠心して行う。そして、凍結乾燥（ステップＳ１０４７）、誘導体化（ステップＳ１０４８）、固形物の除去（ステップＳ１０４９）、分析（ステップＳ１０５０）を順次行う。なお、凍結乾燥（ステップＳ１０４７）から分析（ステップＳ１０５０）は、図１０Ａを参照して説明した凍結乾燥（ステップＳ１０１６）から分析（ステップＳ１０１９）と同様にして行うことができる。

なお、図１０Ａから図１０Ｄに示すいずれの前処理も、試薬の混合、温度制御によるインキュベーション、遠心分離、乾燥のプロセスが基本となる。また、必要な装置は、混合器、温調器、遠心分離機、乾燥機であり、これらの装置を用いたプロセスの組合せとなる。上記プロセスは手技で行うことが可能であるが、各ステップを実行する装置と、各装置の間のサンプルの移送とをロボットなどで操作する自動化で行うことが好ましい。このようにすると、前処理の確実性が向上し、短時間化及び省力化を図ることができる。

（分析手段４による分析）
スクリーニング装置１では、例えば、細胞の細胞増殖期中や、細胞増殖期が過ぎて生産物生成期に入った後、つまり、定常状態に達した後など、適宜のタイミングで培養手段３から培養液Ｍをサンプリングし、分析手段４で細胞の状態を分析する。また、分析手段４は、分析した細胞の状態を反映する、例えば、生産物生成速度、栄養基質消費速度、老廃物などの副生成物分泌速度、細胞増殖速度、細胞内代謝反応速度などの情報を適宜の手法によって分析し、得られた分析値を解析値算出手段５に送信する。分析手段４で分析され得るこれらの分析対象に関する分析方法は、例えば以下のようなものである。

（分析対象Ｉ：生産物生成速度）
生産物生成速度を求めるために、まず培養手段３内の生産物の濃度を分析する。例えば、目的とする生産物がタンパク質である場合におけるタンパク質の濃度は以下のようにして分析することができる。
タンパク質の定量ではＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）法を用いることができる。ＥＬＩＳＡ法は、測定対象のタンパク質と抗原抗体反応を示す抗体を用い、結合した抗体の蛍光又は酵素活性により、測定対象のタンパク質の濃度を算出する。ＥＬＩＳＡ法には、直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法などの方法があるが、いずれの方法で測定してもよい。
培養におけるタンパク質の濃度の経時変化を測定し、単位時間、単位細胞数あたりの生成量に換算することで、生産物生成速度を求めることができる。

（分析対象ＩＩ：栄養基質消費速度）
（分析対象ＩＩＩ：副生成物分泌速度）
栄養基質消費速度及び副生成物分泌速度（代謝物分泌速度）を求めるために、まず培養手段３内の栄養基質濃度及び副生成物濃度を分析する。なお、栄養基質とは、培地成分のうち、細胞の成長や生産物の生成に必要なものをいい、例えば、無機成分、炭素源、ビタミン類、アミノ酸類などが挙げられる。また、副生成物とは、細胞が成長したり、生産物を生成したりする過程において、副産物として生成されるものをいい、例えば、炭酸ガス、乳酸、アンモニア、ピルビン酸、クエン酸などが挙げられる。

栄養基質濃度及び副生成物濃度の測定は、例えば、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフ－タンデム質量分析計（ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ）、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）、ガスクロマトグラフ－タンデム質量分析計（ＧＣ／ＭＳ－ＭＳ）などを用いて、細胞を除いた培養液Ｍ中の成分を測定する。これらの分析法はいずれも、培養液Ｍ中の多項目の成分を一度に測定することができる。
培養における栄養基質濃度及び副生成物濃度の経時変化をそれぞれ測定し、単位時間あたりの消費量及び生成量に換算することで、栄養基質消費速度及び副生成物分泌速度をそれぞれ求めることができる。

（分析対象ＩＶ：細胞増殖速度）
細胞増殖速度を求めるために、まず培養手段３内の細胞数を分析する。細胞数の測定は、トリパンブルー染色法及び血球計算盤を用いた顕微鏡観察により行うことができる。なお、細胞数の測定は、乾燥菌体重量法、濁度法、静電容量法、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）測定、フローサイトメトリー法などの他の方法を用いて行うこともできる。
ここで、生細胞数をＸ、比増殖速度（細胞増殖速度）をμ、時間をｔとすると、細胞増殖速度μＸは式１の関係になる。

μＸ＝ｄＸ／ｄｔ・・・式１

異なる時間の２点の生細胞数が分かれば、式１を用いて比増殖速度を求めることができる。なお、異なる時間の２点のデータから比増殖速度を求めた際に、誤差の影響が無視できなくなった場合は、対数増殖している培養液Ｍを経時的にサンプリングし、より多くのデータを基に比増殖速度を推定してもよい。例えば、培養時間を横軸、生細胞数の対数値を縦軸として散布図にプロットし、その傾きを最小二乗法により計算する。このグラフが直線で得られない場合は、対象の細胞は指数増殖しておらず、培養期間中に何らかの制限因子が存在することを意味している。

（分析対象Ｖ：細胞内代謝反応速度）
代謝反応速度の分析は、前処理手段４２で処理したサンプルをＧＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳや核磁気共鳴（Nuclear Magnetic Resonance：ＮＭＲ）装置などで分析することで、細胞内の中間代謝物の同位体割合を分析する。なお、この細胞内代謝反応速度を分析するため、また、後記する代謝解析を行うため、後述するように、第１培養工程Ｓ２０（図１２参照）で同位体標識基質を用いて細胞培養を行うのが好ましい。
培養における細胞内の中間代謝物の同位体割合の経時変化を測定し、単位時間あたりの中間代謝物の同位体割合に換算することで、細胞内代謝反応速度を求めることができる。

（分析対象ＶＩ：細胞呼吸速度）
細胞呼吸速度の分析は、酸素により消光するリン光性プローブ（例えば、ＭｉｔｏＸｐｒｅｓｓなど）を用いて経時的に酸素消費速度を測定することで行うことができる。

以上に説明した分析対象Ｉ～ＶＩで得られた分析結果は、解析値算出手段５に送信され、入力値として使用される。

（解析値算出手段５）
図５に示す解析値算出手段５は、分析手段４で得られた分析結果に基づいて代謝解析を行い、解析値を算出する装置である。つまり、解析値算出手段５は、細胞Ｃ内の代謝速度を計算するための装置である。代謝解析を行う方法としては、同位体標識基質を用いる方法と同位体標識基質を用いない方法とがあり、本実施形態においてはいずれも採用することができる。なお、同位体標識基質を用いる方法を採用すると、（１）可逆反応での前向き、及び後ろ向き反応の反応速度の解析、（２）リサイクルを含む代謝経路の反応速度の解析、（３）分岐してまた合流するような代謝経路の反応速度の解析が可能であり、代謝解析の精度が上がるため好ましい。

同位体標識基質を用いる方法としては、例えば、^１３Ｃ代謝フラックス解析法（¹³C-metabolic flux analysis；^１３Ｃ－ＭＦＡ）を好適に採用し得る。^１３Ｃ－ＭＦＡは、^１３Ｃで標識された供給炭素原子が細胞内で代謝された場合や代謝経路ネットワークの異なる経路を通った場合に、同位体分布が異なることを利用する方法であり、同位体の収支から代謝反応速度を求めることができる。
同位体標識基質を用いない方法としては、例えば、代謝量論式に基づく代謝反応速度解析法（flux balance analysis；ＦＢＡ）を好適に採用し得る。ＦＢＡは、培養中の細胞の代謝物濃度の経時変化を計測し、代謝物速度と物質収支から測定できない代謝反応速度を求めることができる。
解析値算出手段５の一例として、同位体標識基質を用いて代謝解析を行う代謝フラックスの分析方法について以下に説明する。

図１１は、代謝フラックスの分析方法の概念を示す説明図である。
図１１に示すシミュレーションでは、最初にランダムな代謝フラックスの値（代謝反応速度初期値（乱数））（図１１のＲ１～Ｒ８）を与え、代謝経路モデルを基に、定常状態での細胞Ｃ内の各代謝物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、Ｚに含まれる同位体炭素の数の比を計算する。この計算値と、分析手段４で分析した（実測した）細胞Ｃ内の代謝物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、Ｚの同位体炭素数比とを比較する。そして、同位体比率分布について統計学的に有意差がない場合（一致する場合）は、推定代謝フラックスと決定される。一方、同位体比率分布について統計学的に有意に差がある場合（不一致となる場合）は、シミュレーションによる代謝物質中の同位体数炭素比の値を実験による代謝物質中の同位体炭素数比の値との平均自乗誤差が最小となるように、シミュレーションによる代謝フラックスの値を補正する。この補正は、例えば、ＱＰ（Quadratic Programming）部分問題法を適用することにより行うことができる。ＱＰ部分問題法は、生成された特定の代謝物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、Ｚの同位体炭素数比と、シミュレーションによる特定の代謝物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、Ｚの同位体炭素数比と間に統計学的な有意差が生じる場合に、両者間の平均自乗誤差が予め設定された所定範囲内に収まり、最小となるように、先にシミュレーションにより得た代謝経路Ｒ１～Ｒ８におけるそれぞれの代謝フラックスの値の中で、当該誤差に関係する代謝経路Ｒ１～Ｒ８における代謝フラックスの値を補正するというものである。前記したように、シミュレーションによる結果が不一致となる場合、補正した代謝フラックスで同位体炭素比を計算し、同位体比率分布について統計学的な有意差がなくなるまで実験による代謝物質中の同位体炭素数比の値を比較するという操作を繰り返す。シミュレーションによる結果が一致する場合、その結果により代謝反応速度（代謝フラックス）を決定する。

なお、解析値算出手段５による解析値の算出は、培養細胞が定常状態となった後に、前記代謝解析を行うことが好ましい。このようにすると、代謝解析を安定的に行うことができる。また、定常状態の判別指標が、培養細胞の栄養基質消費速度、培養細胞の副生成物分泌速度、及び培養細胞の細胞呼吸速度のうちのいずれか１つ又は２つ以上を組み合わせたものであることが好ましい。このようにすると、培養細胞が定常状態であるか否かの判別を容易且つ確実に行うことができる。培養細胞が定常状態であるか否かの判別は、解析値算出手段５が分析手段４で得られた分析結果に基づいて行うのが好ましい。図５に示すように、解析値算出手段５はそのような判別を行うための判別手段５１を有し、当該判別手段５１によって培養細胞が定常状態であることを確認してから、前記解析値の算出を行うのが好ましい。このようにすると、定常状態でない培養細胞に対して行う代謝解析を避けることができるので、省力化を図ることができる。なお、定常状態の判別については後述する。

（代謝データベースＤＢ）
図５に示す代謝データベースＤＢは、ＤＯ、Ｔｅｍ、ｐＨなどの培養環境因子と各代謝反応速度式との相関を収集した装置である。代謝データベースＤＢは、後記する培養条件計算手段６１が最適培養条件を計算する際に、予め保存されている相関モデルを当該培養条件計算手段６１に提供する。なお、図１１を参照して代謝反応の例及び相関モデルの例を説明すると、それぞれ以下のように示すことができる。ここで、以下に示す代謝反応の例及び相関モデルの例において、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｚは代謝物であり、ｆは反応速度であり、ｐＨ、ＤＯ、Ｔｅｍは培養環境因子であって、ＤＯは溶存酸素濃度であり、Ｔｅｍは温度である。

〔代謝反応の例〕
代謝反応Ｎｏ．Ｒ３：Ａ→Ｂ
代謝反応Ｎｏ．Ｒ５：Ｂ→Ｃ
代謝反応Ｎｏ．Ｒ７：Ｂ→Ｚ
・
・
・

〔相関モデルの例〕
代謝反応速度式Ｒ３：ｆ_Ａ→Ｂ∝ｐＨ，ＤＯ
代謝反応速度式Ｒ５：ｆ_Ｂ→Ｃ∝Ｔｅｍ
代謝反応速度式Ｒ７：ｆ_Ｃ→Ｚ∝ＤＯ，Ｔｅｍ
・
・
・

このように、相関モデルは、培養条件をパラメータとする代謝反応速度式を用いて構成されていることが好ましい。このようにすると、培養条件計算手段６１で培養条件を計算する際に用いられる当該パラメータと、計算されて得られた培養条件との一致性を高くすることができる。
代謝反応式の例としては、前記「＜図４に示す反応Ｎｏ．及び代謝反応式＞」における代謝反応式が挙げられる。なお、各代謝反応式における反応速度は、前記「（分析対象Ｖ：細胞内代謝反応速度）」で述べた方法で求めることができる。また、培養環境因子の例としては、ＤＯ、ＤＣＯ_２、ｐＨ、温度（Ｔｅｍ）、せん断応力、栄養基質濃度、代謝物濃度、浸透圧などが挙げられる。なお、代謝反応速度及び培養環境因子はこれらに限定されるものではない。
代謝データベースＤＢに保存されている相関モデルは、論文、雑誌、書籍、実験データなどが新たに公開されたり、スクリーニングにおける培養結果（例えば、前記解析値）が得られたりした場合に、前記代謝反応の例及び相関モデルの例に示したような形式でデータベース化を行うことにより、繰り返し補正することができる。なお、この相関モデルの繰り返し補正は、後記する培養条件計算手段６１を行う前に行うことができる。この相関モデルの繰り返し補正は、例えば、図５に示す培養条件シミュレータ６の相関モデル補正手段６０で行うことができる。相関モデル補正手段６０は、培養条件シミュレータ６が有する一機能である。この相関モデル補正手段６０では、前記解析値と、代謝データベースＤＢに保存されている相関モデルとを比較し、必要に応じて補正計算を行って、前記したように相関モデルの補正を行う。前記解析値としては、前記〔相関モデルの例〕における代謝反応式Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７…などが挙げられる。相関モデルの補正は、例えば、前記培養結果（具体的には、前記培養結果から算出される相関モデル）に対して、代謝データベースＤＢに保存されている相関モデルが±１０％を超える場合に行うのが好ましい。

（培養条件計算手段６１）
図５に示す培養条件計算手段６１は、予め設定された又は相関モデル補正手段６０で補正された相関モデルを用いて前記解析値から前記目標値に最も近くなる培養条件（最適培養条件）を計算し、前記培養手段３で設定されている培養条件を前記計算した培養条件（最適培養条件）に変更する装置である。なお、培養条件計算手段６１は、培養条件シミュレータ６が有する一機能である。培養条件計算手段６１は、例えば、目標値設定手段２で設定された培養細胞の代謝反応に関する目標値に近似させるため、前記相関モデルに対して特定の培養条件、つまり特定の培養環境因子を適用して細胞内代謝反応モデルを設定する。そして、培養条件計算手段６１は、この細胞内代謝反応モデルが前記目標値に最も近くなる培養条件を計算する。特定の培養条件は、前記した培養環境因子について設定された一定の値又は変動する値であり、前記した代謝データベースＤＢに保存されているデータに基づいて決定することができる。このようにして計算される計算値としては、相関モデルが有する代謝反応式によって算出される値の積算値などを挙げることができるが、これに限定されない。なお、前記変更した培養条件は培養手段３に送られ、設定されていた培養条件がこれに変更される。培養条件が変更されたら、培養手段３は、当該変更された培養条件で次回の細胞培養を行う。

（スクリーニング手段６２）
図５に示すスクリーニング手段６２は、複数の培養細胞及び培養条件で実施して得られた前記解析値の中から前記目標値に最も近くなる細胞株及び培養条件をスクリーニングする装置である。なお、スクリーニング手段６２は、培養条件シミュレータ６が有する一機能である。スクリーニング手段６２は、例えば、選定手段６３及び選別手段６４を有している。
選定手段６３は、複数の培養細胞及び培養条件で実施して得られた前記解析値の中から最適な培養条件を選定する手段である。
選別手段６４は、前記最適な培養条件で培養された細胞内の代謝反応速度や目的物質の生成量などを評価して細胞培養用細胞株を選別する手段である。
スクリーニング手段６２は、選定手段６３による最適な培養条件の選定と、選別手段６４による細胞株の選別とにより、前記したように、複数の培養細胞及び培養条件で実施して得られた前記解析値の中から前記目標値に最も近くなる細胞株及び培養条件をスクリーニングすることができる。

（制御手段７）
図５に示す制御手段７は、ＣＰＵ及びハードディスクドライブなどの記憶媒体を備えた汎用コンピュータやパーソナルコンピュータなどである。制御手段７は、当該記憶媒体に所定のプログラムを記憶させておき、これを読み出すことで制御手段７を所定の手段として機能させる。
制御手段７は、培養条件計算手段６１から送られてきた培養条件（最適培養条件）の各種パラメータの値を受信し、培養手段３の運転制御を行う。例えば、温度を上げる場合、培養手段３が具備する温度調節手段３６に熱を加え、温度を下げる場合は、水冷装置を駆動することで、目的の温度に調整する。ｐＨを上げる場合は、アルカリ溶液を培養手段３内に添加し、ｐＨを下げる場合は、酸性溶液を培養手段３内に添加する。溶存酸素濃度を上げる場合は、培養手段３内の培養液Ｍに空気又は純酸素を通気し、溶存酸素濃度を下げる場合は、培養手段３内の培養液Ｍに窒素を通気する。せん断応力を上げる場合は、攪拌手段３５の攪拌翼の回転数を上げ、せん断応力を下げる場合は、攪拌手段３５の攪拌翼の回転数を下げる。その他のパラメータに関してもそれぞれのパラメータの制御に適切な方法で制御する。

［４．スクリーニング方法の実施形態］
次に、スクリーニング方法の実施形態について説明する。なお、以下の説明において、スクリーニング装置１と同じ要素については同じ符号を付して詳細な説明は省略する。
図１２は、本実施形態に係るスクリーニング方法の内容を説明するフローチャートである。
図１２に示すように、スクリーニング方法は、目標値設定工程Ｓ１０と、第１培養工程Ｓ２０と、分析工程Ｓ３０と、解析値算出工程Ｓ４０と、培養条件計算工程Ｓ５０と、第２培養工程Ｓ６０と、スクリーニング工程Ｓ７０とを含む。

目標値設定工程Ｓ１０は、培養細胞の代謝反応に関する目標値を設定する工程である。この目標値設定工程Ｓ１０は、前記した目標値設定手段２で行うことができる。

第１培養工程Ｓ２０は、予め設定されている培養条件で培養細胞を培養する工程である。この第１培養工程Ｓ２０は、前記した培養手段３で行うことができる。

分析工程Ｓ３０は、第１培養工程Ｓ１０で培養した培養細胞を含む培養液を分析する工程である。分析工程Ｓ３０で行う分析は、培養細胞が定常状態であるか否かを判別するために、例えば、生産物生成速度、生産物の濃度、培地成分などの指標に関する分析値を得るために行う。この分析工程Ｓ３０は、前記した分析手段４で行うことができる。

解析値算出工程Ｓ４０は、分析工程Ｓ３０で得られた分析結果に基づいて代謝解析を行い、解析値を算出する工程である。この解析値算出工程Ｓ４０は、前記した解析値算出手段５で行うことができる。なお、本実施形態においては、この解析値算出工程Ｓ４０に先立って、分析工程Ｓ３０で得られた分析結果に基づいて培養細胞が定常状態であるか否かの判別を行う判別工程Ｓ４１（図１２において図示せず。図１３参照。）を有していてもよい。そして、解析値算出工程Ｓ４０は、培養細胞が定常状態となった後に、前記代謝解析を行うのが好ましい。このようにすると、定常状態でない培養細胞に対して行う代謝解析を避けることができるので、省力化を図ることができる。判別工程Ｓ４１は、図５に示す判別手段５１で行うことができる。
なお、解析値算出工程Ｓ４０（具体的には、判別工程Ｓ４１）における定常状態の判別指標は、培養細胞の栄養基質消費速度、培養細胞の副生成物分泌速度、及び培養細胞の細胞呼吸速度のうちのいずれか１つ又は２つ以上を組み合わせたものであるのが好ましい。このようにすると、培養細胞が定常状態であるか否かの判別を容易且つ正確に行うことができる。

培養条件計算工程Ｓ５０は、相関モデルを用いて前記解析値から前記目標値に最も近くなる培養条件を計算し、前記第１培養工程Ｓ２０で設定されている培養条件を前記計算した培養条件に変更する工程である。この培養条件計算工程Ｓ５０は、前記した培養条件計算手段６１で行うことができる。なお、本実施形態においては、この培養条件計算工程Ｓ５０の前工程として、相関モデル補正工程Ｓ５１（図１２において図示せず。図１３参照）を有していてもよい。相関モデル補正工程Ｓ５１は、スクリーニングにおける培養結果、例えば、解析値算出工程Ｓ４０で得られた解析値に基づいて代謝データベースＤＢに保存されている相関モデルの補正を行う工程である。相関モデル補正工程Ｓ５１は、図５に示す相関モデル補正手段６０で行うことができる。

第２培養工程Ｓ６０は、培養条件計算工程Ｓ５０で変更した培養条件で前記培養細胞と同じ細胞株の培養細胞を培養し、得られた培養液Ｍを前記分析工程Ｓ３０に送る工程である。この第２培養工程Ｓ６０は、第１培養工程Ｓ２０と同様、前記した培養手段３で行うことができる。つまり、第１培養工程Ｓ２０と第２培養工程Ｓ６０とは、予め設定されている培養条件で培養細胞を培養するか、培養条件計算工程Ｓ５０で変更した培養条件で培養細胞を培養するかという点で異なっているだけであり、工程の内容としては実質的に同様である。

そして、本実施形態においては、前記分析工程Ｓ３０から前記第２培養工程Ｓ６０までを複数の培養細胞及び培養条件について実施する。

スクリーニング工程Ｓ７０は、実施して得られた前記解析値の中から前記目標値に最も近くなる細胞株及び培養条件をスクリーニングする工程である。このスクリーニング工程Ｓ７０は、前記したスクリーニング手段６２で行うことができる。

（スクリーニング方法のより詳しい一態様）
以下に、スクリーニング方法のより詳しい一態様について説明する。
図１３は、本実施形態に係るスクリーニング方法のより詳しい一態様の内容を説明するフローチャートである。

図１３に示すように、スクリーニング方法は、目標値設定工程Ｓ１０と、第１培養工程Ｓ２０と、サンプリング工程Ｓ３１と、前処理工程Ｓ３２と、分析工程Ｓ３０と、判別工程Ｓ４１と、解析値算出工程Ｓ４０と、相関モデル補正工程Ｓ５１と、培養条件計算工程Ｓ５０と、第２培養工程Ｓ６０と、選定工程Ｓ７１と、選別工程Ｓ７２とを含んでいる。この態様では、サンプリング工程Ｓ３１から第２培養工程Ｓ６０までを複数の培養細胞及び培養条件で実施する。
なお、これらの工程のうち、目標値設定工程Ｓ１０、第１培養工程Ｓ２０、分析工程Ｓ３０、解析値算出工程Ｓ４０、培養条件計算工程Ｓ５０及び第２培養工程Ｓ６０は、前述した各工程と同様であるので前述した説明を参照し、ここでの説明は省略する。

サンプリング工程Ｓ３１は、培養液Ｍを無菌的にサンプリングする工程である。このサンプリング工程Ｓ３１は、前記したサンプリング手段４１で行われる。
前処理工程Ｓ３２は、サンプリングした培養液Ｍを分析するために必要な前処理を施す工程である。この前処理工程Ｓ３２は、前記した前処理手段４２で行われる。

判別工程Ｓ４１は、分析工程Ｓ３０で得られた分析値から培養細胞が定常状態であるか否かを判別する工程である。判別工程Ｓ４１による判別の結果、培養細胞が定常状態でない場合は、そのまま培養を行う（第１培養工程Ｓ２０に戻る）。判別工程Ｓ４１による判別の結果、培養細胞が定常状態である場合は、解析値算出工程Ｓ４０に進む。この判別工程Ｓ４１は、前記したように、解析値算出手段５の有する判別手段５１（図５参照）で行われる。

相関モデル補正工程Ｓ５１は、前記相関モデルをスクリーニングにおける培養結果で補正する工程である。つまり、相関モデル補正工程Ｓ５１は、例えば、解析値算出工程Ｓ４０で得られた解析値に基づいて代謝データベースＤＢに保存されている相関モデルの補正を行う工程である。この相関モデル補正工程Ｓ５１は、前記したように、培養条件シミュレータ６の有する相関モデル補正手段６０（図５参照）で行われる。相関モデル補正工程Ｓ５１は、培養条件を変更してスクリーニングを行う度に、つまり、第２培養工程Ｓ６０、分析工程Ｓ３０、解析値算出工程Ｓ４０、培養条件計算工程Ｓ５０を行う度に、スクリーニング方法を終了するまで相関モデルを繰り返し補正することができる。

選定工程Ｓ７１及び選別工程Ｓ７２は、前記したスクリーニング工程Ｓ７０で行われる工程である。
選定工程Ｓ７１は、複数の培養細胞及び培養条件で実施して得られた前記解析値の中から最適な培養条件を選定する工程である。選定工程Ｓ７１は、例えば、前記した細胞増殖速度、細胞周期及び代謝フラックスのうちの少なくとも１つの解析結果に基づいて最適な培養条件を選定するのが好ましい。この選定工程Ｓ７１は、前記した選定手段６３で行われる。
選別工程Ｓ７２は、前記最適な培養条件で培養された細胞内の代謝反応速度や目的物質の生成量などを評価して、細胞培養用細胞株を選別する工程である。この選別工程Ｓ７２は、前記した選別手段６４で行われる。

（スクリーニング方法のさらに詳しい一態様）
次に、図１４を参照してスクリーニング方法のさらに詳しい一態様を説明する。図１４は、本実施形態に係るスクリーニング方法のさらに詳しい一態様の内容を説明するフローチャートである。

図１４に示すように、スクリーニング方法は、最初に、代謝経路モデルと目標の代謝反応速度を設定する（ステップＳ１４０１）。このステップＳ１４０１は目標値設定工程Ｓ１０で行う。
次に、培養手段３に最初の培養条件を設定し（培養条件設定、ステップＳ１４０２）、培養を開始する（ステップＳ１４０３）。ここで、培養には同位体標識基質を用いるのが好ましい。このようにすると、後述する代謝解析をより正確に行うことができる。
なお、最初の培養条件の設定は、予め設定されている標準条件とすることができる。標準条件は任意に設定することができる。また、培養開始直後の培養細胞は非定常状態であるため、定刻ごとにサンプリングを行う（ステップＳ１４０４）。前記したステップＳ１４０２、Ｓ１４０３は、第１培養工程Ｓ２０で行い、ステップＳ１４０４は分析工程Ｓ３０（具体的にはサンプリング工程Ｓ３１）で行う。

そして、生産物の濃度や培地成分などを分析する（ステップＳ１４０５）。具体的には、生産物の濃度や培地成分などのほか、細胞の状態を反映する生産物生成速度、栄養基質消費速度、副生成物分泌速度などを１つ以上分析する。このステップＳ１４０５は、必要に応じて前記した前処理工程Ｓ３２を行った後、分析工程Ｓ３０で行う。
ステップＳ１４０５における分析値について経時変化がなく、一定値となったときを定常状態と判別する（ステップＳ１４０６で“定常”）。一方、前回サンプリング時と比較して、生産物の濃度、培地成分、生産物生成速度、栄養基質消費速度、副生成物分泌速度、細胞内代謝フラックスなどの値が経時変化していれば、定常状態に達していないと判断する（ステップＳ１４０６で“非定常”）。そして、ステップＳ１４０７で非定常の期間を分析し、当該期間が所定値を超えている場合、例えば、設定したサンプリング回数又は培養時間を経過しても定常状態が得られない場合、アラートを表示する（ステップＳ１４０８）。そして、非定常の期間を分析し、当該期間が所定値以下である場合、ステップＳ１４０３に戻って培養を継続する。
前記したステップＳ１４０５は分析工程Ｓ３０（及び前処理工程Ｓ３２）で行い、ステップＳ１４０６は判別工程Ｓ４１で行う。

そして、培養細胞が定常状態である場合（ステップＳ１４０６で“定常”である場合）、生産物生成速度、細胞増殖速度、代謝フラックスなどの代謝解析を行い、解析値を得る（ステップＳ１４０９）。このステップＳ１４０９では、前記したように、必要に応じてＱＰ部分問題法などによりシミュレーションを行って、代謝反応速度（代謝フラックス）を決定するのが好ましい。

そして、代謝解析で得られた解析値（例えば、代謝反応速度の解析値）を記録した後、当該解析値と、前回（Ｎ－１回目）の計算で求めた最適培養条件での最適値（例えば、代謝反応速度の最適値）とを比較する（ステップＳ１４１０）。但し、この比較が１回目である場合は、前記最適値の替わりに、ステップＳ１４０１で設定した目標値（例えば、目標の代謝反応速度など）とすることができる。

代謝解析で得られた解析値とＮ－１回目の計算で求めた最適値とが一致しない場合（ステップＳ１４１０で“不一致”）、培養環境因子と代謝反応速度などとの相関モデルを培養実験から解析した代謝反応速度に合うように相関モデルを補正する（ステップＳ１４１１）。
そして、補正後の相関モデルを用いて、ステップＳ１４０１で設定した目標値に最も近い培養条件を決定する（ステップＳ１４１２）。その後、ステップＳ１４０２に戻り、前回設定していた培養条件を前記決定した培養条件に変更して設定し（ステップＳ１４０２）、培養手段３で培養を開始する（ステップＳ１４０３）。

一方、代謝解析で得られた解析値とＮ－１回目の計算で求めた最適値が一致する場合（ステップＳ１４１０で“一致”）、培養環境因子と代謝反応速度との相関モデルは精度が高く、このときの培養条件は設定した目標値に近いように最適化されていることになる。
他の候補細胞株がある場合、さらに他の候補細胞株で上記と同様の処理を行った結果と比較し、最終的に目標値に最も近い（生産性が最も良い）細胞株及び培養条件を選定・選別し（ステップＳ１４１３）、スクリーニングを完了する。

なお、前記したステップＳ１４０９～Ｓ１４１０は培養条件計算工程Ｓ５０で行う。ステップＳ１４１１、Ｓ１４１２は相関モデル補正工程Ｓ５１で行う。ステップＳ１４１２及びステップＳ１４０２後の培養（ステップＳ１４０３）は第２培養工程Ｓ６０で行う。ステップＳ１４１３はスクリーニング工程Ｓ７０（具体的には、選定工程Ｓ７１及び選別工程Ｓ７２）で行う。

（変形例）
上記手順は一例である。他の変形例として、例えば、代謝解析において（ステップＳ１４０９）、同位体標識基質を用いた代謝解析の代わりに、培養液Ｍ中の代謝物を基に代謝フラックスを推定する方法を用いても構わない。また、ｍＲＮＡの計測により代謝フラックスを推定する方法であっても構わない。これらのようにすると、同位体元素を用いないので、操作や培養液の廃棄などが簡便であり、また、低コストで行うことができる。
また、図５においては、解析値算出手段５と培養条件シミュレータ６と制御手段７とを別個の装置として図示しているが、これらの手段を実現するプログラムを格納した１つの装置（コンピュータ）とすることができる。

以上に説明した本実施形態に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置によれば、目標値（例えば、代謝反応速度など）に近い細胞株及び培養条件を簡便にスクリーニングできる。また、スクリーニングの過程で培養環境因子と代謝反応速度などの目標値の関係を定式化（モデル化）することもできる。本実施形態に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置は、少ない培養条件で最も効率のよい代謝反応経路を見つけることができるため、低コストでスクリーニングできる。また、網羅的な代謝経路のモデル構築を行うため、副生成物等の抑制を効率的に行うことができ、本実施形態に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置で選別された細胞株を利用することで品質にばらつきが少なく、高い生産性で目的物質を得ることができる。

Ｓ１０目標値設定工程
Ｓ２０第１培養工程
Ｓ３０分析工程
Ｓ４０解析値算出工程
Ｓ５０培養条件計算工程
Ｓ６０第２培養工程
Ｓ７０スクリーニング工程
１、１Ａスクリーニング装置
２目標値設定手段
３培養手段
４分析手段
５解析値算出手段
６培養条件シミュレータ
６１培養条件計算手段
６２スクリーニング手段
７制御手段
ＤＢ代謝データベース

Claims

培養細胞の代謝反応に関する目標値を設定する目標値設定工程と、
予め設定されている培養条件で培養細胞を培養する第１培養工程と、
培養した前記培養細胞を含む培養液を分析する分析工程と、
前記分析工程で得られた分析結果に基づいて代謝解析を行い、解析値を算出する解析値算出工程と、
相関モデルを用いて前記解析値から前記目標値に最も近くなる培養条件を計算し、前記第１培養工程で設定されている培養条件を前記計算した培養条件に変更する培養条件計算工程と、
前記変更した培養条件で前記培養細胞と同じ細胞株の培養細胞を培養し、得られた培養液を前記分析工程に送る第２培養工程と、
を含み、前記分析工程から前記第２培養工程までを複数の培養細胞及び培養条件について繰り返し実施し、
繰り返し実施して得られた複数の前記解析値の中から前記目標値の±２０％となる解析値に係る細胞株及び培養条件をスクリーニングするスクリーニング工程を含み、
前記第１培養工程及び前記第２培養工程における前記培養細胞の培養が、複数の培養槽で同時に行われ、
複数の前記培養槽はそれぞれ培地添加手段及び細胞分離手段と配管により接続されており、また、前記細胞分離手段と回収容器とが配管により接続されており、
複数の前記培養槽はそれぞれに、培養制御パラメータとして、それぞれの前記培養槽から前記細胞分離手段を経由してそれぞれの前記培養槽に戻る循環速度、前記細胞分離手段から前記回収容器に送液する送液速度、前記培地添加手段からそれぞれの前記培養槽内に新鮮な培地を添加する添加速度及び当該培地の培地組成を測定して培養を制御し、
前記解析値算出工程と培養条件計算工程との間に、前記相関モデルを前記解析値算出工程で得られた解析値で補正する相関モデル補正工程を含んでいる
ことを特徴とする細胞株及び培養条件のスクリーニング方法。
請求項１において、
前記第１培養工程及び前記第２培養工程で同位体標識基質を用いることを特徴とする細胞株及び培養条件のスクリーニング方法。
請求項１において、
前記解析値算出工程は、前記培養細胞が定常状態となった後に、前記代謝解析を行うことを特徴とする細胞株及び培養条件のスクリーニング方法。
請求項３において、
前記定常状態の判別指標が、前記培養細胞の栄養基質消費速度、前記培養細胞の副生成物分泌速度、及び前記培養細胞の細胞呼吸速度のうちのいずれか１つ又は２つ以上を組み合わせたものであることを特徴とする細胞株及び培養条件のスクリーニング方法。
請求項１において、
前記相関モデルが、培養条件をパラメータとする代謝反応速度式を用いて構成されていることを特徴とする細胞株及び培養条件のスクリーニング方法。
培養細胞の代謝反応に関する目標値を設定する目標値設定手段と、
設定又は変更された培養条件で培養細胞を培養する培養手段と、
前記培養手段で培養した培養細胞を含む培養液を分析する分析手段と、
前記分析手段で得られた分析結果に基づいて代謝解析を行い、解析値を算出する解析値算出手段と、
相関モデルを用いて前記解析値から前記目標値に最も近くなる培養条件を計算し、前記培養手段で設定されている培養条件を前記計算した培養条件に変更する培養条件計算手段と、
複数の培養細胞及び培養条件で繰り返し実施して得られた複数の前記解析値の中から前記目標値の±２０％となる解析値に係る細胞株及び培養条件をスクリーニングするスクリーニング手段と、
前記相関モデルを前記解析値算出手段で得られた解析値で補正する相関モデル補正手段と、
を有し、
前記培養手段における前記培養細胞の培養が、複数の培養槽で同時に行われ、
複数の前記培養槽はそれぞれ培地添加手段及び細胞分離手段と配管により接続されており、また、前記細胞分離手段と回収容器とが配管により接続されており、
複数の前記培養槽はそれぞれに、培養制御パラメータとして、それぞれの前記培養槽から前記細胞分離手段を経由してそれぞれの前記培養槽に戻る循環速度、前記細胞分離手段から前記回収容器に送液する送液速度、前記培地添加手段からそれぞれの前記培養槽内に新鮮な培地を添加する添加速度及び当該培地の培地組成を測定して培養を制御する
ことを特徴とする細胞株及び培養条件のスクリーニング装置。
請求項６において、
前記培養手段が、連続培養であることを特徴とする細胞株及び培養条件のスクリーニング装置。