JP7320826B2

JP7320826B2 - 静菌剤、セリシン含有水性組成物及びその製造方法

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Publication number: JP7320826B2
Application number: JP2019046906A
Authority: JP
Inventors: 肇森; 英治小谷; えりか松本
Original assignee: Kyoto Institute of Technology NUC
Current assignee: Kyoto Institute of Technology NUC
Priority date: 2019-03-14
Filing date: 2019-03-14
Publication date: 2023-08-04
Anticipated expiration: 2039-03-14
Also published as: JP2020147531A

Description

本発明は、静菌剤、セリシン含有水性組成物及びその製造方法に関する。

カイコの生産する繭は主に、内側のフィブロインと外側を覆うセリシンから構成される2種類のタンパク質から構成されている（非特許文献１～３）。

内側のフィブロイン繊維は繭の約75％を占めるタンパク質であり、カイコの後部絹糸腺で作られる。一方、外側の糊状タンパク質であるセリシンは中部絹糸腺で作られる（非特許文献２、４、５）。セリシンは、主成分であるセリシン１～４を含む数種類のタンパク質で構成されている。

セリシンは長い間、生糸を精製する過程で低分子量に分解されて取り除かれ、捨てられてきた。しかし近年、セリシンに生体適合性や抗酸化作用、UVカット作用、抗癌作用などがあることが明らかになり、医療や化粧品の分野で注目されるようになってきた（非特許文献３，６）。

本発明者らは、後部絹糸腺でモンシロチョウ由来の毒性タンパク質であるピエリシン1Aを発現させる事で、後部絹糸腺の機能を失わせたカイコ系統を樹立した（特許文献１、非特許文献７）。このカイコ系統では後部絹糸腺が異常な形態を示し、フィブロイン遺伝子の発現が抑制されているため、フィブロインをほとんど含まないセリシンのみから成る繭を作製することができる。

特開2018-007569号公報

Inoue S. et al., J. Biol Chem, (2000), 275 (51), 40517-28 Tashiro T. et al., J. Cell Biol, (1970), 46 (1), 1-16 Kunz R.I. et al., Bio Med Research International, (2016), 8175701, Equb 2016 Nov 14 Takasu Y. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. (2002), 66 (12), 2715-2718. Takasu Y., et al., Insect Biochem. Melec. Biol. (2010) 40, 339-344. Joseph B. et al., Frontiers in Life Science, (2012), 6, Nos. 3-4, 55-60. Otsuki R. et al., Proc Natl Acad Sci U. S. A. (2017), 114 (26): 6740-6745.

本発明は、新たな有効成分を含む静菌剤を提供することを主な目的とする。

項１. 少なくとも１種のセリシンを有効成分とする静菌剤。
項２. 繭に含まれる完全長セリシンを含有する、セリシン含有水性組成物。
項３. さらに繭由来のフィブロインを含む、項２に記載のセリシン含有水性組成物。
項４. 少なくとも１種のセリシンを含有する繭をカオトロピック剤水溶液で処理し、次いで透析して少なくとも１種の完全長セリシンを含む水性組成物を得る工程を含む、セリシン含有水性組成物の製造方法。
項５. カオトロピック剤水溶液が５Ｍ以上の臭化リチウム水溶液である、項４に記載の製造方法。

従来、セリシンはフィブロインから構成されるシルクの精練工程で除去されていたが、その際、セリシンは加水分解されており、加水分解されていない完全長のセリシンの水性組成物は得られていなかった。

本発明は、繭を臭化リチウムのようなカオトロピック剤の水溶液で処理し、透析することで、加水分解されていない完全長のセリシンを含む水性組成物が得られ、これが強力な静菌作用を有することが明らかになった。

大腸菌（Escherichia coli）、カンジダ菌（Candida albicans）のコロニー数に対するセリシン含有水性組成物の効果を示すグラフ。*P<0.05、***P<0.001 大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ菌（Salmonella enterica）、ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、バチルス菌（Bacillus subtilis）、カンジダ菌（Candida albicans）のコロニーの大きさを示す写真。大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ菌（Salmonella enterica）、ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、バチルス菌（Bacillus subtilis）、カンジダ菌（Candida albicans）のコロニーの大きさに対するセリシン含有水性組成物の効果を示すグラフ。*P<0.05、***P<0.001 本発明のセリシン含有水性組成物(sericin)と市販のpure sericinにおけるセリシン１～４の有無を確認するための電気泳動の結果を示す写真。市販のpure sericinには未分解のセリシン１～４が含まれていないこと、本発明のセリシン含有水性組成物(sericin)にはセリシン１～４がいずれも含まれていることが明らかになった。大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ菌（Salmonella enterica）、カンジダ菌（Candida albicans）のコロニーの大きさに対するセリシン含有水性組成物の効果を示すグラフ。*P<0.05、***P<0.001

本明細書において、カオトロピック剤としては、例えば塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カルシウム、チオシアン酸マグネシウム、塩化リチウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、塩酸グアニジン、臭化水素酸グアニジン、ヨウ化水素酸グアニジン、チオシアン酸グアニジンなどが挙げられ、これらの中でも特に臭化リチウムが好ましい。

カイコから得られる繭は、特許文献１、非特許文献７に記載されるようなフィブロインフリーであり、セリシンが主成分である繭が好ましく用いられるが、フィブロインをセリシンよりも多く含む繭、例えばセリシン約２０～３０質量％、フィブロイン約７０～８０質量％を含む繭を使用しても、静菌作用を有するセリシン水性組成物が得られる。

本明細書において、「セリシン含有水性組成物」は、セリシンを含む水溶液、ゾル、ゲルなどの形態を含むものである。セリシン含有水性組成物は静菌剤として有用である。

フィブロインが主成分であり、セリシン含量がフィブロイン含量よりも低い繭をカオトロピック剤水溶液で処理した場合、得られるセリシン含有水性組成物中のタンパク質は、繭に含まれるタンパク質含量を反映するものになり、セリシン含量がフィブロイン含量よりも低くなるが、このような水性組成物であっても静菌作用を有するので、本発明のセリシン含有水性組成物に包含される。

セリシン含有水性組成物に含まれるセリシンは、セリシン１～４が主成分であり、セリシン１～４以外の少なくとも１種のセリシンが含まれていてもよい。

本明細書において、「少なくとも１種のセリシン」は、セリシン１、セリシン２、セリシン３、セリシン４からなる群から選ばれる少なくとも１種を含むことを意味する。繭のセリシンは、セリシン１～４を含むので、本発明の静菌剤は、セリシン１～４を含むものが好ましい。繭のセリシンはカオトロピック剤によりほとんど或いは完全に溶解するので、セリシンの原料として繭を使用した場合には、セリシン含有水性組成物中のセリシン組成は、繭のセリシン組成を実質的に反映することになる。本発明の静菌剤は、大腸菌等の宿主で製造された遺伝子組換えセリシンを含むものであってもよい。

本発明のセリシン含有水性組成物中のセリシン濃度は、好ましくは0.001～4質量％程度、より好ましくは0.01～3質量％程度、さらに好ましくは0.1～2質量％程度、特に好ましくは0.5～1質量％程度である。セリシン濃度が低すぎると静菌作用を示さなくなる。

本発明において、静菌作用を有するセリシンは、分解されていない完全長のセリシンである。上記の濃度は完全長セリシンの濃度であって、加水分解されたセリシンは考慮しない。

静菌作用の対象となる微生物としては、グラム陰性菌、真菌と一部のグラム陽性菌が挙げられる。ブドウ球菌に対しては有意な静菌作用を示さない。グラム陰性菌としては、ナイセリア、淋菌、髄膜炎菌、百日咳菌、気管支敗血症菌、大腸菌、シトロバクター、サルモネラ、チフス菌、パラチフスA菌、パラチフスB菌、腸炎菌、赤痢菌、エンテロバクター、ペスト菌、ビブリオ、コレラ菌、腸炎ビブリオ、シュードモナス、緑膿菌などが挙げられる。真菌としては、真菌としては、アスペルギルス、カンジダ、皮膚糸状菌などが挙げられる。

本発明の静菌剤は、特にグラム陰性菌、真菌の増殖を抑制することができる。

静菌作用を有するセリシン含有水性組成物は、以下のカオトロピック剤による処理工程と透析工程により調製される。
（１）カオトロピック剤による処理工程
繭をカオトロピック剤水溶液に浸漬し、20～40℃で、1～24時間処理することにより、繭が可溶化され、セリシンとカオトロピック剤を含む水溶液が得られる。カオトロピック剤の濃度は、好ましくは5～7Ｍ程度、より好ましくは5.7～6.3Ｍ程度である。セリシンは6Ｍ程度のときに最もよく溶解し、フィブロインは8～9Ｍ程度でより速やかに溶解する。

カオトロピック剤による処理工程は、ボルテックス、撹拌もしくは超音波を適用することで、繭の溶解を速めることができる。得られた溶液は、フィルターによりろ過してもよい。例えばフィブロインを多く含む繭をカオトロピック剤水溶液で短時間処理した場合、セリシンは溶解するがフィブロインは一部溶解していない場合が考えられ、そのような場合、ろ過を行うことによりセリシン含量を高めることができる。

（２）透析工程
繭をカオトロピック剤で処理した溶液は、次に透析工程を行うことによりカオトロピック剤、或いはその他の低分子量の不純物を除去することができる。透析は、緩衝液中で行ってもよい。緩衝液としては、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グリシン緩衝液などが挙げられる。透析工程において、水交換を行ってもよい。

透析で得られたセリシン含有水性組成物中のセリシン濃度は、例えば0.5～1.2質量％程度である。透析後のセリシン含有水性組成物は遠心分離を行って沈殿物を除去し、さらに精製を行ってもよい。また、セリシン含有水性組成物中のセリシン濃度は、濃縮或いは希釈を行ってもよい。

以下、実施例及び比較例によって本発明をより詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例１
（１）材料
繭は、京都工芸繊維大学で飼育したピエリシン1Aを後部絹糸腺で発現するピエリシン系統カイコの繭を用いた。使用したピエリシン系統カイコの繭は、フィブロインを含まず、ほぼセリシンからなる繭であった。

大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ菌（Salmonella enterica）、ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、バチルス菌（Bacillus subtilis）、カンジダ菌（Candida albicans）に対する静菌活性を測定した。

（２）方法
2-1 セリシンの抽出
6Mリチウムブロマイド溶液24mlに、ピエリシン系統カイコの繭650mgを添加し、室温で16時間静置した後、ボルテックスを行い溶解させた。この溶液に1M Tris-HCLバッファー6mlを添加して転倒混和した後、7000rpm、30分間遠心分離した。得られた上清を純水中で30時間透析した。途中、2L×4回の水交換を行った。透析後の溶液を50mlチューブに移し、7000rpm、30分間遠心分離した上清をセリシン含有水性組成物とした。
2-2 微生物に対する作用の調査
LB寒天培地に滅菌水、またはセリシン含有水性組成物を滴下し、スプレッダーで全面に塗り広げ、10分間風乾した。次に、菌液を滴下し、スプレッダーで全面に塗り広げて10分間風乾した。

乾燥後、E.coliは37℃で48時間、S.enterica、S. aureus、B.subtilisは37℃で16時間、C.albicansは25℃で4日間、それぞれ培養を行った。培養後のコロニーを写真撮影し、画像ソフト（ImageJ）でコロニーの面積を測定した。また、大腸菌、カンジダについてはコロニー数を計測した。

（３）結果
ピエリシン系統の形質転換カイコが作ったセリシンのみから成る繭から得たセリシン含有水性組成物（図１では「sericin」と表記）を塗布した培地で培養した所、E.coli及びC.albicansのコロニー数に変化は見られなかった（図１）。図１中、「control」は、セリシン含有水性組成物の代わりに滅菌水を塗布したものである。

セリシンを塗布した培地で培養すると、滅菌水を塗布した培地で培養した場合と比べて、E.coli、S.enterica、B.subtilis、C.albicansのコロニー面積が減少した。特に、E.coli、S.entericaに対する生育阻害が顕著であった(図２、図３、表１)。一方、S. aureusのコロニー面積は変化しなかった(図２、図３)。

図１～３、表１の結果から、セリシン含有水性組成物は、殺菌作用はなく(図１)、有意な静菌作用を有することが明らかになった(図２、図３、表１)。

一方、図４に示す通り、ピエリシン系統の形質転換カイコが作ったセリシンのみから成る繭を電気泳動した場合、セリシン１（S1）、セリシン２（S2）、セリシン３（S3）、セリシン４（S4）のバンドが観察されるのに対して、市販のセリシン（pure sericin）の場合、S1からS4のいずれのバンドも確認できなかった。これは、pure sericinが繭糸や生糸に含まれるセリシンを除去する工程（この工程を精練と呼ぶ）の廃液から回収されたものであり、この精練の工程の際にセリシンが分解されていることを示している。そして、この分解を受けたセリシンには静菌作用は見られなかった（図５）。

これらの結果から、構造の壊れていないセリシン（完全長セリシン）にはこれらの微生物を殺す作用は無いが、成長を抑制する能力があることが示された。

ヒトの表皮には、良い作用を持つものから悪い作用を持つものまで、様々な微生物が共生している。

Claims

少なくとも１種の完全長セリシンを有効成分とする静菌剤。
グラム陰性菌及び真菌の増殖を抑制する、請求項１に記載の静菌剤。
大腸菌及びサルモネラの増殖を抑制する、請求項２に記載の静菌剤。
フィブロインフリーの、請求項１～３のいずれか一項に記載の静菌剤。