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JP7326281B2 - 抗アルファシヌクレイン抗体 - Google Patents
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JP7326281B2 - 抗アルファシヌクレイン抗体 - Google Patents

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Description

本発明は、抗アルファシヌクレイン抗体及びそれを使用してシヌクレイノパチーを処置する方法に関する。特に、本発明は、抗ヒトアルファシヌクレイン抗体及びパーキンソン病の処置におけるその使用に関する。
アルファシヌクレインは、根本的に異なる形態で存在する小さい可溶性の１４０アミノ酸長のタンパク質である。アルファシヌクレインは、主にシナプス前神経終末において見られ、その正確な機能は未知であるが、研究者は、複数の神経変性プロセスにおいて中心的な役割を果たすと考えている。
過去１５年かけて、アルファシヌクレインは、パーキンソン病のすべての形態の病態形成において重要な役割を果たすとわかった。アルファシヌクレイン遺伝子の遺伝子突然変異又は遺伝子増殖は、家族性早期発症パーキンソン病（ＰＤ）を引き起こす。興味深いことに、遺伝子座多重化家族においては、病原性の影響は、遺伝子量に明確に依存している。遺伝子二重化は、通常の疾患経過を有するＰＤの比較的早期の発症形態（約４７歳）を引き起こすが、遺伝子三重化は、極めて早期の発症年齢（約３３歳）及び極めて迅速な疾患経過に関連する。パーキンソン病のすべての形態において、アルファシヌクレインは、この疾患の重要な病理学的特徴であるレビー小体の主な成分である。
レビー小体病理は、疾患の経過の間に拡大し、アルファシヌクレインは、プリオン様タンパク質として作用し、これがミスフォールディングして、罹患ニューロンから非罹患ニューロンに広がり得る毒性オリゴマー及び凝集物を形成すると提唱されている（Ｏｌａｎｏｗ Ｃ．Ｗら Ｍｏｖｅｍｅｎｔｓ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、第２８巻、１号、２０１３年）。現在存在する療法は、疾患の広がりを停止することは不可能であり、運動ニューロン依存性活動の進行性喪失に関連する症状の処置を補助するのみである。２０１４年に、Ｔｒａｎ Ｈ．Ｔ．ら（Ｔｒａｎ Ｈ．Ｔ．ら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ 第７巻、２０５４～２０６５頁、２０１４年６月２６日）は、アルファシヌクレイン事前形成繊維を予め線条体内注射されたマウスへの、ミスフォールディングしたアルファシヌクレインに対するモノクローナル抗体の腹膜内投与は、レビー小体病理を低減し、黒質ドーパミン作動性ニューロン喪失を回復させ、運動機能障害を改善することを示した。したがって、ＰＤ及びその他のシヌクレイノパチーにおいて治療効果を発揮し得る受動免疫療法が依然として必要である。
本発明は、以下の実施形態による抗アルファシヌクレイン抗体を提供することによって上記で特定された必要性に対処する。
実施形態１：アルファシヌクレインと結合する抗体又はその抗原結合断片であって、抗体又はその断片が
ａ．配列番号１から選択されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２によるＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３によるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域、並びに
ｂ．配列番号４によるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５から選択されるＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６から選択されるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域
を含む、抗体又はその抗原結合断片。
実施形態２：配列番号３における位置６のアミノ酸残基グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）が、アラニン（Ａｌａ；Ａ）によって置き換えられている、実施形態１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
実施形態３：配列番号８における位置１１３から１２９の間のアルファシヌクレインの２個以上のアミノ酸残基と結合し、少なくともアミノ酸残基Ｄ１１９、Ｎ１２２及びＹ１２５と結合する、実施形態１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
実施形態４：アルファシヌクレイン繊維によって誘導されるアルファシヌクレインの凝集を防止する、実施形態１から３までのいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
実施形態５：モノマーとしてのアルファシヌクレイン、及び繊維状のアルファシヌクレインと結合することが可能である、実施形態１から４までのいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。
実施形態６：モノマーとしてのアルファシヌクレインと比較して、繊維状のアルファシヌクレインに対してより高い結合親和性を有する、実施形態１から４までのいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片において、繊維状のアルファシヌクレインに対してよりも、モノマーアルファシヌクレインに対して少なくとも１０倍高い解離定数（ＫＤ）を特徴とする抗体又はその抗原結合断片。
実施形態７：６０ｐＭ以下の繊維状のアルファシヌクレインに対する（ＫＤ）を有する、実施形態１から６までのいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。
実施形態８：抗体が、キメラ、ヒト化又はヒト抗体である、実施形態１から７までのいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。
実施形態９：抗体が全長抗体である、実施形態１から８までのいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。
実施形態１０：全長抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４又はＩｇＧ４Ｐから選択される、実施形態９に記載の抗体又はその抗原結合断片。
実施形態１１：抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ又はＶＨＨから選択される、実施形態１から１０までのいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。
実施形態１２：抗体又はその断片が、
ａ．配列番号１３による軽鎖可変領域及び配列番号２５から選択される重鎖可変領域、又は
ｂ．配列番号１７による軽鎖可変領域及び配列番号２５から選択される重鎖可変領域、又は
ｃ．配列番号２１による軽鎖可変領域及び配列番号２５から選択される重鎖可変領域
を含む、実施形態１から１１までのいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。
実施形態１３：抗体又はその断片が、
ａ．配列番号１４による軽鎖及び配列番号２６による重鎖、又は
ｂ．配列番号１８による軽鎖及び配列番号２６による重鎖、又は
ｃ．配列番号２２による軽鎖及び配列番号２６による重鎖
を含む、実施形態１から１１までのいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。
実施形態１４：実施形態１から１３までのいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする単離ポリヌクレオチド。
実施形態１５：ポリヌクレオチドが、
ａ．軽鎖可変領域をコードし、該ポリヌクレオチドは、
ｉ．配列番号１５、１９若しくは２３に対して少なくとも９０％同一である、又は
ｉｉ．配列番号１５若しくは１９若しくは２３を含む、又は
ｉｉｉ．本質的に配列番号１５、１９若しくは２３からなり、或いは
ｂ．重鎖可変領域をコードし、該ポリヌクレオチドは、
ｉｖ．配列番号２７に対して少なくとも９０％同一である、又は
ｖ．配列番号２７を含む、又は
ｖｉ．本質的に配列番号２７からなり、或いは
ｃ．軽鎖をコードし、該ポリヌクレオチドは、
ｖｉｉ．配列番号１６、２０若しくは２４に対して少なくとも９０％同一である、又は
ｖｉｉｉ．配列番号１６、２０若しくは２４を含む、又は
ｉｘ．本質的に配列番号１６、２０若しくは２４からなり、或いは
ｄ．重鎖をコードし、該ポリヌクレオチドは、
ｘ．配列番号２８に対して少なくとも９０％同一である、又は
ｘｉ．配列番号２８を含む、又は
ｘｉｉ．本質的に配列番号２８からなる、
実施形態１４に記載の単離ポリヌクレオチド。
実施形態１６：実施形態１４又は１５に記載の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むクローニング又は発現ベクター。
実施形態１７：ａ．実施形態１４若しくは１５に記載の１つ若しくは複数のポリヌクレオチド、又は
ｂ．実施形態１６に記載の１つ若しくは複数の発現ベクター
を含む、宿主細胞。
実施形態１８：実施形態１から１３までのいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片の生産のための方法であって、実施形態１７に記載の宿主細胞を、抗体又はその抗原結合断片を生産するのに適した条件下で培養し、抗体又はその抗原結合断片を単離することを含む、方法。
実施形態１９：実施形態１から１３までのいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片と、１つ又は複数の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤とを含む医薬組成物であって、１つ又は複数のさらなる有効成分を含む、医薬組成物。
実施形態２０：治療において使用するための、実施形態１から１３までのいずれか１つに記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は実施形態１９に記載の医薬組成物。
実施形態２１：１つ又は複数のシヌクレイノパチーの処置において使用するための、実施形態１から１３までのいずれか１つに記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は実施形態１９に記載の医薬組成物。
実施形態２２：シヌクレイノパチーが、パーキンソン病（ＰＤ）（パーキンソン病の特発性及び遺伝性形態を含む）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病のレビー小体異型（ＬＢＶＡＤ）、アルツハイマー病及びパーキンソン病の合併、多系統萎縮症（ＭＳＡ）及び脳内鉄沈着を伴う神経変性１型（ＮＢＩＡ－１）から選択される、実施形態２１に記載の使用の抗体又はその抗原結合断片。
実施形態２３：シヌクレイノパチーがパーキンソン病である、実施形態２２に記載の使用の抗体又はその抗原結合断片。
実施形態２４：患者においてシヌクレイノパチーを処置する方法であって、前記患者に、実施形態１から１３までのいずれか１つに記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は実施形態１９に記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
実施形態２５：シヌクレイノパチーが、パーキンソン病（ＰＤ）（パーキンソン病の特発性及び遺伝性形態を含む）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病のレビー小体異型（ＬＢＶＡＤ）、アルツハイマー病及びパーキンソン病の合併、多系統萎縮症（ＭＳＡ）及び脳内鉄沈着を伴う神経変性１型（ＮＢＩＡ－１）から選択され、好ましくは、パーキンソン病である、実施形態２４に記載の方法。
実施形態２６：シヌクレイノパチーの診断において、好ましくは、パーキンソン病の診断において使用するための、実施形態１から１３までのいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片又は実施形態１９に記載の医薬組成物。
図１（Ａ）は、アルファシヌクレイン発現のサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。Ｈｉｓタグを有するアルファシヌクレイン（１）、ＴＥＶプロテアーゼによるＨｉｓタグの除去後のアルファシヌクレイン（２）、ＴＥＶプロテアーゼ処置ヒトアルファ－シヌクレインでのＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５サイズ排除クロマトグラフィー（３）。タンパク質分子量マーカーＳｅｅＢｌｕｅＰｌｕｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｍ）。 図１（Ｂ）は、野生型のタグのないタンパク質としてのＥｘｐｉ２９３上清から精製されたヒトアルファ－シヌクレインのＳＤＳ－ＰＡＧＥ（４）を示す図である。タンパク質分子量マーカーＳｅｅＢｌｕｅＰｌｕｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｍ）。 蛍光のないモノマーの、及び５４０ｎｍの最大蛍光を有する繊維のＪＣ－１アッセイによる繊維解析を示す図である。 モノマーヒトアルファ－シヌクレインのランダムコイルスペクトラム（波長１６４６ｃｍ－１）及び組換えヒトアルファ－シヌクレイン繊維におけるβシート間形成（波長１６２５～１６３０ｃｍ－１）の典型例を示す図である。 ＥＬＩＳＡ結合アッセイを示す図である。 図３Ａは、マウス５８１１ Ｆａｂ１０ＨＩＳの、組換えヒトアルファシヌクレインモノマー及び繊維、並びにヒトアルファシヌクレインのペプチドＰＶＤＰＤＮＥＡＹＥとのＥＬＩＳＡ結合の図である。 図３Ｂは、マウス５８１１ ＩｇＧ１の、組換えヒトアルファシヌクレインモノマー及び繊維とのＥＬＩＳＡ結合の図である。 図４Ａは、マウス５８１１ ＩｇＧ１の、ヒトアルファ－シヌクレイン及びヒトベータ－シヌクレインとの結合を示すウエスタンブロットを示す図である。１．ヒトアルファ－シヌクレイン、２．ヒトアルファ－シヌクレイン（ｒＰｅｐｔｉｄｅ）、３．ヒトベータ－シヌクレイン（ｒＰｅｐｔｉｄｅ）；マーカー、ＭａｇｉｃＭａｒｋ ＸＰ。 図４Ｂは、ヒトアルファシヌクレイン上のマウス５８１１ Ｆａｂの予測されるエピトープを示すＮＭＲ化学シフト変化を示す図である。 ５８１１ Ｆａｂの、固定化アルファシヌクレインとの結合の阻害を示す図である（試験されたペプチド各々は、それぞれ、左側のバーがモノマーであり右側が繊維である）。 エピトープの特性決定のためのアラニンスキャニングのウエスタンブロットを示す図である。 図６Ａは、ヒトアルファ－シヌクレイン（Ｈｉｓタグが付いた）野生型及び単一アミノ酸突然変異体の４～１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ ＮｕＰａｇｅ解析を示す図である。レーン：Ｍ、ＳｅｅＢｌｕｅＰｌｕｓ２、１．ｈ ａ－ｓｙｎ Ｖ１１８Ａ、２．ｈ ａ－ｓｙｎ Ｄ１１９Ａ、３．ｈ ａ－ｓｙｎ Ｐ１２０Ａ、４．ｈ ａ－ｓｙｎ Ｄ１２１Ａ、５．ｈ ａ－ｓｙｎ Ｎ１２２Ａ、６．ｈ ａ－ｓｙｎ Ｅ１２３Ａ、７．ｈ ａ－ｓｙｎ Ａ１２４Ｓ、８．ｈ ａ－ｓｙｎ Ｙ１２５Ａ、９．ｈ ａ－ｓｙｎ Ｅ１２６Ａ、１０．ｈ ａ－ｓｙｎ Ｍ１２７Ａ、１１．ｈ ａ－ｓｙｎ Ｐ１２８Ａ、１２及び１３．ｈ ａ－ｓｙｎ野生型。 図６Ｂは、一次抗体として５８１１ ｍＦａｂを使用するＰＶＤＦブロットを示す図である。 図６Ｃは、一次抗体として５８１１ ｍＩｇＧを使用するＰＶＤＦブロットを示す図である。レーン：Ｍ、ＳｅｅＢｌｕｅＰｌｕｓ２、１．ｈ ａ－ｓｙｎ Ｖ１１８Ａ、２．ｈ ａ－ｓｙｎ Ｄ１１９Ａ、３．ｈ ａ－ｓｙｎ Ｐ１２０Ａ、４．ｈ ａ－ｓｙｎ Ｄ１２１Ａ、５．ｈ ａ－ｓｙｎ Ｎ１２２Ａ、６．ｈ ａ－ｓｙｎ Ｅ１２３Ａ、７．ｈ ａ－ｓｙｎ Ａ１２４Ｓ、８．ｈ ａ－ｓｙｎ Ｙ１２５Ａ、９．ｈ ａ－ｓｙｎ Ｅ１２６Ａ、１０．ｈ ａ－ｓｙｎ Ｍ１２７Ａ、１１．ｈ ａ－ｓｙｎ Ｐ１２８Ａ、１２．ｈ ａ－ｓｙｎ ｗｔ（Ｈｉｓタグが付いた）、１３．ＭａｇｉｃＭａｒｋ ＸＰ、１４．ｈ ａ－ｓｙｎ野生型（タグなし）。 軽鎖ヒト化を示す図である。５８１１は、ラット軽鎖可変鎖配列についてである。５８１１ｇＬ５、５８１１ｇＬ８及び５８１１ｇＬ１４は、アクセプターフレームワークとしてＩＧＫＶ１－３９ヒト生殖系列を使用する抗体５８１１軽鎖可変鎖のヒト化グラフトについてである。ＣＤＲは、太字で／下線が引かれて示されている。ドナー残基は、太字／イタリック体で示されており、影が付けられている：Ｙ７１。潜在的な脱アミド化部位を修飾するＣＤＲ－Ｌ３中の突然変異は、太字で／下線が引かれて示されており、影が付けられている：Ｇ９４Ａ。 重鎖ヒト化を示す図である。５８１１は、ラット重鎖可変鎖配列についてである。５８１１ｇＨ４は、アクセプターフレームワークとしてＩＧＨＶ３－１５ヒト生殖系列を使用する抗体５８１１重鎖可変のヒト化グラフトについてである。ＣＤＲは、太字で／下線が引かれて示されている。ドナー残基は、太字／イタリック体で示されており、影が付けられている：Ａ４９及びＡ１００。 免疫組織化学を示す図である。（Ａ～Ｅ）ＰＤ及び（Ｆ～Ｈ）非ＰＤ患者から得た脳切片における免疫反応性。（Ａ～Ｃ）ＰＤ患者の側頭皮質における、いくつかの細胞の抗体５８１１ ｍＩｇＧ１標識されたニューロピル及び細胞質、時折、レビー小体様構造が観察された（白色矢印）。（Ｄ、Ｅ）ＰＤ患者の黒質中の抗体５８１１ ｍＩｇＧ１標識されたレビー小体様特徴（白色矢印）。（Ｆ、Ｇ）非ＰＤ側頭皮質組織における、同様に抗体５８１１ ｍＩｇＧ１標識されたニューロピルが観察されたが、レビー小体様構造は観察されなかった。（Ｈ）非ＰＤ個体の黒質においてレビー小体様構造は観察されなかった、黒色矢印は、ニューロメラニン含有ニューロン及び神経線維に対応する非特異的標識を示す。スケールバー＝５０μｍ。 細胞ベース凝集アッセイ（ＨＥＫ細胞）を示す図である。本発明の抗体は、アルファ－シヌクレイン繊維によって誘導されたアルファシヌクレイン凝集を阻害でき、５ｎＭ未満のＩＣ５０を有していた。エラーバーは、測定の標準誤差を表す（ＳＥＭ、Ｎ＝４、ｎ＝１２）。 細胞ベース凝集アッセイ（一次ニューロン）を示す図である。本発明による抗体は、内因性レベルのアルファシヌクレインを発現するマウス一次ニューロンでアルファシヌクレイン繊維によって誘導されるアルファシヌクレイン凝集を阻害でき、５ｎＭ未満のＩＣ５０を有していた。エラーバーは、平均の標準誤差を表す（ＳＥＭ、Ｎ＝５、ｎ＝１７）。 マウスＰＦＦに注射した、ＳＮＣＡ－ＯＶＸマウスの異なる脳領域におけるアルファシヌクレイノパチー病理（矢印）の免疫組織化学写真を示す図である。 大脳皮質、線条体、及び黒質におけるＳＮＣＡ－ＯＶＸマウスの異なる脳領域におけるアルファシヌクレイノパチー病理の定量化を示す図である。 野生型マウスにおけるアルファシヌクレイン抗体５８１１の薬物動態プロフィールを示す図である。
本開示を、その個々の制限されない態様及び実施形態に関して、特定の図及び例を参照して以下説明する。
技術用語は、特に明記されない限り、その常識によって使用される。特定の意味が、ある用語に伝えられている場合、用語の定義は、その用語が使用されている文脈で与えられる。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が、本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、それは他の要素を除外しない。本開示の目的のために、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｆ）」の好ましい実施形態であると考えられる。
例えば「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」の単数名詞を指すときに不定冠詞又は定冠詞が使用されている場合、これは、別に特に明記されない限り、その名詞の複数形も含む。
本明細書において、用語「処置」、「処置する」などは、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患又はその症状を完全に若しくは部分的に防止するという点で予防的であり場合もあり、及び／又は疾患及び／又は疾患に起因する有害作用の部分的若しくは完全治癒の点で治療的である場合もある。したがって、処置は、哺乳動物における、特に、ヒトにおける疾患の任意の処置も対象とし、（ａ）疾患にかかりやすい可能性があるが、まだそれを有していると診断されていない対象において疾患が生じることを防止すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発生を停止すること及び（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすことを含む。
「治療有効量」とは、疾患を処置するために哺乳動物又はその他の対象に投与される場合に、疾患に対してこのような処置をもたらすのに十分である抗アルファシヌクレイン抗体又はその抗原結合断片の量を指す。治療有効量は、抗アルファシヌクレイン抗体又はその抗原結合断片、疾患及びその重症度及び処置される対象の年齢、体重などに応じて変わる。
用語「単離された」とは、本明細書を通じて、抗体、抗原結合断片又はポリヌクレオチドは、場合によっては、天然に生じ得るものとは異なる物理的環境中に存在することを意味する。
本発明は、アルファシヌクレインと結合する抗体又はその抗原結合断片を提供し、抗体又はその断片は、
ａ．配列番号１から選択されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２によるＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３によるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域、並びに
ｂ．配列番号４によるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５から選択されるＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６から選択されるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域
を含む。
一実施形態では、配列番号３における位置６のアミノ酸残基グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）は、アラニン（Ａｌａ；Ａ）によって置き換えられる。
アルファシヌクレイン（又はアルファｓｙｎ；α－シヌクレイン；α－ｓｙｎ又は任意のその他の既知同義語）とは、このタンパク質の一般名を指し、制限されるものではないが、選択的スプライシングバリアント、突然変異体及びその他の種（マウス、サルなど）に由来するアルファシヌクレインを含む。特に断りのない限り、ヒトアルファシヌクレインが意図される又は明確に記載される場合には、このようなアルファシヌクレインは、配列番号８に、又はＵｎｉｐｒｏｔ Ｐ３７８４０において与えられる配列を含む。
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ（配列番号８）
用語「抗体」とは、本明細書において、一般に、無傷の（全）抗体、すなわち、２つの重鎖及び２つの軽鎖の要素を含む抗体に関する。抗体は、例えば、ＷＯ２００７／０２４７１５において開示されるような分子ＤＶＤ－Ｉｇ又はＷＯ２０１１／０３０１０７に記載されるいわゆる（ＦａｂＦｖ）２Ｆｃのように、さらなる追加の結合ドメインを含み得る。したがって、本明細書において使用されるような抗体は、二価、三価又は四価全長抗体を含む。
抗体の抗原結合断片は、一本鎖抗体（すなわち、全長重鎖及び軽鎖）、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ－Ｆｖ、Ｆａｂ－ｄｓＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価、三価又は四価抗体、Ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ダイアボディー、トリボディー（ｔｒｉｂｏｄｉｅｓ）、トリアボディー（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディー（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）及び上記のもののいずれかのエピトープ結合断片を含む（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．第２３巻（９号）：１１２６～１１３６頁；Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ、２００５年、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ－Ｏｎｌｉｎｅ 第２巻（３号）、２０９～２１７頁を参照のこと）。これらの抗体断片を作製及び製造する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｖｅｒｍａら、１９９８年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２１６巻、１６５～１８１頁を参照のこと）。ＷＯ２００９／０４０５６２においてＦａｂ－Ｆｖ形式が最初に開示され、そのジスルフィド安定化型、Ｆａｂ－ｄｓＦｖは、ＷＯ２０１０／０３５０１２において最初に開示された。本発明において使用するためのその他の抗体断片として、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されるＦａｂ及びＦａｂ’断片が挙げられる。多価抗体は、多重特異性、例えば、二重特異性を含み得る、又は単一特異性であり得る（例えば、ＷＯ９２／２２５８３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照のこと）。後者の１つのこのような例として、ＷＯ９２／２２５８３に記載されるようなＴｒｉ－Ｆａｂ（又はＴＦＭ）がある。
代替的な抗原結合断片は、２つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖに連結されたＦａｂを含み、各ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは、同一又は異なる標的と結合する（例えば、治療的標的と結合する１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖと、例えば、アルブミンへの結合によって半減期を増大する１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖ）。このような抗体断片は、その全文で参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開ＷＯ２０１５／１９７７７２に、特に、抗体断片の考察に関して記載されている。
通常のＦａｂ’分子は、重鎖が、可変領域ＶＨ、定常ドメインＣＨ１及び天然又は修飾ヒンジ領域を含み、軽鎖が、可変領域ＶＬ及び定常ドメインＣＬを含む重鎖及び軽鎖対を含む。本開示によるＦａｂ’の二量体は、Ｆ（ａｂ’）２を形成し、これは、例えば、ヒンジを介する二量体化であり得る。
本発明による抗体又はその抗原結合断片は、アルファシヌクレインのエピトープと結合する。本発明の範囲内において、用語「エピトープ」は、コンホメーション及び線形エピトープの両方について互換的に使用され、コンホメーションエピトープは、抗原のアミノ酸一次配列の不連続なセクションから構成され、線形エピトープは、連続アミノ酸によって形成された配列によって形成される。
エピトープは、本発明によって提供される抗体の任意の１種と組み合わせて、当技術分野で公知の任意の適したエピトープマッピング法によって同定され得る。このような方法の例は、全長アルファシヌクレインに由来する変動する長さのペプチドを、本発明の抗体又はその断片との結合についてスクリーニングすることを含み、抗体によって認識されるエピトープの配列を含有する抗体と特異的に結合し得る最小の断片を同定する。アルファシヌクレインペプチドは、合成によって、又はアルファシヌクレインタンパク質のタンパク質分解性消化によって生産され得る。抗体と結合するペプチドは、例えば、質量分析によって同定され得る。別の例では、本発明の抗体によって結合されるエピトープを同定するためにＮＭＲ分光法又はＸ線結晶学が使用され得る。ひとたび同定されると、エピトープは、本発明の抗体と結合する断片を調製するために役立つ場合があり、必要に応じて、同一エピトープと結合するさらなる抗体を得るための免疫原として使用される。
一実施形態では、本発明による抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８における位置１１３から１２９の間のアルファシヌクレインの２個以上のアミノ酸残基と結合する。特に、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８における少なくともアミノ酸残基Ｄ１１９、Ｎ１２２及びＹ１２５と結合する。
好ましくは、本発明による抗体又はその抗原結合断片は、アルファシヌクレイン繊維によって誘導されるアルファシヌクレイン凝集を防止する。
この特定の文脈内で、用語「防止する」（及びその文法的バリエーション）は、用語「阻害する」と本明細書において互換的に使用され、本発明による抗体がアルファシヌクレイン繊維によって誘導されるアルファシヌクレイン凝集に関して有する効果を示す。効果は、凝集を完全に若しくは部分的に防止するという点で予防的な場合もあり、又はすでに開始されている凝集を完全に若しくは部分的に低減する、すなわち、さらなる進行するのを妨げる、又はさらなる凝集の出現を完全に若しくは部分的に低減する、又はすでに生じた凝集を完全に若しくは部分的に逆転させる。
理論に捉われるものではないが、本発明による抗体又はその抗原結合断片は、アルファシヌクレインと結合し、
ｉ）モノマー形態では、アルファシヌクレインがオリゴマー及び凝集を形成するのを防止し、及び／又は
ｉｉ）オリゴマー及び繊維形態では、アルファシヌクレインがニューロンからニューロンへと広がることを防止し、及び／又は
ｉｉｉ）オリゴマー及び／又は繊維形態では、アルファシヌクレイン繊維によって誘導されるアルファシヌクレイン凝集、好ましくは、内因性アルファシヌクレイン凝集を防止する
と考えられる。
用語「繊維」、「繊維形態」又は「繊維状の」は、アルファシヌクレインに関して本明細書において使用する場合、脳構造内及び脳構造間で広がる種を構成し得る、アルファシヌクレインオリゴマーを含むアルファシヌクレインの非モノマー形態を指すものとする。
一実施形態では、本発明による抗体又はその抗原結合断片は、モノマーとしてのアルファシヌクレイン、及び繊維状のアルファシヌクレインと結合することが可能である。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、モノマーとしてのアルファシヌクレインと比較して繊維状のアルファシヌクレインに対してより強力な結合親和性を有する。これは、繊維状のアルファシヌクレインに対してよりも、モノマーアルファシヌクレインに対して少なくとも１０倍高い解離定数（ＫＤ）を特徴とする。
一実施形態では、本発明による抗体又はその抗原結合断片は、モノマーアルファシヌクレインに対して６０ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）を有する。別の実施形態では、本発明による抗体又はその抗原結合断片は、繊維状のアルファシヌクレインに対して３０ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）を有する。
用語「ＫＤ」とは、本明細書において、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られる解離定数を指し、モル濃度（Ｍ）として表される。Ｋｄ及びＫａは、それぞれ、特定の抗原－抗体（又はその抗原結合断片）相互作用の解離速度及び会合速度を指す。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定され得る。抗体のＫＤを決定する方法は、例えば、本明細書において実施例に記載されるようなＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどの表面プラズモン共鳴を使用すること、単離された天然又は組換えアルファシヌクレイン、その適した融合タンパク質／ポリペプチド又はその繊維を使用することによってである。一例では、親和性は、本明細書において実施例に記載されるような組換えヒトアルファシヌクレインを使用して測定される。表面プラズモン共鳴については、標的分子は、固相上に固定化され、フローセルに沿って流れる移動相中のリガンドに対して曝露される。固定された標的とのリガンド結合が生じる場合には、局所屈折率が変化し、ＳＰＲ角の変化につながり、これは、反射光の強度の変化を検出することによってリアルタイムでモニタリングされ得る。ＳＰＲシグナルの変化の速度を解析して、結合反応の会合及び解離相の見かけの速度定数を得ることができる。これらの値の比が、見かけの平衡定数（親和性）を与える（例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５３巻：２５６０～６５頁（１９９３年））を参照のこと。
一実施形態では、本発明による抗体又はその抗原結合断片は、モノマーとしてのアルファシヌクレインと比較して、繊維状のアルファシヌクレインに対してより高い結合親和性（すなわち、より小さいＫＤ）を有する。用語「親和性」とは、抗体又はその抗原結合断片とアルファシヌクレイン間の相互作用の強度を指す。
一実施形態では、本発明による抗体又はその抗原結合断片は、アルファシヌクレインによって誘導される、好ましくは、繊維状のアルファシヌクレインによって誘導される凝集を遮断又は防止又は低減する。
一実施形態では、本発明による抗体又はその抗原結合断片は、繊維状のアルファシヌクレインによって誘導される凝集の遮断について１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有し、好ましくは、本発明による抗体又はその抗原結合断片は、繊維状のアルファシヌクレインによって誘導される凝集の遮断について５ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。
本明細書において、用語ＩＣ５０とは、アルファシヌクレイン、好ましくは、繊維状のアルファシヌクレインによって誘導される本発明の凝集における、特定の生物学的又は生化学的機能の阻害の点での、抗体などの物質の有効性の尺度である半最大阻害濃度を指す。ＩＣ５０は、所与の生物学的プロセスを半分阻害するために必要とされる特定の物質の量を示す定量的尺度である。
一実施形態では、本発明による抗体又はその抗原結合断片は、ベータシヌクレイン及び／又はガンマシヌクレインと結合せず、アルファシヌクレインに特異的である。
本明細書において使用される特異的とは、それが特異的であるとする抗原のみを認識する抗体又はそれが非特異的であるとする抗原（ガンマ及びベータシヌクレイン）との結合と比較して、それを特異的であるとする抗原（例えば、アルファシヌクレイン）に対して有意に高い結合親和性、例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０倍高い結合親和性を有する抗体を指すものとする。
本発明による抗体は、当技術分野で公知の任意の適した方法を使用して得ることができる。融合タンパク質を含むアルファシヌクレインポリペプチド／タンパク質、ポリペプチドを（組換えによって、又は天然に）発現する細胞は、アルファシヌクレインを特異的に認識する抗体を生産するために使用され得る。ポリペプチドは、「成熟」ポリペプチド又はその生物学的に活性な断片若しくは誘導体であり得る。
一実施形態では、ポリペプチド（すなわち、抗原）は、好ましくは、以下の実施例に記載されるように生産されたヒトアルファシヌクレインモノマー又はその断片である。
宿主に免疫を与えるために使用されるポリペプチドは、発現系を含む遺伝的に操作された宿主細胞から当技術分野で周知のプロセスによって調製され得る、又はそれらは天然の生物学的供給源から回収され得る。本出願において、用語「ポリペプチド」は、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を含む。これらは、特に断りのない限り互換的に使用される。アルファシヌクレインポリペプチド又はその断片は、いくつかの例では、例えば、親和性タグ又は同様のものに融合された融合タンパク質などのより大きなタンパク質の一部であり得る。
アルファシヌクレインポリペプチドに対して生成した抗体を得ることができ、ここで、周知の、日常的なプロトコールを使用して、動物、好ましくは、非ヒト動物にポリペプチドを投与することによる動物の免疫処置が必要である（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｄ． Ｍ． Ｗｅｉｒ （編）、第４巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８６年を参照のこと）。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ又はブタなどの多数の温血動物が、免疫され得る。しかし、マウス、ウサギ、ブタ及びラットが、全般的に最も適している。
モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻：４９５～４９７頁）、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、第４巻：７２頁）及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、７７～９６頁、Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８５年）によって調製され得る。
本発明において使用するための抗体はまた、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第９３巻（１５号）：７８４３～７８４８ｌ、ＷＯ９２／０２５５１、ＷＯ２００４／０５１２６８及びＷＯ２００４／１０６３７７に記載された方法によって特異的抗体の生産のために選択された単一リンパ球から作製された免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングすること及び発現させることによる、単一リンパ球抗体法を使用して作製され得る。
抗体のスクリーニングは、アルファシヌクレインとの結合を測定するアッセイ及び／又は抗体若しくはその断片の存在下で繊維を形成するアルファシヌクレインの阻害を測定するアッセイを使用して実施され得る。
本発明による抗体又はその抗原結合断片は、重鎖由来の３つ及び軽鎖由来の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。一般に、ＣＤＲは、フレームワーク中にあり、一緒に可変領域を形成する。慣例により、抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域中のＣＤＲは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３と呼ばれ、軽鎖可変領域中では、ＣＤＲ－Ｌ１－ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３と呼ばれる。それらは、各鎖のＮ末端からＣ末端の方向に順次番号付けされる。
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムによって慣習的に番号付けられる。このシステムは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡ、Ｋａｂａｔら、１９８７年（本明細書において以下、「Ｋａｂａｔら（前掲）」）に示されている。この番号付けシステムは、別に示される場合を除いて、本明細書において使用される。
Ｋａｂａｔ残基指定は、アミノ酸残基の線形番号付けと常に直接的に対応するわけではない。実際の線形アミノ酸配列は、厳密なＫａｂａｔ番号付けよりも、少ない又はさらなるアミノ酸を含有し得、これらは、フレームワークか相補性決定領域（ＣＤＲ）かに拘わらず、基本の可変ドメイン構造の構造成分の短縮化又はそれへの挿入に対応する。残基の正確なＫａｂａｔ番号付けは、「標準」Ｋａｂａｔ番号付けされた配列との、抗体の配列中の相同性の残基のアラインメントによって所与の抗体について決定され得る。
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによると残基３１～３５（ＣＤＲ－Ｈ１）、残基５０～６５（ＣＤＲ－Ｈ２）及び残基９５～１０２（ＣＤＲ－Ｈ３）に位置する。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ及びＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ． ｉｏｌ．、第１９６巻、９０１～９１７頁（１９８７年））によると、ＣＤＲ－Ｈ１のループ等価物は、残基２６から残基３２に広がる。したがって、別に示さない限り、本明細書において使用されるような「ＣＤＲ－Ｈ１」は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムとＣｈｏｔｈｉａのトポロジカルループ定義の組合せによって記載されるような残基２６～３５を指すものとする。
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによると残基２４～３４（ＣＤＲ－Ｌ１）、残基５０～５６（ＣＤＲ－Ｌ２）及び残基８９～９７（ＣＤＲ－Ｌ３）に位置する。
一実施形態では、抗体は、キメラ、ヒト化若しくはヒト抗体又はそれらの断片であり得る。
一実施形態では、本発明による抗体又はその抗原結合断片は、抗体が産生された動物のフレームワーク領域を含み得る。例えば、ラットにおいて抗体が産生された場合には、配列番号９による（ヌクレオチド配列は、配列番号１１に示される）軽鎖可変領域及び配列番号１０による（ヌクレオチド配列は、配列番号１２に示される）重鎖可変領域を含む抗体又は抗原結合断片などのように、本明細書において定義され、特許請求されるＣＤＲと、ラット抗体のフレームワーク領域とを含むであろう。
キメラ抗体は、組換えＤＮＡ法を使用して通常生産される。ＤＮＡは、ヒトＬ及びＨ鎖のコード配列を、対応する非ヒト（例えば、マウス）Ｈ及びＬ定常領域と置換することによって修飾され得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ；ＰＮＡＳ 第８１巻、６８５１頁（１９８４年））。
ヒト抗体は、抗体の可変領域又は全長鎖が、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られる場合に、特定の生殖系列配列「の産物」である、又は「に由来する」重鎖若しくは軽鎖可変領域又は全長重鎖若しくは軽鎖を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保持するトランスジェニックマウスを、対象の抗原を用いて免疫処置すること又は対象の抗原を用いて、ファージ上にディスプレイされるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」である、又は「に由来する」ヒト抗体又はその断片は、ヒト抗体のアミノ酸配列を、ヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較すること及びヒト抗体の配列に対して配列が最も近い（すなわち、最大同一性％）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することなどによって同定され得る。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」である、又は「に由来する」ヒト抗体は、例えば、天然に存在する体細胞突然変異又は部位指定突然変異の意図的な導入のために、生殖系列配列と比較してアミノ酸の相違を含有し得る。しかし、選択されたヒト抗体は、通常、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列で少なくとも９０％同一であり、その他の種（例えば、マウス生殖系列配列）の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列と比較した場合に、ヒト抗体をヒトであると同定するアミノ酸残基を含有する。特定の場合には、ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列で少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は少なくとも９５％又はさらに少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％同一であり得る。通常、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列から１０個以下のアミノ酸の相違を示すであろう。特定の場合には、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列から５個以下、又はさらに４、３、２若しくは１個以下のアミノ酸の相違を示し得る。
ヒト抗体は、当業者に公知のいくつかの方法によって生産され得る。ヒト抗体は、ヒト骨髄腫又はマウス－ヒトヘテロミエローマ細胞系を使用するハイブリドーマ法によって作製され得る（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ；（１９８４）第１３３巻：３００１頁；Ｂｒｏｄｅｕｒ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１～６３頁、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ、１９８７年）。代替法として、両方ともヒト可変領域レパートリーを利用するファージライブラリー又はトランスジェニックマウスの使用が挙げられる（Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ；（１９９４年） Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ 第１２巻：４３３～４５５頁、Ｇｒｅｅｎ ＬＬ、（１９９９年）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ 第２３１巻：１ １～２３）。
本発明の１つの好ましい実施形態では、本開示による抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化されている。
本明細書において、用語「ヒト化抗体分子」とは、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワーク中にグラフトされた、ドナー抗体（例えば、マウス又はウサギモノクローナル抗体などの非ヒト抗体）由来の１つ又は複数のＣＤＲ（必要に応じて、１つ又は複数の修飾されたＣＤＲを含む）を含有する抗体分子を指す。概説については、Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１６巻、５３５～５３９頁、１９９８年を参照のこと。一実施形態では、全ＣＤＲが移されるのではなく、上記で本明細書において記載されるＣＤＲのうちいずれか１つに由来する特異性決定残基の１つ又は複数のみが、ヒト抗体フレームワークに移される（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５年、Ｍｅｔｈｏｄｓ、第３６巻、２５～３４頁）。一実施形態では、上記で本明細書において記載されるＣＤＲのうち１つ又は複数に由来する特異性決定残基のみが、ヒト抗体フレームワークに移される。別の実施形態では、上で本明細書において記載されるＣＤＲの各々に由来する特異性決定残基のみが、ヒト抗体フレームワークに移される。
ＣＤＲがグラフトされる場合には、任意の適当なアクセプター可変領域フレームワーク配列が、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／種類を考慮して使用され得、これには、マウス、霊長類及びヒトフレームワーク領域が含まれる。
適宜、本発明によるヒト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域並びに本明細書において具体的に提供されるＣＤＲのうち１つ又は複数を含む可変ドメインを有する。したがって、一実施形態では、アルファシヌクレイン、好ましくは、ヒトアルファシヌクレインと結合し、可変ドメインが、ヒトアクセプターフレームワーク領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含む、遮断ヒト化抗体が提供される。
本発明において使用され得るヒトフレームワークの例として、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭがある（Ｋａｂａｔら、前掲）。例えば、重鎖について、ＫＯＬ及びＮＥＷＭが使用されてもよく、軽鎖について、ＲＥＩが使用されてもよく、重鎖及び軽鎖両方について、ＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭが使用されてもよい。或いは、ヒト生殖系列配列が使用されてもよく、これらは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／で入手可能である。
本発明によるヒト化抗体又はその抗原結合断片では、アクセプター重鎖及び軽鎖は、同一抗体に由来することを必ずしも必要とせず、必要に応じて、異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合鎖を含み得る。
本発明のヒト化抗体の軽鎖にとって、適したフレームワーク領域は、配列番号２９を有するヒト生殖系列ＩＧＫＶ１－３９に由来し、ヌクレオチド配列が、配列番号３１に示される。
したがって、一実施形態では、ＣＤＲ－Ｌ１について配列番号１で示される配列、ＣＤＲ－Ｌ２について配列番号２で示される配列及びＣＤＲＬ３について配列番号３又は配列番号７で示される配列を含むヒト化抗体又はその抗原結合断片が提供され、軽鎖フレームワーク領域は、ヒト生殖系列ＩＧＫＶ１－３９に由来する。
本発明によるヒト化抗体又はその抗原結合断片の重鎖にとって、適したフレームワーク領域は、配列番号３０に示されるような配列を有するヒト生殖系列ＩＧＨＶ３－１５に由来し、ヌクレオチド配列が、配列番号３２に示される。
一実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ１に対して配列番号４で与えられる配列、ＣＤＲ－Ｈ２に対して配列番号５で与えられる配列及びＣＤＲ－Ｈ３に対して配列番号６で与えられる配列を含み、重鎖フレームワーク領域が、ヒト生殖系列ＩＧＨＶ３－１５に由来する、ヒト化抗体又はその抗原結合断片が提供される。
別の実施形態では、
ａ．配列番号１で示される配列によるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２で示される配列によるＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３又は配列番号７で示される配列によるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域であって、軽鎖フレームワーク領域が、ヒト生殖系列ＩＧＫＶ１－３９に由来する、軽鎖可変領域と、
ｂ．配列番号４で示される配列によるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５で示される配列によるＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６で示される配列によるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域であって、重鎖フレームワーク領域が、ヒト生殖系列ＩＧＨＶ３～１５に由来する、重鎖可変領域と
を含む、ヒト化抗体又はその抗原結合断片が提供される。
本発明によるヒト化抗体又はその抗原結合断片では、フレームワーク領域は、アクセプター抗体のものと同一配列を有さない場合もある。例えば、そのアクセプター鎖クラス又は種類にとって、普通ではない残基は、より頻繁に生じる残基に変更されてもよい。或いは、アクセプターフレームワーク領域中の選択された残基が、それらが、ドナー抗体において同一位置に見られる残基に対応するように変更されてもよい（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ、第３３２巻、３２３～３２４頁を参照のこと）。このような変更は、ドナー抗体の親和性を回復するのに必要な最小に維持されなければならない。変更される必要があり得るアクセプターフレームワーク領域中の残基を選択するプロトコールは、ＷＯ９１／０９９６７に示されている。
したがって、一実施形態では、フレームワーク中の１、２、３、４、５、６、７又は８個の残基は、代替アミノ酸残基と置き換えられる。
したがって、一実施形態では、（配列番号１７又は１８における）軽鎖の可変ドメインの位置７１の残基（Ｐｈｅ（Ｆ）７１）が、ドナー残基（Ｔｙｒ（Ｙ）７１）である、ヒト化抗体又はその抗原結合断片が提供される。例えば、配列番号１３及び１４で示される配列を参照されたい。
別の実施形態では、重鎖の可変ドメインの配列番号３０における位置４９及び１００の各々残基（Ｇｌｙ（Ｇ）４９及びＴｈｒ（Ｔ）１００）が、ドナー残基（Ａｌａ４９及びＡｌａ１００）である、ヒト化抗体又はその抗原結合断片が提供される。例えば、配列番号２５及び２６で示される配列を参照されたい。
一実施形態では、本発明は、
１．配列番号１３による軽鎖可変領域及び配列番号２５から選択される重鎖可変領域、又は
２．配列番号１７による軽鎖可変領域及び配列番号２５から選択される重鎖可変領域、又は
３．配列番号２１による軽鎖可変領域及び配列番号２５から選択される重鎖可変領域軽鎖可変領域
を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
一実施形態では、本発明は、本明細書において開示される配列に対して８０％（例えば、関連配列、例えば、可変ドメイン配列、ＣＤＲ配列又はＣＤＲを除く可変ドメイン配列の一部又は全体に対して８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）類似している又は同一である配列を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。一実施形態では、関連配列は、配列番号２５である。一実施形態では、関連配列は、配列番号１３、配列番号１７又は配列番号２１である。
一実施形態では、本発明は、軽鎖及び／又は重鎖を含むヒトアルファシヌクレインと結合する抗体又はその抗原結合断片であって、軽鎖の可変ドメインは、配列番号１３、配列番号１７又は配列番号２１で与えられる配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は類似性を有する配列を含み、及び／又は重鎖の可変ドメインは、配列番号２５で与えられる配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は類似性を有する配列を含む、抗体又はその抗原結合断片を提供する。
一実施形態では、本発明は、ヒトアルファシヌクレインと結合する抗体又はその抗原結合断片であって、配列番号１３、配列番号１７又は配列番号２１で与えられる配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％類似している又は同一である軽鎖可変ドメインを有するが、ＣＤＲ－Ｌ１に対して配列番号１で与えられる配列、ＣＤＲ－Ｌ２に対して配列番号２で与えられる配列及びＣＤＲ－Ｌ３に対して配列番号３又は配列番号７で与えられる配列を有する、抗体又はその抗原結合断片を提供する。
一実施形態では、本発明は、ヒトアルファシヌクレインと結合する抗体又はその抗原結合断片であって、配列番号２５で与えられる配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％類似している又は同一である重鎖可変ドメインを有するが、ＣＤＲ－Ｈ１に対して配列番号４で与えられる配列、ＣＤＲ－Ｈ２に対して配列番号５で与えられる配列及びＣＤＲ－Ｈ３に対して配列番号６で与えられる配列を有する、抗体又はその抗原結合断片を提供する。
「同一性」とは、本明細書において、アラインされた配列中の任意の特定の位置で、配列間でアミノ酸残基が同一であることを示す。「類似性」とは、本明細書において、アラインされた配列中の任意の特定の位置で、配列間でアミノ酸残基が類似の種類であることを示す。例えば、ロイシンは、イソロイシン又はバリンと置換され得る。互いに置換され得ることが多いその他のアミノ酸として、それだけには限らないが、
－ フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）、
－ リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）、
－ アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）、
－ アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）、並びに
－ システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）
が挙げられる。同一性及び類似性の程度は容易に算出され得る（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ １、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１年、ＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． 第２１５巻：４０３～４１０頁；Ｇｉｓｈ，Ｗ．＆ Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ． １９９３年、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．第３巻：２６６～２７２頁．Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら、１９９６年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第２６６巻：１３１～１４１頁；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第２５巻：３３８９～３４０２頁；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆ Ｍａｄｄｅｎ，、Ｔ．Ｌ．１９９７年、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．第７巻：６４９～６５６頁）。
一実施形態では、抗原結合断片は、それだけには限らないが、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、二価、三価又は四価抗体、Ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ダイアボディー、トリアボディー（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディー（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）及び上記のもののいずれかのエピトープ結合断片であり得る（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．第２３巻（９号）：１１２６～１１３６頁； Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ、２００５年、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ－Ｏｎｌｉｎｅ 第２巻（３号）、２０９～２１７頁を参照のこと）。これらの抗体断片を作製及び製造する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｖｅｒｍａら、１９９８年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２１６巻、１６５～１８１頁を参照のこと）。本発明において使用されるその他の抗体断片として、ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されるＦａｂ及びＦａｂ’断片が挙げられる。多価抗体は、多重特異性、例えば、二重特異性を含んでもよいし、又は単一特異性であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３、ＷＯ０５／１１３６０５、ＷＯ２００９／０４０５６２及びＷＯ２０１０／０３５０１２を参照のこと）。
代替的な抗原結合断片は、２つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖに連結されたＦａｂを含み、各ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは、同一又は異なる標的と結合する（例えば、治療的標的と結合する１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖと、例えば、アルブミンへの結合によって半減期を増大する１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖ）。このような抗体断片は、その全文が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開ＷＯ２０１５／１９７７７２に、特に、抗体断片の考察に関して記載されている。
本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、必要な場合には、抗体分子の提案された機能、特に、必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択され得る。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであり得る。特に、ヒトＩｇＧ定常領域ドメインが、抗体分子が治療的使用のために意図され、抗体エフェクター機能が必要とされる場合には、特に、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプのものが使用され得る。或いは、抗体分子が治療目的のために意図され、抗体エフェクター機能が必要ではない場合には、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプが使用され得る。これらの定常領域ドメインの配列バリアントも使用され得ることは認識されよう。例えば、Ａｎｇａｌら（Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３年、第３０巻（１号）、１０５～１０８頁）に記載されるような、本明細書においてＩｇＧ４Ｐと呼ばれる、位置２４１のセリンがプロリンに変更されているＩｇＧ４分子が使用されてもよい。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３、第３０巻（１）、１０５～１０８頁が使用され得る。当業者ならば、抗体は、さまざまな翻訳後修飾を受ける可能性があるということは理解されるであろう。これらの修飾の種類及び程度は、抗体を発現させるために使用される宿主細胞系並びに培養条件に応じて変わることが多い。このような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミド化における変動を含み得る。頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基性残基（リシン又はアルギニンなど）の喪失である（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｈｙ 第７０５巻：１２９～１３４頁、１９９５年に記載されるような）。したがって、抗体重鎖のＣ末端リシンが存在しない場合もある。
一実施形態では、翻訳後修飾の際に抗体からＣ末端アミノ酸が切断される。
一実施形態では、翻訳後修飾の際に抗体からＮ末端アミノ酸が切断される。
別の実施形態では、本発明の抗体は、全長重鎖及び軽鎖を有する完全抗体又はその抗原結合断片を含み得る。例えば、全長抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４又はＩｇＧ４Ｐから選択される。
一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、
１．配列番号１４による軽鎖及び配列番号２６による重鎖、又は
２．配列番号１８による軽鎖及び配列番号２６による重鎖、又は
３．配列番号２２による軽鎖及び配列番号２６による重鎖
を含む。
一実施形態では、本開示の抗体は、例えば、すべて参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／０４０５６２、ＷＯ２０１００３５０１２、ＷＯ２０１１／０３０１０７、ＷＯ２０１１／０６１４９２及びＷＯ２０１１／０８６０９１に記載されるような、免疫グロブリン部分、例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片、それに直接的又は間接的に連結された１つ又は２つの単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）を含むアルファシヌクレイン結合性抗体融合タンパク質として提供される。
一実施形態では、融合タンパク質は、例えば、任意選択で、ジスルフィド結合によって連結された、重鎖可変（ＶＨ）及び軽鎖可変（ＶＬ）対合のような２つのドメイン抗体を含む。
一実施形態では、融合タンパク質のＦａｂ又はＦａｂ’要素は、単一ドメイン抗体（単数又は複数）に対して同一又は同様の特異性を有する。一実施形態では、Ｆａｂ又はＦａｂ’は、単一ドメイン抗体（単数又は複数）に対して異なる特異性を有する、すなわち、融合タンパク質は、多価である。一実施形態では、本発明による多価融合タンパク質は、アルブミン結合部位を有し、例えば、その中のＶＨ／ＶＬ対は、アルブミン結合部位を提供する。
一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１３又は１７又は２１による軽鎖可変領域及び配列番号２５から選択される重鎖可変領域を含む。例えば、抗体は、配列番号１３又は１７又は２１による軽鎖可変領域及び配列番号２５から選択される重鎖可変領域を含む全長ＩｇＧ４抗体である。別の例では、抗体は、配列番号１４、１８又は２２による軽鎖及び配列番号２６による重鎖を含む全長ＩｇＧ４抗体である。さらに別の例では、抗原結合断片は、配列番号１３、１７又は２１による軽可変領域及び配列番号２５から選択される重可変領域を含むＦａｂ’である。
１つの好ましい実施形態では、治療において使用するための抗体若しくはその抗原結合断片又は抗体若しくはその抗原結合断片を含む医薬組成物は、
ａ．配列番号１によるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２によるＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３若しくは配列番号７によるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号４によるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５によるＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６によるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、又は
ｂ．配列番号１３若しくは配列番号１７若しくは配列番号２１による軽可変領域及び配列番号２５から選択される重可変領域、又は
ｃ．配列番号１４若しくは配列番号１８若しくは配列番号２２による軽鎖及び配列番号２６による重鎖
を含む、抗体又はその抗原結合断片であり、
抗体又はその抗原結合断片は、アルファシヌクレインと、配列番号８における、少なくとも残基Ｄ１１９、Ｎ１２２及びＹ１２５を含むエピトープと結合する。
さらにより好ましくは、抗体又はその抗原結合断片は、ベータ－シヌクレインと交差反応せず、アルファシヌクレインと、繊維状のアルファシヌクレインに対してよりも、モノマーアルファシヌクレインに対して少なくとも１０倍高い解離定数（ＫＤ）で結合する。
抗体又は断片などの生体分子は、酸性及び／又は塩基性官能基を含有し、それによって、分子に正味の正電荷又は負電荷を与える。全体的な「観察される」電荷の量は、実体の絶対アミノ酸配列、３Ｄ構造中の電荷を有する基の局所環境及び分子の環境条件に応じて変わる。等電点（ｐＩ）は、その表面に到達できる特定の分子又は溶媒が、正味の電荷を保持しないｐＨである。一例では、本発明による抗アルファシヌクレイン抗体又はその抗原結合断片は、適当な等電点を有するように遺伝子操作され得る。これは、より頑強な特性、特に、適した溶解度及び／又は安定性プロフィール及び／又は改善された精製特徴を有する抗体及び／又は抗原断片につながり得る。
したがって、一態様では、本発明は、最初に同定された抗体のものとは異なる等電点を有するように遺伝子操作されているヒト化抗アルファシヌクレイン抗体又はその抗原結合断片を提供する。抗体は、例えば、アミノ酸残基を置き換えること、例えば、酸性アミノ酸残基を、１つ又は複数の塩基性アミノ酸残基と置き換えることによって遺伝子操作されてもよい。或いは、塩基性アミノ酸残基が導入されてもよく、又は酸性アミノ酸残基が除去される場合もある。或いは、分子が、許容されがたい高いｐＩ値を有する場合には、必要に応じてｐＩを低下させるために酸性残基が導入されてもよい。ｐＩを操作する場合には、抗体又は断片の望ましい活性を保持するように注意されなければならないことは重要である。したがって、一実施形態では、遺伝子操作された抗体又はその抗原結合断片は、「非修飾」抗体又は断片と同一の又は実質的に同一の活性を有する。
抗体又は断片の等電点を予測するために、＊＊ＥｘＰＡＳＹ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｕｔ－ａｒｌｅｓ．ｕｐ．ｕｎｉｖ－ｍｒｓ．ｆｒ／ｗ３ｂｂ／ｄ＿ａｂｉｍ／ｃｏｍｐｏ－ｐ．ｈｔｍｌなどのプログラムが使用されてもよい。
本発明によって提供される抗体の親和性は、当技術分野で公知の任意の適した方法を使用して変更され得ることが認められよう。したがって、本発明はまた、アルファシヌクレイン、特に、ヒトアルファシヌクレインに対して親和性の改善された本発明の抗体分子のバリアントに関する。このようなバリアントは、ＣＤＲを突然変異させること（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２５４巻、３９２～４０３頁、１９９５年）、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１０巻、７７９～７８３頁、１９９２年）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異誘発物株の使用（Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２５０巻、３５９～３６８頁、１９９６年）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第８巻、７２４～７３３頁、１９９７年）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２５６巻、７７～８８頁、１９９６年）及びセクシャルＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ、第３９１巻、２８８～２９１頁、１９９８年）を含む、いくつかの親和性成熟プロトコールによって得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎら（前掲）では、親和性成熟のこれらの方法を論じている。
必要に応じて、本発明による抗体又はその抗原結合断片は、１つ又は複数のエフェクター分子とコンジュゲートされてもよい。エフェクター分子は、本発明の抗体又はその抗原結合断片に付着され得る、単一エフェクター分子又は単一部分を形成するように連結された２つ以上のこのような分子を含み得ることは認識されよう。エフェクター分子に連結された抗体断片を得るように望まれる場合には、これは、抗体断片が直接的に又はカップリング剤を介してエフェクター分子に連結される標準化学手順又は組換えＤＮＡ手順によって調製され得る。このようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートする技術は、当技術分野で周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、第２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、１９８７年、６２３～５３頁；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、第６２巻：１１９～５８頁及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９年、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８３巻、６７～１２３頁を参照のこと）。特定の化学的手順として、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３／０３１５８１に記載されるものが挙げられる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合には、連結は、例えば、ＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に記載されるような組換えＤＮＡ手順を使用して達成され得る。
本明細書において、用語エフェクター分子として、例えば、抗悪性腫瘍剤、薬物、毒素、生物活性タンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体断片、合成又は天然に存在するポリマー、核酸及びその断片、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びその断片、放射性核種、特に、放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート化金属、ナノ粒子及びリポーター基、例えば、蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物が挙げられる。
エフェクター分子の例は、細胞にとって有害である（例えば、死滅させる）任意の薬剤を含む細胞毒又は細胞傷害性薬剤を含み得る。例として、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンギスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアスタリンタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン並びにその類似体又は相同体が挙げられる。
エフェクター分子としてはまた、それだけには限らないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカププリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ及びシス－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン）及び有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が挙げられる。
その他のエフェクター分子としては、キレート化放射性核種、例えば、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８、又はそれだけには限らないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンなどの薬物を挙げることができる。
その他のエフェクター分子としては、タンパク質、ペプチド及び酵素が挙げられる。対象の酵素としては、それだけには限らないが、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが挙げられる。対象のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドとしては、それだけには限らないが、免疫グロブリン、毒素、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素、タンパク質、例えば、インスリン、腫瘍壊死因子、α－インターフェロン、β－インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子又は組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓剤又は抗血管新生剤、例えば、アンギオスタチン又はエンドスタチン、又は生物反応修飾物質、例えば、リンホカイン、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）又はその他の増殖因子及び免疫グロブリンが挙げられる。
その他のエフェクター分子は、例えば、診断において有用な検出可能な物質を含み得る。検出可能な物質の例として、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光物質、生物発光物質、放射活性核種、陽電子放出金属（陽電子放射型断層撮影において使用するための）及び非放射活性常磁性金属イオンが挙げられる。全般的に、診断薬として使用するための抗体にコンジュゲートされ得る金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適した酵素として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適した補欠分子族として、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンが挙げられ、適した蛍光材料として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジシクロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリトリンが挙げられ、適した発光物質として、ルミノールが挙げられ、適した生物発光物質として、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられ、並びに適した放射活性核種として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃが挙げられる。
別の例では、エフェクター分子は、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体の半減期を増大し得る、及び／又は抗体の免疫原性を低減し得る、及び／又は上皮性関門を通る免疫系への．抗体の送達を増強し得る。この種の適したエフェクター分子の例として、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合性タンパク質又はアルブミン結合性化合物、例えば、ＷＯ０５／１１７９８４に記載されるものが挙げられる。
エフェクター分子がポリマーである場合には、一般に、合成又は天然に存在するポリマー、例えば、任意選択で置換された直鎖又は分岐鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン又はポリオキシアルキレンポリマー又は分岐若しくは非分岐多糖、例えば、ホモ－若しくはヘテロ－多糖であり得る。
上記の合成ポリマー上に存在してもよい特定の任意選択の置換基として、１つ又は複数のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基が挙げられる。
合成ポリマーの具体例として、置換されていてもよい直鎖又は分岐鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特に、置換されていてもよいポリ（エチレングリコール）、例えば、メトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体が挙げられる。
特定の天然に存在するポリマーとして、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はその誘導体が挙げられる。
一実施形態では、ポリマーは、アルブミン又はその断片、例えば、ヒト血清アルブミン又はその断片である。
「誘導体」は、本明細書において、反応性誘導体、例えば、マレイミドなどのようなチオール選択的反応性基を含むものとする。反応性基は、直接的に又はリンカーセグメントを介してポリマーに連結され得る。このような基の残基は、いくつかの場合には、抗体断片及びポリマー間の連結基として生成物の一部を形成することは認められよう。
ポリマーの大きさは、必要に応じて変わり得るが、一般に、５００Ｄａ～５００００Ｄａ、例えば、５０００～４００００Ｄａ、例えば、２００００～４００００Ｄａの平均分子量範囲中となる。ポリマーの大きさは、生成物の意図される使用、例えば、腫瘍などの特定の組織に局在する能力又は長期循環半減期に基づいて選択され得る（概説については、Ｃｈａｐｍａｎ、２００２年、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、第５４巻、５３１～５４５頁）。したがって、生成物が、例えば、腫瘍の処置において使用するために、例えば、循環を離れ、組織に浸透するように意図される場合には、例えば、約５０００Ｄａの分子量を有する小分子量ポリマーを使用することが有利であり得る。生成物が循環中のままである適用については、例えば、２００００Ｄａ～４００００Ｄａの範囲中の分子量を有するより高い分子量ポリマーを使用することが有利であり得る。
適したポリマーとして、ポリアルキレンポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）又は特に、メトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体、特に、約１５０００Ｄａ～約４００００Ｄａの範囲中の分子量を有するものが挙げられる。
一例では、本発明において使用される抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に付着される。１つの特定の例では、抗体は、抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、抗体断片中に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル又はカルボキシル基を介して付着され得る。このようなアミノ酸は、抗体断片中に天然に生じる場合も、組換えＤＮＡ法を使用して断片中に遺伝子操作される場合もある（例えば、ＵＳ５，２１９，９９６、ＵＳ５，６６７，４２５、ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４を参照のこと）。一例では、本発明の抗体分子は、修飾が、エフェクター分子の付着を可能にするためのその重鎖のＣ末端への、１つ又は複数のアミノ酸の付加である、修飾Ｆａｂ断片である。適宜、さらなるアミノ酸は、エフェクター分子が付着され得る１つ又は複数のシステイン残基を含有する修飾されたヒンジ領域を形成する。２つ以上のＰＥＧ分子を付着するために複数部位が使用され得る。
適宜、ＰＥＧ分子は、抗体断片中に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合によって連結される。修飾抗体断片に付着された各ポリマー分子は、断片中に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合によって連結され得る。共有結合連結は、一般に、ジスルフィド結合又は特に、硫黄－炭素結合となる。付着点としてチオール基が使用される場合には、適切に活性化されたエフェクター分子、例えば、チオール選択的誘導体、例えば、マレイミド及びシステイン誘導体が使用され得る。活性化されたポリマーは、上記のようなポリマー修飾された抗体断片の調製において出発材料として使用され得る。活性化されたポリマーは、チオール反応性基、例えば、α－ハロカルボン酸又はエステル、例えば、ヨードアセトアミド、イミド、例えば、マレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドを含有する任意のポリマーであり得る。このような出発材料は、商業的に得ることができる（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、以前は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．、ハンツビル、ＡＬ、米国）か、又は市販の出発材料から従来の化学手順を使用して調製され得る。特定のＰＥＧ分子として、２０Ｋメトキシ－ＰＥＧ－アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ；Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）及びＭ－ＰＥＧ－ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）が挙げられる。
一実施形態では、抗体は、例えば、ＥＰ０９４８５４４又はＥＰ１０９００３７に開示される方法によって、ＰＥＧ化されている、すなわち、共有結合によって付着されたＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を有する修飾Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片又はジＦａｂである［「ポリ（エチレングリコール）化学、バイオ技術及び生物医学適用」（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、１９９２年、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、「ポリ（エチレングリコール）化学及び生物学的適用」（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、１９９７年、Ｊ． Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ及び「生物医学科学のためのバイオコンジュゲーションタンパク質カップリング技術」（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１９９８年、Ｍ．Ａｓｌａｍ及びＡ．Ｄｅｎｔ、Ｇｒｏｖｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ、Ａ．２００２年、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００２、５４：５３１－５４５も参照のこと］。一例では、ＰＥＧは、ヒンジ領域中のシステインに付着される。一例では、ＰＥＧ修飾Ｆａｂ断片は、修飾ヒンジ領域中の単一チオール基に連結されたマレイミド基を有する。リシン残基は、マレイミド基に共有結合によって連結されることができ、リシン残基上のアミン基の各々に、およそ２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーが付着され得る。したがって、Ｆａｂ断片に付着されたＰＥＧの総分子量は、およそ４０，０００Ｄａであり得る。
特定のＰＥＧ分子は、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ、以前は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）としても知られる、Ｎ，Ｎ’－ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）ＭＷ２０，０００）修飾リシンの２－［３－（Ｎ－マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミドを含む。
ＰＥＧリンカーの代替供給源として、ＧＬ２－４００ＭＡ３（以下の構造中ｍは５である）及びＧＬ２－４００ＭＡ（ｍは２である）及びｎはおよそ４５０である、を供給するＮＯＦがある：

すなわち、各ＰＥＧは約２０，０００Ｄａである。
したがって、一実施形態では、ＰＥＧは、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２－４００ＭＡ３として知られる、２，３－ビス（メチルポリオキシエチレン－オキシ）－１－｛［３－（６－マレイミド－１－オキソヘキシル）アミノ］プロピルオキシ｝ヘキサン（２アーム分岐ＰＥＧ、－ＣＨ２）３ＮＨＣＯ（ＣＨ２）５－ＭＡＬ、Ｍｗ４０，０００である。
以下のタイプ：

で示されるさらなる代替ＰＥＧエフェクター分子が、Ｄｒ Ｒｅｄｄｙ、ＮＯＦ及びＪｅｎｋｅｍから入手可能である。
一実施形態では、本発明によるＦａｂ又はＦａｂ’は、ＰＥＧ分子にコンジュゲートされる。
一実施形態では、鎖中のアミノ酸２２６、例えば、重鎖のアミノ酸２２６（連続番号付けによって）、例えば、配列番号２６のアミノ酸２２４で又はその付近でシステインアミノ酸残基を介して付着され、ＰＥＧ化されている（例えば、本明細書において記載されるＰＥＧを有する）抗体が提供される。
一実施形態では、本開示は、１つ又は複数のＰＥＧポリマー、例えば、４０ｋＤａポリマー（単数又は複数）などの１つ又は２つポリマーを含むＦａｂ’ＰＥＧ分子を提供する。
本開示によるＦａｂ’－ＰＥＧ分子は、Ｆｃ断片と独立した半減期を有する点で特に有利であり得る。一実施形態では、ポリマー、例えば、ＰＥＧ分子、デンプン分子又はアルブミン分子にコンジュゲートされたＦａｂ’が提供される。一実施形態では、ポリマー、例えば、ＰＥＧ分子、デンプン分子又はアルブミン分子にコンジュゲートされたｓｃＦｖが提供される。一実施形態では、本開示によるＦａｂ又はＦａｂ’は、ヒト血清アルブミンにコンジュゲートされる。一実施形態では、例えば、半減期を増大するために、抗体又は断片は、デンプン分子にコンジュゲートされる。参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，０１７，７３９に記載されるようなタンパク質にデンプンをコンジュゲートする方法。
本発明はまた、本発明による抗体又はその抗原結合断片をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。本発明による単離ポリヌクレオチドは、例えば、化学的処理、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はそれらの任意の組合せによって生産された合成ＤＮＡを含み得る。
分子生物学の標準技術が、本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードするＤＮＡ配列を調製するために使用され得る。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して完全に又は部分的に合成され得る。部位特異的突然変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、必要に応じて使用され得る。
一実施形態では、本発明による単離ポリヌクレオチドは、
ａ．軽鎖可変領域をコードし、当該ポリヌクレオチドが
ｉ．配列番号１５若しくは配列番号１９若しくは配列番号２３に対して少なくとも９０％同一である、又は
ｉｉ．配列番号１５若しくは配列番号１９若しくは配列番号２３を含む、又は
ｉｉｉ．本質的に配列番号１５若しくは配列番号１９若しくは配列番号２３からなり、
ｂ．重鎖可変領域をコードし、当該ポリヌクレオチドが、
ｉ．配列番号２７に対して少なくとも９０％同一である、又は
ｉｉ．配列番号２７を含む、又は
ｉｉｉ．本質的に、配列番号２７からなり、
ｃ．軽鎖をコードし、当該ポリヌクレオチドが、
ｉ．配列番号１６若しくは配列番号２０若しくは配列番号２４に対して少なくとも９０％同一である、又は
ｉｉ．配列番号１６若しくは配列番号２０若しくは配列番号２４を含む、又は
ｉｉｉ．本質的に、配列番号１６若しくは配列番号２０若しくは配列番号２４からなり、
ｄ．重鎖をコードし、当該ポリヌクレオチドが、
ｉ．配列番号２８に対して少なくとも９０％同一である、又は
ｉｉ．配列番号２８を含む、又は
ｉｉｉ．本質的に、配列番号２８からなる。
本発明はまた、本明細書において記載される１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むクローニング又は発現ベクターを提供する。一例では、本発明によるクローニング又は発現ベクターは、配列番号１５、１６、１９、２０、２３、２４、２７又は２８から選択される配列を含む１つ又は複数の単離ポリヌクレオチドを含む。
ベクターが構築され得る一般的な方法、トランスフェクション法及び培養法は、当業者に周知である。この点において、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって作成された、「分子生物学における現在のプロトコール」（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９９９年、Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びＭａｎｉａｔｉｓ Ｍａｎｕａｌが参照される。
また、本発明による１つ若しくは複数の単離ポリヌクレオチド配列又は本発明の抗体をコードする１つ若しくは複数の単離ポリヌクレオチド配列を含む１つ若しくは複数のクローニング若しくは発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列の発現のために、任意の適した宿主細胞／ベクター系が使用され得る。細菌、例えば、大腸菌及びその他の微生物系が使用され得る、又は真核生物の、例えば、哺乳動物宿主細胞発現系も使用され得る。適した哺乳動物宿主細胞として、ＣＨＯ、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞が挙げられる。
本発明において使用するためのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）の適した種類として、ＤＨＦＲ選択マーカーとともに使用され得る、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む、ＣＨＯ及びＣＨＯ－Ｋ１細胞、例えば、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞及びＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞又はグルタミンシンセターゼ選択マーカーとともに使用され得るＣＨＯＫ１－ＳＶ細胞を挙げることができる。抗体の発現において使用するその他の細胞種として、リンパ細胞系、例えば、ＮＳＯ骨髄腫細胞及びＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞が挙げられる。宿主細胞は、本発明による単離ポリヌクレオチド配列又は発現ベクターを用いて安定に形質転換又はトランスフェクトされ得る。
一実施形態では、本発明による宿主細胞は、本発明の単離ポリヌクレオチド配列を含む、好ましくは、配列番号１５及び２７又は配列番号１９及び２７又は配列番号２３及び２７又は配列番号１６及び２８又は配列番号２０及び２８又は配列番号２４及び２８による単離ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを用いて安定にトランスフェクトされたＣＨＯ－ＤＧ４４細胞である。
本発明はまた、本発明による抗体又はその抗原結合断片の生産のための方法であって、本発明による宿主細胞を、本発明による抗体又はその抗原結合断片を生産するのに適した条件下で培養すること及び抗体又はその抗原結合断片を単離することを含む方法を提供する。
抗体又はその抗原結合断片は、重鎖又は軽鎖ポリペプチドのみを含むことがあり、この場合には、宿主細胞をトランスフェクトするために重鎖又は軽鎖ポリペプチドコード配列のみが使用される必要がある。重鎖及び軽鎖両方を含む抗体又はその抗原結合断片の生産のために、細胞系は、２つのベクター、軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクター及び重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクターを用いてトランスフェクトされ得る。或いは、単一ベクター、軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含むベクターが使用され得る。
したがって、宿主細胞を培養し、抗体又はその断片を発現させ、後者を単離し、任意選択で、それを精製して単離された抗体又は断片を提供する方法が提供される。一実施形態では、方法は、エフェクター分子を、単離された抗体又は断片にコンジュゲートするステップ、例えば、特に、本明細書に記載されるようなＰＥＧポリマーにコンジュゲートするステップをさらに含む。
したがって、一実施形態では、実質的に精製された形態の、特に、内毒素及び／又は宿主細胞タンパク質若しくはＤＮＡを含まない、又は実質的に含まない、精製された抗アルファシヌクレイン抗体又はその断片、例えば、ヒト化抗体又はその断片、特に、本発明による抗体又はその断片が提供される。
内毒素を実質的に含まないとは、一般に、抗体生成物１ｍｇ当たり１ＥＵ以下、例えば、生成物１ｍｇ当たり０．５又は０．１ＥＵの内毒素含量を指すものとする。
宿主細胞タンパク質又はＤＮＡを実質的に含まないとは、一般に、必要に応じて、宿主細胞タンパク質及び／又はＤＮＡ含量抗体生成物１ｍｇ当たり４００μｇ以下、例えば、１ｍｇ当たり１００μｇ以下、特に、１ｍｇ当たり２０μｇを指すものとする。
本発明の抗体は、アルファシヌクレイノパチーなどの病状の処置、診断及び／又は予防において有用であるので、本発明はまた、本発明による抗体又はその抗原結合断片を、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤のうち１種又は複数と組み合わせて含む医薬組成物又は診断組成物を提供する。一実施形態では、本発明による抗体又はその抗原結合断片は、唯一の有効成分である。別の実施形態では、本発明による抗体又はその抗原結合断片は、１種又は複数のさらなる有効成分との組合せである。或いは、医薬組成物は、唯一の有効成分である本発明による抗体又はその抗原結合断片を含み、その他の薬剤、薬物又はホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、逐次又は別個に）患者に個別に投与されてもよい。
別の実施形態では、医薬組成物は、配列番号１３又は１７又は２１の軽鎖可変領域を含み、配列番号２５の重鎖可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片、例えば、配列番号１３及び配列番号２５又は配列番号１７及び配列番号２５又は配列番号２１及び配列番号２５を含む。
本発明による医薬組成物は、必要とされる治療有効量を同定するために、患者に適宜投与され得る。用語「治療有効量」とは、本明細書において、疾患又は状態を処置、回復又は防止するために、又は検出可能な治療若しくは予防効果を示すために必要とされる治療薬の量を指す。任意の抗体について、治療有効量は、細胞培養アッセイにおいて、又は動物モデルにおいて、普通、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類においてのいずれかで最初に推定され得る。動物モデルはまた、適当な濃度範囲及び投与経路を決定するために使用され得る。次いで、このような情報は、ヒトにおける投与のための有用な用量及び経路を決定するために使用され得る。
ヒト対象のための正確な治療有効量は、疾患状態の重症度、対象の全身の健康、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物組合せ、療法に対する反応感受性及び耐性／応答に応じて変わる。この量は、日常的な実験によって決定することができ、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００ｍｇ／Ｋｇとなる。医薬組成物は、用量当たり所定量の本発明の活性薬剤を含有する単位用量形態で提示され得ることが好都合である。
治療組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体をさらに含有し得る。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝物質が、このような組成物中に存在し得る。このような担体は、医薬組成物が、患者による経口摂取のための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー及び懸濁液として製剤化されることを可能にする。
投与の適した形態は、例えば、注射又は注入による、例えば、ボーラス注射又は連続注入による、静脈内、吸入可能な又は皮下形態の非経口投与に適した形態を含む。製剤が、注射又は注入用である場合には、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンの形態をとってもよく、懸濁剤、防腐剤、安定化剤及び／又は分散剤などの処方剤を含有してもよい。或いは、本発明による抗体又はその抗原結合断片は、適当な滅菌液体を用いて使用前に再構成するための乾燥形態である場合もある。注射に先立って、液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液に適した固体形態も調製され得る。
ひとたび製剤化されると、本発明の組成物は、対象に直接的に投与され得る。したがって、医薬の製造のための本発明による抗体又はその抗原結合断片の使用が本明細書において提供される。
処置されるべき対象は、動物であり得る。好ましくは、本発明による医薬組成物は、ヒト対象への投与に適応される。
したがって、別の態様では、本発明は、治療において使用するための、特に、１つ又は複数のアルファシヌクレイノパチーの処置において使用するための、抗体若しくはその抗原結合断片又は抗体若しくはその抗原結合断片を含む医薬組成物を提供する。さらに別の態様では、本発明は、患者において１種又は複数のシヌクレイノパチーを処置する方法であって、前記患者に、本発明による抗体若しくはその抗原結合断片又は抗体若しくはその抗原結合断片を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
一実施形態では、治療において使用するための、抗体若しくはその抗原結合断片又は抗体若しくはその抗原結合断片を含む医薬組成物は、
ａ．配列番号１によるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２によるＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３若しくは配列番号７によるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域並びに配列番号４によるＣＤＲ－Ｈ１及び配列番号５によるＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６によるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、又は
ｂ．配列番号１３若しくは配列番号１７若しくは配列番号２１による軽可変領域及び配列番号２５から選択される重可変領域、又は
ｃ．配列番号１４若しくは配列番号１８若しくは配列番号２２による軽鎖及び配列番号２６による重鎖
を含む抗体又はその抗原結合断片であり、
抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化されており、アルファシヌクレイン繊維によって誘導されるアルファシヌクレイン凝集を防止し、抗体又はその抗原結合断片は、アルファシヌクレインと、配列番号８における、少なくとも残基Ｄ１１９、Ｎ１２２及びＹ１２５を含むエピトープと結合し、抗体又はその抗原結合断片は、治療において使用するためのものである。好ましくは、抗体又はその抗原結合断片は、ベータ－シヌクレインと交差反応せず、アルファシヌクレインと、繊維状のアルファシヌクレインに対してよりも、モノマーアルファシヌクレインに対して少なくとも１０倍高い解離定数（ＫＤ）で結合する。
別の実施形態では、抗体若しくはその抗原結合断片又は抗体若しくはその抗原結合断片を含む医薬組成物は、１つ又は複数のシヌクレイノパチーの処置において使用するためのものであり、
ａ．配列番号１によるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２によるＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３若しくは配列番号７によるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域並びに配列番号４によるＣＤＲ－Ｈ１及び配列番号５によるＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６によるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、又は
ｂ．配列番号１３若しくは配列番号１７若しくは配列番号２１による軽可変領域及び配列番号２５から選択される重可変領域、又は
ｃ．配列番号１４若しくは配列番号１８若しくは配列番号２２による軽鎖及び配列番号２６による重鎖
を含む、抗体又はその抗原結合断片であり、
抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化されており、アルファシヌクレイン繊維によって誘導されるアルファシヌクレイン凝集を防止し、抗体又はその抗原結合断片は、アルファシヌクレインと、配列番号８における、少なくとも残基Ｄ１１９、Ｎ１２２及びＹ１２５を含むエピトープと結合する。好ましくは、抗体又はその抗原結合断片は、ベータ－シヌクレインと交差反応せず、アルファシヌクレインと、繊維状のアルファシヌクレインに対してよりも、モノマーアルファシヌクレインに対して少なくとも１０倍高い解離定数（ＫＤ）で結合する。
別の実施形態では、患者において１つ又は複数のシヌクレイノパチーを処置する方法であって、前記患者に、抗体若しくはその抗原結合断片又は抗体若しくはその抗原結合断片を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む方法が提供され、抗体又はその抗原結合断片は、
ａ．配列番号１によるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２によるＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３若しくは配列番号７によるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域並びに配列番号４によるＣＤＲ－Ｈ１及び配列番号５によるＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６によるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、又は
ｂ．配列番号１３若しくは配列番号１７若しくは配列番号２１による軽可変領域及び配列番号２５から選択される重可変領域、又は
ｃ．配列番号１４若しくは配列番号１８若しくは配列番号２２による軽鎖及び配列番号２６による重鎖
を含み、
抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化されており、アルファシヌクレイン繊維によって誘導されるアルファシヌクレイン凝集を防止し、抗体又はその抗原結合断片は、アルファシヌクレインと、配列番号８における、少なくとも残基Ｄ１１９、Ｎ１２２及びＹ１２５を含むエピトープと結合する。好ましくは、抗体又はその抗原結合断片は、ベータ－シヌクレインと交差反応せず、アルファシヌクレインと、繊維状のアルファシヌクレインに対してよりも、モノマーアルファシヌクレインに対して少なくとも１０倍高い解離定数（ＫＤ）で結合する。
本発明によるアルファシヌクレイノパチーは、それだけには限らないが、パーキンソン病（ＰＤ）（パーキンソン病の特発性及び遺伝性形態を含む）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病のレビー小体異型（ＬＢＶＡＤ）、アルツハイマー病及びパーキンソン病の合併、多系統萎縮症（ＭＳＡ）及び脳内鉄沈着を伴う神経変性１型（ＮＢＩＡ－１）を含む。好ましくは、アルファシヌクレイノパチーは、パーキンソン病（ＰＤ）である。
別の実施形態では、抗体若しくはその抗原結合断片又は抗体若しくはその抗原結合断片を含む医薬組成物は、パーキンソン病（ＰＤ）（パーキンソン病の特発性及び遺伝性形態を含む）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病のレビー小体異型（ＬＢＶＡＤ）、アルツハイマー病及びパーキンソン病の合併、多系統萎縮症（ＭＳＡ）及び脳内鉄沈着を伴う神経変性１型（ＮＢＩＡ－１）の処置において使用するためのものであり、好ましくは、パーキンソン病（ＰＤ）は、
ａ．配列番号１によるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２によるＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３若しくは配列番号７によるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域並びに配列番号４によるＣＤＲ－Ｈ１及び配列番号５によるＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６によるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、又は
ｂ．配列番号１３若しくは配列番号１７若しくは配列番号２１による軽可変領域及び配列番号２５から選択される重可変領域、又は
ｃ．配列番号１４若しくは配列番号１８若しくは配列番号２２による軽鎖及び配列番号２６による重鎖
を含む抗体又はその抗原結合断片であり、
抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化されており、アルファシヌクレイン繊維によって誘導されるアルファシヌクレイン凝集を防止し、任意選択で、抗体又はその抗原結合断片は、アルファシヌクレインと、配列番号８における、少なくとも残基Ｄ１１９、Ｎ１２２及びＹ１２５を含むエピトープと結合し、抗体又はその抗原結合断片は、治療において使用するためのものである。好ましくは、抗体又はその抗原結合断片は、ベータ－シヌクレインと交差反応せず、アルファシヌクレインと、繊維状のアルファシヌクレインに対してよりも、モノマーアルファシヌクレインに対して少なくとも１０倍高い解離定数（ＫＤ）で結合する。
別の実施形態では、患者においてパーキンソン病（ＰＤ）（パーキンソン病の特発性及び遺伝性形態を含む）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病のレビー小体異型（ＬＢＶＡＤ）、アルツハイマー病及びパーキンソン病の合併、多系統萎縮症（ＭＳＡ）及び脳内鉄沈着を伴う神経変性１型（ＮＢＩＡ－１）、好ましくは、パーキンソン病（ＰＤ）を処置する方法であって、前記患者に、抗体若しくはその抗原結合断片又は抗体若しくはその抗原結合断片を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む方法が提供され、抗体又はその抗原結合断片は、
ａ．配列番号１によるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２によるＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３若しくは配列番号７によるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域並びに配列番号４によるＣＤＲ－Ｈ１及び配列番号５によるＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６によるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、又は
ｂ．配列番号１３若しくは配列番号１７若しくは配列番号２１による軽可変領域及び配列番号２５から選択される重可変領域、又は
ｃ．配列番号１４若しくは配列番号１８若しくは配列番号２２による軽鎖及び配列番号２６による重鎖
を含み、
抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化されており、アルファシヌクレイン繊維によって誘導されるアルファシヌクレイン凝集を防止し、任意選択で、抗体又はその抗原結合断片は、アルファシヌクレインと、配列番号８における、少なくとも残基Ｄ１１９、Ｎ１２２及びＹ１２５を含むエピトープと結合し、抗体又はその抗原結合断片は、治療において使用するためのものである。好ましくは、抗体又はその抗原結合断片は、ベータ－シヌクレインと交差反応せず、アルファシヌクレインと、繊維状のアルファシヌクレインに対してよりも、モノマーアルファシヌクレインに対して少なくとも１０倍高い解離定数（ＫＤ）で結合する。
あるいは、本発明はまた、アルファシヌクレイノパチーを処置するための医薬の製造のための、抗体又はその抗原結合断片の使用を提供し、アルファシヌクレイノパチーは、好ましくは、パーキンソン病（ＰＤ）（パーキンソン病の特発性及び遺伝性形態を含む）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病のレビー小体異型（ＬＢＶＡＤ）、アルツハイマー病及びパーキンソン病の合併、多系統萎縮症（ＭＳＡ）及び脳内鉄沈着を伴う神経変性１型（ＮＢＩＡ－１）、より好ましくは、パーキンソン病（ＰＤ）であり、抗体又はその抗原結合断片は、
ａ．配列番号１によるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２によるＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３若しくは配列番号７によるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域並びに配列番号４によるＣＤＲ－Ｈ１及び配列番号５によるＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６によるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、又は
ｂ．配列番号１３若しくは配列番号１７若しくは配列番号２１による軽可変領域及び配列番号２５から選択される重可変領域、又は
ｃ．配列番号１４若しくは配列番号１８若しくは配列番号２２による軽鎖及び配列番号２６による重鎖
を含み、
抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化されており、アルファシヌクレイン繊維によって誘導されるアルファシヌクレイン凝集を防止し、任意選択で、抗体又はその抗原結合断片は、アルファシヌクレインと、配列番号８における、少なくとも残基Ｄ１１９、Ｎ１２２及びＹ１２５を含むエピトープと結合し、抗体又はその抗原結合断片は、治療において使用するためのものである。好ましくは、抗体又はその抗原結合断片は、ベータ－シヌクレインと交差反応せず、アルファシヌクレインと、繊維状のアルファシヌクレインに対してよりも、モノマーアルファシヌクレインに対して少なくとも１０倍高い解離定数（ＫＤ）で結合する。
本発明の一部はまた、診断上活性な薬剤として使用するための、又はパーキンソン病（ＰＤ）（パーキンソン病の特発性及び遺伝性形態を含む）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病のレビー小体異型（ＬＢＶＡＤ）、アルツハイマー病及びパーキンソン病の合併、多系統萎縮症（ＭＳＡ）及び脳内鉄沈着を伴う神経変性１型（ＮＢＩＡ－１）などのアルファシヌクレイノパチーを診断するための診断アッセイにおける抗アルファシヌクレイン抗体又は抗原結合断片の使用である。
診断は、好ましくは、生体サンプルで実施され得る。「生体サンプル」は、個体から得られたさまざまなサンプル種を包含し、診断アッセイ又はモニタリングアッセイにおいて使用され得る。この定義は、脳脊髄液、血漿及び血清などの血液並びに尿及び唾液などの生物学的起源のその他の液体サンプル、生検検体などの固体組織サンプル又は組織培養物若しくはそれに由来する細胞及びその後代を包含する。この定義はまた、試薬を用いる処置、可溶化又はポリヌクレオチドなどの特定の構成成分についての濃縮などによって、その獲得後に任意の方法で操作されているサンプルも含む。
診断検査は、好ましくは、ヒト又は動物身体と接触していない生体サンプルで実施され得る。このような診断検査はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ検査と呼ばれる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断検査は、ｉ）生体サンプルを、本明細書に記載されるような抗アルファシヌクレイン抗体又はその抗原結合断片と接触させるステップと、ｉｉ）抗アルファシヌクレイン抗体又はその抗原結合断片の、アルファシヌクレインとの結合を検出するステップとを含む、個体から得られている生体サンプルにおいてアルファシヌクレインを検出するｉｎ ｖｉｔｒｏ法に依存し得る。検出されたアルファシヌクレインレベル又はアルファシヌクレインの特定の翻訳後修飾形態の存在を、適した対照と比較することによって、１種又は複数のアルファシヌクレイノパチーが同定され得る。したがって、アルファシヌクレイノパチーのステージ（重症度）を決定することを含む、アルファシヌクレイノパチーを有するか、又はそれを発症するリスクにあるか否かを決定するために、このような検出法が使用され得る。
したがって、本発明は、アルファシヌクレイノパチーの診断において、好ましくは、パーキンソン病（ＰＤ）の診断において使用するための抗体又はその抗原結合断片を提供し、抗体又はその抗原結合断片は、
ａ．配列番号１によるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２によるＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３若しくは配列番号７によるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域並びに配列番号４によるＣＤＲ－Ｈ１及び配列番号５によるＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６によるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、又は
ｂ．配列番号１３若しくは配列番号１７若しくは配列番号２１による軽可変領域及び配列番号２５から選択される重可変領域、又は
ｃ．配列番号１４若しくは配列番号１８若しくは配列番号２２による軽鎖及び配列番号２６による重鎖
を含み、
任意選択で、抗体又はその抗原結合断片は、アルファシヌクレインと、配列番号８における、少なくとも残基Ｄ１１９、Ｎ１２２及びＹ１２５を含むエピトープと結合する。
本発明に含まれる配列は、表１に示されている：




本発明を以下、添付の図面に例示される実施形態を参照して例としてさらに説明する。
（例１）
ヒトアルファシヌクレインモノマー及び繊維の発現
ヒトアルファ－シヌクレインをコードする遺伝子を合成によって作製し、標準分子生物学技術を使用してベクターｐＭＨ １０Ｈｉｓ ＴＥＶ（ＣＭＶプロモーターを含有する）中にサブクローニングして、Ｎ末端１０Ｈｉｓ－ＴＥＶタグを有するアルファシヌクレインを生成するように遺伝子操作されたベクターを作出した。得られたベクターを、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者のプロトコールに従って使用して、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞中にトランスフェクトした。培養培地中に蓄積したアルファシヌクレインタンパク質を、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーＨｉｓＴｒａｐエクセルカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してそこから回収した。２５ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０を用いてカラムを洗浄し、同バッファー中５００ｍＭイミダゾールの段階的勾配を用いてタンパク質を溶出した。１０Ｈｉｓタグを、ＴＥＶプロテアーゼを使用して除去した。次いで、サンプルを濃縮し、脱塩し、その後、切断されたタンパク質をＨｉｓＴｒａｐエクセルカラムに再度アプライし、切断されたアルファシヌクレインをフロースルー中に収集した。ＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのゲル濾過によってアルファシヌクレインをさらに精製し、Ｐｒｏｔｅｕｓ ＮｏＥｎｄｏカートリッジ（Ｇｅｎｅｒｏｎ）に通すことによって内毒素を除去した。精製されたＳＥＣ ＭＡＬＳによってアルファシヌクレインがモノマーであることを確認した（図１Ａ）。
野生型（タグのついていない）ヒトアルファシヌクレインもまた、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞において発現させた。タンパク質を、ＨｉＴｒａｐ Ｑカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するアニオン交換によって培養培地から再度回収した。カラムを２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８．０を用いて洗浄し、４００ｍＭへの塩化ナトリウム勾配を使用してタンパク質を溶出した。画分を濃縮し、ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通すことによって脱塩し、２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８．０を用いて溶出した。タンパク質を、ＭｏｎｏＱ １０／１００ＧＬカラムを使用してさらに精製し、２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８．０中、４００ｍＭへの塩化ナトリウム勾配を用いて溶出し、ＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのゲル濾過を続け、ＰＢＳ ｐＨ７．４で溶出した（図１Ｂ）。
この野生型のタグのついていないアルファシヌクレインモノマーを使用して、アルファ－シヌクレイン繊維を調製し、これは、精製されたモノマー（ＰＢＳ ｐＨ７．４中、９～１０ｍｇ／ｍＬ）を、Ｖｏｒｔｅｍｐ５６シェーキングインキュベーター（Ｌａｂｎｅｔ）中、１２００ｒｐｍ、３７℃で１０日間継続して撹拌することによって得た。繊維形成は、ＪＣ－１アッセイ（Ｌｅｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００９年、第４１８巻、３１１～３２３頁）及び溶液のＣフーリエ変換赤外分光法によって評価した。繊維溶液中の組み込まれていないモノマーを、超遠心分離法によって、及び１００ＫＤａカットオフメンブレンを通すことと、それに続くゲル電気泳動によって評価した。ＪＣ－１応答＞１５、少量の可溶性モノマー（＜５％）及び１６２５から１６３０ｃｍ－１の間の主吸収を有するＦＴＩＲスペクトルを有する繊維のみをさらなる研究に使用した（図２）。調製された繊維は、－８０℃で保存した。
（例２）
種々の種及び免疫原を使用する多数の免疫処置戦略を実施した。抗体５８１１は、５０μｇの上記のように発現された野生型のタグが付けられていないアルファシヌクレインモノマー（配列番号８）を用いて皮下免疫処置を施されていた雌Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（＞１８０ｇ）に由来した。
ラットにフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）を使用して２１日間隔で３回の追加免疫を与え、免疫処置の１４日後、尾静脈から出血させた。最終出血の１４日後に終結させ、脾臓、リンパ節、骨髄及び末梢血単核細胞の単細胞懸濁液を調製し、１０％ＤＭＳＯ／ＦＣＳ中で－８０℃で凍結した。
Ｂ細胞培養
Ｂ細胞培養物を、Ｔｉｃｋｌｅら、２０１５年 Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ：第２０巻（４号）、４９２～４９７頁によって記載されるものと同様の方法を使用して調製した。手短には、免疫処置された動物から得たＢ細胞に由来するリンパ節又は脾細胞を、ウェル当たりおよそ２０００～５０００個細胞の密度で、バーコード付き９６ウェル組織培養プレート中で、２００μｌ／ウェルの、１０％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、２％ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、０．１％ β－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、１％の活性化ヒトＰＢＭＣ上清（ＢＳＳ）及びＸ線照射突然変異体ＥＬ４マウス胸腺腫細胞（５×１０４個／ウェル）を補給したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて、５％ ＣＯ２の雰囲気中３７℃で７日間培養した。培養は、免疫処置したすべての動物から得たＢ細胞を使用して設定し、合計で、およそ１．７×１０９個のＢ細胞をサンプリングした。
本発明による抗体である５８１１を、ウェル当たりおよそ２０００個細胞の密度で培養された活性化リンパ節由来Ｂ細胞から作製した。新規抗体をサンプリングし、同定するためのＢ細胞の代替供給源を本発明者らに与えるために、抗体発見のために脾細胞に加えてリンパ節を使用した。全長モノマーヒトアルファシヌクレインで免疫処置したラットから、およそ３．３×１０８個細胞をサンプリングした。
一次スクリーニング
Ｂ細胞培養上清中のヒトアルファシヌクレイン特異的抗体の存在を、標的抗原の供給源としてビオチン化組換えヒトアルファシヌクレイン全長モノマーを用いてコーティングされたＳｕｐｅｒａｖｉｄｉｎ（商標）ビーズ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用する均一蛍光ベース結合アッセイを使用して調べた。本明細書に記載されるような組換えヒトアルファシヌクレインを、３倍モル過剰のビオチンを使用してビオチン化した。アルファシヌクレイン分子内の７個のリシン残基の完全修飾を避けるために低モル過剰のビオチンを使用した。アルファシヌクレインモノマーをビオチンとともに４０℃で一晩インキュベートし、翌日、Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラムを使用して遊離ビオチンを除去した。スクリーニングは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｒａｖｏ液体ハンドラーを使用する、バーコード付き９６ウェル組織培養プレートから、Ｓｕｐｅｒａｖｉｄｉｎビーズ（１０ｕｌ／ウェル）上に固定化されたビオチン化組換えヒトアルファシヌクレインモノマーを含有するバーコード付き３８４ウェル黒色壁アッセイプレート中への１０μｌの上清の移動を含んでいた。結合は、ヤギ抗ラットＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いて示した。アルファシヌクレイン特異的ＩｇＧを含有するウェルを同定するためにＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌでプレートを読み取った。
二次スクリーニング
一次スクリーニング後、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＢｉｏｍｅｋＮＸＰヒットピッキングロボットを使用して、陽性上清を９６ウェルバーコード付きマスタープレート上に統合し、細胞培養プレート中のＢ細胞を－８０℃で凍結した。次いで、ビオチン化組換えヒトアルファシヌクレインモノマー又はビオチン化組換えヒトアルファシヌクレイン繊維を使用するストレプトアビジン捕獲ＥＬＩＳＡアッセイにおいてマスタープレートをスクリーニングした。これは、モノマー及び繊維状組換えヒトアルファシヌクレイン療法との結合を与えたウェルを同定するために、またＳｕｐｅｒａｖｉｄｉｎ（商標）ビーズとのオフターゲット結合を示す何らかの偽陽性ウェルを排除するために実施した。繊維の不溶性を考慮すると、溶液中のタンパク質とともに使用される従来のＥＬＩＳＡコーティングプロトコールは好都合ではなかった。繊維状構造を保つため、また、ストレプトアビジンを用いて事前コーティングされたＥＬＩＳＡプレート上での繊維の効率的なコーティングを促進するために、最小のビオチン化プロトコールが使用されることが決定された。
ビオチン化アルファシヌクレイン総繊維は、ＰＢＳ中でビオチン化組換えアルファシヌクレインモノマー（上記のような）を、５０倍過剰の未標識組換えアルファシヌクレインと組み合わせることによって本明細書に記載されたように作製した。繊維形成は、ＪＣ１アッセイによって確認した（Ｌｅｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００９年、第４１８巻、３１１～３２３頁）。
ＰＢＳ中のビオチン化モノマー又はビオチン化繊維を、炭酸含有バッファー（ｄＨ２Ｏ＋０．１６％ Ｎａ２ＣＯ３＋０．３％ ＮａＨＣＯ３）中のストレプトアビジンを用いてコーティングされた３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ プレート上に捕獲した。１％ ｗ／ｖ ＰＥＧ／ＰＢＳを用いてプレートをブロッキングし、次いで、１０μｌ／ウェルＢ細胞培養上清（ブロッキングバッファーと１：１希釈された）とともにインキュベートした。二次ＨＲＰコンジュゲート型ヤギ抗ラットＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ＨＲＰコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）をプレートに添加し、続いて、ＴＭＢ基質（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製；１０μｌ／ウェル）を用いて結合を可視化した。光学濃度は、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ２マイクロプレートリーダーを使用して６３０ｎＭで測定した。一次結合アッセイによって、８３ヒットが同定され、ＥＬＩＳＡスクリーニング後、それらのうち２９が、モノマー及び繊維状組換えヒトアルファシヌクレインン両方と結合すると示された。
組換え繊維に対して最強のＥＬＩＳＡ結合シグナルを実証するＢ細胞上清を、組換えヒトアルファシヌクレインモノマー、組換えヒトアルファシヌクレイン繊維及び組換えマウスアルファシヌクレイン繊維上での最良の解離速度を有するものを同定するための表面プラズモン共鳴によるさらなる解析のために選択した。２６種の異なるＢ細胞から得た上清を試験し、１９種のウェルが、組換えヒトアルファシヌクレインモノマー上で解離速度（ｋｄ）＜１×１０－５を示した。これらのうち、６種が組換えマウスアルファシヌクレインモノマー上で１×１０－５未満の解離速度（ｋｄ）を示した。１９種の上清すべてを可変領域回収のために選択した。
可変領域回収
対象の上清の選択からの抗体可変領域遺伝子の回収を可能にするために、Ｂ細胞の不均一な集団を含有していた所与のウェルにおける抗原特異的Ｂ細胞の同定を可能にするための逆重畳積分ステップを実施しなくてはならなかった。これは、蛍光焦点法（Ｃｌａｒｇｏら、２０１４年ＭＡｂｓ：第６巻（１号）、１４３～１５９頁）を使用して達成した。手短には、陽性ウェルから得た免疫グロブリン分泌Ｂ細胞を、ビオチン化組換えヒトアルファシヌクレイン繊維でコーティングされたストレプトアビジンビーズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（上記のように１：５０ミックスを使用して作製された）及びヤギ抗ウサギＦｃγ断片特異的ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）の１：１２００最終希釈物と混合した。３７℃で１時間の静的インキュベーション後、Ｂ細胞の周囲の蛍光ハロの存在のために抗原特異的Ｂ細胞を同定できた。Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を使用して同定されたいくつかのこれらの個々のＢ細胞クローンを、次いで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆミクロマニピュレーターを用いて選び取り、ＰＣＲ管中に蓄積させた。
抗体可変領域遺伝子を、単細胞から重鎖及び軽鎖可変領域特異的プライマーを使用する逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲによって回収した。３’及び５’末端の制限部位を組み込むネステッド２ＰＣＲを用いて２ラウンドのＰＣＲを実施して、可変領域の、マウスＩｇＧＦｃγ１又はＦａｂ－１０ＨＩＳ（ＶＨ）又はマウスカッパ（ＶＬ）哺乳動物発現ベクターへのクローニングを可能にした。９種の異なる上清から得た抗アルファシヌクレイン抗体遺伝子が、発現ベクター中に成功裏にクローニングされた。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び３０ｍｌの容積中で１２５ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中で発現されたラット－マウスキメラ組換え抗体５８１１ ｍＦａｂ又は５８１１ ｍＩｇＧ１（ラット５８１１可変領域及びマウス定常領域を含む（ＩｇＧについて配列番号３４及び３５による、並びにＦａｂについて配列番号３４及び３６による）を使用して重鎖及び軽鎖構築物をＥｘｐｉ－２９３細胞中に同時トランスフェクトした。５～７日の発現後、上清を回収し、アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。
一過性上清のＥＬＩＳＡスクリーニング
次いで、精製されたラット－マウスキメラ抗体を、ＥＬＩＳＡによるさらなるスクリーニング付した。ビオチン化組換えヒトアルファシヌクレインモノマー及び繊維を、炭酸含有バッファー（ｄＨ２Ｏ＋０．１６％ Ｎａ２ＣＯ３＋０．３％ ＮａＨＣＯ３）中のストレプトアビジンを用いてコーティングされた３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｎｕｎｃ）上に捕獲した。別個のプレートはまた、配列番号８によるヒトアルファシヌクレインの残基１１７～１２６（ペプチド ＰＶＤＰＤＮＥＡＹＥ）に対応するビオチン化ペプチドを用いてコーティングして、一過性のものが、これ又は分子上の異なる領域に結合したか否かを調べた。プレートを、１％ ｗ／ｖ ＰＥＧ／ＰＢＳを用いてブロッキングし、次いで、精製一過性上清のいくつかの希釈物とともにインキュベートした。二次ＨＲＰコンジュゲート型ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｓｔｒａｔｅｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ／Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をプレートに添加し、続いて、ＴＭＢ基質（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製；１０μｌ／ウェル）を用いて結合を可視化した。光学濃度は、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ２マイクロプレートリーダーを使用して６３０ｎＭで測定した。ＩｇＧ Ｆｃγ１（配列番号３４及び３５を含む）としての、及びＦａｂ（配列番号３４及び３６を含む）としての抗体５８１１についてのデータは、図３Ａ及び３Ｂに示されている。見られるように、５８１１抗体は、モノマー及び繊維状組換えヒトアルファシヌクレイン両方との結合を示し、ＰＶＤＰＤＮＥＡＹＥペプチドとの結合も示す。
さらなる特性決定を実施して、このような抗体の活性、親和性及び結合力、エピトープ結合及び生物物理学的特性を決定した。ヒト化版を使用したと明確に記載されない限り、実験はラット－マウスキメラ抗体（５８１１ ｍＦａｂ又は５８１１ ｍＩｇＧ１）を用いて実施した。
（例３）
抗体特性決定
Ｂｉａｃｏｒｅ動態
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器で表面プラズモン共鳴技術を使用することによって相互作用動態を決定した。本明細書に記載されるように調整した、組換え全長ヒトアルファシヌクレインモノマー、精製組換えヒトアルファシヌクレイン繊維及び精製組換えマウスアルファシヌクレイン繊維を含む３種の異なるリガンドを、アミンカップリング化学を使用してＣＭ５チップ表面の３種の異なるフローセル上に各々固定化した。３種のリガンドを１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ３．５中で調製し、１０μｌ／分の流速で、それぞれ、アルファシヌクレインモノマーについての約３０反応単位（ＲＵ）、ヒトアルファシヌクレイン繊維についての約４０ＲＵ及び、マウスアルファシヌクレイン繊維についての約３００ＲＵの固定化レベルに到達するように別個のフローセル表面に固定化させた。リガンド固定化及び動態アッセイ両方のためのランニングバッファーとして、バッファーＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）を使用した。次いで、抗アルファシヌクレインモノクローナル５８１１ ｍＩｇＧ１抗体及びモノクローナル５８１１ ｍＦａｂ抗体の、３種のリガンドに対する結合を測定した。モノクローナルｍＩｇＧ１又はｍＦａｂ抗体を、８００ｎＭ～０．１９５ｎＭの７種の異なる濃度で、３つのフローセルにわたって、３分の接触時間及び３０分の解離時間を用い、１００μｌ／分の流速で注入した。１０μｌ／分で９０秒間の５０ｍＭ ＨＣｌの１回の注入及び１０μｌ／分で６０秒間の５０ｍＭ ＨＣｌの別の注入によって表面を再生した。データは、バルク寄与なし（ＲＩ＝０）及びｍＩｇＧ１形式のためのグローバルＲｍａｘを仮定した二価解析物モデル並びに柔軟なバルク寄与（ローカルＲＩ）及びグローバルＲｍａｘを用いる１：１モデルを使用してＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア（バージョン３．０）を使用して解析した。
固定化された標的とのｍＩｇＧ１及びｍＦａｂ両方の結合の動態値が表２に示されている。ｍＩｇＧ１形式は、解離定数ＫＤが、ヒト繊維に対してよりも１０倍より小さいので、ヒトアルファシヌクレインモノマーとの親和性と比較して、ヒトアルファシヌクレイン繊維に向けた明らかな選択的親和性を示した。
ベータシヌクレインとの結合
ヒトアルファシヌクレインに対して産生された抗体のヒトベータシヌクレインとの結合を、ｒペプチドベータシヌクレインを使用するウエスタンブロットによって試験した。１マイクログラムのシヌクレインを４～１２％ Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ ゲルに流し、ＰＶＤＦメンブレン上にブロットした。メンブレンを、３％ ＢＳＡ及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳ中でブロッキングした。ブロッキングされたブロットに抗体５８１１ｍＩｇＧ１を添加し、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を用いて洗浄し、二次抗体－ＨＲＰコンジュゲート（抗ウサギＨ＋Ｌ ＨＲＰコンジュゲート、Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ１２０－１０１Ｐ）とともに１時間インキュベートした。ブロットを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳ、ＰＢＳ及び水で十分に洗浄した。ＥＣＬウエスタンブロット基質（Ｐｉｅｒｃｅ）の添加後に化学発光を測定した。図４（Ａ）レーン３に示されるように、抗体５８１１ｍＩｇＧ１は、ヒトベータ－シヌクレインと結合しない。
エピトープマッピング
ＮＭＲ
ヒトアルファ－シヌクレインを、タンパク質が任意のタグを伴わずに発現されるようにｐＥＴ２８ａ発現ベクター中にクローニングした。構築物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に形質転換し、細胞を、重水（Ｄ２Ｏ）の存在下及び不在下でＣ１３標識されたＤＬ－グルコース及びＮ１５標識された硫酸アンモニウムを有する規定の培地で増殖させた。ＯＤ６００ｎｍ＝１で３００ｍＭ ＩＰＴＧを用いて発現を誘導し、培養物を３０℃で４時間インキュベートした。細胞をペレットにし、１００ｍｌ溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．０、２５ユニットのベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、完全ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（２錠、Ｒｏｃｈｅ）及び１０ｍｇリゾチーム（Ｓｉｇｍａ））中での３回の凍結解凍サイクルによって溶解した。溶解物を１８０００ｒｐｍでの遠心分離によって清澄化し、清澄化された溶解物を０．２２μｍフィルター（Ｓｔｅｒｉｃｕｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通した。滅菌溶解物を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．０、５ＣＶを用いて平衡化したＭｏｎｏＱ １０／１００ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の頂部にロードし、同バッファー中５００ｍＭへのＮａＣｌ勾配を用いてタンパク質を溶出させた。最も純粋な画分のさらなる精製を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．０での５倍希釈後ＭｏｎｏＱ １０／１００ＧＬカラムで反復した。最も純粋な画分をプールし、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心濃縮機（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮し、ＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除によって精製し、２５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．４）で溶出した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムから得た画分をプールし、ナトリウムアジド（０．０２％最終濃度）及びＡＥＢＳＦ（１０、μＭ最終濃度）を添加した。最終タンパク質濃度は、およそ５ｍｇ／ｍｌであった。
ラット－マウス５８１１Ｆａｂ抗体を、Ｈｉｓタグが付いた実体としてＣＨＯ ＳＸＥにおいて発現させ、Ｈｉｓ－タグアフィニティークロマトグラフィー、上清からのタンパク質の、ＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）との結合及びＰＢＳ中２５０ｍＭのイミダゾールを用いる溶出によって上清から精製した。溶出プールをＨｉＴｒａｐ ＧａｍｍａＢｉｎｄ Ｐｌｕｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードし、ＰＢＳを用いてカラムを洗浄し、０．１Ｍグリシン－ＨＣｌ ｐＨ２．６を用いてタンパク質を溶出し、０．７５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ９を用いてｐＨをｐＨ６に調整した。溶出されたＦａｂ－Ｈｉｓタンパク質を、ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラムでＮＭＲバッファー（２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ）にバッファー交換した。Ｆａｂ－Ｈｉｓタンパク質画分を濃縮し、プロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦ（１０μＭ最終濃度）及びナトリウムアジド（０．０２％最終濃度）を添加し、その後、Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ ０．２２μｍフィルターでフィルター滅菌した。
配列番号９のＶＬ及び配列番号１０のＶＨを有する抗体５８１１のエピトープ結合を、抗体のＦａｂ断片を使用する異種核核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法を使用して調べた。
α－シヌクレインの骨格割当
ＮＭＲサンプルは、通常、５ｍｍ Ｓｈｉｇｅｍｉ管中の３６０μＭ １３Ｃ／１５Ｎ標識された、又は４３０μＭ ２Ｈ／１３Ｃ／１５Ｎ標識されたヒトアルファシヌクレインのタンパク質濃度を有する、容量３５０μｌとした。バッファー条件は、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．４、１０μＭ ＡＥＢＳＦ、０．０２％ ＮａＮ３とした。すべての実験は、低温貯蔵用冷却プローブが取り付けられた６００ＭＨｚ Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＩＩＩ又は８００ＭＨｚ Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＩＩスペクトロメーターのいずれかで２０℃で記録した。タンパク質、ＨＮ（ｉ）－Ｎ（ｉ）－Ｎ（ｉ±１）中の残基の骨格ＮＭＲシグナル間の連続接続は、それぞれ１５Ｎ、１５Ｎ及び１Ｈ次元において、２８、２８及び１０ｐｐｍのスペクトル幅並びに１１７（Ｆ１）、１１７（Ｆ２）及び１４０（Ｆ３）ミリ秒の獲得時間を用い、増分当たり８回スキャン及び１．５秒の緩和遅延を用いて記録された、３Ｄ（Ｈ）Ｎ（ＣＡ）ＮＮＨ実験（Ｗｅｉｓｅｍａｎｎら、１９９３年「ＮＨの連続割当のための３Ｄ三重共鳴ＮＭＲ技術並びに１５Ｎ－及び１３Ｃ－標識タンパク質における１５Ｎ共鳴」（３Ｄ Ｔｒｉｐｌｅ－ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ＮＭＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ＮＨ ａｎｄ １５Ｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ ｉｎ １５Ｎ－ ａｎｄ １３Ｃ－ｌａｂｅｌｌｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ ３）を使用して行った。１０％（４００００のハイパーコンプレックス（ｈｙｐｅｒ－ｃｏｍｐｌｅｘ）点のうち４０００）のサンプリング密度を有する均一でないサンプリングを採用して、２．７５日の総取得時間をもたらした。ＴＲＯＳＹ－ＨＮＣＡ（Ｇｒｚｅｓｉｅｋ及びＢａｘ、１９９２年「３１ｋＤａのタンパク質に適用された改善された３Ｄ三重共鳴ＮＭＲ技術」（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ３Ｄ ｔｒｉｐｌｅ－ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ＮＭＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ａ ３１ ｋＤａ ｐｒｏｔｅｉｎ．）Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．第９６巻、４３２～４４０頁；Ｓａｌｚｍａｎｎら、１９９８年「三重共鳴実験におけるＴＲＯＳＹ：大きなタンパク質の連続ＮＭＲ割当の新規展望」（ＴＲＯＳＹ ｉｎ ｔｒｉｐｌｅ－ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：ｎｅｗ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ＮＭＲ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．第９５巻、１３５８５～９０頁）及びＴＲＯＳＹ－ＨＮＣＡＣＢ（Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄ及びＭｕｅｌｌｅｒ、１９９３年「ＨＮＣＡＣＢ、アミド－プロトン及び窒素共鳴を、タンパク質中のアルファ－及びベータ－炭素共鳴と関連づけるための高感度３Ｄ ＮＭＲ実験」（ＨＮＣＡＣＢ，ａ Ｈｉｇｈ－Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ３Ｄ ＮＭＲ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｔｏ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅ Ａｍｉｄｅ－Ｐｒｏｔｏｎ ａｎｄ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ａｌｐｈａ－ ａｎｄ Ｂｅｔａ－Ｃａｒｂｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｓｅｒ．Ｂ 第１０１巻、２０１～２０５頁；Ｓａｌｚｍａｎｎら、１９９９年「大きなタンパク質の連続ＮＭＲ割当のＴＲＯＳＹ型三重共鳴実験」（ＴＲＯＳＹ－ｔｙｐｅ Ｔｒｉｐｌｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ＮＭＲ Ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｒｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１２１巻、８４４～８４８頁）実験を使用して、連続接続が確認され、残基種類が同定された。ＴＲＯＳＹ－ＨＮＣＡ実験は、それぞれ１３Ｃ、１５Ｎ及び１Ｈ次元において２３、２８、１０ｐｐｍのスペクトル幅及び１２．１（Ｆ１）、２１．７（Ｆ２）及び１００（Ｆ３）ミリ秒の取得時間（増分当たり８回スキャン、１．５秒の緩和遅延、１日の総取得時間）を用いて記録したが、ＴＲＯＳＹ－ＨＮＣＡＣＢは、それぞれ１３Ｃ、１５Ｎ及び１Ｈ次元において５６、２８、１０ｐｐｍのスペクトル幅及び８．２（Ｆ１）、２１．７（Ｆ２）及び１００（Ｆ３）ミリ秒の取得時間（増分当たり８回スキャン、１．５秒の緩和遅延、１．７日の総取得時間）を用いて記録した。骨格カルボニル割当は、それぞれ１３Ｃ、１５Ｎ及び１Ｈ次元において１０、２９、１０ｐｐｍのスペクトル幅及び８０（Ｆ１）、２１．７（Ｆ２）及び１５０（Ｆ３）ミリ秒の取得時間（増分当たり８回スキャン、１．５秒の緩和遅延）を用いて記録されたＴＲＯＳＹ－ＨＮＣＯスペクトルから得た（Ｇｒｚｅｓｉｅｋ及びＢａｘ、１９９２年「３１ｋＤａのタンパク質に適用された改善された３Ｄ三重共鳴ＮＭＲ技術」（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ３Ｄ ｔｒｉｐｌｅ－ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ＮＭＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ａ ３１ ｋＤａ ｐｒｏｔｅｉｎ．）Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．第９６巻、４３２～４４０頁；Ｓａｌｚｍａｎｎら、１９９８年「三重共鳴実験におけるＴＲＯＳＹ：大きなタンパク質の連続ＮＭＲ割当の新規展望」（ＴＲＯＳＹ ｉｎ ｔｒｉｐｌｅ－ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ： ｎｅｗ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ＮＭＲ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．第９５巻、１３５８５～９０頁）。１５％（８０５０のハイパーコンプレックス（ｈｙｐｅｒ－ｃｏｍｐｌｅｘ）点のうち１２０８）のサンプリング密度を有する均一でないサンプリングを採用して、１９時間の総取得時間をもたらした。ＮＭＲスペクトルは、ＮＭＲＰｉｐｅ（Ｄｅｌａｇｌｉｏら、１９９５年「ＮＭＲＰｉｐｅ：ａ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＵＮＩＸ（登録商標）ｐｉｐｅｓ．」Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ． ＮＭＲ 第６巻、２７７～９３頁）を使用して処理し、線形予測を使用して、最大１倍まで窒素における有効な取得時間を拡大した。均一でないサンプリングされたデータを、Ｈａｒｖａｒｄ反復性ソフト閾値法を使用して再構築し（Ｈｙｂｅｒｔｓら、２０１２年「多次元ポアソンギャップスケジューリングを用いて均一でなくサンプリングされたＮＭＲデータの迅速な再構築のための反復性ソフト閾値の適用」（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｓｏｆｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ ｆｏｒ ｆａｓｔ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮＭＲ ｄａｔａ ｎｏｎ－ｕｎｉｆｏｒｍｌｙ ｓａｍｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｐｏｉｓｓｏｎ Ｇａｐ ｓｃｈｅｄｕｌｉｎｇ．）Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ ＮＭＲ 第５２巻、３１５～２７頁）、データを次のフーリエ数に再構築し、間接取得時間を最大６０％まで増大した。データ解析はＳｐａｒｋｙ（カリフォルニア大学、サンフランシスコ中、Ｇｏｄｄａｒｄ及びＫｎｅｌｌｅｒ、Ｄ．Ｇ． ＳＰＡＲＫＹ ３．）を使用して実施し、１３３残基のアミドプロトン及び窒素共鳴の割当が得られ、これは、プロリン残基及びＮ末端メチオニンを除く残基の９９％に相当した。割り当てられなかったアルファシヌクレインの唯一のその他の残基は、位置２のアスパラギン酸であった。
抗体５８１１Ｆａｂ断片の結合部位のマッピング
１０％モル過剰の未標識５８１１Ｆａｂを含有する２Ｈ／１３Ｃ／１５Ｎ標識されたヒトα－シヌクレインの１５０μＭのサンプルを使用して、５８１１の結合部位のマッピングを実施した。α－シヌクレインの骨格割当について上記で記載されたものと同一のバッファーでサンプルを調製した。アルファシヌクレイン／Ｆａｂ複合体で記録されたＴＲＯＳＹ－ＨＮＣＯ（Ｇｒｚｅｓｉｅｋ及びＢａｘ、１９９２年「３１ｋＤａのタンパク質に適用された改善された３Ｄ三重共鳴ＮＭＲ技術」（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ３Ｄ ｔｒｉｐｌｅ－ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ＮＭＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ａ ３１ ｋＤａ ｐｒｏｔｅｉｎ．）Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．第９６巻、４３２～４４０頁；Ｓａｌｚｍａｎｎら、１９９８年「三重共鳴実験におけるＴＲＯＳＹ：大きなタンパク質の連続ＮＭＲ割当の新規展望」（ＴＲＯＳＹ ｉｎ ｔｒｉｐｌｅ－ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：ｎｅｗ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ＮＭＲ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．第９５巻、１３５８５～９０頁）スペクトルの、遊離アルファシヌクレインで記録された等価対照スペクトルとの比較によって、１Ｈ、１５Ｎ及び１３Ｃ化学シフト変化を決定した。遊離アルファシヌクレインの対照ＴＲＯＳＹ－ＨＮＣＯ実験は、それぞれ１３Ｃ、１５Ｎ及び１Ｈ次元において１０、２８及び１０ｐｐｍのスペクトル幅及び８０（Ｆ１）、１．７（Ｆ２）及び１５０（Ｆ３）ミリ秒の取得時間（増分当たり１６回スキャン、１．４秒の緩和遅延）を用いて記録した。２５％（８０５０のハイパーコンプレックス（ｈｙｐｅｒ－ｃｏｍｐｌｅｘ）点のうち２０１３）のサンプリング密度を有する均一でないサンプリング（ＮＵＳ）を採用して、２．５日の総取得時間をもたらした。α－シヌクレイン／Ｆａｂ複合体のＴＲＯＳＹ－ＨＮＣＯ実験は、それぞれ１３Ｃ、１５Ｎ及び１Ｈ次元において１０、２８及び１０ｐｐｍのスペクトル幅及び８０（Ｆ１）、２１．７（Ｆ２）及び８０（Ｆ３）ミリ秒の取得時間（増分当たり３２回スキャン、１．５秒の緩和遅延）を用いて記録した。２５％（４４７７のハイパーコンプレックス（ｈｙｐｅｒ－ｃｏｍｐｌｅｘ）点のうち１１１９）のサンプリング密度を有する均一でないサンプリングを採用して、２．８日の総取得時間をもたらした。ＮＭＲスペクトルは、ＮＭＲＰｉｐｅ（Ｄｅｌａｇｌｉｏら、１９９５年「ＮＭＲＰｉｐｅ：ａ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＵＮＩＸ（登録商標） ｐｉｐｅｓ．」Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ 第６巻、２７７～９３頁）を使用して処理し、ＮＵＳデータの再構築は、ｍｄｄｎｍｒを使用して実施した。（ＯｒｅｋｈｏｖとＪａｒａｖｉｎｅ、２０１１年「多次元分解を用いる均一でないサンプリングスペクトルの解析」（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｕｎｉｆｏｒｍｌｙ ｓａｍｐｌｅｄ ｓｐｅｃｔｒａ ｗｉｔｈ Ｍｕｌｔｉ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．）Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．、第５９巻、２７１～２９２頁）。窒素次元の有効な取得時間は、データ再構築の際に最大１倍まで増大された。
化学シフト変化は、カルボニル化学シフトを含むように、組み合わされた化学シフト変化（Δδ）を算出するために使用された方程式への修飾を除いて、本質的にこれまでに記載されたように（Ｖｅｖｅｒｋａら、２００８年「ｍＴＯＲのホスファチジン酸及び新規クラスの阻害剤との相互作用の構造的特性決定：ｍＴＯＲの分子媒介性調節におけるＦＲＢドメインの中心的役割の説得力のある証拠」（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍＴＯＲ ｗｉｔｈ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ： ｃｏｍｐｅｌｌｉｎｇ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｃｅｎｔｒａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ＦＲＢ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＴＯＲ．）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ 第２７巻、５８５～９５頁）、最小シフトアプローチ（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、１９９７年「ＮＭＲ化学シフト撹乱によるメタロプロテイナーゼ－２の組織阻害剤のＮ末端ドメインでのマトリックスメタロプロテイナーゼの結合部位のマッピング」（Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｆｏｒ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ－２ ｂｙ ＮＭＲ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｈｉｆｔ ｐｅｒｔｕｂａｔｉｏｎ．）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第３６巻、１３８８２～９頁）を使用して解析し、以下の方程式が得られた：

［式中、ΔδＨＮ、ΔδＮ及びΔδＣは、それぞれ１Ｈ、１５Ｎ及び１３Ｃ化学シフトにおける相違である］。αＮ及びαＣは、それぞれ０．２及び０．３５のスケーリング係数に対応し、アミドプロトン、窒素及びカルボニル化学シフトの化学シフト範囲における相違を説明するために使用される。
アルファシヌクレイン上のＦａｂ結合部位（エピトープ）を同定するために、組み合わされた最小シフト対タンパク質配列のヒストグラムを使用して、大幅に撹乱されたシグナルを含有するアルファシヌクレインの領域を示した。個々のアミノ酸の組み合わされた化学シフト変化の大きさが、すべてのアミノ酸の組み合わされた化学シフト変化の平均及びその平均からの１つの標準偏差の閾値を超えた場合には、これらの残基はＦａｂ結合部位中の可能性ある接触残基としてさらなる評価のために選択された。
大幅に撹乱された残基を、最小シフトが、すべての算出されたシフトの平均及び１つの標準偏差よりも少なくとも大きいものと同定した。４つの異なる閾値が、Ｆａｂによって結合された残基を同定するために適用された。結合部位に含まれる残基を、最小シフトがすべての算出されるシフトの平均及び１つの標準偏差を超えるもの（＞０．０２５５７４である）、最小シフトがすべての算出されるシフトの平均及び２つの標準偏差を超えるもの（＞０．０４２５５２である）、最小シフトがすべての算出されるシフトの平均及び３つの標準偏差を超えるもの（＞０．０５９５３０である）、最小シフトがすべての算出されるシフトの平均及び４つの標準偏差を超えるもの（＞０．０７６５０８である）のように増大するストリンジェンシーを用いてスコア化する。この解析では、プロリン残基は、アミドプロトンを含有しないので同定され得ない。
したがって、５８１１Ｆａｂに対するアルファシヌクレインエピトープは、すべての算出されるシフト：Ｅ１１４、Ｄ１１５、Ｖ１１８、Ｄ１１９、Ｄ１２１、Ｎ１２２、Ｅ１２３、Ａ１２４、Ｙ１２５、Ｅ１２６、Ｍ１２７、Ｓ１２９、Ｑ１３４、Ｄ１３５及びＹ１３６の平均及び１つの標準偏差；すべての算出されるシフト：Ｖ１１８、Ｄ１１９、Ｄ１２１、Ｎ１２２、Ｙ１２５、Ｍ１２７、Ｄ１３５及びＹ１３６の平均及び２つの標準偏差、すべての算出されるシフト：Ｖ１１８、Ｄ１１９、Ｄ１２１、Ｎ１２２、Ｍ１２７、Ｄ１３５及びＹ１３６の平均及び３つの標準偏差のように増大するストリンジェンシーを用いて定義され、すべての算出されるシフトの平均及び４つの標準偏差を超えてシフトされる残基はなかった。
ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００３３６．１において使用されたアミノ酸番号付けを使用して、５８１１Ｆａｂは、少なくとも以下のアルファシヌクレイン残基と結合するとわかった（平均＋３ＳＤ）Ｖ１１８、Ｄ１１９、Ｄ１２１、Ｎ１２２、Ｙ１２５、Ｍ１２７、Ｄ１３５及びＹ１３６。抗体はまた、以下の残基すべてと結合する可能性がある（平均＋１ＳＤ）Ｅ１１４、Ｄ１１５、Ｖ１１８、Ｄ１１９、Ｄ１２１、Ｎ１２２、Ｅ１２３、Ａ１２４、Ｙ１２５、Ｅ１２６、Ｍ１２７、Ｓ１２９、Ｑ１３４、Ｄ１３５及びＹ１３６。
図４Ｂに示されるように、ＮＭＲ化学シフトは、５８１１ ｍＦａｂとの結合の際にｄＣＮヒトアルファシヌクレインで変化した。５８１１ｍＦａｂの予測されたエピトープは、ヒトアルファ－シヌクレインのアミノ酸１１４から１３６内の残基（配列番号８）を含むと思われる。
ペプチドマッピング
抗体５８１１ｍＦａｂによって結合されるエピトープのさらなる特性決定を、ヒトアルファシヌクレインのＣ末端領域を代表する、及びそれを覆う短い（通常、９マー又は１０マー）ペプチドを使用することによって実施した。これらは、比較表面プラズモン共鳴アッセイにおいて使用して、任意のものが、抗体のＢｉａｃｏｒｅチップ上に固定化されたモノマーアルファシヌクレイン又は事前形成アルファシヌクレイン繊維のいずれかとの結合を阻害可能か否かを試験した。次いで、最大レベルの阻害を示すペプチドを、正確なエピトープを確認するための抗体との共結晶化研究のために選択した。
ペプチドは、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌｔｄ．、ビショップスウォルサム、英国によって供給され、Ａｔｈｅｒｔｏｎ及びＳｈｅｐｐａｒｄの方法に従ってＦｍｏｃ固相ペプチド化学によって合成した（参照：Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．；Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．（１９８９）．「固相ペプチド合成：実際的なアプローチ」（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．）Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）。Ｎ及びＣペプチド末端にそれぞれ、アセチル及びアミド基キャップし、α－シヌクレインのＮ末端及びＣ末端を表すペプチドの場合を除き、この場合には、それぞれアミノ及びカルボキシル基は遊離のままとした。ペプチド保存溶液をＤＭＳＯ中、１０ｍＭで調製した。ペプチドの全リストが、表３に示されている。
組換えヒトアルファシヌクレインモノマー及び事前形成されたアルファシヌクレイン繊維を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＣＭ５チップ上に固定化した。ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１０μｌ／分の流速での１００μｌの、５０ｍＭのＮ－ヒドロキシスクシニミド（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｍｉｄｅ）及び２００ｍＭの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミドの新鮮１：１（ｖ／ｖ）混合物の注入によるカルボキシメチルデキストラン表面の活性化後、１０ｍＭアセテートｐＨ５．０中、５μＭで、１００μｌのモノマー及び繊維を別個のフローセルに注入することによってカップリングを達成した。参照フローセルを同じ方法で活性化し、次いで、１ＭエタノールアミンＨＣｌ ｐＨ８．５の５０μｌパルスですべてのフローセル表面を不活性化した
ペプチド溶液を、ランニングバッファー中、１００μＭで調製し、ペプチドブランク対照を、ランニングバッファーでのＤＭＳＯの１００中の１希釈として調製した。５８１１ｍＦａｂの溶液をランニングバッファー中５０．５ｎＭで調製し、その後、１９８μｌを２μｌのブランク対照又は希釈ペプチドいずれかとともにプレインキュベートして、５０ｎＭ Ｆａｂ及び１μＭペプチド又は対照の最終混合物を得た。各サンプルのセンソグラムを、３０μｌの混合物を１０μｌ／分で注入すること及び各注入の５秒前に報告点を記録することによって記録した。４０ｍＭ ＨＣｌの２回の１０μｌ注入及び５ｍＭ ＮａＯＨの１回の注入によって各サイクルの最後にチップを再生した。対照サイクルは、ペプチドサイクルと交互とした。
各ペプチドの阻害の程度を、隣接対照サイクルの平均のものと比較した、報告点で測定された応答単位におけるパーセンテージ変化として算出した。
各アルファシヌクレインペプチドの阻害のレベルが図５に示されている。アルファシヌクレインモノマー又は繊維いずれかに対する５８１１ｍＦａｂの有意な阻害は、Ｃ末端ペプチドＡＳ１１３～１２２、ＡＳ１１５～１２４、ＡＳ１１７～１２６及びＡＳ１１９～１２８についてのみ観察され、α－シヌクレインのいずれかの形態に対する阻害のレベルは、極めて同様であった。モノマー及び繊維それぞれとの結合に対して８１％及び９０％でペプチドＡＳ１１７～１２６について最強レベルの阻害が観察された。上記の４種のペプチドにわたって共通する残基は、１１９～１２２であり、従って、これはエピトープの一部を成す。ペプチドＡＳ１１３～１２２及びＡＳ１１９～１２８について、阻害のレベルは２～５％のみの間で低下するので、残基１１５～１１８及び１２３～１２４もまた、エピトープの一部を含むに違いない。
この研究の結果は、抗体５８１１のエピトープは、残基１１５～１２４（ＤＭＰＶＤＰＤＮＥＡ）を含むことを示唆した。
アラニンスキャニング
ヒトアルファシヌクレイン（Ｈｉｓタグが付けられた）の単一アミノ酸突然変異体を調製し、製造業者の説明書に従ってＥｘｐｉ２９３系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において発現させた。アラニン残基を、すでにアラニンであり、セリンに変更した残基１２４を除く、位置１１８～１２８に配置した（表４）。遠心分離（４２００ｒｐｍ、２時間）とそれに続く滅菌濾過（Ｓｔｅｒｉｃｕｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）後に得られた上清から突然変異体タンパク質を精製した。上清を、予備平衡化したＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、２５ｍＭリン酸ナトリウム及び５００ｍＭ ＮａＣｌを用いて洗浄した。同バッファー中、最大５００ｍＭのイミダゾールの勾配を用いて結合しているタンパク質を溶出した。対象のタンパク質を有する画分をＮｕＰａｇｅゲル電気泳動によって同定し、プールし、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮し、ＰＤ－１０カラムでＰＢＳにバッファー交換した。タンパク質画分を、Ｕｌｔｒａｃｅｌ ３ＫＤａ ＭＷＣＯ 遠心スピンコンセントレーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。濃縮物を０．２２ｍＭ滅菌フィルター（Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通し、－２０℃で保存した。すべての突然変異体は、野生型ヒトアルファシヌクレインと同様の量で発現された（図６Ａ）。
ヒトアルファシヌクレインの突然変異体を、レーンあたりタンパク質あたり１マイクログラムを使用して４～１２％ Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ ＮｕＰａｇｅゲルで解析し、ＰＶＤＦメンブレン（ｉＢｌｏｔ ｍｉｎｉ ｓｔａｃｋ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にブロットした。ブロットを、ブロッキングバッファー（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ中、３％ウシ血清アルブミン）でブロッキングし、抗体５８１１ｍＦａｂ又は抗体５８１１ｍＩｇＧ１のいずれかとともにインキュベートした。ＰＢＳ中、０．１％ Ｔｗｅｅｎとともに室温で１時間インキュベートした後ブロットを洗浄した。ブロットをブロッキングバッファー中、二次検出抗体抗マウスＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰコンジュゲート（ＡＢ５８７９、Ａｂｃａｍ）とともに１時間インキュベートし、洗浄し、ＥＣＬウエスタンブロッティング基質（Ｐｉｅｒｃｅ）の添加後に化学発光を検出した。
図６Ｂ及び６Ｃに示されるように、ヒトアルファシヌクレインＤ１１９Ａ、Ｎ１２２Ａ及びＹ１２５Ａに対応する３種の突然変異体は、抗体５８１１ｍＦａｂ及び５８１１ｍＩｇＧ１によって認識されなかった。この解析は、ヒトアルファ－シヌクレイン中のこれらのアミノ酸は、抗体５８１１ｍＦａｂ及び５８１１ｍＩｇＧ１の、ヒトアルファシヌクレインとの結合にとって必須であり得ることを示唆する。
（例４）
抗体ヒト化
ラット抗体５８１１を、ラットＶ領域からヒト生殖系列抗体Ｖ領域フレームワークにＣＤＲをグラフトすることによってヒト化した。抗体の活性を回復させるために、ヒト化配列中でラットＶ領域に由来するいくつかのフレームワーク残基も保持した。これらの残基は、Ａｄａｉｒら（ＷＯ９１／０９９６７）によって概説されるプロトコールを使用して選択した。ラット抗体（ドナー）Ｖ領域配列の、ヒト生殖系列（アクセプター）Ｖ領域配列とのアラインメントは、図７及び８に、設計されたヒト化配列と一緒に示されている。ドナーからアクセプター配列にグラフトされたＣＤＲは、ＣＤＲ－Ｈ１を除いてＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、１９８７年）によって定義されるとおりであるが、ＣＤＲ－Ｈ１では、組み合わされたＣｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔ定義が使用されている（Ａｄａｉｒら、１９９１年「ヒト化抗体」（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．）ＷＯ９１／０９９６７を参照のこと）。
いくつかのバリアント重鎖及び軽鎖Ｖ領域配列をコードする遺伝子を、ＤＮＡ２．０ Ｉｎｃ．による自動化合成アプローチによって設計し、構築した。いくつかの場合には、ＣＤＲ内の突然変異を含むオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発によってＶＨ及びＶＫ遺伝子を修飾することによって、重鎖及び軽鎖Ｖ領域のさらなるバリアントを作出した。哺乳動物細胞における一過性の発現のために、ヒト化軽鎖Ｖ領域遺伝子を、ヒトカッパ鎖定常領域（Ｋｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡを含有するＵＣＢ軽鎖発現ベクターｐＭｈＣＫ中にクローニングした。ヒト化重鎖Ｖ領域遺伝子を、ヒトガンマ－４重鎖定常領域及びヒンジ安定化突然変異Ｓ２４１ＰをコードするＤＮＡを含有するＵＣＢヒトガンマ４重鎖発現ベクターｐＭｈγ４ＰＦＬ中にクローニングした（Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３年、第３０巻（１号）：１０５～８頁）。キメララット－ヒト５８１１抗体（配列番号９及び１０を含む）も同様に調製した。得られた重鎖及び軽鎖ベクターの、Ｅｘｐｉ２９３（商標）懸濁液細胞への同時トランスフェクションを、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクション試薬（Ａ１４５２５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して達成し、ヒトＩｇＧ４Ｐ又はＦａｂ－ＨＩＳ形式いずれかでのヒト化組換え抗体の発現を得た。
ヒトＶ領域ＩＧＫＶ１－３９及びＪＫ１ Ｊ－領域（ＩＭＧＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を、抗体５８１１軽鎖ＣＤＲのアクセプターとして選択した。グラフトｇＬ５、ｇＬ８及びｇＬ１４中の軽鎖フレームワーク残基は、ドナー残基チロシン（Ｙ７１）が保持された（配列番号１３における）残基７１を除いて、すべてヒト生殖系列遺伝子由来である。グラフトｇＬ１４のＣＤＲＬ３中の残基９４を、グリシン（Ｇ）からアラニン（Ａ）残基に突然変異させ、従って、潜在的なアスパラギン脱アミド化部位を修飾した。
ヒトＶ領域ＩＧＨＶ３－１５及びＪＨ３ Ｊ－領域（ＩＭＧＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を、抗体５８１１の重鎖ＣＤＲのアクセプターとして選択した。グラフトｇＨ４中の重鎖フレームワーク残基は、ドナー残基アラニン（Ａ４９）及びアラニン（Ａ１００）がそれぞれ保持された（配列番号２５における）残基４９及び１００を除いて、すべてヒト生殖系列遺伝子由来である。
バリアントヒト化抗体鎖及びその組合せを発現させ、親抗体に対するその効力、その生物物理学的特性及び下流処理に対する適合性について評価した。
表５に示されるように、すべてのグラフトは、繊維状のアルファシヌクレインに対して、親のラット－ヒト抗体と同一又は同様の親和性を保持していた。
（例５）
免疫組織化学
免疫組織化学は、Ａｓｔｅｒａｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（英国、ロイストン）によって実施された。凍結切片（１０μｍ）を、自動化加熱及び冷却を用いて９７℃で２０分間Ｄａｋｏ ＰＴ Ｌｉｎｋ及びＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ標的検索溶液（ｐＨ６）を使用する抗原検索手順に最初に付した。以下のインキュベーションステップすべてを室温で実施した。凍結切片を３０分間風乾し、１×ＰＢＳで調製した４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定化し、Ｄａｋｏ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）ＦＬＥＸ洗浄バッファー（Ｄａｋｏ）中で洗浄し、次いで、Ｄａｋｏ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ Ｐｌｕｓにロードした。切片をＤａｋｏペルオキシダーゼブロック（Ｄａｋｏ）とともに５分間インキュベートすることによって内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断した。次いで、切片を１×ＰＢＳを用いて２回洗浄し、次いで、Ｄａｋｏ ＣＳＡ ＩＩタンパク質ブロック（Ｄａｋｏ）とともに１０分間インキュベートした。タンパク質ブロック溶液をエアージェットによって除去し、切片を３０分間、Ｄａｋｏ抗体希釈剤（Ｄａｋｏ）で希釈した（０．０５μｇ／ｍｌ）５８１１ラット－マウスＩｇＧ１抗体（配列番号３４及び３５を含む）とともにインキュベートした。インキュベーション後、切片を１×ＰＢＳを用いて２回洗浄し、次いで、抗マウスＤａｋｏ Ｆｌｅｘポリマー－ＨＲＰ基質（Ｄａｋｏ）とともに２０分間インキュベートし、２回洗浄し、次いで、ジアミノベンジジン基質（Ｄａｋｏ）とともに１０分間インキュベートした。スライドを蒸留水ですすぐことによって発色反応を停止させた。発色後、切片をＤａｋｏ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ Ｐｌｕｓから回収し、ヘマトキシリンを用いて手作業で対比染色し、上昇系列のエタノールで脱水し、キシレンの３回の変更で清澄化し、ＤＰＸ封入剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）下にカバーガラスを付けた。Ａｐｅｒｉｏ ＳｃａｎＳｃｏｐｅ ＡＴ Ｔｕｒｂｏシステム（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して染色した切片のデジタル画像を得た。抗体５８１１ｍＩｇＧ１を、５個体の異なるｐＳ１２９－アルファ－シヌクレイン陽性及び３個体の異なるｐＳ１２９－アルファ－シヌクレイン陰性ドナーに由来する脳切片（１切片／ドナー）で試験した。抗体５８１１ｍＩｇＧ１は、ＰＤ患者の側頭皮質及び黒質においてニューロピル及び時折レビー小体様特徴を標識した（図９Ａ～Ｅ）。非ＰＤ脳組織では、抗体５８１１ｍＩｇＧ１は、側頭皮質においてニューロピルを標識したが、皮質又は黒質においてレビー小体様構造は観察されなかった（図９Ｆ～Ｈ）。これらの観察結果は、抗体５８１１ｍＩｇＧ１が、ＰＤ及び非ＰＤ患者から得た脳組織のニューロピル中の正常アルファシヌクレインと結合するが、一方で、ＰＤ患者のみにおいてレビー小体中に存在する病理学的α－シヌクレインと結合することを示唆する。
（例６）
ヒト化抗体の特性決定
３種のＡｂ５８１１ヒト化ＩｇＧ４Ｐ抗体（５８１１ｇＬ５ｇＨ４、５８１１ｇＬ８ｇＨ４ ５８１１ｇＬ１４ｇＨ４、表１中の配列）を試験して、熱安定性（Ｔｍ）、実験ｐＩ、疎水性、溶解度（ＰＥＧ沈殿アッセイ）、空気／液体界面での凝集安定性及びＣＤＲ－Ｌ３上のＡｓｎ９３の脱アミド化傾向に関する化学安定性を含むその生化学的及び生物物理学的特徴を評価した（５８１１ｇＬ１４ｇＨ４は、Ｎ（９３）Ａモチーフを有し、５８１１ｇＬ８ｇＨ４及びｇＬ５ｇＨ４の両方ともＮ（９３）Ｇモチーフを有する）。
熱安定性（Ｔｍ）測定
Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒアッセイを使用して、融解温度（Ｔｍ）又はアンフォールディングの中点の温度を決定した。この方法では、蛍光色素ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅを使用して、温度が高まるにつれ、露出するようになる疎水性領域と結合することによって、タンパク質アンフォールディングプロセスをモニタリングした。
反応ミックスは、５０００×保存溶液からＰＢＳで希釈された、５μｌの３０×ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））及び４５μｌの０．１２ｍｇ／ｍｌのサンプル（ＰＢＳ ｐＨ７．４中）を含有していた。ミックスの約１０μｌを３８４ＰＣＲ光学ウェルプレート中に４連で分注し、７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））で実行した。ＰＣＲシステム加熱デバイスを２０℃で９９℃に設定し、１．１℃／分の増加速度を用いた。電荷カップリング装置は、ウェルにおいて蛍光変化をモニタリングした。以下に記載されるように、強度増大をプロットし、傾斜の屈曲点（複数可）を使用してＴｍを算出した。各抗体分子のＴｍは、一般的なプレフォーミュレーションバッファーである、ＰＢＳ ｐＨ７．４及び５０ｍＭ酢酸ナトリウム／１２５ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ５．０の両方において得た。
３種のヒト化抗体すべての熱安定性が、表６に示されている。ＰＢＳ ｐＨ７．４において１つの遷移が観察され、これは、ＣＨ２及びＦａｂドメインアンフォールディングの両方に起因した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム／１２５ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ５．０では、２つの遷移が観察された。低い方のＴｍは、ＣＨ２アンフォールディングドメインに起因し、第２の遷移は、Ｆａｂドメインに起因していた。この解析から、抗体５８１１ｇＬ８ｇＨ４及び５８１１ｇＬ５ｇＨ４は、同等の熱安定性を有し、抗体５８１１ｇＬ１４ｇＨ４は、ほんのわずかに熱的安定性が低い。
実験ｐＩ
５８１１ｇＬ１４ｇＨ４、５８１１ｇＬ８ｇＨ４及び５８１１ｇＬ５ｇＨ４の実験ｐＩは、全キャピラリー画像化ｃＩＥＦ ｉＣＥ３（商標）システム（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を使用して得た。サンプルは、以下を混合することによって調製した：３０μＬのサンプル（ＨＰＬＣ等級水中、１ｍｇ／ｍＬストックから）、３５μＬの１％メチルセルロース溶液（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）、４μＬのｐＨ３～１０両性電解質（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ）、０．５μＬの４．６５及び０．５μＬの９．７７合成ｐＩマーカー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）、１２．５μＬの８Ｍ尿素溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））。ＨＰＬＣ等級水を使用して最終容量を１００μＬに構成した。混合物を短時間ボルテックス処理して、完全混合を確実にし、解析の前に１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して気泡を除去した。サンプルを１．５ｋＶで１分間、続いて、３ｋＶで５分間集束させ、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅソフトウェアを使用してキャピラリーのＡ２８０像をとった。得られた電気泳動図をｉＣＥ３ソフトウェアを使用して最初に解析し、ｐＩ値を割り当てた（ｐＩマーカー間の線形関係）。次いで、較正された電気泳動図をＥｍｐｏｗｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して統合した。
すべての分子の実験ｐＩは、８．８０～９．２３の範囲にあり、主な種は、９．０９であった。ＩｇＧ４Ｐ分子について通常である酸性／塩基性種分布に相違はなかった。実験ｐＩは高く、したがって、抗体の製造プロセスにおいて補助するであろう。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
ヒト化抗体５８１１ｇＬ１４ｇＨ４、５８１１ｇＬ８ｇＨ４及び５８１１ｇＬ５ｇＨ４を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によってその疎水性挙動について評価した。ＨＩＣでは、抗体は、高濃度の極性塩の存在下で疎水性固定相と結合し、塩の濃度が低下するにつれ移動相中に放出される。保持時間が長いほど、大きい疎水性と一致する。
２ｍｇ／ｍＬの抗体サンプルを、１．６Ｍ硫酸アンモニウム及びＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて１：２希釈した。５μｇ（１０μＬ）のサンプルを、蛍光検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００バイナリーＨＰＬＣに直接に接続されたＤｉｏｎｅｘ ＰｒｏＰａｃ（商標）ＨＩＣ－１０カラム（１００ｍｍ×４．６ｍｍ）上に注入した。分離は、内因性蛍光（励起波長及び発光波長、それぞれ２８０ｎｍ及び３４０ｎｍ）によってモニタリングした。
バッファーＡ（０．８Ｍ硫酸アンモニウム１００ｍＭリン酸 ｐＨ７．４）及びバッファーＢ（１００ｍＭリン酸 ｐＨ７．４）を使用し、以下のとおりの勾配溶出を使用してサンプルを解析した、（ｉ）０％ Ｂで２分保持、（ｉｉ）３０分で０から１００％ Ｂの直線勾配（０．８ｍＬ／分）（ｉｉｉ）カラムを１００％ Ｂを用いて２分間洗浄し、次のサンプル注入の前に０％ Ｂ中で１０分、再平衡化した。カラム温度は、２０℃で維持した。低及び高疎水性を示す標準及び対照も同一実行順序で解析し、保持時間の正規化を可能にした。以下の方程式を使用して、低及び高疎水性標準に対してサンプルの保持時間（ＲＴ）を正規化した：
［（サンプル（ＲＴ）－低標準（ＲＴ）／高標準（ＲＴ）－低標準（ＲＴ）］×１００
３種の抗体５８１１ｇＬ１４ｇＨ４、５８１１ｇＬ８ｇＨ４及び５８１１ｇＬ５ｇＨ４はすべて、同様の正規化保持時間及び同様の低疎水性を示した、すなわち、カラムから５分未満で溶出した（表７を参照のこと）。低疎水性は、製造の間、安定性を補助する（すなわち、凝集を低減する）。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿アッセイを使用する溶解度測定
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿アッセイを使用して、ヒト化抗体５８１１ｇＬ１４ｇＨ４、５８１１ｇＬ８ｇＨ４及び５８１１ｇＬ５ｇＨ４のコロイド安定性を解析した。ＰＥＧを使用して、ＰＥＧの濃度（ｗ／ｖ）を増大すること及び溶液中に残存するタンパク質の量を測定することによって量的に定義可能な方法でタンパク質溶解度を低減した。このアッセイは、従来の濃度法を使用せずに高濃度溶解度の効果を模倣するように働いた。
ヒト化抗体５８１１ｇＬ１４ｇＨ４、５８１１ｇＬ８ｇＨ４及び５８１１ｇＬ５ｇＨ４のＰＥＧ誘導性沈殿をＰＢＳ ｐＨ７．４及び５０ｍＭ酢酸ナトリウム／１２５ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ５．０中、７～１８％ ＰＥＧ－３３５０の存在下で調べた。抗体サンプルを、透析を使用してバッファー交換し、濃度を２ｍｇ／ｍＬに調整した。非平衡沈殿を最小にするために、サンプル調製は、２×タンパク質及び２×ＰＥＧ溶液を１：１容量比で混合することからなるものとした。混合後、非平衡凝集を再溶解するために、サンプルを３７℃で３０分間インキュベートした。２０℃で一晩インキュベートした後、サンプルを６０分間遠心分離した（４０００ｇ）。上清のアリコートを半容量の９６ウェル光学プレートに移し、プレートリーダーＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ ＦＬＵＯｓｔａｒ（登録商標）Ｏｍｅｇａ ＬＶＩＳ Ａ２８０を使用して２８０ｎｍでの吸光度を測定した。濃度データを、ＰＥＧ％に対してプロットし、算出された中点（ＬｏｇＥＣ５０）、（非線形回帰曲線フィットから作製した、可変傾斜）を、サンプルの相対コロイド溶解度の尺度として得た。このアッセイでは、ＬｏｇＥＣ５０が高いほど、大きいコロイド安定性と一致する。
表８に示されるように、３種の異なる抗体間でコロイド安定性に相違は観察されなかった。より大きいコロイド安定性は、より大きなｌｏｇＥＣ５０値によって示されるように酢酸ｐＨ５バッファーにおいて観察された。
空気－液体界面でのストレスの効果（凝集アッセイ）
このアッセイは、製造（例えば、限外濾過）の際に抗体が付されるであろうストレスを模倣するように働く。抗体などのタンパク質は、空気－液体界面に曝露されるとアンフォールディングする傾向があり、疎水性表面が疎水性環境（空気）に、親水性表面が親水性環境（水）に提示される。タンパク質溶液を撹拌すると、凝集を駆動し得る大きな空気－液体界面が得られる。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｆｏｒｔ（商標）を使用してボルテックス処理することによって、ＰＢＳ ｐＨ７．４及び５０ｍＭ酢酸ナトリウム／１２５ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ５．０中のヒト化抗体５８１１ｇＬ１４ｇＨ４、５８１１ｇＬ８ｇＨ４及び５８１１ｇＬ５ｇＨ４のサンプルにストレスをかけた。ボルテックス処理の前に、Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ（登録商標）５０－Ｂｉｏ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用して得た、適当な吸光係数（１．４１Ａｂｓ ２８０ｎｍ、１ｍｇ／ｍＬ、１ｃｍ光路長）並びに２８０ｎｍ、３４０ｎｍ及び５９５ｎｍでの吸光度を使用して、濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整し、ゼロ時間読み取りを確立した。各サンプルを１．５ｍＬのコニカルＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）スタイルキャップ付きチューブ中にアリコートし（４×２５０μＬ）、２５℃、１４００ｒｐｍで最大２４時間のボルテックス処理によって頑強性を試験するためのストリンジェントな条件に付した。Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ（商標）５０－Ｂｉｏ分光光度計を使用する５９５ｎｍでの、ボルテックス処理の２４時間後でのサンプルの測定によって時間依存性凝集（濁度）をモニタリングした。各サンプルについて時間に対して平均吸光度値をプロットした。
抗体分子５８１１ｇＬ５ｇＨ４は、５８１１ｇＬ１４ｇＨ４及び５８１１ｇＬ８ｇＨ４と比較してより大きな凝集安定性を示した。すべての抗体は、ＰＢＳ ｐＨ７．４でより大きな凝集安定性を示した。
化学安定性－脱アミド化ストレス研究
３種の抗体：５８１１ｇＬ５ｇＨ４、５８１１ｇＬ８ｇＨ４及び５８１１ｇＬ１４ｇＨ４のすべてを使用して加速化ストレス研究を実施して、１つの同定された潜在的部位：ＣＤＲ３の軽鎖中のＡｓｎ（９３）の脱アミド化傾向を調べ、５８１１ｇＬ１４ｇＨ４は、Ａｓｎ（９３）Ａｌａモチーフを有し、５８１１ｇＬ８ｇＨ４及びｇＬ５ｇＨ４は両方ともＡｓｎ（９３）Ｇｌｙモチーフを有する。
３種の抗体を、Ａｓｎ（Ｎ）残基の脱アミド化に好都合であるとわかっている条件（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１２５ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ８．０／３７℃）に付した。さらに、ストレスをかける前に基礎脱アミド化を評価するために、サンプルを、対照条件として５０ｍＭ酢酸ナトリウム／１２５ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ５．０においても調製した。バッファー各々におけるサンプルの最終濃度を約５ｍｇ／ｍＬに調整し、次いで、２つのアリコートにわけ、一方を４℃で保存し、一方を最大５週間３７℃とした。アリコートを直ちに（Ｔ０）並びに２週及び５週で取り出し、－２０℃で保存した。
残基Ａｓｎ（９３）での基礎脱アミド化を、ストレスを受けていないサンプルで測定し（５０ｍＭ酢酸ナトリウム／１２５ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ５／４℃）、対象の配列を含有するトリプシンペプチドを作製することによって２週間／ｐＨ８／３７℃ストレスをかけたサンプルを使用してＡｓｎ（９３）の脱アミド化傾向を得た。手短には、８０μｇの各サンプルをＤＴＴを用いて還元し、塩酸グアニジンを用いて３７℃で変性させた。次いで、サンプルをヨードアセトアミドを用いて室温でアルキル化し、その後、７．５ｍＭ Ｔｒｉｓ／１．５ｍＭ ＣａＣｌ２ ｐＨ７．９にバッファー交換し（Ｚｅｂａ（商標）７ｋＤａ ＭＷＣＯスピンカラム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、トリプシン（１：２３ｗ／ｗ）とともに３７℃でおよそ３時間インキュベートした。トリフルオロ酢酸を０．１％ ｖ／ｖまで添加することによってタンパク質分解を停止し、サンプルを－２０℃で保存した。解凍すると、サンプルを遠心分離して、沈殿物を除去した。
得られたペプチドを分離し、正イオン、データ依存性ｏｒｂｉｔｒａｐ－ｏｒｂｉｔｒａｐ法を衝突活性化解離法（ＣＩＤ）フラグメンテーションを用いて実行するＴｈｅｒｍｏ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）質量分析計に接続されたＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｃ１８カラムで解析した。ＬＣ－ＭＳ及びＭＳ２データは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｘｃａｌｉｂｕｒ（商標）及びＰｅｐｆｉｎｄｅｒ（商標）ソフトウェアを使用して解析した。対象のペプチド（ＬＣ Ｎ９３－Ｋ１０２）を分析して、化学修飾のパーセンテージを評価した。
ペプチドマッピング質量分析は、基礎Ａｓｎ（９３）脱アミド化レベルは、５８１１ｇＬ８ｇＨ４及び５８１１ｇＬ５ｇＨ４と比較して５８１１ｇＬ１４ｇＨ４について低かったことを示した。脱アミド化傾向の予測は困難であるが、Ａｓｎ（Ｎ）残基と、それに続くＧｌｙ（Ｇ）残基は、嵩高いＡｌａ（Ａ）残基が続くものよりも、脱アミド化するより大きな傾向を示すことがわかっていたので、分子間の相違は予期しないものではなかった（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｎ．Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００１年、第９８巻、４３６７～４３７２頁）。
３種の抗体すべてについて、Ａｓｎ（９３）で低率の脱アミド化が観察された、すなわち、週あたり１．２％～１．４％。５８１１ｇＬ５ｇＨ４及び５８１１ｇＬ８ｇＨ４の軽鎖Ｎ９３－Ｋ１０２ペプチドの質量差は、－１７Ｄａ修飾（おそらくは、中間スクシンイミド種）及び＋１Ｄａ（Ａｓｎ（９３）での完全脱アミド化生成物）を含んでいたが、５８１１ｇＬ１４ｇＨ４についてスクシンイミドは観察されなかった（表９）。
全体的な脱アミド化率は、すべての抗体について低かったが、５８１１ｇＬ５ｇＨ４及び５８１１ｇＬ８ｇＨ４について、より多い不均一性が観察された。
（例７）
細胞ベースの凝集アッセイ
ＨＥＫ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（懸濁液細胞）を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））中、０．７×１０６個細胞／ｍｌで調製し、３００×１０６個細胞／ｍｌに培養した。トランスフェクションを製造業者の説明書に従って実施し、手短には、６００μｇの、アルファ－シヌクレイン遺伝子を組み込むｐｃＤＮＡ３．１（＋）を、２０ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地中に混合し、一方で、２９３ＦｅｃｔｉｎをＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））で希釈し、室温で５分間インキュベートした。希釈したＤＮＡを添加し、室温で２０分間インキュベートし、その後、細胞に１滴ずつ滴下した（フラスコ当たり２０ｍｌ）。細胞を３７℃、１２５ｒｐｍ、８％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。細胞を直ちに使用するか、又はＦＢＳ＋１０％ ＤＭＳＯ中５００万個細胞／ｍｌの濃度で凍結した。
細胞がこれまでに凍結されていた場合には、クライオバイアルを解凍し、細胞をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地に再懸濁し、５００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））に、２×１０６個細胞／ｍｌで再懸濁した。３８４ウェルプレート（Ｇｒａｉｎｅｒ（商標））では、２０μｌの細胞懸濁液を添加した（合計約４０，０００個細胞／ウェルに）。各ウェルに、１５０ｎＭのヒトアルファ－シヌクレイン繊維（例１において本明細書に記載されたとおりに調製した）を、続いて、試験されるべきＰＢＳ中の抗体５８１１ｇＬ５ｇＨ４ ＩｇＧ４Ｐ、５８１１ ｇＬ８ｇＨ４ ＩｇＧ４Ｐ及び５８１１ ｇＬ１４ｇＨ４ ＩｇＧ４Ｐ（表１中の配列）（種々の濃度の）を添加した。プレートを細胞培養インキュベーター中、３７℃、５％ ＣＯ２、９５％湿度で２日間インキュベートした。
２日目の最後に、すべてのウェルから培地を吸引し、プレートを洗浄し、ウェル当たり２０μｌを残した。各ウェルに約５０μｌのＰＢＳを添加し、プレートを５００ｇで５分間遠心分離した。プレートウォッシャーを用いてすべてのウェルから上清を吸引し、各ウェルに２０μｌの培地を残した。ヴェルセン（Ｌｏｎｚａ（商標））を添加し（５０μｌ／ウェル）、プレートを５００ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引し、ウェル当たり２０μｌの培地のみを残した。各ウェルに、２０μｌの、ＰＢＳ中、８％ホルムアルデヒド（水中、１６％溶液、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））＋２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＶＷＲ（商標））を補給した。プレートを室温で１５分間インキュベートし、その後、５０μｌの、ＨＢＳＳ（カルシウム－マグネシウム不含ＶＷＲ（商標））＋２％ ＦＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））からなるＦＡＣＳバッファーを添加した。プレートを２０００ｇで１分間遠心分離し、上清を吸引し、各ウェルにおいて２０μｌのみの培地を残した。各ウェルに、２０μｌの、１：３００希釈した抗ｐＳｅｒ１２９アルファ－シヌクレイン 抗体（ＡｂＣａｍ（商標））を有するＦＡＣＳバッファーをさらに補給した。プレートを室温で１時間インキュベートし、次いで、各ウェルに、５０μｌのＦＡＣＳバッファーを補給し、その後、再度、２０００ｇで１分間遠心分離した。上清を除去し、その後、各ウェルに、１：５００希釈したＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７コンジュゲート型抗ウサギ二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））及びＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））を補給した。プレートを暗所、室温で１時間インキュベートし、次いで、５０μｌのＦＡＣＳバッファーを添加し、プレートを２０００ｇで１分間遠心分離した。洗浄の際、より多くのＦＡＣＳバッファーを添加し、プレートを、読取りのためにフローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ）中に設置されるように準備した。
ＦＡＣＳデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。最初に、生存単細胞が、前方及び側方散乱を使用してゲートされた。第２に、ＤＡＰＩ＋事象がゲート開閉され、その数を生存有核単細胞数の尺度として使用した。最後に、ホスホセリン１２９－アルファ－シヌクレイン陽性（ｐＳｅｒ１２９＋）細胞がゲートされた。すべてのＤＡＰＩ＋細胞に対するｐＳｅｒ１２９＋細胞のパーセンテージを、凝集の尺度として使用した。データを、繊維のみ抗体なしを用いて処置したウェルに対して正規化し、パーセンテージとして表した。結果は図１０にまとめられており、試験された抗体の、アルファシヌクレインを発現する細胞でアルファシヌクレイン繊維によって誘導される凝集を阻害する能力を示す。これらのデータによって、本発明による抗体は、アルファ－シヌクレイン繊維によって誘導される凝集を遮断でき、約５ｎＭ以下のＩＣ５０を有することが確認される。
（例８）
一次ニューロン凝集アッセイ
Ｅ１７マウス胚から得た海馬を、解剖バッファー（カルシウムを含まない、マグネシウムを含まないＨＢＳＳ、０．６％ Ｄ－（＋）－グルコース、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ）中で解剖した。次いで、解剖バッファーを除去し、解離溶液（カルシウムを含まない、マグネシウムを含まないＨＢＳＳ、０．６ ％Ｄ－（＋）－グルコース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０Ｕ／ｍパパイン、１ｍｇ／ｍｌ ＤＮアーゼ、１ｍＭ Ｌ－システイン、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）によって置き換えた。３７℃で３０分インキュベートした後、解離バッファーを除去し、海馬を、プレーティング培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地、２％ Ｂ２７上清、１ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、２．５％ ＦＢＳ、５０ユニット／ｍｌペニシリン－ストレプトマイシン）で３回洗浄した。組織凝集塊を１ｍｌピペットを用いてトリチュレートして、単細胞懸濁液を得た。細胞をプレーティング培地で適当な濃度に希釈した。ＰＤＬコーティング３８４ウェルプレートの各ウェルにおいて約１５０００個細胞をプレーティングした。次いで、３７℃、５％ ＣＯ２、９５％湿度で細胞培養インキュベーター中で細胞を維持した。
翌日、培地の８０％を、ＦＢＳ［Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地、２％ Ｂ２７上清、１ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、５０ユニット／ｍｌのペニシリン－ストレプトマイシン）を含まないプレーティング培地で置き換えた。プレーティングの７日後、培地を除去し、各ウェルに２０μｌのみを残した。各ウェルに、１００ｎＭのヒトアルファ－シヌクレイン繊維（例１において本明細書に記載されたとおりに調製された）を、続いて、試験されるべきＰＢＳ中の抗体５８１１ｇＬ５ｇＨ４ ＩｇＧ４Ｐ、５８１１ ｇＬ８ｇＨ４ ＩｇＧ４Ｐ及び５８１１ ｇＬ１４ｇＨ４ ＩｇＧ４Ｐ（表１中の配列）（種々の濃度の）を添加した。プレートを、細胞培養インキュベーター中、３７℃、５％ ＣＯ２、９５％湿度でさらに７日間インキュベートした。プレーティングの１４日後、すべてのウェルから培地を吸引し、ウェル当たり２０μｌを残した。各ウェルを８０μｌのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）を用いて洗浄した。ＤＰＢＳを除去し、細胞を、ウェル当たり４０μｌの固定バッファー（４％パラホルムアルデヒドを有するＤＰＢＳ）中で１５分間インキュベートした。次いで、固定バッファーを除去し、細胞を８０μｌのＤＰＢＳを用いて再度洗浄した。ＤＰＢＳを除去し、ウェル当たり４０μｌの透過処理バッファー（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を有するＤＰＢＳ）によって置き換えた。１０分後、過処理バッファーを除去し、細胞をウェル当たり４０μｌのブロッキングバッファー（１％ ＢＳＡ及び０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を有するＰＢＳ）中で１時間インキュベートした。次いで、ブロッキングバッファーを除去し、４０μｌ／ウェルの一次抗体溶液（０．３％ウサギ抗ホスホセリン１２９アルファ－シヌクレイン抗体（ＡｂＣａｍ（商標）ａｂ５１２５３を有するブロッキングッファー）によって置き換えた。抗体溶液を細胞上で１時間インキュベートし、３回の洗浄（９０μｌ／各、ＰＢＳ）を続けた。最後の洗浄後、ＰＢＳを除去し、４０μｌの二次抗体溶液（０．２％ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲート型抗ベータＩＩＩ－チュブリン抗体を有するＰＢＳ中、０．１％ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７コンジュゲート型抗ウサギ抗体）によって置き換えた。二次抗体溶液を、細胞上で１時間インキュベートし、次いで、除去し、４０μｌの、０．３％ ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｂｌｕｅ（商標）を含むＰＢＳに従って置き換えた。インキュベーションの５分後、ウェルを８０μμｌのＰＢＳを用いて３回洗浄し、次いで、ウェル当たり５０μｌのＰＢＳを充填し、その後プレートをプラスチックフィルムで密閉した。
Ａｒｒａｙｓｃａｎプレートイメージャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））でプレートを画像化した。画像を同一製造業者製のＨＣＳ Ｓｃａｎ（商標）ソフトウェアを使用して解析した。ベータ－ＩＩＩ－チュブリンシグナルを使用してニューロン密度をモニタリングした。ベータ－ＩＩＩ－チュブリンシグナルの表面における有意な低下によって反映される、低密度フィールド又は損傷したニューロン細胞層を示すフィールドを排除した。最後に、フィールド当たりのｐＳｅｒ１２９アルファシヌクレインシグナルの表面を使用して、病理学的アルファ－シヌクレイン凝集を定量化した。
アルファシヌクレインのＳ１２９でのリン酸化は、アルファシヌクレイン正常機能の制御並びにその凝集の調節、ＬＢ形成及び神経毒性において重要な役割を果たすと考えられる。正常状態下では、アルファシヌクレインの小画分のみが、脳においてＳ１２９で構成的にリン酸化されている（Ｆｕｊｉｗａｒａ Ｈら（２００２年）Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、第４巻、１６０～１６４頁）が、シヌクレイノパチーを患っている患者の脳においてｐＳ１２９の著しい蓄積が観察されている（Ｋａｈｌｅ ＰＪら（２０００年）Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、９２０巻、３３～４１頁）；Ｏｋｏｃｈｉ Ｍら（２０００年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、第２７５巻、３９０～３９７頁）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＪＰら（２００６年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、第２８１巻、２９７３９～２９７５２頁）。
データをウェルに繊維のみを用いて処置されたウェルと抗体を用いなかったものに対して正規化し、パーセンテージとして表した。図１１に示されるように、３種の抗体すべてが、内因性レベルのアルファシヌクレインを発現するマウス一次ニューロンでアルファシヌクレイン繊維によって誘導されるアルファシヌクレイン凝集を阻害した。これらのデータによって、５８１１ｇＬ５ｇＨ４ ＩｇＧ４Ｐ、５８１１ ｇＬ８ｇＨ４ ＩｇＧ４Ｐ及び５８１１ ｇＬ１４ｇＨ４ ＩｇＧ４Ｐ抗体が、マウス一次ニューロンでアルファシヌクレイン繊維によって誘導される凝集を遮断でき、５ｎＭ未満のＩＣ５０を有していたことが確認される。
（例９）
ｉｎ ｖｉｖｏでのＶＲ５８１１有効性の評価
抗体５８１１ｇＬ５ｇＨ４ ＩｇＧ４Ｐ（配列番号１４及び配列番号２６を含み、本明細書において以下、簡単にＶＲ５８１１と呼ばれる）を、ヒトアルファシヌクレインを発現するα－シヌクレインノックアウトマウスのトランスジェニックモデルにおいて（以下ＳＮＣＡ－ＯＶＸと名付ける；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、フランス）試験した。
ＳＮＣＡ－ＯＶＸマウスに、ＶＲ５８１１及びマウス事前形成繊維（ＰＦＦ）（本明細書の例１に記載されたように調製された）を用いて注射した。陰性対照抗体及びビヒクルも、最後の９個のＣ末端残基でアルファシヌクレインと結合する対照薬抗アルファシヌクレイン抗体（対照薬Ｃ末端Ａｂ）とともに注射した。このような対照薬抗体（本発明による抗体とは異なるＣＤＲを有する）は、本発明の抗体に対して匹敵する結合特徴を示した。対照薬Ｃ末端Ａｂ抗体は、アルファシヌクレインに対して本発明の抗体と類似の親和性及び同様の生物物理学的特性を有する。細胞ベースアッセイでのアルファシヌクレイン凝集の防止においても有効であった（表１０）。
抗体を、室温にてシェーカーでＰＦＦとともに３０分間プレインキュベートし、その後、動物の脳に直接投与した。抗体／ＰＦＦ混合物をＰＢＳ中、１μｇのＰＦＦ／１０μｇの抗体の比で調製した。ビヒクル溶液としてｐＨ７．４のＰＢＳを使用した。抗体を、併用大脳内投与の２４時間前に注射した。
次いで、抗体を３０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに腹膜内投与した。第１のものの７日後に、第２の腹膜内注射を与え、次いで、同一レジメン（１０ｍｌ／ｋｇの投与容量について、３０ｍｇ／ｋｇの用量で１回の腹膜内注射）を用い、ＳＮＣＡ－ＯＶＸマウスについて１１週間、合計１２回の注射で追跡した。両実験について、マウスは、薬物処置群に無作為に割り当て、実験者は処置に対して目隠しされていた。
動物実験を欧州指令２０１０／６３／ＥＵ及びベルギーの法律のガイドラインに従って実施した。ＵＣＢ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ ＳＰＲＬの動物実験倫理委員会（ＬＡ１２２００４０及びＬＡ２２２０３６３）は、実験プロトコール（ＡＳＹＮ－ＩＣ－ＰＡＲＫＩＮＳＯＮ－ＭＯ）を承認した。２５から３０ｇの間で体重のマウスは、手術の時点で１７週齢であった。マウスをケージ中に収容した（ケージ当たり４匹のマウス、Ｍａｃｒｏｌｏｎ２型）。それらを１２：１２明／暗周期、０６：００時に点灯で維持した。温度は、２０～２１℃で維持し、湿度は、およそ４０％のものとした。すべての動物は、実験群への割り当て前は標準ペレットフード及び水を自由に利用した。手術の前後に、さらに豊かにすること及び福祉を提供した（Ｅｎｖｉｒｏ－ｄｒｉ、Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖ）。動物の健康は、動物ケアスタッフによって毎日モニタリングされた。苦痛を最小にするためのすべての努力が行われた。屠殺は麻酔下で実施した。
手術は、腹膜内注射された５０ｍｇ／ｋｇのケタミン（Ｎｉｍａｔｅｋ、Ｅｕｒｏｖｅｔ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｂ．Ｖ．）及び０．５ｍｇ／ｋｇのメデトミジン（Ｄｏｍｉｔｏｒ、Ｏｒｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の混合物を使用して全身麻酔下で実施した。さらに、覚醒状態を支持するために２．５ｍｇ／ｋｇのアチパメゾール（Ａｎｔｉｓｅｄａｎ、Ｏｒｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を与えた。組換え精製ＰＦＦを解凍し、室温で超音波処理した（Ｑｓｏｎｉｃａ ５００－２０ｋＨｚ；６５％出力、１分間で１秒のＯＮ、１秒のＯＦＦの３０パルスの間）。次いで、ＰＦＦを抗体と３０分間事前混合し、室温で３０分間振盪し、その後、脳注射した。溶液（２μｌ）を０．２μｌ／分の速度で注入し、ニードルをさらなる２．５分間そのまま残し、その後、ゆっくりと後退した。注射は、右線条体において以下の座標で片側性で実施した：ＡＰ＝＋０．２０ｍｍ、ＭＬ＝－２．００ｍｍ、ＤＶ＝－３．２０ｍｍ。
麻酔後、マウスに、１０Ｕ／ｍｌヘパリンを含有する氷冷０．９％ＰＢＳを９分間、左心室を介して６ｍｌ／分の流速で経心臓灌流によって灌流した。右心房は流出経路として切断した。続いて、動物に、６ｍｌ／分の流速で、ＰＢＳ中氷冷４％パラホルムアルデヒドを用いて１５分間灌流した。脳を４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中、４℃で一晩、後固定した（０日目）。翌朝（＋１日目）、４％パラホルムアルデヒドを廃棄し、脳を冷ＰＢＳで洗浄し、一晩インキュベートした。翌日（＋２日目）脳をＰＢＳで最小１時間洗浄し、１５％スクロースを含有するＰＢＳに移し、出荷まで４℃で保存した。
脳切片作製は、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ＴＮ、米国）で実施した。第１に、凍結アーチファクトを防止するために、脳を２０％グリセロール及び２％ジメチルスルホキシドを用いて一晩処置し、ＭｕｌｔｉＢｒａｉｎ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用してゼラチンマトリックス中に包埋した。硬化後、砕いたドライアイスで－７０℃に冷却したイソペンタン中に浸漬することによって、ブロックを急速凍結し、ＡＯ８６０スライディングミクロトームの凍結ステージに載せた。ＭｕｌｔｉＢｒａｉｎ（登録商標）ブロックを、冠状面で４０μｍで切片作製した。すべての切片をブロック当たり２４容器中に逐次集め、これを抗原保存溶液（４９％ ＰＢＳ ｐＨ７．０、５０％エチレングリコール、１％ポリビニルピロリドン）で満たした。直ちに染色されない切片は、－２０℃で保存した。
自由浮遊切片は、ｐＳｅｒ１２９アルファシヌクレイン抗体（マウス抗アルファシヌクレイン（ｐＳｅｒ１２９）ビオチン－（Ｗａｋｏ－０１０－２６４８１））を用いて免疫化学によって染色し、１：３０，０００で希釈した。ブロッキング血清以降のすべてのインキュベーション溶液は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００をビヒクルとして有する Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を使用し、すべてのすすぎは、ＴＢＳを用いた。内因性ペルオキシダーゼ活性は、０．９％過酸化水素処置によってブロックし、非特異的結合は、１．２６％の全正常血清を用いてブロックした。すすぎ後、切片を一次抗体を用いて室温で一晩染色した。ビヒクル溶液は、透過処理のために０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有していた。すすぎ後、切片をアビジン－ビオチン－ＨＲＰ複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、ＣＡ）とともに室温で１時間インキュベートした。すすぎ後、切片をアビジン－ビオチン－ＨＲＰ複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州、バーリンゲーム）とともに室温で１時間インキュベートした。すすぎ後、切片をジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）及び０．００１５％過酸化水素を用いて処置して、可視反応生成物を作出し、ゼラチン化（下塗り）ガラススライド上に載せ、風乾し、チオニンを用いて軽度に染色し、アルコール中で脱水し、キシレン中で透明化し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔを用いてカバーした。
フィールドｐＳｅｒ１２９アルファシヌクレインシグナル当たりのｐＳｅｒ１２９アルファシヌクレインシグナルの定量化を使用して、線条体、皮質、扁桃体基底外側部及び黒質の同側の病理学的アルファシヌクレイン凝集を定量した。対象の領域（ＲＯＩ）を手動で描き、種々の脳領域におけるｐＳｅｒ１２９アルファシヌクレインシグナルの自動定量化をＶｉｓｉｏＰｈａｒｍ６ソフトウェア（ＶｉｓｉｏＰｈａｒｍ）を用いて実施した。ｐＳｅｒ１２９アルファシヌクレインシグナルを定量するために、シグナル面積の値（μｍ２でのマーカー面積）を提供する線形Ｂａｙｅｓｉａｎアルゴリズムを使用した。マーカー面積は、種々の脳領域をカバーするｐＳｅｒ１２９アルファシヌクレイノパチー病理の量を反映する。すべての定量化は、統計解析の最後まで盲検的に実施した。
データ解析は、マーカー面積％で（すなわち、μｍ２でのｐＳｅｒ１２９シグナル面積とμｍ２での対象の領域面積の間の比）で行った。マーカー面積％は、体軸方向に位置する複数の脳切片について反復して評価し（線条体：１３～１４切片ブレグマ＋１．１～－０．９４；皮質：１３～１４切片＋１．１～－０．９４；扁桃体基底外側部：６～１０切片－０．５８～－２．０６；黒質：６～８切片－２．５４～－３．８８）、ＡＵＣを試験した対象毎に別個に算出した。
統計解析のために一元配置分散分析を考慮した。分散分析に続いて、多重度を調整せずに、平均間の複数のペアワイズ比較を行った（ｐ＜０．０１のために＊＊を用い、ｐ＜０．０５のために＊を用いた）。データは、正規性と等分散性の基準を満たすように対数変換した。グラフは、変換されていないデータの幾何平均を表す。
図１２に示されるように、ＶＲ５８１１抗体は、ＳＮＣＡ－ＯＶＸマウスへのＰＦＦ投与の３カ月後に線条体、大脳皮質、扁桃体及び黒質を含む異なる脳領域において、アルファシヌクレイノパチー病理（すなわち、ｐＳｅｒ１２９アルファシヌクレインシグナル）を著しく減少させた。
陰性対照抗体及び対照薬Ｃ末端抗体は、同一ヒトＰＦＦを注射されたビヒクル処置マウスと比較して、アルファシヌクレイノパチー病理（ｐＳｅｒ１２９アルファシヌクレインシグナル）の低下において効果を示さなかった。
図１３は、ＳＮＣＡ－ＯＶＸマウスの解析された脳領域各々における、Ｓｅｒ１２９でリン酸化されたアルファシヌクレインの定量化を示す。結果から、ＶＲ５８１１は、３種の対照群（すなわち、ビヒクル、１０１．４及び対照薬Ｃ末端Ａｂ）と比較して、同側の線条体、大脳皮質及び黒質を含む異なる脳領域においてアルファシヌクレイノパチー病理を有意に（ｐ＜０．０５）低減することが確認される。
結果として、ＳＮＣＡ－ＯＶＸマウスにおいて試験された場合、５８１１を用いて処置した群は、３つの異なる構造において有意に低減したレベルのｐＳｅｒ１２９ α－シヌクレインを示し、それらの中で、２つは注射部位から遠位領域であった（大脳皮質及び黒質）。
これから、本発明の構造的特徴を含む抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで、Ｓｅｒ１２９でリン酸化されたアルファシヌクレインの出現を予防可能であるということが確認される。さらに、結果は、Ｃ末端領域でａ－ｓｙｎと結合する抗体のすべてが、ｉｎ ｖｉｖｏで効果的であるわけではない：ａ－ｓｙｎのＣ末端と高親和性で結合し、細胞ベースアッセイにおいてａ－ｓｙｎ凝集の防止において有効である対照薬抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏでＳｅｒ１２９リン酸化を防止できなかったことを実証する。
したがって、本発明による抗体又はその抗原結合断片は、パーキンソン病（ＰＤ）（パーキンソン病の特発性及び遺伝性形態を含む）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病のレビー小体異型（ＬＢＶＡＤ）、アルツハイマー病及びパーキンソン病の合併、多系統萎縮症（ＭＳＡ）及び脳内鉄沈着を伴う神経変性１型（ＮＢＩＡ－１）を含む、Ｓｅｒ１２９リン酸化の増大を特徴とするアルファシヌクレイノパチーの処置のために使用され得る。
（例１０）
マウスにおける抗体５８１１の薬物動態
雄Ｃ５７／Ｂｌ６マウス（薬物あたりｎ＝３）に、抗体５８１１ｇＬ１４ｇＨ４ ＩｇＧ４Ｐ（５８１１）を用いて２ｍｇ／ｋｇの単回用量として静脈内注射した。
血液サンプルを（注射から０．０８３、１、４、８、２４、７２、１２０、１６８及び３３６時間）で尾静脈から採取し、室温で凝血させた。遠心分離後血清を単離し、次いで、これを解析まで凍結した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって５８１１抗体の定量化を実施した。研究から得た血清サンプルを解凍し、種々の濃度で対照マウス血清に添加された５８１１抗体を使用して準備された較正線に対して定量化した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムにサンプルを注射する前に、血清を変性させ、還元し、それぞれアセトニトリル（ＶＷＲ、英国）、ＴＣＥＰ－Ｔｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（Ｓｉｇｍａ、英国）及びロドアセトアミド（Ｓｉｇｍａ、英国）を使用してアルキル化した。次いで、アルキル化サンプルを１００ｍＭ重炭酸アンモニウムバッファー（Ｓｉｇｍａ、英国）で再構成し、３７℃でトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、英国）酵素を使用して一晩消化した。サンプルにギ酸を添加して、ｐＨを低下させることによって消化を停止し、次いで、Ｗａｔｅｒｓ ＨＬＢ ＳＰＥプレートを使用して脱塩した。得られた溶出剤を、真空エバポレーターを使用して蒸発させた。サンプルを完全に乾燥させた後、それらを０．１％ギ酸を含有する９５／５：水／アセトニトリルを用いて再構成し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析は、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＱＴｒａｐ ６５００トリプル四重極質量分析計に接続されたＳｃｈｉｍａｄｚｕプロミネンスＨＰＬＣシステムによって実施した。消化サンプルを、オートサンプラーによって、５０℃で維持された逆相高性能液体クロマトグラフィーカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ａｅｒｉｓ Ｃ１８ペプチドカラム１００Ｘ２．１ｍｍ、２．６μｍ）上に注入した。０．６ｍｌ／分の流速で、０．１％ギ酸中、５～７０％アセトニトリルの直線勾配を６分間適用し、次いで、０．１％ギ酸中、９５％アセトニトリルに０．８分かけて傾斜をつけた。質量分析計を、５８１１のペプチドの複数遷移を、遷移当たり５０ミリ秒の滞留時間で検出するために複数反応モニタリング解析を実行するように設定した。データ解析を、Ａｎａｌｙｓｔ１．６ソフトウェアバージョンを使用して実施した。
これらのデータは、抗体５８１１が、測定された低いクリアランス値に基づいて、マウスにおいて極めて良好な薬物動態特性（表１１及び図１４）を有することを実証する。これらは、マウスに投薬されるヒトＩｇＧ薬物について取り上げられる通常の範囲より優れていると思われる（３～１６ｍｌ／日／ｋｇ；Ｄｅｎｇら２０１１年 ｍａｂｓ 第３巻：１ ６１～６６頁）。

Claims (24)

  1. アルファシヌクレインと結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
    該抗体又はその断片が、
    ａ．配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域、並びに
    ｂ．配列番号４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域
    を含む、抗体又はその抗原結合断片。
  2. 配列番号３における位置６のアミノ酸残基グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）が、アラニン（Ａｌａ；Ａ）によって置き換えられる、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  3. 配列番号８における位置１１３から１２９の間のアルファシヌクレインの２個以上のアミノ酸残基と結合し、配列番号８における少なくともアミノ酸残基Ｄ１１９、Ｎ１２２及びＹ１２５と結合する、請求項１又は請求項２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  4. アルファシヌクレイン繊維によって誘導されるアルファシヌクレインの凝集を防止する、請求項１から３までのいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  5. モノマーとしてのアルファシヌクレイン、及び繊維状のアルファシヌクレインと結合することが可能である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  6. モノマーとしてのアルファシヌクレインと比較して、繊維状のアルファシヌクレインに対してより高い結合親和性を有する、請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗体であって、
    繊維状のアルファシヌクレインに対してよりも、モノマーアルファシヌクレインに対して少なくとも１０倍高い解離定数（ＫＤ）を特徴とする、抗体。
  7. ６０ｐＭ以下の繊維状のアルファシヌクレインに対する解離定数（ＫＤ）を有する、請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗体。
  8. 前記抗体が、キメラ又はヒト化抗体である、請求項１から７までのいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  9. ＩｇＧ１、ＩｇＧ４又はＩｇＧ４Ｐから選択される、請求項１から８までのいずれか一項に記載の抗体。
  10. 前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖから選択される、請求項１から５および８までのいずれか一項に記載の抗原結合断片。
  11. 前記抗体又はその断片が、
    ａ．配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号２５のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、又は
    ｂ．配列番号１７のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号２５のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、又は
    ｃ．配列番号２１のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号２５のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域
    を含む、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  12. 前記抗体が、
    ａ．配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号２６のアミノ酸配列からなる重鎖、又は
    ｂ．配列番号１８のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号２６のアミノ酸配列からなる重鎖、又は
    ｃ．配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号２６のアミノ酸配列からなる重鎖
    を含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載の抗体。
  13. 請求項１から１２までのいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする単離ポリヌクレオチド。
  14. ａ．軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドが、
    ｉ．配列番号１５、１９若しくは２３に対して少なくとも９０％同一である、若しくは
    ｉｉ．配列番号１５若しくは１９若しくは２３を含む、若しくは
    ｉｉｉ．配列番号１５、１９若しくは２３からなり、且つ
    ｂ．重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドが、
    ｉ．配列番号２７に対して少なくとも９０％同一である、
    ｉｉ．配列番号２７を含む、若しくは
    ｉｉｉ．配列番号２７からなり、あるいは
    ｃ．軽鎖をコードするポリヌクレオチドが、
    ｉ．配列番号１６、２０若しくは２４に対して少なくとも９０％同一である、若しくは
    ｉｉ．配列番号１６、２０若しくは２４を含む、若しくは
    ｉｉｉ．配列番号１６、２０若しくは２４からなり、且つ
    ｄ．重鎖をコードするポリヌクレオチドが、
    ｉ．配列番号２８に対して少なくとも９０％同一である、若しくは
    ｉｉ．配列番号２８を含む、若しくは
    ｉｉｉ．配列番号２８からなる、
    請求項１３に記載の単離ポリヌクレオチド。
  15. 請求項１３又は１４に記載の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むクローニング又は発現ベクター。
  16. ａ．請求項１３若しくは１４に記載の１つ若しくは複数のポリヌクレオチド、又は
    ｂ．請求項１５に記載の１つ若しくは複数の発現ベクター
    を含む、宿主細胞。
  17. 請求項１から１２までのいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の生産方法であって、請求項１６に記載の宿主細胞を、抗体又はその抗原結合断片を生産するのに適した条件下で培養すること及び抗体又はその抗原結合断片を単離することを含む、方法。
  18. 請求項１から１２までのいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と、１つ又は複数の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤とを含み、任意選択で、１つ又は複数のさらなる有効成分を含む、医薬組成物。
  19. 治療において使用するための、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. １つ又は複数のシヌクレイノパチーの処置において使用するための、請求項１８または１９に記載の医薬組成物。
  21. 前記シヌクレイノパチーが、パーキンソン病（ＰＤ）（パーキンソン病の特発性及び遺伝性形態を含む）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病のレビー小体異型（ＬＢＶＡＤ）、アルツハイマー病及びパーキンソン病の合併、多系統萎縮症（ＭＳＡ）及び脳内鉄沈着を伴う神経変性１型（ＮＢＩＡ－１）から選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 前記シヌクレイノパチーがパーキンソン病である、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. シヌクレイノパチーの診断において使用するための、請求項１８に記載の医薬組成物。
  24. パーキンソン病の診断において使用するための、請求項１８に記載の医薬組成物。
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