JP7338165B2

JP7338165B2 - 肝臓脂肪合成抑制用食品組成物

Info

Publication number: JP7338165B2
Application number: JP2019031375A
Authority: JP
Inventors: 啓井上; 久美木村; 伸彦橘
Original assignee: Fuji Oil Co Ltd (fka Fuji Oil Holdings Inc); Fuji Oil Co Ltd; Fuji Oil Holdings Inc
Current assignee: Fuji Oil Co Ltd (fka Fuji Oil Holdings Inc)
Priority date: 2019-02-25
Filing date: 2019-02-25
Publication date: 2023-09-05
Anticipated expiration: 2039-02-25
Also published as: JP2020130120A

Description

本発明は、肝臓脂肪合成抑制用食品組成物に関する。

脂肪肝は、糖尿病・心血管疾患との悪循環を引き起こすことが知られている。脂肪肝の誘因として、肝臓脂肪合成の増加が重要な役割を担っており、その制御機構として、脂肪合成酵素が知られている。
脂肪肝の予防及び改善には、肝臓における脂質の合成を抑制することや、脂質の代謝を亢進して蓄積を抑制することが有効である。

近年、種々の天然由来機能性成分の探索が進められており、脂質代謝に作用して肝臓における脂質量を低減させ得る成分についての報告がある。特許文献１および２では、大豆タンパク質または植物の発芽物の乾燥粉砕物が、血中の中性脂肪を低減させる作用を有することが開示されている。しかしながらこれらの文献では、肝臓における脂肪蓄積抑制作用については確認されていない。

また、植物性タンパクの摂取が脂肪合成酵素の発現抑制を介して、脂肪肝を改善する事、さらには、そのペプチド分解産物が肝細胞で脂肪合成酵素の発現抑制を起こすことが見出されている（非特許文献１）。

国際公開ＷＯ２００２／０２６２４３号特開２００６－６９９４３号公報

Watanabe H, Inaba Y, Kimura K, Asahara SI, Kido Y, Matsumoto M, Motoyama T, Tachibana N, Kaneko S, Kohno M, Inoue H. Dietary Mung Bean Protein Reduces Hepatic Steatosis, Fibrosis, and Inflammation in Male Mice with Diet-Induced, Nonalcoholic Fatty Liver Disease. J Nutr. 2017 Jan;147(1):52-60. doi: 10.3945/jn.116.231662.

従来技術では、肝臓脂肪合成抑制効果を示す成分は何ら開示されていない。
本発明は、肝臓脂肪合成抑制作用を有する成分を含む食品組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記の課題の解決に対し鋭意検討を重ねた結果、Ala-Gly、His-Asn、His-Ser、His-Thr、His-Trp、Val-Met、Trp-Glu、Trp-Lys、Tyr-Lys、Tyr-SerまたはTyr-Tyrから選択される１種または２種以上のジペプチドを有効成分として含有する、肝臓脂肪合成抑制用食品組成物を見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、
（１）Ala-Gly、His-Asn、His-Ser、His-Thr、His-Trp、Val-Met、Trp-Glu、Trp-Lys、Tyr-Lys、Tyr-SerまたはTyr-Tyrから選択される１種または２種以上のジペプチドを有効成分として含有する、肝臓脂肪合成抑制用食品組成物、
（２）Ala-Gly、His-Asn、His-Ser、His-Thr、His-Trp、Val-Met、Trp-Glu、Trp-Lys、Tyr-Lys、Tyr-SerまたはTyr-Tyrから選択される１種または２種以上のジペプチドを有効成分として含有する肝臓脂肪合成抑制剤、
である。

本発明により、肝臓脂肪合成抑制効果を示す11種類のジペプチドを有効成分とする食品組成物を提供することができる。

１次スクリーニングにおいて、Fasnレポーターマウスを作成する方法の参考図である。ジペプチドライブラリー（＃１～＃５０）のジペプチドの１次スクリーニングのガウシアルシフェラーゼの活性のブランクに対する相対活性値を測定した結果を示す図である。各サンプルの相対活性値を丸印で示し、黒丸はブランクに比して、有意に低値を示したサンプルを示す。ジペプチドライブラリー（＃５１～＃１００）のジペプチドの１次スクリーニングのガウシアルシフェラーゼの活性のブランクに対する相対活性値を測定した結果を示す図である。各サンプルの相対活性値を丸印で示し、黒丸はブランクに比して、有意に低値を示したサンプルを示す。ジペプチドライブラリー（＃１０１～＃１５０）のジペプチドの１次スクリーニングのガウシアルシフェラーゼの活性のブランクに対する相対活性値を測定した結果を示す図である。各サンプルの相対活性値を丸印で示し、黒丸はブランクに比して、有意に低値を示したサンプルを示す。ジペプチドライブラリー（＃１５１～＃２００）のジペプチドの１次スクリーニングのガウシアルシフェラーゼの活性のブランクに対する相対活性値を測定した結果を示す図である。各サンプルの相対活性値を丸印で示し、黒丸はブランクに比して、有意に低値を示したサンプルを示す。ジペプチドライブラリー（＃２０１～＃２５０）のジペプチドの１次スクリーニングのガウシアルシフェラーゼの活性のブランクに対する相対活性値を測定した結果を示す図である。各サンプルの相対活性値を丸印で示し、黒丸はブランクに比して、有意に低値を示したサンプルを示す。ジペプチドライブラリー（＃２５１～＃３００）のジペプチドの１次スクリーニングのガウシアルシフェラーゼの活性のブランクに対する相対活性値を測定した結果を示す図である。各サンプルの相対活性値を丸印で示し、黒丸はブランクに比して、有意に低値を示したサンプルを示す。ジペプチドライブラリー（＃３０１～＃３３６）のジペプチドの１次スクリーニングのガウシアルシフェラーゼの活性のブランクに対する相対活性値を測定した結果を示す図である。各サンプルの相対活性値を丸印で示し、黒丸はブランクに比して、有意に低値を示したサンプルを示す。２２個のジペプチドの２次スクリーニングのFasn遺伝子発現量を測定した結果を示す図である。黒色棒グラフは、ブランク(Vehと記載)に比して、有意にFasn遺伝子発現量が低下したサンプルを示す。１１個のジペプチドの３次スクリーニングのFasn遺伝子発現量を測定した結果を示す図である。黒色棒グラフは、ブランク(Vehと記載)に比して、有意にFasn遺伝子発現量が低下したサンプルを示す。１１個のジペプチドの３次スクリーニングのFasn遺伝子発現量を測定した結果を示す図である。黒色棒グラフは、ブランク(Vehと記載)に比して、有意にFasn遺伝子発現量が低下したサンプルを示す。

（肝臓脂肪合成抑制用食品組成物）
本発明の肝臓脂肪合成抑制用食品組成物は11種類のジペプチド（Ala-Gly、His-Asn、His-Ser、His-Thr、His-Trp、Val-Met、Trp-Glu、Trp-Lys、Tyr-Lys、Tyr-SerまたはTyr-Tyr）を有効成分として含有することを特徴とする。これらのジペプチドは肝臓脂肪合成抑制用食品組成物中に、１種含有していても良いし2種以上含有していても良い。

肝臓脂肪合成抑制作用を発揮するメカニズムとしては、本発明のジペプチドが、肝臓内でde novo合成される脂肪酸を合成する酵素である脂肪合成酵素（Fatty acid synthase、FAS）のmRNA（Fasn）の発現を抑制することにより、脂肪合成を抑制すると推定される。

なお、本発明のジペプチドを以下のように、アミノ酸の略号の記号を用いて表すことがある。
Ala-Gly：AG、His-Asn：HN、His-Ser：HS、His-Thr：HT、His-Trp：HW、Val-Met：VM、Trp-Glu：WE、Trp-Lys：WK、Tyr-Lys：YK、Tyr-Ser：YS、Tyr-Tyr：YY。

本発明のジペプチドは、アミノ酸から合成することもできるし、蛋白質を加水分解して得ることもできる。蛋白質を加水分解する手段として、プロテアーゼによる加水分解、酸による加水分解、アルカリによる加水分解等が挙げられ、プロテアーゼによる加水分解が好ましい。
ジペプチドの原料としては、植物性蛋白質、動物性蛋白質を用いることができ、例えば、植物性蛋白質の原料として、大豆、エンドウ、緑豆、ひよこ豆等の豆類、米、とうもろこし、小麦等の穀類、アーモンド、カシューナッツ、クルミ、ピスタチオ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ等のナッツ類等が挙げられ、動物性蛋白質の原料として、牛肉、豚肉、鶏肉、卵、乳などが挙げられる。

（プロテアーゼ）
プロテアーゼによる蛋白質加水分解の場合は上記蛋白質のスラリー又は水溶液を基質とし、プロテアーゼ処理を行う。ここで用いるプロテアーゼは動物起源，植物起源あるいは微生物起源は問わず、プロテアーゼの分類において「金属プロテアーゼ」、「酸性プロテアーゼ」、「チオールプロテアーゼ」、「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼ、好ましくは「金属プロテアーゼ」、「チオールプロテアーゼ」、「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼの中から適宜選択することができる。

このプロテアーゼの分類は、酵素科学の分野において通常行われている活性中心のアミノ酸の種類による分類方法である。各々の代表として「金属プロテアーゼ」にはBacillus中性プロテアーゼ，Streptomyces中性プロテアーゼ，Aspergillus中性プロテアーゼ，『サモアーゼ』等、「酸性プロテアーゼ」にはペプシン，Aspergillus酸性プロテアーゼ，『スミチュームAP』等、「チオールプロテアーゼ」にはブロメライン，パパイン等、「セリンプロテアーゼ」にはトリプシン，キモトリプシン，ズブチリシン，Streptomycesアルカリプロテアーゼ，『アルカラーゼ』，『ビオプラーゼ』等が挙げられる。これら以外の酵素でも作用pHや阻害剤との反応性により、その分類を確認することができる。活性中心が異なる酵素間では、基質への作用部位が大きく異なるため、「切れ残り」を減らし、効率よく酵素分解物を得ることができる。あるいは異なった起源の（起源生物）の酵素を併用することにより、更に効率良く酵素分解物を製造することができる。

プロテアーゼ処理の反応pHや反応温度は、用いるプロテアーゼの特性に合わせて設定すれば良く、通常反応pHは至適pH付近で行い、反応温度は至適温度付近で行えば良い。概ね反応温度は20～80℃、好ましくは40～60℃で反応を行うことができる。反応後は酵素を失活するのに十分な温度（60～170℃程度）で加熱し、残存酵素活性を失活させる。

プロテアーゼ処理後の反応液は、そのまま又は濃縮して用いることもできるが、通常、殺菌して噴霧乾燥、凍結乾燥等して乾燥粉末の状態で利用することができる。殺菌は、加熱殺菌が好ましく、加熱温度は110～170℃が好ましく、130～170℃が更に好ましい。加熱時間は3～20秒間が好ましい。また反応液を任意のpHに調整しておくこともでき、pH調整時に発生する沈殿物や懸濁物を遠心分離や濾過等により除去することもできる。また更に活性炭や吸着樹脂により精製することもできる。

（酸またはアルカリによる加水分解）
蛋白質加水分解の、酸またはアルカリによる加水分解における、基質濃度、酵素量、処理温度、ｐH、時間等の条件は適宜設定することができる。

本発明の食品組成物は、医薬品の形態、あるいは食品に添加された形態として、必要により適宜その他の原材料と混合して使用することができる。医薬品の形態として供する場合は、液体，散薬，錠剤，カプセル等の種々の形態で使用することができる。食品に混合された形態として供する場合は、ビスケット，ケーキ，パン，フードバー，肉製品等の固形状食品に混合して使用しても差し支えなく、水に溶解して飲料として、または、ヨーグルト，プリンのような流動状，半固形状食品に混合しても問題ない。また、糖質，ビタミン，ミネラル等を混合してサプリメントとして利用することもできる。

以下に実施例を記載することで本発明を説明する。尚、例中の％は特に断らない限り容量基準を意味するものとする。

（マウスの飼育方法）
肝細胞を採取するためのマウスは、12時間の明暗周期により、照明を管理し、恒温環境下において、自由飲水および自由摂餌による飼育をおこなった。8から12週齢マウスに対して、ペントバルビタールおよびイソフルレン下での麻酔下で、コラゲナーゼ還流により、肝細胞採取を行った。レポーターマウスは下記に記述のように作成し、野生型マウスは、日本エスエルシー株式会社より購入した導入遺伝子を有さないC57BL/6J マウスを用いた。

（１次スクリーニング）
336種類のジペプチドライブラリー（アナスペック社製）の中から、肝臓脂肪合成抑制に関与する可能性のあるものを検討する。１次スクリーニングでは、大まかに、肝臓脂肪合成抑制効果があるかどうかを確認するため、脂肪酸合成酵素の遺伝子であるFasn（Fatty acid synthase）遺伝子を導入したレポーターマウス由来の培養肝細胞を用いて、Fasnプロモーター活性を測定することで、Fasn遺伝子発現を評価した。詳細な方法を以下に示す。

（肝臓Fasnレポーターマウスの作成）
Fasn遺伝子座を内包する全長240.2kbのDNAに対し、Fasn遺伝子プロモーターの直後に、loxP配列（バクテリオファージP1ゲノムに由来する34bpのDNA配列）を両末端にもつＹＦＰ（黄色蛍光蛋白）およびポリＡ鎖を入れた遺伝子カセット、それに続いて、ガウシアルシフェラーゼ（GLuc）およびポリＡ鎖を挿入し、マウス導入用DNAを作成する。このマウス導入DNAを、C57BL/6J マウスから採取した受精卵に導入し、マウスＡを作出した。マウスＡをC57BL/6J マウスと交配することで子孫を得たうえで、ラットアルブミンプロモーターおよびCre組み換え酵素が導入されているマウスＢと交配し、マウスＡおよびマウスＢの両遺伝子を有するマウスをレポーターマウスとして作成する。このレポーターマウスでは、ラットアルブミンプロモーターによって肝臓特異的に発現するCre組み換え酵素によって、肝臓組織に特異的に、ＹＦＰ（黄色蛍光蛋白）およびポリＡ鎖を入れた遺伝子カセットが脱落し、
肝臓組織特異的に、Fasn遺伝子プロモーターによるガウシアルシフェラーゼ（GLuc）発現を得るものである（図１）。なお、このFasn遺伝子プロモーターは、肝臓での脂肪合成酵素特異的に、ガウシアルシフェラーゼ（GLuc）の発現増加とともに活性増加を引き起こすものである。

（評価）
肝臓Fasnレポーターマウスから摘出した肝細胞を、96ウエルプレートで、１％のペニシリンとストレプトマイシン、１０％牛胎児血清（FCS）を含んだダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて8時間培養後、１％のペニシリンとストレプトマイシンを含んだダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に置換して、16時間スタベイション（Ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）させた。
培地を採取し、インシュリン、LXR（肝臓X受容体）アゴニスト、アミノ酸混合物、各ジペプチド（培地中100μｇ/ｍｌ）を含む培地で24時間培養した。また、ジペプチドの代わりに10％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を添加したものも同様に24時間培養した。
培地中にインシュリン、LXRアゴニスト、アミノ酸混合物を添加して培養することにより、脂肪酸合成に関与するFasn遺伝子の発現を促進させる、プロモーターが活性化される。プロモーターが活性化されると、ガウシアルシフェラーゼ（GLuc）遺伝子が発現するので、その活性を測定する。
ガウシアルシフェラーゼの活性は、セレンテラジンを発光基質として、Biochem. Biophys. Res. Commun. 365, 96-101(2007)記載の方法に従い、発光活性をルミノメーターLB941(ベルトールド社製)により測定した。
ジペプチド添加群の測定値、または10％ＤＭＳＯ添加のみの測定値（ジペプチド無添加群）をそれぞれ測定し、ジペプチド無添加群の測定値を１とした場合の、ジペプチド添加群の相対的な活性を算出し評価する。
なお、有意差検定は統計解析ソフトウエア「StatView」（SAS Institute社製）を使用し、コントロールとの比較としてBonferroni法を用いて評価を行った。
結果を図２～８に示した。

統計的に、ガウシアルシフェラーゼ活性が抑制されていることが示されたジペプチドは22種類であった（図２～８、表１）。そこで、これらの22種類のジペプチドが、実際に脂肪合成抑制効果があるのか詳細に確認するため、これらのジペプチドを合成し二次スクリーニングを行った。

（表１）１次スクリーニングで効果のあった22種類のジペプチド

（二次スクリーニング）
ジペプチドは、不二製油所有のペプチド合成機（ResPep SL（INTAVIS社））を用いて合成したものを用いた。合成したジペプチドを表２に示した。

二次スクリーニングでは、野生型マウス（C57BL/6Jマウス）由来の単離肝細胞を用いて、Fasn遺伝子のｍRNA発現量を測定することにより評価した。
具体的には、野生型マウス（C57BL/6Jマウス）由来の単離肝細胞を12ウエルプレートで、１％のペニシリンとストレプトマイシン、１０％牛胎児血清（FCS）を含んだダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて8時間培養後、１％のペニシリンとストレプトマイシンを含んだダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に置換して、16時間スタベイション（Ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）させた。
培地を採取し、インシュリン、LXR（肝臓X受容体）アゴニスト、アミノ酸混合物、各ジペプチド（培地中の終濃度100μｇ/ｍｌ）を含む培地で24時間培養した。また、ジペプチドの代わりに10％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を添加したものも同様に24時間培養した。
各ウエルから培地を除いた後、ｍRNAの抽出を行った。ｍRNA抽出は、SV Total RNA Isolation System (Promega, Z3105)で行い、RNAからの逆転写はPrimeScript RT reagent kit(Takara, RR0037A)で、定量的PCRはSYBR Select Master Mix kit (Life technologies, 4472908)を用いてCFX384Real-Time SystemおよびC1000 Thermal Cyclerにより行った。方法は、該当キットおよび機器のマニュアルに従った。
測定した結果を図９に示した。

22種類のジペプチドの内13種類のジペプチド（Ala-Gly、Ala-His、Ala-Tyr、His-Asn、His-Ser、His-Thr、His-Trp、Val-Met、Trp-Glu、Trp-Lys、Tyr-Lys、Tyr-Ser、Tyr-Tyr）がコントロールに対してFasn遺伝子の発現を有意に抑制する結果となった。

（3次スクリーニング）
2次スクリーニングで、Fasn遺伝子発現の抑制効果があった、13種類のジペプチドについて、添加量を変えて（ジペプチドの終濃度を10, 30, 100μｇ/ｍｌとする。）、2次スクリーニングと同様にFasn遺伝子の発現量を評価した。測定した結果を図１０、１１に示した。

13種類のジペプチドの内11種類のジペプチド（Ala-Gly、His-Asn、His-Ser、His-Thr、His-Trp、Val-Met、Trp-Glu、Trp-Lys、Tyr-Lys、Tyr-SerまたはTyr-Tyr）がコントロールに対してFasn遺伝子の発現を有意に抑制する結果となった。これらの結果から、11種類のジペプチドが肝臓脂肪合成抑制効果があることがわかった。

Claims

Ala-Gly、His-Asn、His-Ser、His-Thr、Val-Met、Trp-Lys、Tyr-Lys、Tyr-SerまたはTyr-Tyrから選択される１種または２種以上のジペプチドを有効成分として含有する、肝臓脂肪合成抑制用食品組成物。
Ala-Gly、His-Asn、His-Ser、His-Thr、Val-Met、Trp-Lys、Tyr-Lys、Tyr-SerまたはTyr-Tyrから選択される１種または２種以上のジペプチドを有効成分として含有する肝臓脂肪合成抑制剤。