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JP7339262B2 - Ｐａｃ１抗体及びその使用 - Google Patents
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JP7339262B2 - Ｐａｃ１抗体及びその使用 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１８年１月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／６１７，１５７号明細書の利益を主張するものであり、その出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を包含し、その配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１８年１２月２０日に作成された、コンピュータで読み取り可能なフォーマットの配列表のコピーは、名称がＡ－２１８９－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５であり、サイズが４９０キロバイトである。
本発明は、バイオ医薬品の分野に関する。特に、本発明は、ヒト下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドＩ型受容体（ＰＡＣ１）に特異的に結合し、且つその生物学的活性を強力に阻害する抗体に関する。本発明は、その抗体を含む医薬組成物並びにそのような抗体を生成及び使用する方法にも関する。
片頭痛は、激しい痛みを伴い得る反復性頭痛であり、多くの場合、吐き気、嘔吐並びに光に対する極度の過敏（光恐怖症）及び音に対する極度の過敏（音声恐怖症）を伴い、ときに感覚警告症状又は徴候（前兆）が先行する。片頭痛は、世界中で非常に流行している疾患であり、欧州人口の約１２％及び米国の女性の１８％、男性の６％が片頭痛発作に苦しんでいる（Ｌｉｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６８：３４３－３４９，２００７；Ｌｉｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｄａｃｈｅ，Ｖｏｌ．４１：６４６－６５７，２００１）。米国における片頭痛の有病率を評価する研究は、片頭痛患者の人口のほぼ半分が月に３回以上の片頭痛を患っていたと報告した（Ｌｉｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６８：３４３－３４９，２００７）。更に、片頭痛は、うつ病及び血管障害などの多くの精神医学的及び医学的併存疾患に関係している（Ｂｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，Ｖｏｌ．８１：４２８－４３２，２０１０；Ｂｉｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７２：１８６４－１８７１，２００９）。現在の片頭痛治療の大部分は、忍容性が良好でないか又は効果がないかのいずれかであり（Ｌｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｄａｃｈｅ，Ｖｏｌ．５２：９３０－９４５，２０１２；Ｌｉｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）；したがって、片頭痛には、依然として満たされていない医学的要求がある。
片頭痛の病因の主要な構成要素は、三叉神経血管系の活性化を含む。血管周囲神経線維からの三叉神経及び副交感神経伝達物質の放出（Ｓａｎｃｈｅｚ－ｄｅｌ－Ｒｉｏ ａｎｄ Ｒｅｕｔｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．１７（３）：２８９－９３，２００４）は、頭蓋血管の血管拡張をもたらし、片頭痛の発症と関連することが示唆されている（Ｅｄｖｉｎｓｓｏｎ，Ｃｅｐｈａｌａｇｉａ，Ｖｏｌ．３３（１３）：１０７０－１０７２，２０１３；Ｇｏａｄｓｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．３４６（４）：２５７－２７０，２００２）。
下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）は、下垂体前葉細胞での環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）形成を刺激する能力に基づいて、最初にヒツジ視床下部抽出物から単離された３８－アミノ酸（ＰＡＣＡＰ３８）又は２７－アミノ酸（ＰＡＣＡＰ２７）ペプチドである（Ｍｉｙａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．１６４：５６７－５７４，１９８９；Ｍｉｙａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．１７０：６４３－６４８，１９９０）。ＰＡＣＡＰは、ＶＩＰ／セクレチン／グルカゴンスーパーファミリーに属する。ＰＡＣＡＰ２７の配列は、ＰＡＣＡＰ３８の２７Ｎ－末端アミノ酸に対応し、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）と６８％の同一性を共有する（Ｐａｎｔａｌｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７１：２２１４６－２２１５１，１９９６；Ｐｉｓｅｇｎａ ａｎｄ Ｗａｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９０：６３４５－４９，１９９３；Ｃａｍｐｂｅｌｌ ａｎｄ Ｓｃａｎｅｓ，Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌ．，Ｖｏｌ．２：１７５－１９１，１９９２）。人体におけるＰＡＣＡＰペプチドの主要な形態は、ＰＡＣＡＰ３８であり、ＰＡＣＡＰ３８の薬効薬理は、ＰＡＣＡＰ２７の薬効薬理と異なることが示されていない。３つのＰＡＣＡＰ受容体は、以下のように報告されている：ＰＡＣＡＰに高い親和性で結合し、ＶＩＰに対してはるかに低い親和性を有する１つの受容体（ＰＡＣ１受容体）及びＰＡＣＡＰとＶＩＰとを同等によく認識する２つの受容体（ＶＰＡＣ１及びＶＰＡＣ２受容体）である（Ｖａｕｄｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ．，Ｖｏｌ．６１：２８３－３５７，２００９）。
片頭痛のような頭痛を誘発する誘発薬としてＰＡＣＡＰを使用するヒト実験的片頭痛モデルは、片頭痛予防のための治療薬としてのＰＡＣＡＰ／ＰＡＣ１シグナル伝達経路の拮抗作用のアプローチをサポートする。ＰＡＣＡＰ３８は、片頭痛患者の自然発生片頭痛発作中に血漿中で上昇し、これらの上昇したＰＡＣＡＰ３８レベルは、急性片頭痛治療であるスマトリプタンで正常化することができる（Ｔｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ，Ｖｏｌ．３３：１０８５－１０９５，２０１３；Ｚａｇａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｎｅｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．１：１０３６－１０４０，２０１４）。ＰＡＣＡＰ３８の注入は、健康な対象において頭痛を引き起こし、片頭痛患者において片頭痛様頭痛を引き起こす（Ｓｃｈｙｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ，Ｖｏｌ．１３２：１６－２５，２００９；Ａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ，Ｖｏｌ．１３７：７７９－７９４，２０１４；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ，Ｖｏｌ．３７：１２５－１３５，２０１７）。しかし、同一モデルにおいて、ＶＩＰは、片頭痛患者において片頭痛様頭痛を引き起こさない（Ｒａｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ，Ｖｏｌ．２８：２２６－２３６，２００８）。ＶＩＰ注入による片頭痛様頭痛の誘発の欠如は、ＶＩＰが後者の２つの受容体ではるかに高い親和性を有するため、ＰＡＣＡＰ３８ペプチドの効果が、ＶＰＡＣ１又はＶＰＡＣ２受容体ではなく、ＰＡＣ１受容体を介して媒介されることを示唆する。この概念は、ＰＡＣ１受容体アンタゴニストが片頭痛のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおける三叉神経頸管複合体の侵害受容ニューロン活動を阻害する動物試験によって更に支持される（Ａｋｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．７：３０８ｒａ１５７，２０１５；Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ，Ｖｏｌ．３７（１Ｓ）：３，Ａｂｓｔｒａｃｔ ＯＣ－ＢＡ－００４，２０１７）。まとめると、これらのデータは、ＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ活性化を阻害する薬理学的薬剤が片頭痛を治療する可能性があることを示唆する。
Ｌｉｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６８：３４３－３４９，２００７ Ｌｉｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｄａｃｈｅ，Ｖｏｌ．４１：６４６－６５７，２００１ Ｂｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，Ｖｏｌ．８１：４２８－４３２，２０１０ Ｂｉｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７２：１８６４－１８７１，２００９ Ｌｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｄａｃｈｅ，Ｖｏｌ．５２：９３０－９４５，２０１２ Ｓａｎｃｈｅｚ－ｄｅｌ－Ｒｉｏ ａｎｄ Ｒｅｕｔｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．１７（３）：２８９－９３，２００４ Ｅｄｖｉｎｓｓｏｎ，Ｃｅｐｈａｌａｇｉａ，Ｖｏｌ．３３（１３）：１０７０－１０７２，２０１３ Ｇｏａｄｓｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．３４６（４）：２５７－２７０，２００２
本発明は、部分的には、ヒトＰＡＣ１に特異的に結合し、且つそれを強力に阻害する高親和性抗体の設計及び生成に基づく。本発明の抗体は、前述の抗ＰＡＣ１抗体と比較して、ヒトＰＡＣ１に対する増強された阻害力を有し、ピコモル範囲のＩＣ５０値を有する。単離された抗体及びその抗原結合断片は、ＰＡＣ１のＰＡＣＡＰ誘導活性化の阻害又は低減、血管拡張の阻害又は低減、片頭痛及び他の血管性頭痛の症状の改善又は治療など、ヒトＰＡＣ１の生物学的活性を阻害、干渉又は調節するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、単離された抗体及びその抗原結合断片は、配列番号１のＡｓｐ５９、Ａｓｎ６０、Ｉｌｅ６１、Ａｒｇ１１６、Ａｓｎ１１７、Ｔｈｒ１１９、Ｇｌｕ１２０、Ａｓｐ１２１、Ｇｌｙ１２２、Ｔｒｐ１２３、Ｓｅｒ１２４、Ｇｌｕ１２５、Ｐｒｏ１２６、Ｐｈｅ１２７、Ｐｒｏ１２８、Ｈｉｓ１２９、Ｔｙｒ１３０、Ｐｈｅ１３１、Ａｓｐ１３２及びＧｌｙ１３５から選択される１つ以上のアミノ酸を含むエピトープでヒトＰＡＣ１に特異的に結合する。特定の実施形態では、エピトープは、ヒトＰＡＣ１の少なくともアミノ酸Ａｓｎ６０、Ｉｌｅ６１、Ｇｌｕ１２０及びＡｓｐ１２１を含む。これらの実施形態及び他の実施形態では、本発明の抗体及び抗原結合断片は、これらのエピトープ残基と相互作用する軽鎖及び重鎖可変領域内の特定の位置で特定のアミノ酸を含む。例えば、一実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ＡＨｏ番号付けによる２９位のアミノ酸が、ヒトＰＡＣ１のアミノ酸Ｇｌｕ１２０又はＡｓｐ１２１と相互作用する塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン又はリジン）である軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ＡＨｏ番号付けによる６１位のアミノ酸が、ヒトＰＡＣ１のアミノ酸Ａｓｎ６０又はＩｌｅ６１と相互作用する疎水性、塩基性又は中性親水性アミノ酸（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン）である重鎖可変領域を含む。更に別の実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ＡＨｏ番号付けによる６６位のアミノ酸が、ヒトＰＡＣ１のアミノ酸Ａｓｎ６０又はＩｌｅ６１と相互作用する塩基性若しくは中性親水性アミノ酸（例えば、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン）である重鎖可変領域を含む。
本発明の抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片は、ＰＡＣ１受容体のリガンド誘導活性化を阻害し得る。例えば、いくつかの実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に５００ｐＭ未満のＩＣ５０でヒトＰＡＣ１のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に３００ｐＭ未満のＩＣ５０でヒトＰＡＣ１のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。特定の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約５０ｐＭ～約５００ｐＭのＩＣ５０でヒトＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片は、他の種由来のＰＡＣ１受容体と交差反応する。一実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、カニクイザルＰＡＣ１受容体に特異的に結合し、且つそのＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。このような実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約０．１ｎＭ～約１ｎＭ又は約５０ｐＭ～約５００ｐＭのＩＣ５０でカニクイザルＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害し得る。別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ラットＰＡＣ１受容体に特異的に結合し、且つそのＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に１０ｎＭ未満のＩＣ５０、例えば約０．１ｎＭ～約１０ｎＭ又は約１００ｐＭ～約２ｎＭのＩＣ５０でラットＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害し得る。
特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域並びに相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む。これらの軽鎖及び重鎖可変領域又はＣＤＲは、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体のいずれかに由来し得る。例えば、いくつかの実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、配列番号５～１６から選択される配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号２６の配列を含むＣＤＲＬ２；配列番号３６～３８から選択される配列を含むＣＤＲＬ３；配列番号８８～９６から選択される配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号１０６～１６６から選択される配列を含むＣＤＲＨ２；及び配列番号１７１～１７７から選択される配列を含むＣＤＲＨ３を含む。他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、配列番号１７～２５から選択される配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号２７～３５から選択される配列を含むＣＤＲＬ２；配列番号３９～５１から選択される配列を含むＣＤＲＬ３；配列番号９７～１０５から選択される配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号１６７～１７０から選択される配列を含むＣＤＲＨ２；及び配列番号１７８～１９０から選択される配列を含むＣＤＲＨ３を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、配列番号５４～６６及び配列番号６８～８７から選択される配列と少なくとも９０％同一又は少なくとも９５％同一である配列を含む軽鎖可変領域を含む。これらの実施形態及び他の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、配列番号１９１～３１２から選択される配列と少なくとも９０％同一又は少なくとも９５％同一である配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、配列番号５４～６６から選択される配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号１９１～２９５から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、配列番号６８～８７から選択される配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号２９６～３１２から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む。
上記の実施形態を含む、本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、キメラ抗体又はその抗原結合断片である。他の実施形態では、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化抗体又はその抗原結合断片である。更に他の実施形態では、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、完全ヒト抗体又はその抗原結合断片である。モノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４などの任意のアイソタイプのものであり得る。特定の一実施形態では、モノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体である。特定の別の実施形態では、モノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ２抗体である。モノクローナル抗体は、ヒトκ定常領域を含む軽鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、ヒトκ定常領域は、配列番号３１８又は配列番号３１９の配列を含む。したがって、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、配列番号３１８又は配列番号３１９の配列を含むヒトκ定常領域に融合する、表１Ａに示した軽鎖可変領域配列のいずれかを含む軽鎖を含み得る。他の実施形態では、モノクローナル抗体は、ヒトλ定常領域を含む軽鎖を含み得る。特定の実施形態では、ヒトλ定常領域は、配列番号３１５の配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、配列番号３１５の配列を含むヒトλ定常領域に融合する、表１Ａに示した軽鎖可変領域配列のいずれかを含む軽鎖を含み得る。
特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、抗体又は抗原結合断片のグリコシル化に影響を及ぼす１つ以上の改変を含有し得る。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、グリコシル化を減少又は排除する１つ以上の変異を含む。このような実施形態では、アグリコシル化抗体は、その重鎖において、Ｎ２９７Ｇ変異など、アミノ酸位置Ｎ２９７（ＥＵ番号付けスキームによる）に変異を含み得る。アグリコシル化抗体は、抗体構造を安定化する変異を更に含み得る。このような変異には、Ａ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ並びにＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃ（ＥＵ番号付けスキームによるアミノ酸位置）などのシステイン置換対が含まれ得る。一実施形態では、アグリコシル化抗体は、その重鎖において、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ変異（ＥＵ番号付けスキームによる）を含む。特定の実施形態では、アグリコシル化抗ＰＡＣ１抗体は、配列番号３２４又は配列番号３２５のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。
本発明は、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチド及び発現ベクター並びにコーディングポリヌクレオチド及び発現ベクターを含む、ＣＨＯ細胞などの宿主細胞も含む。特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片を生成するための方法を含む。一実施形態では、本方法は、抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片の発現を可能にする条件下において、抗体又は抗原結合断片をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を培養することと、培養培地又は宿主細胞から抗体又は抗原結合断片を回収することとを含む。
本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＰＡＣ１の生物学的活性に関係する病態、例えば頭痛、片頭痛、群発性頭痛及び血管運動症状の治療又は予防のための医薬組成物又は薬剤の製造において使用され得る。したがって、本発明は、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物も提供する。医薬組成物は、本明細書に記載の方法のいずれかで使用され得る。
特定の実施形態では、本発明は、頭痛病態の治療又は予防を、それを必要とする患者において行うための方法であって、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片の有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法で治療又は予防される頭痛病態は、片頭痛である。片頭痛は、反復性片頭痛又は慢性片頭痛であり得る。他の実施形態では、本発明の方法で治療又は予防される頭痛病態は、群発性頭痛である。特定の実施形態では、方法は、これらの病態のための予防的治療を提供する。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、方法は、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片と組み合わせて、患者に第２の頭痛治療薬を投与することを含む。第２の頭痛治療薬は、急性頭痛治療薬、例えばセロトニン受容体アゴニスト（例えば、５ＨＴ１Ｂ、５ＨＴ１Ｄ及び／又は５ＨＴ１Ｆセロトニン受容体のアゴニスト）であり得る。いくつかの実施形態では、急性頭痛治療薬は、トリプタン、エルゴタミン、非ステロイド性抗炎症薬又はオピオイドである。他の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片と組み合わせて投与される第２の頭痛治療薬は、予防的頭痛治療薬、例えば抗てんかん薬、β遮断薬、抗うつ薬又はオナボツリヌストキシンＡである。第２の頭痛治療薬は、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片の前、その後又はそれと同時に患者に投与され得る。
本発明の方法の特定の実施形態では、方法は、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片と組み合わせて、患者にＣＧＲＰ経路アンタゴニストを投与することを含む。ＣＧＲＰ経路アンタゴニストは、ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合する抗体など、ヒトＣＧＲＰ受容体のアンタゴニストであり得る。一実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片と組み合わせて投与されるＣＧＲＰ経路アンタゴニストは、エレヌマブである。他の実施形態では、ＣＧＲＰ経路アンタゴニストは、ヒトα－ＣＧＲＰ及び／又はβ－ＣＧＲＰに特異的に結合する抗体など、ＣＧＲＰリガンドのアンタゴニストであり得る。このような一実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片と組み合わせて投与されるＣＧＲＰ経路アンタゴニストは、フレマネズマブである。別のこのような実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片と組み合わせて投与されるＣＧＲＰ経路アンタゴニストは、ガルカネズマブである。更に別のこのような実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片と組み合わせて投与されるＣＧＲＰ経路アンタゴニストは、エプチネズマブである。
本発明は、血管拡張の阻害を、それを必要とする患者において行う方法も含む。一実施形態では、この方法は、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片のいずれかの有効量を患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、治療を必要とする患者は、片頭痛又は群発性頭痛などの頭痛病態を有する。他の実施形態では、治療を必要とする患者は、閉経に関連するものなどの血管運動症状（例えば、ほてり、顔面紅潮、発汗及び寝汗）を有する。
本明細書に記載の方法のいずれかにおける又は本明細書に開示の方法のいずれかによる投与のための医薬の調製のための、抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片の使用が具体的に検討される。例えば、本発明は、頭痛病態の治療又は予防を、それを必要とする患者において行うための方法で使用するための抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片を含む。頭痛病態としては、片頭痛（例えば、反復性及び慢性片頭痛）及び群発性頭痛が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明は、血管拡張の阻害を、それを必要とする患者において行うための方法で使用するための抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片を提供する。このような実施形態では、患者は、頭痛病態を診断されているか又は有し得る。他の実施形態では、本発明は、頭痛病態を有する患者においてヒトＰＡＣ１受容体の活性化を阻害するための方法で使用するための抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片を提供する。頭痛病態は、片頭痛（例えば、反復性又は慢性片頭痛）又は群発性頭痛であり得る。
本発明は、頭痛病態の治療又は予防を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片の使用も含む。頭痛病態としては、片頭痛（例えば、反復性及び慢性片頭痛）及び群発性頭痛が挙げられる。特定の実施形態では、本発明は、血管拡張の阻害を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片の使用を包含する。このような実施形態では、患者は、頭痛病態を診断されているか又は有し得る。他の実施形態では、本発明は、頭痛病態を有する患者においてヒトＰＡＣ１受容体の活性化を阻害するための医薬の調製における抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片の使用を含む。頭痛病態は、片頭痛（例えば、反復性又は慢性片頭痛）又は群発性頭痛であり得る。
ヒトＰＡＣ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と２９Ｇ４ｖ９抗体のＦａｂ断片との間の複合体の結晶構造の正面図である。ＶＬ＝軽鎖可変領域；ＣＬ＝軽鎖定常領域；ＶＨ＝重鎖可変領域；及びＣＨ１＝重鎖ＣＨ１定常領域。 ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤと２９Ｇ４ｖ９抗体のＦａｂ断片との間の複合体の結晶構造の側面図である。本図は、図１Ａに示す構造を左に９０度回転したものである。この図では、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、重鎖可変領域（ＶＨ）の後ろに配置され、軽鎖定常領域（ＣＬ）は、重鎖ＣＨ１定常領域の後ろに配置されている。 ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤと２９Ｇ４ｖ９ Ｆａｂの軽鎖ＣＤＲ１（配列番号３の２４～３４のアミノ酸）との間の界面の拡大図である。ゾーン１は、ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤ（配列番号１）のＧｌｕ１２０及びＡｓｐ１２１残基を含有するが、ゾーン３は、ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤのＰｈｅ１２７残基を含有する。 ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤと２９Ｇ４ｖ９ Ｆａｂの軽鎖ＣＤＲ３のＡｒｇ９３残基との間の界面の拡大図である。 ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤと２９Ｇ４ｖ９ Ｆａｂの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸Ａｒｇ３１及びＰｈｅ３２との間の界面の拡大図である。２つの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸は、ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤのＰｈｅ１３１残基の両側にある。 アミノ酸残基Ａｓｎ６０及びＩｌｅ６１を含有するヒトＰＡＣ１ ＥＣＤの領域（配列番号１に関する）と、２９Ｇ４ｖ９ Ｆａｂの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸Ｔｙｒ５３、Ａｓｐ５４及びＧｌｙ５６との間の界面の拡大図である。 ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤと、２９Ｇ４ｖ９ Ｆａｂの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸Ｖａｌ１０２、Ｌｅｕ１０３及びＴｈｒ１０４との間の界面の拡大図である。 酵母ディスプレイされた抗体Ｆａｂ変異型ライブラリからの改良された結合変異体の選択プロセスの概略図である。 酵母ディスプレイされたライブラリからの高親和性結合変異体のための結合オフレート度駆動選択プロセスの概略図である。 ラットのマキサジラン誘導皮膚血流増加に対する抗ＰＡＣ１抗体の阻害効果を示す。７つの抗体（４２０６５３、４２０８４５、４２０９４３、４２１８７３、４２０８８９（ＰＬ－５０３４７）、４２１０９１（ＰＬ－５０３５０）及び４２１０５１（ＰＬ－５０３５１））の１つを、１０ｎｇのマキサジランでチャレンジ（皮内注射）する２４時間前に０．１ｍｇ／ｋｇ又は０．３ｍｇ／ｋｇの用量でラットに静脈内投与した。皮膚血流をレーザードップラーイメージングによるマキサジランチャレンジの３０分後に評価した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、一元配置分散分析とそれに続くダネットのＭＣＴを用いたビヒクル群との比較。 ラットのマキサジラン誘導皮膚血流増加に対する抗ＰＡＣ１抗体４２０６５３の用量依存阻害効果を示す。１０ｎｇのマキサジランでチャレンジ（皮内注射）する２４時間前に０．０１ｍｇ／ｋｇ～３ｍｇ／ｋｇの範囲の７つの用量の１つでラットに抗体を静脈内投与した。皮膚血流をレーザードップラーイメージングによるマキサジランチャレンジの３０分後に評価した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析とそれに続くダネットのＭＣＴを用いたビヒクル群との比較。 ラットにおけるマキサジラン誘導皮膚血流増加に対する抗ＰＡＣ１抗体４２０８４５の用量依存阻害効果を示す。１０ｎｇのマキサジランでチャレンジ（皮内注射）する２４時間前に０．０１ｍｇ／ｋｇ～３ｍｇ／ｋｇの範囲の５つの用量の１つでラットに抗体を静脈内投与した。皮膚血流をレーザードップラーイメージングによるマキサジランチャレンジの３０分後に評価した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析とそれに続くダネットのＭＣＴを用いたビヒクル群との比較。 ラットにおけるマキサジラン誘導皮膚血流増加に対する抗ＰＡＣ１抗体４２０９４３の用量依存阻害効果を示す。１０ｎｇのマキサジランでチャレンジ（皮内注射）する２４時間前に０．１ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇの範囲の６つの用量の１つでラットに抗体を静脈内投与した。皮膚血流をレーザードップラーイメージングによるマキサジランチャレンジの３０分後に評価した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析とそれに続くダネットのＭＣＴを用いたビヒクル群との比較。 ラットにおけるマキサジラン誘導皮膚血流増加に対する抗ＰＡＣ１抗体４２１８７３の用量依存阻害効果を示す。１０ｎｇのマキサジランでチャレンジ（皮下注射）する２４時間前に０．３ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇの範囲の５つの用量の１つでラットに抗体を静脈内投与した。皮膚血流をレーザードップラーイメージングによるマキサジランチャレンジの３０分後に評価した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析とそれに続くダネットのＭＣＴを用いたビヒクル群との比較。 ラットにおける１ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与後の、抗ＰＡＣ１抗体４２０６５３、４２０８４５、４２０９４３及び４２１８７３についての血清濃度－時間プロファイルである。 ラットにおける５ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与後の、抗ＰＡＣ１抗体４２０６５３、４２０８４５、４２０９４３及び４２１８７３についての血清濃度－時間プロファイルである。 ラットにおける２５ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与後の、抗ＰＡＣ１抗体４２０６５３、４２０８４５、４２０９４３及び４２１８７３についての血清濃度－時間プロファイルである。 カニクイザルにおける１０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与後の、抗ＰＡＣ１抗体４２０６５３、４２０８４５、４２０９４３、４２１８７３及び２９Ｇ４ｖ２２についての血清濃度－時間プロファイルである。 カニクイザルにおけるマキサジラン誘導皮膚血流増加に対する抗ＰＡＣ１抗体４２０６５３及び２９Ｇ４ｖ２２の阻害効果の経時変化を示す。２４匹のカニクイザルに０日目に０．１ｍｇ／ｋｇ若しくは３ｍｇ／ｋｇの抗体４２０６５３又は１０ｍｇ／ｋｇの抗体２９Ｇ４ｖ２２の単回静脈内ボーラス注入を行った。抗体投与後の２、４、７、１０、１４、２１、２８及び３６日目に後マキサジラン反応を測定した。各場合において、皮膚血流は、１ｎｇのマキサジラン皮内注射の３０分後にレーザードップラーイメージングによって測定された。全てのデータは、平均±標準誤差として表される。図１０Ａは、抗体処理後の表示された日にマキサジランの皮内注射によって誘導された皮膚血流のベースラインからの変化％を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析とそれに続くボンフェローニの多重比較検定による同一治療群での０日目の比較。＾記号で示されているように、４匹の動物が３ｍｇ／ｋｇの抗体４２０６５３で試験された３６日目を除いて、一群あたり８匹の動物が試験された。図１０Ｂは、阻害％として表されるマキサジラン誘導皮膚血流増加に対する抗体の阻害効果を示す。＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃ｐ＜０．００１、３ｍｇ／ｋｇの抗体４２０６５３及び１０ｍｇ／ｋｇの抗体２９Ｇ４ｖ２２の両側の対応のないｔ検定による各時点での比較。
本発明は、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドＩ型受容体（ＰＡＣ１）、特にヒトＰＡＣ１に特異的に結合する単離された抗体及びその抗原結合断片に関する。本発明の抗体は、前述の抗ＰＡＣ１アンタゴニスト抗体と比較して、ヒトＰＡＣ１に対する増強された阻害力を有する。本発明の抗体は、ラットＰＡＣ１受容体及びカニクイザルＰＡＣ１受容体とも交差反応し、それによりこれらの種の抗体の前臨床ｉｎ ｖｉｖｏ評価を可能にする。
ヒトＰＡＣ１は、７番染色体上のＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１遺伝子によりコードされる４６８アミノ酸タンパク質（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１０９．２）である。ヒトＰＡＣ１受容体は、アデニル酸シクラーゼと積極的に結合するＧタンパク質共役受容体である。内因性リガンド（例えば、ＰＡＣＡＰ３８又はＰＡＣＡＰ２７）によるヒトＰＡＣ１受容体の活性化により、細胞内環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）が増加する。ヒトＰＡＣ１についてのアミノ酸配列を配列番号１として下記に示す。
Figure 0007339262000001
ヒトＰＡＣ１タンパク質（配列番号１）のアミノ酸１～２３は、一般に成熟タンパク質から除去されるシグナルペプチドを構成する。成熟ヒトＰＡＣ１タンパク質は、７回膜貫通ドメイン、Ｎ末端領域及び３つの細胞外ループで構成される細胞外ドメイン、３つの細胞内ループ並びにＣ末端細胞質ドメインからなるＧタンパク質共役受容体の基本構造を有する。Ｎ末端細胞外ドメインは、およそ配列番号１のアミノ酸２４～１５３にあり、７回膜貫通ドメインの最初は、配列番号１のアミノ酸１５４で始まる。Ｃ末端細胞質ドメインは、配列番号１のおよそアミノ酸３９７～４６８に位置している。アミノ酸配列内のドメインの位置については、Ｂｌｅｃｈｍａｎ ａｎｄ Ｌｅｖｋｏｗｉｔｚ，Ｆｒｏｎｔ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，Ｖｏｌ．４（５５）：１－１９，２０１３を参照されたい。用語「ヒトＰＡＣ１」、「ヒトＰＡＣ１受容体」、「ｈＰＡＣ１」及び「ｈＰＡＣ１受容体」は、同じ意味で用いられ、配列番号１のポリペプチド、配列番号１のポリペプチドからシグナルペプチド（アミノ酸１～２３）を差し引いたもの、ヒトＰＡＣ１の対立遺伝子バリアント又はヒトＰＡＣ１のスプライスバリアントを指し得る。
本発明は、ヒトＰＡＣ１に特異的に結合する抗体を提供する。「抗体」は、抗原に特異的に結合する抗原結合断片を含み、抗原結合断片が、抗体の抗原への結合を促進するコンフォメーションをとることを可能にする骨格又はフレームワーク部分を含むタンパク質である。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、一般的に、２つの軽鎖ポリペプチド（それぞれ約２５ｋＤａ）及び２つの重鎖ポリペプチド（それぞれ約５０～７０ｋＤａ）を含む四量体免疫グロブリンタンパク質を指す。用語「軽鎖」又は「免疫グロブリン軽鎖」は、アミノ末端からカルボキシル末端に、単一の免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）及び単一の免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むポリペプチドを指す。免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、ヒトカッパ（κ）又はヒトラムダ（λ）定常ドメインであり得る。用語「重鎖」又は「免疫グロブリン重鎖」は、アミノ末端からカルボキシル末端に、単一の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）及び任意選択的に免疫グロブリン重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）を含むポリペプチドを指す。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）及びイプシロン（ε）として分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと定義する。ＩｇＧクラス及びＩｇＡクラス抗体は、サブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４並びにＩｇＡ１及びＩｇＡ２にそれぞれ更に分けられる。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤ抗体の重鎖は、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有し、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体の重鎖は、４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）を有する。免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、サブタイプを含む任意の免疫グロブリンアイソタイプ由来であり得る。抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間（すなわち軽鎖と重鎖との間）及び２つの抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介して連結されている。
本発明は、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体の抗原結合断片も含む。本明細書において「結合断片」又は「断片」と同じ意味で用いられる「抗原結合断片」は、完全長の重鎖及び／又は軽鎖に存在するアミノ酸の少なくともいくつかを欠くが、それでもなお抗原に特異的に結合することができる抗体の一部である。抗原結合断片としては、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ナノボディ（例えば、ラクダ重鎖抗体のＶＨドメイン；ＶＨＨ断片、Ｃｏｒｔｅｚ－Ｒｅｔａｍｏｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．６４：２８５３－５７，２００４を参照されたい）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、Ｆｄ断片及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片が挙げられるが、これらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギ又はラクダなどの任意の哺乳動物供給源に由来し得る。抗原結合断片は、標的抗原との結合で完全な抗体と競合し得、及び断片は、完全な抗体の改変（例えば、酵素的若しくは化学的切断）によって生成されるか、又は組換えＤＮＡ技術若しくはペプチド合成を使用して新たに合成され得る。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、抗原に結合する抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲ、例えば抗原に結合する抗体由来の重鎖ＣＤＲ３を含む。他の実施形態では、抗原結合断片は、抗原に結合する抗体の重鎖由来の３つのＣＤＲの全て又は抗原に結合する抗体の軽鎖由来の３つのＣＤＲの全てを含む。更に他の実施形態では、抗原結合断片は、抗原に結合する抗体由来の６つのＣＤＲの全て（重鎖由来の３つ及び軽鎖由来の３つ）を含む。
用語「単離された分子」（分子が例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体又は抗原結合断片である場合）は、その起源又は誘導源のために、（１）その天然状態ではそれに付随する天然に会合したコンポーネントと会合していないか、（２）同じ種由来の他の分子を実質的に含まないか、（３）異なる種由来の細胞によって発現するか、又は（４）天然に存在しない分子である。したがって、化学的に合成されるか、又はそれが天然に由来する細胞と異なる細胞系において発現する分子は、その天然に会合するコンポーネントから「単離されて」いる。分子は、当該技術分野でよく知られた精製技術を使用して、単離により、天然に会合したコンポーネントを実質的に含まないようにもされ得る。分子の純度又は均質性は、当該技術分野でよく知られた多くの手段によってアッセイすることができる。例えば、ポリペプチド試料の純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び当該技術分野でよく知られた技術を使用してポリペプチドを可視化するゲルの染色を使用してアッセイすることができる。特定の目的のために、ＨＰＬＣ又は当該技術分野でよく知られた他の精製手段を使用することにより、より高い分解能が提供され得る。
本発明の特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＰＡＣ１に特異的に結合する。抗体又はその抗原結合断片は、標的抗原に対し、類似の結合アッセイ条件下において、他の無関係なタンパク質に対するその親和性と比較して有意に高い結合親和性を有し、その結果、その抗原を区別することができる場合、標的抗原に「特異的に結合する」。抗原に特異的に結合する抗体又は抗原結合断片は、平衡解離定数（ＫＤ）≦１×１０－６Ｍを有し得る。抗体又は結合断片は、ＫＤが≦１×１０－８Ｍである場合、「高親和性」で抗原に特異的に結合する。一実施形態では、本発明の抗体又は結合断片は、≦５×１０－９ＭのＫＤでヒトＰＡＣ１に結合する。別の実施形態では、本発明の抗体又は結合断片は、≦１×１０－９ＭのＫＤでヒトＰＡＣ１に結合する。更に別の実施形態では、本発明の抗体又は結合断片は、≦５×１０－１０ＭのＫＤでヒトＰＡＣ１に結合する。別の実施形態では、本発明の抗体又は結合断片は、≦１×１０－１０ＭのＫＤでヒトＰＡＣ１に結合する。特定の実施形態では、本発明の抗体又は結合断片は、≦５×１０－１１ＭのＫＤでヒトＰＡＣ１に結合する。他の実施形態では、本発明の抗体又は結合断片は、≦１×１０－１１ＭのＫＤでヒトＰＡＣ１に結合する。特定の一実施形態では、本発明の抗体又は結合断片は、≦５×１０－１２ＭのＫＤでヒトＰＡＣ１に結合する。別の特定の実施形態では、本発明の抗体又は結合断片は、≦１×１０－１２ＭのＫＤでヒトＰＡＣ１に結合する。
親和性は、種々の手法を用いて決定され、その一例は、親和性ＥＬＩＳＡアッセイである。様々な実施形態において、親和性は、表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）ベースのアッセイ）によって決定される。この方法論を用いて、会合速度定数（ｋａ単位：Ｍ－１ｓ－１）及び解離速度定数（ｋｄ単位：ｓ－１）を測定することができる。次いで、平衡解離定数（ＫＤ単位：Ｍ）を速度定数の比（ｋｄ／ｋａ）から計算することができる。いくつかの実施形態では、親和性は、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３７３：５２－６０，２００８に記載されているような結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡ）などの速度論的方法によって決定される。ＫｉｎＥｘＡアッセイを用いて、平衡解離定数（ＫＤ単位：Ｍ）及び会合速度定数（ｋａ単位：Ｍ－１ｓ－１）を測定することができる。解離速度定数（ｋｄ単位：ｓ－１）は、これらの値（ＫＤ×ｋａ）から計算することができる。他の実施形態では、親和性は、Ｋｕｍａｒａｓｗａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１２７８：１６５－８２，２０１５に記載され、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）システム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で使用されているようなバイオレイヤー干渉法によって決定される。速度定数（ｋａ及びｋｄ）及び親和性定数（ＫＤ）は、バイオレイヤー干渉法を用いて実時間で計算することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体又は結合断片は、約１０－２、１０－３、１０－４、１０－５、１０－６、１０－７、１０－８、１０－９、１０－１０ｓ－１若しくはそれ未満のヒトＰＡＣ１に対するｋｄ（解離速度定数）によって測定される結合親和力（値が小さいほどより大きい結合親和力を示す）及び／又は約１０－８、１０－９、１０－１０、１０－１１、１０－１２Ｍ若しくはそれ未満のヒトＰＡＣ１に対するＫＤ（平衡解離定数）によって測定される結合親和性（値が小さいほどより高い結合親和性を示す）などの望ましい特性を示す。
好ましくは、本発明の抗体又は結合断片は、セクレチン／グルカゴン受容体ファミリーの他のメンバー、例えばヒトＶＰＡＣ１受容体（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４６１５．２）及びヒトＶＰＡＣ２受容体（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３３７３．２）と有意に結合又は交差反応しない。本明細書で使用する場合、抗体又は結合断片は、同様の結合アッセイ条件下において、その抗原に対する結合親和性が他の無関係なタンパク質に対する親和性に匹敵する場合、標的抗原に「有意に結合しない」。標的抗原に有意に結合しない抗体又は結合断片は、標的抗原について、本明細書に記載されているものなどの親和性アッセイにおける陰性対照と統計的に異なるシグナルを生成しないタンパク質も含み得る。例として、ＥＬＩＳＡ系又はＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）系アッセイにおいて陰性対照（例えば、抗体を含まないバッファー）で生成されたシグナル値と統計的に異ならない、ヒトＶＰＡＣ１への結合を決定するためのシグナル値を生成する抗体は、ヒトＶＰＡＣ１に有意に結合しないと考えられる。抗原に有意に結合しない抗体又は結合断片は、１×１０－６Ｍより大きい、１×１０－５Ｍより大きい、１×１０－４Ｍより大きい又は１×１０－３Ｍより大きい、その抗原についての平衡解離定数（ＫＤ）を有し得る。そのため、特定の実施形態では、本発明の抗体及び結合断片は、ヒトＶＰＡＣ１及びヒトＶＰＡＣ２と比較してヒトＰＡＣ１に選択的に結合する。換言すれば、本発明の抗体及び結合断片は、ヒトＶＰＡＣ１又はヒトＶＰＡＣ２に有意に結合しない。
本発明の抗体及び抗原結合断片は、ヒトＰＡＣ１受容体の１つ以上の生物学的活性を阻害、干渉又は調節し得る。ヒトＰＡＣ１受容体の生物学的活性としては、ＰＡＣＡＰ媒介受容体シグナル伝達経路の誘発、血管拡張の誘発及び血管収縮の阻害が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体又は結合断片は、ＰＡＣＡＰ（例えば、ＰＡＣＡＰ３８又はＰＡＣＡＰ２７）のヒトＰＡＣ１受容体への結合を阻害する。「結合の阻害」は、過剰な抗体又は結合断片が、ＰＡＣＡＰに結合したヒトＰＡＣ１受容体の量を減少させる場合又はその逆の場合に発生し、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏでの競合結合アッセイで結合を測定することにより、例えば少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％又はそれを超える。本発明の抗体又は抗原結合断片がＰＡＣＡＰのヒトＰＡＣ１受容体への結合を防ぐうえでどの程度強力であるかを示す阻害定数（Ｋｉ）は、そのような競合結合アッセイから計算することができる。例として、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ）は、受容体リガンド（例えば、ＰＡＣＡＰ３８）に結合し、アッセイは、抗ＰＡＣ１抗体又はその結合断片の濃度を増加させて、放射性標識リガンドのヒトＰＡＣ１受容体への結合を測定する。Ｋｉ値は、式Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋（［Ｌ］／Ｋｄ））（式中、［Ｌ］は、使用される放射性リガンド（例えば、１２５Ｉ標識されたＰＡＣＡＰ３８）の濃度であり、Ｋｄは、放射性リガンドの解離定数である）を用いて計算することができる。例えば、Ｋｅｅｎ Ｍ，ＭａｃＤｅｒｍｏｔ Ｊ（１９９３）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｂｙ ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｉｎ：Ｗｈａｒｔｏｎ Ｊ，Ｐｏｌａｋ ＪＭ（ｅｄｓ）Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ，ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ．を参照されたい。アンタゴニストについてのＫｉの値が低いほど、アンタゴニストが強力になる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＰＡＣ１受容体への結合について、≦１ｎＭのＫｉで放射標識されたＰＡＣＡＰリガンドと競合する。他の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＰＡＣ１受容体への結合について、≦５００ｐＭのＫｉで放射標識されたＰＡＣＡＰリガンドと競合する。更に他の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＰＡＣ１受容体への結合について、≦２００ｐＭのＫｉで放射標識されたＰＡＣＡＰリガンドと競合する。特定の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＰＡＣ１受容体への結合について、≦１００ｐＭのＫｉで放射標識されたＰＡＣＡＰリガンドと競合する。
特定の実施形態では、本発明の抗体及び抗原結合断片は、ヒトＰＡＣ１受容体のリガンド誘導活性化を阻害する。リガンドは、ＰＡＣＡＰ３８若しくはＰＡＣＡＰ２７などの受容体の内因性リガンドであり得るか、又はリガンドは、マキサジランなどの受容体の別の既知のアゴニストであり得る。マキサジランは、もともと、ＶＰＡＣ１又はＶＰＡＣ２と比較してＰＡＣ１に対して非常に選択的である、サシチョウバエから単離された６５アミノ酸のペプチドであり、ＰＡＣ１選択的アゴニストとして使用できる（Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６６（１７）：１１２３４－１１２３６，１９９１；Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｖｏｌ．２８（９）：１６５１－１６５４，２００７）。ＰＡＣ１受容体の活性化を評価するための様々なアッセイは、当該技術分野において既知であり、リガンド誘導カルシウム可動化及びｃＡＭＰ生成を測定する細胞系アッセイが挙げられる。例示的な細胞系ｃＡＭＰアッセイを実施例３に記載する。他の好適なＰＡＣ１受容体活性化アッセイは、Ｄｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．１０７０：２３９－４２，２００６；Ｂｏｕｒｇａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５２：３３０８－３３１６，２００９；及び米国特許出願公開第２０１１／０２２９４２３号明細書（これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ＰＡＣ１受容体活性化に対する抗体又は抗原結合断片の阻害活性は、上記のものなどの受容体についての任意の機能アッセイでＩＣ５０を計算することによって定量化することかできる。「ＩＣ５０」は、生物学的又は生化学的機能の５０％阻害を達成するのに必要な用量／濃度である。放射性リガンドの場合、ＩＣ５０は、放射性リガンドの特異的結合の５０％を置換する競合リガンドの濃度である。任意の特定の物質又はアンタゴニストのＩＣ５０は、用量反応曲線を構築し、特定の機能アッセイにおけるアゴニスト活性の逆転に対する異なる濃度の薬物又はアンタゴニストの効果を試験することによって決定され得る。アゴニストの最大の生物学的応答の半分を阻害するのに必要な濃度を決定することにより、ＩＣ５０値を所与のアンタゴニスト又は物質について算出することができる。したがって、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又はその結合断片のＩＣ５０値は、機能アッセイ、例えば実施例で記載されたｃＡＭＰアッセイなどにおいて、ヒトＰＡＣ１受容体の活性化におけるリガンド（例えば、ＰＡＣＡＰ２７、ＰＡＣＡＰ３８又はマキサジラン）の最大生物学的応答の半分を阻害するのに必要な抗体又は結合断片の濃度を決定することによって算出することができる。ＰＡＣ１受容体のリガンド誘導（例えば、ＰＡＣＡＰ誘導）活性化を阻害する抗ＰＡＣ１抗体又はその結合断片は、中和若しくはアンタゴニスト抗体又はＰＡＣ１受容体の結合断片であると理解されている。
特定の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、ヒトＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導（ＰＡＣＡＰ３８誘導又はＰＡＣＡＰ２７誘導）活性化を阻害する。例えば、抗体又は抗原結合断片は、細胞系カルシウム可動化アッセイ又はｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約１０ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約８００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満又は約１００ｐＭ未満のＩＣ５０でヒトＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害し得る。特定の一実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約５ｎＭ未満のＩＣ５０でヒトＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。別の特定の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約１ｎＭ未満のＩＣ５０でヒトＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。更に別の特定の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約５００ｐＭ未満のＩＣ５０でヒトＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。別の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約３００ｐＭ未満のＩＣ５０でヒトＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約０．１ｎＭ～約１ｎＭのＩＣ５０でヒトＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。他の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約５０ｐＭ～約５００ｐＭのＩＣ５０でヒトＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、他の種由来のＰＡＣ１受容体に結合し、且つそれを阻害する。例えば、抗体又は抗原結合断片は、カニクイザルＰＡＣ１受容体（ＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿０１５３０３０４１．１）に結合し、且つそれを阻害する。このような実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、細胞系カルシウム可動化アッセイ又はｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約１０ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約８００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満又は約１００ｐＭ未満のＩＣ５０でカニクイザルＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。一実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約１ｎＭ未満のＩＣ５０でカニクイザルＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。別の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約５００ｐＭ未満のＩＣ５０でカニクイザルＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。更に別の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約０．１ｎＭ～約１ｎＭのＩＣ５０でカニクイザルＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。更に別の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約５０ｐＭ～約５００ｐＭのＩＣ５０でカニクイザルＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。
特定の実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ラットＰＡＣ１受容体（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿５９８１９５．１）に結合し、且つそれを阻害する。これらの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、細胞系カルシウム可動化アッセイ又はｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約１０ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約８００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満又は約１００ｐＭ未満のＩＣ５０でラットＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害し得る。一実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約１０ｎＭ未満のＩＣ５０でラットＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。別の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約５ｎＭ未満のＩＣ５０でラットＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。更に別の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約５００ｐＭ未満のＩＣ５０でラットＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。更に別の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約３００ｐＭ未満のＩＣ５０でラットＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約０．１ｎＭ～約１０ｎＭのＩＣ５０でラットＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。更に別の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に約１００ｐＭ～約２ｎＭのＩＣ５０でラットＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する。本発明の抗体又は結合断片が、他の種由来のＰＡＣ１受容体と交差反応するいくつかの実施形態では、抗体又は結合断片は、同程度の効力でＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害し得る。例えば、本発明の抗体又は結合断片は、カニクイザル又はラットＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害するために、抗体又は結合断片についてのＩＣ５０と同様のＩＣ５０でヒトＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害し得る。他の種のＰＡＣ１受容体の、本発明の抗体又は結合断片との交差反応性は、抗体又は結合断片が治療効果について追加の前臨床動物モデルで評価することができるため、有利であり得る。
一般に、本発明の抗体又は抗原結合断片は、ヒトＶＰＡＣ１受容体又はＶＰＡＣ２受容体のリガンド誘導（例えば、ＰＡＣＡＰ３８誘導、ＰＡＣＡＰ２７誘導又はＶＩＰ誘導）活性化を有意に阻害しない。本明細書で使用する場合、抗体又は抗原結合断片の存在下又は非存在下で受容体のリガンド誘導体活性化又は受容体へのリガンド結合間に統計的差異がない場合、抗体又は抗原結合断片は、受容体の活性化又はその受容体へのリガンドの結合を「有意に阻害しない」。例えば、抗体又は結合断片の存在下でヒトＶＰＡＣ１受容体を発現する細胞においてＰＡＣＡＰ又はＶＩＰにより誘導されるｃＡＭＰ生成量が、抗体又は結合断片の非存在下で生成される量と統計的に異ならない場合、抗体又は結合断片は、ヒトＶＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ誘導活性化を有意に阻害しないと考えられる。同様に、過剰な抗体又は結合断片の存在下でヒトＶＰＡＣ１受容体に結合したＰＡＣＡＰ又はＶＩＰの量が、抗体又は結合断片の非存在下で受容体に結合したＰＡＣＡＰ又はＶＩＰの量と統計的に異ならない場合、抗体又は結合断片は、ＰＡＣＡＰ又はＶＩＰのヒトＶＰＡＣ１受容体との結合を有意に阻害しないと考えられる。特定の実施形態では、本発明の抗体又は結合断片は、ヒトＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害するが、ヒトＶＰＡＣ１受容体又はヒトＶＰＡＣ２受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を有意に阻害しない。したがって、本発明の抗体及び結合断片は、ヒトＶＰＡＣ１受容体及びヒトＶＰＡＣ２受容体に対してヒトＰＡＣ１受容体を選択的に阻害する。
本発明の抗体及び結合断片は、いくつかの実施形態では、ヒトＰＡＣ１の特定の領域又はエピトープに結合し得る。本明細書で使用する場合、「エピトープ」は、抗体又はその断片によって特異的に結合され得る任意の決定基を指す。エピトープは、その抗原を標的とする抗体若しくは結合断片によって結合されるか、又はそれと相互作用する抗原の領域であり、抗原がタンパク質である場合、抗体若しくは結合断片と直接接触するか、又はそれと相互作用する特定のアミノ酸を含む。エピトープは、タンパク質の三次フォールディングによって並置された連続アミノ酸又は非連続アミノ酸の両方によって形成され得る。「線状エピトープ」は、アミノ酸一次配列が認識されるエピトープを含むエピトープである。線状エピトープは、一般的には、少なくとも３又は４個のアミノ酸を含み、より一般的には少なくとも５個、少なくとも６個又は少なくとも７個のアミノ酸、例えば特有の配列の約８～約１０個のアミノ酸を含む。「立体構造エピトープ」は、線状エピトープとは対照的に、不連続なアミノ酸の群（例えば、ポリペプチドにおいて、ポリペプチドの一次配列は連続していないが、ポリペプチドの三次及び四次構造の観点では抗体又はその結合断片によって結合されるのに十分に互いに近いアミノ酸残基）である。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基又はスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面グループを含み得、且つ特定の三次元構造特性及び／又は特定の電荷特性を有し得る。一般に、特定の標的分子に特異的な抗体又は結合断片は、タンパク質及び／又は巨大分子の複合混合物中の標的分子上のエピトープを優先的に認識する。
特定の実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ヒトＰＡＣ１のＮ末端側細胞外ドメイン（配列番号４）内のエピトープでヒトＰＡＣ１に結合する。関連する実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１のアミノ酸２４～１５３内のエピトープでヒトＰＡＣ１に結合する。他の関連する実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１のアミノ酸５０～１４０内のエピトープでヒトＰＡＣ１に結合する。実施例１に記載されているように、ヒトＰＡＣ１Ｎ末端ＥＣＤと抗ＰＡＣ１中和抗体のＦａｂ領域との複合体の結晶構造は、抗ＰＡＣ１ Ｆａｂとの結合界面を構成するヒトＰＡＣ１ ＥＣＤ内の重要なアミノ酸を明らかにした。これらのコア界面アミノ酸は、全てＦａｂ内の非水素原子から５Å以下の距離に少なくとも１つの非水素原子を含み、Ａｓｐ５９、Ａｓｎ６０、Ｉｌｅ６１、Ａｒｇ１１６、Ａｓｎ１１７、Ｔｈｒ１１９、Ａｓｐ１２１、Ｇｌｙ１２２、Ｔｒｐ１２３、Ｓｅｒ１２４、Ｇｌｕ１２５、Ｐｒｏ１２６、Ｐｈｅ１２７、Ｐｒｏ１２８、Ｈｉｓ１２９、Ｔｙｒ１３０、Ｐｈｅ１３１、Ａｓｐ１３２及びＧｌｙ１３５（配列番号１に対するアミノ酸位置番号）が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の抗体又は結合断片は、配列番号１のＡｓｐ５９、Ａｓｎ６０、Ｉｌｅ６１、Ａｒｇ１１６、Ａｓｎ１１７、Ｔｈｒ１１９、Ｇｌｕ１２０、Ａｓｐ１２１、Ｇｌｙ１２２、Ｔｒｐ１２３、Ｓｅｒ１２４、Ｇｌｕ１２５、Ｐｒｏ１２６、Ｐｈｅ１２７、Ｐｒｏ１２８、Ｈｉｓ１２９、Ｔｙｒ１３０、Ｐｈｅ１３１、Ａｓｐ１３２及びＧｌｙ１３５から選択される１つ以上のアミノ酸を含むエピトープでヒトＰＡＣ１に結合する。他の実施形態では、抗体又は結合断片は、配列番号１の少なくともアミノ酸Ａｓｎ６０、Ｉｌｅ６１、Ｇｌｕ１２０及びＡｓｐ１２１を含むエピトープでヒトＰＡＣ１に結合する。更に他の実施形態では、抗体又は結合断片は、配列番号１の少なくともアミノ酸Ａｓｎ６０、Ｉｌｅ６１、Ｇｌｕ１２０、Ａｓｐ１２１、Ｐｈｅ１２７及びＰｈｅ１３１を含むエピトープでヒトＰＡＣ１に結合する。特定の他の実施形態では、抗体又は結合断片は、配列番号１のＡｓｐ５９、Ａｓｎ６０、Ｉｌｅ６１、Ａｒｇ１１６、Ａｓｎ１１７、Ｔｈｒ１１９、Ｇｌｕ１２０、Ａｓｐ１２１、Ｇｌｙ１２２、Ｔｒｐ１２３、Ｓｅｒ１２４、Ｇｌｕ１２５、Ｐｒｏ１２６、Ｐｈｅ１２７、Ｐｒｏ１２８、Ｈｉｓ１２９、Ｔｙｒ１３０、Ｐｈｅ１３１、Ａｓｐ１３２及びＧｌｙ１３５から選択されるアミノ酸の全てを含むエピトープでヒトＰＡＣ１に結合する。
実施例１で記載されるヒトＰＡＣ１ ＥＣＤ－Ｆａｂ複合体の結晶構造は、ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤ中のアミノ酸と相互作用するＦａｂの重鎖及び軽鎖のＣＤＲにおいて重要な残基も明らかにし、それにより抗体のパラトープにおける重要なアミノ酸を同定した。「パラトープ」は、標的抗原を認識して結合する抗体の領域である。パラトープ残基としては、軽鎖可変領域（配列番号３）中のＧｌｎ２７、Ｇｌｙ３０、Ａｒｇ３１及びＳｅｒ３２並びに重鎖可変領域（配列番号２）中のＡｒｇ３１、Ｐｈｅ３２、Ｔｙｒ５３、Ａｓｐ５４、Ｇｌｙ５６が挙げられる。パラトープ内のこれらの残基のいくつかの特定の変異は、ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤのコア界面残基（すなわちエピトープ内の残基）との相互作用を改善するように設計されており、親抗体と比較して結合親和性と阻害力が強化された（実施例１～３を参照されたい）。配列番号３又は列番号５２の軽鎖可変領域におけるＧｌｎ２７、Ｇｌｙ３０、Ａｒｇ３１及びＳｅｒ３２は、それぞれＡＨｏ番号付けで２９、３２、３９及び４０位のアミノ酸に対応し、配列番号２又は配列番号１９１の重鎖可変領域におけるＡｒｇ３１、Ｐｈｅ３２、Ｔｙｒ５３、Ａｓｐ５４、Ｇｌｙ５６は、それぞれＡＨｏ番号付けで３３、３９、６０、６１及び６６位のアミノ酸に対応する。ＡＨｏ番号付けスキームは、構造ベースの番号付けスキームであり、これは、ＣＤＲ領域にギャップを導入して、整列したドメインの平均構造からの偏差を最小化する（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９（３）：６５７－６７０；２００１）。ＡＨｏ番号付けスキームでは、異なる抗体における構造的に均等な位置は、同じ残基番号を有する。
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＰＡＣ１（配列番号１）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、（ｉ）ＡＨｏ番号付けによる２９位のアミノ酸が、ヒトＰＡＣ１のアミノ酸Ｇｌｕ１２０又はＡｓｐ１２１と相互作用する塩基性アミノ酸である軽鎖可変領域と、（ｉｉ）ＡＨｏ番号付けによる６１位のアミノ酸が、ヒトＰＡＣ１のアミノ酸Ａｓｎ６０又はＩｌｅ６１と相互作用する疎水性、塩基性又は中性親水性アミノ酸である重鎖可変領域とを含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。本明細書で使用する場合、１つのアミノ酸の１つ以上の原子が他のアミノ酸の１つ以上の原子と例えばファンデルワールス力、疎水力又は静電気力を介して非共有結合を形成する場合、１つのアミノ酸は、別のアミノ酸と「相互作用」すると言われる。塩基性アミノ酸としては、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられるが、中性親水性アミノ酸としては、グルタミン、セリン及びトレオニンが挙げられる。疎水性アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン及びバリンが挙げられる。特定の実施形態では、軽鎖可変領域におけるＡＨｏ番号付けによる２９位のアミノ酸は、リジン又はアルギニンである。特定の一実施形態では、軽鎖可変領域におけるＡＨｏ番号付けによる２９位のアミノ酸は、リジンである。関連実施形態では、重鎖可変領域におけるＡＨｏ番号付けによる６１位のアミノ酸は、イソロイシン、ロイシン、バリン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンである。一実施形態では、重鎖可変領域におけるのＡＨｏ番号付けによる６１位のアミノ酸は、イソロイシンである。別の実施形態では、重鎖可変領域におけるＡＨｏ番号付けによる６１位のアミノ酸は、グルタミン又はアスパラギンである。更に別の実施形態では、重鎖可変領域におけるＡＨｏ番号付けによる６１位のアミノ酸は、アルギニンである。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域におけるＡＨｏ番号付けによる６６位のアミノ酸は、ヒトＰＡＣ１（配列番号１）のアミノ酸Ａｓｎ６０又はＩｌｅ６１と相互作用する塩基性若しくは中性親水性アミノ酸である。重鎖可変領域におけるＡＨｏ番号付けによる６６位のアミノ酸は、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンであり得る。一実施形態では、重鎖可変領域におけるＡＨｏ番号付けによる６６位のアミノ酸は、アルギニンである。別の実施形態では、重鎖可変領域におけるＡＨｏ番号付けによる６６位のアミノ酸は、アスパラギンである。
上記のパラトープ－エピトープ相互作用は、ピコモル範囲のＩＣ５０値で阻害力の改善と相関することが判明した。実施例３を参照されたい。そのため、ＡＨｏ番号付けによる、軽鎖可変領域における２９位の上記特定のアミノ酸並びに重鎖可変領域における６１及び／又は６６位のアミノ酸を有し、且つヒトＰＡＣ１受容体における特定の残基（配列番号１のＧｌｕ１２０、Ａｓｐ１２１、Ａｓｎ６０及び／又はＩｌｅ６１）と相互作用する抗体又はその抗原結合断片は、強化された阻害力、例えば細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に５００ｐＭ未満のＩＣ５０でヒトＰＡＣ１のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害することが期待される。いくつかの実施形態では、このような抗体又は抗原結合断片は、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に３００ｐＭ未満のＩＣ５０でヒトＰＡＣ１のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害し得る。これらの実施形態及び他の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５２の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号１９１の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む重鎖可変領域とを有し得る。
本発明の抗体又は抗原結合断片は、本明細書に記載されるように、ヒトＰＡＣ１に特異的に結合する抗体の軽鎖及び重鎖可変領域由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。用語「ＣＤＲ」は、抗体可変配列内の相補性決定領域（「最小認識単位」又は「超可変領域」とも呼ばれる）を指す。３つの重鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）及び３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）が存在する。本明細書で使用される用語「ＣＤＲ領域」は、単一の可変領域に存在する３つのＣＤＲ（すなわち３つの軽鎖ＣＤＲ又は３つの重鎖ＣＤＲ）の群を指す。２つの鎖の各々におけるＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域（ＦＲ）によって整列され、標的タンパク質（例えば、ヒトＰＡＣ１）上の特定のエピトープ又はドメインと特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端まで、天然に存在する軽鎖及び重鎖可変領域の両方は、典型的には、これらの要素が以下の順序に従う：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４。これらのドメインの各々に位置を占めるアミノ酸に番号を割り当てるための番号付けシステムが考案されている。この番号付けシステムは、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７及び１９９１，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）又はＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３に定義されている。所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）は、このシステムを使用して同定され得る。免疫グロブリン鎖におけるアミノ酸のための他の番号付けシステムには、ＩＭＧＴ（登録商標）（ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：１８５－２０３；２００５）及びＡＨｏ（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９（３）：６５７－６７０；２００１）が含まれる。
特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体のいずれかに由来する、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含む。例示的なヒト抗ＰＡＣ１抗体の軽鎖及び重鎖可変領域並びに関連するＣＤＲを以下の表１Ａ及び１Ｂにそれぞれ記載する。
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本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、それぞれ表１Ａ及び１Ｂで示される軽鎖ＣＤＲ（すなわちＣＤＲＬ）及び／又は重鎖ＣＤＲ（すなわちＣＤＲＨ）の１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその結合断片は、抗体２９Ｇ４ｖ９、２９Ｇ４ｖ１０又は２９Ｇ４ｖ２２から誘導される（すなわち２９Ｇ４ｖ９、２９Ｇ４ｖ１０又は２９Ｇ４ｖ２２抗体のＣＤＲＬ及び／又はＣＤＲＨの１つ以上で１つ以上の置換を有する）。例えば、特定の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、（ｉ）配列番号５～１６から選択されるＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号２６のＣＤＲＬ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３６～３８から選択されるＣＤＲＬ３、並びに（ｉｖ）１つ以上、例えば１つ、２つ、３つ、４つ若しくはそれを超えるアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、欠失又は５つ、４つ、３つ、２つ若しくは１つ以下のアミノ酸の挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＬから選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲを含む。これら及び他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、（ｉ）配列番号８８～９６から選択されるＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１０６～１６６から選択されるＣＤＲＨ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７１～１７７から選択されるＣＤＲＨ３、並びに（ｉｖ）１つ以上、例えば１つ、２つ、３つ、４つ若しくはそれを超えるアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、欠失又は５つ、４つ、３つ、２つ若しくは１つ以下のアミノ酸の挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＨから選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲを含む。
他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその結合断片は、抗体１９Ｈ８から誘導される（すなわち１９Ｈ８抗体のＣＤＲＬ及び／又はＣＤＲＨの１つ以上で１つ以上の置換を有する）。このような実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、（ｉ）配列番号１７～２５から選択されるＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号２７～３５から選択されるＣＤＲＬ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３９～５１から選択されるＣＤＲＬ３、並びに（ｉｖ）１つ以上、例えば１つ、２つ、３つ、４つ若しくはそれを超えるアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、欠失又は５つ、４つ、３つ、２つ若しくは１つ以下のアミノ酸の挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＬから選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲを含む。これら及び他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、（ｉ）配列番号９７～１０５から選択されるＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１６７～１７０から選択されるＣＤＲＨ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７８～１９０から選択されるＣＤＲＨ３、並びに（ｉｖ）１つ以上、例えば１つ、２つ、３つ、４つ若しくはそれを超えるアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、欠失又は５つ、４つ、３つ、２つ若しくは１つ以下のアミノ酸の挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＨから選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、表１Ａ及び１Ｂに列挙したＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのバリアント形態（それぞれ表１Ａ及び１Ｂに列挙したＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の配列同一性を有する）を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、表１Ａ及び１Ｂに列挙したＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ（それぞれこれらの表に列挙したＣＤＲと１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ以下のアミノ酸が異なる）を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、配列番号５～１６から選択される配列又は１つ、２つ、３つ若しくは４つのアミノ酸置換を有するそのバリアントを含むＣＤＲＬ１；配列番号２６の配列又は１つ、２つ、３つ若しくは４つのアミノ酸置換を有するそのバリアントを含むＣＤＲＬ２；配列番号３６～３８から選択される配列又は１つ、２つ、３つ若しくは４つのアミノ酸置換を有するそのバリアントを含むＣＤＲＬ３；配列番号８８～９６から選択される配列又は１つ、２つ、３つ若しくは４つのアミノ酸置換を有するそのバリアントを含むＣＤＲＨ１；配列番号１０６～１６６から選択される配列又は１つ、２つ、３つ若しくは４つのアミノ酸置換を有するそのバリアントを含むＣＤＲＨ２；及び配列番号１７１～１７７から選択される配列又は１つ、２つ、３つ若しくは４つのアミノ酸置換を有するそのバリアントを含むＣＤＲＨ３を含む。他の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、配列番号５～１６から選択される配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号２６の配列を含むＣＤＲＬ２；配列番号３６～３８から選択される配列を含むＣＤＲＬ３；配列番号８８～９６から選択される配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号１０６～１６６から選択される配列を含むＣＤＲＨ２；及び配列番号１７１～１７７から選択される配列を含むＣＤＲＨ３を含む。
他の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、配列番号１７～２５から選択される配列又は１つ、２つ、３つ若しくは４つのアミノ酸置換を有するそのバリアントを含むＣＤＲＬ１；配列番号２７～３５から選択される配列又は１つ、２つ、３つ若しくは４つのアミノ酸置換を有するそのバリアントを含むＣＤＲＬ２；配列番号３９～５１から選択される配列又は１つ、２つ、３つ若しくは４つのアミノ酸置換を有するそのバリアントを含むＣＤＲＬ３；配列番号９７～１０５から選択される配列又は１つ、２つ、３つ若しくは４つのアミノ酸置換を有するそのバリアントを含むＣＤＲＨ１；配列番号１６７～１７０から選択される配列又は１つ、２つ、３つ若しくは４つのアミノ酸置換を有するそのバリアントを含むＣＤＲＨ２；及び配列番号１７８～１９０から選択される配列又は１つ、２つ、３つ若しくは４つのアミノ酸置換を有するそのバリアントを含むＣＤＲＨ３を含む。他の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、配列番号１７～２５から選択される配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号２７～３５から選択される配列を含むＣＤＲＬ２；配列番号３９～５１から選択される配列を含むＣＤＲＬ３；配列番号９７～１０５から選択される配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号１６７～１７０から選択される配列を含むＣＤＲＨ２；及び配列番号１７８～１９０から選択される配列を含むＣＤＲＨ３を含む。
特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７、２６及び３６の配列を有するか；（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号５、２６及び３６の配列を有するか；（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１２、２６及び３６の配列を有するか；又は（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１３、２６及び３６の配列を有する。
他の特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、（ａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１０８及び１７１の配列を有するか；（ｂ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１１６及び１７１の配列を有するか；（ｃ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１３４及び１７１の配列を有するか；（ｄ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９２、１４５及び１７４の配列を有するか；（ｅ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１０８及び１７２の配列を有するか；（ｆ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１２８及び１７２の配列を有するか；（ｇ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１５３及び１７１の配列を有するか；（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１５４及び１７１の配列を有するか；又は（ｊ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１５５及び１７１の配列を有する。
特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、
（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１０８及び１７１の配列を有するか；
（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１１６及び１７１の配列を有するか；
（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号５、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１３４及び１７１の配列を有するか；
（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号５、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９２、１４５及び１７４の配列を有するか；
（ｅ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１０８及び１７２の配列を有するか；
（ｆ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号５、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１２８及び１７２の配列を有するか；
（ｇ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１３４及び１７１の配列を有するか；
（ｈ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１２、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１５３及び１７１の配列を有するか；
（ｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１２、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１５４及び１７１の配列を有するか；又は
（ｊ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１３、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１５５及び１７１の配列を有する。
一実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１０８及び１７１の配列を有する。別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１１６及び１７１の配列を有する。更に別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号５、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１３４及び１７１の配列を有する。更に別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号５、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９２、１４５及び１７４の配列を有する。１つの特定の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１０８及び１７２の配列を有する。別の特定の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１２、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１５３及び１７１の配列を有する。
特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２５、３１及び４２の配列を有するか；（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２０、３０及び４４の配列を有するか；（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１７、３３及び４２の配列を有するか；（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２３、３１及び５０の配列を有するか；（ｅ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１７、３１及び４４の配列を有するか；（ｆ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１７、２７及び３９の配列を有するか；（ｇ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１８、３１及び４６の配列を有するか；（ｈ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１７、２８及び４０の配列を有するか；（ｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１８、３０及び４３の配列を有するか；又は（ｊ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２２、２８及び４９の配列を有する。
特定の他の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、（ａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９８、１６８及び１９０の配列を有するか；（ｂ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１００、１６８及び１８２の配列を有するか；（ｃ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９９、１６８及び１８７の配列を有するか；（ｄ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９７、１６７及び１７８の配列を有するか；（ｅ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９８、１６８及び１８９の配列を有するか；（ｆ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９８、１６８及び１７９の配列を有するか；又は（ｇ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１０２、１６９及び１８２の配列を有する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、
（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２５、３１及び４２の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９８、１６８及び１９０の配列を有するか；
（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２０、３０及び４４の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１００、１６８及び１８２の配列を有するか；
（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１７、３３及び４２の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９９、１６８及び１８７の配列を有するか；
（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２３、３１及び５０の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９７、１６７及び１７８の配列を有するか；
（ｅ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１７、３１及び４４の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９８、１６８及び１８９の配列を有するか；
（ｆ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１７、２７及び３９の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１００、１６８及び１８２の配列を有するか；
（ｇ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１８、３１及び４６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９８、１６８及び１７９の配列を有するか；
（ｈ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１７、２８及び４０の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９８、１６８及び１７９の配列を有するか；
（ｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１８、３０及び４３の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１００、１６８及び１８２の配列を有するか；又は
（ｊ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２２、２８及び４９の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１０２、１６９及び１８２の配列を有する。
一実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２５、３１及び４２の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９８、１６８及び１９０の配列を有する。別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２０、３０及び４４の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１００、１６８及び１８２の配列を有する。更に別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１７、３３及び４２の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９９、１６８及び１８７の配列を有する。更に別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２３、３１及び５０の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９７、１６７及び１７８の配列を有する。１つの特定の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１７、３１及び４４の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９８、１６８及び１８９の配列を有する。別の特定の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１７、２７及び３９の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１００、１６８及び１８２の配列を有する。
特定の実施形態では、本発明の抗体及び抗原結合断片は、ヒトＰＡＣ１に特異的に結合する抗体、例えば本明細書中に記載される抗体由来の、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）及び免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。本明細書において「可変ドメイン」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））と同じ意味で用いられる「可変領域」は、抗体の抗原への結合に直接関与する、軽免疫グロブリン鎖及び重免疫グロブリン鎖のそれぞれにおける領域を指す。上記のように、可変軽鎖及び可変重鎖の領域は、同じ一般構造を有し、各領域は４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含み、それらの配列は、広く保存され、３つのＣＤＲによって連結されている。フレームワーク領域は、β－シート構造を採用し、ＣＤＲは、β－シート構造を接続するループを形成し得る。各鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域によってそれらの三次元構造に保持され、他方の鎖のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片は、表１Ａに示されるようなＬＶ－０１～ＬＶ－１５から選択される軽鎖可変領域及び／又は表１Ｂに示されるようなＨＶ－０１～ＨＶ－１０５から選択される重鎖可変領域並びにこれらの軽鎖及び重鎖可変領域の結合断片、誘導体及びバリアントを含み得る。他の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片は、表１Ａに示されるようなＬＶ－１６～ＬＶ－３６から選択される軽鎖可変領域及び／又は表１Ｂに示されるようなＨＶ－１０６～ＨＶ－１２２から選択される重鎖可変領域並びにこれらの軽鎖及び重鎖可変領域の結合断片、誘導体及びバリアントを含み得る。
表１Ａに列挙した軽鎖可変領域の各々は、表１Ｂに列挙した重鎖可変領域のいずれかと組み合わされて、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片を形成し得る。このような組み合わせの例としては、（ｉ）ＬＶ－０３とＨＶ－０３～ＨＶ－２６、ＨＶ－３２～ＨＶ－４７及びＨＶ－５７～ＨＶ－６２のいずれか１つ；（ｉｉ）ＬＶ－０４とＨＶ－１１～ＨＶ－９１のいずれか１つ；（ｉｉｉ）ＬＶ－０５とＨＶ－０１、ＨＶ－０３、ＨＶ－０７、ＨＶ－０９及びＨＶ－１０のいずれか１つ；（ｉｖ）ＬＶ－０６とＨＶ－０１、ＨＶ－０３、ＨＶ－０７、ＨＶ－０９及びＨＶ－１０のいずれか１つ；（ｖ）ＬＶ－０７とＨＶ－０１、ＨＶ－０３、ＨＶ－０７、ＨＶ－０９及びＨＶ－１０のいずれか１つ；（ｖｉ）ＬＶ－０８とＨＶ－０１；（ｖｉｉ）ＬＶ－０９とＨＶ－０１；（ｖｉｉｉ）ＬＶ－１０とＨＶ－０１；（ｉｘ）ＬＶ－１１とＨＶ－９２、ＨＶ－９３、ＨＶ－９５～ＨＶ－９７及びＨＶ－９９～ＨＶ－１０１のいずれか１つ；（ｘ）ＬＶ－１２とＨＶ－９４；（ｘｉ）ＬＶ－１３とＨＶ－９８；（ｘｉｉ）ＬＶ－１４とＨＶ－１０２～ＨＶ－１０４のいずれか１つ；（ｘｉｉｉ）ＬＶ－１５とＨＶ－１０５；（ｘｉｖ）ＬＶ－１７とＨＶ－１０７；（ｘｖ）ＬＶ－１８とＨＶ－１０８；（ｘｖｉ）ＬＶ－１９とＨＶ－１０９；（ｘｖｉｉ）ＬＶ－２０とＨＶ－１１０；（ｘｖｉｉｉ）ＬＶ－２１とＨＶ－１１０；（ｘｉｘ）ＬＶ－２２とＨＶ－１１１；（ｘｘ）ＬＶ－２３とＨＶ－１０７；（ｘｘｉ）ＬＶ－２４とＨＶ－１１２；（ｘｘｉｉ）ＬＶ－２５とＨＶ－１１３；（ｘｘｉｉｉ）ＬＶ－２６とＨＶ－１１４；（ｘｘｉｖ）ＬＶ－２７とＨＶ－１０６又はＨＶ－１１０；（ｘｘｖ）ＬＶ－２８とＨＶ－１１５又はＨＶ－１１８；（ｘｘｖｉ）ＬＶ－２９とＨＶ－１１６；（ｘｘｖｉｉ）ＬＶ－３０とＨＶ－１１７；（ｘｘｖｉｉｉ）ＬＶ－３１とＨＶ－１１９；（ｘｘｉｘ）ＬＶ－３２とＨＶ－１２０；（ｘｘｘ）ＬＶ－３３とＨＶ－１２１；（ｘｘｘｉ）ＬＶ－３４とＨＶ－１２２；（ｘｘｘｉｉ）ＬＶ－３５とＨＶ－１１０；並びに（ｘｘｘｉｉｉ）ＬＶ－３６とＨＶ－１１０が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＬＶ－０３（配列番号５４）の配列を含む軽鎖可変領域及びＨＶ－０４（配列番号１９４）の配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＬＶ－０３（配列番号５４）の配列を含む軽鎖可変領域及びＨＶ－１３（配列番号２０３）の配列を含む重鎖可変領域を含む。他の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＬＶ－０４（配列番号５５）の配列を含む軽鎖可変領域及びＨＶ－３８（配列番号２２８）の配列を含む重鎖可変領域を含む。更に他の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＬＶ－０４（配列番号５５）の配列を含む軽鎖可変領域及びＨＶ－８４（配列番号２７４）の配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＬＶ－０３（配列番号５４）の配列を含む軽鎖可変領域及びＨＶ－２４（配列番号２１４）の配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＬＶ－０４（配列番号５５）の配列を含む軽鎖可変領域及びＨＶ－５０（配列番号２４０）の配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＬＶ－０３（配列番号５４）の配列を含む軽鎖可変領域及びＨＶ－３８（配列番号２２８）の配列を含む重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＬＶ－１１（配列番号６２）の配列を含む軽鎖可変領域及びＨＶ－９２（配列番号２８２）の配列を含む重鎖可変領域を含む。更に別の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＬＶ－１１（配列番号６２）の配列を含む軽鎖可変領域及びＨＶ－９３（配列番号２８３）の配列を含む重鎖可変領域を含む。更に別の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＬＶ－１２（配列番号６３）の配列を含む軽鎖可変領域及びＨＶ－９４（配列番号２８４）の配列を含む重鎖可変領域を含む。
特定の他の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＬＶ－３４（配列番号８５）の配列を含む軽鎖可変領域及びＨＶ－１２２（配列番号３１２）の配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＬＶ－２１（配列番号７２）の配列を含む軽鎖可変領域及びＨＶ－１１０（配列番号３００）の配列を含む重鎖可変領域を含む。他の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＬＶ－３０（配列番号８１）の配列を含む軽鎖可変領域及びＨＶ－１１７（配列番号３０７）の配列を含む重鎖可変領域を含む。更に他の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＬＶ－２７（配列番号７８）の配列を含む軽鎖可変領域及びＨＶ－１０６（配列番号２９６）の配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＬＶ－３２（配列番号８３）の配列を含む軽鎖可変領域及びＨＶ－１２０（配列番号３１０）の配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＬＶ－３６（配列番号８７）の配列を含む軽鎖可変領域及びＨＶ－１１０（配列番号３００）の配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＬＶ－２３（配列番号７４）の配列を含む軽鎖可変領域及びＨＶ－１０７（配列番号２９７）の配列を含む重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＬＶ－１７（配列番号６８）の配列を含む軽鎖可変領域及びＨＶ－１０７（配列番号２９７）の配列を含む重鎖可変領域を含む。更に別の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＬＶ－２０（配列番号７１）の配列を含む軽鎖可変領域及びＨＶ－１１０（配列番号３００）の配列を含む重鎖可変領域を含む。更に別の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、ＬＶ－２６（配列番号７７）の配列を含む軽鎖可変領域及びＨＶ－１１４（配列番号３０４）の配列を含む重鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、表１Ａの軽鎖可変領域の配列、すなわちＬＶ－０１～ＬＶ－３６から選択されるＶＬと、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸残基のみで異なる連続するアミノ酸の配列を含む軽鎖可変領域を含み、そのような配列の相違は、それぞれ独立して、１つのアミノ酸の欠失、挿入又は置換であり、欠失、挿入及び／又は置換は、前述の可変ドメイン配列に対して１５以下のアミノ酸の変化をもたらす。いくつかの抗ＰＡＣ１抗体及び結合断片の軽鎖可変領域は、配列番号５２～８７（すなわち表１Ａ中の軽鎖可変領域）のアミノ酸配列（すなわち表１Ａ中の軽鎖可変領域）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
一実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５４～６６から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５４～６６から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む軽鎖可変領域を含む。更に別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５４～６６から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５４の配列を含む軽鎖可変領域を含む。他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５５の配列を含む軽鎖可変領域を含む。更に他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６２の配列を含む軽鎖可変領域を含む。更に他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６３の配列を含む軽鎖可変領域を含む。
別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６８～８７から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含む軽鎖可変領域を含む。更に別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６８～８７から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む軽鎖可変領域を含む。更に別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６８～８７から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６８の配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号７１の配列を含む軽鎖可変領域を含む。他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号７２の配列を含む軽鎖可変領域を含む。更に他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号７４の配列を含む軽鎖可変領域を含む。更に他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号７７の配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号７８の配列を含む軽鎖可変領域を含む。他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８１の配列を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８３の配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８５の配列を含む軽鎖可変領域を含む。更に別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８７の配列を含む軽鎖可変領域を含む。
これらの実施形態及び他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体及びその抗原結合断片は、表１Ｂの重鎖可変領域の配列、すなわちＨＶ－０１～ＨＶ－１２２から選択されるＶＨと、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸残基のみで異なる連続するアミノ酸の配列を含む重鎖可変領域を含み、そのような配列の相違は、それぞれ独立して、１つのアミノ酸の欠失、挿入又は置換であり、欠失、挿入及び／又は置換は、前述の可変ドメイン配列に対して１５以下のアミノ酸の変化をもたらす。いくつかの抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片の重鎖可変領域は、配列番号１９１～３１２（すなわち表１Ｂ中の重鎖可変領域）のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
一実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１９１～２９５から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含む重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１９１～２９５から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む重鎖可変領域を含む。更に別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１９１～２９５から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１９４の配列を含む重鎖可変領域を含む。他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２０３の配列を含む重鎖可変領域を含む。更に別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２１４の配列を含む重鎖可変領域を含む。更に別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２２８の配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２４０の配列を含む重鎖可変領域を含む。他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２７４の配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２８２の配列を含む重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２８３の配列を含む重鎖可変領域を含む。更に別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２８４の配列を含む重鎖可変領域を含む。
別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２９６～３１２から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含む重鎖可変領域を含む。更に別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２９６～３１２から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む重鎖可変領域を含む。更に別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２９６～３１２から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２９６の配列を含む重鎖可変領域を含む。他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２９７の配列を含む重鎖可変領域を含む。更に別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３００の配列を含む重鎖可変領域を含む。更に別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３０４の配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３０７の配列を含む重鎖可変領域を含む。他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３１０の配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３１２の配列を含む重鎖可変領域を含む。
用語「同一性」は、本明細書で使用される場合、配列を整列させ、比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド分子又は２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「同一性パーセント」は、本明細書中で使用される場合、比較する分子中のアミノ酸又はヌクレオチド間の同一残基のパーセントを意味し、比較する分子の最小の大きさに基づいて計算される。これらの計算のために、アラインメントにおけるギャップ（存在する場合）に特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって対処しなければならない。整列させた核酸又はポリペプチドの同一性を計算するために使用され得る方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；及びＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載されるものが含まれる。例えば、配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較するために一般に使用されている標準的な方法によって決定することができる。ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどのコンピュータプログラムを用いて、２つのポリペプチド又は２つのポリヌクレオチド配列を、それらのそれぞれの残基が最適に一致するように整列させる（一方若しくは両方の配列の全長に沿って又は一方若しくは両方の配列の所定の部分に沿って）。プログラムは、デフォルトの開始ペナルティ及びデフォルトのギャップペナルティを提供し、ＰＡＭ ２５０（Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐ．３，１９７８）又はＢＬＯＳＵＭ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５－１０９１９）などのスコアリングマトリックスをコンピュータプログラムと共に使用することができる。次いで、例えば、同一性パーセントを次のように計算することができる：完全一致の総数に１００を掛け、次いで２つの配列を整列させるために、一致したスパン内のより長い配列の長さと、より長い配列に導入されたギャップの数との合計で割る。同一性パーセントを計算する際、比較する配列を、配列間の最大の一致を与えるような方法で整列させる。
ＧＣＧプログラムパッケージは、同一性パーセントを決定するために使用することができるコンピュータプログラムであり、このパッケージは、ＧＡＰを含む（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、配列同一性パーセントを決定しようとする２つのポリペプチド又は２つのポリヌクレオチドを整列させるために使用される。配列は、それらのそれぞれのアミノ酸又はヌクレオチドが最適に一致するように並べられる（アルゴリズムによって決定される「一致スパン」）。ギャップ開始ペナルティ（３×平均対角として計算される。ここで、「平均対角」は、使用される比較マトリックスの対角の平均であり、「対角」は、特定の比較マトリックスによってそれぞれの完全アミノ酸一致に割り当てられるスコア又は数である）及びギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップ開始ペナルティの１／１０倍である）並びにＰＡＭ ２５０又はＢＬＯＳＵＭ ６２などの比較マトリックスがアルゴリズムと共に使用される。特定の実施形態では、標準比較マトリックス（ＰＡＭ ２５０比較マトリックスについては、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：３４５－３５２を参照されたい；ＢＬＯＳＵＭ ６２比較マトリックスについては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５－１０９１９を参照されたい）もアルゴリズムによって使用される。
ＧＡＰプログラムを用いてポリペプチド又はヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定するために推奨されるパラメータには、以下が含まれる。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２（上記）のＢＬＯＳＵＭ ６２；
ギャップペナルティ：１２（ただし、エンドギャップに対するペナルティなし）
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０
２つのアミノ酸配列を整列させるための特定のアラインメントスキームは、２つの配列の短い領域のみの一致をもたらし得、この小さい整列領域は、２つの全長配列間に有意な関係がないにも関わらず、非常に高い配列同一性を有し得る。したがって、選択したアラインメント方法（ＧＡＰプログラム）は、必要に応じて、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続するアミノ酸にわたるアラインメントを生じるように調節し得る。
本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、任意の免疫グロブリン定常領域を含むことができる。本明細書で「定常ドメイン」と同じ意味で用いられる「定常領域」は、可変領域以外の抗体の全てのドメインを指す。定常領域は、抗原の結合に直接関与しないが、種々のエフェクタ機能を示す。上記のように、抗体は、それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、特定のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ）及びサブタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）に分けられる。軽鎖定常領域は、例えば、κ型又はλ型軽鎖定常領域、例えば５つの抗体アイソタイプ全てに見出されるヒトκ型又はλ型軽鎖定常領域であり得る。ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列の例を以下の表に示す。
Figure 0007339262000045
本発明の抗ＰＡＣ１抗体の重鎖定常領域は、例えば、α型、δ型、ε型、γ型又はμ型重鎖定常領域、例えば、ヒトα型、δ型、ε型、γ型又はμ型重鎖定常領域であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４免疫グロブリン、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４免疫グロブリンなど由来の重鎖定常領域を含む。一実施形態において、抗ＰＡＣ１抗体は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。このような実施形態では、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン定常領域は、本明細書により詳細に記載されるように、抗体のグリコシル化を防止する１つ以上の変異を含み得る。別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体は、ヒトＩｇＧ２免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。更に別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体は、ヒトＩｇＧ４免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４重鎖定常領域配列の例を下記の表３に示す。
Figure 0007339262000046
Figure 0007339262000047
表１Ａに開示される軽鎖可変領域の各々及び表１Ｂに開示される重鎖可変領域の各々は、上記の軽鎖定常領域（表２）及び重鎖定常領域（表３）に結合されて、完全な抗体の軽鎖及び重鎖をそれぞれ形成し得る。更に、このようにして生成された重鎖及び軽鎖配列の各々は、完全な抗体構造を形成するために組み合わされ得る。本明細書中に提供される重鎖及び軽鎖可変領域は、上に列挙された例示的な配列と異なる配列を有する他の定常ドメインにも結合され得ることが理解されなければならない。
本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、本明細書に開示の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片のいずれかであり得る。例えば、特定の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体は、表９、１０、１２、１３、１４、１９及び２０で列挙した抗体のいずれかから選択される抗ＰＡＣ１抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体は、表９、１０、１２、１３、１９又は２０に記載されるアミノ酸置換の１つ以上を有する軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含む。例えば、一実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体は、２７、２８、３０、３１、３２及び／又は９３の１つ以上のアミノ酸位置に変異を有する配列番号５２の配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、変異は、Ｑ２７Ｋ、Ｑ２７Ｒ、Ｑ２７Ｈ、Ｓ２８Ａ、Ｇ３０Ｍ、Ｇ３０Ｗ、Ｒ３１Ｑ、Ｒ３１Ｌ、Ｒ３１Ｈ、Ｒ３１Ｗ、Ｒ３１Ｙ、Ｓ３２Ａ、Ｓ３２Ｎ、Ｓ３２Ｌ、Ｒ９３Ｆ、Ｒ９３Ｍ、Ｒ９３Ｙ又はこれらの組み合わせから選択される。これらの実施形態及び他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体は、３１、３２、４９、５２、５３、５４、５６、５７、６２、７０、１０２、１０３及び／又は１０４の１つ以上のアミノ酸位置に変異を有する配列番号１９１の配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、変異は、Ｒ３１Ｆ、Ｒ３１Ｈ、Ｒ３１Ｙ、Ｒ３１Ｍ、Ｒ３１Ｋ、Ｆ３２Ｙ、Ａ４９Ｇ、Ｓ５２Ｎ、Ｓ５２Ｔ、Ｙ５３Ｆ、Ｙ５３Ｈ、Ｙ５３Ｓ、Ｄ５４Ｉ、Ｄ５４Ｌ、Ｄ５４Ｎ、Ｄ５４Ｒ、Ｄ５４Ｑ、Ｄ５４Ｙ、Ｄ５４Ｆ、Ｄ５４Ｍ、Ｄ５４Ｓ、Ｄ５４Ｔ、Ｇ５６Ｑ、Ｇ５６Ｎ、Ｇ５６Ｒ、Ｇ５６Ｈ、Ｇ５６Ａ、Ｇ５６Ｓ、Ｇ５６Ｔ、Ｇ５６Ｄ、Ｎ５７Ａ、Ｎ５７Ｆ、Ｎ５７Ｇ、Ｎ５７Ｓ、Ｎ５７Ｑ、Ｎ５７Ｌ、Ｎ５７Ｔ、Ｅ６２Ｒ、Ｉ７０Ｖ、Ｉ７０Ｌ、Ｉ７０Ｍ、Ｖ１０２Ｐ、Ｖ１０２Ｌ、Ｖ１０２Ｉ、Ｖ１０２Ｆ、Ｖ１０２Ｍ、Ｌ１０３Ｍ、Ｔ１０４Ｓ又はこれらの組み合わせから選択される。
別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体は、２８、３０、３１、３４、４９、５０、５１、５２、５３、９１、９２、９３、９４及び／又は９６の１つ以上のアミノ酸位置に変異を有する配列番号６７の配列を含む軽鎖可変領域を含む。変異は、Ｓ２８Ｙ、Ｓ２８Ｔ、Ｓ２８Ｋ、Ｓ２８Ｐ、Ｓ２８Ｑ、Ｓ２８Ｒ、Ｓ２８Ｍ、Ｓ３０Ａ、Ｓ３０Ｖ、Ｒ３１Ｑ、Ｎ３４Ｖ、Ｎ３４Ｓ、Ｙ４９Ｆ、Ａ５０Ｖ、Ａ５０Ｇ、Ａ５１Ｇ、Ａ５１Ｓ、Ｓ５２Ｑ、Ｓ５２Ｈ、Ｓ５２Ｎ、Ｓ５２Ｙ、Ｓ５２Ｒ、Ｓ５２Ｌ、Ｓ５３Ｉ、Ｓ５３Ｙ、Ｓ５３Ｎ、Ｓ５３Ｍ、Ｓ５３Ｈ、Ｓ５３Ｒ、Ｓ９１Ａ、Ｙ９２Ｉ、Ｓ９３Ｇ、Ｓ９３Ｑ、Ｓ９３Ｉ、Ｓ９３Ｎ、Ｓ９３Ｍ、Ｐ９４Ｅ、Ｐ９４Ｍ、Ｐ９４Ｎ、Ｐ９４Ｑ、Ｐ９４Ａ、Ｐ９４Ｔ、Ｐ９４Ｉ、Ｆ９６Ｙ又はこれらの組み合わせから選択され得る。これらの実施形態及び他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体は、３１、３２、３３、５７、５８、６０、１０３、１０５、１０６、１０７及び／又は１１０の１つ以上のアミノ酸位置に変異を有する配列番号２９６の配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、変異は、Ｓ３１Ｎ、Ｎ３２Ｒ、Ｎ３２Ｋ、Ｎ３２Ｈ、Ｓ３３Ｌ、Ｓ３３Ｑ、Ｓ３３Ｙ、Ｓ３３Ｖ、Ｓ３３Ｄ、Ｓ５７Ｇ、Ｋ５８Ｑ、Ｓ６０Ｋ、Ｔ１０３Ｍ、Ｔ１０３Ｑ、Ｔ１０３Ｒ、Ｔ１０３Ｖ、Ｋ１０５Ｎ、Ｋ１０５Ｅ、Ｋ１０５Ｄ、Ｋ１０５Ｉ、Ｋ１０５Ａ、Ｋ１０５Ｓ、Ｋ１０５Ｑ、Ｑ１０６Ｇ、Ｑ１０６Ｅ、Ｌ１０７Ｄ、Ｌ１０７Ｎ、Ｌ１１０Ｍ、Ｌ１１０Ｆ又はこれらの組み合わせから選択される。
特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、抗体４２０６５３、４２０８４５、４２０９４３、４２１８７３、４２０８８９、４２１０９１、４２１０５１、４８０７１１、４８０７０６、４８０７１３、４４８７３０、４４８１９５、４４８７８８、４４８９０１、４４８６８９、４４８２０２、４５２１２８、４４８９２４、３５７４及び３５７５又はその抗原結合断片から選択され、その可変領域及びＣＤＲ配列は、表１Ａ及び１Ｂに記載されている。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体は、４２０６５３、４２０８４５、４２０９４３、４２１８７３、４２０８８９、４２１０９１、４２１０５１、４８０７１１、４８０７０６及び４８０７１３抗体から選択される抗体である。他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体は、４４８７３０、４４８１９５、４４８７８８、４４８９０１、４４８６８９、４４８２０２、４５２１２８、４４８９２４、３５７４及び３５７５抗体から選択される抗体である。これらの例示的なヒト抗ＰＡＣ１抗体の全長軽鎖及び全長重鎖配列は、それぞれ下記表４Ａ及び４Ｂに記載されている。
Figure 0007339262000048
Figure 0007339262000049
Figure 0007339262000050
Figure 0007339262000051
Figure 0007339262000052
Figure 0007339262000053
Figure 0007339262000054
Figure 0007339262000055
Figure 0007339262000056
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Figure 0007339262000058
Figure 0007339262000059
Figure 0007339262000060
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Figure 0007339262000064
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Figure 0007339262000068
Figure 0007339262000069
Figure 0007339262000070
Figure 0007339262000071
Figure 0007339262000072
Figure 0007339262000073
Figure 0007339262000074
Figure 0007339262000075
特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、表４Ａに示されるようなＬＣ－０１～ＬＣ－０５から選択される軽鎖及び／又は表４Ｂに示されるようなＨＣ－０１～ＨＣ－１１から選択される重鎖並びにこれらの軽鎖及び重鎖の結合断片、誘導体及びバリアントを含み得る。他の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、表４Ａに示されるようなＬＣ－０６～ＬＣ－１５から選択される軽鎖及び／又は表４Ｂに示されるようなＨＣ－１２～ＨＣ－１８から選択される重鎖並びにこれらの軽鎖及び重鎖の結合断片、誘導体及びバリアントを含み得る。
表４Ａに列挙した軽鎖の各々は、表４Ｂに列挙した重鎖のいずれかと組み合わされて、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片を形成し得る。例えば、特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、ＬＣ－０３（配列番号５０６）の配列を含む軽鎖及びＨＣ－０３（配列番号５２１）の配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、ＬＣ－０３（配列番号５０６）の配列を含む軽鎖及びＨＣ－０４（配列番号５２２）の配列を含む重鎖を含む。他の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、ＬＣ－０１（配列番号５０４）の配列を含む軽鎖及びＨＣ－０５（配列番号５２３）の配列を含む重鎖を含む。更に他の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、ＬＣ－０１（配列番号５０４）の配列を含む軽鎖及びＨＣ－０６（配列番号５２４）の配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、ＬＣ－０３（配列番号５０６）の配列を含む軽鎖及びＨＣ－０７（配列番号５２５）の配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、ＬＣ－０１（配列番号５０４）の配列を含む軽鎖及びＨＣ－０８（配列番号５２６）の配列を含む重鎖を含む。一実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、ＬＣ－０３（配列番号５０６）の配列を含む軽鎖及びＨＣ－０５（配列番号５２３）の配列を含む重鎖を含む。別の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、ＬＣ－０４（配列番号５０７）の配列を含む軽鎖及びＨＣ－０９（配列番号５２７）の配列を含む重鎖を含む。更に別の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、ＬＣ－０４（配列番号５０７）の配列を含む軽鎖及びＨＣ－１０（配列番号５２８）の配列を含む重鎖を含む。更に別の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、ＬＣ－０５（配列番号５０８）の配列を含む軽鎖及びＨＣ－１１（配列番号５２９）の配列を含む重鎖を含む。
特定の他の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、ＬＣ－０７（配列番号５１０）の配列を含む軽鎖及びＨＣ－１３（配列番号５３１）の配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、ＬＣ－０８（配列番号５１１）の配列を含む軽鎖及びＨＣ－１４（配列番号５３２）の配列を含む重鎖を含む。他の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、ＬＣ－０９（配列番号５１２）の配列を含む軽鎖及びＨＣ－１５（配列番号５３３）の配列を含む重鎖を含む。更に他の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、ＬＣ－１０（配列番号５１３）の配列を含む軽鎖及びＨＣ－１６（配列番号５３４）の配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、ＬＣ－１１（配列番号５１４）の配列を含む軽鎖及びＨＣ－１７（配列番号５３５）の配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、ＬＣ－１２（配列番号５１５）の配列を含む軽鎖及びＨＣ－１７（配列番号５３５）の配列を含む重鎖を含む。一実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、ＬＣ－１３（配列番号５１６）の配列を含む軽鎖及びＨＣ－１４（配列番号５３２）の配列を含む重鎖を含む。別の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、ＬＣ－１４（配列番号５１７）の配列を含む軽鎖及びＨＣ－１８（配列番号５３６）の配列を含む重鎖を含む。更に別の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、ＬＣ－０６（配列番号５０９）の配列を含む軽鎖及びＨＣ－１４（配列番号５３２）の配列を含む重鎖を含む。更に別の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、ＬＣ－１５（配列番号５１８）の配列を含む軽鎖及びＨＣ－１２（配列番号５３０）の配列を含む重鎖を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体は、表４Ａの軽鎖の配列、すなわちＬＣ－０１～ＬＣ－１５から選択される軽鎖と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸残基のみで異なる連続するアミノ酸の配列を含む軽鎖を含み、そのような配列の相違は、それぞれ独立して、１つのアミノ酸の欠失、挿入又は置換であり、欠失、挿入及び／又は置換は、前述の軽鎖配列に対して１５以下のアミノ酸の変化をもたらす。いくつかの抗ＰＡＣ１抗体中の軽鎖は、配列番号５０４～５１８（すなわち表４Ａ中の軽鎖）のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
これらの実施形態及び他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体は、表４Ｂの重鎖の配列、すなわちＨＣ－０１～ＨＣ－１８から選択される重鎖と１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸残基のみで異なる連続するアミノ酸の配列を含む重鎖を含み、そのような配列の相違は、それぞれ独立して、１つのアミノ酸の欠失、挿入又は置換であり、欠失、挿入及び／又は置換は、前述の重鎖配列に対して１５以下のアミノ酸の変化をもたらす。いくつかの抗ＰＡＣ１抗体中の重鎖は、配列番号５１９～５３６（すなわち表４Ｂ中の重鎖）のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体若しくは多重特異性抗体又はそれらの抗原結合断片であり得る。特定の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体は、モノクローナル抗体である。そのような実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト免疫グロブリン定常ドメインを有する完全ヒト抗体であり得る。これらの実施形態及び他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体である。したがって、抗ＰＡＣ１抗体は、いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４定常ドメインを有し得る。一実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体は、モノクローナルヒトＩｇＧ１抗体である。別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体は、モノクローナルヒトＩｇＧ２抗体である。更に別の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体は、モノクローナルヒトＩｇＧ４抗体である。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」（又は「ｍＡｂ」）は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかに存在し得る可能性のある天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、典型的には、異なるエピトープに対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、特異性が高く、個々の抗原部位又はエピトープに対するものである。モノクローナル抗体は、当該技術分野で知られた任意の手法を用いて、例えば免疫スケジュールの完了後に動物から採取した脾臓細胞を不死化することによって生成され得る。脾臓細胞は、当該技術分野で知られた任意の手法を用いて、例えばそれらを骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成することによって不死化し得る。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ（例えば、１９８８からの）又は２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（例えば、２０１４からの）を参照されたい。ハイブリドーマ生成融合手順に使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは、非抗体産生性であり、高い融合効率を有し、且つ所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地においてそれらの増殖を不可能にする酵素欠損を有する。マウス細胞との融合に使用するのに好適な細胞株の例としては、Ｓｐ－２０、Ｐ３－Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４ １、Ｓｐ２１０－Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ－１１、ＭＰＣ１１－Ｘ４５－ＧＴＧ １．７及びＳ１９４／５ＸＸＯ Ｂｕｌが挙げられるが、これらに限定されない。ラット細胞との融合に使用するのに好適な細胞株の例としては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３－Ａｇ １．２．３、ＩＲ９８３Ｆ及び４Ｂ２１０が挙げられるが、これらに限定されない。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ－２６６、ＧＭ１５００－ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ－ＬＯＮ－ＨＭｙ２及びＵＣ７２９－６である。
いくつかの例では、ハイブリドーマ細胞株は、動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス又はヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）をＰＡＣ１免疫原（例えば、国際公開第２０１４／１４４６３２号パンフレットを参照されたい）で免疫し、この免疫された動物から脾臓細胞を採取し；採取した脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによってハイブリドーマ細胞を生成し、このハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を確立し、且つＰＡＣ１に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することによって生成される。モノクローナル抗体を生成するための別の有用な方法は、Ｂａｂｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３：７８４３－７８４８，１９９６で記載されているＳＬＡＭ法である。
ハイブリドーマ細胞株によって分泌されたモノクローナル抗体は、プロテインＡ－セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなど、当該技術分野で知られた任意の技術を使用して精製され得る。ハイブリドーマ上清又はｍＡｂを更にスクリーニングして、ＰＡＣ１（例えば、ヒトＰＡＣ１、カニクイザルＰＡＣ１又はラットＰＡＣ１）に結合する能力；他のＰＡＣ１ファミリーメンバー（例えば、ヒトＶＰＡＣ１又はヒトＶＰＡＣ２）との交差反応性；ＰＡＣＡＰリガンドのＰＡＣ１への結合をブロック若しくは妨害する能力又はＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を機能的にブロックする能力などの特定の特性を有するｍＡｂを、例えば本明細書に記載のｃＡＭＰアッセイを使用して同定することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、本明細書に記載の抗体のＣＤＲ及び可変領域配列に基づくキメラ若しくはヒト化抗体又はそれらの抗原結合断片である。キメラ抗体は、共有結合して機能的免疫グロブリン軽鎖若しくは重鎖又はそれらの結合断片を生成する、異なる抗体由来のタンパク質セグメントから構成される抗体である。一般に、重鎖及び／又は軽鎖の一部は、特定の種に由来するか、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一若しくは相同である一方、鎖の残りは、別の種に由来するか、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一若しくは相同である。キメラ抗体に関する方法は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５を参照されたい。これらの両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一般に、キメラ抗体を作製する目的は、意図する種由来のアミノ酸の数が最大となるキメラを作製することである。一例は、抗体が、特定の種に由来するか、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する１つ以上のＣＤＲを含む一方、抗体鎖の残りは、別の種に由来するか、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一若しくは相同である「ＣＤＲグラフト」抗体である。ＣＤＲグラフト化は、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号明細書、同第５，６９３，７６２号明細書、同第５，６９３，７６１号明細書、同第５，５８５，０８９号明細書及び同第５，５３０，１０１号明細書に記載されている。ヒトで使用するために、齧歯動物又はウサギ抗体由来の可変領域又は選択されたＣＤＲは、多くの場合、ヒト抗体にグラフトされ、ヒト抗体の天然に存在する可変領域又はＣＤＲを置換する。
キメラ抗体の１つの有用な型は、「ヒト化」抗体である。一般に、ヒト化抗体は、齧歯動物又はウサギなどの非ヒト動物において最初に産生されたモノクローナル抗体から生成される。典型的には、抗体の非抗原認識部分に由来する、このモノクローナル抗体の特定のアミノ酸残基は、対応するアイソタイプのヒト抗体における対応する残基に相同であるように改変される。ヒト化は、例えば、種々の方法を用いて、齧歯動物又はウサギの可変領域の少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域に置換することにより行うことができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書及び同第５，６９３，７６２号明細書、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－２７並びにＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６を参照されたい）。
一態様では、本明細書中に提示される抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のＣＤＲ（表１Ａ及び１Ｂを参照されたい）は、同一の又は異なる系統発生的種由来の抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトされる。例えば、表１Ａ及び１Ｂに列挙した重鎖及び軽鎖可変領域のＣＤＲがコンセンサスヒトＦＲにグラフトされ得る。コンセンサスヒトＦＲを作製するために、いくつかのヒト重鎖又は軽鎖アミノ酸配列由来のＦＲをアラインさせて、コンセンサスアミノ酸配列を同定し得る。代わりに、１つの重鎖又は軽鎖由来のグラフト化可変領域は、本明細書に開示する特定の重鎖又は軽鎖の定常領域と異なる定常領域と共に使用され得る。他の実施形態では、グラフト化可変領域は、一本鎖Ｆｖ抗体の一部である。
特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、完全ヒト抗体又はその抗原結合断片である。ヒトＰＡＣ１に特異的に結合する完全ヒト抗体は、国際公開第２０１４／１４４６３２号パンフレットに記載の免疫原又はその断片、例えば配列番号１又は配列番号４の配列からなるポリペプチドを使用して生成することができる。「完全ヒト抗体」は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来するか、又はそれを示す可変領域及び定常領域を含む抗体である。完全ヒト抗体の生成を実施するために提供される１つの具体的な手段は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されたマウスへのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の導入は、任意の所望の抗原で免疫化され得る動物であるマウスにおいて完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成する１つの手段である。完全ヒト抗体を使用することにより、マウス又はマウス由来のｍＡｂを治療剤としてヒトに投与することによって引き起こされることがある免疫原性及びアレルギー反応を最小限に抑えることができる。
完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（通常、マウス）を免疫化することによって生成することができる。この目的のための抗原は、典型的には、６個以上の連続するアミノ酸を有し、任意選択的にハプテンなどのキャリアにコンジュゲートされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１－２５５５、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５－２５８及びＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照されたい。このような方法の一例では、トランスジェニック動物は、マウスの免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖をコードする内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座を無能力化し、マウスのゲノム中に、ヒトの重鎖及び軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含むヒトゲノムＤＮＡの大きい断片を挿入することによって生産される。次いで、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の完全相補体より少ない相補体を有する部分的に改変された動物を交雑して、所望の免疫系を全て改変した動物を得る。免疫原を投与すると、これらのトランスジェニック動物は、免疫原に対して免疫特異的であるが、マウスでなくヒトの、可変領域を含むアミノ酸配列を有する抗体を産生する。このような方法の更なる詳細については、例えば、国際公開第９６／３３７３５号パンフレット及び国際公開第９４／０２６０２号パンフレットを参照されたい。ヒト抗体を作るためのトランスジェニックマウスに関連する更なる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、同第６，７１３，６１０号明細書、同第６，６７３，９８６号明細書、同第６，１６２，９６３号明細書、同第５，９３９，５９８号明細書、同第５，５４５，８０７号明細書、同第６，３００，１２９号明細書、同第６，２５５，４５８号明細書、同第５，８７７，３９７号明細書、同第５，８７４，２９９及び同第５，５４５，８０６号明細書、ＰＣＴ公報の国際公開第９１／１０７４１号パンフレット、国際公開第９０／０４０３６号パンフレット、国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、国際公開第９６／３０４９８号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット並びに欧州特許第５４６０７３Ｂ１号明細書及び欧州特許出願公開第５４６０７３Ａ１号明細書に記載されている。
「ＨｕＭａｂ」マウスと呼ばれる上記のトランスジェニックマウスは、内因性のμ及びκ鎖遺伝子座を不活性化する標的変異と共に、再配列されていないヒト重鎖（μ及びγ）及びκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含む（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭ及びκタンパク質の発現の減少を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチ及び体細胞変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３；Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６－５４６）。ＨｕＭａｂマウスの作製は、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７－６２９５；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７－６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２－２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９－１０１；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９－５９１；Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３；Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６－５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５－８５１に詳細に記載されており、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。更に、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、同第５，５６９，８２５号明細書、同第５，６２５，１２６号明細書、同第５，６３３，４２５号明細書、同第５，７８９，６５０号明細書、同第５，８７７，３９７号明細書、同第５，６６１，０１６号明細書、同第５，８１４，３１８号明細書、同第５，８７４，２９９号明細書及び同第５，７７０，４２９号明細書並びに米国特許第５，５４５，８０７号明細書、国際公開第９３／１２２７号パンフレット、国際公開第９２／２２６４６号パンフレット及び国際公開第９２／０３９１８号パンフレットを参照されたい。これら全ての開示内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらのトランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するために利用される技術は、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット及びＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）にも開示されている。例えば、ＨＣｏ７及びＨＣｏ１２トランスジェニックマウス株を用いて、完全ヒト抗ＰＡＣ１抗体を生成することができる。完全ヒト抗ＰＡＣ１抗体の生成に好適な１つの特定のトランスジェニックマウス株は、米国特許第６，１１４，５９８号明細書、同第６，１６２，９６３号明細書、同第６，８３３，２６８号明細書、同第７，０４９，４２６号明細書、同第７，０６４，２４４号明細書；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３－２１；Ｍｅｎｄｅｚｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６；Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｉｓ，１９９８，Ｊ．Ｅｘ．Ｍｅｄ，１８８：４８３－４９５；Ｇｒｅｅｎ，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１－２３；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，２００２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３，５９３－５９７（これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）トランスジェニックマウス株である。
ヒト由来抗体は、ファージディスプレイ技術を用いて生成することもできる。ファージディスプレイは、例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．による国際公開第９１／１７２７１号パンフレット、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．による国際公開第９２／０１０４７号パンフレット及びＣａｔｏｎ ａｎｄ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０－６４５４に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ファージ技術によって生成される抗体は、通常、細菌において、抗原結合断片、例えばＦｖ又はＦａｂ断片として生成され、したがってエフェクタ機能を欠く。エフェクタ機能は、２つの戦略の１つによって導入することができる：断片は、必要に応じて、哺乳動物細胞で発現する完全な抗体に、又はエフェクタ機能を誘発し得る第２の結合部位を有する二重特異性抗体断片に操作され得る。典型的には、抗体のＦｄ断片（ＶＨ－ＣＨ１）及び軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）は、ＰＣＲによって別々にクローン化され、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリでランダムに組み換えられ、これは、その後、特定の抗原に結合するために選択され得る。抗体断片は、ファージ表面で発現し、抗原結合によるＦｖ又はＦａｂ（したがって抗体断片をコードするＤＮＡを含むファージ）の選択は、パンニングと呼ばれる手順である抗原結合及び再増幅を数ラウンド行うことによって達成される。抗原に特異的な抗体断片は、リッチ化され、最終的に単離される。ファージディスプレイ技術は、「ガイデッドセレクション」と呼ばれる、齧歯類モノクローナル抗体のヒト化のためのアプローチにおいて使用することもできる（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２，８９９－９０３を参照されたい）。このために、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片は、ヒト軽鎖ライブラリと組み合わせて提示され得、次いで、得られたハイブリッドＦａｂライブラリは、抗原を用いて選択され得る。これにより、マウスＦｄ断片は、選択を誘導するテンプレートを提供する。続いて、選択されたヒト軽鎖は、ヒトＦｄ断片ライブラリと組み合わされる。得られたライブラリの選択により、完全にヒトＦａｂが得られる。
本発明による抗ＰＡＣ１抗体を産生する細胞が上記の免疫化及び他の技術のいずれかを使用して得られたら、本明細書中に記載されるような標準的な手順に従い、それからＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離し、増幅することにより、特異的抗体遺伝子がクローン化され得る。それから産生された抗体の配列を決定し、ＣＤＲを同定し、ＣＤＲをコードするＤＮＡを本明細書に記載のように操作して、本発明による他の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片を生成することができる。
特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片は、定常領域に対する１つ以上の変異又は改変を含み得る。例えば、抗ＰＡＣ１抗体の重鎖定常領域又はＦｃ領域は、抗体のグリコシル化、エフェクタ機能及び／又はＦｃγ受容体結合に影響を及ぼす１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。用語「Ｆｃ領域」は、無傷の抗体のパパイン消化によって生成され得る免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、任意選択的にＣＨ４ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４免疫グロブリン由来のＦｃ領域である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ２免疫グロブリン由来のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ領域は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）及び食作用などのエフェクタ機能を保持し得る。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、以下に更に詳細に記載されるように、エフェクタ機能を低下又は排除するように改変され得る。
特定の配列を参照して別段の指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９（３）：６５７－６７０；２００１に記載されるようなＡＨｏ番号付け又はＥｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．６３：７８－８５（１９６９）に記載されるようなＥＵ番号付けに従う。本明細書で使用する場合、ＡＨｏ番号付けスキームは、典型的には、可変領域内のアミノ酸の位置に言及する場合に使用される一方、ＥＵ番号付けスキームは、免疫グロブリン定常領域を有するアミノ酸の位置に言及する場合に一般に使用される。
アミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、本明細書では、通常、特定の位置におけるアミノ酸残基が一文字略語で示され、次いで目的の元の配列に対するアミノ酸位置の数字が続き、次いで置換されたアミノ酸残基の１文字の略語が続く。例えば、「Ｔ３０Ｄ」は、目的の元の配列に対して、アミノ酸位置３０でのアスパラギン酸塩残基によるトレオニン残基の置換を表す。別の例「Ｓ２１８Ｇ」は、目的の元のアミノ酸配列に対して、アミノ酸位置２１８でのグリシン残基によるセリン残基の置換を表す。
免疫グロブリンのＦｃ領域の機能の１つは、免疫グロブリンがその標的に結合するときに免疫系に伝達することである。これは、一般に「エフェクタ機能」と呼ばれる。伝達は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）及び／又は補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）につながる。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、免疫系の細胞の表面上のＦｃ受容体へのＦｃ領域の結合を介して媒介される。ＣＤＣは、Ｆｃ領域と補体系のタンパク質、例えばＣ１ｑとの結合を介して媒介される。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、Ｆｃ領域にエフェクタ機能、例えば、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＰ活性及び／又は抗体のクリアランス若しくは半減期を増強する１つ以上のアミノ酸置換を含む。エフェクタ機能を増強し得る例示的なアミノ酸置換（ＥＵ番号付けスキームによる）としては、Ｅ２３３Ｌ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３５Ｓ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｖ、Ｐ２４７Ｉ、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｙ、Ｒ２９２Ｐ、Ｅ２９４Ｌ、Ｙ２９６Ｗ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｔ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｑ３１１Ｍ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３２６Ｗ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｍ、Ａ３３０Ｆ、Ｉ３３２Ｅ、Ｄ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｖ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ又は上記のいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
他の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、Ｆｃ領域に、エフェクタ機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。エフェクタ機能を低下させることができる例示的なアミノ酸置換（ＥＵ番号付けスキームによる）としては、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ又は上記のいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
グリコシル化は、抗体、特にＩｇＧ１抗体のエフェクタ機能に寄与し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、抗体のグリコシル化のレベル又は型に影響を及ぼす１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合である。Ｎ結合は、糖鎖のアスパラギン残基側鎖への結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－トレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖鎖の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を生成する。Ｏ結合グリコシル化は、糖のＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースの１つのヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はトレオニンへの結合を指すが、５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリジンも使用され得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体のグリコシル化を、１つ以上のグリコシル化部位を例えば抗体のＦｃ領域に付加することによって増加させる。抗体へのグリコシル化部位の付加は、（Ｎ結合型グリコシル化部位のための）上記のトリペプチド配列の１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することにより好都合に行うことができる。改変は、１つ以上のセリン若しくはトレオニン残基の開始配列への付加又はそれによる置換によってもなされ得る（Ｏ結合グリコシル化部位について）。容易にするために、抗体アミノ酸配列を、ＤＮＡレベルでの変化により、特に所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように、予め選択された塩基で標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによって改変し得る。
本発明は、エフェクタ活性の変化をもたらす改変炭水化物構造を有する抗体分子、例えばＡＤＣＣ活性の向上を示すフコシル化が存在しないか又は減少した抗体の生成も包含する。フコシル化を減少又は排除する様々な方法が当該技術分野で知られている。例えば、ＡＤＣＣエフェクタ活性は、抗体分子のＦｃγＲＩＩＩ受容体への結合によって媒介され、これは、ＣＨ２ドメインのＮ２９７残基でのＮ結合型グリコシル化の糖鎖構造に依存することが示されている。非フコシル化抗体は、高い親和性でこの受容体に結合し、ＦｃγＲＩＩＩ媒介エフェクタ機能を天然のフコシル化抗体よりも効率的に誘発する。例えば、α－１，６－フコシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされているＣＨＯ細胞における非フコシル化抗体の組換え産生は、ＡＤＣＣ活性が１００倍増加した抗体を生じる（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．８７（５）：６１４－２２，２００４を参照されたい）。同様の効果は、フコシル化経路におけるα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ酵素又は他の酵素の活性を減少させることにより、例えばｓｉＲＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡ処理、酵素をノックアウトするための細胞株の操作又は選択的グリコシル化阻害剤との培養によって達成され得る（Ｒｏｔｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１２）：１１１３－２３，１９８９を参照されたい）。いくつかの宿主細胞株、例えばＬｅｃ１３又はラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株は、より低いフコシル化レベルを有する抗体を天然に産生する（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７（３０）：２６７３３－４０，２００２及びＳｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６－７３，２００３を参照されたい）。例えば、ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞において抗体を組換え産生することによる、二分された糖鎖レベルの増加もＡＤＣＣ活性を増加させることが判明している（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６－８０，１９９９を参照されたい）。
他の実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体のグリコシル化を、１つ以上のグリコシル化部位を例えば抗体のＦｃ領域から除くことによって減少又は排除する。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体は、アグリコシル化ヒトモノクローナル抗体、例えばアグリコシル化ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体である。Ｎ結合グリコシル化部位を排除又は改変するアミノ酸置換により、抗体のＮ結合グリコシル化を減少又は排除することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体は、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ａ又はＮ２９７ＧなどのＮ２９７の位置（ＥＵ番号付けスキームによる）での重鎖変異を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、Ｎ２９７の位置に変異を有するヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。特定の一実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、Ｎ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、配列番号３２４の配列を含む重鎖定常領域を含む。
Ｎ２９７変異を含む分子の安定性を改善するために、抗ＰＡＣ１抗体のＦｃ領域を更に操作することができる。例えば、いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域における１つ以上のアミノ酸は、二量体状態のジスルフィド結合形成を促進するためにシステインで置換される。したがって、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＶ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３又はＩ３３２（ＥＵ番号付けスキームによる）に対応する残基がシステインで置換され得る。好ましくは、残基の特定の対が互いにジスルフィド結合を優先的に形成するようにシステインで置換し、それによってジスルフィド結合のスクランブルを制限又は防止する。好ましい対としては、Ａ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ並びにＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体は、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃの変異を有するヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。このような実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｎ２９７Ｇ変異などのＮ２９７変異も含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体は、配列番号３２５の配列を含む重鎖定常領域を含む。
血清半減期を増加させるための本発明の抗ＰＡＣ１抗体の改変は、例えば、サルベージ受容体結合エピトープの組み込み若しくは追加（例えば、適切な領域の変異によるか、又はエピトープをペプチドタグに組み込み、次いで例えばＤＮＡ若しくはペプチド合成により、いずれかの末端又は中央で抗体に融合されることによる；例えば、国際公開第９６／３２４７８号パンフレットを参照されたい）又はＰＥＧ若しくは他の水溶性ポリマー、例えば多糖ポリマーなどの追加によっても所望され得る。サルベージ受容体結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃ領域の１つ又は２つのループ由来の任意の１つ以上のアミノ酸残基が抗体中の類似の位置に転移される領域を構成する。より一層好ましくは、Ｆｃ領域の１つ又は２つのループ由来の３つ以上の残基が転移される。更により好ましくは、エピトープがＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ領域）のＣＨ２ドメインから取られ、抗体のＣＨ１、ＣＨ３若しくはＶＨ領域又は２つ以上のそのような領域に移される。代わりに、エピトープがＦｃ領域のＣＨ２ドメインから取られ、抗体のＣＬ領域若しくはＶＬ領域又はその両方に移される。Ｆｃバリアント及びサルベージ受容体とのそれらの相互作用の説明については、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット及び国際公開第９６／３２４７８号パンフレットを参照されたい。
本発明は、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片をコードする１つ以上の単離されたポリヌクレオチド又は単離された核酸を含む。加えて、本発明は、核酸を含むベクター、核酸を含む宿主細胞又は細胞株及び本発明の抗ＰＡＣ１抗体並びに抗原結合断片を作製する方法を包含する。核酸は、例えば、抗体又は抗原結合断片の全部又は一部、例えば本発明の抗体の一方若しくは両方の鎖又はその断片、誘導体若しくはバリアントをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定、分析、変異又は増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー又はシークエンシングプライマーとして使用するのに十分なポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド及び上記の相補的配列を含む。核酸は、所望の使用又は機能に適した長さであり得、１つ以上の更なる配列、例えば調節配列を含み得、且つ／又はより大きい核酸、例えばベクターの一部であり得る。本発明の核酸分子には、一本鎖及び二本鎖の両方の形態のＤＮＡ及びＲＮＡ並びに対応する相補的配列が含まれる。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明の核酸分子には、全長遺伝子又はｃＤＮＡ分子並びにそれらの断片の組み合わせが含まれる。本発明の核酸は、ヒト供給源及び非ヒト種に由来し得る。
免疫グロブリン又はその領域（例えば、可変領域、Ｆｃ領域など）又は目的のポリペプチド由来の関連するアミノ酸配列は、直接タンパク質配列決定法によって決定され得、及び好適なコードヌクレオチド配列は、普遍コドン表に従って設計され得る。代わりに、本発明のモノクローナル抗体又はその結合断片をコードするゲノム若しくはｃＤＮＡは、従来の手順を使用して、（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）このような抗体を産生する細胞から単離して、配列決定することができる。
本明細書において「単離されたポリヌクレオチド」と互換的に使用される「単離された核酸」は、天然に存在する供給源から単離された核酸の場合、核酸が単離された生物のゲノムに存在する隣接遺伝子配列から分離された核酸である。例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子又はオリゴヌクレオチドなど、鋳型から酵素的に又は化学的に合成された核酸の場合、このようなプロセスから得られる核酸は、単離された核酸であると理解される。単離された核酸分子は、別個の断片の形態の核酸分子又はより大きい核酸構築物のコンポーネントとしての核酸分子を指す。好ましい一実施形態では、核酸は、混入する内因性物質を実質的に含まない。核酸分子は、好ましくは、実質的に純粋な形態において且つ標準的な生化学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に概説されるもの）によるそのコンポーネントヌクレオチド配列の同定、操作及び回収を可能にする量又は濃度において、少なくとも１回単離されたＤＮＡ又はＲＮＡから誘導されている。このような配列は、好ましくは、典型的には真核生物遺伝子に典型的に存在する内部非翻訳配列又はイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供及び／又は構築される。翻訳されないＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’又は３’に存在することができ、この場合、これは、コード領域の操作又は発現を妨害しない。特に明記しない限り、本明細書で考察する任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は、５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写産物の５’から３’への産生の方向は、転写方向と呼ばれ、ＲＮＡ転写産物の５’末端の５’側にあるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれ、ＲＮＡ転写産物の３’末端の３’側にあるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。
本発明は、中程度にストリンジェントな条件下、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下において、本明細書中に記載されるようなポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする核酸も含む。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響する基本パラメータ及び好適な条件を考案するためのガイダンスは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ ９ ａｎｄ １１；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．１０ ａｎｄ ６．３－６．４）によって示されており、例えば、ＤＮＡの長さ及び／又は塩基組成に基づいて当業者が容易に決定することができる。中程度にストリンジェントな条件を達成する１つの方法は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、約５０％ホルムアミドのハイブリダイゼーションバッファー、６×ＳＳＣ及び約５５℃のハイブリダイゼーション温度を含む前洗浄溶液（又は約４２℃のハイブリダイゼーション温度を有する約５０％ホルムアミドを含有するものなどの他の類似のハイブリダイゼーション溶液）並びに０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける約６０℃の洗浄条件の使用を含む。一般に、高度にストリンジェントな条件は、約６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する以外、上記のようなハイブリダイゼーション条件として定義される。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４及び１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）である）をハイブリダイゼーションバッファー及び洗浄バッファー中のＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び１５ｍＭクエン酸ナトリウム）に置き換えることができ、ハイブリダイゼーションが完了した後、１５分間洗浄を行う。当業者に知られており、以下に更に記載するように、ハイブリダイゼーション反応及び二重鎖安定性を支配する基本原理を適用することにより、所望の程度のストリンジェンシーを達成するために、洗浄温度及び洗浄塩濃度を必要に応じて調節し得ることが理解されるべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。
核酸を未知の配列の標的核酸にハイブリダイズさせる場合、ハイブリッド長は、ハイブリダイズする核酸の長さであると仮定する。既知の配列の核酸をハイブリダイズする場合、ハイブリッド長は、核酸の配列を整列させ、最適な配列相補性の領域又は領域群を同定することによって決定することができる。長さが５０塩基対未満であると予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５～１０℃低くなければならず、ここで、Ｔｍは、以下の式に従って決定される。長さが１８塩基対未満のハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。長さが１８塩基対を超えるハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－（６００／Ｎ）（式中、Ｎは、ハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーションバッファー中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ））。好ましくは、このようなハイブリダイズする核酸の各々は、少なくとも１５ヌクレオチド（又はより好ましくは、少なくとも１８ヌクレオチド、若しくは少なくとも２０ヌクレオチド、若しくは少なくとも２５ヌクレオチド、若しくは少なくとも３０ヌクレオチド、若しくは少なくとも４０ヌクレオチド又は最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド）或いはそれがハイブリダイズする本発明の核酸の長さの少なくとも２５％（より好ましくは、少なくとも５０％、若しくは少なくとも６０％、若しくは少なくとも７０％及び最も好ましくは少なくとも８０％）である長さを有し、且つそれがハイブリダイズする本発明の核酸と少なくとも６０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％及び最も好ましくは少なくとも９９．５％）を有する。ここで、配列同一性は、上でより詳細に記載されたように、配列ギャップを最小化しながら、重複及び同一性が最大となるように整列させたときのハイブリダイズする核酸の配列を比較することによって決定される。
本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片のバリアントは、ポリペプチドをコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的変異導入によって調製することができ、カセット若しくはＰＣＲ変異導入又は当該技術分野でよく知られた他の技術、例えば実施例３で記載されているものなどを使用して、バリアントをコードするＤＮＡを産生し、その後、本明細書に概説するように、細胞培養において組換えＤＮＡを発現する。しかし、約１００～１５０個までの残基を有するバリアントＣＤＲを含む抗体又は抗原結合断片は、確立された技術を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでの合成によって調製することができる。バリアントは、典型的には、天然に存在するアナログと同じ定性的な生物学的活性、例えば抗原への結合を示す。このようなバリアントは、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入、及び／又は置換を含む。欠失、挿入及び置換のいずれかの組み合わせは、最終構築物が所望の特徴を有するのであれば、その最終構築物に到達するようになされる。アミノ酸の変化は、グリコシル化部位の数又は位置の変化などの抗体の翻訳後プロセスも変え得る。特定の実施形態では、抗体バリアントは、エピトープ結合に直接関与するアミノ酸残基を改変する目的で調製される。他の実施形態では、エピトープ結合に直接関与しない残基又はエピトープ結合に何ら関与しない残基の改変は、本明細書で論じる目的のために望ましい。ＣＤＲ領域及び／又はフレームワーク領域のいずれかにおける変異誘発が意図される。抗体のアミノ酸配列における有用な改変を設計するために、当業者は、共変異分析技術を使用することができる。例えば、Ｃｈｏｕｌｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ４１：４７５－４８４，２０００；Ｄｅｍａｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：４１－４８，２００４；Ｈｕｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １６（５）：３８１－８６，２００３；Ａｕｒｏｒａ ｅｔ ａｌ．、米国特許出願公開第２００８／０３１８２０７Ａ１号明細書；Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許出願公開第２００９／００４８１２２Ａ１号明細書；Ｕｒｅｃｈ ｅｔ ａｌ．、国際公開第２００８／１１０３４８Ａ１号パンフレット；Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．、国際公開第２００９／００００９９Ａ２号パンフレットを参照されたい。共変異分析によって決定されるそのような改変は、抗体の効力、薬物動態、薬力学及び／又は製造性の特性を向上させることができる。
表４Ａ及び４Ｂは、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体の完全長及び重鎖をそれぞれコードする例示的な核酸配列を示す。表５Ａ及び５Ｂは、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をそれぞれコードする例示的な核酸配列を示す。抗ＰＡＣ１可変領域をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ任意選択的に表２及び３に列挙した軽鎖及び重鎖定常領域をコードする核酸と共に使用して、本発明の抗体及び抗原結合断片を構築することができる。
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本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片をコードする単離された核酸は、表４Ａ、４Ｂ、５Ａ及び５Ｂに列挙したヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一又は少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体軽鎖可変領域をコードする単離された核酸は、配列番号３２８～３４２から選択される配列と少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一又は少なくとも９８％同一である配列を含む。他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体軽鎖可変領域をコードする単離された核酸は、配列番号３４３～３６３から選択される配列と少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一又は少なくとも９８％同一である配列を含む。特定の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体軽鎖可変領域をコードする単離された核酸は、配列番号３２８～３４２から選択される配列を含む。特定の他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体軽鎖可変領域をコードする単離された核酸は、配列番号３４３～３６３から選択される配列を含む。関連する実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体重鎖可変領域をコードする単離された核酸は、配列番号３６４～４６８から選択される配列と少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一又は少なくとも９８％同一である配列を含む。他の関連する実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体重鎖可変領域をコードする単離された核酸は、配列番号４６９～４８５から選択される配列と少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一又は少なくとも９８％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体重鎖可変領域をコードする単離された核酸は、配列番号３６４～４６８から選択される配列を含む。他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体重鎖可変領域をコードする単離された核酸は、配列番号４６９～４８５から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体軽鎖をコードする単離された核酸は、配列番号５３７～５４１から選択される配列と少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一又は少なくとも９８％同一である配列を含む。他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体軽鎖をコードする単離された核酸は、配列番号５４２～５５１から選択される配列と少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一又は少なくとも９８％同一である配列を含む。特定の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体軽鎖をコードする単離された核酸は、配列番号５３７～５４１から選択される配列を含む。特定の他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体軽鎖をコードする単離された核酸は、配列番号５４２～５５１から選択される配列を含む。関連する実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体重鎖をコードする単離された核酸は、配列番号５５２～５６２から選択される配列と少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一又は少なくとも９８％同一である配列を含む。他の関連する実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体重鎖をコードする単離された核酸は、配列番号５６３～５６９から選択される配列と少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一又は少なくとも９８％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体重鎖をコードする単離された核酸は、配列番号５５２～５６２から選択される配列を含む。他の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体重鎖をコードする単離された核酸は、配列番号５６３～５６９から選択される配列を含む。
表４Ａ、４Ｂ、５Ａ及び５Ｂに示す核酸配列は例示に過ぎない。当業者に理解されるように、遺伝コードの縮重のために、極めて多数の核酸が作製され得、それらの全ては、本明細書に記載の抗体及び抗原結合断片のＣＤＲ、可変領域並びに重鎖及び軽鎖又は他のコンポーネントをコードする。したがって、特定のアミノ酸配列を同定したら、当業者は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化させない方法で１つ以上のコドンの配列を単に改変することにより、任意の数の異なる核酸を作製し得るであろう。
本発明は、本発明の抗体又は抗原結合断片の１つ以上の構成要素（例えば、可変領域、軽鎖及び重鎖）をコードする１つ以上の核酸を含むベクターも含む。用語「ベクター」は、タンパク質コード情報を宿主細胞に移入するために使用される任意の分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス）を指す。ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター及び発現ベクター、例えば組換え発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される用語「発現ベクター」又は「発現構築物」は、特定の宿主細胞における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要である、所望のコード配列及び適切な核酸制御配列を含む組換えＤＮＡ分子を指す。発現ベクターは、転写、翻訳に影響を及ぼすか又はそれを制御し、且つイントロンが存在する場合、それに作動可能に連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列を含み得るが、これらに限定されない。原核生物での発現に必要な核酸配列には、プロモーター、任意選択的にオペレーター配列、リボソーム結合部位及び場合により他の配列が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー並びに終結及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
目的のコード配列に作動可能に連結された分泌シグナルペプチド配列も、任意選択的に発現ベクターによってコードされ得、その結果、必要に応じて細胞から目的ポリペプチドがより容易に単離されるように、組換え宿主細胞に発現ポリペプチドを分泌させることができる。例えば、いくつかの実施形態では、シグナルペプチド配列は、表１Ａ及び１Ｂに列挙された可変領域ポリペプチド配列のいずれか又は表４Ａ及び４Ｂに列挙された完全長鎖ポリペプチドのいずれかのアミノ末端に付加／融合され得る。特定の実施形態では、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ（配列番号４８６）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドは、表１Ａ及び１Ｂの可変領域ポリペプチド配列又は表４Ａ及び４Ｂの完全長鎖ポリペプチドのいずれかのアミノ末端に融合される。他の実施形態では、ＭＡＷＡＬＬＬＬＴＬＬＴＱＧＴＧＳＷＡ（配列番号４８７）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドは、表１Ａ及び１Ｂの可変領域ポリペプチド配列又は表４Ａ及び４Ｂの完全長鎖ポリペプチドのいずれかのアミノ末端に融合される。更に他の実施形態では、ＭＴＣＳＰＬＬＬＴＬＬＩＨＣＴＧＳＷＡ（配列番号４８８）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドは、表１Ａ及び１Ｂの可変領域ポリペプチド配列又は表４Ａ及び４Ｂの完全長鎖ポリペプチドのいずれかのアミノ末端に融合される。本明細書に記載の可変領域ポリペプチド配列又は完全長鎖ポリペプチド配列のアミノ末端に融合され得る他の好適なシグナルペプチド配列としては、ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号４８９）、ＭＥＷＴＷＲＶＬＦＬＶＡＡＡＴＧＡＨＳ（配列番号４９０）、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号４９１）、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号４９２）、ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ（配列番号４９３）、ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号４９４）、ＭＤＩＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＫＣ（配列番号４９５）、ＭＤＩＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ（配列番号４９６）、ＭＤＴＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＴＦ（配列番号４９７）、ＭＤＴＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ（配列番号４９８）、ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣ（配列番号４９９）、ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣＱＥ（配列番号５００）及びＭＤＭＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ（配列番号５０１）が挙げられる。他のシグナル又は分泌ペプチドは、当業者に知られており、例えば特定の宿主細胞における発現を促進又は最適化するために、表１Ａ及び１Ｂに列挙された可変領域ポリペプチド鎖又は表４Ａ及び４Ｂの完全長鎖ポリペプチドのいずれかに融合され得る。
典型的には、本発明の抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片を産生するために宿主細胞中で使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための配列並びに抗体及び抗原結合断片のコンポーネントをコードする外因性ヌクレオチド配列のクローニング及び発現のための配列を含む。特定の実施形態において集合的に「フランキング配列」と呼ばれるこのような配列は、典型的には、以下のヌクレオチド配列：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナー及びアクセプタースプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域並びに選択マーカーエレメントの１つ以上を含む。これらの配列の各々を以下に論じる。
任意選択的に、ベクターは、「タグ」コード配列、すなわちポリペプチドコード配列の５’又は３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含み得、このオリゴヌクレオチドタグ配列は、ポリＨｉｓ（ｈｅｘａＨｉｓなど）、ＦＬＡＧ、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）、ｍｙｃ又は商業的に入手可能な抗体が存在する別の「タグ」分子をコードする。このタグは、典型的には、ポリペプチドの発現時にポリペプチドに融合され、宿主細胞由来のポリペプチドの親和性精製又は検出のための手段として機能し得る。親和性精製は、例えば、親和性マトリックスとしてタグに対する抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによって達成され得る。任意選択的に、その後、特定の切断用ペプチダーゼを使用するなどの様々な手段により、精製されたポリペプチドからタグを除去することができる。
フランキング配列は、同種（すなわち宿主細胞と同じ種及び／又は株由来）、異種（すなわち宿主細胞種又は株以外の種由来）、ハイブリッド（すなわち２つ以上の供給源由来のフランキング配列の組み合わせ）、合成又は天然であり得る。したがって、フランキング配列の供給源は、そのフランキング配列が宿主細胞機構において機能的であり、且つ宿主細胞機構によって活性化され得ることを条件として、任意の原核生物若しくは真核生物、任意の脊椎生物若しくは無脊椎生物又は任意の植物であり得る。
本発明のベクターに有用なフランキング配列は、当該技術分野でよく知られたいくつかの方法のいずれかによって得ることができる。典型的には、本明細書において有用なフランキング配列は、マッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、したがって適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して適切な組織供給源から単離することができる。いくつかの場合、フランキング配列の完全なヌクレオチド配列が既知であり得る。本明細書では、フランキング配列は、核酸合成又はクローニングに日常的に行われている方法を使用して合成することができる。
フランキング配列は、その全てが知られているか又は一部のみが知られているかに関わらず、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、且つ／又はゲノムライブラリを同じ種又は別の種由来のオリゴヌクレオチド及び／又はフランキング配列断片などの好適なプローブでスクリーニングすることによって得ることができる。フランキング配列が知られていない場合、フランキング配列を含むＤＮＡの断片を、例えばコード配列又は別の遺伝子を含み得るＤＮＡのより大きい断片から単離することができる。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適当なＤＮＡ断片を生成し、続いてアガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）又は当業者に知られた他の方法を使用して単離することにより達成され得る。この目的の達成に好適な酵素の選択は、当業者に容易に分かるであろう。
典型的には、複製起点は、商業的に購入された原核生物の発現ベクターの一部であり、起点は、宿主細胞におけるベクターの増幅を補助する。選択したベクターが複製部位の起点を含まない場合、既知の配列に基づいて化学的に合成し、ベクターに結合することができる。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に好適であり、種々のウイルス起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）又はＨＰＶ若しくはＢＰＶなどのパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングに有用である。一般に、複製コンポーネントの起点は、哺乳動物発現ベクターに必要ではない（例えば、ＳＶ４０起点は、それがウイルス初期プロモーターも含むという理由からのみ、多くの場合に使用される）。
転写終止配列は、典型的には、ポリペプチドコード領域の３’側末端に位置し、転写を終結させる役割を果たす。通常、原核細胞における転写終止配列は、Ｇ－Ｃに富む断片とそれに続くポリＴ配列である。この配列は、ライブラリから容易にクローニングされるか、又はベクターの一部として商業的に購入されるが、知られた核酸合成の方法を使用して容易に合成することもできる。
選択マーカー遺伝子は、選択培養培地中で増殖させた宿主細胞の生存及び増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核宿主細胞に、抗生物質又は他の毒素、例えばアンピシリン、テトラサイクリン又はカナマイシンに対する耐性を付与するか；（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完するか；又は（ｃ）複合培地又は限定培地から利用できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。特異的選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利には、ネオマイシン耐性遺伝子は、原核宿主細胞及び真核宿主細胞の両方でも選択に使用され得る。
他の選択遺伝子を用いて、発現する遺伝子を増幅し得る。増幅は、増殖又は細胞生存に重要なタンパク質の産生に必要とされる遺伝子が組換え細胞の累代の染色体内でタンデムに繰り返されるプロセスである。哺乳動物細胞に好適な選択マーカーの例には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びプロモーターレスチミジンキナーゼ遺伝子が含まれる。哺乳動物細胞形質転換体を、この形質転換体のみがベクター中に存在する選択可能な遺伝子によって生存するように特異的に適合されている選択圧下に置く。選択圧は、培地中の選択剤の濃度が連続的に増加する条件下で形質転換された細胞を培養することによって課され、それにより、選択可能な遺伝子と、本明細書中に記載の抗体又は抗原結合断片の１つ以上のコンポーネントなどの別の遺伝子をコードするＤＮＡとの両方の増幅を導く。その結果、増幅されたＤＮＡから多量のポリペプチドが合成される。
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、シャイン・ダルガノ配列（原核生物）又はコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、典型的には、プロモーターの３’及び発現されるポリペプチドのコード配列の５’に位置する。特定の実施形態では、１つ以上のコード領域は、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結され得、単一のＲＮＡ転写物から２つのオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする。
真核宿主細胞発現系においてグリコシル化が所望される場合などのいくつかの場合、グリコシル化又は収率を向上させるために種々のプレ配列又はプロ配列を操作し得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を改変するか、又はプロ配列を付加することができ、これもグリコシル化に影響し得る。最終タンパク質産物は、－１位（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）に、発現に付随する１つ以上の更なるアミノ酸を有し得、これは、完全には除去されていなかった可能性がある。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ切断部位に見出される１個又は２個のアミノ酸残基を有し得る。代わりに、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域で切断する場合、いくつかの酵素切断部位の使用は、所望のポリペプチドのわずかに切断された形態を生じ得る。
本発明の発現ベクター及びクローニングベクターは、典型的には、宿主生物によって認識され、ポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。本明細書で使用される用語「作動可能に連結された」は、所与の遺伝子の転写及び／又は所望のタンパク質分子の合成を指令することができる核酸分子が生成されるような方法で２つ以上の核酸配列が連結されていることを指す。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結された」ベクター中の制御配列は、タンパク質コード配列の発現が制御配列の転写活性と適合する条件下で行われるようにタンパク質コード配列に連結されている。より具体的には、プロモーター及び／又はエンハンサー配列（シス作用性転写制御エレメントの任意の組み合わせを含む）は、それが適切な宿主細胞又は他の発現系においてコード配列の転写を刺激又は調節する場合、そのコード配列に作動可能に連結されている。
プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流（すなわち５’）に位置する非転写配列（一般に約１００～１０００ｂｐ以内）であり、構造遺伝子の転写を制御する。通常、プロモーターは、２つのクラス：誘導性プロモーター及び構成的プロモーターの一方に分類される。誘導性プロモーターは、栄養素の有無又は温度の変化などの培養条件の何らかの変化に応じて、その制御下でＤＮＡからの転写レベルの増加を開始する。一方、構成的プロモーターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子を均一に、すなわち遺伝子発現に対する制御をほとんど又は全く行わずに転写する。種々の潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターがよく知られている。好適なプロモーターは、制限酵素消化により供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、所望のプロモーター配列をベクターに挿入することにより、例えば本発明の抗体及び抗原結合断片の重鎖、軽鎖又は他のコンポーネントをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。
酵母宿主と共に使用するのに好適なプロモーターも当該技術分野において周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞と共に使用するのに好適なプロモーターは、よく知られており、以下に限定されるものではないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス血清型２、８又は９など）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものが含まれる。他の好適な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター、例えば熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターが挙げられる。
興味深い更なる特定プロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４－３１０）；ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｒｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９－６６３）；ラウス羅臼肉腫ウイルスの３’側の長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８０、Ｃｅｌｌ２２：７８７－７９７）；ヘルパスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４－１４４５）；メタロチオニン遺伝子由来のプロモーター及び調節配列（Ｐｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９－４２）；及びβ－ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物プロモーター（Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７－３７３１）；又はｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１－２５）が挙げられるが、これらに限定されない。組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用されている以下の動物転写制御領域も対象とする：膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９－６４６；Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９－４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５－５１５）；膵β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５－１２２）；リンパ細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７－６５８；Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３－５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６－１４４４）；精巣、乳房、リンパ球及び肥満細胞において活性であるマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５－４９５）；肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８－２７６）；肝臓において活性であるα－フェト－タンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９－１６４８；Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：５３－５８）；肝臓において活性であるα１－アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１－１７１）；骨髄細胞において活性であるβグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８－３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９－９４）；脳におけるオリゴデンドロサイト細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３－７１２）；骨格筋において活性であるミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３－２８６）；及び視床下部において活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２－１３７８）。
エンハンサー配列をベクターに挿入して、高等真核生物による抗体又は抗原結合断片のコンポーネント（例えば、軽鎖、重鎖又は可変領域）をコードするＤＮＡの転写を増加させることができる。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写を増加させる、通常、約１０～３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、方向及び位置に比較的依存せず、転写単位に対して５’及び３’の両方の位置に見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェト－タンパク質及びインスリン）。しかし、典型的には、ウイルス由来のエンハンサーが使用される。当該技術分野で知られているＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサーは、コード配列に対して５’又は３’でベクター中に位置し得るが、一般的にはプロモーターの５’の部位に位置する。適切な天然又は異種のシグナル配列（リーダー配列又はシグナルペプチド）をコードする配列を発現ベクターに組み込んで、上記のような抗体又は抗原結合断片の細胞外分泌を促進することができる。シグナルペプチド又はリーダーの選択は、抗体又は抗原結合断片を産生する宿主細胞の型に依存し、天然のシグナル配列を異種性のシグナル配列と交換することができる。シグナルペプチドの例は、上に記載されている。哺乳動物宿主細胞において機能する他のシグナルペプチドとしては、米国特許第４，９６５，１９５号明細書に記載されるインターロイキン－７（ＩＬ－７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８に記載されるインターロイキン－２受容体のシグナル配列；欧州特許第０３６７ ５６６号明細書に記載されるインターロイキン－４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号明細書に記載されるＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチド；欧州特許第０ ４６０ ８４６号明細書に記載されるＩＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチドが挙げられる。
提供される発現ベクターは、市販のベクターなどの出発ベクターから構築され得る。このようなベクターは、所望のフランキング配列の全てを含むことも含まないこともあり得る。本明細書に記載のフランキング配列の１つ以上がベクター中に依然として存在しない場合、それらを個別に得て、ベクターに結合させることができる。フランキング配列の各々を得るために使用される方法は、当業者に周知である。発現ベクターを宿主細胞に導入し、それにより、本明細書に記載の核酸によってコードされる抗体及び抗原結合断片を含むタンパク質を産生することができる。
特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片の異なるコンポーネントをコードする核酸を同じ発現ベクターに挿入し得る。例えば、抗ＰＡＣ１抗体軽鎖又は可変領域をコードする核酸を、抗ＰＡＣ１抗体重鎖又は可変領域をコードする核酸と同じベクターにクローニングすることができる。そのような実施形態では、軽鎖及び重鎖が同じｍＲＮＡ転写物から発現されるように、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により、且つ単一のプロモーターの制御下で２つの核酸が分離され得る。代わりに、２つの核酸は、軽鎖及び重鎖が２つの別個のｍＲＮＡ転写物から発現されるように２つの別個のプロモーターの制御下にあり得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体軽鎖又は可変領域をコードする核酸が１つの発現ベクターにクローニングされ、抗ＰＡＣ１抗体重鎖又は可変領域をコードする核酸が第２の発現ベクターにクローニングされる。このような実施形態では、宿主細胞は、本発明の完全な抗体又は抗原結合断片を産生するために、両方の発現ベクターで同時トランスフェクトされ得る。
ベクターが構築され、本明細書に記載の抗体及び抗原結合断片のコンポーネントをコードする１つ以上の核酸分子がベクターの適当な部位に挿入された後、完成したベクターは、増幅及び／又はポリペプチド発現に好適な宿主細胞に挿入され得る。したがって、本発明は、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片のコンポーネントをコードする１つ以上の発現ベクターを含む単離された宿主細胞又は細胞株を包含する。本明細書で使用される用語「宿主細胞」は、核酸で形質転換されているか、又は形質転換され得、それによって目的遺伝子を発現する細胞を指す。この用語には、目的遺伝子が存在する限り、子孫の形態又は遺伝的構成が元の親細胞と同一であるか否かに関わらず、親細胞の子孫が含まれる。好ましくは少なくとも１つの発現制御配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）に作動可能に連結された本発明の単離された核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」である
抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片のための発現ベクターの選択宿主細胞への形質転換は、遺伝子導入、感染、リン酸カルシウムによる共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介型遺伝子導入又は他の既知の手法を含む、よく知られる方法によって達成することができる。選択される方法は、部分的に、使用される宿主細胞の型の機能であろう。これらの方法及び他の好適な方法は、当業者によく知られており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１に記載されている。
宿主細胞は、適切な条件下で培養されると、抗体又は抗原結合断片を合成し、これは、続いて、培養培地（宿主細胞がそれを培地中に分泌する場合）から、又はそれを産生する宿主細胞（それが分泌されない場合）から直接回収され得る。適切な宿主細胞の選択は、所望する発現レベル、活性（グリコシル化又はリン酸化など）のために所望されるか又は必要であるポリペプチドの改変及び生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さなどの種々の因子によるであろう。
例示的な宿主細胞としては、原核生物、酵母又は高等真核生物細胞が挙げられる。原核生物の宿主細胞としては、グラム陰性又はグラム陽性微生物などの真正細菌、例えば腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えばサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えばセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及びシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）並びにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えばＢ．ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）及びストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。真核生物の微生物、例えば糸状菌又は酵母は、組換えポリペプチドに好適な適切なクローニング宿主又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかしながら、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、例えばＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トリコデルマ・レシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、シュヴァンニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュヴァンニオミセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）並びに糸状菌、例えばニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えばＡ．ニドゥランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などの多くの他の属、種及び株が一般に利用可能であり、ここで有用である、
グリコシル化抗体及び抗原結合断片の発現のための宿主細胞は、多細胞生物由来であり得る。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株及びバリアント並びにツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモ虫）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。このような細胞のトランスフェクションのための種々のウイルス株、例えばオートグラファカリフォルニアＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶ）のＬ－１変異体及びカイコＮＰＶ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶ）のＢｍ－５株が公に入手可能である。
脊椎動物宿主細胞も好適な宿主であり、このような細胞由来の抗体及び抗原結合断片の組換え産生は、常法となっている。発現の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野でよく知られており、限定されないが、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株、例えば、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４及びチャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６，１９８０）；ＳＶ４０（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（懸濁培養液中の増殖用としてサブクローニングされた２９３又は２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１，１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８，１９８２）；ＭＲＣ ５細胞又はＦＳ４細胞；哺乳動物骨髄腫細胞及び多くの他の細胞株が挙げられる。特定の実施形態では、ＰＡＣ１結合特性を有する抗体及び抗原結合断片をいずれの細胞株が高レベルで発現し、恒常的に産生するかを決定することによって細胞株を選択し得る。別の実施形態では、それ自体の抗体を作製しないが、異種抗体を作製し、分泌する能力を有する、Ｂ細胞系列由来の細胞株を選択することができる。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞は、本発明の抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片の発現に好ましい宿主細胞である。
宿主細胞は、抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片の産生のために、上記の核酸又はベクターで形質転換又はトランスフェクトされ、プロモーターの誘導、形質転換体の選択又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に改変された従来の栄養培地中で培養される。更に、選択マーカーによって分離された転写単位の複数のコピーを有する新規ベクター及びトランスフェクトされた細胞株は、抗体及び抗原結合断片の発現に特に有用である。したがって、本発明は、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片を生成するための方法であって、本明細書に記載の１つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞を、１つ以上の発現ベクターによってコードされる抗体又は抗原結合断片の発現を可能にする条件下において培養培地中で培養することと；培養培地又は宿主細胞から抗体又は抗原結合断片を回収することとを含む方法も提供する。
本発明の抗体又は抗原結合断片を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに適している。更に、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４，１９７９；Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５，１９８０；米国特許第４，７６７，７０４号明細書；同第４，６５７，８６６号明細書；同第４，９２７，７６２号明細書；同第４，５６０，６５５号明細書；若しくは同第５，１２２，４６９号明細書；国際公開第９０１０３４３０号パンフレット；国際公開第８７／００１９５号パンフレット；又は米国再発行特許第３０，９８５号明細書に記載される培地のいずれかを宿主細胞の培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれかは、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の成長因子（インスリン、トランスフェリン又は上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩など）、バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）薬剤）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）並びにグルコース又は同等のエネルギー源を補充され得る。任意の他の必要な栄養補助物質も、当業者に知られる適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者に明らかであろう。
宿主細胞を培養すると、抗体又は抗原結合断片は、細胞内、細胞膜周辺腔内で産生されるか、又は培地中に直接分泌され得る。抗体又は抗原結合断片が細胞内で産生される場合、第１の工程として、微粒子の破片、すなわち宿主細胞又は溶解した断片のいずれかを例えば遠心分離又は限外濾過によって除去する。抗体又は抗原結合断片は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、カチオン若しくはアニオン交換クロマトグラフィー好ましくは、親和性リガンドとして目的の抗原又は又はプロテインＡ若しくはプロテインＧを使用するアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２又はγ４重鎖に基づくポリペプチドを含むタンパク質を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３，１９８３）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７－１５７５，１９８６）。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合にアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。コントロールドポアガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。タンパク質がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製に有用である。回収される特定の抗体又は抗原結合断片に応じて、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技術も可能である。
特定の実施形態では、本発明は、本発明の１つ又は複数の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片（例えば、抗ＰＡＣ１モノクローナル抗体又はその結合断片）を薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤、可溶化剤、乳化剤、防腐剤及び／又はアジュバントと共に含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。医薬組成物は、本明細書に記載の方法のいずれかで使用され得る。本発明の医薬組成物としては、液体、凍結及び凍結乾燥組成物が挙げられるが、これらに限定されない。「薬学的に許容される」は、使用する用量及び濃度でヒトレシピエントに対して毒性がなく、且つ／又はヒトに投与したときにアレルギー又は有害な反応を生じない分子、化合物及び組成物を指す。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌状態、安定性、溶解又は放出速度、吸着又は浸透性を修正、維持又は保存するための製剤材料を含有し得る。そのような実施形態では、好適な製剤材料として、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス－ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩又は他の有機酸など）；増量剤（マンニトール又はグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β－シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖類；二糖類；及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）；着色及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトール又はソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤又は湿潤剤（プルロニック（登録商標）、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパールなど）；安定性促進剤（スクロース又はソルビトールなど）；等張化促進剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウム又はカリウム、マンニトールソルビトールなど）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／又は医薬アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。治療的使用のための分子を製剤化するための方法及び好適な材料は、薬学分野において知られており、例えばＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水、静菌水などの標準的な医薬担体を含む。種々の水性担体、例えば水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどを使用することができ、穏やかな化学的改変などに供されるアルブミン、リポタンパク質、グロブリンなど、安定性を高めるための他のタンパク質を含み得る。
製剤中の抗体又は抗原結合断片の例示的な濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約２００ｍｇ／ｍｌ、又は約０．１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、又は約０．５ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬ、又は約２ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。抗体又は抗原結合断片の水性製剤は、例えば、約４．５～約６．５、又は約４．８～約５．５、又は約５．０のｐＨのｐＨ緩衝溶液で調製され得る。この範囲のｐＨに好適なバッファーの例としては、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えば、コハク酸ナトリウム）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩及び他の有機酸バッファーが挙げられる。バッファー濃度は、例えば、バッファー及び製剤の所望の等張性に応じて、約１ｍＭ～約２００ｍＭ又は約１０ｍＭ～約６０ｍＭであり得る。
抗体又は抗原結合断片を安定化させることも可能な等張化剤を製剤に含めることができる。例示的な等張化剤としては、マンニトール、スクロース又はトレハロースなどのポリオールが挙げられる。水性製剤は、高張又は低張溶液も好適であり得るが、等張であることが好ましい。製剤中のポリオールの例示的な濃度は、約１ｗ／ｖ％～約１５ｗ／ｖ％の範囲であり得る。
界面活性剤を製剤に添加して、製剤化抗体又は抗原結合断片の凝集を減少させ、且つ／又は製剤中の粒子の形成を最小限にし、且つ／又は吸着を減少させることもできる。例示的な界面活性剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０）又はポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。界面活性剤の例示的な濃度は、約０．００１ｗ／ｖ％～約０．５ｗ／ｖ％、又は約０．００５ｗ／ｖ％～約０．２ｗ／ｖ％、又は代わりに約０．００４ｗ／ｖ％～約０．０１ｗ／ｖ％の範囲であり得る。
一実施形態では、製剤は、上記の薬剤（すなわち抗体又は抗原結合断片、バッファー、ポリオール及び界面活性剤）を含有し、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、クロロブタノール及び塩化ベンゼトニウムなどの１種以上の防腐剤を実質的に含まない。別の実施形態では、防腐剤は、製剤中に例えば約０．１％～約２％又は代わりに約０．５％～約１％の範囲の濃度で含まれ得る。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙに記載されているような、１種又は複数の他の薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤を、製剤の所望の特性に悪影響を及ぼさない限り、製剤に含めることができる。
抗体又は抗原結合断片の治療製剤は、所望の純度を有する抗体又は抗原結合断片を任意選択的な生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ、ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）と凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で混合することにより、貯蔵のために調製される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、上記記載のもの、例えばバッファー（例えば、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸及びメチオニン）；防腐剤（塩化オクタデシルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール、メチルパラベン若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール及びｍ－クレゾール）；低分子量（例えば、約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン）；グルコース、マンノース、マルトース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；並びに／又はポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０）、若しくはポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
一実施形態では、本発明の好適な製剤は、リン酸塩、酢酸塩又はトリスバッファーなどの等張性バッファーをポリオール、ソルビトール、スクロース又は塩化ナトリウムなどの等張化剤（これは、等張化し、安定化する）と組み合わせて含有する。このような等張化剤の一例は、５％ソルビトール又はスクロースである。更に、製剤は、任意選択的に、例えば凝集の防止又は安定性の改善のために界面活性剤を０．０１ｗｔ／ｖｏｌ％～０．０２ｗｔ／ｖｏｌ％含むことができる。製剤のｐＨは、４．５～６．５又は４．５～５．５の範囲であり得る。抗体及び抗原結合断片のための医薬製剤の他の例示的な説明は、米国特許出願公開第２００３／０１１３３１６号明細書及び米国特許第６，１７１，５８６号明細書に見出すことができ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。本発明の組成物は、従来のよく知られた滅菌技術によって滅菌され得る。例えば、滅菌は、滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。得られた溶液は使用のために包装されるか、又は無菌条件下で濾過されて凍結乾燥され得、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌溶液と組み合わされる。
凍結乾燥プロセスは、特にポリペプチドが液体組成物中で比較的不安定である場合、ポリペプチドを長期保存に対し安定化するために多くの場合に使用される。凍結乾燥サイクルは、通常、３つの工程：凍結、一次乾燥及び二次乾燥からなる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｐｏｌｌｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ３８、Ｎｕｍｂｅｒ ２，ｐａｇｅｓ ４８－５９，１９８４を参照されたい）。凍結工程では、溶液を十分に凍結されるまで冷却する。溶液中のバルク水がこの段階で氷を形成する。氷は、真空を用いて氷の蒸気圧未満にチャンバー圧力を低下させることによって行われる一次乾燥段階で昇華する。最後に、吸着又は結合した水は、第２の乾燥段階において、減圧したチャンバー圧力及び高い棚温度下で除去される。このプロセスにより、凍結乾燥ケーキとして知られる物質が生成される。その後、ケーキを使用前に再構成することができる。凍結乾燥物質の標準的な再構成の方法は、ある量の純水（通常、凍結乾燥中に除去された量に等しい）を添加することであるが、非経口投与のための医薬の製造では抗菌剤の希釈溶液がときに使用される（Ｃｈｅｎ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １８：１３１１－１３５４，１９９２を参照されたい）。
場合により、賦形剤が凍結乾燥製品の安定剤として作用することが知られている（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖｏｌｕｍｅ ７４：２２５－２３９，１９９１を参照されたい）。例えば、知られている賦形剤としては、ポリオール（マンニトール、ソルビトール及びグリセロールを含む）；糖（グルコース及びスクロースを含む）；及びアミノ酸（アラニン、グリシン及びグルタミン酸を含む）が挙げられる。更に、ポリオール及び糖類は、凍結及び乾燥により誘発される損傷からポリペプチドを保護し、乾燥状態での貯蔵中の安定性を高めるためにもよく使用される。一般に、糖類、特に二糖類は、凍結乾燥プロセス及び貯蔵中の両方において有効である。単糖類及び二糖類並びにＰＶＰなどのポリマーを含む他のクラスの分子も凍結乾燥製品の安定剤として報告されている。
注射のために、医薬製剤及び／又は薬剤は、上記のような適切な溶液で再溶解するのに好適な粉末であり得る。これらの例としては、凍結乾燥、回転乾燥又は噴霧乾燥した粉末、非晶質粉末、顆粒、沈殿物又は粒子が挙げられるが、これらに限定されない。注射のために、製剤は、任意選択的に、安定剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティ調整剤及びこれらの組み合わせを含有し得る。
徐放性製剤が調製され得る。徐放性製剤の好適な例としては、抗体又は抗原結合断片を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態を有する。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ－グルタミン酸とｙエチル－Ｌ－グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニルコポリマー、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマー及びロイプロリド酢酸塩から構成される注射可能なミクロスフェア）などの分解性乳酸－グリコール酸コポリマー及びポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン－酢酸ビニル及び乳酸－グリコール酸などのポリマーは、１００日間を超えて分子を放出できるが、特定のヒドロゲルは、より短い時間にわたってタンパク質を放出する。カプセル化されたポリペプチドが長時間体内に残存する場合、３７℃の水分に曝露される結果として、それらは、変性又は凝集し、生物学的活性の消失及び免疫原性の可能な変化が生じ得る。関与している機構に応じた安定化のための合理的な戦略を立てることができる。例えば、凝集メカニズムがチオ－ジスルフィド交換による分子間のＳ－Ｓ結合の形成であると分かったら、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液の凍結乾燥、水分含量の制御、適切な添加剤の使用及び特定のポリマーマトリックス組成物の開発によって安定化を達成することができる。
本発明の製剤は、本明細書に記載のように、短時間作用性、速放性、長時間作用性又は持続放出性であるように設計することができる。したがって、医薬製剤は、制御放出又は徐放のためにも製剤化され得る。
具体的な用量は、処置される疾患、障害又は状態（例えば、反復性片頭痛、慢性片頭痛又は群発性頭痛）、対象の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食事、用量間隔、投与経路、排泄速度並びに薬物の組み合わせに応じて調節され得る。
本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、非経口、皮下、静脈内、腹腔内、肺内及び鼻腔内を含む任意の好適な手段によって投与され得、また局所治療で所望される場合には病変内投与によって投与され得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内又は皮下投与が挙げられる。更に、抗体又は抗原結合断片は、好適には、パルス注入により、特に抗体又は抗原結合断片の用量を減少させて投与される。投与が短期的なものであるか又は長期的なものであるかにある程度基づき、投与は、注射により行われることが好ましく、静脈内又は皮下注射により行われることが最も好ましい。局所、特に経皮、経粘膜、直腸、経口又は例えば所望の部位の近くに配置されるカテーテルによる局所の投与を含む他の投与方法が意図される。本発明の抗体又は抗原結合断片は、生理的溶液中、毎日から毎週から毎月までの範囲の頻度において０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与され得る。
本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片は、それを必要とする患者における、ＰＡＣ１受容体の生物学的活性に関係する病態の治療又は改善に有用である。したがって、治療方法で使用するための本発明の抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片が本明細書に開示されている。用語「患者」には、ヒト患者が含まれ、用語「対象」と互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「治療する」又は「治療」という用語は、障害の発生を予防するか、又は障害の病状を改変することを意図して行われる介入である。したがって、「治療」は、治療的治療及び予防的又は抑止的手段の両方を指す。治療を必要とする者には、障害若しくは病態と既に診断されているか又はそれを患っている者及び障害又は病態が予防されるべき者が含まれる。「治療」は、損傷、病状又は病態の改善における成功の任意の兆候を含み、こうした兆候には、症状の軽減、寛解、縮小又は損傷、病状若しくは病態の患者耐容性の向上、悪化速度又は衰退速度の鈍化、悪化終点の衰弱軽減又は患者の身体的又は精神的な健全性の改善など、任意の客観的又は主観的なパラメータが含まれる。症状の治療又は改善は、身体検査、患者による自己申告、神経精神医学的検査及び／又は精神医学的評価の結果を含む客観的又は主観的なパラメータに基づき得る。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＡＣ１受容体（例えば、ＰＡＣ１受容体のＰＡＣＡＰ誘導活性化を伴う病態）の生物学的活性に関係する病態の治療又は予防を、それを必要とする患者において行うための方法であって、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片の有効量をその患者に投与することを含む方法を提供する。ＰＡＣＡＰ／ＰＡＣ１シグナル伝達経路は、心臓血管機能、代謝及び内分泌機能、炎症、ストレス応答、血管運動神経緊張度の調節及び自律神経系の調節、特に交感神経系と副交感神経系との間のバランスを含む種々の生理学的プロセスに関係している。例えば、Ｔａｎｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｖｏｌ．１６１：７３－８０，２０１０；Ｍｏｏｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ．，Ｖｏｌ．１８：６１－６７，２０１１；及びＨａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｖｏｌ．１７：９８５－９８９，２０１１を参照されたい。ＰＡＣＡＰ／ＰＡＣ１シグナル伝達経路の異常又は過剰活性化に関連する病態としては、頭痛病態、例えば片頭痛、群発性頭痛、緊張型頭痛、片麻痺性片頭痛及び網膜片頭痛など；炎症性皮膚病態；慢性疼痛、例えば神経障害性疼痛など；不安障害；過敏性腸症候群；並びに血管運動症、例えばほてり、顔面紅潮、発汗及び寝汗などが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本発明の抗ＰＡＣ１抗体及びその抗原結合断片は、これらの病態若しくは障害又は異常若しくは過度のＰＡＣ１受容体の生物学的活性に関連する他の病態のいずれかを予防、改善又は治療するために患者に投与され得る。特定の実施形態では、本発明は、頭痛病態（例えば、反復性片頭痛、慢性片頭痛、群発性頭痛、緊張型頭痛、片麻痺性片頭痛及び網膜片頭痛）の治療又は予防を、それを必要とする患者において行うための方法であって、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片の有効量をその患者に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、頭痛病態を有する患者においてヒトＰＡＣ１受容体の活性化を阻害するための方法であって、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片の有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、患者は、反復性片頭痛又は慢性片頭痛などの片頭痛病態を有する。別の実施形態では、患者は、群発性頭痛病態を有する。
「有効量」は、一般に、症状の重症度及び／若しくは頻度を減少させ、症状及び／若しくは根底にある原因を排除し、症状及び／若しくはその根底にある原因の発生を予防し、且つ／又は特定の病態から生じるか若しくは特定の病態に関連する損傷を改善若しくは修復するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、治療有効量又は予防有効量である。「治療有効量」は、疾患状態若しくは症状、特に疾患状態に関連する状態若しくは症状を治療するのに十分な量又は疾患状態若しくは疾患に関連する他の望ましくない症状の進行をいかなる方法であれ防止、妨害、遅延若しくは逆転させる（すなわち「治療効果」を提供する）のに十分な量である。「予防有効量」は、対象に投与されると、意図した予防効果、例えば病態の発症（又は再発）を防止若しくは遅延させるか、又は病態の発症開始（又は再発）の可能性を減少させる抗体又は抗原結合断片の量である。完全な治療効果又は予防効果は、必ずしも１回用量の投与によって生じる必要はなく、一連の用量の投与後にのみ生じ得る。したがって、治療有効量又は予防有効量は、１回以上の投与で投与され得る。
特定の実施形態では、本発明は、血管拡張の阻害を、それを必要とする患者において行うための方法であって、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片の有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。ＰＡＣ１受容体のリガンド、例えばＰＡＣＡＰ３８及びＶＩＰは、強力な血管拡張剤であり、これらのリガンドのＰＡＣ１受容体への結合をブロックすると、血管拡張を阻害し、異常又は過度な血管拡張、例えば頭痛病態、ほてり及び紅潮などを伴う病態を改善することができる。一実施形態では、患者は、片頭痛又は群発性頭痛などの頭痛病態を有する。別の実施形態では、患者は、血管運動症状（例えば、ほてり、顔面紅潮、発汗及び寝汗）を有する。関連する実施形態では、患者は、閉経に関連する血管運動症を有する。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、治療、予防又は改善される頭痛病態は、片頭痛である。したがって、本発明は、片頭痛の治療、予防又は改善を、それを必要とする患者において行うための方法であって、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片の有効量を患者に投与することを含む方法を含む。片頭痛は、片側性、拍動性及び／若しくは中度～重度の痛み並びに／又は身体活動によって悪化する痛みを特徴とする、約４時間～約７２時間持続する再発性の頭痛である。片頭痛は、多くの場合、吐き気、嘔吐及び／又は光に対する過敏（光恐怖症）、音に対する過敏（音声恐怖症）若しくは匂いに対する過敏を伴う。一部の患者では、片頭痛の発症に先立って前兆がある。前兆は、典型的には、頭痛がまもなく起こることを知らせる視覚障害、感覚障害、言語障害又は運動障害である。本明細書に記載の方法は、ヒト患者における前兆のある片頭痛及び前兆のない片頭痛の１つ以上の症状を予防、治療又は改善する。
ＰＡＣＡＰ３８は、その受容体を活性化することにより、血管拡張、特に硬膜血管系の血管拡張を誘導する（Ｓｃｈｙｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．７（２）：１９１－１９６，２０１０）。ＰＡＣＡＰ３８／ＰＡＣ１受容体シグナル伝達カスケードは、特に片頭痛の病態生理学に関係している（Ａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ，Ｖｏｌ．１３７：７７９－７９４，２０１４）。ＶＰＡＣ１及びＶＰＡＣ２受容体よりもＰＡＣ１受容体に対して高い親和性を有するＰＡＣＡＰ３８の注入は、片頭痛患者において片頭痛様頭痛を引き起こす（Ｓｃｈｙｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ １３２：１６－２５、２００９；Ａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ，Ｖｏｌ．１３７：７７９－７９４，２０１４；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ，Ｖｏｌ．３７：１２５－１３５，２０１７）。更に、片頭痛発作を経験している患者の頭蓋循環では、ＰＡＣＡＰ３８レベルが上昇し、トリプタンによる片頭痛症状の治療後にＰＡＣＡＰ３８レベルが低下する（Ｔｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ，Ｖｏｌ．３３，１０８５－１０９５，２０１３；Ｚａｇａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｎｅｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．１：１０３６－１０４０，２０１４）。これらの報告は、ＰＡＣＡＰ３８の内因性放出が片頭痛の重要な誘因であり、その影響が主にＰＡＣ１受容体の活性化により媒介されることを示唆する。
いくつかの実施形態では、本発明の方法により治療される患者は、反復性片頭痛を有するか、患っているか又は診断されている。片頭痛歴（例えば、これまでに少なくとも５回の片頭痛の発作）を有する患者が１ヶ月に１４日以下の片頭痛日を有する場合、反復性片頭痛と診断される。「片頭痛日」は、前兆の有無に関わらず、患者が３０分を超えて続く「片頭痛」の発症、継続又は再発を経験する任意の暦日を含む。「片頭痛」は、吐き気若しくは嘔吐又は光若しくは音に対する過敏と関連する頭痛及び／又は以下の痛みの特徴：片側性の痛み、ズキズキする痛み、中度～重度の痛みの強さ又は身体活動によって悪化する痛みの少なくとも２つを特徴とする頭痛である。特定の実施形態では、反復性片頭痛を有するか、患っているか又は診断された患者は、平均して１ヶ月あたり少なくとも４日で１５日未満の片頭痛日を有する。関連する実施形態では、反復性片頭痛を有するか、患っているか又は診断された患者は、平均して１ヶ月あたり１５日未満の頭痛日を有する。本明細書で使用される場合、「頭痛日」は、患者が本明細書で定義される片頭痛又は３０分を超えて持続するか、若しくは急性頭痛治療を必要とする任意の頭痛を経験するいずれかの暦日である。
特定の実施形態では、本発明の方法により治療される患者は、慢性片頭痛を有するか、患っているか又は診断されている。慢性片頭痛は、片頭痛患者（すなわちこれまでに少なくとも５回の片頭痛の発作を有する患者）のある患者が１ヶ月に１５日以上の頭痛を有し、且つ少なくとも８日の頭痛日が片頭痛日である場合に診断される。いくつかの実施形態では、慢性片頭痛を有するか、患っているか又は診断された患者は、平均して１ヶ月あたり１５日以上の頭痛日を有する。本明細書に記載の方法の特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片を投与することにより、患者の反復性片頭痛の慢性片頭痛への進行を予防、低減又は遅延させる。
いくつかの実施形態では、本発明は、群発性頭痛の治療、予防又は改善を、それを必要とする患者において行うための方法であって、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片の有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。群発性頭痛は、その最も顕著な特徴として、頭部の片側、一般的には眼の周りに再発性の重篤な頭痛を伴う状態である（Ｎｅｓｂｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＪ，Ｖｏｌ．３４４：ｅ２４０７，２０１２を参照されたい）。群発性頭痛は、多くの場合、定期的に発生する：自然軽快により、痛みの活発な期間は、中断される。群発性頭痛は、多くの場合、涙、鼻閉、眼瞼下垂、縮瞳、顔面紅斑、発汗及び眼の周りの腫脹などの頭部自律神経症状を伴い、痛みが頭部の側部に限定されることが多い。群発性頭痛発症の平均年齢は、ほぼ３０歳～５０歳である。それは、男性においてより一般的であり、男性対女性の比は、約２．５：１～約３．５：１である。群発性頭痛の治療に翼口蓋神経節（ＳＰＧ）への刺激が使用されている。低レベル（しかし、高頻度、生理学的遮断）の電気刺激をＳＰＧに送達する神経刺激システムは、最近の臨床試験において、群発性頭痛の急性消耗性の痛みの軽減に有効であることが示された（Ｓｃｈｏｅｎｅｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ，Ｖｏｌ．３３（１０）：８１６－３０，２０１３を参照されたい）。この証拠を考慮すると、ＰＡＣＡＰは、ＳＰＧにおける主要な神経伝達物質の１つであるため、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片によるＰＡＣＡＰ／ＰＡＣ１シグナル伝達の阻害は、ヒトにおける群発性頭痛の治療に有効であると予想される。
本発明の方法に従って治療され得るＰＡＣＡＰ／ＰＡＣ１シグナル伝達経路に関連する他の病態としては、炎症性皮膚病態、例えば酒さなど（米国特許出願公開第２０１１０２２９４２３号明細書を参照されたい）、慢性疼痛症候群、例えば神経障害性疼痛（Ｊｏｎｇｓｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，Ｖｏｌ．１２：２２１５－２２１９，２００１；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．１０７０：７５－８９，２００６を参照されたい）、緊張型頭痛、片麻痺性片頭痛、網膜片頭痛、不安障害、例えば心的外傷後ストレス障害など（Ｈａｍｍａｃｋ ａｎｄ Ｍａｙ，Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，Ｖｏｌ．７８（３）：１６７－１７７，２０１５を参照されたい）、過敏性腸症候群及び閉経に関連するものなどの血管運動症状（例えば、ほてり、顔面紅潮、発汗及び寝汗）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片を投与することによって治療される病態は、慢性疼痛である。別の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片を投与することによって治療される病態は、神経因性疼痛である。
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、治療は、予防的治療を含み得る。予防的治療とは、患者の症状（例えば、片頭痛又は群発性頭痛）の頻度、重症度及び／又は長さを低減するために、病態又は発作の発症前（例えば、片頭痛発作前又は群発性頭痛症状の発現前）に行われるように設計された治療を指す。
いくつかの実施形態では、患者の頭痛病態を治療又は予防するための本発明の方法は、本明細書に記載の片頭痛又は他の頭痛障害の急性的又は予防的治療に好適な１つ以上の薬剤と組み合わせた本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片を患者に投与することを含む。用語「併用療法」は、本明細書で使用する場合、実質的に２つの化合物を同時に投与することに加え、順次的な手法（すなわち各化合物を任意の順序で異なる時間に投与する）で２つの化合物（例えば、抗ＰＡＣ１抗体及び更なる薬剤）を投与することを包含する。実質的同時投与は、同時投与が含まれ、両方の化合物を含む単一の製剤（例えば、両方の化合物の固定比率を含む単一の製剤又は各化合物の固定比率を有するプレフィルドシリンジ）を投与するか、又は化合物の各々を含有する個別の製剤を同時に投与することにより達成され得る。したがって、特定の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片を第２の頭痛治療薬と共に投与することを含む。
特定の実施形態では、第２の頭痛治療薬は、頭痛又は片頭痛の急性期治療に使用される急性頭痛治療薬であり得る。いくつかの実施形態では、急性頭痛治療薬は、セロトニン（５－ヒドロキシトリプタミン；５－ＨＴ）受容体アゴニスト、例えば５ＨＴ１受容体アゴニストである。急性頭痛治療薬は、５ＨＴ１Ｂ、５ＨＴ１Ｄ及び／又は５ＨＴ１Ｆセロトニン受容体のアゴニストであり得る。このようなセロトニン受容体アゴニストとしては、トリプタン（例えば、アルモトリプタン、フロバトリプタン、リザトリプタン、スマトリプタン、ナラトリプタン、エレトリプタン及びゾルミトリプタン）、エルゴタミン（例えば、ジヒドロエルゴタミン及びエルゴタミン酒石酸塩）及び５ＨＴ１Ｆ選択的セロトニン受容体アゴニスト、例えばラスミジタンが挙げられるがこれらに限定されない。他の好適な頭痛治療薬としては、非ステロイド抗炎症薬（例えば、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン及びジクロフェナク）及びオピオイド（例えば、コデイン、モルヒネ、ヒドロコドン、フェンタニール、メペリジン及びオキシコドン）が挙げられる。一実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片と組み合わせて投与される急性頭痛治療薬は、トリプタンである。別の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片と組み合わせて投与される急性頭痛治療薬は、エルゴタミンである。更に別の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片と組み合わせて投与される急性頭痛治療薬は、非ステロイド性抗炎症薬である。更に別の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片と組み合わせて投与される急性頭痛治療薬は、オピオイドである。
いくつかの実施形態では、第２の頭痛治療薬は、頭痛又は片頭痛の予防的治療に使用される予防的頭痛治療薬である。一実施形態では、予防的頭痛治療薬は、抗てんかん薬、例えばジバルプロエクス、バルプロ酸ナトリウム、バルプロ酸、トピラメート又はガバペンチンである。別の実施形態では、予防的頭痛治療薬は、β遮断薬、例えばプロプラノロール、チモロール，アテノロール、メトプロロール又はナドロールである。更に別の実施形態では、予防的頭痛治療薬は、抗うつ薬、例えば三環式抗うつ薬（例えば、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、ドキセピン及びフルオキセチン）である。更に別の実施形態では、予防的頭痛治療薬は、オナボツリヌストキシンＡである。
特定の実施形態では、本発明の方法は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）シグナル伝達経路のアンタゴニストと共に本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む（すなわちＣＧＲＰリガンドによりＣＧＲＰ受容体の活性化又はシグナル伝達を阻害する）。例えば、本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片を、ＣＧＲＰ経路アンタゴニストと組み合わせて投与して、それを必要とする患者の頭痛病態（例えば、片頭痛又は群発性頭痛）を治療又は予防することができる。いくつかの実施形態では、ＣＧＲＰ経路アンタゴニストは、ヒトＣＧＲＰ受容体のアンタゴニストである。ＣＧＲＰ受容体アンタゴニストとしては、米国特許出願公開第２００６０１４２２７３号明細書並びに米国特許第７，８４２，８０８号明細書；同第７，７７２，２４４号明細書；同第７，７５４，７３２号明細書；同第７，５６９，５７８号明細書；同第８，６８５，９６５号明細書；同第８，５６９，２９１号明細書；同第８，３７７，９５５号明細書；同第８，３７２，８５９号明細書；同第８，１４３，２６６号明細書；同第７，９４７，６７７号明細書；及び同第７，６２５，９０１号明細書（それらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で記載されているものなどのＣＧＲＰ受容体の低分子阻害薬が挙げられる。ＣＧＲＰ受容体アンタゴニストとしては、米国特許第８，１６８，５９２号明細書（その全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているものなど、受容体のペプチドアンタゴニストも挙げることができる。特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片と共に投与されるＣＧＲＰ受容体アンタゴニストは、ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体であり、例えば米国特許第９，１０２，７３１号明細書及び米国特許出願公開第２０１６０３１１９１３号明細書（その両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている抗体などである。本発明の方法の特定の一実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５０２（下記で示される配列）の配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号５０３（下記で示される配列）の配列を含む重鎖可変領域を含む抗ＣＧＲＰ受容体モノクローナル抗体と組み合わせて投与され、患者の頭痛病態（例えば、片頭痛又は群発性頭痛）を治療又は予防する。本発明の方法の別の特定の実施形態では、患者の頭痛病態（例えば、片頭痛又は群発性頭痛）を治療又は予防するために本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片と組み合わせて投与される抗ＣＧＲＰ受容体モノクローナル抗体は、エレヌマブである。
例示的な抗ＣＧＲＰ受容体モノクローナル抗体についての軽鎖可変領域配列：
Figure 0007339262000106
例示的な抗ＣＧＲＰ受容体モノクローナル抗体についての重鎖可変領域配列：
Figure 0007339262000107
いくつかの実施形態では、患者の頭痛病態（例えば、片頭痛又は群発性頭痛）を治療又は予防するために本発明の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片と組み合わせて投与されるＣＧＲＰ経路アンタゴニストは、ＣＧＲＰリガンドのアンタゴニストである。ＣＧＲＰリガンドアンタゴニストは、デコイ若しくは可溶性ＣＧＲＰ受容体又はＣＧＲＰリガンド、例えば抗ＣＧＲＰリガンド抗体などに結合する他のタンパク質であり得る。抗ＣＧＲＰリガンド抗体は、当該技術分野において既知であり、例えば国際公開第２００７／０５４８０９号パンフレット；同第２００７／０７６３３６号パンフレット；同第２０１１／１５６３２４号パンフレット；及び同第２０１２／１６２２４３（それらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。特定の実施形態では、本発明の抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片と共に投与されるＣＧＲＰリガンドアンタゴニストは、ヒトα－ＣＧＲＰ及び／又はヒトβ－ＣＧＲＰに特異的に結合するモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗ＣＧＲＰリガンド抗体は、フレマネズマブである。別の実施形態では、抗ＣＧＲＰリガンド抗体は、ガルカネズマブである。更に別の実施形態では、抗ＣＧＲＰリガンド抗体は、エプチネズマブである。
本発明は、本明細書に記載の方法のいずれかにおける抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片の使用も含む。例えば、特定の実施形態では、本発明は頭痛病態の治療又は予防を、それを必要とする患者において行うための方法で使用するための、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片を提供する。いくつかのこのような実施形態では、頭痛病態は、片頭痛である。片頭痛は、反復性片頭痛又は慢性片頭痛であり得る。他の実施形態では、頭痛病態は、群発性頭痛である。いくつかの実施形態では、頭痛病態を治療又は予防するための方法は、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片と組み合わせて第２の頭痛治療薬を投与することを含む。一実施形態では、第２の頭痛治療薬は、急性頭痛治療薬、例えば５ＨＴ１Ｂ、５ＨＴ１Ｄ及び／又は５ＨＴ１Ｆセロトニン受容体アゴニスト（例えば、トリプタン又はエルゴタミン）並びに非ステロイド抗炎症薬又はオピオイドである。別の実施形態では、第２の頭痛治療薬は、予防的頭痛治療薬、例えば抗てんかん薬、β遮断薬、抗うつ薬、オナボツリヌストキシンＡ又はＣＧＲＰ経路アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＣＧＲＰ経路アンタゴニストは、ヒトＣＧＲＰ受容体アンタゴニストである。特定の一実施形態では、ヒトＣＧＲＰ受容体アンタゴニストは、ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体、例えばエレヌマブである。他の実施形態では、ＣＧＲＰ経路アンタゴニストは、ヒトα－ＣＧＲＰ及び／又はヒトβ－ＣＧＲＰに特異的に結合するモノクローナル抗体など、ヒトＣＧＲＰリガンドのアンタゴニストである。特定の実施形態では、抗ＣＧＲＰリガンド抗体は、フレマネズマブ、ガルカネズマブ又はエプチネズマブである。
いくつかの実施形態では、本発明は、血管拡張の阻害を、それを必要とする患者において行うための方法で使用するための、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片を提供する。このような実施形態では、患者は、片頭痛（例えば、反復性又は慢性片頭痛）又は群発性頭痛などの頭痛病態を診断されているか又は有し得る。他の実施形態では、本発明は、頭痛病態を有する患者においてヒトＰＡＣ１受容体の活性化を阻害するための方法で使用するための、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片を提供する。頭痛病態は、片頭痛（例えば、反復性又は慢性片頭痛）又は群発性頭痛であり得る。
本明細書に開示の方法のいずれかによる投与のための医薬の調製のための、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片の使用が具体的に検討される。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、頭痛病態の治療又は予防を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片の使用を包含する。いくつかのこのような実施形態では、頭痛病態は、片頭痛である。片頭痛は、反復性片頭痛又は慢性片頭痛であり得る。他の実施形態では、頭痛病態は、群発性頭痛である。特定の実施形態では、抗ＰＡＣ１抗体又はその抗原結合断片は、第２の頭痛治療薬と共に投与するために配合される。一実施形態では、第２の頭痛治療薬は、急性頭痛治療薬、例えば５ＨＴ１Ｂ、５ＨＴ１Ｄ及び／又は５ＨＴ１Ｆセロトニン受容体アゴニスト（例えば、トリプタン又はエルゴタミン）並びに非ステロイド抗炎症薬又はオピオイドである。別の実施形態では、第２の頭痛治療薬は、予防的頭痛治療薬、例えば抗てんかん薬、β遮断薬、抗うつ薬、オナボツリヌストキシンＡ又はＣＧＲＰ経路アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＣＧＲＰ経路アンタゴニストは、ヒトＣＧＲＰ受容体アンタゴニストである。特定の一実施形態では、ヒトＣＧＲＰ受容体アンタゴニストは、ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体、例えばエレヌマブである。他の実施形態では、ＣＧＲＰ経路アンタゴニストは、ヒトα－ＣＧＲＰ及び／又はヒトβ－ＣＧＲＰに特異的に結合するモノクローナル抗体など、ヒトＣＧＲＰリガンドのアンタゴニストである。特定の実施形態では、抗ＣＧＲＰリガンド抗体は、フレマネズマブ、ガルカネズマブ又はエプチネズマブである。
いくつかの実施形態では、本発明は、血管拡張の阻害を、それを必要とする患者において行うための医薬の調製における、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片の使用を含む。このような実施形態では、患者は、片頭痛（例えば、反復性又は慢性片頭痛）又は群発性頭痛などの頭痛病態を診断されているか又は有し得る。他の実施形態では、本発明は、頭痛病態を有する患者のヒトＰＡＣ１受容体の活性化を阻害するための医薬の調製における、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片の使用を含む。頭痛病態は、片頭痛（例えば、反復性又は慢性片頭痛）又は群発性頭痛であり得る。
本発明の抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片は、生体試料中のヒトＰＡＣ１の検出及びヒトＰＡＣ１を発現する細胞又は組織の同定にも有用である。例えば、抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片は、診断アッセイ、例えば組織又は細胞で発現されたＰＡＣ１を検出及び／又は定量するためのイムノアッセイで使用することができる。加えて、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片を使用して、ＰＡＣ１がＰＡＣＡＰとの複合体を形成することを阻害し得、それにより細胞又は組織におけるＰＡＣ１の生物学的活性を調節する。このような生物学的活性としては、細胞内ｃＡＭＰの上昇及び血管拡張が挙げられる。
本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片は、片頭痛、群発性頭痛及び心的外傷後ストレス障害などの不安障害を含む、ＰＡＣ１に関連する疾患及び／又は病態を検出、診断又は監視する診断目的で使用することができる。また、当業者に知られた古典的な免疫組織学的方法（例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｖｏｌ １５（Ｅｄｓ Ｒ．Ｈ．Ｂｕｒｄｏｎ ａｎｄ Ｐ．Ｈ．ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｚｏｌａ，１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７－１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｊａｌｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６－９８５；Ｊａｌｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７－３０９６）を使用して、試料中のＰＡＣ１の存在を検出する方法が提供される。ＰＡＣ１の存在の検出に有用な方法の例には、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片を使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのイムノアッセイが含まれる。ＰＡＣ１の検出は、インビボ又はインビトロで実施することができる。
診断の適用では、抗ＰＡＣ１抗体又は抗原結合断片は、検出可能な標識基で標識され得る。好適な標識基としては、以下：放射性同位体若しくは放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基又は二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、標識基は、潜在的な立体障害を低減するために様々な長さのスペーサーアームを介して抗体又は抗原結合断片にカップリングされる。タンパク質を標識するための様々な方法が当該技術分野で知られており、使用することができる。
別の実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＡＣ１抗体及び抗原結合断片を使用して、ＰＡＣ１を発現する１つ又は複数の細胞を同定することができる。特定の実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、標識基で標識され、標識された抗体又は抗原結合断片のＰＡＣ１への結合が検出される。抗体又は抗原結合断片は、生体試料の免疫沈降アッセイでも使用することができる。更なる特定の実施形態では、ＰＡＣ１への抗体又は抗原結合断片の結合は、ｉｎ ｖｉｖｏで検出される。更なる特定の実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、当該技術分野で知られた技術を使用して単離され、測定される。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（ｅｄ．１９９１ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）；Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｄ．，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓを参照されたい。
実施された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のみのために提供されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１．ヒトＰＡＣ１抗体の結晶構造誘導設計
ヒトＰＡＣ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）とヒト抗ＰＡＣ１中和抗体（２９Ｇ４ｖ９）のＦａｂ断片との間の複合体の結晶構造を決定した。ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤ及び抗ＰＡＣ１Ｆａｂを別々に精製し、１：１のモル比で複合体化した。その後、２０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ中で平衡化したゲル濾過カラムに試料をかけ、３５ｍｇ／ｍＬまで濃縮して、濾過した。
Ｆａｂ断片の重鎖（可変領域（ＶＨ）、ＣＨ１定常領域、アッパーヒンジ及びカスパーゼＩＩＩ切断部位を含む）及び軽鎖（可変領域（ＶＬ）及びＣＬ定常領域を含む）の配列を以下に列挙する。ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤ構築物の配列は、以下に示され、ヒトＰＡＣ１（配列番号１）のアミノ酸２６～１４３からアミノ酸８９～１０９の領域を除いたものを含有した。
２９Ｇ４ｖ９ Ｆａｂの重鎖（ＶＨ領域（アミノ酸：１～１２０）；ＣＨ１領域（アミノ酸：１２１～２１８）；アッパーヒンジ領域（アミノ酸２１９～２２１）及びカスパーゼＩＩＩ切断部位（２２２～２２６）で構成されている）についてのアミノ酸配列：
Figure 0007339262000108
２９Ｇ４ｖ９ Ｆａｂの軽鎖（ＶＬ領域（アミノ酸：１～１０８）及びＣＬ領域（アミノ酸：１０９～２１４）で構成されている）についてのアミノ酸配列：
Figure 0007339262000109
ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤ構築物のアミノ酸配列：
Figure 0007339262000110
精製したヒトＰＡＣ１ ＥＣＤ及び抗ＰＡＣ１Ｆａｂを、最初に市販のスクリーニングでシッティングドロップ蒸気拡散法を使用して共結晶化した。結晶化状態（Ｑｉａｇｅｎ ＭＰＤ Ｓｕｉｔｅ Ｓｃｒｅｅｎ＃６１（１３４５６１））を、ハンギングドロップ蒸気拡散法を使用して更に展開した。タンパク質及び結晶化バッファー（０．１Ｍクエン酸ｐＨ４．０、４０％ＭＰＤ）を４℃の結晶化バッファーのリザーバ溶液上において１μＬのハンギングドロップに１：１で混合した。数週間で棒状の結晶が形成された。
結晶を凍結保護剤としての結晶化バッファー中で平衡化し、データ収集のためにＬａｗｒｅｎｃｅ Ｂｅｒｋｅｌｅｙナショナル研究所に発送するために液体窒素で凍結した。ＡＤＳＣ－Ｑ３１５ｒ ＣＣＤ検出器（λ＝１．０００Å）上の先端光源シンクロトロンビームライン５．０．２でデータセットを収集した。ＨＫＬ２０００を使用してデータを統合して基準化し（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ ａｎｄ Ｍｉｎｏｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２７６，３０７－３２６，１９９７）、０．０８１のＲｍｅｒｇｅで２．００Åまで９９．８％完了（Ｉ／σ＝２．３５でラストシェル２．０７～２．００Åを９８．０％完了）した。結晶は、ａ＝６５．２Å，ｂ＝１７７．９Å、ｃ＝５３．８Å、α＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°のユニットセル寸法を有する斜方空間群Ｐ２１２１２に属する。結晶構造は、ＰｈａｓｅｒＭＲを使用して分子置換により解明された（Ｗｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｓｅｃｔ．Ｄ：Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｖｏｌ．６７：２３５－２４２，２０１１）。独自のＦａｂ構造は、抗ＰＡＣ１Ｆａｂコンポーネントを解明する最初の検索モデルとして使用した。後続の分子置換は、ＰＤＢＩＤ：２ＪＯＤ（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１０４：７８７５，２００７）、ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤ ＮＭＲ構造を開始モデルとして使用し、ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤコンポーネントを解明した。非対称ユニットには１つのＥＣＤ分子及び１つのＦａｂ分子がある。構造は、両Ｒｅｆｍａｃ５を使用して精密化され（Ｗｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｓｅｃｔ．Ｄ：Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｖｏｌ．６７：２３５－２４２，２０１１；Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｓｅｃｔ．Ｄ：Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｖｏｌ．６７：３５５－３６７，２０１１）及びＰｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅ（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｓｅｃｔ．Ｄ：Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｖｏｌ．６６：２１３－２２１，２０１０）、モデルの構築は、グラフィックプログラムＣｏｏｔを使用して実行された（Ｅｍｓｌｅｙ ａｎｄ Ｃｏｗｔａｎ、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、Ｓｅｃｔ．Ｄ：Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｖｏｌ．２００４，６０：２１２６－２１３２，２００４）。
ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤの構造：抗ＰＡＣ１ Ｆａｂ複合体は、２０％Ｒ因子及び２３％のＲｆｒｅｅで２．００Åに精密化された。複合体の構造の正面図及び側面図をそれぞれ図１Ａ及び図１Ｂに示す。２９Ｇ４ｖ９ ＦａｂとＰＡＣ１ ＥＣＤとの間の相互作用は、疎水性、静電的及び水素結合相互作用で構成される。２９Ｇ４ｖ９ ＦａｂとＰＡＣ１ ＥＣＤとの間の相互作用は、抗体－抗原相互作用に典型的である埋没表面積（１６１３Å２）及び形状相補性（０．６９５）値を有する。２９Ｇ４ｖ９ Ｆａｂにおける非水素原子から５Å以下の距離で少なくとも１つの非水素原子を含有したＰＡＣ１ ＥＣＤ中の全てのアミノ酸は、ＰＡＣ１ ＥＣＤ中のコア界面アミノ酸であると判断された。原子の距離は、ＰｙＭＯＬプログラムで計算した（ＤｅＬａｎｏ，Ｗ．Ｌ．Ｔｈｅ ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，２００２））。ＰＡＣ１ ＥＣＤ中のコア界面アミノ酸としては、配列番号１に対するアミノ酸位置番号でＡｓｐ５９、Ａｓｎ６０、Ｉｌｅ６１、Ａｒｇ１１６、Ａｓｎ１１７、Ｔｈｒ１１９、Ａｓｐ１２１、Ｇｌｙ１２２、Ｔｒｐ１２３、Ｓｅｒ１２４、Ｇｌｕ１２５、Ｐｒｏ１２６、Ｐｈｅ１２７、Ｐｒｏ１２８、Ｈｉｓ１２９、Ｔｙｒ１３０、Ｐｈｅ１３１、Ａｓｐ１３２及びＧｌｙ１３５が挙げられる。
結晶構造における２９Ｇ４ｖ９ ＦａｂとＰＡＣ１ ＥＣＤとの間の界面を分析して、２つの分子間の相互作用が最適以下である領域を特定した。構造分析に基づいて、軽鎖及び重鎖可変領域におけるアミノ酸の変異は、ＦａｂとＰＡＣ１ ＥＣＤとの間のこれらの領域の相互作用を強化して、抗体の結合親和性及び／又は阻害力を改善するように設計された。特に、Ｆａｂ軽鎖とＰＡＣ１ ＥＣＤとの間の相互作用の分析により、Ｆａｂ軽鎖における変異がＰＡＣ１との相互作用を改善する可能性のある４つの領域が明らかになった。ゾーン１では、ＰＡＣ１ ＥＣＤアミノ酸Ｇｌｕ１２０及びＡｓｐ１２１、軽鎖ＣＤＲ１（配列番号３）のＧｌｎ２７のリジン、チロシン又はアルギニンへの変異を含む領域は、Ｇｌｕ１２０及びＡｓｐ１２１ ＰＡＣ１アミノ酸でより優れた電荷相補性又は水素結合ポテンシャルを提供するために提案された（図２Ａ）。ゾーン２は、正の静電ポテンシャルを有する領域であり、軽鎖ＣＤＲ１（配列番号３）中のＳｅｒ２８のグルタメートへの変異は、電荷の相補性を高めるために提案された（図２Ａ）。ゾーン３は、ＰＡＣ１ ＥＣＤ Ｐｈｅ１２７残基を含有する疎水性領域であり、水素結合ポテンシャルを有する。軽鎖ＣＤＲ１中のＧｌｙ３０、Ａｒｇ３１及びＳｅｒ３２は、ゾーン３からわずかに離れている（図２Ａ）。したがって、複数変異は、以下の表６でまとめたようにこれらの３つの部位で提案され、これらの３つの残基とＰＡＣ１ ＥＣＤのこのゾーンとの間の疎水性又は水素結合相互作用を向上させる。軽鎖ＣＤＲ３中のＡｒｇ９３は、負の静電ポテンシャルを有するＰＡＣ１残基のポケットに位置する（ゾーン４；図２Ｂ）。しかし、形状により、Ａｒｇ９３は、ＰＡＣ１残基と直接水素結合を形成しない。軽鎖ＣＤＲ３中のＡｒｇ９３のグルタミン、リジン、ヒスチジン又はアスパラギンへの変異は、ＰＡＣ１ ＥＣＤの残基との交互電荷相補性又は水素結合ポテンシャルを提供するために提案された（図２Ｂ）。
２９Ｇ４ｖ９ Ｆａｂ重鎖とＰＡＣ１ ＥＣＤとの間の相互作用の分析により、Ｆａｂ重鎖における変異がＰＡＣ１ ＥＣＤとの相互作用を改善し得る３つの主要な領域が明らかになった。図３Ａに示すように、ゾーン５は、ＰＡＣ１アミノ酸Ｐｈｅ１３１を包含し、Ｐｈｅ１３１の両側にある２つのサブゾーンに分けることができる。重鎖ＣＤＲ１中のＡｒｇ３１及びＰｈｅ３２は、これらのサブゾーンにあり、これらの部位での変異が提案されて、ＰＡＣ１ Ｐｈｅ１３１残基との疎水性相互作用を改善するか、又は交互電荷相補性相互作用をもたらす。変異のリストについての表６を参照されたい。ゾーン６では、ＰＡＣ１ ＥＣＤ残基Ａｓｎ６０及びＩｌｅ６１（配列番号１に関して）を含み、重鎖ＣＤＲ２残基Ｔｙｒ５３、Ａｓｐ５４及びＧｌｙ５６の変異が提案されて、疎水性相互作用を改善するか、又はＡｓｎ６０及びＩｌｅ６１ ＰＡＣ１残基との交互水素結合をもたらす（図３Ｂ）。ゾーン７では、表６に示すように、疎水性残基及びいくつかの負の静電ポテンシャル、重鎖ＣＤＲ３残基Ｖａｌ１０２、Ｌｅｕ１０３及びＴｈｒ１０４の変異がある領域が提案されて、疎水性相互作用を改善するか、又は交互水素結合相互作用をもたらす（図３Ｃ）。
Ｆａｂ／ＰＡＣ１ ＥＣＤ複合体の結晶構造の分析に基づいて、抗ＰＡＣ１抗体とヒトＰＡＣ１受容体との間の相互作用を改善するために提案された特定の変異の概要を以下の表６に示す。
Figure 0007339262000111
上記のような抗ＰＡＣ１ ＦａｂとヒトＰＡＣ１ ＥＣＤとの間の相互作用アミノ酸の分析によって設計される変異に加えて、結晶構造を使用したｉｎ ｓｉｌｉｃｏ親和性成熟分析も実施され、抗ＰＡＣ１抗体の結合親和性及び／又は阻害力を改善するための更なる変異が同定された。ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤへの結合に関与する２９Ｇ４ｖ９ Ｆａｂにおけるアミノ酸残基は、上記の複合体の結晶構造の目視検査により同定された。システインを除く他の全てのアミノ酸に対する仮想変異のために、抗体のこれらの界面残基を選択した。変異の抗体／ＰＡＣ１ ＥＣＤ結合相互作用への影響は、ＢｉｏｖｉａからのＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ分子モデリングソフトウェアを使用して、特定の残基の変異時の結合自由エネルギーの変化（ΔΔＧ結合）を計算することにより評価した。負のΔΔＧ結合値は、変異が親分子と比較してＰＡＣ１ ＥＣＤへのより強い結合をもたらすことを示す。これらの計算により、負のΔΔＧ結合値につながるおよそ６５の変異が同定された。これらの６５の変異は、ＰＡＣ１ ＥＣＤを用いたこれらのバリアントの「モデル化された」構造の目視検査及び分析に基づいて、５０（軽鎖では１８、重鎖では３２）に更に絞り込まれた。結合自由エネルギーの計算に基づいて、ＰＡＣ１に対する抗体の結合親和性を高めると予測されたこれらの５０の変異を以下の表７にまとめる。
Figure 0007339262000112
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのアプローチにより、構造ベースの分析と比較して、異なるアミノ酸並びに軽鎖及び／又は重鎖内の異なる位置の両方に関して更なる変異の同定がもたらされた。
本実施例に記載の変異は、組換え産生により抗ＰＡＣ１抗体に組み込まれ、本明細書実施例３で記載されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞系アッセイでヒトＰＡＣ１のＰＡＣＡＰ誘導活性化の阻害能力について試験した。
実施例２．２９Ｇ４ｖ１０ヒトＰＡＣ１抗体の酵母ディスプレイ親和性成熟
親和性成熟についての１つの強力なアプローチには、酵母ディスプレイされた抗体Ｆａｂ変異体のライブラリの構築及び蛍光支援細胞選別（ＦＡＣＳ）による改善されたバインダの選択が含まれる（図４）。阻害力が向上した抗ＰＡＣ１抗体を生成するために、２９Ｇ４ｖ１０抗体（配列番号１９１のＶＨ領域；配列番号５２のＶＬ領域）を、酵母ディスプレイされたＦａｂライブラリのＦＡＣＳにより親和性成熟させた。ライブラリの設計は、ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤと２９Ｇ４ｖ９ Ｆａｂとの間の複合体の実施例１に記載される解明された共結晶構造によって導かれ、そのＣＤＲは、２９Ｇ４ｖ１０のＣＤＲとほぼ同じである。構造分析は、最初に、それぞれ変異誘発のための軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）内の６つ及び７つのＣＤＲ位置を特定し、親和性増強の戦略を提案した。疎水性相互作用及び電荷相互性を改善し、界面全体に交互水素結合相互作用をもたらすようにポイント変異を設計した。実施例１を参照されたい。これらのポイント変異体は、生成、特性評価及び有益な変異の合理的な組み合わせの反復巡回を含む工学的アプローチを開始した。酵母ライブラリの設計は、１３の位置間の変異組み合わせをより包括的に調査し、各選択位置での多様化戦略を強化することにより、実施例１で記載した線形アプローチを補完することを目的とした。
ＬＣライブラリ及びＨＣライブラリを別々に作製することにより、理論上の多様性は、１０７未満の扱いやすいサイズに保たれた。ＬＣライブラリは、ＭＩＸ１９飽和突然変異誘発を、６つの選択位置の５つ（配列番号５２のＧｌｎ２７、Ｇｌｙ３０、Ａｒｇ３１、Ｓｅｒ３２及びＡｒｇ９３）で使用するように設計されている。ＭＩＸ１９は、システイン以外の全てのアミノ酸をコードする３量体ホスホラミダイト（コドン）混合物を表す。残っている軽鎖位置（配列番号５２のＳｅｒ２８）でセリン、グルタメート、アラニン又は終止コドンへの突然変異が採用された。本発明者らは、１つのライブラリ中の７つ全てのＨＣ位置（配列番号１９１のＡｒｇ３１、Ｐｈｅ３２、Ｔｙｒ５３、Ｇｌｙ５６、Ｖａｌ１０２、Ｌｅｕ１０３及びＴｈｒ１０４）を調査するために、７つの重鎖ＣＤＲ位置（配列番号１９１のＡｒｇ３１、Ｐｈｅ３２、Ｔｙｒ５３、Ｖａｌ１０２及びＬｅｕ１０３）の５つにおいて、多様化のために９つのコドンのカスタム混合（ＭＩＸ９）を設計した。カスタムＭＩＸ９は、疎水性アミノ酸、塩基性アミノ酸及び水素結合ドナー及びアクセプター（例えば、Ｆ、Ｌ、Ｙ、Ｍ、Ｑ、Ｈ、Ｋ、Ｒ及びＳ）を含む。重要なことに、下流の製造性リスクを引き起こす可能性のある配列ライアビリティの導入を最小化するために、カスタムＭＩＸ９は、システイン、アスパラギン及びトリプトファンを除外した。残っている２つの重鎖位置（配列番号１９１のＧｌｙ５６及びＴｈｒ１０４）について、グリシン、アラニン、セリン及びトレオニンへの変異を実施した。要約すると、この最初のキャンペーンについて、８．５×１０６の理論的多様性を備えたｍｕｔＨＣライブラリ及び９．９×１０６の理論的多様性を備えたｍｕｔＬＣライブラリが設計され、構築されたライブラリは、理論的多様性を９倍より多くオーバーサンプリングした。
構築された２つのｍｕｔＨＣ及びｍｕｔＬＣ Ｆａｂライブラリは、ＦＡＣＳを使用してヒトＰＡＣ１ ＥＣＤに結合するためにリッチ化され、結合に使用されるＥＣＤの濃度を下げることにより、連続する各ラウンドでストリンジェンシーを高める（ラウンド１：３０ｎＭ ＰＡＣ１ ＥＣＤ；ラウンド２：０．６７ｎＭ ＰＡＣ１ ＥＣＤ；及びラウンド３：０．２ｎＭ ＰＡＣ１ ＥＣＤ）。親Ｆａｂと比較して改善された結合を示す酵母クローンを特異的にゲートするために、通常、同様に処理された２９Ｇ４ｖ１０ Ｆａｂ－酵母試料を使用した。各クローンについての正規化された結合／ディスプレイ比は、各クローンの蛍光結合シグナルの中央値を各クローンの蛍光ディスプレイシグナルの中央値で除算することによって算出した。ラウンド３までに、ｍｕｔＨＣライブラリではなく、ｍｕｔＨＣライブラリから改善されたバインダがリッチ化された。ｍｕｔＨＣラウンド３プールからの約２００の酵母クローンの簡略スクリーニングにより、１１の適度に改善されたバインダが得られた（表８）。改善された親和性バリアントを組換えにより作製し、実施例３に記載されるようにｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能的活性について評価した。偶然にも、２９Ｇ４ｖ１０親Ｆａｂ内のアスパラギン酸異性化部位、製造についてのポテンシャルライアビリティは、これら１１のユニークな変異体全てで修復された。
Figure 0007339262000113
更なる親和性の改善をもたらすために、ｍｕｔＨＣ及びｍｕｔＬＣのソートされたプールからのリッチ化変異を組み合わせたチェーンシャッフルされたライブラリも構築された。上位結合クローン間の相違点を改善するために、結合オフレート駆動選択及びスクリーニング戦略を導入した（図５）。変異体Ｆａｂをディスプレイする酵母細胞に最初にビオチン化ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤを十分にしみ込ませ、広範囲に洗浄した後、大過剰の非標識ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤを含むバッファーで長時間インキュベートした（最大２４時間）。２５℃～３７℃の範囲の温度で発生した非標識ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤとのインキュベーションにより、細胞からの解離現象が不可逆的となった。ビオチン化ＰＡＣ１への結合が最も多く、それによりオフレートが最も遅い細胞を蛍光ストレプトアビジンコンジュゲートで染色した後、ＦＡＣＳで単離した（図５）。オフレートが最も遅い酵母クローンディスプレイＦａｂは、蛍光性が最も高かった。
チェーンシャッフルされたライブラリのオフレート駆動ソートでは、同様に処理された２９Ｇ４ｖ１０ Ｆａｂ酵母試料を使用して、非標識ＰＡＣ１と一晩競合させた後、ビオチン化ＰＡＣ１結合がより大きい細胞を特異的に単離した。異なるゲートストリンジェンシーで収集された２つのプールから、結合オフレートアッセイを使用して約６００個の個別の酵母クローンをスクリーニングし、親２９Ｇ４ｖ１０ Ｆａｂよりも高いＰＡＣ１結合が残っている１９０個を超えるクローンを特定した。これらの有望なクローンの結合の特異性は、無関係な受容体（プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）及び胃抑制ポリペプチド受容体（ＧＩＰＲ））のＥＣＤへのクローンの結合がないことを確認することによって評価された。更なるシステイン異常、Ｎ－結合グリコシル化、アスパラギン酸異性化、アスパラギン脱アミド化及び開始２９Ｇ４ｖ１０配列に対するトリプトファン酸化部位を含有する変異体もスクリーニングで除去された。上位３０の結合変異体を、親２９Ｇ４ｖ１０抗体からのＣＤＲにおける配列変化及びオフレートアッセイ後のヒトＰＡＣ１ ＥＣＤ結合のパーセンテージと共に表９に示す。ＰＡＣ１ ＥＣＤ結合のパーセンテージが高いほど、変異体Ｆａｂのオフレートが遅いことを示す。
Figure 0007339262000114
Figure 0007339262000115
Figure 0007339262000116
Figure 0007339262000117
第２世代ライブラリのセットは、更なる親和性の向上をもたらすように設計された。上記の第１世代ライブラリは、結晶構造においてＰＡＣ１ ＥＣＤの４．５Å以内にある２９Ｇ４ｖ１０親抗体ＣＤＲ位置のサブセットで多様化を集中させた（実施例１）。第２世代ライブラリについて、軽鎖のＣＤＲ２及びＣＤＲ３などの第１世代ライブラリではほとんど変更されていない領域での変異誘発が検討された。第１世代ライブラリで検討されたいくつかの位置について、配列動向を使用して、３ラウンドの選別後に出現した中立／有益な突然変異の制限されたセットに多様化した。最後に、ＣＤＲコンフォメーションに影響を与える可能性があるいくつかの埋め込みフレームワーク残基は、他のヒトＶＨ３及びＶＫ３生殖細胞系列の同じ位置で頻繁に見られるアミノ酸を優先する変異戦略により、制限された多様化を対象とした。
全体で、４つの第２世代Ｆａｂライブラリは、多様化のために２４個の重鎖ＣＤＲ残基（配列番号１９１のアミノ酸２７、２９、３１～３４、４９、５２～５７、７０、７２、７７、７９、９８、１００～１０４及び１０６）及び１７個の軽鎖ＣＤＲ残基（配列番号５２のアミノ酸２７、２８、３０～３２、３４、４６、４９～５４、９２～９４及び９６）を標的とするように設計された。多くの標的位置での制限された多様性により、１つのライブラリ内のより多くのＣＤＲ位置の調査並びにＨＣＤＲ１のＨＣＤＲ３との共同最適化及びＬＣＤＲ１のＬＣＤＲ３との共同最適化が可能になった。構築された４つのライブラリは、７×１０６～１×１０７の範囲の８～２４倍の理論的多様性をカバーした。
４つの構築されたＦａｂライブラリは、上記のように、ＦＡＣＳを使用して、ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤへの結合のためにリッチ化された。ラウンド３までに、ｍｕｔＨＣＤＲ２及びｍｕｔＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ３ライブラリのみが、親２９Ｇ４ｖ１０抗体と同等以上の結合を有するプールを生成した。したがって、これらの２つのプールは、持ち越されて、更なる親和性の向上のために、ｍｕｔＨ２／ｍｕｔＬ１Ｌ３チェーンシャッフルされたライブラリが作製された。最も親和性の高い変異体をリッチ化するために、第１世代ライブラリ（表９）の最高性能の酵母クローンである２Ｂ１０を使用して、よりストリンジェントなソートゲートを設定した。３０℃～３７℃で非標識ＰＡＣ１との一晩のオフレート競合後、２Ｂ１０クローンと比較してオフレートが有意に低下した酵母クローンを選別することができた。約２００クローンの制限されたスクリーニングは、約１００のオフレートが２Ｂ１０より遅いことが明らかになったが、有望なバインダのほとんどにＨＣＤＲ２内の潜在的なアスパラギン脱アミド化ライアビリティが含まれていた。ＥＣＤのＰＤ１又はＧＩＰＲとの非特異的結合は、スクリーニングされた全てのクローンに関して最小であった。ストリンジェントな結合及び配列フィルタを適用すると、ＰＡＣ１の結合が２Ｂ１０クローンよりも有意に改善され（３７℃の一晩競合後、関連割合が２倍超に高い）、ポテンシャル配列ライアビリティがない上位１０個の変異体が得られた（表１０）。これらの上位１０個の変異体の親２９Ｇ４ｖ１０抗体からの配列変化並びに３０℃及び３７℃でのオフレートアッセイ後のヒトＰＡＣ１ ＥＣＤ結合のパーセンテージを表１０に示す。関連パーセンテージは、オフレートアッセイ後の正規化された結合を、オフレートアッセイなしの正規化された結合で除算した値として計算された。ＰＡＣ１ ＥＣＤ結合のパーセンテージが高いほど、変異体Ｆａｂのオフレートが遅いことを示す。
Figure 0007339262000118
表１０に示すように、上位１０個の結合変異体の全てがＣＤＲＬ１においてＱ２７Ｋ変異を含有し、１つを除く全てがＣＤＲＬ１においてＲ３１Ｗ変異を含有した。変異体の全てがＣＤＲＨ２中のアミノ酸位置Ｄ５４及びＮ５７で変異を有し、またほとんどがＣＤＲＨ２中のアミノ酸位置Ｇ５６に変異を有した。重鎖フレームワーク２（ＦＲ２）及びフレームワーク３（ＦＲ３）領域中のアミノ酸位置４９及び７０での保存的変異は、これらの１０個の変異体の多くでも観察された。
要約すると、２９Ｇ４ｖ９ Ｆａｂとの複合体のＰＡＣ１ ＥＣＤの構造によって導かれ、ＰＡＣ１ ＥＣＤへの結合を改善するために、２９Ｇ４ｖ２２及び２９Ｇ４ｖ１０抗ＰＡＣ１中和抗体の密接に関連するバリアント、２９Ｇ４ｖ１０変異体のコンビナトリアルライブラリが設計され、ソートされた。最も改良されたバインダを単離するため、リッチ化変異は、よりストリンジェントな条件下での選択のために、ＣＤＲシャッフル及び／又はチェーンシャッフルされたライブラリの構築を通じて結合された。ソート後の個別の酵母Ｆａｂクローンのスクリーニングにより、２９Ｇ４ｖ１０親抗体と比較して結合オフレートが有意に遅く、非特異的結合が最小限であり、ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤへのバインダの改善が得られた。改善された親和性バリアントのサブセットを組換えにより生成し、実施例３に記載されるようにｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能的活性について評価した。
実施例３．ヒトＰＡＣ１抗体バリアントのｉｎ ｖｉｖｏでの機能的活性
抗ＰＡＣ１抗体の阻害力に対する共結晶構造（実施例１）又は酵母ディスプレイライブラリ（実施例２）の分析によって同定された重鎖及び軽鎖可変領域における変異の影響を評価するために、バリアントは、完全な二価のモノクローナル抗体として、且つ／又は一価のＦａｂ－Ｆｃ融合物（例えば、二量体ＩｇＧ Ｆｃ領域に融合したＦａｂ領域）として組換え発現法によって生成され、以下でより詳細に説明するように、細胞系ＡＭＰアッセイで評価された。モノクローナル抗体の軽鎖及びＦａｂ断片は、配列番号３１８又は配列番号３１９の配列を有するヒトκ軽鎖定常領域に融合された示された抗体バリアント由来の軽鎖可変領域を含んでいた。モノクローナル抗体の重鎖及びＦａｂ－Ｆｃ融合物は、配列番号３２５の配列を有するアグリコシル化した、ジスルフィド安定化ヒトＩｇＧ１ｚ定常領域に融合された示された抗体バリアント由来の重鎖可変領域を含んでいた。
ＰＡＣ１抗体バリアント配列は、ＳＤＭが成功しなかった場合、部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）又はゴールデンゲートアセンブリ（ＧＧＡ）によって生成された。部位特異的変異誘発は、変異部位に隣接する対になった変異誘発プライマーを利用した。二本鎖プラスミドＤＮＡ鋳型を使用して、ベクター全体のＰＣＲ反応を実施した。特定のクローンの望ましい変異の全てについてのプライマーをマスタープライマーミックスに組み合わせ、１つからいくつかの変異を個別の反応に組み込んだ。増幅後、メチル化ＤＮＡを優先的に切断するエンドヌクレアーゼであるＤｐｎＩで消化することにより、鋳型プラスミドＤＮＡを除去した。次いで、ＳＤＭ産物を増殖のためのコンピテントセルに形質転換し、シーケンシングによるスクリーニングを行った。ＳＤＭ反応は、製造元の指示に従い、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して実施した。
ＳＤＭが成功しなかった場合、代替のクローニング戦略が使用された。要約すると、ＧＧＡは、ＩＩ型制限酵素及びＴ４ ＤＮＡリガーゼを利用して、複数のＤＮＡ断片を切断し、シームレスにライゲーションした（Ｅｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，Ｖｏｌ．３（１１）：ｅ３６４７，２００８）。本実施例では、複数のＤＮＡ断片は、（ｉ）コザックコンセンサス配列、シグナルペプチド配列及び抗体可変領域配列をコードする合成核酸配列（ｇＢｌｏｃｋ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）；（ｉｉ）Ｐａｒｔｓベクターから放出された抗体定常ドメイン断片；及び（ｉｉｉ）発現ベクターの骨格からなった。ＧＧＡ反応は、１０ｎｇのｇＢｌｏｃｋ、１０ｎｇのＰａｒｔベクター、１０ｎｇの発現ベクター、１μＬの１０倍Ｆａｓｔ Ｄｉｇｅｓｔ反応バッファー＋０．５ｍＭのＡＴＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、０．５μＬのＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ Ｅｓｐ３Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、１μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ／μＬ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）及び水１０μＬまでで構成された。反応は、３７℃で２分の消化工程及び１６℃で３分のライゲーション工程からなる１５サイクルにわたって行われた。１５サイクル後、最後の５分間の３７℃消化工程及び８０℃での５分間の酵素不活化工程が続いた。
クローニング後、最初の２２アミノ酸がＶＫ１シグナルペプチド（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ；配列番号４８６）であるＰＡＣ１抗体ポリペプチドは、２９３ＨＥＫ細胞を対応するｃＤＮＡで一過性にトランスフェクトすることにより生成された。１．５×１０６細胞／ｍＬの細胞に、Ｆ１７培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中の４ｍＬのＰＥＩ／ｍｇのＤＮＡと共に、０．５ｍｇ／ＬのＤＮＡ（ｐＴＴ５ベクター中０．５ｍｇ／ＬのＰＡＣ１）又は（０．４ｍｇ／Ｌの空のｐＴＴ５ベクターを有するｐＴＴ５ベクター中の０．１ｍｇ／ＬのＰＡＣ１）（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＮＲＣＣ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３０：ｅ９，２００２）をトランスフェクトした。イーストレート（Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）及びグルコースをトランスフェクションの１時間後に培養物に添加し、次いで０．１％のＫｏｌｌｉｐｈｏｒ、６ｍＭのＬ－グルタミン及び５０μｇ／ｍＬのジェネティシンを補充したＦ１７発現培地を使用して、細胞を懸濁液中で６日間増殖させ、その後、条件培地を精製のために回収した。
タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）、続いてカチオン交換クロマトグラフィー（ＳＰセファロース高性能カラム（ＳＰ ＨＰ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、条件培地からＰＡＣ１抗体バリアントを精製した。ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ））を使用して、各精製プールのタンパク質濃度を２８０ｎｍ（Ａ２８０）でのＵＶ吸光度によって測定した。精製したプールを、２０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ透析フラスコ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、２Ｌの１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％のスクロース、ｐＨ５．２（Ａ５２Ｓｕ）に対して、撹拌プレート上で穏やかに撹拌しながら、４℃で２時間透析した。使用した透析液をデカンテーションで取り除き、新しい２ＬのＡ５２Ｓｕを添加し、透析を一晩行った。透析後、３０ｋＤａ ＭＷＣＯ限外濾過濃縮装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して試料を濃縮し、各試料がＡ２８０に基づいて約４０ｍｇ／ｍＬになるまで、スイングバケットローターで２，０００×ｇで遠心分離した。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩマイクロキャピラリー電気泳動（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）及びＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣタンパク質ＢＥＨ ＳＥＣカラム、２００Å、４．６×３００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、最終生成物をメインピーク純度について分析した。Ｅｎｄｏｓａｆｅ－ＭＣＳ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）及び０．０５ＥＵ／ｍＬ ＰＴＳカートリッジ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を使用して、エンドトキシン含有量を測定した。
精製されたモノクローナル抗体又はＦａｂ－Ｆｃ融合タンパク質の機能的活性を、細胞系ＰＡＣ１受容体ｃＡＭＰ活性アッセイを使用して評価した。ＰＡＣＡＰ３８とＰＡＣＡＰ２７との両方は、ＰＡＣ１受容体のアゴニストであり、その活性化により細胞内ｃＡＭＰの増加がもたらされる。アッセイは、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－２２６６；「ＣＲＬ－２２６６細胞」）由来のヒト神経芽細胞腫誘導細胞株（ＳＨ－ＳＹ５Ｙ；Ｂｉｅｄｌｅｒ ＪＬ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３８：３７５１－３７５７，１９７８）を用いた。ＣＲＬ－２２６６細胞は、内因的にヒトＰＡＣ１受容体を発現する（Ｍｏｎａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１０４（１）：７４－８８，２００８）。加えて、ラットＰＡＣ１受容体（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿１３３５１１．２）又はカニクイザルＰＡＣ１受容体（ＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿０１５３０３０４１．１）を安定して発現するＣＨＯ細胞株をＣＲＬ２２６６細胞の代わりにアッセイのために使用して、ラット及びカニクイザルＰＡＣ１受容体における抗ＰＡＣ１抗体又はＦａｂ－Ｆｃ融合の種交差反応性を評価した。ＬＡＮＣＥ Ｕｌｔｒａ ｃＡＭＰアッセイキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、ｃＡＭＰ濃度を測定した。
アッセイ当日、凍結したＣＲＬ－２２６６細胞を３７℃で解凍し、アッセイバッファーで１回洗浄した。２，０００個の細胞を含有する１０μＬの細胞懸濁液を９６ハーフエリアホワイトプレートに添加した。５μＬの抗ＰＡＣ１バリアントモノクローナル抗体又はＦａｂ－Ｆｃ融合タンパク質（１０点容量反応曲線：１μＭ～０．５ｆＭの範囲の濃度）を添加した後、混合物を室温で３０分間インキュベーションした。次いで、５μＬのヒトＰＡＣＡＰ３８（１０ｐＭの最終濃度）をアゴニストとして添加し、混合物を室温で更に１５分間インキュベーションした。ヒトＰＡＣＡＰ３８刺激後、２０μＬの検出ミックスを添加し、室温で４５分間インキュベーションした。プレートをＥｎＶｉｓｉｏｎ機器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で発光波長６６５ｎｍにおいて読み取った。データをＰｒｉｚｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）によって処理及び分析し、試験されたアンタゴニスト濃度（例えば、抗ＰＡＣ１バリアント抗体又はＦａｂ－Ｆｃ融合タンパク質）の関数としてＰＯＣ（対照のパーセント、対照はアッセイで使用されるアゴニストの活性として定義される）を示し、標準の非線形回帰曲線をフィッティングして、ＩＣ５０値を得た。ＰＯＣを以下のとおり計算した。
Figure 0007339262000119
一価のＦａｂ－Ｆｃ融合タンパク質は、表６及び７にまとめられた変異で生成され、上記の細胞系ｃＡＭＰアッセイにおける機能的活性について試験した。変異体Ｆａｂ－Ｆｃ融合タンパク質は、２つの別々のグループ：親分子と比較してヒトＰＡＣ１受容体に対する阻害力を改善する変異及び中立として特徴付けられる変異に分けられた（表１１）。変異の平均効力が親分子よりも１．５倍弱であり、同じ実行で少なくとも１つの効力測定が親分子よりも強力である場合、変異は、中立と特性付けられた。
Figure 0007339262000120
ヒトＰＡＣ１受容体に対する阻害力の増加をもたらした変異は、抗体表面の３次元空間の３つの異なる領域にある。バリアント抗体及びＦａｂ－Ｆｃ融合タンパク質の第２ラウンドは、これらの３つの領域の変異を組み合わせることにより生成され、効力を更に高める可能性がある。加えて、中立変異のいくつかは、結合に有意な影響を与えない可能性が高いために組み込まれたが、抗体の生物物理学的特性を改変するメカニズムを提供し得る。所望の変異を含有する可変領域を、ヒトアグリコシル化ＩｇＧ１ Ｆｃ領域及び／又は一価Ｆａｂ－Ｆｃ融合タンパク質を有する二価モノクローナル抗体中に組み込んだ。アグリコシル化ヒトＩｇＧ１抗体Ｆｃ領域は、ＥＵ番号付けによるＮ２９７Ｇ、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ変異を有するヒトＩｇＧ１ｚ Ｆｃ領域の配列（配列番号３２５）を含んでいた。バリアント抗体及び変異の組み合わせを有するＦａｂ－Ｆｃ融合タンパク質を細胞系ｃＡＭＰアッセイの機能的活性について評価した。結果を以下の表１２に示す。
Figure 0007339262000121
Figure 0007339262000122
Figure 0007339262000123
Figure 0007339262000124
Figure 0007339262000125
Figure 0007339262000126
Figure 0007339262000127
抗体が、軽鎖可変領域中のＱ２７位置（Ｑ２７Ｋ）に変異を有し、重鎖可変領域中のＤ５４位置（Ｄ５４Ｉ、Ｄ５４Ｑ又はＤ５４Ｎ）及び／又はＧ５６位置（Ｇ５６Ｒ又はＧ５６Ｎ）に変異を有する場合、力の最大の改善が見られた。配列番号５２の軽鎖可変領域中のＱ２７は、ＡＨｏ番号付けで２９位のアミノ酸に対応する。配列番号１９１の重鎖可変領域中のＤ５４及びＧ５６は、それぞれＡＨｏ番号付けで６１位及び６６位のアミノ酸に対応する。軽鎖可変領域中のＱ２７位置のリジン又はアルギニンなどの塩基性アミノ酸は、おそらくＰＡＣ１ ＥＣＤ中の酸性アミノ酸Ｇｌｕ１２０とＡｓｐ１２１との電荷相補性の改善をもたらす（図２Ａのゾーン１を参照されたい）。重鎖可変領域中の位置Ｄ５４の疎水性残基（例えば、イソロイシン）又は中性親水性残基（例えば、グルタミン又はアスパラギン）及び重鎖可変領域中の位置Ｇ５６の塩基性残基（例えば、アルギニン）又は中性親水性残基（例えば、アスパラギン）は、ＰＡＣ１ ＥＣＤ中のアミノ酸残基Ａｓｎ６０及びＩｌｅ６１との疎水性相互作用又は水素結合を改善するように見えた（図３Ｂのゾーン６を参照されたい）。
ＭｕｔＨＣライブラリスクリーニングからの上位１１個の変異体（表８）は、ｃＡＭＰアッセイにおける生成及び機能試験（表１３）のために上記のようにアグリコシル化ＩｇＧ１モノクローナル抗体及び一価Ｆａｂ－Ｆｃ分子としてフォーマットされた。このバリアントのセットに対する酵母への適度に改善された結合により、１１個のｍＡｂの４個及び１１個のＦａｂ－Ｆｃｓの７個のための改善されたＰＡＣ１受容体ブロッキング機能に変換された。それにも関わらず、抗体として、ｉＰＳ：４２１８７３変異体は、親２９Ｇ４ｖ１０抗体と比較してＰＡＣ１ブロッキング機能で約４倍の改善を示した。変異体の活性ランキングは、２つの形式間でほぼ一貫しており、おそらくアビディティの損失のために、Ｆａｂ－Ｆｃｓは、一貫してｍＡｂｓよりも弱い機能（より高いＩＣ５０値）を示す。
Figure 0007339262000128
チェーンシャッフルされたライブラリ由来の２９Ｇ４ｖ１０変異体のサブセット（表９及び表１０）をアグリコシル化ＩｇＧ１モノクローナル抗体に変換し、細胞系ｃＡＭＰアッセイで機能的活性を試験した。結果を以下の表１４に示す。
Figure 0007339262000129
モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）としてフォーマットした場合、第２世代のチェーンシャッフルされたライブラリ（表１０）由来の２９Ｇ４ｖ１０変異体は、第１世代のチェーンシャッフルされたライブラリ（表９）からの変異体よりもＰＡＣ１の強力なアンタゴニストであり、ＰＡＣ１ブロッキング機能の強化は、特に結合の改善及び結合オフレートの低下と相関することが示唆される。しかしながら、驚くべきことに、ｍＡｂｓとしての変異体の大部分は、抗体ｉＰＳ：４２１８７３よりも活性が低く、ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤへの結合がおそらく強化されているにも関わらず、ｍｕｔＨＣライブラリスクリーニングからの最も強力な変異体である（表１３）。それにも関わらず、３０＿Ｄ０５変異体は、２９Ｇ４ｖ１０親抗体及び２９Ｇ４ｖ２２対照抗体と比較してそれぞれ機能が約１０倍及び６７倍向上した。１つの共通のフィーチャは、非常に強力なＳ８＿３０＿Ｄ０５により共有され、ｉＰＳ：４２１８７３ｍＡｂｓは、ＨＣＤＲ２内のＤ５４Ｒ変異であり、他のそれほど強力でないｍＡｂ変異体に存在しない。興味深いことに、２９Ｇ４ｖ１０親抗体及び２９Ｇ４ｖ２２対照抗体とは対照的に、親和性成熟バリアントは、全てラットＰＡＣ１受容体との交差反応性を示す（表１４）。
実施例４．ヒトＰＡＣ１抗体バリアントのｉｎ ｖｉｖｏでの機能的活性
マキサジランは、血管拡張性ペプチドであり、ＰＡＣ１受容体のアゴニストである。マキサジランを皮内投与した場合、レーザードップラーイメージングで測定できる局所的な皮膚血流が増加する。ＰＡＣ１アンタゴニスト（例えば、抗ＰＡＣ１抗体）によるこの効果の阻害は、ＰＡＣ１生物活性の拮抗作用の並進薬力学的モデルとして役立ち得る。実施例３からのモノクローナル抗体としてフォーマットした場合、改善されたｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害力を示したＰＡＣ１バリアントのサブセットを、ラット皮膚血流モデルを使用することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＡＣ１受容体活性化を阻害する効力について試験した。
ｉｎ ｖｉｖｏでの薬力学モデル
試験の時点で８週齢～１２週齢のナイーブ雄Ｓｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。本実施例における全ての手順は、動物福祉法（Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔ）、実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）及び実験動物福祉部門（Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ）に準拠して実施した。動物は、Ａｍｇｅｎ’ｓ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＡＡＡＬＡＣ）認定施設の無菌換気ｍｉｃｒｏ－ｉｓｏｌａｔｏｒハウジングにおいて集団で飼育した。動物は、自動給水システムによりペレット飼料（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ ２０２０Ｘ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）及び水（現場生成逆浸透）に自由にアクセスした。
抗ＰＡＣ１抗体のサブセットを、ラットマキサジラン誘導皮膚血流増加（ＭＩＩＢＦ）薬力学（ＰＤ）モデルにおいて、レーザードップラーイメージングを用いて試験した。マキサジラン（Ｂａｃｈｅｍ、Ｈ６７３４．０５００）の投薬溶液を、１×リン酸塩－緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈したマキサジラン原液（０．５ｍｇ／ｍＬ）により、最終濃度０．５μｇ／ｍＬに毎日新たに調製した。実験に必要な用量に応じて、全ての抗ＰＡＣ１抗体（Ａｂｓ）を１０ｍＭの酢酸ナトリウム、９％のスクロース、ｐＨ５．２（Ａ５２Ｓｕ）中において異なる濃度で調製し、レーザードップラーイメージングによる皮膚血流（ＤＢＦ）測定の１日前に単回ボーラス静脈内注射を投与した。
レーザードップラーイメージャー（ＬＤＩ－２、Ｍｏｏｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌｔｄ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を使用して、６３３ｎｍヘリウムネオンバルブによって生成された低出力レーザービームを用いてラット腹部の皮膚を測定した。測定分解能は、０．２～２ｍｍであり、器具の開口部と組織表面との間のスキャン距離は、３０ｃｍであった。ＤＢＦを測定し、ベースラインからの変化％［１００×（個々のマキサジラン後のフラックス－個々のベースラインフラックス）／個々のベースラインフラックス］又はＤＢＦ阻害％［ＢＬからのビヒクルの平均％－個々の抗体処理ラットのＢＬからの変化％］のいずれかとして表し、抗体効果の大きさを定量化した。
試験日にプロポフォールで麻酔した後、ラットの腹部領域を剃毛し、各動物を温度制御循環温水パッド上に仰臥位に置いて、試験中、安定した体温を維持した。１０～１５分の安定期間後、ゴム製Ｏリング（０．９２５ｃｍ内径、Ｏ－Ｒｉｎｇｓ Ｗｅｓｔ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を（目に見える血管の上に直接配置することなく）ラットの腹部に配置した。選択された領域上にＯリングを配置した後、ベースライン（ＢＬ）ＤＢＦ測定を行った。ＢＬスキャン後、ＰＡＣ１アゴニストマキサジランをＯリングの中心に皮内注射（０．５μｇ／ｍＬを２０μＬ）で投与した。ＤＢＦは、マキサジラン注射後３０分又は抗体処理後２４±１．５時間で測定された。Ｏリングは、ＤＢＦが分析された対象領域を定義する。
全てのＤＢＦ結果を平均±ＳＥＭとして表した。一元配置分散分析、続いてダネットの多重比較検定（ＭＣＴ）を用いて、ビヒクル治療に対するＰＡＣ１Ａｂ効果の統計的有意性を評価した。ｐ値＜０．０５を用いて、２群間の有意性を決定した。
単一静脈内（ｉ．ｖ．）投与スクリーニング評価
ラットを、０．１ｍｇ／ｋｇ又は０．３ｍｇ／ｋｇの用量において、マキサジランチャレンジ（０．５μｇ／ｍＬを２０μＬ）の２４時間前に７つの異なる抗ＰＡＣ１抗体（４２０６５３、４２０８４５、４２０９４３、４２１８７３、４２０８８９（ＰＬ－５０３４７）、４２１０９１（ＰＬ－５０３５０）及び４２１０５１（ＰＬ－５０３５１））の１つで前処理し、これは、ビヒクル（Ａ５２Ｓｕ）処理群と比較してＭＩＩＢＦの減少をもたらした。マキサジラン処理後３０分で、試験した７つの抗体の５つについて、ビヒクル群と比較して０．３ｍｇ／ｋｇでＭＩＩＢＦの統計的に有意な抑制があった（図６）。７つの抗体の６つについて、２４±１．５時間での最終血清濃度を以下の表１５に示す。
Figure 0007339262000130
用量反応評価
ラットを、０．０１ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量において、マキサジランチャレンジ（０．５μｇ／ｍＬを２０μＬ）の２４時間前に４つの異なる抗ＰＡＣ１抗体（４２０６５３、４２０８４５、４２０９４３及び４２１８７３）で前処理した。ビヒクル処理群と比較したＭＩＩＢＦの用量依存的減少が４つの抗体の各々で観察された（図７Ａ～図７Ｄ）。Ａｂ４２０６５３は、０．０６ｍｇ／ｋｇの低用量で有意な効果をもたらし、０．０６、０．１、０．３、１及び３ｍｇ／ｋｇでそれぞれ４４％、６８％、８６％、９５％及び１０１％の阻害効果を示した（図７Ａ）。Ａｂ４２０８４５は、０．３、１及び３ｍｇ／ｋｇでそれぞれ７９％、１０２％及び１０７％の阻害を有する有意な効果をもたらした（図７Ｂ）。Ａｂ４２０９４３及び４２１８７３は、Ａｂ４２０８４５及びＡｂ４２０６５３よりもわずかに効力が低かったが、１ｍｇ／ｋｇで依然として有意な阻害効果をもたらした。Ａｂ４２０９４３についてのＤＢＦの阻害％は、１、３、１０、３０ｍｇ／ｋｇでそれぞれ５６％、４６％、５２％及び８１％であった（図７Ｃ）。Ａｂ４２１８７３についてのＤＢＦの阻害％は、１、３、１０及び３０ｍｇ／ｋｇでそれぞれ３４％、５５％、７２％及び１００％であった（図７Ｄ）。
本実施例で記載された実験の結果は、リガンド誘導ＰＡＣ１受容体活性化をｉｎ ｖｉｔｒｏで強力に阻害する抗体が、ＰＡＣ１媒介血管拡張のモデルである皮膚血流アッセイによって評価されるように、ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＡＣ１受容体活性化も阻害することを示す。
実施例５．ヒトＰＡＣ１抗体バリアントの薬物動態特性
４つの抗ＰＡＣ１抗体（４２０６５３、４２０８４５、４２０９４３及び４２１８７３）の予備的薬物動態（ＰＫ）を、ナイーブ雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット及びナイーブ雄カニクイザルを用いて実施した。２９Ｇ４ｖ１０親抗体又は構造的に関連する２９Ｇ４ｖ２２抗体（配列番号５３を含むＶＬ及び配列番号１９２を含むＶＨ）を対照として評価した。試験抗体を静脈内ボーラス投与によって試験用動物に投与した。血液試料は、投与後の特定の時点で収集され、血清に処理された。全ての血清検体は、その後の分析のために移すまで約－７０℃（±１０℃）で保存した。
投与後のラット及びカニクイザルの血清試料中の試験抗体の量を測定するために、比色分析の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）に対するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用して現像した。マイクロタイタープレートを２μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＦｃ ｍＡｂでコーティングした。コーティングしたマイクロタイタープレートは、Ｉ－ｂｌｏｃｋ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）でブロックされた。アッセイ標準（ＳＴＤ）及び品質管理（ＱＣ）は、試験対象種からの１００％血清に試験抗体をスパイクすることで調製した。ＳＴＤ、ＱＣ、ブランク及び試験用試料をアッセイバッファー（１ＭのＮａＣｌ、１％のＢＳＡ及び０．５％のＴｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳ）中に１：３０で希釈した。希釈したＳＴＤ、ＱＣ、ブランク及び試験用試料を、撹拌することなく、コーティングされたマイクロタイタープレート上で２５℃において１時間インキュベーションした。洗浄工程後、アッセイバッファー中３０ｎｇ／ｍＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートマウス抗ヒトＦｃ ｍＡｂをマイクロタイタープレートに添加し、撹拌することなく、２５℃で１時間インキュベーションした。最終洗浄工程後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）過酸化物基質溶液（ＫＰＬ Ｉｎｃ．，ＭＤ，ＵＳＡ）をマイクロタイタープレートに添加した。ＨＲＰの存在下において、ＴＭＢは、ＳＴＤ、ＱＣ及び試験用飼料に存在する結合ヒトＦｃの量に比例する比色シグナルを生成した。発色現像時間は、分析対象物に依存し、２Ｎ硫酸の添加により停止した。光学密度（ＯＤ）は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣマイクロタイタープレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを使用して、６５０ｎｍを基準に４５０ｎｍで測定された。アッセイデータを、１／ｙの重み付け係数を使用したロジスティック（自動推定）回帰モデルを使用して回帰した。アッセイのダイナミックレンジは、２０ｎｇ／ｍＬ～２０００ｎｇ／ｍＬであった。
ラット及びカニクイザルＰＫ試験の両方について、非コンパートメント分析は、個々の血清濃度－公称時間データでＰｈｏｅｎｉｘ（登録商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）（バージョン６．４；Ｃｅｒｔａｒａ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用して実施された。定量下限（ＬＬＯＱ、２０ｎｇ／ｍＬ）未満の個々の濃度値は、定量限界未満（ＢＱＬ）を下回ると報告され、要約統計量の計算ではゼロに設定された。ＬＬＯＱ未満の平均濃度値は、報告又はプロットされなかった。ＬＬＯＱ未満の全ての濃度値は、非コンパートメント分析から除外された。公称用量及び公称サンプリング時間をＰＫ分析に使用した。以下のＰＫパラメータを推定した：
・静脈内投与後の初期濃度（Ｃ０）値は、観測された最初の２つの低下する濃度値を使用して、時間０に逆外挿することによって推定した。
・時間０から無限大（ＡＵＣｉｎｆ）までの濃度時間曲線の下の面積は、線形台形法で計算した。
・終末相半減期（ｔ１／２，ｚ）は、ｌｎ２／λｚとして計算した。λｚは、曲線の末端部分に関連する薬物の一次速度定数である。
・全身クリアランス（ＣＬ）は、ＣＬ＝用量／静脈内投与後のＡＵＣｉｎｆとして計算した。
・定常状態での分布量（Ｖｓｓ）は、Ｖｓｓ＝ＣＬ×ＭＲＴｉｎｆ（時間ゼロから無限大までの平均滞留時間）のように推定された。
ヒトＰＡＣ１、ラットＰＡＣ１及びカニクイザルＰＡＣ１に対する４つの抗体並びに２９Ｇ４ｖ１０親抗体及び２９Ｇ４ｖ２２対照抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害力のまとめを以下の表１６に提供する。抗体は、実施例３に記載されているｃＡＭＰアッセイを使用して、異なる種由来のＰＡＣ１受容体のリガンド誘導（ＰＡＣＡＰ３８又はマキサジラン）活性化を阻害する能力について評価された。
Figure 0007339262000131
４つの抗体の１つを１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ及び２５ｍｇ／ｋｇの用量でラットに静脈内投与した。投与後、様々な時点で血液試料を収集し、上記のＥＬＩＳＡアッセイを使用して、各時点で血清試料において抗体濃度を測定した。ラットについてのＰＫパラメータ試験を以下の表１７にまとめ、各用量の血清濃度－時間プロファイルを図８Ａ～８Ｃに示す。
Figure 0007339262000132
４つの抗体の１つを１０ｍｇ／ｋｇの用量でカニクイザルに静脈内投与した。投与後、様々な時点で血液試料を収集し、上記のＥＬＩＳＡアッセイを使用して、各時点で血清試料において抗体濃度を測定した。カニクイザルについてのＰＫパラメータ試験を以下の表１８にまとめ、血清濃度－時間プロファイルを図９に示す。２９Ｇ４ｖ２２抗体のＰＫプロファイルを比較のために示す。
Figure 0007339262000133
この用量では、ＰＡＣ１バリアント抗体の４つ全てが２９Ｇ４ｖ２２対照抗体よりも長い血清半減期を示した。興味深いことに、４つのＰＡＣ１バリアント抗体は、全て２９Ｇ４ｖ２２対照抗体と比較してＰＡＣ１受容体に対してより高いｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害力を示したが（表１６）、バリアントのいくつかのＰＫプロファイルは、カニクイザルではあまり好ましくなかった。例えば、Ａｂ４２０８４５は、２９Ｇ４ｖ２２対照抗体と比較してクリアランス率が速く、全体的な曝露が低かった。しかし、Ａｂ４２０６５３は、２９Ｇ４ｖ２２対照抗体と同等のＰＫプロファイルを有し（図９）、Ａｂ４２０６５３を同じ投与頻度で低用量の投与で同様の薬理効果を達成できることを示唆した。
実施例６．１９Ｈ８ヒトＰＡＣ１抗体の酵母ディスプレイ親和性成熟
阻害力が向上した更なる抗ＰＡＣ１抗体を生成するために、１９Ｈ８抗体（配列番号２９６のＶＨ領域；配列番号６７のＶＬ領域）を、実施例２で記載された方法を用いて、酵母ディスプレイされたＦａｂライブラリのＦＡＣＳにより親和性成熟させた。１９Ｈ８抗体は、２９Ｇ４ｖ９、２９Ｇ４ｖ１０及び２９Ｇ４ｖ２２抗体と構造的に異なるが、ヒトＰＡＣ１受容体に対して非常に強力な中和活性も示す。
ＰＡＣ１ ＥＣＤ－１９Ｈ８ Ｆａｂ複合体の結晶構造情報は、最初に利用できなかったため、各ＣＤＲループ内の表面露出残基を識別するために相同性モデルが生成された。ＰＡＣ１ ＥＣＤが表面に露出したＣＤＲ残基と直接接触すると予想されるため、これらの接触の性質を変更するか、又は包括的な変異誘発によって新しい接触を作りだすかにより、抗体のＰＡＣ１ ＥＣＤへの結合が改善されるとの仮説が立てられた。各ライブラリの理論的多様性を扱いやすい１０６～１０７に制限するために、ＭＩＸ１９飽和変異誘発についてＣＤＲごとに最大５つの位置が同定され、ＣＤＲごとに１つの別個のライブラリが構築された。モデル化されたＣＤＲＨ３ループコンフォメーションの精度に関する懸念により、このループ内で最も溶媒にさらされた残基は、確実に同定できなかった。したがって、ループの最初及び最後の残基を除いて、ＣＤＲＨ３内の１１のＣＤＲ残基の８つでの多様化が考慮された。飽和変異誘発の位置の数を５つに絞り込むために、芳香族残基は、タンパク質間相互作用の重要なメディエーターであることが多いため、ＣＤＲＨ３内の２つのトリプトファン及び１つのフェニルアラニンを回避した。全体で、６つの個別ＣＤＲ Ｆａｂライブラリは、多様化のために１６の重鎖及び１５の軽鎖ＣＤＲ残基を標的にするように設計され、構築されたライブラリは、理論的多様性を４．５～４６倍でオーバーサンプリングした。各ＣＤＲライブラリについての標的位置のまとめを以下に示す。
重鎖ＣＤＲライブラリ（配列番号２９６に関するアミノ酸位置）：
・ＣＤＲＨ１ライブラリ：Ａｓｐ２７（ＦＲ１のＣＤＲＨ１に隣接して配置されている）、Ｓｅｒ３１、Ａｓｎ３２、Ｓｅｒ３３及びＴｈｒ３５
・ＣＤＲＨ２ライブラリ：Ｔｙｒ５４、Ｔｙｒ５５、Ｓｅｒ５７、Ｌｙｓ５８、Ｓｅｒ６０及びＨｉｓ６２
・ＣＤＲＨ３ライブラリ：Ｔｈｒ１０３、Ｌｙｓ１０５、Ｇｌｎ１０６、Ｌｅｕ１０７及びＬｅｕ１１０
軽鎖ＣＤＲライブラリ（配列番号６７に関するアミノ酸位置）：
・ＣＤＲＬ１ライブラリ：Ｓｅｒ２８、Ｓｅｒ３０、Ａｒｇ３１、Ｔｙｒ３２及びＡｓｎ３４
・ＣＤＲＬ２ライブラリ：Ｔｙｒ４９（ＦＲ２のＣＤＲＬ２に隣接して配置されている）、Ａｌａ５０、Ａｌａ５１、Ｓｅｒ５２及びＳｅｒ５３
・ＣＤＲＬ３ライブラリ：Ｓｅｒ９１、Ｔｙｒ９２、Ｓｅｒ９３、Ｐｒｏ９４及びＰｈｅ９６
６つの個別のＣＤＲ Ｆａｂライブラリは、ＦＡＣＳを使用してヒトＰＡＣ１ ＥＣＤに結合するためにリッチ化され、結合に使用されるＰＡＣ１ ＥＣＤの濃度を下げることにより、連続する各ラウンドでストリンジェンシーを高める（ラウンド１：３０ｎＭ ＰＡＣ１ ＥＣＤ；ラウンド２：０．６７ｎＭ ＰＡＣ１ ＥＣＤ；及びラウンド３：０．２ｎＭ ＰＡＣ１ ＥＣＤ）。更なる親和性の向上のために、個別のＣＤＲライブラリ（１つは、重鎖用であり、もう一方は、軽鎖用である）からのリッチ化変異を組み合わせた２つのＣＤＲシャッフルされたＦａｂライブラリ並びに各ＣＤＲシャッフルされたライブラリからのリッチ化変異を組み合わせた最終的なチェーンシャッフルされたライブラリも構築された。ＣＤＲシャッフル及びチェーンシャッフルされたライブラリは、実施例２に記載され、図５に示されているオフレート結合選択プロセスを使用して、より厳しい条件下でＰＡＣ１ ＥＣＤ結合の選択に供された。チェーンシャッフルされたライブラリの最終的なオフレートソートは、このプール内のほとんどの酵母クローンが、親１９Ｈ８抗体と比較してＰＡＣ１ ＥＣＤ結合が有意に改善されていることを示唆した。
およそ８００の個々の酵母クローンをヒトＰＡＣ１ ＥＣＤへの結合の改善についてスクリーニングした。配列ライアビリティを有する変異体配列（例えば、システイン異常、Ｎ結合型グリコシル化部位、アスパルテート異性化、アスパラギン脱アミド化及びトリプトファン酸化部位）は、除去された。上位約２００個の特有結合は、二次スクリーニングに進み、オフレート結合によってランク付けされ、非特異的結合について評価された。二次スクリーニングでは、非標識ＰＡＣ１ ＥＣＤと３０℃で一晩競合させた後のビオチン化ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤのより高い会合パーセンテージで測定した際、８０％超のクローンが親１９Ｈ８抗体よりも結合オフレートが遅かった。３０℃で１時間のみ競合した後、親１９Ｈ８からビオチン化ＰＡＣ１ ＥＣＤが完全に解離したため、測定値は、オフレートの改善の下限を表している。スクリーニングされたクローンは、いずれも関連のないＰＤ１及びＧＩＰＲ受容体のＥＣＤへの結合を示さなかったため、クローンのプールを更に絞り込むために、更なる配列フィルタを適用して、ＣＤＲにフーリン切断部位、更なるトリプトファン残基及び親１９Ｈ８抗体よりも多くの共分散違反が含まれる変異体を除去した。クローンのランク付けには、構造的に関連する受容体であるヒトＶＰＡＣ２のヒトＰＡＣ１受容体への非特異的結合の程度を決定するために、ビオチン化ヒトＶＰＡＣ２ ＥＣＤを用いた更なる結合アッセイを使用した。ヒトＰＡＣ１ ＥＣＤへの結合オフレートが最も遅い上位２０個の変異体及び二次スクリーニングに入った酵母クローン間でのヒトＶＰＡＣ２結合の最小量を以下の表１９に示す。ＰＡＣ１ ＥＣＤ結合のパーセンテージが高いほど、変異体Ｆａｂのオフレートが遅いことを示す。
Figure 0007339262000134
Figure 0007339262000135
Figure 0007339262000136
改良された親和性バリアントは、完全な二価モノクローナル抗体及び／又は一価Ｆａｂ－Ｆｃ融合物（例えば、二量体ＩｇＧ Ｆｃ領域に融合したＦａｂ領域）として組換え発現法によって生成され、実施例３で記載されている細胞系ｃＡＭＰアッセイでｉｎ ｖｉｔｒｏの機能的活性を評価した。機能アッセイの結果を以下の表２０に示す。
Figure 0007339262000137
Figure 0007339262000138
Figure 0007339262000139
Ｆａｂ－Ｆｃ融合タンパク質としてフォーマットした場合、１９Ｈ８バリアントは、親１９Ｈ８ Ｆａｂ－Ｆｃ融合タンパク質と比較して２倍～５８倍の阻害力の増加を示した。１９Ｈ８バリアントの多くは、Ｆａｂ－Ｆｃ融合タンパク質としてフォーマットした場合、２９Ｇ４ｖ１０バリアントよりも強力であった（Ｆａｂ－Ｆｃ融合タンパク質について、表２０の結果を表１２の結果と比較して）。二価モノクローナル抗体としてフォーマットした場合、１９Ｈ８バリアントは、ＩＣ５０値が１桁のナノモル又はピコモルの範囲で強力なヒトＰＡＣ１中和活性も示した。
実施例７．カニクイザルにおけるヒトＰＡＣ１抗体バリアントのｉｎ ｖｉｖｏでの機能的活性
抗ＰＡＣ１抗体４２０６５３を使用してｉｎ ｖｉｖｏで標的結合を評価するために、カニクイザルにおけるマキサジラン誘導皮膚血流増加を阻害する抗体の能力を評価した。マキサジランは、ＰＡＣ１受容体の選択的アゴニストであり、げっ歯類、カニクイザル及びヒトの受容体を活性化することができる。実施例４で記載されるように、マキサジランの皮内投与により、レーザードップラーイメージングで測定できる局所的な皮膚血流の増加が引き起こされる。抗ＰＡＣ１抗体によるこの効果の阻害は、ＰＡＣ１生物活性の拮抗作用の並進薬力学的モデルとして役立ち得る。
５歳～８歳のオスのカニクイザルを試験のために用いた。マキサジラン（Ｂａｃｈｅｍ，Ｈ６７３４．０５００）の投薬溶液を、１×リン酸塩－緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にマキサジラン原液（０．５ｍｇ／ｍＬ）を希釈することにより、毎日新たに調製した。対照として試験される抗ＰＡＣ１抗体４２０６５３又は２９Ｇ４ｖ２２を、実験に必要な用量に応じて、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ－８０、ｐＨ５．２（Ａ５２ＳｕＴ）で異なる濃度で調製し、静脈内（ｉ．ｖ．）注入により投与した。
レーザードップラーイメージャー（ＬＤＩ２－ＩＲ、Ｍｏｏｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌｔｄ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を使用して、６３３ｎｍヘリウムネオンバルブによって生成された低出力レーザービームを用いて、腹側前腕又は大腿内側の剃毛した皮膚の皮膚血流量（ＤＢＦ）を測定した。赤外線の波長と可視光赤色照準ビームとを組み合わせて、より深い真皮（０．６～１ｍｍ）の血流に高い重み付けをした。入射光線は、静止した組織及び動いている血液によって散乱された。微小血管系で血液を移動すると、ドップラー光シフトが発生した。動いている血液からのシフト光及び組織からの非シフト光は、２つの二乗則検出器に向けられた。次いで、検出された強度変動を処理して、フラックス（組織の血流に比例）及び濃度（移動する血球の濃度に比例）のパラメータを得た。測定分解能は、０．２ｍｍ～２ｍｍであり、機器開口部と組織表面との間のスキャン距離は、２０～１００ｃｍであった。
ＤＢＦをフラックス（相対単位）として測定し、マキサジラン投与後３０分のベースラインからの変化率として表した［１００×（個別のマキサジラン後フラックス－個別のベースラインフラックス）／個別のベースラインフラックス］。２つの個別のＯリングからのフラックス単位を共に各試験セッションについて平均化した。個別の動物からのマキサジラン誘導血流増加（ＭＩＩＢＦ）に対する抗ＰＡＣ１抗体の阻害効果を阻害％として表した［１００×（０日目のベースラインからの変化％の平均－個別の抗体処理された動物のベースラインからの変化％）／０日目のベースラインからの変化％の平均］。
１５～２０分間の麻酔及びバイタルサインの安定化後、ゴム製Ｏリング（０．９２５ｃｍ内径、Ｏ－Ｒｉｎｇｓ Ｗｅｓｔ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を、目に見える血管上に直接配置することなく、腹側前腕又は大腿内側の事前剃毛した皮膚上において互いに約０．６～１ｃｍ離して配置した。各試験セッションで使用される四肢は、事前に決定されており、試験の異なる試験日に異なる四肢が使用された。皮膚上にＯリングを配置した後、ベースライン測定を行った。ベースラインスキャン後、２０μＬビヒクル（ＰＢＳ）中の１ｎｇのマキサジリン溶液をＯリングの中央で皮内注射した。Ｏリングは、データ分析中に対象領域として機能した。
抗ＰＡＣ１抗体投与前にＭＩＩＢＦの時間経過を０日目に取得した。１ｎｇのマキサジラン用量は、カニクイザルにおける以前のマキサジラン用量反応の結果に基づいて選択した。マキサジラン前のベースラインＤＢＦ測定後、マキサジラン皮内注射に対するＤＢＦ応答の時間経過を、マキサジラン適用後５、１０、１５、２０、２５及び３０分の時点でレーザードップラースキャンを取得して評価した。マキサジラン応答者を特定し、非応答者を試験に含めないようにするために、抗体投与前の事前スクリーニング手順を実施した。動物は、マキサジラン応答者と見なされ、ＤＢＦフローが６０フラックス単位以上で変化した場合（マキサジラン後３０分でのＤＢＦの平均－ベースラインの平均）に試験に含まれた。
マキサジラン応答者として特定された２４匹のカニクイザルは、０日目に０．１ｍｇ／ｋｇ若しくは３ｍｇ／ｋｇの用量の４２０６５３抗体又は１０ｍｇ／ｋｇの用量の抗体２９Ｇ４ｖ２２のいずれかを受けた。抗体は、シリンジ注入ポンプによって１ｍＬ／分の速度で伏在静脈への静脈内注入により投与された。マキサジラン後ＤＢＦ測定は、異なる四肢を使用して、２、４、７、１０、１４、２１、２８及び３６日目に行った。各場合において、ＤＢＦは、１ｎｇのマキサジラン皮内注射の３０分後にレーザードップラーイメージングによって測定された。薬物動態（ＰＫ）分析のための全血液試料は、抗体投与前、抗体処理後３０分、１、２、４、７、１０、１４、２１、２８、３５又は３６及び４２日を含む複数の時点で収集された。
図１０Ａに示すように、０．１ｍｇ／ｋｇではなく３ｍｇ／ｋｇの抗体４２０６５３は、２日目、７日目、１４日目及び２１日目（抗体処理後）のＭＩＩＢＦを、０日目（抗体処理前）と比較して有意に抑制した（ｎ＝８匹の動物／群；ボンフェローニ調整ｐ値＝０．００８７）。１０ｍｇ／ｋｇの抗体２９Ｇ４ｖ２２は、２日目及び７日目でＭＩＩＢＦも有意に抑制した（ｎ＝８匹の動物／群）（図１０Ａ）。３ｍｇ／ｋｇの抗体４２０６５３の最大阻害効果は、２日目に９６％の阻害であったが、０．１ｍｇ／ｋｇでは、抗体４２０６５３は、４日目に３９％の最大阻害を示し、統計的に有意ではなかった（図１０Ｂ）。１０ｍｇ／ｋｇの抗体２９Ｇ４ｖ２２は、７日目に６３％の最大阻害を示した（図１０Ｂ）。同じ時点での抗体４２０６５３（３ｍｇ／ｋｇ）及び抗体２９Ｇ４ｖ２２（１０ｍｇ／ｋｇ）の比較では、２日目、７日目、１４日目及び２１日目に有意差が見られた（図１０Ｂ）。
ＤＢＦ測定が行われた日の抗体４２０６５３及び抗体２９Ｇ４ｖ２２についての抗体血清濃度を以下の表２１に示す。定量下限（ＬＬＯＱ）又は定量レベル未満（ＢＱＬ）は、抗体４２０６５３について０ｎｇ／ｍＬ、抗体２９Ｇ４ｖ２２について５０ｎｇ／ｍＬであった。
Figure 0007339262000140
全体として、これらの結果は、抗体４２０６５３が３ｍｇ／ｋｇの用量で投与された場合、カニクイザルのＭＩＩＢＦを有意に減衰させたことを示す。ＭＩＩＢＦに対する３ｍｇ／ｋｇの抗体４２０６５３の阻害効果は、１０ｍｇ／ｋｇの高用量の抗体２９Ｇ４ｖ２２よりも強力であった。
本明細書において議論及び引用された全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。開示した本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル及び材料に限定されず、これらは、変化し得ることが理解される。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲を限定することを意図されていないことも理解される。
当業者であれば、単なる日常的な実験により、本明細に記載した本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識又は確認することができるであろう。このような均等物は、添付の特許請求の範囲に包含されるものとする。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
ヒト下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドＩ型受容体（ＰＡＣ１）（配列番号１）に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、（ｉ）ＡＨｏ番号付けによる２９位のアミノ酸が、ヒトＰＡＣ１のアミノ酸Ｇｌｕ１２０又はＡｓｐ１２１と相互作用する塩基性アミノ酸である軽鎖可変領域と、（ｉｉ）ＡＨｏ番号付けによる６１位のアミノ酸が、ヒトＰＡＣ１のアミノ酸Ａｓｎ６０又はＩｌｅ６１と相互作用する疎水性、塩基性又は中性親水性アミノ酸である重鎖可変領域とを含み、細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に５００ｐＭ未満のＩＣ５０でヒトＰＡＣ１のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する、単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目２)
前記軽鎖可変領域の２９位の前記アミノ酸は、リジン又はアルギニンである、項目１に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目３)
前記重鎖可変領域の６１位の前記アミノ酸は、イソロイシン、バリン、ロイシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンである、項目１又は２に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目４)
前記抗体又はその抗原結合断片の前記重鎖可変領域におけるＡＨｏ番号付けによる６６位のアミノ酸は、ヒトＰＡＣ１のアミノ酸Ａｓｎ６０又はＩｌｅ６１と相互作用する塩基性若しくは中性親水性アミノ酸である、項目１～３のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目５)
前記重鎖可変領域の６６位の前記アミノ酸は、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンである、項目４に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目６)
配列番号１のＡｓｐ５９、Ａｒｇ１１６、Ａｓｎ１１７、Ｔｈｒ１１９、Ｇｌｙ１２２、Ｔｒｐ１２３、Ｓｅｒ１２４、Ｇｌｕ１２５、Ｐｒｏ１２６、Ｐｈｅ１２７、Ｐｒｏ１２８、Ｈｉｓ１２９、Ｔｙｒ１３０、Ｐｈｅ１３１、Ａｓｐ１３２及びＧｌｙ１３５から選択される１つ以上のアミノ酸を更に含むエピトープでヒトＰＡＣ１に結合する、項目１～５のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目７)
前記軽鎖可変領域は、配列番号５２の配列と少なくとも９０％同一である配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号１９１の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む、項目１～６のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目８)
ヒトＰＡＣ１に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域並びに相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ１は、配列番号５～１６から選択される配列を含み；ＣＤＲＬ２は、配列番号２６の配列を含み；ＣＤＲＬ３は、配列番号３６～３８から選択される配列を含み；ＣＤＲＨ１は、配列番号８８～９６から選択される配列を含み；ＣＤＲＨ２は、配列番号１０６～１６６から選択される配列を含み；且つＣＤＲＨ３は、配列番号１７１～１７７から選択される配列を含む、単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目９)
（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１０８及び１７１の配列を有するか；
（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１１６及び１７１の配列を有するか；
（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号５、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１３４及び１７１の配列を有するか；
（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号５、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９２、１４５及び１７４の配列を有するか；
（ｅ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１０８及び１７２の配列を有するか；
（ｆ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号５、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１２８及び１７２の配列を有するか；
（ｇ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１３４及び１７１の配列を有するか；
（ｈ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１２、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１５３及び１７１の配列を有するか；
（ｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１２、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１５４及び１７１の配列を有するか；又は
（ｊ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１３、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１５５及び１７１の配列を有する、項目８に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目１０)
前記軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号５４～６６から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列、（ｉｉ）配列番号５４～６６から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列、又は（ｉｉｉ）配列番号５４～６６から選択される配列を含む、項目８又は９に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目１１)
前記重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１９１～２９５から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列、（ｉｉ）配列番号１９１～２９５から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列、又は（ｉｉｉ）配列番号１９１～２９５から選択される配列を含む、項目８～１０のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目１２)
（ａ）前記軽鎖可変領域は、配列番号５４の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号１９４の配列を含むか；
（ｂ）前記軽鎖可変領域は、配列番号５４の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２０３の配列を含むか；
（ｃ）前記軽鎖可変領域は、配列番号５５の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２２８の配列を含むか；
（ｄ）前記軽鎖可変領域は、配列番号５５の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２７４の配列を含むか；
（ｅ）前記軽鎖可変領域は、配列番号５４の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２１４の配列を含むか；
（ｆ）前記軽鎖可変領域は、配列番号５５の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２４０の配列を含むか；
（ｇ）前記軽鎖可変領域は、配列番号５４の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２２８の配列を含むか；
（ｈ）前記軽鎖可変領域は、配列番号６２の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２８２の配列を含むか；
（ｉ）前記軽鎖可変領域は、配列番号６２の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２８３の配列を含むか；又は
（ｊ）前記軽鎖可変領域は、配列番号６３の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２８４の配列を含む、項目８～１１のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目１３)
ヒトＰＡＣ１に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域並びに相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ１は、配列番号１７～２５から選択される配列を含み；ＣＤＲＬ２は、配列番号２７～３５から選択される配列を含み；ＣＤＲＬ３は、配列番号３９～５１から選択される配列を含み；ＣＤＲＨ１は、配列番号９７～１０５から選択される配列を含み；ＣＤＲＨ２は、配列番号１６７～１７０から選択される配列を含み；且つＣＤＲＨ３は、配列番号１７８～１９０から選択される配列を含む、単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目１４)
（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２５、３１及び４２の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９８、１６８及び１９０の配列を有するか；
（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２０、３０及び４４の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１００、１６８及び１８２の配列を有するか；
（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１７、３３及び４２の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９９、１６８及び１８７の配列を有するか；
（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２３、３１及び５０の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９７、１６７及び１７８の配列を有するか；
（ｅ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１７、３１及び４４の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９８、１６８及び１８９の配列を有するか；
（ｆ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１７、２７及び３９の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１００、１６８及び１８２の配列を有するか；
（ｇ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１８、３１及び４６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９８、１６８及び１７９の配列を有するか；
（ｈ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１７、２８及び４０の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９８、１６８及び１７９の配列を有するか；
（ｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１８、３０及び４３の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１００、１６８及び１８２の配列を有するか；又は
（ｊ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２２、２８及び４９の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１０２、１６９及び１８２の配列を有する、項目１３に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目１５)
前記軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６８～８７から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列、（ｉｉ）配列番号６８～８７から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列、又は（ｉｉｉ）配列番号６８～８７から選択される配列を含む、項目１３又は１４に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目１６)
前記重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号２９６～３１２から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列、（ｉｉ）配列番号２９６～３１２から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列、又は（ｉｉｉ）配列番号２９６～３１２から選択される配列を含む、項目１３～１５のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目１７)
（ａ）前記軽鎖可変領域は、配列番号８５の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号３１２の配列を含むか；
（ｂ）前記軽鎖可変領域は、配列番号７２の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号３００の配列を含むか；
（ｃ）前記軽鎖可変領域は、配列番号８１の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号３０７の配列を含むか；
（ｄ）前記軽鎖可変領域は、配列番号７８の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２９６の配列を含むか；
（ｅ）前記軽鎖可変領域は、配列番号８３の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号３１０の配列を含むか；
（ｆ）前記軽鎖可変領域は、配列番号８７の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号３００の配列を含むか；
（ｇ）前記軽鎖可変領域は、配列番号７４の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２９７の配列を含むか；
（ｈ）前記軽鎖可変領域は、配列番号６８の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２９７の配列を含むか；
（ｉ）前記軽鎖可変領域は、配列番号７１の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号３００の配列を含むか；又は
（ｊ）前記軽鎖可変領域は、配列番号７７の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号３０４の配列を含む、項目１３～１６のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目１８)
モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である、項目１～１７のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目１９)
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化抗体若しくはその抗原結合断片又は完全ヒト抗体若しくはその抗原結合断片である、項目１８に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目２０)
前記モノクローナル抗体は、ヒトκ定常領域を含む軽鎖を含む、項目１８又は１９に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目２１)
前記ヒトκ定常領域は、配列番号３１８又は配列番号３１９の配列を含む、項目２０に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目２２)
前記モノクローナル抗体は、ヒトλ定常領域を含む軽鎖を含む、項目１８又は１９に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目２３)
前記ヒトλ定常領域は、配列番号３１５の配列を含む、項目２２に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目２４)
前記モノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体である、項目１８～２３のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目２５)
前記モノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体である、項目２４に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目２６)
前記モノクローナル抗体は、アグリコシル化ヒトＩｇＧ１抗体である、項目２５に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目２７)
前記モノクローナル抗体は、その重鎖において、ＥＵ番号付けによるアミノ酸位置Ｎ２９７に変異を含む、項目２６に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目２８)
前記変異は、Ｎ２９７Ｇである、項目２７に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目２９)
前記モノクローナル抗体は、その重鎖において、ＥＵ番号付けによるＲ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃの変異を更に含む、項目２７又は２８に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目３０)
前記モノクローナル抗体は、配列番号３２４又は配列番号３２５の配列を含む重鎖定常領域を含む、項目２６に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目３１)
細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に１０ｎＭ未満のＩＣ５０でラットＰＡＣ１のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する、項目１～３０のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
(項目３２)
ヒトＰＡＣ１に特異的に結合する単離された抗体であって、軽鎖及び重鎖を含み、
（ａ）前記軽鎖は、配列番号５０６の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５２１の配列を含むか；
（ｂ）前記軽鎖は、配列番号５０６の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５２２の配列を含むか；
（ｃ）前記軽鎖は、配列番号５０４の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５２３の配列を含むか；
（ｄ）前記軽鎖は、配列番号５０４の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５２４の配列を含むか；
（ｅ）前記軽鎖は、配列番号５０６の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５２５の配列を含むか；
（ｆ）前記軽鎖は、配列番号５０４の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５２６の配列を含むか；
（ｇ）前記軽鎖は、配列番号５０６の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５２３の配列を含むか；
（ｈ）前記軽鎖は、配列番号５０７の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５２７の配列を含むか；
（ｉ）前記軽鎖は、配列番号５０７の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５２８の配列を含むか；
（ｊ）前記軽鎖は、配列番号５０８の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５２９の配列を含むか；
（ｋ）前記軽鎖は、配列番号５１０の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５３１の配列を含むか；
（ｌ）前記軽鎖は、配列番号５１１の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５３２の配列を含むか；
（ｍ）前記軽鎖は、配列番号５１２の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５３３の配列を含むか；
（ｎ）前記軽鎖は、配列番号５１３の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５３４の配列を含むか；
（ｏ）前記軽鎖は、配列番号５１４の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５３５の配列を含むか；
（ｐ）前記軽鎖は、配列番号５１５の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５３５の配列を含むか；
（ｑ）前記軽鎖は、配列番号５１６の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５３２の配列を含むか；
（ｒ）前記軽鎖は、配列番号５１７の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５３６の配列を含むか；
（ｓ）前記軽鎖は、配列番号５０９の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５３２の配列を含むか；又は
（Ｔ）前記軽鎖は、配列番号５１８の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５３０の配列を含む、単離された抗体。
(項目３３)
項目１～３２のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
(項目３４)
項目１～３２のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
(項目３５)
項目３４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
(項目３６)
項目３５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
(項目３７)
ヒトＰＡＣ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を生成する方法であって、前記抗体又はその抗原結合断片の発現を可能にする条件下において、項目３６に記載の宿主細胞を培養することと；培養培地又は前記宿主細胞から前記抗体又はその抗原結合断片を回収することとを含む方法。
(項目３８)
血管拡張の阻害を、それを必要とする患者において行うための方法であって、項目１～３２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の有効量を前記患者に投与することを含む方法。
(項目３９)
前記患者は、頭痛病態を有する、項目３８に記載の方法。
(項目４０)
頭痛病態を有する患者においてヒトＰＡＣ１受容体の活性化を阻害するための方法であって、項目１～３２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の有効量を前記患者に投与することを含む方法。
(項目４１)
頭痛病態の治療又は予防を、それを必要とする患者において行うための方法であって、項目１～３２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の有効量を前記患者に投与することを含む方法。
(項目４２)
前記頭痛病態は、片頭痛である、項目３９～４１のいずれか一項に記載の方法。
(項目４３)
前記片頭痛は、反復性片頭痛である、項目４２に記載の方法。
(項目４４)
前記片頭痛は、慢性片頭痛である、項目４２に記載の方法。
(項目４５)
前記頭痛病態は、群発性頭痛である、項目３９～４１のいずれか一項に記載の方法。
(項目４６)
前記抗体又はその抗原結合断片は、予防的治療として前記患者に投与される、項目４１～４５のいずれか一項に記載の方法。
(項目４７)
前記患者に第２の頭痛治療薬を投与することを更に含む、項目４１～４５のいずれか一項に記載の方法。
(項目４８)
前記第２の頭痛治療薬は、急性頭痛治療薬である、項目４７に記載の方法。
(項目４９)
前記急性頭痛治療薬は、５ＨＴ １Ｂ 、５ＨＴ １Ｄ 及び／又は５ＨＴ １Ｆ セロトニン受容体アゴニストである、項目４８に記載の方法。
(項目５０)
前記セロトニン受容体アゴニストは、トリプタン又はエルゴタミンである、項目４９に記載の方法。
(項目５１)
前記急性頭痛治療薬は、非ステロイド性抗炎症薬又はオピオイドである、項目４８に記載の方法。
(項目５２)
前記第２の頭痛治療薬は、予防的頭痛治療薬である、項目４７に記載の方法。
(項目５３)
前記予防的頭痛治療薬は、抗てんかん薬、β遮断薬、抗うつ薬、オナボツリヌストキシンＡ又はＣＧＲＰ経路アンタゴニストである、項目５２に記載の方法。
(項目５４)
前記ＣＧＲＰ経路アンタゴニストは、ヒトＣＧＲＰ受容体アンタゴニストである、項目５３に記載の方法。
(項目５５)
前記ヒトＣＧＲＰ受容体アンタゴニストは、ヒトＣＧＲＰ受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体である、項目５４に記載の方法。
(項目５６)
前記抗ＣＧＲＰ受容体モノクローナル抗体は、エレヌマブである、項目５５に記載の方法。

Claims (27)

  1. ヒト下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドＩ型受容体（ＰＡＣ１）に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＰＡＣ１のリガンド誘導活性化を阻害し、且つ、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域並びに相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、
    （ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１０８及び１７１の配列を有するか；
    （ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１１６及び１７１の配列を有するか；
    （ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号５、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１３４及び１７１の配列を有するか；
    （ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号５、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号９２、１４５及び１７４の配列を有するか；
    （ｅ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１０８及び１７２の配列を有するか；
    （ｆ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号５、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１２８及び１７２の配列を有するか；
    （ｇ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１３４及び１７１の配列を有するか；又は
    （ｈ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１２、２６及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号８８、１５３及び１７１の配列を有する、
    単離された抗体又はその抗原結合断片。
  2. 前記軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号５４、５５および６２から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列、（ｉｉ）配列番号５４、５５および６２から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列、又は（ｉｉｉ）配列番号５４、５５および６２から選択される配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  3. 前記重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１９４、２０３、２１４、２２８、２４０、２７４および２８２から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列、（ｉｉ）配列番号１９４、２０３、２１４、２２８、２４０、２７４および２８２から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列、又は（ｉｉｉ）配列番号１９４、２０３、２１４、２２８、２４０、２７４および２８２から選択される配列を含む、請求項１または２に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  4. （ａ）前記軽鎖可変領域は、配列番号５４の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号１９４の配列を含むか；
    （ｂ）前記軽鎖可変領域は、配列番号５４の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２０３の配列を含むか；
    （ｃ）前記軽鎖可変領域は、配列番号５５の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２２８の配列を含むか；
    （ｄ）前記軽鎖可変領域は、配列番号５５の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２７４の配列を含むか；
    （ｅ）前記軽鎖可変領域は、配列番号５４の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２１４の配列を含むか；
    （ｆ）前記軽鎖可変領域は、配列番号５５の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２４０の配列を含むか；
    （ｇ）前記軽鎖可変領域は、配列番号５４の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２２８の配列を含むか；又は
    （ｈ）前記軽鎖可変領域は、配列番号６２の配列を含み、且つ前記重鎖可変領域は、配列番号２８２の配列を含む、
    請求項１～３のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  5. モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  6. 前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化抗体若しくはその抗原結合断片又は完全ヒト抗体若しくはその抗原結合断片である、請求項５に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  7. 前記モノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体である、請求項５または６に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  8. 前記モノクローナル抗体は、アグリコシル化ヒトＩｇＧ１抗体である、請求項７に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  9. 前記モノクローナル抗体は、その重鎖において、ＥＵ番号付けによるアミノ酸位置Ｎ２９７に変異を含む、請求項８に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  10. 前記変異は、Ｎ２９７Ｇである、請求項９に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  11. 前記モノクローナル抗体は、その重鎖において、ＥＵ番号付けによるＲ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃの変異を更に含む、請求項９または１０に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  12. 細胞系ｃＡＭＰアッセイによって測定された際に１０ｎＭ未満のＩＣ５０でラットＰＡＣ１のＰＡＣＡＰ誘導活性化を阻害する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
  13. ヒトＰＡＣ１に特異的に結合し、且つ、ヒトＰＡＣ１のリガンド誘導活性化を阻害する単離された抗体であって、軽鎖及び重鎖を含み、
    （ａ）前記軽鎖は、配列番号５０６の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５２１の配列を含むか；
    （ｂ）前記軽鎖は、配列番号５０６の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５２２の配列を含むか；
    （ｃ）前記軽鎖は、配列番号５０４の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５２３の配列を含むか；
    （ｄ）前記軽鎖は、配列番号５０４の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５２４の配列を含むか；
    （ｅ）前記軽鎖は、配列番号５０６の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５２５の配列を含むか；
    （ｆ）前記軽鎖は、配列番号５０４の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５２６の配列を含むか；
    （ｇ）前記軽鎖は、配列番号５０６の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５２３の配列を含むか；又は
    （ｈ）前記軽鎖は、配列番号５０７の配列を含み、且つ前記重鎖は、配列番号５２７の配列を含む、単離された抗体。
  14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  15. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
  16. 請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  17. 請求項１６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  18. ヒトＰＡＣ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を生成する方法であって、前記抗体又はその抗原結合断片の発現を可能にする条件下において、請求項１７に記載の宿主細胞を培養することと；培養培地又は前記宿主細胞から前記抗体又はその抗原結合断片を回収することとを含む方法。
  19. 頭痛病態の治療又は予防を、それを必要とする患者において行うための医薬組成物であって、請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片を含む、医薬組成物。
  20. 前記頭痛病態は、片頭痛または群発性頭痛である、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 前記片頭痛は、反復性片頭痛または慢性片頭痛である、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 前記治療は、予防的治療である、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  23. 前記医薬組成物は、急性頭痛治療薬または予防的頭痛治療薬との組み合わせ治療としての投与のために製剤化されている、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  24. 前記急性頭痛治療薬は、５ＨＴ１Ｂ、５ＨＴ１Ｄ及び／又は５ＨＴ１Ｆセロトニン受容体アゴニスト、非ステロイド性抗炎症薬又はオピオイドである、請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. 前記セロトニン受容体アゴニストは、トリプタン又はエルゴタミンである、請求項２４に記載の医薬組成物。
  26. 前記予防的頭痛治療薬は、抗てんかん薬、β遮断薬、抗うつ薬、オナボツリヌストキシンＡ又はＣＧＲＰ経路アンタゴニストである、請求項２３に記載の医薬組成物。
  27. 前記ＣＧＲＰ経路アンタゴニストは、エレヌマブである、請求項２６に記載の医薬組成物。
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