JP7340314B2 - How to measure the protein content in rice - Google Patents
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Description
本発明は、米に含まれるタンパク質の含有量を測定する方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring the protein content contained in rice.
従来、米に含まれる特定のタンパク質の含有量を定量的に測定する方法として、ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）法、ウェスタンブロッティング解析等が知られている。例えば下記非特許文献１では、米に含まれるタンパク質を定量分析するにあたり、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって貯蔵タンパク質の一種であるプロラミン等を分析する方法が開示されている。 Conventionally, polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Western blotting analysis, etc. are known as methods for quantitatively measuring the content of specific proteins contained in rice. . For example, Non-Patent Document 1 listed below discloses a method of analyzing prolamin, which is a type of storage protein, by SDS-PAGE in quantitatively analyzing proteins contained in rice.
ところで、米に含まれるタンパク質と米の食味との関係はこれまで、米に含まれる全体的なタンパク質量が低いと米の食味・旨味が増すと考えられてきた。ところが、本発明者の検討によれば、後述する参考例で述べるように、米に含まれる総タンパク質量と米の食味・旨味とは必ずしも相関していないことが判明した。 By the way, regarding the relationship between the protein contained in rice and the taste of rice, it has been thought that the taste and umami of rice increase when the overall amount of protein contained in rice is low. However, according to studies conducted by the present inventors, it has been found that the total amount of protein contained in rice does not necessarily correlate with the taste and flavor of rice, as described in Reference Examples below.
そこで、米に含まれるタンパク質と米の食味・旨味との関係を突き詰めていくには、米に含まれる各種タンパク質の含有量をより詳細且つ網羅的に調べる必要があるが、上述したような従来の方法では、絶対的な定量評価を行うことができない。 Therefore, in order to investigate the relationship between the proteins contained in rice and the taste and flavor of rice, it is necessary to investigate the contents of various proteins contained in rice in more detail and comprehensively. This method does not allow for absolute quantitative evaluation.
本発明は、このような実情に鑑みてなされたものであり、米に含まれるタンパク質の定量評価を可能とするための方法を提供することを目的とする。 The present invention was made in view of these circumstances, and an object of the present invention is to provide a method that enables quantitative evaluation of proteins contained in rice.
本発明は、米に含まれるタンパク質の含有量を測定する方法であって、液体クロマトグラフィー質量分析法を用いて上記タンパク質のペプチド断片の含有量を測定する方法を提供する。 The present invention provides a method for measuring the content of protein contained in rice, and a method for measuring the content of peptide fragments of the protein using liquid chromatography mass spectrometry.
上記タンパク質は、貯蔵タンパク質であってよい。 The protein may be a storage protein.
上記タンパク質は、グロブリン、グルテリン及びプロラミンから選ばれる少なくとも１種であってよい。 The above-mentioned protein may be at least one selected from globulin, glutelin, and prolamin.
上記タンパク質のペプチド断片を測定する方法において、タンパク質が１９ｋＤａのグロブリンであり、ペプチド断片が配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド断片であるか、タンパク質がグルテリンＡ１であり、ペプチド断片が配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド断片であるか、タンパク質がグルテリンＡ２であり、ペプチド断片が配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド断片であるか、タンパク質がグルテリンＡ３であり、ペプチド断片が配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド断片であるか、タンパク質がグルテリンＢであり、ペプチド断片が配列番号５のアミノ酸配列を有するペプチド断片であるか、タンパク質がグルテリンＤであり、ペプチド断片が配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチド断片であるか、又は、タンパク質がプロラミン１３ａ－１であり、ペプチド断片が配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチド断片であってよい。 In the above method for measuring a peptide fragment of a protein, the protein is a 19 kDa globulin and the peptide fragment has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or the protein is glutelin A1 and the peptide fragment has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The protein is glutelin A2 and the peptide fragment has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, or the protein is glutelin A3 and the peptide fragment has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. or the protein is glutelin B and the peptide fragment has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, or the protein is glutelin D and the peptide fragment has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. Alternatively, the protein may be prolamin 13a-1 and the peptide fragment may be a peptide fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO:7.
本発明によれば、米に含まれるタンパク質の定量評価を可能とするための方法が提供される。 According to the present invention, a method is provided that enables quantitative evaluation of proteins contained in rice.
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。しかし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。 Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the following embodiments.
本実施形態において、米に含まれるタンパク質の含有量を測定する方法は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）法を用いてタンパク質のペプチド断片の含有量を測定するものである。すなわち、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）法を用いて、測定対象となるタンパク質に対応するタンパク質のペプチド断片の含有量を測定する工程を含む。 In this embodiment, the method for measuring the content of protein contained in rice is to measure the content of protein peptide fragments using liquid chromatography mass spectrometry (LC/MS). That is, it includes a step of measuring the content of a peptide fragment of a protein corresponding to a protein to be measured using a liquid chromatography mass spectrometry (LC/MS) method.
米に含まれるタンパク質において定量対象となるタンパク質は、米に含まれるタンパク質の大部分を占める貯蔵タンパク質と呼ばれるものであってよい。貯蔵タンパク質としては、例えば、アルカリ可溶性のグルテリン、食塩水可溶性のグロブリン、及びアルコール可溶性のプロラミンなどが挙げられる。グロブリンとしては、例えば、１９ｋＤａのグロブリン、７Ｓのグロブリン、１２Ｓのグロブリン等が挙げられる。グルテリンとしては、例えば、グルテリンＡ１、グルテリンＡ２、グルテリンＡ３、グルテリンＢ（グルテリンＢ１、グルテリンＢ２、グルテリンＢ４、グルテリンＢ５）、グルテリンＤ、グルテリンＣ（インディカ）等が挙げられる。プロラミンとしては、例えば、プロラミン１３ａ－１、プロラミン１３ｂ－１等が挙げられる。 Among the proteins contained in rice, the protein to be quantified may be what is called a storage protein, which accounts for most of the proteins contained in rice. Examples of storage proteins include alkaline-soluble glutelin, saline-soluble globulin, and alcohol-soluble prolamin. Examples of the globulin include 19 kDa globulin, 7S globulin, 12S globulin, and the like. Examples of glutelin include glutelin A1, glutelin A2, glutelin A3, glutelin B (glutelin B1, glutelin B2, glutelin B4, glutelin B5), glutelin D, glutelin C (indica), and the like. Examples of prolamins include prolamin 13a-1 and prolamin 13b-1.
液体クロマトグラフィー質量分析法を用いてタンパク質のペプチド断片の含有量を測定する方法は、特に制限されるものではないが、例えば以下の方法で測定することができる。 The method for measuring the content of protein peptide fragments using liquid chromatography mass spectrometry is not particularly limited, but can be measured, for example, by the following method.
まず、米を粉砕して得られた米粉から、タンパク質を抽出・精製し、酵素処理によってタンパク質を断片化してペプチド断片を得る。米粉からタンパク質を抽出・精製する方法は、特に制限されるものではなく、通常の抽出・精製処理の方法を適宜採用することができる。また、酵素処理によってタンパク質を断片化する方法において用いる酵素は、目的とするペプチド断片により適宜選定することができるが、例えばトリプシン等を用いて消化することにより、目的のペプチド断片を得ることができる。なお酵素処理の後は、適宜界面活性剤の除去や脱塩を行なってもよい。 First, proteins are extracted and purified from rice flour obtained by crushing rice, and the proteins are fragmented by enzyme treatment to obtain peptide fragments. The method for extracting and purifying protein from rice flour is not particularly limited, and any conventional extraction and purification method can be used as appropriate. In addition, the enzyme used in the method of fragmenting proteins by enzymatic treatment can be selected as appropriate depending on the desired peptide fragment, but the desired peptide fragment can be obtained, for example, by digestion with trypsin etc. . Note that after the enzyme treatment, the surfactant may be removed and desalted as appropriate.
一方、内部標準として、濃度既知であって、標準となる元素とは異なる質量の同位体で標識されたペプチドを含む標品ペプチド溶液を調製する。このような標識ペプチドは、予め同位体で標識されたアミノ酸を用いてペプチド合成することにより、同位体で標識されたアミノ酸が導入されたペプチドとして合成されてもよいし、ペプチドを化学合成した後、同位体元素を有するラベル化試薬を当該ペプチドに結合させて合成されてもよい。ラベル化試薬をペプチドに結合させて同位体標識ペプチドを合成した場合は、上記酵素処理で得られたペプチド断片にも、対応する標準となる元素を有するラベル化試薬を結合させる。同位体標識される元素としては、標準となる元素とは異なる質量を有していればよく、標準となる元素よりも重くても軽くてもよい。このような同位体としては、例えば、標準となる元素１２Ｃの同位体である１３Ｃ、１４Ｃ、１１Ｃ等、標準となる元素１４Ｎの同位体である１５Ｎ等、標準となる元素１６Ｏの同位体である１７Ｏ等であってよいが、ペプチド断片中に最も多く存在する元素である炭素同位体を用いることが、測定感度を良好に保つ点から好ましい。ラベル化試薬としては、例えば、サーモサイエンティフィック社製のＴＭＴ ｌａｂｅｌ ｋｉｔ等が市販されている。 On the other hand, as an internal standard, a standard peptide solution containing a peptide of known concentration and labeled with an isotope having a mass different from that of the standard element is prepared. Such a labeled peptide may be synthesized as a peptide into which an isotope-labeled amino acid is introduced, by performing peptide synthesis using an isotope-labeled amino acid in advance, or it may be synthesized as a peptide into which an isotope-labeled amino acid is introduced, or after chemically synthesizing the peptide. The peptide may be synthesized by binding a labeling reagent having an isotopic element to the peptide. When an isotope-labeled peptide is synthesized by bonding a labeling reagent to a peptide, a labeling reagent having a corresponding standard element is also bonded to the peptide fragment obtained by the above enzyme treatment. The element to be isotopically labeled only needs to have a mass different from that of the standard element, and may be heavier or lighter than the standard element. Such isotopes include, for example, 13 C, 14 C, 11 C, which are isotopes of the standard element 12 C, and 15 N, which is an isotope of the standard element 14 N. Although 17 O, which is an isotope of 16 O, etc., may be used, it is preferable to use a carbon isotope, which is the element most present in the peptide fragment, from the viewpoint of maintaining good measurement sensitivity. As a labeling reagent, for example, TMT label kit manufactured by Thermo Scientific is commercially available.
続いて、上記で得られた米タンパク質由来のペプチド断片を含む溶液と、標品ペプチド溶液とを混合して測定サンプルを調製し、液体クロマトグラフィー質量分析によりタンパク質のペプチド断片の含有量を測定する。 Next, a measurement sample is prepared by mixing the solution containing the rice protein-derived peptide fragments obtained above and a standard peptide solution, and the content of protein peptide fragments is measured by liquid chromatography mass spectrometry. .
液体クロマトグラフィー質量分析は、例えば、液体クロマトグラフ質量分析計ＬＣ－ＭＳ９０１０（株式会社島津製作所製）を用いて行うことができる。液体クロマトグラフィー質量分析法の分析条件は、例えば以下のとおりである。
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ ＡＱ－Ｃ１８（φ２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、ジーエルサイエンス株式会社製）
カラム温度：４０℃
流速：４００μｌ／分
注入量：５μｌ
溶媒：移動相Ａ：超純水（ＬＣＭＳ用）＋０．１％ギ酸、移動相Ｂ：１００％アセトニトリル（ＬＣＭＳ用）＋０．１％ギ酸、５％移動相Ｂ（０～２分）、５～４５％移動相Ｂ（２～１３分）、４５～９５％移動相Ｂ（１３～１６分）、９５％移動相Ｂ（１６～１８分）、５％移動相Ｂ（１８～２０分）
Liquid chromatography mass spectrometry can be performed using, for example, a liquid chromatography mass spectrometer LC-MS9010 (manufactured by Shimadzu Corporation). The analysis conditions for liquid chromatography mass spectrometry are, for example, as follows.
Column: InertSustain AQ-C18 (φ2.1mm x 150mm, manufactured by GL Sciences, Inc.)
Column temperature: 40℃
Flow rate: 400μl/min Injection volume: 5μl
Solvent: Mobile phase A: ultrapure water (for LCMS) + 0.1% formic acid, mobile phase B: 100% acetonitrile (for LCMS) + 0.1% formic acid, 5% mobile phase B (0 to 2 minutes), 5 to 45% mobile phase B (2-13 minutes), 45-95% mobile phase B (13-16 minutes), 95% mobile phase B (16-18 minutes), 5% mobile phase B (18-20 minutes)
測定サンプルに含まれるペプチド断片は、上記液体クロマトグラフィー（ＬＣ）カラムにより分離され、順次オンラインで質量分析計に投入され解析される。得られたクロマトグラムにおける定量対象ペプチドと内部標準である安定同位体標識ペプチドとのピークエリア比と検量線とから、測定サンプル中の定量対象ペプチドの絶対量が測定され、さらに得られたペプチド断片の絶対量から、各ペプチド断片に対応するタンパク質の含有量が算出される。 Peptide fragments contained in the measurement sample are separated by the liquid chromatography (LC) column described above, and sequentially introduced into a mass spectrometer online for analysis. The absolute amount of the peptide to be quantified in the measurement sample is determined from the peak area ratio of the peptide to be quantified and the stable isotope-labeled peptide serving as an internal standard in the obtained chromatogram and the calibration curve, and the obtained peptide fragment is The protein content corresponding to each peptide fragment is calculated from the absolute amount of .
定量対象となるタンパク質を断片化して得られるペプチド断片の種類は、対象となるタンパク質により異なるが、通常１種のタンパク質を酵素処理することにより複数種（２種以上）のペプチド断片が得られる。ペプチド断片の含有量を更に高感度に測定し、より定量性の高いタンパク質定量を達成する観点から、特定のタンパク質の定量に際して最適なペプチド断片を選択して用いることが好ましい。ここで、最適なペプチド断片を選択する方法としては、上記で得られたクロマトグラムにおけるピーク面積値が大きく、且つピークの形状がシャープであるものを選択することが、検出感度を更に高める観点から好ましい。定量対象となるタンパク質と用いるペプチド断片との好ましい組み合わせは、以下のとおりである。 The types of peptide fragments obtained by fragmenting a protein to be quantified vary depending on the protein to be quantified, but usually multiple (two or more) types of peptide fragments can be obtained by enzymatically treating one type of protein. From the viewpoint of measuring the content of peptide fragments with higher sensitivity and achieving more quantitative protein quantification, it is preferable to select and use an optimal peptide fragment for quantifying a specific protein. Here, as a method for selecting the optimal peptide fragment, it is recommended to select one with a large peak area value and a sharp peak shape in the chromatogram obtained above, from the viewpoint of further increasing detection sensitivity. preferable. Preferred combinations of the protein to be quantified and the peptide fragments used are as follows.
定量対象となるタンパク質が１９ｋＤａのグロブリンである場合、１９ｋＤａのグロブリンをトリプシン消化して得られた断片の一つである配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド断片を用いることが好ましく、定量対象となるタンパク質がグルテリンＡ１である場合、グルテリンＡ１をトリプシン消化して得られた断片の一つである配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド断片を用いることが好ましく、定量対象となるタンパク質がグルテリンＡ２である場合、グルテリンＡ２をトリプシン消化して得られた断片の一つである配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド断片を用いることが好ましく、定量対象となるタンパク質がグルテリンＡ３である場合、グルテリンＡ３をトリプシン消化して得られた断片の一つである配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド断片を用いることが好ましく、定量対象となるタンパク質がグルテリンＢである場合、グルテリンＢをトリプシン消化して得られた断片の一つである配列番号５のアミノ酸配列を有するペプチド断片を用いることが好ましく、定量対象となるタンパク質がグルテリンＤである場合、グルテリンＤをトリプシン消化して得られた断片の一つである配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチド断片を用いることが好ましく、定量対象となるタンパク質がプロラミン１３ａ－１である場合、プロラミン１３ａ－１をトリプシン消化して得られた断片の一つである配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチド断片を用いることが好ましい。 When the protein to be quantified is a 19 kDa globulin, it is preferable to use a peptide fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, which is one of the fragments obtained by digesting the 19 kDa globulin with trypsin, and is the peptide to be quantified. When the protein is glutelin A1, it is preferable to use a peptide fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, which is one of the fragments obtained by digesting glutelin A1 with trypsin, and when the protein to be quantified is glutelin A2. In this case, it is preferable to use a peptide fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, which is one of the fragments obtained by digesting glutelin A2 with trypsin; It is preferable to use a peptide fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, which is one of the fragments obtained by digestion, and when the protein to be quantified is glutelin B, a peptide fragment obtained by digesting glutelin B with trypsin is preferably used. It is preferable to use a peptide fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, which is one of the fragments, and when the protein to be quantified is glutelin D, one of the fragments obtained by digesting glutelin D with trypsin. It is preferable to use a peptide fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and when the protein to be quantified is prolamin 13a-1, one of the fragments obtained by digesting prolamin 13a-1 with trypsin, SEQ ID NO: Preferably, a peptide fragment having an amino acid sequence of 7 is used.
なお、上記各配列番号のアミノ酸配列を有するペプチド断片は、当該各配列番号のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を有していてもよいが、当該各配列番号のアミノ酸配列からなるペプチド断片であることが好ましい。 Note that the peptide fragment having the amino acid sequence of each SEQ ID number above may have an amino acid sequence other than the amino acid sequence of each SEQ ID number, but it is possible that the peptide fragment has the amino acid sequence of each SEQ ID number. preferable.
本実施形態において用いられる米の由来は特に限定されず、任意の種類の米を用いて実施することができる。米としては、例えば、コシヒカリ、ササニシキ、ひとめぼれ、あきたこまち、つぶぞろい等が挙げられる。米の産地は特に限定されない。 The origin of the rice used in this embodiment is not particularly limited, and any type of rice can be used. Examples of rice include Koshihikari, Sasanishiki, Hitomebore, Akitakomachi, and Tsubasoroi. The origin of rice is not particularly limited.
本実施形態に係る方法により米に含まれるタンパク質の含有量を測定することで、従来の方法と比較して、米に含まれる各種タンパク質の含有量をより詳細且つ網羅的に調べることができる。 By measuring the content of proteins contained in rice using the method according to the present embodiment, the content of various proteins contained in rice can be investigated in more detail and comprehensively compared to conventional methods.
以下、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to the following Examples.
（参考例：米に含まれるタンパク質と食味・風味との相関）
米に含まれるタンパク質量と食味・旨味とが相関するか否かを調べるために、表１に示す各銘柄の米に対し、食味分析計（ＴＭ－３５００、静岡製機株式会社製）を用いてタンパク質値（％）を測定した。また、表１に示す各銘柄の米を炊飯し、無作為に選出したパネルにより、官能試験を実施した。官能試験は食味・旨味について、１～７の７段階で評価した。評価結果は、数値が高い方が食味・旨味がよいことを意味する。表１に各銘柄の米のタンパク質値（％）及び官能評価値の平均値を示し、図１に米に含まれるタンパク質値（％）と米の食味・旨味の官能評価値の平均値との関係を示す。
(Reference example: Correlation between protein contained in rice and taste/flavor)
In order to investigate whether there is a correlation between the amount of protein contained in rice and its taste/umami, each brand of rice shown in Table 1 was tested using a taste analyzer (TM-3500, manufactured by Shizuoka Seiki Co., Ltd.). The protein value (%) was measured. In addition, each brand of rice shown in Table 1 was cooked and a sensory test was conducted using a randomly selected panel. In the sensory test, taste and flavor were evaluated on a seven-point scale from 1 to 7. The higher the evaluation result, the better the taste and flavor. Table 1 shows the average value of the protein value (%) and sensory evaluation value of each brand of rice, and Figure 1 shows the relationship between the protein value (%) contained in rice and the average value of the sensory evaluation value of rice taste/umami. Show relationships.
米に含まれるタンパク質と米の食味・旨味との関係はこれまで、米に含まれる全体的なタンパク質量が低いと米の食味・旨味が増すと考えられてきたが、表１及び図１に示されるように、米に含まれるタンパク質量と米の食味・旨味とは必ずしも相関していないことが判明した。 Regarding the relationship between the protein contained in rice and the taste and flavor of rice, it has been thought that the lower the overall amount of protein contained in rice, the better the taste and flavor of rice. As shown, it was found that the amount of protein contained in rice does not necessarily correlate with the taste and flavor of rice.
（実施例１：米に含まれる１９ｋＤａのグロブリンの含有量の測定）
＜タンパク質抽出・精製＞
米（コシヒカリ、ひとめぼれ、ササニシキ、あきたこまち及びつぶぞろい）を粉砕して得られた米粉５０ｍｇを２ｍｌチューブに量り取り、１ｍｌタンパク質抽出用バッファー（バッファー９５０μｌ（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ、８Ｍ ウレア、４％ＳＤＳ）＋２－メルカプトエタノール５０μｌ）を添加し、１６時間以上室温で撹拌した。その後、１６０００×ｇで１５分間（４℃）遠心し、得られた上清２００μｌに対してメタノールクロロホルム沈殿を行い、沈殿物を得た。
(Example 1: Measurement of the content of 19kDa globulin contained in rice)
<Protein extraction/purification>
Weigh out 50 mg of rice flour obtained by crushing rice (Koshihikari, Hitomebore, Sasanishiki, Akitakomachi, and Tsubusoro) into a 2 ml tube, add 1 ml of protein extraction buffer (950 μl of buffer (0.125 M Tris, 8 M urea, 4% SDS)). +2-mercaptoethanol (50 μl) was added and stirred at room temperature for 16 hours or more. Thereafter, the mixture was centrifuged at 16,000×g for 15 minutes (4° C.), and 200 μl of the resulting supernatant was subjected to methanol-chloroform precipitation to obtain a precipitate.
＜タンパク質の断片化（ペプチド断片の調製）＞
上記で得られた沈殿物に２００μｌタンパク質溶解バッファー（５０ｍＭ ＴＥＡＢ（ｐＨ８．５）、１２ｍＭデオキシコール酸ナトリウム一水和物、１２ｍＭ Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム）及び２０μｌの５００ｍＭ ＤＴＴ溶液を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後、遮光しながら２０μｍの５００ｍＭ ＩＡＡを加え、３０分以上室温でインキュベートし、１ｍｌの５０ｍＭ ＴＥＡＢを加えて希釈した。Ｌｙｓ－Ｃ（Ｌｙｓｙｌ Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（１μｇ／μｌ））をタンパク質１００μｇ当たり２μｇ加え、３７℃で４時間インキュベートした後、トリプシン（１μｇ／μｌ）をタンパク質５０μｇ当たり１μｇ等量加え、３７℃で１８時間以上インキュベートすることでタンパク質を断片化した。得られたペプチド断片を含む溶液に対して等量の酢酸エチルを加えた後、最終濃度０．５％となるようにＴＦＡを加え、遠心分離（１６０００×ｇ、２分間）を行い、有機層を除去して減圧乾燥させ、ペプチド断片のペレットを得た。得られたペレットをスピンカラム（Ｍｏｎｏ ｓｐｉｎ Ｃ１８、ジーエルサイエンス株式会社製）で脱塩処理して減圧乾燥させ、１００μｌの０．２ｍＭ ＴＥＭＢに再溶解させてペプチド断片を含む溶液を得た。
<Protein fragmentation (preparation of peptide fragments)>
Add 200 μl of protein lysis buffer (50 mM TEAB (pH 8.5), 12 mM sodium deoxycholate monohydrate, 12 mM sodium N-lauroylsarcosine) and 20 μl of 500 mM DTT solution to the precipitate obtained above, and mix at 37°C. After incubating for 30 minutes, 20 μm of 500 mM IAA was added while shielding from light, incubated at room temperature for 30 minutes or more, and diluted by adding 1 ml of 50 mM TEAB. Add 2 μg of Lys-C (Lysyl Endopeptidase (1 μg/μl)) per 100 μg of protein and incubate at 37°C for 4 hours, then add trypsin (1 μg/μl) in an equivalent amount of 1 μg per 50 μg of protein and incubate at 37°C for 18 hours or more. This fragmented the protein. After adding an equal volume of ethyl acetate to the solution containing the obtained peptide fragment, TFA was added to give a final concentration of 0.5%, centrifugation was performed (16,000 x g, 2 minutes), and the organic layer was separated. was removed and dried under reduced pressure to obtain a pellet of peptide fragments. The obtained pellet was desalted using a spin column (Mono spin C18, manufactured by GL Sciences, Inc.), dried under reduced pressure, and redissolved in 100 μl of 0.2 mM TEMB to obtain a solution containing peptide fragments.
＜ペプチド断片のラベル化＞
ペプチド断片のラベル化は、ＴＭＴ ｌａｂｅｌ ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック社製）を用いて行った。具体的には、上記で得られたペプチド断片を含む溶液１００μｌに対し、１０μｌのＴＭＴ ｚｅｒｏ ｒｅａｇｅｎｔを加え、室温で１時間反応させた後、５％ヒドロキシルアミン（８μｌ）を添加して反応を停止させることでＴＭＴラベル化したペプチド断片を含む溶液を得た。
<Labeling of peptide fragments>
Labeling of the peptide fragments was performed using TMT label kit (manufactured by Thermo Scientific). Specifically, 10 μl of TMT zero reagent was added to 100 μl of the solution containing the peptide fragment obtained above, and after reacting for 1 hour at room temperature, 5% hydroxylamine (8 μl) was added to stop the reaction. By doing so, a solution containing the TMT-labeled peptide fragment was obtained.
＜標品ペプチドのラベル化＞
配列番号１からなるペプチドを含む溶液（濃度５．７ｍｇ／ｍｌ）を準備し、当該溶液に安定同位体元素１３Ｃを含むＴＭＴ ｌｅｂｅｌ ｒｅａｇｅｎｔを加えて、室温で１時間反応させた後、５％ヒドロキシルアミンを添加して反応を停止させることで安定同位体元素１３Ｃを含むＴＭＴでラベル化された標品ペプチドを含む溶液１を得た。
<Labeling of standard peptide>
A solution (concentration 5.7 mg/ml) containing the peptide consisting of SEQ ID NO: 1 was prepared, TMT level reagent containing the stable isotope element 13C was added to the solution, and after reacting at room temperature for 1 hour, 5% By adding hydroxylamine to stop the reaction, a solution 1 containing a standard peptide labeled with TMT containing the stable isotope element 13C was obtained.
＜液体クロマトグラフィー質量分析法による１９ｋＤａのグロブリンの含有量の測定＞
上記で得られたペプチド断片を含む溶液及び標品ペプチドを含む溶液１にそれぞれ０．１％ギ酸溶液を加え、ペプチド断片を含む溶液４２．５μｌと標品ペプチドを含む溶液７．５μｌとを混合して、フィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－ＭＣ－ＨＶ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ Ｄｕｒａｐｏｒｅ ＰＶＤＦ ０．４５μｍ）によりろ過して測定サンプルを得た。
<Measurement of 19 kDa globulin content by liquid chromatography mass spectrometry>
Add 0.1% formic acid solution to the solution containing the peptide fragment obtained above and the solution 1 containing the standard peptide, and mix 42.5 μl of the solution containing the peptide fragment and 7.5 μl of the solution containing the standard peptide. The sample was filtered through a filter (Ultrafree-MC-HV Centrifugal Filters Durapore PVDF 0.45 μm) to obtain a measurement sample.
液体クロマトグラフィー質量分析は、液体クロマトグラフ質量分析計ＬＣ－ＭＳ９０１０（株式会社島津製作所製）を用いて、以下の分析条件で行った。
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ ＡＱ－Ｃ１８（φ２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、ジーエルサイエンス株式会社製）
カラム温度：４０℃
流速：４００μｌ／分
注入量：５μｌ
溶媒：移動相Ａ：超純水（ＬＣＭＳ用）＋０．１％ギ酸、移動相Ｂ：１００％アセトニトリル（ＬＣＭＳ用）＋０．１％ギ酸、５％移動相Ｂ（０～２分）、５～４５％移動相Ｂ（２～１３分）、４５～９５％移動相Ｂ（１３～１６分）、９５％移動相Ｂ（１６～１８分）、５％移動相Ｂ（１８～２０分）
Liquid chromatography mass spectrometry was performed using a liquid chromatography mass spectrometer LC-MS9010 (manufactured by Shimadzu Corporation) under the following analysis conditions.
Column: InertSustain AQ-C18 (φ2.1mm x 150mm, manufactured by GL Sciences, Inc.)
Column temperature: 40℃
Flow rate: 400μl/min Injection volume: 5μl
Solvent: Mobile phase A: ultrapure water (for LCMS) + 0.1% formic acid, mobile phase B: 100% acetonitrile (for LCMS) + 0.1% formic acid, 5% mobile phase B (0 to 2 minutes), 5 to 45% mobile phase B (2-13 minutes), 45-95% mobile phase B (13-16 minutes), 95% mobile phase B (16-18 minutes), 5% mobile phase B (18-20 minutes)
上記で得られた濃度既知の標品ペプチドのピーク面積値及びペプチド断片のピーク面積値からサンプルに含まれる各ペプチド断片の濃度を算出し、算出結果から対応するタンパク質（１９ｋＤａのグロブリン）の濃度を算出した。算出結果は９８．７ｐｍｏｌであった。 The concentration of each peptide fragment contained in the sample is calculated from the peak area value of the standard peptide of known concentration and the peak area value of the peptide fragment obtained above, and the concentration of the corresponding protein (globulin of 19 kDa) is calculated from the calculation result. Calculated. The calculation result was 98.7 pmol.
（実施例２：米に含まれるグルテリンＡ１の含有量の測定）
標品ペプチドのラベル化において、配列番号１からなるペプチドを含む溶液を準備する代わりに、配列番号２からなるペプチドを含む溶液（濃度１．０８ｍｇ／ｍｌ）を準備したこと以外は、上記実施例１と同様の手法により、標品ペプチドを含む溶液２を調製し、米に含まれるグルテリンＡ１の含有量を測定した。算出結果は５９．９ｐｍｏｌであった。
(Example 2: Measurement of content of glutelin A1 contained in rice)
The above Example except that in labeling the standard peptide, a solution containing the peptide consisting of SEQ ID NO: 2 (concentration 1.08 mg/ml) was prepared instead of preparing a solution containing the peptide consisting of SEQ ID NO: 1. Solution 2 containing standard peptide was prepared by the same method as in 1, and the content of glutelin A1 contained in rice was measured. The calculation result was 59.9 pmol.
（実施例３：米に含まれるグルテリンＡ２の含有量の測定）
標品ペプチドのラベル化において、配列番号１からなるペプチドを含む溶液を準備する代わりに、配列番号３からなるペプチドを含む溶液（濃度５．０ｍｇ／ｍｌ）を準備したこと以外は、上記実施例１と同様の手法により、標品ペプチドを含む溶液３を調製し、米に含まれるグルテリンＡ２の含有量を測定した。算出結果は４５．３ｐｍｏｌであった。
(Example 3: Measurement of content of glutelin A2 contained in rice)
The above Example except that in labeling the standard peptide, a solution containing the peptide consisting of SEQ ID NO: 3 (concentration 5.0 mg/ml) was prepared instead of preparing a solution containing the peptide consisting of SEQ ID NO: 1. Solution 3 containing standard peptide was prepared by the same method as in Example 1, and the content of glutelin A2 contained in rice was measured. The calculation result was 45.3 pmol.
（実施例４：米に含まれるグルテリンＡ３の含有量の測定）
標品ペプチドのラベル化において、配列番号１からなるペプチドを含む溶液を準備する代わりに、配列番号４からなるペプチドを含む溶液（濃度５．０ｍｇ／ｍｌ）を準備したこと以外は、上記実施例１と同様の手法により、標品ペプチドを含む溶液４を調製し、米に含まれるグルテリンＡ３の含有量を測定した。算出結果は４．９ｐｍｏｌであった。
(Example 4: Measurement of content of glutelin A3 contained in rice)
The above Example except that in labeling the standard peptide, a solution containing the peptide consisting of SEQ ID NO: 4 (concentration 5.0 mg/ml) was prepared instead of preparing a solution containing the peptide consisting of SEQ ID NO: 1. Solution 4 containing standard peptide was prepared by the same method as in 1, and the content of glutelin A3 contained in rice was measured. The calculation result was 4.9 pmol.
（実施例５：米に含まれるグルテリンＢの含有量の測定）
標品ペプチドのラベル化において、配列番号１からなるペプチドを含む溶液を準備する代わりに、配列番号５からなるペプチドを含む溶液（濃度１ｍｇ／ｍｌ）を準備したこと以外は、上記実施例１と同様の手法により、標品ペプチドを含む溶液５を準備し、米に含まれるグルテリンＢの含有量を測定した。算出結果は１２．４ｐｍｏｌであった。
(Example 5: Measurement of content of glutelin B contained in rice)
In labeling the standard peptide, the same procedure as in Example 1 above was performed, except that instead of preparing a solution containing the peptide consisting of SEQ ID NO: 1, a solution containing the peptide consisting of SEQ ID NO: 5 (concentration 1 mg/ml) was prepared. Solution 5 containing standard peptide was prepared using the same method, and the content of glutelin B contained in rice was measured. The calculation result was 12.4 pmol.
（実施例６：米に含まれるグルテリンＤの含有量の測定）
標品ペプチドのラベル化において、配列番号１からなるペプチドを含む溶液を準備する代わりに、配列番号６からなるペプチドを含む溶液（濃度５．０ｍｇ／ｍｌ）を準備したこと以外は、上記実施例１と同様の手法により、標品ペプチドを含む溶液６を調製し、米に含まれるグルテリンＤの含有量を測定した。算出結果は１２．０ｐｍｏｌであった。
(Example 6: Measurement of content of glutelin D contained in rice)
The above Example except that in labeling the standard peptide, a solution containing the peptide consisting of SEQ ID NO: 6 (concentration 5.0 mg/ml) was prepared instead of preparing a solution containing the peptide consisting of SEQ ID NO: 1. Solution 6 containing standard peptide was prepared by the same method as in 1, and the content of glutelin D contained in rice was measured. The calculation result was 12.0 pmol.
（実施例７：米に含まれるプロラミン１３ａ－１の含有量の測定）
標品ペプチドのラベル化において、配列番号１からなるペプチドを含む溶液を準備する代わりに、配列番号７からなるペプチドを含む溶液（濃度５．４ｍｇ／ｍｌ）を準備したこと以外は、上記実施例１と同様の手法により、標品ペプチドを含む溶液７を調製し、米に含まれるプロラミン１３ａ－１の含有量を測定した。算出結果は７３．２ｐｍｏｌであった。
(Example 7: Measurement of content of prolamin 13a-1 contained in rice)
The above Example except that in labeling the standard peptide, a solution containing the peptide consisting of SEQ ID NO: 7 (concentration 5.4 mg/ml) was prepared instead of preparing a solution containing the peptide consisting of SEQ ID NO: 1. Solution 7 containing standard peptide was prepared by the same method as in 1, and the content of prolamin 13a-1 contained in rice was measured. The calculation result was 73.2 pmol.
以下の試験例１～７においては、定量対象となるタンパク質を断片化して得られるペプチド断片の種類に応じた、ペプチド断片の含有量の測定感度を比較した。 In Test Examples 1 to 7 below, the sensitivity of measuring the content of peptide fragments was compared depending on the type of peptide fragments obtained by fragmenting a protein to be quantified.
（試験例１：１９ｋＤａのグロブリンの各種ペプチド断片の種類による測定感度の比較）
標品ペプチドのラベル化において、配列番号１からなるペプチドを含む溶液を準備する代わりに、下記表２に示すような、１９ｋＤａのグロブリンの各種ペプチド断片に相当するペプチドをそれぞれ含む溶液を準備したこと以外は、上記実施例１と同様の手法により、それぞれのペプチド断片の標品ペプチドを含む溶液を調製した。得られた各種標品ペプチドを含む溶液を、液体クロマトグラフ質量分析計ＬＣ－ＭＳ９０１０（株式会社島津製作所製）を用いて、上記実施例１で示した同様の測定条件により測定し、ピーク面積値及びピーク形状を比較した。下記表２に使用したペプチド断片及びピーク面積値を示す。
(Test Example 1: Comparison of measurement sensitivity depending on the type of various peptide fragments of 19kDa globulin)
In labeling standard peptides, instead of preparing a solution containing the peptide consisting of SEQ ID NO: 1, solutions containing peptides corresponding to various peptide fragments of 19 kDa globulin as shown in Table 2 below were prepared. A solution containing standard peptides of each peptide fragment was prepared in the same manner as in Example 1 except for the above. The obtained solutions containing various standard peptides were measured using a liquid chromatograph mass spectrometer LC-MS9010 (manufactured by Shimadzu Corporation) under the same measurement conditions as shown in Example 1 above, and the peak area values were determined. and the peak shapes were compared. Table 2 below shows the peptide fragments and peak area values used.
測定感度の比較は、ピーク面積値が大きく、且つピーク形状がシャープであるものを選択することが好ましい。したがって、１９ｋＤａのグロブリンの各種ペプチド断片の種類による測定感度の比較においては、ピーク面積値とピーク形状を総合的に考慮し、配列番号１のペプチドを用いることが最も好ましい。 When comparing measurement sensitivities, it is preferable to select a sample with a large peak area value and a sharp peak shape. Therefore, in comparing the measurement sensitivity of various types of peptide fragments of 19 kDa globulin, it is most preferable to use the peptide of SEQ ID NO: 1, taking into consideration the peak area value and peak shape comprehensively.
（試験例２：グルテリンＡ１の各種ペプチド断片の種類による測定感度の比較）
標品ペプチドのラベル化において、配列番号１からなるペプチドを含む溶液を準備する代わりに、下記表３に示すような、グルテリンＡ１の各種ペプチド断片に相当するペプチドをそれぞれ含む溶液を準備したこと以外は、上記実施例１と同様の手法により、それぞれのペプチド断片の標品ペプチドを含む溶液を調製した。得られた各種標品ペプチドを含む溶液を、液体クロマトグラフ質量分析計ＬＣ－ＭＳ９０１０（株式会社島津製作所製）を用いて、上記実施例１で示した同様の測定条件により測定し、ピーク面積値及びピーク形状を比較した。下記表３に使用したペプチド断片及びピーク面積値を示す。
(Test Example 2: Comparison of measurement sensitivity depending on the type of various peptide fragments of glutelin A1)
In labeling the standard peptide, instead of preparing a solution containing the peptide consisting of SEQ ID NO: 1, solutions containing peptides corresponding to various peptide fragments of glutelin A1 as shown in Table 3 below were prepared. A solution containing standard peptides of each peptide fragment was prepared by the same method as in Example 1 above. The obtained solutions containing various standard peptides were measured using a liquid chromatograph mass spectrometer LC-MS9010 (manufactured by Shimadzu Corporation) under the same measurement conditions as shown in Example 1 above, and the peak area values were determined. and the peak shapes were compared. Table 3 below shows the peptide fragments and peak area values used.
測定感度の比較は、ピーク面積値が大きく、且つピーク形状がシャープであるものを選択することが好ましい。したがって、グルテリンＡ１の各種ペプチド断片の種類による測定感度の比較においては、ピーク面積値とピーク形状を総合的に考慮し、配列番号２のペプチドを用いることが最も好ましい。 When comparing measurement sensitivities, it is preferable to select a sample with a large peak area value and a sharp peak shape. Therefore, in comparing the measurement sensitivity of various types of peptide fragments of glutelin A1, it is most preferable to use the peptide of SEQ ID NO: 2 by comprehensively considering the peak area value and peak shape.
（試験例３：グルテリンＡ２の各種ペプチド断片の種類による測定感度の比較）
標品ペプチドのラベル化において、配列番号１からなるペプチドを含む溶液を準備する代わりに、下記表４に示すような、グルテリンＡ２の各種ペプチド断片に相当するペプチドをそれぞれ含む溶液を準備したこと以外は、上記実施例１と同様の手法により、それぞれのペプチド断片の標品ペプチドを含む溶液を調製した。得られた各種標品ペプチドを含む溶液を、液体クロマトグラフ質量分析計ＬＣ－ＭＳ９０１０（株式会社島津製作所製）を用いて、上記実施例１で示した同様の測定条件により測定し、ピーク面積値及びピーク形状を比較した。下記表４に使用したペプチド断片及びピーク面積値を示す。
(Test Example 3: Comparison of measurement sensitivity depending on the type of various peptide fragments of glutelin A2)
In labeling the standard peptide, instead of preparing a solution containing the peptide consisting of SEQ ID NO: 1, solutions containing peptides corresponding to various peptide fragments of glutelin A2 as shown in Table 4 below were prepared. A solution containing standard peptides of each peptide fragment was prepared by the same method as in Example 1 above. The obtained solutions containing various standard peptides were measured using a liquid chromatograph mass spectrometer LC-MS9010 (manufactured by Shimadzu Corporation) under the same measurement conditions as shown in Example 1 above, and the peak area values were determined. and the peak shapes were compared. Table 4 below shows the peptide fragments and peak area values used.
測定感度の比較は、ピーク面積値が大きく、且つピーク形状がシャープであるものを選択することが好ましい。したがって、グルテリンＡ２の各種ペプチド断片の種類による測定感度の比較においては、ピーク面積値とピーク形状を総合的に考慮し、配列番号３のペプチドを用いることが最も好ましい。 When comparing measurement sensitivities, it is preferable to select a sample with a large peak area value and a sharp peak shape. Therefore, in comparing the measurement sensitivity of various types of peptide fragments of glutelin A2, it is most preferable to use the peptide of SEQ ID NO: 3 by comprehensively considering the peak area value and peak shape.
（試験例４：グルテリンＡ３の各種ペプチド断片の種類による測定感度の比較）
標品ペプチドのラベル化において、配列番号１からなるペプチドを含む溶液を準備する代わりに、下記表５に示すような、グルテリンＡ３の各種ペプチド断片に相当するペプチドをそれぞれ含む溶液を準備したこと以外は、上記実施例１と同様の手法により、それぞれのペプチド断片の標品ペプチドを含む溶液を調製した。得られた各種標品ペプチドを含む溶液を、液体クロマトグラフ質量分析計ＬＣ－ＭＳ９０１０（株式会社島津製作所製）を用いて、上記実施例１で示した同様の測定条件により測定し、ピーク面積値及びピーク形状を比較した。下記表５に使用したペプチド断片及びピーク面積値を示す。
(Test Example 4: Comparison of measurement sensitivity depending on the type of various peptide fragments of glutelin A3)
In labeling the standard peptide, instead of preparing a solution containing the peptide consisting of SEQ ID NO: 1, solutions containing peptides corresponding to various peptide fragments of glutelin A3 as shown in Table 5 below were prepared. A solution containing standard peptides of each peptide fragment was prepared by the same method as in Example 1 above. The obtained solutions containing various standard peptides were measured using a liquid chromatograph mass spectrometer LC-MS9010 (manufactured by Shimadzu Corporation) under the same measurement conditions as shown in Example 1 above, and the peak area values were determined. and the peak shapes were compared. Table 5 below shows the peptide fragments and peak area values used.
測定感度の比較は、ピーク面積値が大きく、且つピーク形状がシャープであるものを選択することが好ましい。したがって、グルテリンＡ３の各種ペプチド断片の種類による測定感度の比較においては、ピーク面積値とピーク形状を総合的に考慮し、配列番号４のペプチドを用いることが最も好ましい。 When comparing measurement sensitivities, it is preferable to select a sample with a large peak area value and a sharp peak shape. Therefore, in comparing the measurement sensitivity of various types of peptide fragments of glutelin A3, it is most preferable to use the peptide of SEQ ID NO: 4 by comprehensively considering the peak area value and peak shape.
（試験例５：グルテリンＢの各種ペプチド断片の種類による測定感度の比較）
標品ペプチドのラベル化において、配列番号１からなるペプチドを含む溶液を準備する代わりに、下記表６に示すような、グルテリンＢの各種ペプチド断片に相当するペプチドをそれぞれ含む溶液を準備したこと以外は、上記実施例１と同様の手法により、それぞれのペプチド断片の標品ペプチドを含む溶液を調製した。得られた各種標品ペプチドを含む溶液を、液体クロマトグラフ質量分析計ＬＣ－ＭＳ９０１０（株式会社島津製作所製）を用いて、上記実施例１で示した同様の測定条件により測定し、ピーク面積値及びピーク形状を比較した。下記表６に使用したペプチド断片及びピーク面積値を示す。
(Test Example 5: Comparison of measurement sensitivity depending on the type of various peptide fragments of glutelin B)
In labeling the standard peptide, instead of preparing a solution containing the peptide consisting of SEQ ID NO: 1, solutions containing peptides corresponding to various peptide fragments of glutelin B as shown in Table 6 below were prepared. A solution containing standard peptides of each peptide fragment was prepared by the same method as in Example 1 above. The obtained solutions containing various standard peptides were measured using a liquid chromatograph mass spectrometer LC-MS9010 (manufactured by Shimadzu Corporation) under the same measurement conditions as shown in Example 1 above, and the peak area values were determined. and the peak shapes were compared. Table 6 below shows the peptide fragments and peak area values used.
測定感度の比較は、ピーク面積値が大きく、且つピーク形状がシャープであるものを選択することが好ましい。したがって、グルテリンＢの各種ペプチド断片の種類による測定感度の比較においては、ピーク面積値とピーク形状を総合的に考慮し、配列番号５のペプチドを用いることが最も好ましい。 When comparing measurement sensitivities, it is preferable to select a sample with a large peak area value and a sharp peak shape. Therefore, in comparing the measurement sensitivity of various types of peptide fragments of glutelin B, it is most preferable to use the peptide of SEQ ID NO: 5 by comprehensively considering the peak area value and peak shape.
（試験例６：グルテリンＤの各種ペプチド断片の種類による測定感度の比較）
標品ペプチドのラベル化において、配列番号１からなるペプチドを含む溶液を準備する代わりに、下記表７に示すような、グルテリンＤの各種ペプチド断片に相当するペプチドをそれぞれ含む溶液を準備したこと以外は、上記実施例１と同様の手法により、それぞれのペプチド断片の標品ペプチドを含む溶液を調製した。得られた各種標品ペプチドを含む溶液を、液体クロマトグラフ質量分析計ＬＣ－ＭＳ９０１０（株式会社島津製作所製）を用いて、上記実施例１で示した同様の測定条件により測定し、ピーク面積値及びピーク形状を比較した。下記表７に使用したペプチド断片及びピーク面積値を示す。
(Test Example 6: Comparison of measurement sensitivity depending on the type of various peptide fragments of glutelin D)
In labeling the standard peptide, instead of preparing a solution containing the peptide consisting of SEQ ID NO: 1, solutions containing peptides corresponding to various peptide fragments of glutelin D as shown in Table 7 below were prepared. A solution containing standard peptides of each peptide fragment was prepared by the same method as in Example 1 above. The obtained solutions containing various standard peptides were measured using a liquid chromatograph mass spectrometer LC-MS9010 (manufactured by Shimadzu Corporation) under the same measurement conditions as shown in Example 1 above, and the peak area values were determined. and the peak shapes were compared. Table 7 below shows the peptide fragments and peak area values used.
測定感度の比較は、ピーク面積値が大きく、且つピーク形状がシャープであるものを選択することが好ましい。したがって、グルテリンＤの各種ペプチド断片の種類による測定感度の比較においては、ピーク面積値とピーク形状を総合的に考慮し、配列番号６のペプチドを用いることが最も好ましい。 When comparing measurement sensitivities, it is preferable to select a sample with a large peak area value and a sharp peak shape. Therefore, in comparing the measurement sensitivity of various types of peptide fragments of glutelin D, it is most preferable to use the peptide of SEQ ID NO: 6 by comprehensively considering the peak area value and peak shape.
（試験例７：プロラミン１３ａ－１の各種ペプチド断片の種類による測定感度の比較）
標品ペプチドのラベル化において、配列番号１からなるペプチドを含む溶液を準備する代わりに、下記表８に示すような、プロラミン１３ａ－１の各種ペプチド断片に相当するペプチドをそれぞれ含む溶液を準備したこと以外は、上記実施例１と同様の手法により、それぞれのペプチド断片の標品ペプチドを含む溶液を調製した。得られた各種標品ペプチドを含む溶液を、液体クロマトグラフ質量分析計ＬＣ－ＭＳ９０１０（株式会社島津製作所製）を用いて、上記実施例１で示した同様の測定条件により測定し、ピーク面積値及びピーク形状を比較した。下記表８に使用したペプチド断片及びピーク面積値を示す。
(Test Example 7: Comparison of measurement sensitivity depending on the type of various peptide fragments of prolamin 13a-1)
In labeling the standard peptide, instead of preparing a solution containing the peptide consisting of SEQ ID NO: 1, solutions containing peptides corresponding to various peptide fragments of prolamin 13a-1 as shown in Table 8 below were prepared. Except for this, a solution containing standard peptides of each peptide fragment was prepared in the same manner as in Example 1 above. The obtained solutions containing various standard peptides were measured using a liquid chromatograph mass spectrometer LC-MS9010 (manufactured by Shimadzu Corporation) under the same measurement conditions as shown in Example 1 above, and the peak area values were determined. and the peak shapes were compared. Table 8 below shows the peptide fragments and peak area values used.
測定感度の比較は、ピーク面積値が大きく、且つピーク形状がシャープであるものを選択することが好ましい。したがって、プロラミン１３ａ－１の各種ペプチド断片の種類による測定感度の比較においては、ピーク面積値とピーク形状を総合的に考慮し、配列番号７のペプチドを用いることが最も好ましい。 When comparing measurement sensitivities, it is preferable to select a sample with a large peak area value and a sharp peak shape. Therefore, in comparing the measurement sensitivity of various types of peptide fragments of prolamin 13a-1, it is most preferable to use the peptide of SEQ ID NO: 7 by comprehensively considering the peak area value and peak shape.
Claims (1)
液体クロマトグラフィー質量分析法を用いて前記タンパク質のペプチド断片の含有量を測定するものであり、
前記タンパク質がグルテリンＡ１であり、前記ペプチド断片が配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド断片であるか、
前記タンパク質がグルテリンＡ３であり、前記ペプチド断片が配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド断片であるか、又は
前記タンパク質がグルテリンＢであり、前記ペプチド断片が配列番号５のアミノ酸配列を有するペプチド断片である、方法。 A method for measuring the protein content contained in rice, the method comprising:
The content of peptide fragments of the protein is measured using liquid chromatography mass spectrometry,
The protein is glutelin A1, and the peptide fragment is a peptide fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
The protein is glutelin A3, the peptide fragment is a peptide fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, or
The method , wherein the protein is glutelin B, and the peptide fragment is a peptide fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 .
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