JP7345753B2 - Antitumor peptides and their uses - Google Patents
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Description
特許法第３０条第２項適用 ２０１８年９月１２日にウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｃｃｏ－ｏｒｇ．ｅｕ／Ｅｖｅｎｔｓ／ＥＮＡ２０１８／Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ－Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ＃ａｎｃｈｏｒＳｃｐｒ）に発表Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act Announced on the website (https://www.ecco-org.eu/Events/ENA2018/Searchable-Programme#anchorScpr) on September 12, 2018
特許法第３０条第２項適用 ２０１８年１０月３０日にウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｃｃｏ－ｏｒｇ．ｅｕ／Ｅｖｅｎｔｓ／ＥＮＡ２０１８／Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ－Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ＃ａｎｃｈｏｒＳｃｐｒ）に発表Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act Announced on the website (https://www.ecco-org.eu/Events/ENA2018/Searchable-Programme#anchorScpr) on October 30, 2018
本発明は、腫瘍細胞の増殖を抑制し得る人為的に合成された抗腫瘍性ペプチドとその利用に関する。詳しくは、スフィンゴシン1リン酸レセプター(Ｓ１ＰＲ：sphingosine 1-phosphate receptor)ファミリーに属するタンパク質のトランスメンブレン(ＴＭ)領域を構成するアミノ酸配列（以下「ＴＭ配列」ともいう。）と、膜透過性ペプチド配列とを備える人工ペプチドの利用に関する。 The present invention relates to an artificially synthesized anti-tumor peptide capable of suppressing the proliferation of tumor cells and its use. Specifically, the amino acid sequence (hereinafter also referred to as "TM sequence") that constitutes the transmembrane (TM) region of proteins belonging to the sphingosine 1-phosphate receptor (S1PR) family, and the membrane-permeable peptide sequence. The present invention relates to the use of an artificial peptide comprising:
近年、細胞膜構成成分の一つであるスフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ：sphingosine 1-phosphate）が、がんの増悪化を促進しているとの報告が多数されている。がん患者の血清中におけるＳ１Ｐレベルは健常人に比べて高く、Ｓ１Ｐの合成酵素スフィンゴシンキナーゼ１（ＳｐｈＫ１：sphingosine kinase 1）や受容体Ｓ１ＰＲの発現もがん患者での増加が報告されている（非特許文献１，２）。細胞レベルでは、Ｓ１Ｐが腫瘍細胞の増殖、転移を促進し、腫瘍微小環境では炎症や血管新生を促すことで、腫瘍の生育に好適な条件を提供するとの報告がある。そのため、ＳｐｈＫ１やＳ１ＰＲは新たながん治療における治療標的になり得るとして、これらを対象とした研究が精力的に行われている。 In recent years, there have been many reports that sphingosine 1-phosphate (S1P), one of the constituents of cell membranes, promotes the aggravation and deterioration of cancer. The S1P level in the serum of cancer patients is higher than that of healthy individuals, and the expression of S1P synthase sphingosine kinase 1 (SphK1) and receptor S1PR has also been reported to increase in cancer patients ( Non-patent documents 1, 2). At the cellular level, it has been reported that S1P promotes tumor cell proliferation and metastasis, and promotes inflammation and angiogenesis in the tumor microenvironment, thereby providing conditions suitable for tumor growth. Therefore, SphK1 and S1PR are considered to be therapeutic targets for new cancer treatments, and research targeting them is being conducted vigorously.
ところで、今日では、疾患特異的な分子を標的とした治療に関する研究が急速に進んでおり、抗体医薬品を含め、多数の分子標的治療薬が開発されてきた。がんの分子標的治療の例として、近年ではＭＡＰＫシグナル経路関連分子（ＢＲＡＦ等）をターゲットとした分子標的薬が開発され、例えばメラノーマの治療に応用されている。分子標的治療薬は対象となるがんに対し、一時的には極めて優れた抗腫瘍作用を現すが、一定期間後には薬剤耐性がん細胞が現れてくる場合もあり得る。また、抗体を薬効成分として用いる抗腫瘍剤は、たいへん高価であり、がん医療にかかるコストの問題が避けては通れない深刻な状況にある。
そこで本発明は、高価な抗体を使用する抗腫瘍剤とは異なる構成かつ抗腫瘍（抗がん）メカニズムを有する合成ペプチドを提供することを課題（目的）として創出されたものである。
Nowadays, research on treatments that target disease-specific molecules is progressing rapidly, and a large number of molecular-targeted therapeutic drugs, including antibody drugs, have been developed. As an example of molecular target therapy for cancer, molecular target drugs targeting molecules related to the MAPK signal pathway (BRAF, etc.) have been developed in recent years and are being applied, for example, to the treatment of melanoma. Molecularly targeted therapeutic drugs temporarily exhibit excellent antitumor effects against the target cancer, but after a certain period of time, drug-resistant cancer cells may appear. Furthermore, antitumor drugs that use antibodies as their active ingredients are very expensive, and the cost of cancer treatment is a serious problem that cannot be avoided.
Therefore, the present invention was created with the object (object) of providing a synthetic peptide that has a different structure and antitumor (anticancer) mechanism from antitumor agents that use expensive antibodies.
本発明者は、各生物種、特に哺乳類において発現される７回膜貫通型タンパク質Ｓ１ＰＲファミリーに属するタンパク質のＴＭ領域に着目した。そして、驚くべきことに、特にＳ１ＰＲ２，Ｓ１ＰＲ４，Ｓ１ＰＲ５のＴＭ領域を構成するアミノ酸配列と、従来知られた細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ；cell penetrating peptide）を構成するアミノ酸配列とを組み合わせた合成ペプチドが、種々の腫瘍細胞に対して優れた抗腫瘍性（抗がん性）を有することを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors focused on the TM region of a protein belonging to the S1PR family of seven-transmembrane proteins expressed in various biological species, especially mammals. Surprisingly, a synthetic peptide that combines the amino acid sequences constituting the TM regions of S1PR2, S1PR4, and S1PR5 with the amino acid sequences constituting the conventionally known cell penetrating peptide (CPP) has been discovered. The present inventors have discovered that they have excellent antitumor properties (anticancer properties) against various tumor cells, and have completed the present invention.
即ち、ここで開示される合成ペプチドは、少なくとも一種の腫瘍細胞の増殖を抑制する合成ペプチドであって、以下の（１）および（２）に示すアミノ酸配列：
（１）膜タンパク質であるＳ１ＰＲのＴＭ領域を構成するアミノ酸配列であって、以下のｉ）～ｖｉ）に示すいずれかのＳ１ＰＲ-ＴＭ関連配列：
ｉ）Ｓ１ＰＲ２の、Ｎ末端から２番目のＴＭ領域を構成するアミノ酸配列；
または、該アミノ酸配列において１個、２個又は３個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加された改変アミノ酸配列；
ｉｉ）Ｓ１ＰＲ４の、Ｎ末端から２番目のＴＭ領域を構成するアミノ酸配列；
または、該アミノ酸配列において１個、２個又は３個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加された改変アミノ酸配列；
ｉｉｉ）Ｓ１ＰＲ４の、Ｎ末端から３番目のＴＭ領域を構成するアミノ酸配列；
または、該アミノ酸配列において１個、２個又は３個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加された改変アミノ酸配列；
ｉｖ）Ｓ１ＰＲ４の、Ｎ末端から４番目のＴＭ領域を構成するアミノ酸配列；
または、該アミノ酸配列において１個、２個又は３個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加された改変アミノ酸配列；
ｖ）Ｓ１ＰＲ５の、Ｎ末端から３番目のＴＭ領域を構成するアミノ酸配列；
または、該アミノ酸配列において１個、２個又は３個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加された改変アミノ酸配列；
ｖｉ）Ｓ１ＰＲ５の、Ｎ末端から４番目のＴＭ領域を構成するアミノ酸配列；
または、該アミノ酸配列において１個、２個又は３個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加された改変アミノ酸配列；及び、
（２）膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）として機能するアミノ酸配列（以下、「ＣＰＰ関連配列」という。）；
をともに備えることを特徴とする。
好ましい一態様では、ここで開示される抗腫瘍ペプチドは、総アミノ酸残基数が１００以下である。製造コスト、合成のしやすさ、取り扱い性の観点からは、総アミノ酸残基数が８０以下（例えば、７０以下）であるものがさらに好ましい。
或いは、上記（１）に示すアミノ酸配列と、（２）に示すアミノ酸配列とが全体８０個数％以上（より好ましくは９０個数％以上、例えば１００個数％以上）を占めるような合成ペプチドは、ここで開示される抗腫瘍ペプチドの内の特に好適な一態様である。
That is, the synthetic peptide disclosed herein is a synthetic peptide that suppresses the proliferation of at least one type of tumor cell, and has the amino acid sequences shown in (1) and (2) below:
(1) An amino acid sequence constituting the TM region of S1PR, which is a membrane protein, and any S1PR-TM related sequence shown in i) to vi) below:
i) Amino acid sequence constituting the second TM region from the N-terminus of S1PR2;
or a modified amino acid sequence in which 1, 2 or 3 amino acid residues are deleted, substituted or added;
ii) Amino acid sequence constituting the second TM region from the N-terminus of S1PR4;
or a modified amino acid sequence in which 1, 2 or 3 amino acid residues are deleted, substituted or added;
iii) Amino acid sequence constituting the third TM region from the N-terminus of S1PR4;
or a modified amino acid sequence in which 1, 2 or 3 amino acid residues are deleted, substituted or added;
iv) Amino acid sequence constituting the fourth TM region from the N-terminus of S1PR4;
or a modified amino acid sequence in which 1, 2 or 3 amino acid residues are deleted, substituted or added;
v) Amino acid sequence constituting the third TM region from the N-terminus of S1PR5;
or a modified amino acid sequence in which 1, 2 or 3 amino acid residues are deleted, substituted or added;
vi) Amino acid sequence constituting the fourth TM region from the N-terminus of S1PR5;
or a modified amino acid sequence in which 1, 2 or 3 amino acid residues are deleted, substituted or added to the amino acid sequence; and
(2) Amino acid sequence that functions as a membrane-permeable peptide (CPP) (hereinafter referred to as "CPP-related sequence");
It is characterized by having both.
In one preferred embodiment, the antitumor peptide disclosed herein has a total number of amino acid residues of 100 or less. From the viewpoint of manufacturing cost, ease of synthesis, and ease of handling, those having a total number of amino acid residues of 80 or less (for example, 70 or less) are more preferable.
Alternatively, a synthetic peptide in which the amino acid sequence shown in (1) above and the amino acid sequence shown in (2) account for 80% or more (more preferably 90% or more, for example, 100% or more) of the total number, This is one particularly preferred embodiment of the antitumor peptides disclosed in .
配列番号１～１７として開示されるアミノ酸配列は、本発明の実施に好適に採用し得るＳ１ＰＲ-ＴＭ関連配列の典型例である。
また、ここで開示される抗腫瘍ペプチドの好適な他の一態様では、上記ＣＰＰ関連配列が、ポリアルギニン（特に限定しないが、典型的には、５個以上９個以下のアルギニン残基から構成される）、又は、配列番号１８～３５のいずれかに示すアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列について１個、２個又は３個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加された改変アミノ酸配列であることを特徴とする。
例えば、
（ｉ）配列番号１～６に示すアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列について１個又は複数個（例えば２個又は３個）のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加された改変アミノ酸配列；及び
（ｉｉ）ポリアルギニン、又は、配列番号１８～３５のうちのいずれかに示すアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列について１個又は複数個（例えば２個又は３個）のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加された改変アミノ酸配列；
をともに備える合成ペプチドが好適例として挙げられる。
The amino acid sequences disclosed as SEQ ID NOs: 1 to 17 are typical examples of S1PR-TM related sequences that can be suitably employed in the practice of the present invention.
In another preferred embodiment of the antitumor peptide disclosed herein, the CPP-related sequence is polyarginine (typically, but not limited to, composed of 5 to 9 arginine residues). ), or an amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 18 to 35, or a modified amino acid sequence in which 1, 2, or 3 amino acid residues are deleted, substituted, or added to the amino acid sequence. characterized by something.
for example,
(i) Amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6, or modified amino acid sequences in which one or more (for example, two or three) amino acid residues are deleted, substituted, or added to the amino acid sequences; and (ii) polyarginine, or the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 18 to 35, or one or more (for example, two or three) amino acid residues deleted from the amino acid sequence; Modified amino acid sequence substituted or added;
A preferable example is a synthetic peptide having the following.
ここで開示される抗腫瘍ペプチドの好適な他の一態様では、上記ＣＰＰ関連配列（又はその改変アミノ酸配列）が、上記Ｓ１ＰＲ-ＴＭ関連配列のＮ末端或いはＣ末端側に隣接する。或いは、リンカーとして機能する１０個以下（好ましくは５個以下、例えば１個か２個）のアミノ酸残基を介して配置される。 In another preferred embodiment of the antitumor peptide disclosed herein, the CPP-related sequence (or its modified amino acid sequence) is adjacent to the N-terminus or C-terminus of the S1PR-TM-related sequence. Alternatively, it is arranged via up to 10 (preferably up to 5, eg, 1 or 2) amino acid residues that function as linkers.
好ましい一態様では、ここで開示される抗腫瘍ペプチドは、配列番号３６～４１に示すアミノ酸配列であることを特徴とする。 In one preferred embodiment, the antitumor peptide disclosed herein is characterized by having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 36-41.
また、本発明は、ここで開示されるいずれかの合成ペプチド（抗腫瘍ペプチド）と、薬学上許容され得る少なくとも一種の担体とを備える、少なくとも一種の腫瘍細胞の増殖を抑制する抗腫瘍組成物を提供する。
かかる組成物は、ここで開示される抗腫瘍ペプチドを含むことにより、抗腫瘍剤（抗がん剤を包含する。以下同じ。）としての利用、或いは新たな抗腫瘍剤の開発のための材料として利用することができる。
The present invention also provides an antitumor composition that suppresses the proliferation of at least one tumor cell, which comprises any of the synthetic peptides (antitumor peptides) disclosed herein and at least one pharmaceutically acceptable carrier. I will provide a.
By containing the antitumor peptide disclosed herein, such a composition can be used as an antitumor agent (including anticancer agents; the same applies hereinafter) or as a material for the development of a new antitumor agent. It can be used as
また、本発明は、ここで開示されるいずれかの合成ペプチド（抗腫瘍ペプチド）を、対象とする腫瘍細胞に対して（例えば生体外＝インビトロにおいて、或いは、生体内＝インビボにおいて）、少なくとも１回供給することを特徴とする、少なくとも一種の腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を提供する。
かかる構成の方法では、ここで開示される抗腫瘍ペプチドを腫瘍細胞に供給することによって、該腫瘍細胞の増殖（ひいては腫瘍、癌組織の増大）を阻止若しくは抑制することができる。
Furthermore, the present invention provides at least one method of administering any of the synthetic peptides (antitumor peptides) disclosed herein to target tumor cells (for example, in vitro = in vitro, or in vivo = in vivo). Provided is a method for inhibiting the proliferation of at least one tumor cell, the method comprising: supplying a tumor cell twice.
In this method, by supplying the antitumor peptide disclosed herein to tumor cells, the proliferation of tumor cells (and thus the growth of tumors and cancer tissues) can be inhibited or suppressed.
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。本明細書において特に言及している事項（例えばここで開示される合成ペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチドの化学合成法、細胞培養技法、ペプチドを成分とする薬学的組成物の調製に関するような一般的事項）は、細胞工学、生理学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、遺伝学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、アミノ酸を１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。
本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described. Matters other than those specifically mentioned in this specification (e.g., primary structure and chain length of synthetic peptides disclosed herein) that are necessary for carrying out the present invention (e.g., methods for chemically synthesizing peptides, cell culture) techniques, general matters such as those concerning the preparation of pharmaceutical compositions containing peptides as ingredients), cell engineering, physiology, medicine, pharmacy, organic chemistry, biochemistry, genetic engineering, protein engineering, molecular biology, genetics, etc. It can be understood as a matter of design by a person skilled in the art based on the prior art in the field. The present invention can be implemented based on the content disclosed in this specification and the common general knowledge in the field. In the following explanation, amino acids are expressed by one letter (however, in the sequence listing, they are expressed by three letters).
The entire contents of all documents cited herein are incorporated by reference.
本明細書において「腫瘍」とは、広義に解釈される用語であり、癌腫及び肉腫或いは血液や造血組織の病変（白血病、リンパ腫等）を含む腫瘍一般（典型的には悪性腫瘍）をいう。また、「腫瘍細胞」とは、「がん細胞」と同義であり、そのような腫瘍を形成する細胞であって、典型的には周辺の正常組織とは無関係に異常に増殖を行うに至った細胞（所謂がん化した細胞）をいう。従って、特別に規定しない限り、正常細胞ではなく腫瘍細胞（がん細胞）に区分される細胞であれば、該細胞の起源や性状に関わりなく腫瘍細胞と呼称される。上皮性腫瘍（扁平上皮癌、腺癌等）、非上皮性腫瘍（各種の肉腫、骨肉腫等）、各種の細胞腫（神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫等）、リンパ腫、メラノーマ等を構成する細胞は、ここでいう腫瘍細胞に包含される典型例である。 The term "tumor" as used herein is a term that is broadly interpreted and refers to tumors in general (typically malignant tumors) including carcinomas, sarcomas, or lesions of blood or hematopoietic tissue (leukemia, lymphoma, etc.). Furthermore, "tumor cells" are synonymous with "cancer cells," and are cells that form such tumors and typically proliferate abnormally regardless of surrounding normal tissue. This refers to cells that have become cancerous (so-called cancerous cells). Therefore, unless otherwise specified, any cell that is classified as a tumor cell (cancer cell) rather than a normal cell is referred to as a tumor cell, regardless of its origin or properties. Consists of epithelial tumors (squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, etc.), non-epithelial tumors (various sarcomas, osteosarcomas, etc.), various cell tumors (neuroblastoma, retinoblastoma, etc.), lymphoma, melanoma, etc. Cells that cause cancer are typical examples included in the term tumor cells herein.
また、本明細書において「合成ペプチド」とは、そのペプチド鎖がそれのみ独立して自然界に安定的に存在するものではなく、人為的な化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され、所定の組成物中で安定して存在し得るペプチド断片をいう。ここで「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が概ね１００以下（好ましくは８０以下、より好ましくは７０以下、特に好ましくは５０以下）のような比較的分子量の小さいものをいう。
また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。
なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がＮ末端側であり右側がＣ末端側である。
In addition, as used herein, "synthetic peptide" refers to a peptide chain that does not exist stably independently in nature, but is produced by artificial chemical synthesis or biosynthesis (i.e., production based on genetic engineering). Refers to a peptide fragment that has been produced and can stably exist in a given composition. The term "peptide" here refers to an amino acid polymer having multiple peptide bonds, and is not limited by the number of amino acid residues contained in the peptide chain, but typically the total number of amino acid residues is approximately 100 or less. (preferably 80 or less, more preferably 70 or less, particularly preferably 50 or less).
Furthermore, in this specification, the term "amino acid residue" includes the N-terminal amino acid and C-terminal amino acid of a peptide chain, unless otherwise specified.
In addition, in the amino acid sequences described in this specification, the left side is always the N-terminal side and the right side is always the C-terminal side.
本明細書において所定のアミノ酸配列に対して「改変アミノ酸配列」とは、当該所定のアミノ酸配列が有する機能（例えば抗腫瘍活性や細胞膜透過性能）を損なうことなく、１個から数個（典型的には９個以下、好ましくは５個以下）のアミノ酸残基、例えば、１個、２個又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列をいう。例えば、１個、２個又は３個のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列（例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列：例えばリジン残基とアルギニン残基との相互置換）、或いは、所定のアミノ酸配列について１個、２個又は３個のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列等は、本明細書でいうところの改変アミノ酸配列に包含される典型例である。従って、ここで実施例として開示される抗腫瘍ペプチドには、各配列番号のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列で構成される合成ペプチドに加え、各配列番号のアミノ酸配列において１個、２個又は３個のアミノ酸残基が置換（例えば、上記の同類置換）、欠失又は付加された改変アミノ酸配列であって、同様に抗腫瘍活性を示すアミノ酸配列からなる合成ペプチドを包含する。 In this specification, a "modified amino acid sequence" for a predetermined amino acid sequence refers to one to several (typically Refers to an amino acid sequence formed by substitution, deletion, or addition (insertion) of 9 or less, preferably 5 or less, amino acid residues, for example, 1, 2, or 3 amino acid residues. . For example, sequences resulting from so-called conservative amino acid replacements in which one, two or three amino acid residues are replaced conservatively (e.g. a basic amino acid residue replaced by another basic amino acid residue) (for example, mutual substitution of a lysine residue and an arginine residue), or a sequence in which one, two, or three amino acid residues have been added (inserted) or deleted from a given amino acid sequence, etc. This is a typical example included in the modified amino acid sequence referred to herein. Therefore, the anti-tumor peptides disclosed here as examples include synthetic peptides consisting of the same amino acid sequence as the amino acid sequence of each SEQ ID NO. The synthetic peptides include synthetic peptides consisting of modified amino acid sequences in which six amino acid residues have been substituted (for example, conservative substitutions as described above), deleted, or added, and which similarly exhibit antitumor activity.
ここで開示される人為的に合成される抗腫瘍ペプチドは、腫瘍細胞の増殖を抑制すること（即ち、抗腫瘍活性）が本発明者によって見出された天然には存在しない短鎖のペプチドであり、上述する２種のアミノ酸配列、即ち、
（１）Ｓ１ＰＲ-ＴＭ関連配列、及び、
（２）ＣＰＰ関連配列、
をともに備えることで特徴付けられるペプチドである。
ここで、Ｓ１ＰＲ-ＴＭ関連配列とは、Ｓ１ＰＲファミリーに属するＳ１ＰＲ２、Ｓ１ＰＲ４、又はＳ１ＰＲ５のいずれかを構成するタンパク質のＴＭ領域を構成するアミノ酸配列であって、抗腫瘍活性を有するアミノ酸配列のことをいう。
上記タンパク質の機能としては、例えば以下のものが知られている。
Ｓ１ＰＲ２は、典型的には３５３程度のアミノ酸残基からなる７回膜貫通型の膜タンパク質であり、Ｓ１Ｐと結合してがん細胞の運動性の制御に関与するタンパク質である（非特許文献１，２）。
Ｓ１ＰＲ４は、典型的には３８４程度のアミノ酸残基からなる７回膜貫通型の膜タンパク質であり、Ｓ１Ｐと結合して細胞の肝損傷時における幹細胞（卵形細胞）の増殖性の制御に関与するタンパク質である（非特許文献１，２）。
Ｓ１ＰＲ５は、典型的には３９８程度のアミノ酸残基からなる７回膜貫通型の膜タンパク質であり、Ｓ１Ｐと結合してがん細胞の増殖性の制御に関与するタンパク質である（非特許文献１，２）。
しかしながら、上述のＳ１ＰＲのＴＭ領域が、抗腫瘍活性を有することは見出されておらず、かかるペプチド領域のアミノ酸配列を合成し、該配列にＣＰＰを付加することにより、人為的に合成された抗腫瘍ペプチドが得られることは、本願出願当時、全く予想されていないことであった。
The artificially synthesized anti-tumor peptide disclosed herein is a short-chain peptide that does not exist in nature and has been found by the present inventors to suppress the proliferation of tumor cells (i.e., has anti-tumor activity). Yes, the two amino acid sequences mentioned above, namely:
(1) S1PR-TM related sequence, and
(2) CPP-related sequences,
It is a peptide characterized by having both of the following.
Here, the S1PR-TM-related sequence refers to an amino acid sequence that constitutes the TM region of a protein that constitutes any of S1PR2, S1PR4, or S1PR5 belonging to the S1PR family, and that has antitumor activity. say.
For example, the following functions are known as the functions of the above proteins.
S1PR2 is a seven-transmembrane membrane protein that typically consists of about 353 amino acid residues, and is a protein that binds to S1P and is involved in the control of cancer cell motility (Non-patent Document 1). ,2).
S1PR4 is a seven-transmembrane membrane protein that typically consists of about 384 amino acid residues, and binds to S1P and is involved in controlling the proliferation of stem cells (ovoid cells) during liver damage. (Non-patent Documents 1 and 2).
S1PR5 is a 7-transmembrane membrane protein that typically consists of about 398 amino acid residues, and is a protein that binds to S1P and is involved in controlling the proliferation of cancer cells (Non-patent Document 1). ,2).
However, the TM region of S1PR described above has not been found to have antitumor activity, and was artificially synthesized by synthesizing the amino acid sequence of such a peptide region and adding CPP to the sequence. The fact that an antitumor peptide could be obtained was completely unexpected at the time of filing of this application.
例えば、上述の非特許文献１，２にも記載されているように、Ｓ１ＰＲ２，４，５をコードする遺伝子（cDNAである場合を包含する。）は、ヒト、マウス、ラット、ブタ等の哺乳類で見つかっている。そして、Ｓ１ＰＲの遺伝子情報ならびにアミノ酸配列情報は、種々の公的な国際機関の知識ベース（データベース）にアクセスすることにより取得することができる。例えば、Universal Protein Resource (UniProt)において、種々の生物種由来のＳ１ＰＲの全アミノ酸配列情報ならびにＴＭ領域のアミノ酸配列情報を得ることができる。 For example, as described in the above-mentioned non-patent documents 1 and 2, the genes encoding S1PR2, 4, and 5 (including cases in which they are cDNA) can be found in mammals such as humans, mice, rats, and pigs. It has been found in The genetic information and amino acid sequence information of S1PR can be obtained by accessing the knowledge bases (databases) of various public international organizations. For example, information on the entire amino acid sequence of S1PR derived from various species as well as information on the amino acid sequence of the TM region can be obtained from Universal Protein Resource (UniProt).
本発明の実施に当たって好ましく使用される上記（１）に係るＳ１ＰＲ-ＴＭ関連配列は、配列番号１～６にそれぞれ示されている。
具体的には、配列番号１のアミノ酸配列は、ヒト由来のＳ１ＰＲ２のＮ末端から２番目のＴＭ領域を構成する合計２９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
また、配列番号２のアミノ酸配列は、ヒト由来のＳ１ＰＲ４のＮ末端から２番目のＴＭ領域を構成する合計２１アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
また、配列番号３のアミノ酸配列は、ヒト由来のＳ１ＰＲ４のＮ末端から３番目のＴＭ領域を構成する合計２１アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
また、配列番号４のアミノ酸配列は、ヒト由来のＳ１ＰＲ４のＮ末端から４番目のＴＭ領域を構成する合計２１アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
また、配列番号５のアミノ酸配列は、ヒト由来のＳ１ＰＲ５のＮ末端から３番目のＴＭ領域を構成する合計２１アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
また、配列番号６のアミノ酸配列は、ヒト由来のＳ１ＰＲ５のＮ末端から４番目のＴＭ領域を構成する合計２１アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
なお、上記配列番号１～６には、ヒト由来のＳ１ＰＲ２，４，５のＴＭ配列を示したが、当該配列はあくまでも例示であり、利用可能なアミノ酸配列はこれに限定されない。
S1PR-TM related sequences according to (1) above that are preferably used in carrying out the present invention are shown in SEQ ID NOS: 1 to 6, respectively.
Specifically, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence consisting of a total of 29 amino acid residues that constitutes the second TM region from the N-terminus of human-derived S1PR2.
Furthermore, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is an amino acid sequence consisting of a total of 21 amino acid residues constituting the second TM region from the N-terminus of human-derived S1PR4.
Moreover, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is an amino acid sequence consisting of a total of 21 amino acid residues constituting the third TM region from the N-terminus of human-derived S1PR4.
Furthermore, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is an amino acid sequence consisting of a total of 21 amino acid residues constituting the fourth TM region from the N-terminus of human-derived S1PR4.
Furthermore, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 is an amino acid sequence consisting of a total of 21 amino acid residues constituting the third TM region from the N-terminus of human-derived S1PR5.
Furthermore, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is an amino acid sequence consisting of a total of 21 amino acid residues constituting the fourth TM region from the N-terminus of human-derived S1PR5.
Note that although the TM sequences of human-derived S1PR2, 4, and 5 are shown in SEQ ID NOs: 1 to 6 above, the sequences are merely examples, and the usable amino acid sequences are not limited thereto.
例えば、配列番号７は、マウス由来のＳ１ＰＲ２のＮ末端から２番目のＴＭ領域を構成する合計２９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
また、配列番号８は、ラット由来のＳ１ＰＲ２のＮ末端から２番目のＴＭ領域を構成する合計２９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
また、配列番号９は、マウス及びラット由来のＳ１ＰＲ４のＮ末端から２番目のＴＭ領域を構成する合計２１アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
また、配列番号１０は、マウス、ラット及びブタ由来のＳ１ＰＲ４のＮ末端から３番目のＴＭ領域を構成する合計２１アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
また、配列番号１１は、マウス由来のＳ１ＰＲ４のＮ末端から４番目のＴＭ領域を構成する合計２１アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
また、配列番号１２は、ラット由来のＳ１ＰＲ４のＮ末端から４番目のＴＭ領域を構成する合計２３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
また、配列番号１３は、ブタ由来のＳ１ＰＲ４のＮ末端から４番目のＴＭ領域を構成する合計２３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
また、配列番号１４は、マウス、ラット及びブタ由来のＳ１ＰＲ５のＮ末端から３番目のＴＭ領域を構成する合計２１アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
また、配列番号１５は、マウス由来のＳ１ＰＲ５のＮ末端から４番目のＴＭ領域を構成する合計２１アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
また、配列番号１６は、ラット由来のＳ１ＰＲ５のＮ末端から４番目のＴＭ領域を構成する合計２１アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
また、配列番号１７は、ブタ由来のＳ１ＰＲ５のＮ末端から４番目のＴＭ領域を構成する合計２１アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
なお、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ブタ由来のＳ１ＰＲ４のＮ末端から２番目のＴＭ領域を構成するアミノ酸配列でもある。
For example, SEQ ID NO: 7 is an amino acid sequence consisting of a total of 29 amino acid residues that constitutes the second TM region from the N-terminus of mouse-derived S1PR2.
Furthermore, SEQ ID NO: 8 is an amino acid sequence consisting of a total of 29 amino acid residues constituting the second TM region from the N-terminus of rat-derived S1PR2.
Furthermore, SEQ ID NO: 9 is an amino acid sequence consisting of a total of 21 amino acid residues constituting the second TM region from the N-terminus of S1PR4 derived from mouse and rat.
Furthermore, SEQ ID NO: 10 is an amino acid sequence consisting of a total of 21 amino acid residues constituting the third TM region from the N-terminus of S1PR4 derived from mouse, rat, and pig.
Furthermore, SEQ ID NO: 11 is an amino acid sequence consisting of a total of 21 amino acid residues constituting the fourth TM region from the N-terminus of mouse-derived S1PR4.
Furthermore, SEQ ID NO: 12 is an amino acid sequence consisting of a total of 23 amino acid residues constituting the fourth TM region from the N-terminus of rat-derived S1PR4.
Furthermore, SEQ ID NO: 13 is an amino acid sequence consisting of a total of 23 amino acid residues constituting the fourth TM region from the N-terminus of pig-derived S1PR4.
Furthermore, SEQ ID NO: 14 is an amino acid sequence consisting of a total of 21 amino acid residues constituting the third TM region from the N-terminus of S1PR5 derived from mouse, rat, and pig.
Furthermore, SEQ ID NO: 15 is an amino acid sequence consisting of a total of 21 amino acid residues constituting the fourth TM region from the N-terminus of mouse-derived S1PR5.
Furthermore, SEQ ID NO: 16 is an amino acid sequence consisting of a total of 21 amino acid residues constituting the fourth TM region from the N-terminus of rat-derived S1PR5.
Furthermore, SEQ ID NO: 17 is an amino acid sequence consisting of a total of 21 amino acid residues constituting the fourth TM region from the N-terminus of pig-derived S1PR5.
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 above is also the amino acid sequence that constitutes the second TM region from the N-terminus of pig-derived S1PR4.
ここで開示される抗腫瘍ペプチドを構築するために使用されるＣＰＰ関連配列として、従来公知の種々のＣＰＰを採用することができる。例えば、３個以上、好ましくは５個以上であって１１個以下、好ましくは９個以下のアルギニン残基からなる、いわゆるポリアルギニン（Ｒｎ）は、ここで用いられるＣＰＰとして好適である。その他、公知である種々のＣＰＰを採用することができる。 Various conventionally known CPPs can be employed as CPP-related sequences used to construct the antitumor peptides disclosed herein. For example, so-called polyarginine (Rn) consisting of 3 or more, preferably 5 or more, but 11 or less, preferably 9 or less arginine residues is suitable as the CPP used here. In addition, various known CPPs can be employed.
特に限定するものではないが、配列番号１８～３５にＣＰＰの好適例を示す。具体的には、以下のとおりである。
配列番号１８のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２（塩基性線維芽細胞増殖因子）由来の合計１４アミノ酸残基から成るＮｏＬＳ（核小体局在シグナル：Nucleolar localization signal）に対応する。
配列番号１９のアミノ酸配列は、核小体タンパク質の１種（ＡｐＬＬＰ）由来の合計１９アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号２０のアミノ酸配列は、ＨＳＶ－１（単純ヘルペスウイルス タイプ１）のタンパク質（γ（１）３４．５）由来の合計１６アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号２１のアミノ酸配列は、ＨＩＣ（human I-mfa domain-containing protein）のｐ４０タンパク質由来の合計１９アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号２２のアミノ酸配列は、ＭＤＶ（Ｍａｒｅｋ病ウイルス）のＭＥＱタンパク質由来の合計１６アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号２３のアミノ酸配列は、アポトーシスを抑制するタンパク質であるSurvivin- deltaEx3由来の合計１７アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号２４のアミノ酸配列は、血管増殖因子であるAngiogenin由来の合計７アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号２５のアミノ酸配列は、核リンタンパク質であってｐ５３腫瘍抑制タンパク質と複合体を形成するＭＤＭ２由来の合計８アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号２６のアミノ酸配列は、ベータノダウイルスのタンパク質であるＧＧＮＮＶα由来の合計９アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号２７のアミノ酸配列は、ＮＦ－κＢ誘導性キナーゼ（ＮＩＫ）由来の合計７アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号２８のアミノ酸配列は、Nuclear VCP-like protein由来の合計１５アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号２９のアミノ酸配列は、核小体タンパク質であるｐ１２０由来の合計１８アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号３０のアミノ酸配列は、ＨＶＳ（ヘルペスウイルスsaimiri）のＯＲＦ５７タンパク質由来の合計１４アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号３１のアミノ酸配列は、細胞内情報伝達に関与するプロテインキナーゼの１種であるヒト内皮細胞に存在するＬＩＭキナーゼ２（LIM Kinase 2）の第４９１番目のアミノ酸残基から第５０３番目のアミノ酸残基までの合計１３アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号３２のアミノ酸配列は、ＩＢＶ（トリ伝染性気管支炎ウイルス：avian infectious bronchitis virus）のＮタンパク質（nucleocapsid protein）に含まれる合計８アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号３３のアミノ酸配列は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：Human Immunodeficiency Virus）のＴＡＴに含まれるタンパク質導入ドメイン由来の合計９アミノ酸配列から成る膜透過性モチーフに対応する。
配列番号３４のアミノ酸配列は、上記ＴＡＴを改変したタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ４）の合計１１アミノ酸配列から成る膜透過性モチーフに対応する。
配列番号３５のアミノ酸配列は、ショウジョウバエ（Drosophila）の変異体であるAntennapediaのＡＮＴ由来の合計１８アミノ酸配列から成る膜透過性モチーフに対応する。
これらのうち、特にＮｏＬＳやＴＡＴに関連するアミノ酸配列（又はその改変アミノ酸配列）が好ましい。例えば、配列番号３１や配列番号３２に示すようなＮｏＬＳ関連のＣＰＰ配列、或いは配列番号３３～３５のＴＡＴやＡＮＴ関連のＣＰＰ配列は、ここで開示される抗腫瘍ペプチドを構築するために好適に用いることができる。
Although not particularly limited, preferred examples of CPPs are shown in SEQ ID NOs: 18 to 35. Specifically, it is as follows.
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 corresponds to NoLS (nucleolar localization signal) consisting of a total of 14 amino acid residues derived from FGF2 (basic fibroblast growth factor).
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 corresponds to NoLS consisting of a total of 19 amino acid residues derived from one type of nucleolar protein (ApLLP).
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 corresponds to NoLS consisting of a total of 16 amino acid residues derived from the protein (γ(1) 34.5) of HSV-1 (herpes simplex virus type 1).
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 corresponds to NoLS consisting of a total of 19 amino acid residues derived from p40 protein of HIC (human I-mfa domain-containing protein).
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 corresponds to NoLS consisting of a total of 16 amino acid residues derived from the MEQ protein of MDV (Marek disease virus).
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 corresponds to NoLS consisting of a total of 17 amino acid residues derived from Survivin-deltaEx3, a protein that suppresses apoptosis.
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 corresponds to NoLS consisting of a total of 7 amino acid residues derived from Angiogenin, which is a vascular growth factor.
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 corresponds to NoLS consisting of a total of 8 amino acid residues derived from MDM2, which is a nuclear phosphoprotein and forms a complex with p53 tumor suppressor protein.
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 corresponds to NoLS consisting of a total of 9 amino acid residues derived from GGNNVα, a betanodavirus protein.
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 corresponds to NoLS consisting of a total of 7 amino acid residues derived from NF-κB-induced kinase (NIK).
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 corresponds to NoLS consisting of a total of 15 amino acid residues derived from Nuclear VCP-like protein.
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 corresponds to NoLS consisting of a total of 18 amino acid residues derived from p120, a nucleolar protein.
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 corresponds to NoLS consisting of a total of 14 amino acid residues derived from the ORF57 protein of HVS (herpesvirus saimiri).
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 is from the 491st amino acid residue to the 503rd amino acid residue of LIM Kinase 2, which is present in human endothelial cells and is a type of protein kinase involved in intracellular signal transduction. This corresponds to NoLS consisting of a total of 13 amino acid residues.
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 corresponds to NoLS consisting of a total of 8 amino acid residues contained in the N protein (nucleocapsid protein) of IBV (avian infectious bronchitis virus).
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 corresponds to a membrane-permeable motif consisting of a total of 9 amino acid sequences derived from the protein transduction domain contained in TAT of HIV (Human Immunodeficiency Virus).
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 corresponds to a membrane-permeable motif consisting of a total of 11 amino acid sequences of the protein transduction domain (PTD4) modified from the above TAT.
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 corresponds to a membrane-permeable motif consisting of a total of 18 amino acid sequences derived from ANT of Antennapedia, a mutant of Drosophila.
Among these, amino acid sequences related to NoLS and TAT (or modified amino acid sequences thereof) are particularly preferred. For example, NoLS-related CPP sequences as shown in SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32, or TAT- and ANT-related CPP sequences of SEQ ID NOs: 33 to 35 are suitable for constructing the antitumor peptide disclosed herein. Can be used.
ここで開示される抗腫瘍ペプチドのペプチド鎖（アミノ酸配列）は、上述したように、（１）Ｓ１ＰＲ－ＴＭ関連配列、及び、
（２）ＣＰＰ関連配列
を備えておればよく、Ｓ１ＰＲ－ＴＭ関連配列とＣＰＰ関連配列のいずれが相対的にＮ末端側（Ｃ末端側）に配置されていてもよい。
Ｓ１ＰＲ－ＴＭ関連配列とＣＰＰ関連配列とが隣接して配置されていることが好ましく、具体的には、Ｓ１ＰＲ－ＴＭ関連配列とＣＰＰ関連配列との間に、両配列部分に包含されないアミノ酸残基が存在しないことが好ましい。或いは、存在していても、前記２つの配列をつなぐリンカーとして機能するアミノ酸残基は、１０個以下（より好ましくは５個以下、例えば１個か２個のアミノ酸残基）が好ましい。
As mentioned above, the peptide chain (amino acid sequence) of the antitumor peptide disclosed herein includes (1) S1PR-TM related sequence;
(2) It is only necessary to have a CPP-related sequence, and either the S1PR-TM-related sequence or the CPP-related sequence may be located relatively to the N-terminal side (C-terminal side).
It is preferable that the S1PR-TM-related sequence and the CPP-related sequence are arranged adjacent to each other, and specifically, there may be an amino acid residue between the S1PR-TM-related sequence and the CPP-related sequence that is not included in both sequence parts. It is preferable that there is no. Alternatively, even if present, the number of amino acid residues that function as a linker connecting the two sequences is preferably 10 or less (more preferably 5 or less, for example, 1 or 2 amino acid residues).
少なくとも一種の腫瘍細胞の増殖を抑制し得る抗腫瘍活性を失わない限りにおいて、Ｓ１ＰＲ－ＴＭ関連配列とＣＰＰ関連配列を構成するアミノ酸配列以外の配列（アミノ酸残基）部分を含み得る。
ここで開示される抗腫瘍ペプチドは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１００以下が適当であり、８０以下が好ましく、７０以下（例えば３０から５０程度のペプチド鎖）が好ましい。このような鎖長の短いペプチドは、化学合成が容易であり、容易に抗腫瘍ペプチドを提供することができる。特に限定されるものではないが、免疫原（抗原）になり難いという観点から直鎖状又はヘリックス状のものが好ましい。このような形状のペプチドはエピトープを構成し難い。
It may contain sequence (amino acid residue) portions other than the amino acid sequences constituting the S1PR-TM-related sequence and the CPP-related sequence, as long as it does not lose anti-tumor activity capable of suppressing the proliferation of at least one type of tumor cell.
The antitumor peptide disclosed herein suitably has a total number of amino acid residues constituting the peptide chain of 100 or less, preferably 80 or less, and preferably 70 or less (for example, a peptide chain of about 30 to 50). Such short-chain peptides are easy to chemically synthesize and can easily provide antitumor peptides. Although not particularly limited, linear or helical forms are preferred from the viewpoint of being less likely to become immunogens (antigens). A peptide with such a shape is difficult to constitute an epitope.
合成したペプチド全体のアミノ酸配列に対するＳ１ＰＲ－ＴＭ関連配列及びＣＰＰ関連配列の占める割合は、抗腫瘍活性を失わない限り特に限定されないが、当該割合は概ね８０個数％以上が望ましく、９０個数％以上が好ましい。なお、全てのアミノ酸残基がＬ型アミノ酸であるものが好ましいが、抗腫瘍活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がＤ型アミノ酸に置換されているものであってもよい。 The proportion of S1PR-TM-related sequences and CPP-related sequences to the amino acid sequence of the entire synthesized peptide is not particularly limited as long as antitumor activity is not lost, but the proportion is preferably 80% or more by number, and 90% or more by number. preferable. Preferably, all amino acid residues are L-type amino acids, but some or all of the amino acid residues may be substituted with D-type amino acids as long as the antitumor activity is not lost. .
好ましくは、ここで開示される抗腫瘍ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されているものが好ましい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基のアミド化により、合成ペプチドの構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）を向上させることができる。例えば、抗腫瘍ペプチドのＣ末端をＣＰＰ関連配列部分が構成するとき、該配列部分のＣ末端アミノ酸残基をアミド化することが好ましい。一方、抗腫瘍ペプチドのＣ末端をＳ１ＰＲ－ＴＭ関連配列部分が構成するとき、該配列部分のＣ末端アミノ酸残基をアミド化することが好ましい。好ましい他の一態様では、配列番号３６～４１のアミノ酸配列を有する合成ペプチドのＣ末端アミノ酸残基をアミド化して、合成ペプチドの安定性を向上することができる。 Preferably, the antitumor peptide disclosed herein is one in which at least one amino acid residue is amidated. Amidation of the carboxyl group of an amino acid residue (typically the C-terminal amino acid residue of a peptide chain) can improve the structural stability (eg, protease resistance) of synthetic peptides. For example, when a CPP-related sequence portion constitutes the C-terminus of an anti-tumor peptide, it is preferable to amidate the C-terminal amino acid residue of the sequence portion. On the other hand, when the S1PR-TM related sequence portion constitutes the C-terminus of the anti-tumor peptide, it is preferable to amidate the C-terminal amino acid residue of the sequence portion. In another preferred embodiment, the stability of the synthetic peptide can be improved by amidating the C-terminal amino acid residue of the synthetic peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 36-41.
ここで開示される抗腫瘍ペプチドは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。
ここで開示される抗腫瘍ペプチドは、市販のペプチド合成機を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
The antitumor peptide disclosed herein can be easily produced according to general chemical synthesis methods. For example, any of the conventionally known solid phase synthesis method or liquid phase synthesis method may be employed. A solid phase synthesis method using Boc (t-butyloxycarbonyl) or Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) as a protecting group for an amino group is suitable.
The antitumor peptide disclosed herein can be synthesized into a peptide chain having a desired amino acid sequence and modification (such as C-terminal amidation) by solid-phase synthesis using a commercially available peptide synthesizer.
或いは、遺伝子工学的手法に基づいて抗腫瘍ペプチドを生合成してもよい。即ち、所望する抗腫瘍ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）を合成する。そして、合成したポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチドを単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的の抗腫瘍ペプチドを得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
Alternatively, antitumor peptides may be biosynthesized based on genetic engineering techniques. That is, a polynucleotide (typically DNA) having a nucleotide sequence (including the ATG start codon) encoding the amino acid sequence of the desired anti-tumor peptide is synthesized. Various regulatory elements (including a promoter, a ribosome binding site, a terminator, an enhancer, and various cis elements that control the expression level) are used to express the synthesized polynucleotide (DNA) and the amino acid sequence in host cells. ) A recombinant vector carrying an expression gene construct consisting of the following is constructed depending on the host cell.
This recombinant vector is introduced into a predetermined host cell (eg, yeast, insect cell, plant cell) by a common technique, and the host cell or a tissue or individual containing the cell is cultured under predetermined conditions. This allows the desired peptide to be expressed and produced within the cell. Then, the desired antitumor peptide can be obtained by isolating the peptide from the host cell (in the medium if secreted) and performing refolding, purification, etc. as necessary.
Note that the method for constructing a recombinant vector and the method for introducing the constructed recombinant vector into a host cell may be any method conventionally used in the field, and such methods themselves are particularly characteristic of the present invention. Since this is not a complete description, a detailed explanation will be omitted.
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ち抗腫瘍ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の（株）セルフリーサイエンスから入手可能）が市販されている。 Alternatively, a template DNA for a cell-free protein synthesis system (i.e., a synthetic gene fragment containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of an antitumor peptide) is constructed, and various compounds necessary for peptide synthesis (ATP, RNA polymerase, amino acids, etc.) are constructed. etc.), the desired polypeptide can be synthesized in vitro by employing a so-called cell-free protein synthesis system. Regarding cell-free protein synthesis systems, for example, Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755 (2001), Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000)) may be helpful. Based on the technology described in these papers, many companies are already engaged in contract production of polypeptides at the time of filing of this application, and cell-free protein synthesis kits (for example, cell-free protein synthesis kits (for example, Cell Free Science Co., Ltd. in Japan) are producing polypeptides on a contract basis. available) are commercially available.
ここで開示される抗腫瘍ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。即ち、設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、抗腫瘍ペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、抗腫瘍ペプチド生産のための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
A single-stranded or double-stranded polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the antitumor peptide disclosed herein and/or a nucleotide sequence complementary thereto can be easily produced (synthesized) by a conventionally known method. be able to. That is, by selecting codons corresponding to each amino acid residue constituting the designed amino acid sequence, the nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence of the antitumor peptide can be easily determined and provided. Once the nucleotide sequence is determined, a polynucleotide (single strand) corresponding to the desired nucleotide sequence can be easily obtained using a DNA synthesizer or the like. Furthermore, the desired double-stranded DNA can be obtained by using the obtained single-stranded DNA as a template and employing various enzymatic synthesis methods (typically PCR). Further, the polynucleotide may be in the form of DNA or RNA (such as mRNA). DNA can be provided in double-stranded or single-stranded form. When provided as a single strand, it may be a coding strand (sense strand) or a non-coding strand (antisense strand) having a complementary sequence thereto.
The polynucleotides thus obtained are used as materials for constructing recombinant genes (expression cassettes) for the production of antitumor peptides in various host cells or in cell-free protein synthesis systems, as described above. be able to.
ここで開示される抗腫瘍ペプチドは、腫瘍細胞の増殖を抑制（或いは阻害）する用途の組成物（即ち、抗腫瘍剤等の薬学的な抗腫瘍組成物）の有効成分として好適に使用し得る。なお、抗腫瘍ペプチドは、抗腫瘍活性を失わない限りにおいて塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る合成ペプチドの酸付加塩を使用することができる。従って、本明細書及び特許請求の範囲に記載の「ペプチド」は、かかる塩形態のものを包含する。 The antitumor peptide disclosed herein can be suitably used as an active ingredient of a composition for suppressing (or inhibiting) the proliferation of tumor cells (i.e., a pharmaceutical antitumor composition such as an antitumor agent). . Note that the antitumor peptide may be in the form of a salt as long as it does not lose its antitumor activity. For example, an acid addition salt of a synthetic peptide that can be obtained by addition reaction with a commonly used inorganic or organic acid according to a conventional method can be used. Therefore, the term "peptide" as used in the present specification and claims includes such salt forms.
ここで開示される抗腫瘍組成物は、有効成分である抗腫瘍ペプチドの抗腫瘍活性を失わない限りにおいて、使用形態に応じて薬学（医薬）上許容され得る種々の担体を含み得る。例えば、希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体を適用し得る。
ここで開示される抗腫瘍組成物の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。また、抗腫瘍組成物に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
抗腫瘍組成物（抗腫瘍剤）の典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、抗腫瘍ペプチド（主成分）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の組成物（薬剤）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
The antitumor composition disclosed herein may contain various pharmaceutically acceptable carriers depending on the form of use, as long as the antitumor activity of the antitumor peptide as an active ingredient is not lost. For example, carriers commonly used in peptide medicines can be used as diluents, excipients, and the like.
Typical examples include water, physiological buffers, and various organic solvents, although they may vary depending on the use and form of the antitumor composition disclosed herein. It may be an aqueous solution of alcohol (such as ethanol) at an appropriate concentration, glycerol, or a non-drying oil such as olive oil. Alternatively, it may be a liposome. Further, as subsidiary components that may be included in the antitumor composition, various fillers, extenders, binders, wetting agents, surfactants, pigments, fragrances, and the like can be mentioned.
Typical forms of antitumor compositions (antitumor agents) include solutions, suspensions, emulsions, aerosols, foams, granules, powders, tablets, capsules, ointments, aqueous gels, and the like. Furthermore, for use in injections, etc., it can be made into a lyophilized product or granulated product by dissolving it in physiological saline or an appropriate buffer solution (for example, PBS) to prepare a drug solution immediately before use.
The process itself for preparing compositions (drugs) in various forms using the antitumor peptide (main component) and various carriers (auxiliary components) may be carried out in accordance with conventionally known methods; Since this does not characterize the present invention, detailed explanation will be omitted. An example of a detailed information source regarding prescriptions is Comprehensive Medicinal Chemistry, supervised by Corwin Hansch, published by Pergamon Press (1990). The entire contents of this book are incorporated herein by reference.
ここで開示される抗腫瘍組成物（抗腫瘍ペプチド）の適用対象細胞は、腫瘍細胞（がん細胞）であれば特に制限されず、ヒト又はヒト以外の哺乳動物に発生する種々のタイプの腫瘍細胞に対して適用可能である。例えば、多くの種類の扁平上皮がんや腺がんが含まれる。例えば、メラノーマ、肺がん（非小細胞肺がん及び小細胞肺がん、肺胞基底上皮腺がん等）、腎臓がん等のがん細胞、或いはまた、乳がん、大腸がん、すい臓がん、基底細胞がん等の皮膚がん、神経芽細胞腫（神経芽腫）、網膜芽細胞腫、褐色細胞腫その他の細胞腫を構成する細胞が挙げられる。 The target cells to which the anti-tumor composition (anti-tumor peptide) disclosed herein can be applied are not particularly limited as long as they are tumor cells (cancer cells), and include various types of tumors that occur in humans or non-human mammals. Applicable to cells. Examples include many types of squamous cell carcinoma and adenocarcinoma. For example, cancer cells such as melanoma, lung cancer (non-small cell lung cancer and small cell lung cancer, alveolar basal epithelial adenocarcinoma, etc.), kidney cancer, or also breast cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, basal cell Examples include cells constituting skin cancers such as skin cancer, neuroblastoma (neuroblastoma), retinoblastoma, pheochromocytoma, and other cell tumors.
ここで開示される抗腫瘍組成物は、従来のペプチド製剤と同様、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。例えば、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射によって患者(即ち生体)の患部（典型的には悪性腫瘍組織）に所望する量だけ投与することができる。或いは、錠剤等の固体形態のものや軟膏等のゲル状若しくは水性ジェリー状のものを、直接所定の組織（即ち腫瘍細胞を含む組織や器官等の患部）に投与することができる。或いは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。経口投与の場合は、消化管内での消化酵素分解を抑止すべくカプセル化や保護（コーティング）材の適用が好ましい。
或いは、生体外（インビトロ）において培養している腫瘍細胞（培養細胞株、又は生体から摘出された細胞塊又は組織又は器官である場合を包含する。）に対し、ここで開示される抗腫瘍組成物の適当量（即ち抗腫瘍ペプチドの適当量）を、少なくとも１回、対象とする培養細胞（組織等）の培地に供給するとよい。１回当たりの供給量及び供給回数は、培養する腫瘍細胞の種類、細胞密度（培養開始時の細胞密度）、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されないが、培地中の抗腫瘍ペプチド濃度が概ね５μＭ以上１００μＭ以下の範囲内、好ましくは１０μＭ以上５０μＭ以下（例えば１２．５μＭ以上２５μＭ以下）の範囲内となるように、１回、２回又はそれ以上の複数回添加することが好ましい。
The antitumor composition disclosed herein, like conventional peptide preparations, can be used in a manner and at a dose depending on its form and purpose. For example, as a liquid, it can be administered in a desired amount to an affected area (typically a malignant tumor tissue) of a patient (ie, a living body) by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, or intraperitoneal injection. Alternatively, a solid form such as a tablet or a gel or aqueous jelly form such as an ointment can be administered directly to a predetermined tissue (ie, an affected area such as a tissue or organ containing tumor cells). Alternatively, solid forms such as tablets can be administered orally. In the case of oral administration, it is preferable to encapsulate or apply a protective (coating) material to prevent decomposition by digestive enzymes in the gastrointestinal tract.
Alternatively, the antitumor composition disclosed herein may be applied to tumor cells (including cultured cell lines, or cell masses, tissues, or organs excised from a living body) that are cultured outside the body (in vitro). It is preferable to supply an appropriate amount of the antitumor peptide (ie, an appropriate amount of the antitumor peptide) to the culture medium of the target cultured cells (tissues, etc.) at least once. The amount of supply per time and the number of times of supply are not particularly limited as they may vary depending on conditions such as the type of tumor cells to be cultured, cell density (cell density at the start of culture), passage number, culture conditions, type of medium, etc. , once, twice or more so that the concentration of the antitumor peptide in the medium is approximately within the range of 5 μM or more and 100 μM or less, preferably 10 μM or more and 50 μM or less (for example, 12.5 μM or more and 25 μM or less). Preferably, it is added multiple times.
ここで開示される抗腫瘍組成物の、インビトロにおける抗腫瘍活性の試験方法は、特に限定されないが、好ましくは、例えば、テトラゾリウム塩を用いた細胞増殖測定用試薬を用いた試験が挙げられる。好ましい一態様では、ここで開示される抗腫瘍組成物の添加ありの実施例により、添加なしの比較例に対して、該試験において算出される細胞増殖率（或いは細胞生存率）が３０％（好ましくは２０％、さらに好ましくは１０％）より低くなる。
また別の一態様では、後述する比細胞生存率（即ち、腫瘍細胞選択的な抗腫瘍活性の指標）が５０％（好ましくは４０％又は３０％、より好ましくは２０％、さらに好ましくは１０％）より低くなる。
A method for testing the in vitro antitumor activity of the antitumor composition disclosed herein is not particularly limited, but preferably includes, for example, a test using a reagent for measuring cell proliferation using a tetrazolium salt. In a preferred embodiment, the Example with the addition of the antitumor composition disclosed herein increases the cell proliferation rate (or cell survival rate) calculated in the test by 30% ( (preferably 20%, more preferably 10%).
In another aspect, the specific cell survival rate (i.e., an index of tumor cell-selective antitumor activity) described below is 50% (preferably 40% or 30%, more preferably 20%, still more preferably 10%). ) will be lower.
以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。 Hereinafter, some examples relating to the present invention will be described, but the present invention is not intended to be limited to what is shown in these examples.
＜試験例１：ペプチド合成＞
表１に示す計６種のペプチドを市販のペプチド合成機を用いて製造した。具体的には次のとおりである。
サンプル１は、一実施例として設計されたものであり、ヒトＳ１ＰＲ２のＮ末端から２番目のＴＭ領域のアミノ酸配列（配列番号１）のＣ末端側に、ＣＰＰ関連配列として配列番号３３のアミノ酸配列（ＨＩＶのＴＡＴ）を含む合成ペプチドである（配列番号３６）。
サンプル２は、一実施例として設計されたものであり、ヒトＳ１ＰＲ４のＮ末端から２番目のＴＭ領域のアミノ酸配列（配列番号２）のＣ末端側に、ＣＰＰ関連配列として配列番号３３のアミノ酸配列（ＨＩＶのＴＡＴ）を含む合成ペプチドである（配列番号３７）。
サンプル３は、一実施例として設計されたものであり、ヒトＳ１ＰＲ４のＮ末端から３番目のＴＭ領域のアミノ酸配列（配列番号３）のＣ末端側に、ＣＰＰ関連配列として配列番号３３のアミノ酸配列（ＨＩＶのＴＡＴ）を含む合成ペプチドである（配列番号３８）。
サンプル４は、一実施例として設計されたものであり、ヒトＳ１ＰＲ４のＮ末端から４番目のＴＭ領域のアミノ酸配列（配列番号４）のＣ末端側に、ＣＰＰ関連配列として配列番号３３のアミノ酸配列（ＨＩＶのＴＡＴ）を含む合成ペプチドである（配列番号３９）。
サンプル５は、一実施例として設計されたものであり、ヒトＳ１ＰＲ５のＮ末端から３番目のＴＭ領域のアミノ酸配列（配列番号５）のＣ末端側に、ＣＰＰ関連配列として配列番号３３のアミノ酸配列（ＨＩＶのＴＡＴ）を含む合成ペプチドである（配列番号４０）。
サンプル６は、一実施例として設計されたものであり、ヒトＳ１ＰＲ５のＮ末端から４番目のＴＭ領域のアミノ酸配列（配列番号６）のＣ末端側に、ＣＰＰ関連配列として配列番号３３のアミノ酸配列（ＨＩＶのＴＡＴ）を含む合成ペプチドである（配列番号４１）。
<Test Example 1: Peptide synthesis>
A total of six types of peptides shown in Table 1 were produced using a commercially available peptide synthesizer. Specifically, it is as follows.
Sample 1 was designed as an example, and contained the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 as a CPP-related sequence on the C-terminal side of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the second TM region from the N-terminus of human S1PR2. (TAT of HIV) (SEQ ID NO: 36).
Sample 2 was designed as an example, and contained the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 as a CPP-related sequence on the C-terminal side of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the second TM region from the N-terminus of human S1PR4. (TAT of HIV) (SEQ ID NO: 37).
Sample 3 was designed as an example, and contained the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 as a CPP-related sequence on the C-terminal side of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) of the third TM region from the N-terminus of human S1PR4. (TAT of HIV) (SEQ ID NO: 38).
Sample 4 was designed as an example, and contained the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 as a CPP-related sequence on the C-terminal side of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of the fourth TM region from the N-terminus of human S1PR4. (TAT of HIV) (SEQ ID NO: 39).
Sample 5 was designed as an example, and contained the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 as a CPP-related sequence on the C-terminal side of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of the third TM region from the N-terminus of human S1PR5. (TAT of HIV) (SEQ ID NO: 40).
Sample 6 was designed as an example, and had the amino acid sequence SEQ ID NO: 33 as a CPP-related sequence on the C-terminal side of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of the fourth TM region from the N-terminus of human S1PR5. (TAT of HIV) (SEQ ID NO: 41).
表１：試験した合成ペプチドのアミノ酸配列
上記サンプル１～６のペプチドはいずれも市販のペプチド合成機を用いてマニュアルどおりに固相合成法（Ｆｍｏｃ法）を実施して合成した。なお、ペプチド合成機の使用態様自体は本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。なお、表１に記載した全ての合成ペプチドは、該当する配列番号のアミノ酸配列を有するペプチドにおいて、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）はアミド化（－ＣＯＮＨ２）されている。
合成した各サンプルのペプチドは、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶かし、各サンプルペプチドのストック液（濃度２．５ｍＭ）を調製した。
The peptides of Samples 1 to 6 above were all synthesized by solid phase synthesis (Fmoc method) using a commercially available peptide synthesizer according to the manual. Note that the manner in which the peptide synthesizer is used itself does not characterize the present invention, and therefore a detailed explanation will be omitted. In all of the synthetic peptides listed in Table 1, the carboxyl group (-COOH) of the C-terminal amino acid is amidated (-CONH 2 ) in the peptides having the amino acid sequence of the corresponding SEQ ID NO.
The synthesized peptides of each sample were dissolved in DMSO (dimethyl sulfoxide) to prepare a stock solution (concentration: 2.5 mM) of each sample peptide.
＜試験例２：各合成ペプチドの抗腫瘍活性の評価試験(1)＞
上記試験例１で合成した各サンプルペプチドについて、ヒト由来培養腫瘍細胞を対象として抗腫瘍活性を評価した。
具体的には、供試腫瘍細胞として現在市場において入手可能な、ヒトメラノーマ（Ａ２０５８）細胞株を使用した。また、比較対象としては、正常ヒト乳腺上皮細胞の培養株（ＭＣＦ－１２Ｆ）を使用した。なお、各細胞の培養液を以下に示す。
（１）Ａ２０５８細胞：
２ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（non-essential amino acids）、５０ユニット／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ；fetal bovine serum）を含むＤＭＥＭ培地（和光純薬（株）製品）
（２）ＭＣＦ－１２Ｆ細胞：
２０ｎｇ／ｍＬのリコンビナントＥＧＦ、１０μｇ／ｍＬのインスリン、０．５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、及び１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（和光純薬（株）製品）。
試験の詳細は以下のとおりである。
<Test Example 2: Evaluation test of antitumor activity of each synthetic peptide (1)>
The antitumor activity of each sample peptide synthesized in Test Example 1 above was evaluated using human-derived cultured tumor cells.
Specifically, a human melanoma (A2058) cell line, which is currently available on the market, was used as the test tumor cell. In addition, a cultured line of normal human mammary epithelial cells (MCF-12F) was used for comparison. The culture solution for each cell is shown below.
(1) A2058 cells:
Contains 2mM L-glutamine, 0.1mM non-essential amino acids, 50 units/mL penicillin, 50 μg/mL streptomycin, and 10% fetal bovine serum (FBS). DMEM medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. product)
(2) MCF-12F cells:
DMEM/F12 medium (product of Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 20 ng/mL recombinant EGF, 10 μg/mL insulin, 0.5 μg/mL hydrocortisone, and 10% FBS.
Details of the test are as follows.
Ａ２０５８細胞とＭＣＦ－１２Ｆ細胞をそれぞれ培養し、９６穴（ウェル）プレートの１ウェルあたりの細胞数が約５×１０３個となるように調製した。このときの培地量はウェルあたり１００μＬとした。
次いで、当該９６穴（ウェル）プレートを、ＣＯ２インキュベータ内に配置し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で約１日間（２１時間～２４時間）のプレインキュベーションを実施した。
その後、評価対象とするいずれかのサンプルペプチドの濃度が１２．５μＭ及び２５μＭのいずれかとなるように、濃度別にペプチド含有試験培地をそれぞれ調製し、１ウェルあたり９０μＬとなるように評価対象とする細胞が培養されているウェル（即ち、上記プレインキュベーション後のウェル）に供給した。そして、当該９６穴（ウェル）プレートを、ＣＯ２インキュベータ内に戻し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４８時間のインキュベーションを実施した。
なお、各ペプチド添加試験区の各ペプチド濃度における試験ウェル数（ｎ）は、いずれも３に設定した。従って、以下の表に示す結果の値は、試験ウェル数３のそれぞれで得た結果の平均値である。先ず、細胞生存率（％）を以下のように決定した。
A2058 cells and MCF-12F cells were respectively cultured and prepared so that the number of cells per well of a 96-well plate was approximately 5×10 3 . The amount of medium at this time was 100 μL per well.
Next, the 96-well plate was placed in a CO 2 incubator, and preincubation was performed for about 1 day (21 to 24 hours) at 37° C. and 5% CO 2 conditions.
Thereafter, prepare peptide-containing test media for each concentration so that the concentration of either sample peptide to be evaluated is either 12.5 μM or 25 μM, and add 90 μL per well to the cells to be evaluated. was supplied to the wells in which the cells were cultured (ie, the wells after the above-mentioned pre-incubation). The 96-well plate was then returned to the CO 2 incubator and incubated at 37° C. and 5% CO 2 for 48 hours.
The number of test wells (n) at each peptide concentration in each peptide addition test group was set to 3. Therefore, the result values shown in the table below are the average values of the results obtained in each of the three test wells. First, cell viability (%) was determined as follows.
上記４８時間のインキュベーション終了後、各ウェルの培地を、ペプチドを含まないフレッシュな培地１００μＬと交換し、さらに、発色試薬として「水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ－８）」を含有する細胞増殖測定用試薬「Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８」（（株）同仁化学研究所製品）を各ウェルに１０μＬずつ添加した。その後、当該９６穴（ウェル）プレートを、ＣＯ２インキュベータ内に再び戻し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１．５時間～２時間のインキュベーションを実施した。
インキュベーション終了後、上記試薬を添加した細胞培養液を回収するとともにテトラゾリウム塩の還元に基づく波長４５０ｎｍの吸光度（波長６５０ｎｍの吸光度で補正した値：Ａ４５０－Ａ６５０）を測定する比色法により、細胞生存率（％）を評価した。具体
的には、ペプチドを含有しない培地のみで上記４８時間のインキュベーションを行った比
較試験区の測定値（測定吸光度）を細胞生存率１００％とした相対値で、各試験細胞株の
細胞生存率（％）を測定吸光度から算出した。
その結果、ここで使用されたサンプルペプチドのいずれか（サンプル１～６）を２５μＭの濃度となるように培地に含ませた各試験区のＡ２０５８細胞生存率は、いずれも１０％未満であった。具体的には、サンプル１試験区で０．７％、サンプル２試験区で０．１％、サンプル３試験区で４．６％、サンプル４試験区で５．３％、サンプル５試験区で５．５％、サンプル６試験区で０．５％の生存率であった。かかる結果は、各サンプルペプチドの高い抗腫瘍活性を示している。
After the above 48-hour incubation, the medium in each well was replaced with 100 μL of fresh medium containing no peptide, and a reagent for measuring cell proliferation containing "water-soluble tetrazolium salt (WST-8)" as a coloring reagent was added. 10 μL of “Cell Counting Kit-8” (manufactured by Dojindo Laboratories, Inc.) was added to each well. Thereafter, the 96-well plate was returned to the CO 2 incubator and incubated at 37° C. and 5% CO 2 for 1.5 to 2 hours.
After the incubation, the cell culture medium to which the above reagents have been added is collected, and cell survival is determined by a colorimetric method that measures the absorbance at a wavelength of 450 nm (value corrected by absorbance at a wavelength of 650 nm: A450-A650) based on the reduction of the tetrazolium salt. The rate (%) was evaluated. Specifically, the cell viability of each test cell line is a relative value with the cell viability as 100%, which is the measured value (measured absorbance) of the comparative test group in which the above 48-hour incubation was performed with only a medium containing no peptide. (%) was calculated from the measured absorbance.
As a result, the survival rate of A2058 cells in each test group containing any of the sample peptides used here (samples 1 to 6) at a concentration of 25 μM was less than 10%. . Specifically, 0.7% in Sample 1 test area, 0.1% in Sample 2 test area, 4.6% in Sample 3 test area, 5.3% in Sample 4 test area, and 5.3% in Sample 5 test area. The survival rate was 5.5%, and the survival rate was 0.5% in the sample 6 test area. These results indicate high antitumor activity of each sample peptide.
次に、各サンプルペプチドを培地に添加したときの、正常細胞の生存率と供試腫瘍細胞の生存率を比較して、腫瘍細胞選択的な抗腫瘍活性を評価した。
具体的には、上記のようにして測定した濃度１２．５μＭまたは２５μＭで各サンプルペプチドを添加したときの対象腫瘍細胞（ここではＡ２０５８細胞）の細胞生存率を、同条件において測定した比較正常細胞（ここではＭＣＦ－１２Ｆ細胞）の細胞生存率で除した値（便宜上１００倍した値）、即ち、
｛（Ａ２０５８細胞生存率）／（ＭＣＦ－１２Ｆ細胞生存率）｝×１００
を、当該腫瘍細胞の比細胞生存率として算出し、かかる比細胞生存率を指標として、正常細胞に対する供試腫瘍細胞選択的な抗腫瘍活性を評価した。結果を表２に示す。
表２に示す結果から明らかなように、サンプル１～６の合成ペプチドは、サンプル１の１２．５μＭ濃度条件試験区を除いてＡ２０５８細胞に対して選択的な抗腫瘍活性を示した。Ａ２０５８細胞はヒトメラノーマ細胞株の中でも悪性度が強く、多くの抗腫瘍組成物に対して耐性を示すことが知られている。上述した試験結果は、そのようなＡ２０５８細胞に対して、各サンプルペプチドが高い抗腫瘍活性および選択的抗腫瘍活性を有することを示すものである。
Next, when each sample peptide was added to the medium, the survival rate of normal cells and the survival rate of test tumor cells were compared to evaluate tumor cell-selective antitumor activity.
Specifically, the cell viability of target tumor cells (A2058 cells here) when each sample peptide was added at a concentration of 12.5 μM or 25 μM measured as described above was compared with that of comparative normal cells measured under the same conditions. (MCF-12F cells here) divided by the cell viability (value multiplied by 100 for convenience), that is,
{(A2058 cell viability)/(MCF-12F cell viability)}×100
was calculated as the specific cell survival rate of the tumor cells, and using this specific cell survival rate as an index, the antitumor activity selective for the test tumor cells relative to normal cells was evaluated. The results are shown in Table 2.
As is clear from the results shown in Table 2, the synthetic peptides of Samples 1 to 6 exhibited selective antitumor activity against A2058 cells, except for Sample 1, which was tested at a concentration of 12.5 μM. A2058 cells are highly malignant among human melanoma cell lines, and are known to exhibit resistance to many antitumor compositions. The test results described above demonstrate that each sample peptide has high antitumor activity and selective antitumor activity against such A2058 cells.
＜試験例３：各合成ペプチドの抗腫瘍活性の評価試験(２)＞
上記試験例１のサンプル２，６について、複数種類のヒト由来培養腫瘍細胞を対象として抗腫瘍活性ならびに抗腫瘍細胞選択的な抗腫瘍活性を評価した。
具体的には、供試腫瘍細胞として現在市場において入手可能な、ヒトメラノーマ細胞株（ＳＫ－ＭＥＬ５）、ヒト非小細胞肺がん細胞株（Ｈ２４４４）、ヒト大腸がん細胞株（ＳＷ４８０）を使用した。また、比較対象の正常細胞として、上記ＭＣＦ－１２Ｆ細胞を使用した。
各細胞株の培養には、以下の培地を使用した。
即ち、
（１）ヒトメラノーマ細胞株（ＳＫ－ＭＥＬ５）：
１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び１０％のＦＢＳを含むＥ－ＭＥＭ培地（和光純薬（株）製品）。
（２）ヒト肺がん細胞株（Ｈ２４４４）：
２ｍＭのＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、４５００ｍｇ／ｍＬのグルコース、５０ユニット／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地（和光純薬（株）製品）。
（３）ヒト大腸がん細胞株（ＳＷ４８０）：
１００ユニット／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び１０％のＦＢＳを含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ－１５培地（Ｇｉｂｃｏ社製品）。
なお、ＳＷ４８０細胞株を用いた評価試験では、当該細胞株の培養を３７℃、ＣＯ２なしの条件下で行った。
そして、試験例２と同様のプロセスによって、細胞生存率を算出した。なお、本試験例では、ＳＫ－ＭＥＬ５細胞に対するサンプル６の抗腫瘍活性、Ｈ２４４４細胞に対するサンプル２の抗腫瘍活性、ならびに、ＳＷ４８０細胞に対するサンプル２およびサンプル６の抗腫瘍活性を評価した。
その結果、サンプル２またはサンプル６を２５μＭの濃度となるように培地に含ませた各試験区の腫瘍細胞の細胞生存率は、約２０％以下またはそれ以下（１０％未満）であった。具体的には、サンプル６を供試したＳＫ－ＭＥＬ５細胞の細胞生存率は１．９％であり、サンプル２を供試したＨ２４４４細胞の細胞生存率は２．１％であり、サンプル２を供試したＳＷ４８０細胞の細胞生存率は２．３％であり、サンプル６を供試したＳＷ４８０細胞の細胞生存率は２０．２％であった。
次に、試験例２と同様のプロセスによって、比細胞生存率を算出した。即ち、
｛（供試腫瘍細胞生存率）／（ＭＣＦ－１２Ｆ細胞生存率）｝×１００
を、当該腫瘍細胞の比細胞生存率として算出し、かかる比細胞生存率を指標として、正常細胞に対する供試腫瘍細胞選択的な抗腫瘍活性を評価した。結果を表３および表４に示す。これらの結果から明らかなように、上記サンプル２およびサンプル６の合成ペプチドは、いずれも本試験例で供試した各腫瘍細胞に対して強い抗腫瘍活性および選択的抗腫瘍活性を有することが認められた。このことは、一種類の腫瘍細胞のみならず、異なる種類の腫瘍細胞が、ここで開示される抗腫瘍ペプチドの適用対象になり得ることを示している。
<Test Example 3: Evaluation test of antitumor activity of each synthetic peptide (2)>
Samples 2 and 6 of Test Example 1 above were evaluated for antitumor activity and antitumor cell-selective antitumor activity using a plurality of types of human-derived cultured tumor cells.
Specifically, human melanoma cell line (SK-MEL5), human non-small cell lung cancer cell line (H2444), and human colon cancer cell line (SW480), which are currently available on the market, were used as test tumor cells. . Furthermore, the above MCF-12F cells were used as normal cells for comparison.
The following medium was used for culturing each cell line.
That is,
(1) Human melanoma cell line (SK-MEL5):
E-MEM medium (product of Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 1 mM sodium pyruvate, 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, and 10% FBS.
(2) Human lung cancer cell line (H2444):
RPMI-1640 medium containing 2mM L-glutamine, 1mM sodium pyruvate, 10mM HEPES, 4500mg/mL glucose, 50 units/mL penicillin, 50μg/mL streptomycin, and 10% FBS (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Products Co., Ltd.).
(3) Human colon cancer cell line (SW480):
Leibovitz's L-15 medium (Gibco) containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, and 10% FBS.
In the evaluation test using the SW480 cell line, the cell line was cultured at 37° C. without CO 2 .
Then, the cell survival rate was calculated by the same process as in Test Example 2. In this test example, the antitumor activity of sample 6 against SK-MEL5 cells, the antitumor activity of sample 2 against H2444 cells, and the antitumor activity of samples 2 and 6 against SW480 cells were evaluated.
As a result, the cell survival rate of tumor cells in each test group containing Sample 2 or Sample 6 at a concentration of 25 μM was approximately 20% or less (less than 10%). Specifically, the cell viability of SK-MEL5 cells tested with Sample 6 was 1.9%, the cell viability of H2444 cells tested with Sample 2 was 2.1%, and The cell survival rate of the SW480 cells tested was 2.3%, and the cell survival rate of the SW480 cells tested with Sample 6 was 20.2%.
Next, the specific cell survival rate was calculated by the same process as Test Example 2. That is,
{(Test tumor cell viability)/(MCF-12F cell viability)}×100
was calculated as the specific cell survival rate of the tumor cells, and using this specific cell survival rate as an index, the antitumor activity selective to the test tumor cells relative to normal cells was evaluated. The results are shown in Tables 3 and 4. As is clear from these results, both the synthetic peptides of Sample 2 and Sample 6 were found to have strong antitumor activity and selective antitumor activity against each tumor cell tested in this test example. It was done. This indicates that not only one type of tumor cell, but also different types of tumor cells can be targeted by the anti-tumor peptides disclosed herein.
上述したように、ここで開示される抗腫瘍ペプチドによると、腫瘍細胞の増殖を抑制する（又は阻害する）ことができる。このため、本発明によって提供される抗腫瘍ペプチドを使用することによって、少なくとも一種の腫瘍細胞の増殖を抑制する抗腫瘍組成物（抗腫瘍剤）を提供することができる。 As mentioned above, the antitumor peptide disclosed herein can suppress (or inhibit) the proliferation of tumor cells. Therefore, by using the antitumor peptide provided by the present invention, it is possible to provide an antitumor composition (antitumor agent) that suppresses the proliferation of at least one type of tumor cell.
配列番号１～４１ 合成ペプチド SEQ ID NO: 1-41 Synthetic peptide
Claims (4)
以下の（１）および（２）に示すアミノ酸配列：
（１）配列番号１～６のいずれかに示すアミノ酸配列；及び、
（２）配列番号１８～３５のいずれかに示すアミノ酸配列；
からなり、
前記（２）に示すアミノ酸配列が、前記（１）に示すアミノ酸配列のＣ末端側に、隣接して配置されている、合成ペプチド。 A synthetic peptide that suppresses the proliferation of at least one type of tumor cell,
Amino acid sequences shown in (1) and (2) below:
(1) Amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 6 ; and
(2) Amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 18 to 35 ;
Consisting of
A synthetic peptide, wherein the amino acid sequence shown in (2) above is arranged adjacent to the C-terminal side of the amino acid sequence shown in (1) above.
請求項１または２に記載の合成ペプチドと、
薬学上許容され得る少なくとも一種の担体と、
を備える、抗腫瘍組成物。 An anti-tumor composition that inhibits the proliferation of at least one tumor cell, the composition comprising:
The synthetic peptide according to claim 1 or 2 ,
at least one pharmaceutically acceptable carrier;
An anti-tumor composition comprising:
インビトロにおいて対象とする腫瘍細胞に対して請求項１または２に記載の合成ペプチドを少なくとも１回供給することを包含する、腫瘍細胞の増殖抑制方法。 A method of inhibiting the proliferation of at least one type of tumor cell, the method comprising:
A method for inhibiting tumor cell growth, which comprises supplying the synthetic peptide according to claim 1 or 2 at least once to target tumor cells in vitro.
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