JP7350289B2 - トリクロロエチレン及び１，１，２－トリクロロエタンをエチレンに分解するデハロコッコイデス属細菌、浄化剤、及び浄化方法 - Google Patents
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Description
特許法第３０条第２項適用 平成３０年１０月３０日発行 一般社団法人土壌環境センター「第２４回地下水・土壌汚染とその防止対策に関する研究集会」講演集（第５８８～５８９頁）にて公開
特許法第３０条第２項適用 平成３０年１０月３１日とうほう・みんなの分化センター 大ホールで開催された 一般社団法人土壌環境センター「第２４回地下水・土壌汚染とその防止対策に関する研究集会」（講演番号Ｓ６－０１）で発表
特許法第３０条第２項適用 平成３１年３月１日発行 公益社団法人日本水環境学会「第５３回日本水環境学会年会」講演集（第２０１頁）にて公開
特許法第３０条第２項適用 平成３１年３月８日山梨大学甲府キャンパスで開催された 公益社団法人日本水環境学会「第５３回日本水環境学会年会」（講演番号２－Ｊ－０９－３）で発表
本発明は、トリクロロエチレン及び１，１，２－トリクロロエタンをエチレンに分解するデハロコッコイデス属細菌、浄化剤、及び浄化方法に関する。
トリクロロエチレンやトリクロロエタンなどの塩素化脂肪族化合物は、安価で油に対する親和性の高い溶剤として、幅広い分野で使用されている。その一方で、これらの塩素化脂肪族化合物による土壌汚染や地下水汚染について多くの報告があり、社会問題となっている。
土壌汚染や地下水汚染を浄化する方法の一つとして、微生物により浄化する技術（バイオレメディエーション）が、環境負荷及び浄化コストが小さい方法として着目されている（例えば、特許文献１）。
特許文献１には、デハロコッコイデス属細菌が含まれる微生物群を用いて、クロロエテン類の脱塩素化を行う技術が開示されている。特許文献２には、デハロコッコイデス属細菌によりクロロエチレン及びクロロエタンの脱塩素化を行う技術が開示されている。また、非特許文献１には、デハロコッコイデス属細菌によりトリクロロエチレンの脱塩素化を行う技術が開示されている。
Siyan Zhao, Jianzhong He, "Reductive dechlorination of high concentrations of chloroethenes by a Dehalococcoides mccartyi strain 11G", FEMS Microbiology Ecology, Volume 95, Issue 1, January 2019
しかし、特許文献１に記載の技術では、脱塩素化能を得るために複数の微生物から形成される微生物群を用いており、微生物群の構成比率を管理する必要があるため管理が煩雑であるという課題があった。また、特許文献２に記載の細菌は、微生物群を形成しないと安定性が低いという課題があり、微生物群にすると管理が煩雑であるという課題があった。
また、非特許文献１に記載の細菌では、トリクロロエタンの脱塩素化ができないという課題があり、トリクロロエチレンについても３．５ｍｍｏｌ／Ｌまでしか脱塩素化できないという課題があった。
このため、微生物単体でも十分な脱塩素化能が発揮でき、かつ、トリクロロエタンの脱塩素化についても可能な微生物が望まれており、このような微生物を用いた浄化方法についても望まれていた。
本発明は、上述の課題を解決するためになされたものであり、以下の形態として実現することが可能である。
（１）本発明の一形態によれば、デハロコッコイデス属細菌が提供される。このデハロコッコイデス属細菌は、以下の特徴を備える。
（ｉ）４ｍｍоｌ／Ｌのトリクロロエチレンをエチレンに分解する；
（ｉｉ）１，１，２－トリクロロエタンをエチレンに分解する；
（ｉ）４ｍｍоｌ／Ｌのトリクロロエチレンをエチレンに分解する；
（ｉｉ）１，１，２－トリクロロエタンをエチレンに分解する；
（２）上述のデハロコッコイデス属細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列が、配列番号１に示す配列であってもよい。
（３）上述のデハロコッコイデス属細菌は、受託番号がＮＩＴＥ Ｐ－０２８９３であってもよい。
（４）本発明の他の形態によれば、浄化剤が提供される。この浄化剤は、上述のデハロコッコイデス属細菌を含有する。
（５）本発明の他の形態によれば、浄化する方法が提供される。この浄化する方法は、上述のデハロコッコイデス属細菌を用いて、塩素化エチレン類と塩素化エタン類との少なくとも一方を含む汚染物を浄化する。
（６）本発明の他の形態によれば、浄化する方法が提供される。この浄化する方法は、上述のデハロコッコイデス属細菌を用いて、塩素化ビフェニルと、塩素化ベンゼンと、塩素化フェノールと、塩素化ジベンゾ－ｐ－ジオキシンと、塩素化ジベンゾフランと、塩素化ナフタレンと、塩素化アニリンと、の少なくとも一つを含む汚染物を浄化する。
本発明の一実施形態であるデハロコッコイデス（Dehalococcoides）属細菌は、以下の特徴（１）及び（２）によって特徴づけられる。
（１）４ｍｍоｌ／Ｌのトリクロロエチレンをエチレンに分解する。
（２）１，１，２－トリクロロエタンをエチレンに分解する。
（１）４ｍｍоｌ／Ｌのトリクロロエチレンをエチレンに分解する。
（２）１，１，２－トリクロロエタンをエチレンに分解する。
特徴（１）及び（２）は、本実施形態の最大の特徴である。これらの特徴を備えることから、本細菌は、トリクロロエチレン及び１，１，２－トリクロロエタンの無毒化に極めて有用である。本細菌によれば、菌単独でトリクロロエチレン及び１，１，２－トリクロロエタンの分解することができるため、微生物群を維持管理する必要がない。本明細書において、「トリクロロエチレン又はトリクロロエタンをエチレンに分解すること」を、「トリクロロエチレン又はトリクロロエタンの無毒化」とも表現する。
さらに、本細菌は、有機ハロゲン存在下でのみ限定的に増殖可能である。このため、土壌汚染や地下水汚染を浄化した後、速やかに菌数が減少することが予測される。このような性質により、浄化後の本細菌による土壌や地下水への影響を軽減できる。
本発明者は、後述の実施例に示す通り、特性（１）及び（２）を示すデハロコッコイデス属細菌を分離・同定することに成功し、当該細菌をDehalococcoides mccartyi NIT01株と命名した。この株を、以下、「ＮＩＴ０１株」とも呼ぶ。ＮＩＴ０１株は、以下のとおり、所定の寄託機関に寄託されており、容易に入手可能である。
寄託機関：独立行政法人三条技術総合研究所 特許生物寄託センター
寄託日（受領日）：２０１９年２月２５日
受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２８９３
寄託機関：独立行政法人三条技術総合研究所 特許生物寄託センター
寄託日（受領日）：２０１９年２月２５日
受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２８９３
後述の実施例に示す通り、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に基づく構造解析の結果、ＮＩＴ０１株はDehalococcoide mccartyi CBDB1等に最類縁であることが判明した。
本発明のデハロコッコイデス属細菌は、後述の実施例に示す集積方法及び単離方法に従って、あるいは諸条件（出発材料、生育状態など）に応じてこれらの方法に必要な修正を加えた方法に従って、単離した状態に調製することができる。
本発明のデハロコッコイデス属細菌には、ＮＩＴ０１株のほか、４ｍｍоｌ／Ｌのトリクロロエチレンをエチレンに分解する分解能及び１，１，２－トリクロロエタンをエチレンに分解する分解能を有するＮＩＴ０１株の近縁の菌株も含まれる。後述する配列番号１に記載の塩基配列と９８％以上の相同性、好ましくは９９％以上の相同性、さらに好ましくは１００％の相同性を有する塩基配列からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する微生物は、ＮＩＴ０１株の近縁の菌株に含まれる。
また、本発明のデハロコッコイデス属細菌は、ＮＩＴ０１株の突然変異体（変異株）であってもよい。変異株は、従来からよく用いられている変異剤であるエチルメタンスルホン酸による変異処理、ニトロソグアニジン、メチルメタンスルホン酸などの他の化学物質処理、紫外線照射、あるいは、変異剤処理無しで得られる、いわゆる自然突然変異によって取得することも可能である。
本発明の他の実施形態として、本発明のデハロコッコイデス属細菌を用いて、塩素化エチレン類と塩素化エタン類との少なくとも一方を含む汚染物を浄化する方法が挙げられる。この形態の浄化方法によれば、本発明のデハロコッコイデス属細菌の働きにより、汚染物を浄化することができる。
また、本発明の他の実施形態として、本発明のデハロコッコイデス属細菌を含有する浄化剤が挙げられる。この浄化剤によれば、本発明のデハロコッコイデス属細菌の働きにより、塩素化エチレン類と塩素化エタン類との少なくとも一方を含む汚染物を浄化することができる。
本明細書において、塩素化エチレン類としては、例えば、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレン、塩化ビニル等が挙げられる。また、塩素化エタン類としては、例えば、１，２－ジクロロエタン、１，１，２－トリクロロエタン、１，１，１－トリクロロエタン等が挙げられる。
また、本発明の他の実施形態として、本発明のデハロコッコイデス属細菌を用いて、塩素化ビフェニルと、塩素化ベンゼンと、塩素化フェノールと、塩素化ジベンゾ－ｐ－ジオキシンと、塩素化ジベンゾフランと、塩素化ナフタレンと、塩素化アニリンと、の少なくとも一つを含む汚染物を浄化する方法が挙げられる。この形態の浄化方法によれば、本発明のデハロコッコイデス属細菌の働きにより、汚染物を浄化することができる。この効果を奏する推定メカニズムは、以下のように考えられる。つまり、ＮＩＴ０１株と同様に、塩素化エチレンを脱塩素化するデハロコッコイデス属細菌としては、これまでに、塩素化ビフェニル（参考文献：Sarah L LaRoe et al., “Dehalococcoides mccartyi Strain JNA in Pure Culture Extensively Dechlorinates Aroclor 1260 According to Polychlorinated Biphenyl (PCB) Dechlorination Process N” Environmental Science and Technology 2014, 48, 9187-9196; Donne F Fennell et al., “Dehalococcoides ethenogenes Strain 195 Reductively Dechlorinates Diverse Chlorinated Aromatic Pollutants” Environmental Science and Technology 2004, 38, 2075-2081）、塩素化ベンゼン（参考文献：Lorenz Adrian et al., “Bacterial dehalorespiration with chlorinated benzenes” Nature. VOL408, 30 November 2000, 580-583）、塩素化エタン（参考文献：Xavier Maymo-Gatell et al., “Isolation of a Bacterium That Reductively Dechlorinates Tetrachloroethene to Ethene” Science, VOL. 276, 6 JUNE 1997, 1568-1571）、塩素化フェノール（参考文献：Lorenz Adrian et al., “Growth of Dehalococcoides Strains with Chlorophenols as Electron Acceptors” Environmental Science and Technology 2007, 41, 2318-2323）、塩素化ジベンゾ－ｐ－ジオキンン、塩素化ジベンゾフラン、塩素化ナフタレン（参考文献：Donne F Fennell et al., “Dehalococcoides ethenogenes Strain 195 Reductively Dechlorinates Diverse Chlorinated Aromatic Pollutants” Environmental Science and Technology 2004, 38, 2075-2081）、塩素化アニリン（参考文献：Shangwei Zhang et al., “Anaerobic Dehalogenation of Chloroanilines by Dehalococcoides
mccartyi Strain CBDB1 and Dehalobacter Strain 14DCB1 via Different Pathways as Related to Molecular Electronic Structure” Environmental Science and Technology 2017, 51, 3714-3724）を脱塩素化する菌が報告されている。これらのデハロコッコイデス属細菌のゲノム配列には１１～３２の還元的脱ハロゲン化酵素遺伝子が存在し、ＮＩＴ０１株には１９の還元的脱ハロゲン化酵素遺伝子が存在することから、既報と同様に、上記の有機ハロゲンを脱ハロゲン化することが推定される。
mccartyi Strain CBDB1 and Dehalobacter Strain 14DCB1 via Different Pathways as Related to Molecular Electronic Structure” Environmental Science and Technology 2017, 51, 3714-3724）を脱塩素化する菌が報告されている。これらのデハロコッコイデス属細菌のゲノム配列には１１～３２の還元的脱ハロゲン化酵素遺伝子が存在し、ＮＩＴ０１株には１９の還元的脱ハロゲン化酵素遺伝子が存在することから、既報と同様に、上記の有機ハロゲンを脱ハロゲン化することが推定される。
本明細書における汚染物は、特に限定されないが、例えば、河川水、地下水、工業廃液、工業廃水、生活排水、工業廃棄物、汚染土壌等が挙げられる。本発明のデハロコッコイデス属細菌を汚染物に作用させるための方法としては、特に限定されないが、汚染物の形態に合わせて、本発明のデハロコッコイデス属細菌を汚染物に直接、添加又は混合等させてもよく、本発明のデハロコッコイデス属細菌を含有する浄化剤を汚染物に散布してもよい。本発明のデハロコッコイデス属細菌の適用量は、任意に設定可能である。例えば、地下水に本発明のデハロコッコイデス属細菌を１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ添加してもよい。また、予備実験を通じて汚染物に適した適用量を設定することができる。また、本発明のデハロコッコイデス属細菌を支持体に固定化又は担持させた状態で用いてもよい。
＜単離及び特性の検討＞
１．方法
（１）分離方法
塩素化エチレン類を含む河川堆積物を接種源とし、後述する表１に記載した液体培地Ａに５００μＭのｃｉｓ－１，２－ジクロロエチレンと０．０１質量％の酵母エキスと０．０１質量％のペプトンとを加えた培地で３年間、約１か月ごとに１回の頻度で５％植え継ぎを行った。さらに、この培地から酵母エキス及びペプトンを除いた培地Ｂを用い、さらに１．５年間、約１か月ごとに１回の頻度で５％植え継ぎを行った。その後、集積培養物について、限界希釈培養によって、本発明のデハロコッコイデス属細菌の分離を行った。
１．方法
（１）分離方法
塩素化エチレン類を含む河川堆積物を接種源とし、後述する表１に記載した液体培地Ａに５００μＭのｃｉｓ－１，２－ジクロロエチレンと０．０１質量％の酵母エキスと０．０１質量％のペプトンとを加えた培地で３年間、約１か月ごとに１回の頻度で５％植え継ぎを行った。さらに、この培地から酵母エキス及びペプトンを除いた培地Ｂを用い、さらに１．５年間、約１か月ごとに１回の頻度で５％植え継ぎを行った。その後、集積培養物について、限界希釈培養によって、本発明のデハロコッコイデス属細菌の分離を行った。
（２）１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列に基づく系統解析
分離したデハロコッコイデス属細菌を同定する目的で、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全長シーケンシングを行った。具体的には、大腸菌（E.coli）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子位置で８－１４９２に相当する部位を２７ｆ（配列番号２）および１４９２ｒ（配列番号３）プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、培養物から遠心により集菌した細胞をプロテアーゼ処理により溶菌後、ボイルした溶菌液を鋳型とし、ｅｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行った。ＰＣＲサーマルサイクルプログラムには、９５℃で２分の熱変性の後、９５℃で１分、５０℃で３０秒、７２℃で１分３０秒を１サイクルとして３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で２分保温するプログラムを用いた。得られたＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ(キアゲン社製)を用いて精製し、さらにＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ(アプライドバイオシステムズ社製)を用いてシーケンス反応を行い、反応物をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００－ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ (アプライドバイオシステムズ社製)で泳動し、塩基配列を決定した。塩基配列データはＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標） ｖｅｒ ７．０ ｐｒｏｇｒａｍ (ゼネティックス社製)を用いて解析し、オンラインBLAST解析ツール（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を用いて、データベースと照合することで同定した。
分離したデハロコッコイデス属細菌を同定する目的で、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全長シーケンシングを行った。具体的には、大腸菌（E.coli）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子位置で８－１４９２に相当する部位を２７ｆ（配列番号２）および１４９２ｒ（配列番号３）プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、培養物から遠心により集菌した細胞をプロテアーゼ処理により溶菌後、ボイルした溶菌液を鋳型とし、ｅｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行った。ＰＣＲサーマルサイクルプログラムには、９５℃で２分の熱変性の後、９５℃で１分、５０℃で３０秒、７２℃で１分３０秒を１サイクルとして３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で２分保温するプログラムを用いた。得られたＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ(キアゲン社製)を用いて精製し、さらにＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ(アプライドバイオシステムズ社製)を用いてシーケンス反応を行い、反応物をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００－ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ (アプライドバイオシステムズ社製)で泳動し、塩基配列を決定した。塩基配列データはＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標） ｖｅｒ ７．０ ｐｒｏｇｒａｍ (ゼネティックス社製)を用いて解析し、オンラインBLAST解析ツール（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を用いて、データベースと照合することで同定した。
ＮＩＴ０１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。図１は、分離したデハロコッコイデス属細菌であるＮＩＴ０１株及び類縁菌の１６Ｓ ｒＮＡ遺伝子に基づく進化系統樹を示す図である。図１におけるＣ、Ｖ及びＰは、それぞれＣｏｒｎｅｌｌグループ、Ｖｉｃｔｏｒｉａグループ、Ｐｉｎｅｌｌａｓグループを示す。また、スケールバーは、１００ｂｐ．あたり２ｂｐ．の塩基置換を示す。
ＮＩＴ０１株は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析結果において、Chloroflexi門Dehalococcoidaceae科Dehalococcoides属Dehalococcoides mccartyiに類縁であることが分かった。また、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく進化系統樹において、ＮＩＴ０１株は、Ｐｉｎｅｌｌａｓグループと呼ばれるサブクラスターに属することが示された。また、ＮＩＴ０１株は、Dehalococcoides mccartyi CBDB1株等の既存株に１００％一致した。以上より、ＮＩＴ０１株は、Dehalococcoides mccartyiに属する株であると同定される。
（３）外形等の特徴
図２は、ＮＩＴ０１株の走査顕微鏡写真を示す。図２は、３０，０００倍に拡大した写真である。ＮＩＴ０１株は、直径１μｍ程度の円盤形状をしており、運動性はないことが分かった。また、基質利用性試験を行った結果、ＮＩＴ０１株は、硝酸、亜硝酸、硫酸、亜硫酸、チオ硫酸、酸素の還元能をもたず、塩素化エチレン類等の有機ハロゲンの還元的脱塩素化によってのみ生育可能であることが分かった。
図２は、ＮＩＴ０１株の走査顕微鏡写真を示す。図２は、３０，０００倍に拡大した写真である。ＮＩＴ０１株は、直径１μｍ程度の円盤形状をしており、運動性はないことが分かった。また、基質利用性試験を行った結果、ＮＩＴ０１株は、硝酸、亜硝酸、硫酸、亜硫酸、チオ硫酸、酸素の還元能をもたず、塩素化エチレン類等の有機ハロゲンの還元的脱塩素化によってのみ生育可能であることが分かった。
２．分解能を示す実験条件及び実験結果
（１）１，１，２－トリクロロエタンの分解能を示す実験結果及び実験条件
（ｉ）実験条件
無機塩類、ビタミン類、酢酸ナトリウムおよび１，１，２－トリクロロエタン(１，１，２－ＴＣＡ)を含む培地（気相ガス組成 Ｈ２：ＣＯ２＝４：１（ｖ/ｖ））にＮＩＴ０１株を接種した後、２８℃で静置培養した。培養物の１，１，２－ＴＣＡの濃度は、２７０μｍｏｌ／Ｌとした。そして、一定期間毎に、ＧＣ（ガスクロマトグラフィー，ＧＣ－２０１４，島津製作所社製）により密閉瓶気相の測定を行った。本実験の反復数は４である。
（１）１，１，２－トリクロロエタンの分解能を示す実験結果及び実験条件
（ｉ）実験条件
無機塩類、ビタミン類、酢酸ナトリウムおよび１，１，２－トリクロロエタン(１，１，２－ＴＣＡ)を含む培地（気相ガス組成 Ｈ２：ＣＯ２＝４：１（ｖ/ｖ））にＮＩＴ０１株を接種した後、２８℃で静置培養した。培養物の１，１，２－ＴＣＡの濃度は、２７０μｍｏｌ／Ｌとした。そして、一定期間毎に、ＧＣ（ガスクロマトグラフィー，ＧＣ－２０１４，島津製作所社製）により密閉瓶気相の測定を行った。本実験の反復数は４である。
（ｉｉ）実験結果
図３は、ＮＩＴ０１株による１，１，２－ＴＣＡの脱塩素化の結果を示す図である。図３の縦軸は、１，１，２－トリクロロエタン(１，１，２－ＴＣＡ)、塩化ビニル（ＶＣ）、エチレンの各濃度［ｍｍｏｌ／Ｌ］を示す。図３の横軸は、経過日数［ｄａｙｓ］を示す。
図３は、ＮＩＴ０１株による１，１，２－ＴＣＡの脱塩素化の結果を示す図である。図３の縦軸は、１，１，２－トリクロロエタン(１，１，２－ＴＣＡ)、塩化ビニル（ＶＣ）、エチレンの各濃度［ｍｍｏｌ／Ｌ］を示す。図３の横軸は、経過日数［ｄａｙｓ］を示す。
図３に示す結果によれば、エチレン濃度が０．００ｍｍｏｌ／Ｌ（経過日数：０日）から０．０５ｍｍｏｌ／Ｌに増加している。このため、ＮＩＴ０１株は、１，１，２－ＴＣＡをエチレンまで分解可能であることが分かった。
（２）トリクロロエチレンの分解能を示す実験結果及び実験条件
（ｉ）実験条件
無機塩類、ビタミン類、酢酸ナトリウム及び４ｍｍｏｌ／Ｌのトリクロロエチレン（ＴＣＥ）を含む培地（気相ガス組成 Ｈ２：ＣＯ２＝４：１（ｖ/ｖ））にＮＩＴ０１株を接種した後、２８℃で静置培養した。そして、一定期間毎に、ＧＣ（ガスクロマトグラフィー，ＧＣ－２０１４，島津製作所社製）により密閉瓶気相の測定を行うとともに、落射蛍光顕微鏡観察により培養液中の菌体密度を計測した。本実験の反復数は３である。
（ｉ）実験条件
無機塩類、ビタミン類、酢酸ナトリウム及び４ｍｍｏｌ／Ｌのトリクロロエチレン（ＴＣＥ）を含む培地（気相ガス組成 Ｈ２：ＣＯ２＝４：１（ｖ/ｖ））にＮＩＴ０１株を接種した後、２８℃で静置培養した。そして、一定期間毎に、ＧＣ（ガスクロマトグラフィー，ＧＣ－２０１４，島津製作所社製）により密閉瓶気相の測定を行うとともに、落射蛍光顕微鏡観察により培養液中の菌体密度を計測した。本実験の反復数は３である。
（ｉｉ）実験結果
図４は、ＮＩＴ０１株によるＴＣＥの脱塩素化の結果を示す図である。図４の縦軸は、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）、ジクロロエチレン（ＤＣＥ）、塩化ビニル（ＶＣ）、エチレンの各濃度［ｍｍｏｌ／Ｌ］を示す。図４の横軸は、経過日数［ｄａｙｓ］を示す。
図４は、ＮＩＴ０１株によるＴＣＥの脱塩素化の結果を示す図である。図４の縦軸は、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）、ジクロロエチレン（ＤＣＥ）、塩化ビニル（ＶＣ）、エチレンの各濃度［ｍｍｏｌ／Ｌ］を示す。図４の横軸は、経過日数［ｄａｙｓ］を示す。
図５は、この実験でのＮＩＴ０１株の細胞密度の変化を示す図である。図５の縦軸は、ＮＩＴ０１株の細胞密度［ｃｅｌｌｓ／ｍL］を示す。図５の横軸は、経過日数［ｄａｙｓ］を示す。
図４の結果から以下のことが分かった。つまり、トリクロロエチレンの濃度が、４０日経過後に０ｍｍｏｌ／Ｌまで減少していることが分かった。また、エチレン濃度が、０ｍｍｏｌ／Ｌ（経過日数：０日）から４ｍｍｏｌ／Ｌ（経過日数：４０日）に増加していることが分かった。このことから、この実験では、４０日間で４ｍｍｏｌ／ＬのトリクロロエチレンをすべてエチレンまでＮＩＴ０１株が脱塩素化したことが分かった。また、図５の結果から、ＮＩＴ０１株の細胞密度が、この実験期間において増えていることが分かった。
また、その他の実験において、ＮＩＴ０１株の初期細胞密度を３．４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍLから８．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍL接種した場合、２ｍｍｏｌ／Ｌのトリクロロエチレンは２週間以内にすべてエチレンまで分解され、３ｍｍｏｌ／Ｌのトリクロロエチレンは２５日間ですべてエチレンまで分解された。また、その他の実験において、ＮＩＴ０１株は、１，１－ジクロロエチレン、ｔｒａｎｓ－１，２－ジクロロエチレン、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）を脱塩素化することが分かった。
図６は、ＮＩＴ０１株による塩素化エチレンの推定分解経路を示す図である。図６では、実線の矢印で示した経路において、ＮＩＴ０１株は増殖しながら分解を行うと推定され、破線の矢印で示す経路において、ＮＩＴ０１株は増殖せずに共代謝により分解を行うと推定される。
図６は、以下の推定を示している。ＮＩＴ０１株は、共代謝により、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）をトリクロロエチレン（ＴＣＥ）に分解すると推定される。また、ＮＩＴ０１株は、増殖により、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）をｃｉｓ－１，２－ジクロロエチレン（ＤＣＥ）に分解すると推定される。また、ＮＩＴ０１株は、増殖によって、１，１－ジクロロエチレン（ＤＣＥ）及びｃｉｓ－１，２－ジクロロエチレン（ＤＣＥ）を塩化ビニル（ＶＣ）に分解するとともに、塩化ビニル（ＶＣ）をエチレンに分解すると推定される。また、ＮＩＴ０１株は、共代謝により、ｔｒａｎｓ－１，２－ジクロロエチレン（ＤＣＥ）を塩化ビニル（ＶＣ）に分解すると推定される。
本発明のデハロコッコイデス属細菌は、４ｍｍｏｌ／Ｌのトリクロロエチレンをエチレンに分解するとともに、１，１，２－トリクロロエタンをエチレンに分解する。このため、トリクロロエチレンと１，１，２－トリクロロエタンとの少なくとも一方により汚染された汚染物（例えば、河川水、地下水、排水、土壌等）の浄化（バイオレメディエーション）に有用である。塩素化エチレン類を分解可能な他の微生物と併用し、様々な塩素化エチレン類を同時に分解することも可能であり、様々な汚染物の浄化への適用が期待される。
本発明は、上述の実施形態に限られるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲において種々の構成で実現することができる。例えば、発明の概要の欄に記載した各形態中の技術的特徴に対応する実施形態、実施例中の技術的特徴は、上述の課題の一部または全部を解決するために、あるいは、上述の効果の一部または全部を達成するために、適宜、差し替えや、組み合わせを行うことが可能である。また、その技術的特徴が本明細書中に必須なものとして説明されていなければ、適宜、削除することが可能である。
Claims (5)
- １，１，２－トリクロロエタンを含む汚染物を浄化する方法であって、受託番号がＮＩＴＥ Ｐ－０２８９３であるデハロコッコイデス属細菌を用い、前記１，１，２－トリクロロエタンがエチレンに分解されることにより、前記汚染物に含まれる前記エチレン濃度が増加する、１，１，２－トリクロロエタンを含む汚染物を浄化する方法。
- 前記汚染物に含まれる前記１，１，２－トリクロロエタンの濃度は、２７０μｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１に記載の１，１，２－トリクロロエタンを含む汚染物を浄化する方法。
- トリクロロエチレンを含む汚染物を浄化する方法であって、受託番号がＮＩＴＥ Ｐ－０２８９３であるデハロコッコイデス属細菌を用い、前記トリクロロエチレンの濃度は４ｍｍоｌ／Ｌ～３ｍｍоｌ／Ｌであり、前記デハロコッコイデス属細菌を初期細胞密度３．４×１０ ６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～８．１×１０ ６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで接種し、所定日数の後には、前記汚染物に含まれる前記トリクロロエチレンの濃度が０ｍｍоｌ／Ｌとなる、トリクロロエチレンを含む汚染物を浄化する方法。
- 前記トリクロロエチレンの濃度が４ｍｍоｌ／Ｌであるときには、前記所定日数は４０日である、請求項３に記載のトリクロロエチレンを含む汚染物を浄化する方法。
- 前記トリクロロエチレンの濃度が３ｍｍоｌ／Ｌであるときには、前記所定日数は２５日である、請求項３に記載のトリクロロエチレンを含む汚染物を浄化する方法。
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| 日下部俊弥，土木学会優秀研究発表賞受賞！！，国立大 学法人名古屋工業大学社会工学科環境都市分野水環境微生物工学研究室ウェブページ，＜ＵＲＬ：http://yoshidana.web.nitech.ac.jp/category/society/award/＞ |
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