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JP7354099B2 - マイクロｒｎａ遺伝子発現を使用して黒色腫を診断し、病期分類し、モニタリングする方法 - Google Patents
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JP7354099B2 - マイクロｒｎａ遺伝子発現を使用して黒色腫を診断し、病期分類し、モニタリングする方法 - Google Patents

マイクロｒｎａ遺伝子発現を使用して黒色腫を診断し、病期分類し、モニタリングする方法 Download PDF

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Description

本発明の分野
本発明は、対象における黒色腫を診断する方法であって、マイクロＲＮＡ発現レベルを検出することを含む方法に関する。本発明はまた、黒色腫の病期を評価し、及び／又は前記黒色腫の病期をモニタリングする方法に関する。また、本発明は、黒色腫の診断又は病期に基づき治療を選択し、又は治療を改変することに関する。さらに、本発明は、患者における黒色腫を検出し、診断し、及び黒色腫の病期を決定するシステムに関する。
本発明の背景
世界的に、毎年１３０，０００人を超える個人が黒色腫と診断されている。黒色腫は極めて希な形態の皮膚癌である一方、それは最も死者が多くもある。罹患率は、過去１０年間にわたり増加している。それというのも、大気オゾンレベルが枯渇し、太陽ＵＶ放射線が比例的に増加しているためである。黒色腫の発症についてのリスク因子としては、色白、染み形成、及び薄色の毛髪；娯楽及び職業上の日光曝露；皮膚癌の家族又は以前の個人の病歴；低下した免疫系を有すること；高齢又は男性であることが挙げられる。
豪州在住者は、世界で最も高い黒色腫の罹患率を有し、１４人の男性に１人及び２３人の女性に１人がその生涯において黒色腫を発症することが予測される。これらの割合は、米国の３倍及び英国の４倍高く、最近１０年間にわたり男性で１６％及び女性で２４％だけ増加している。豪州単独において、６時間毎に１人の人間が黒色腫により死亡しており、その年間死亡者は国内の交通事故による死亡者を超過する。２０１８年において１４，０００人を超える豪州人が黒色腫と診断されることが予測される。黒色腫は、全ての皮膚癌の２％に相当するにすぎないが、皮膚癌の死亡の７５％を引き起こす。
黒色腫はその進行の早期に診断されると、極端に高い生存率を有する。１期において同定及び摘出されると、患者の９５％は診断後１０年間生存する。ＩＶ期において診断された場合、１０年生存率は１０～１５％に降下し、早期検出及び正確で非侵襲性の診断アッセイの潜在的な臨床的取り入れの必要性が強調される。
一部の国において、集団の最大５０％が全身イメージングを受けるが、これは依然として死亡率に対する有意な影響を示していない。広範に利用可能でエビデンスに基づく、黒色腫の定型的なスクリーニングの方法は存在しない。
したがって、非侵襲性で低コストでハイスループットの方法を使用して活性悪性黒色腫細胞の存在を検出する客観的な方法の必要性が緊急で満たされていない。さらに、黒色腫をその早期及び最も治療可能な病期で診断するだけでなく、治療選択の情報を与え得る病期分類／予後診断情報を同定することも要求される。正確で非侵襲性、例えば、血液ベース又は尿ベースの黒色腫のバイオマーカーは、長期治療応答をモニタリングし、再発を予測する方法が必要とされる治療後の状況においても有用である。
本発明の概要
本発明者らは、対象における黒色腫の診断、病期分類（staging）及びモニタリングにおいて有用なマイクロＲＮＡバイオマーカーシグネチャーを同定した。
一実施形態において、本発明は、対象における黒色腫を検出し、診断する方法であって、
（ｉ）生物試料中のマイクロＲＮＡ発現レベルを検出すること、
（ｉｉ）前記マイクロＲＮＡの発現レベルを含むデータセットに由来する１つ以上のアルゴリズムに基づき生物試料の分類スコア（ＣＳ）を算出すること、及び
（ｉｉｉ）分類スコアの値に基づき生物試料を黒色腫として、又は黒色腫でないとして分類すること
を含み、
マイクロＲＮＡは、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-3131、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-331-3p、
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hsa-miR-1264、hsa-miR-34a-5p、
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hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-4532、
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hsa-miR-154-5p、hsa-miR-497-5p、
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hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-521、
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hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-553、
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hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-660-5p
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-764
から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡを含む方法を提供する。
一実施形態において、対象における黒色腫を検出し、診断する方法であって、マイクロＲＮＡは、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-3131、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-4532、
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hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-520d-3p、
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hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-522-3p、
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hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-764
からなる方法。
関連態様において、対象における黒色腫を検出し、診断する方法であって、マイクロＲＮＡは、
hsa-miR-1258、hsa-miR-1537-3p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-154-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-1-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-181b-5p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-1910-5p、
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hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-3131、hsa-miR-522-3p、
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hsa-miR-3928-3p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-424-5p、hsa-miR-553、
hsa-miR-431-5p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-450a-5p、hsa-miR-764
からなる方法。
さらなる関連態様において、対象における黒色腫を検出し、診断する方法であって、マイクロＲＮＡは、
hsa-miR-1258、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p
hsa-miR-299-3p
からなる方法。
生物試料は、固形組織、血漿、血液、皮膚、エキソソーム、尿、乳汁、血清、腹水、嚢胞液、胸膜液、腹腔液、脳脊髄液、涙液、唾液、痰、毛髪又はそれらの組合せである。
一実施形態において、対象は、ヒトである。
本発明はまた、黒色腫の病期を決定する方法であって、
（ｉ）生物試料中のマイクロＲＮＡ発現レベルを検出すること、
（ｉｉ）前記マイクロＲＮＡの発現レベルを含むデータセットに基づき生物試料の病期分類スコア（ＳＳ）を算出すること、及び
（ｉｉｉ）病期分類スコアの値に基づき生物試料を黒色腫の病期として分類すること
を含み、
マイクロＲＮＡは、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-3131、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-34a-5p、
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hsa-miR-127-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-521、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-652-3p、
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hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-764
から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡを含む方法を提供する。
関連態様において、黒色腫の病期を決定する方法であって、マイクロＲＮＡは、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-3131、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-331-3p、
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hsa-miR-1269a、hsa-miR-3928-3p、
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hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-450a-5p、
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hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-521、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-764
からなる方法。
別の関連態様において、黒色腫の病期を決定する方法であって、マイクロＲＮＡは、hsa-let-7e-5p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-301a-3p、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-3127-5p
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-521、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-660-5p
hsa-miR-299-3p
からなる方法。
一実施形態において、黒色腫の病期分類は、Ｉ又はＩＩ又はＩＩＩ又はＩＶ期である。
生物試料は、固形組織、血漿、血液、皮膚、エキソソーム、尿、乳汁、血清、腹水、嚢胞液、胸膜液、腹腔液、脳脊髄液、涙液、唾液、痰、毛髪又はそれらの組合せである。
一実施形態において、対象は、ヒトである。
一実施形態において、本発明は、対象における黒色腫をモニタリングする方法であって、少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現のレベルは、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-1537-3p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-154-5p、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-1-5p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-181b-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-1910-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-1973、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-199b-5p、
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hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-219a-2-3p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-2682-5p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-27a-3p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-3127-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-3131、hsa-miR-521、
hsa-miR-331-3p、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-337-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-3928-3p、hsa-miR-548l、
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hsa-miR-450a-5p、hsa-miR-652-3p、
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hsa-miR-454-3p、hsa-miR-764
から選択される方法を提供する。
本発明は、対象における黒色腫をモニタリングする方法であって、マイクロＲＮＡは、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-199b-5p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-205-5p、
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hsa-miR-1264、hsa-miR-27a-3p、
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hsa-miR-127-5p、hsa-miR-301a-3p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-3131、
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hsa-miR-1-5p、hsa-miR-424-5p、
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hsa-miR-1973、hsa-miR-4532、
hsa-miR-454-3p、hsa-miR-548ad-3p、
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hsa-miR-521、hsa-miR-652-3p、
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hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-764
からなる方法を提供する。
本発明は、対象における黒色腫をモニタリングする方法であって、マイクロＲＮＡは、
hsa-miR-1258、hsa-miR-3131、
hsa-miR-1264、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-764
からなる方法を提供する。
本発明は、対象における黒色腫をモニタリングする方法であって、マイクロＲＮＡは、
hsa-miR-1258、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-548a-5p
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-299-3p
からなる方法を提供する。
生物試料は、固形組織、血漿、血液、皮膚、エキソソーム、尿、乳汁、血清、腹水、嚢胞液、胸膜液、腹腔液、脳脊髄液、涙液、唾液、痰、毛髪又はそれらの組合せである。
一実施形態において、対象は、ヒトである。
本発明は、既に黒色腫と診断された対象における再燃又は再発について黒色腫の状態をモニタリングする方法であって、
（ｉ）生物試料中のマイクロＲＮＡ発現レベルを検出すること、
（ｉｉ）前記マイクロＲＮＡの発現レベルを含むデータセットからの１つ以上のアルゴリズムに基づき生物試料の分類スコア（ＣＳ）を算出すること、及び
（ｉｉｉ）分類スコアの値に基づき生物試料を黒色腫として、又は黒色腫でないとして分類し、黒色腫を有する者と有さない者とを分ける既に決定された分類閾値と比較すること
を含み、
マイクロＲＮＡは、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-1306-5p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-138-5p、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-152-3p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-1537-3p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-154-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-1-5p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-181b-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-1910-5p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-521、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-3127-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-3131、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-331-3p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-337-5p、hsa-miR-553、
hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-3928-3p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-424-5p、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-431-5p、hsa-miR-764
から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡを含む方法を提供する。
一実施形態において、前記マイクロＲＮＡは、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-1973、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-199b-5p、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-205-5p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-219a-2-3p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-2682-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-27a-3p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-299-3p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-301a-3p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-3131、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-450a-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-4532、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-454-3p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-4787-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-497-5p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-521、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-522-3p、hsa-miR-764
からなる。
さらなる実施形態において、前記マイクロＲＮＡは、
hsa-miR-1258、hsa-miR-3131、
hsa-miR-1264、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-764
からなる。
さらに別の実施形態において、前記マイクロＲＮＡは、
hsa-miR-1258、hsa-miR-1302、
hsa-miR-1264、hsa-miR-152-3p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-548ad-3p
hsa-miR-424-5p
からなる。
本発明はまた、対象における黒色腫を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の薬剤を投与することを含み、前記薬剤は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを直接的又は間接的に改変し、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-299-3p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-301a-3p、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-3131、
hsa-miR-1264、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-521、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-624-3p、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-652-3p、hsa-miR-764
から選択される方法を提供する。
一態様において、本発明は、対象における黒色腫を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の薬剤を投与することを含み、前記薬剤は、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-3131、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-521、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-764
からなるｍｉＲＮＡの発現レベルを直接的又は間接的に改変する方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、対象における黒色腫を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の薬剤を投与することを含み、前記薬剤は、
hsa-miR-1258、hsa-miR-3131、
hsa-miR-1264、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-764
からなるｍｉＲＮＡの発現レベルを直接的又は間接的に改変する方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、対象における黒色腫を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の薬剤を投与することを含み、前記薬剤は、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-199b-5p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-27a-3p、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-299-3p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-301a-3p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-4787-3p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-521、hsa-miR-660-5p
からなるｍｉＲＮＡの発現レベルを直接的又は間接的に改変する方法を提供する。
その上さらなる態様において、本発明は、対象における黒色腫を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の薬剤を投与することを含み、前記薬剤は、
hsa-miR-1258、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p
hsa-miR-299-3p
からなるｍｉＲＮＡの発現レベルを直接的又は間接的に改変する方法を提供する。
生物試料は、固形組織、血漿、血液、皮膚、エキソソーム、尿、乳汁、血清、腹水、嚢胞液、胸膜液、腹腔液、脳脊髄液、涙液、唾液、痰、毛髪又はそれらの組合せである。
一実施形態において、対象は、ヒトである。
さらなる態様において、本発明は、分類スコアにより決定された少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現レベルに基づく有害黒色腫アウトカムに従って治療を選択し、又は治療を改変することを含み、前記方法は、前記対象における少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを直接的又は間接的に改変する黒色腫の治療において有効な薬剤を投与することを含み、前記少なくとも１つ以上のｍｉＲＮＡは、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-1264、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-1269a、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-127-5p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-1302、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-521、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-3127-5p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-3131、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-331-3p、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-337-5p、hsa-miR-764
から選択される。
一態様において、本発明は、分類スコアにより決定されたマイクロＲＮＡの発現レベルに基づく有害黒色腫アウトカムに従って治療を選択し、又は治療を改変することを含み、前記方法は、
（ａ）
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-127-5p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-1302、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-1306-5p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-138-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-152-3p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-1537-3p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-1973、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-521、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-3127-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-3131、hsa-miR-553、
hsa-miR-331-3p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-337-5p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-3928-3p、hsa-miR-764；
又は
（ｂ）
hsa-miR-1258、hsa-miR-1973
hsa-miR-1264、hsa-miR-205-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-219a-2-3p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-2682-5p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-27a-3p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-299-3p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-301a-3p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-3131、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-431-5p、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-450a-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-4532、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-454-3p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-4787-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-497-5p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-764
又は
（ｃ）
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-299-3p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-301a-3p、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-521、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-660-5p
又は
（ｄ）
hsa-miR-1258、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p
hsa-miR-299-3p
からなるｍｉＲＮＡの発現レベルを直接的又は間接的に改変する、黒色腫の治療において有効な薬剤を投与することを含む。
生物試料は、固形組織、血漿、血液、皮膚、エキソソーム、尿、乳汁、血清、腹水、嚢胞液、胸膜液、腹腔液、脳脊髄液、涙液、唾液、痰、毛髪又はそれらの組合せである。
一実施形態において、対象は、ヒトである。
別の態様において、本発明は、黒色腫の治療において有効な医薬品の製造のための、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを改変する薬剤の使用であって、前記少なくとも１つのマイクロＲＮＡは、以下：
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-3131、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-521、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-764
から選択される使用を提供する。
一態様において、本発明は、黒色腫の治療において有効な医薬品の製造のための、ｍｉＲＮＡの発現レベルを改変する薬剤の使用であって、前記マイクロＲＮＡは、
（ａ）
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-3131、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-521、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-764;
又は
（ｂ）
hsa-miR-1258、hsa-miR-3131、
hsa-miR-1264、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-764
又は
（ｃ）
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-299-3p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-301a-3p、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-521、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-660-5p
又は
（ｄ）
hsa-miR-1258、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p
hsa-miR-299-3p
からなる使用を提供する。
一実施形態において、薬剤は、以下の１つ以上：
（ｉ）免疫療法薬、例として、アルデスロイキン（ＩＬ－２）、Intron A（組換えインターフェロンアルファ－２ｂ）、イピリムマブ、Keytruda（ペムブロリズマブ）、ペムブロリズマブ、Sylatron（ペグインターフェロンアルファ－２ｂ）、Yervoy（イピリムマブ）、Zelboraf（ベムラフェニブ）、
（ｉｉ）標的／小分子療法薬、例として、コビメチニブ、ダブラフェニブ、Mekinist（トラメチニブ）、ニボルマブ（Opdivo）、ベムラフェニブ
（ｉｉｉ）化学療法薬、例として、ダカルバジン
（ｉｖ）ウイルス療法薬、例として、Imlygic（タリモジーン・ラヘルパレプベク）
（ｖ）ｓｉＲＮＡ
（ｖｉ）アンチセンス核酸、
（ｖｉｉ）アンタゴニストマイクロＲＮＡ、例として、アンタゴｍｉｒ、
（ｖｉｉｉ）酵素ＲＮＡ分子、例として、リボザイム
（ｉｘ）ｍｉＲＮＡアゴニスト；及び／又は
（ｘ）抗ｍｉＲＮＡ抗体
から選択される。
別の態様において、患者における黒色腫を検出し、診断するシステムであって、
少なくとも１つのプロセッサ：及び
前記プロセッサによる実行のためのプログラム命令を含有する少なくとも１つのストレージ媒体
を含み、前記プログラム命令は、
（ｉ）患者からの生物試料中のマイクロＲＮＡ発現レベルを検出すること
（ｉｉ）前記マイクロＲＮＡの発現レベルを含むデータセットに由来する１つ以上のアルゴリズムに基づき生物試料の分類スコア（ＣＳ）を算出すること、及び
（ｉｉｉ）分類スコアの値に基づき生物試料を黒色腫として又は黒色腫でないとして分類すること
を含むステップを前記プロセッサに実行させ、
マイクロＲＮＡは、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-3131、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-521、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-553、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-764
hsa-miR-301a-3p、
hsa-miR-3127-5p
から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡを含むシステムが提供される。
さらなる態様において、マイクロＲＮＡは、
（ａ）
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-3131、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-521、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-764；
又は
（ｂ）
hsa-miR-1258、hsa-miR-1269a、
hsa-miR-1264、hsa-miR-1302、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-3131、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-337-5p、hsa-miR-764
又は
（ｃ）
hsa-miR-1258、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p
hsa-miR-299-3p
からなる。
１つ以上のアルゴリズムは、データセットからの試料を使用して訓練された訓練サポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズムを含み得、ＳＶＭは、マイクロＲＮＡの重み及び発現の内側の和（inner sum）が所定の閾値よりも大きい場合に生物試料を黒色腫に対応するクラスに属するとして分類するように構成される。
１つ以上のアルゴリズムは、最近傍セントロイド分類器を含み得、最近傍セントロイド分類器は、生物試料のマイクロＲＮＡのセントロイドがマイクロＲＮＡの正常セントロイドではなくマイクロＲＮＡの黒色腫セントロイドに近い場合に黒色腫クラスを生物試料に割り当てるように構成される。
１つ以上のアルゴリズムは、複合共変量予測因子を含み得、複合共変量予測因子は、マイクロＲＮＡの重み及び発現の内側の和が所定の閾値よりも大きい場合に生物試料を黒色腫に対応するクラスに属するとして分類するように構成され、マイクロＲＮＡの重み及び発現の内側の和が所定の閾値よりも大きい場合に生物試料を黒色腫に対応するクラスに属するとして分類するように構成される。
別の態様において、黒色腫の病期を決定するシステムであって、
少なくとも１つのプロセッサ；及び
前記プロセッサによる実行のためのプログラム命令を含有する少なくとも１つのストレージ媒体
を含み、前記プログラム命令は、
（ｉ）生物試料中のマイクロＲＮＡ発現レベルを検出すること、
（ｉｉ）前記マイクロＲＮＡの発現レベルを含むデータセットに基づき生物試料の病期分類スコア（ＳＳ）を算出すること、及び
（ｉｉｉ）病期分類スコアの値に基づき生物試料を黒色腫の病期として分類すること
を含むステップを前記プロセッサに実行させ、
マイクロＲＮＡは、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-1306-5p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-138-5p、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-152-3p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-1537-3p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-154-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-1-5p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-181b-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-1910-5p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-521、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-3127-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-3131、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-331-3p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-337-5p、hsa-miR-553、
hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-3928-3p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-424-5p、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-431-5p、hsa-miR-764
から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡを含むシステムが提供される。
別の態様において、マイクロＲＮＡは、
（ａ）
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-1973、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-199b-5p、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-205-5p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-219a-2-3p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-2682-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-27a-3p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-299-3p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-301a-3p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-3131、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-450a-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-4532、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-454-3p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-4787-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-497-5p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-521、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-522-3p、hsa-miR-764
又は
（ｂ）
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-299-3p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-301a-3p、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-521、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-660-5p
からなる。
病期分類スコアは、ロジスティック回帰モデル、４つの病期分類クラスを含む多クラスアルゴリズム、最近傍セントロイド分類器、サポートベクターマシン及び二分決定木分類器からなる群からの任意のアルゴリズムにより算出することができる。
さらなる態様において、本発明は、分子アレイ又は一連の試薬であって、複数の
（ｉ）表１に列記されるマイクロＲＮＡのいずれか１つ以上に対応するヌクレオチド配列若しくはそれと少なくとも８０％の同一性を示す配列を含む核酸分子又は前記核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント若しくはホモログ；又は
（ｉｉ）中程度のストリンジェンシー条件下で（ｉ）の配列のいずれか１つ以上に結合し得るヌクレオチド配列を含む核酸分子又は前記核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント若しくはホモログ；又は
（ｉｉｉ）中程度のストリンジェンシー条件下で（ｉ）の配列のいずれか１つ以上にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む核酸プローブ若しくはオリゴヌクレオチド又は前記核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント若しくはホモログ
を含み、
（ｉ）～（ｉｉｉ）の前記マイクロＲＮＡの発現のレベルを使用して対象における黒色腫の存在若しくは不存在を示す分類スコア（ＣＳ）又は対象における黒色腫の病期を示す病期分類スコア（ＳＳ）を算出する分子アレイ又は一連の試薬を提供する。
さらなる実施形態において、分類スコア（ＣＳ）を算出するために使用される（ｉ）～（ｉｉｉ）のマイクロＲＮＡは、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-2682-5p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-27a-3p、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-299-3p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-301a-3p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-3131、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-mi R-521、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-548ad-3p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-548l、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-553、hsa-miR-764
から選択される。
一実施形態において、分類スコア（ＣＳ）を算出するために使用される（ｉ）～（ｉｉｉ）のマイクロＲＮＡは、
（ａ）
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-3131、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-521、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-764；
又は
（ｂ）
hsa-miR-1258、hsa-miR-3131、
hsa-miR-1264、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-764
又は
（ｃ）
hsa-miR-1258、hsa-miR-219a-2-3p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-299-3p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-497-5p、hsa-miR-548ad-3p
hsa-miR-548a-5p
からなる。
別の実施形態において、病期分類スコア（ＳＳ）を算出するために使用される（ｉ）～（ｉｉｉ）のマイクロＲＮＡは、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-299-3p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-301a-3p、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-521、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-660-5p
からなる。
別の態様において、本発明は、黒色腫の診断、黒色腫の病期の評価又は提案治療に対する黒色腫の疾患感受性の評価のための診断キットであって、
ａ．少なくとも１つの「フォワード」増幅プライマー；及び／又は
ｂ．少なくとも１つの「リバース」増幅プライマー；及び／又は
ｃ．マイクロＲＮＡのための検出若しくは捕捉プローブ
を含み、
プライマーは、表１から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡのヌクレオチド配列の特異的増幅を可能とする診断キットを提供する。
さらなる実施形態において、マイクロＲＮＡは、
（ａ）
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-3131、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-521、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-764;
又は
（ｂ）
hsa-miR-1258、hsa-miR-1302、
hsa-miR-1264、hsa-miR-1306-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-138-5p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-3131、hsa-miR-553、
hsa-miR-337-5p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-764
又は
（ｃ）
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-299-3p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-301a-3p、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-521、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-660-5p
又は
（ｄ）
hsa-miR-1258、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p
hsa-miR-299-3p
からなる。
一実施形態において、対象は、ヒトである。
本明細書における任意の実施形態は、特に具体的に記述のない限り、任意の他の実施形態に準用されると解釈されるものとする。例えば、当業者が理解するとおり、本発明の方法について上記概説されるバイオマーカーシグネチャーの例は本発明の使用に等しく当てはまる。本発明は、本明細書に記載の具体的な実施形態により範囲に限定されるべきでなく、それは、例示の目的のために意図されるにすぎない。機能的に均等な生成物、組成物及び方法は、本明細書に記載のとおり明らかに本発明の範囲内である。
本明細書全体にわたり、特に具体的に記述がない限り、又は文脈が特に要求しない限り、単一のステップ、物質の組成物、ステップの群又は物質の組成物の群への言及は、それらのステップ、物質の組成物、ステップの群又は物質の組成物の群の１つ及び複数（すなわち、１つ以上）を包含すると解釈されるものとする。
本発明は、以下の非限定的な実施例により、及び添付の図面を参照して以下に記載される。
添付図面の簡単な説明
上段パネル：黒色腫患者及び正常対照からの血漿間の示差的発現について評価された８００個全てのマイクロＲＮＡ。下段パネル：ベースラインに対して発現されなかった遺伝子の排除及びクラス間の統計的に有意な差（ＦＤＲ＜０．０１及びＦＣ＞２）に基づく３８遺伝子の選択。それぞれのパネルの上段右及び上段左における遺伝子は、最も生物学的に（倍率変化）及び統計的に（ＦＤＲ）有意な、正常対照からの黒色腫の識別器である。 MEL38発見データベースにおける試料についての３８遺伝子ＳＶＭスコアを示す。この分析において、ＳＶＭスコア＞１１は、黒色腫結果に対応する。 黒色腫病期によりグループ化された発見データベースにおけるそれぞれの試料について作成されたＳＶＭスコアのボックスプロット分析。 独立検証の２８／３２遺伝子ＳＶＭ分析についての曲線下面積分析。ＳＶＭの部分的再訓練は、ＡＵＣ＝０．９６を実行した。 追加の再訓練を用いない独立検証の２８／３２遺伝子ＳＶＭ分析についての曲線下面積分析。ＡＵＣ＝０．７９８ 緑色球体＝正常、青色立方体＝黒色腫から同定された２８／３８個の遺伝子を使用した血漿及び正常対照マイクロＲＮＡ遺伝子発現プロファイルの多次元スケーリング。 発見（上段パネル）及び独立検証（下段）データベース上のMEL38遺伝子シグネチャーのサブセットを使用したＰＡＭ分類モデルの交差検証。 それぞれの細胞系の組織培養培地から単離された黒色腫細胞、正常メラノサイト及びエキソソーム中のマイクロＲＮＡ発現レベル（Affymetrix MicroRNA GeneChip）の階層クラスタリング。 マッチしたMEL38遺伝子シグネチャーを使用して黒色腫細胞、黒色腫エキソソーム、正常メラノサイト細胞及びエキソソームプロファイルについて算出されたＳＶＭ分類スコア。 黒色腫及び母斑（良性）組織試料（ＦＦＰＥ）中で計測されたMEL38の階層クラスタリング。 それぞれの黒色腫及び母斑組織生検試料について算出されたMEL38 ＳＶＭスコア。 MEL38の２７マイクロＲＮＡサブセットを使用した母斑対黒色腫ＦＦＰＥ試料の分類スコア。 Ｉ～ＩＶ期疾患の患者の血漿中で同定された１８遺伝子黒色腫病期シグネチャーの発現レベルの平均倍率変化。変化は、Ｉ期疾患を有する患者におけるそれらの発現に対して示す。 MEL38診断遺伝子シグネチャー及びMel18病期分類遺伝子シグネチャーにおけるマイクロＲＮＡのベン図。合計ｎ＝４８、重複＝８。 非黒色腫正常対照血漿試料及び外科的切除前後に回収された黒色腫患者血漿におけるMEL38スコア。 本発明を具体化する例示的なシステムアーキテクチャを説明するブロック図。
本発明の詳細な説明
一般的技術及び選択される定義
特に具体的に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語は、当業者（例えば、分子生物学、細胞培養、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学）により通常理解されるのと同じ意味を有すると解釈されるものとする。
特に示されない限り、本発明において利用される技術は、当業者に周知の標準的手順である。このような技術は、出典の文献、例えば、J. Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Homes (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)、及びF.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988、現在までの全ての改訂を含む), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)、及びJ.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons（現在までの全ての改訂を含む）全体にわたり記載され、説明されている。
「及び／又は」という語、例えば、「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味すると理解されるものとし、両方の意味又はいずれかの意味のための明確な支持を提供すると解釈されるものとする。本明細書全体にわたって、「含む（comprise）」という語、又は「含む（comprises）」若しくは「含む（comprising）」などの変化形は、記述される要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群を含むことを意味するが、任意の他の要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群を除外しないと理解される。
黒色腫
黒色腫は、通常、上皮層中で色素の産生を担う特殊化メラノサイトの無秩序な増殖から生じる。これらの細胞は、典型的には皮膚に伴うが、眼球、骨及び心臓中にも存在し得、癌病変は、それらの場所のいずれにおいても発症し得る。診断時における黒色腫の病期分類は、厚さ、有糸分裂指数、潰瘍形成、及びセンチネルリンパ節状態を包含し、一般に、臨床アウトカムを示す。黒色腫は、原発性腫瘍が適切に摘出されるほとんどの患者について治癒可能であるが、多くの患者は再発並びに進行性疾患への進行及び死亡を罹患する。再発患者の大部分は転移性疾患を呈し、それにより最終的に死亡する。
黒色腫は、以下のカテゴリーに分類することができる：
１．表在拡大型黒色腫：これは、診断される全ての黒色腫の約５０％を構成する黒色腫の最も一般的なタイプである。この黒色腫は、通常、皮膚にわたり拡大する不整の輪郭の暗色スポットとして現れる。
２．結節型黒色腫：結節型は、黒色腫の最も急速に成長するタイプのものである。これは、隆起した塊又は「結節」として現れ、色が褐色、黒色、桃色又は赤色であり得、又は全く色を有さない。全ての黒色腫の約１５％が結節型である。
３．悪性黒子型黒色腫：悪性黒子型黒色腫は、大きな染みとして始まる。これらは、一般に高齢の人々に見出され、多くの日光曝露を受容した区域、例えば、顔面、頭部、頸部及び上半身に見出されることが多い。このタイプの黒色腫は、全ての黒色腫の１０％を構成する。
４．末端黒子型黒色腫：末端型は、掌、足の裏の上又は爪の下（爪下）で成長する傾向がある黒色腫の希少なタイプである。これは、全ての黒色腫の約３％を占める。
５．その他、一般的でないタイプの黒色腫としては、線維形成性及び母斑様黒色腫が挙げられる。粘膜性黒色腫は、呼吸器、消化器、及び生殖器中の組織中で見出すことができる。ブドウ膜（眼）黒色腫は、眼球中で発症する。
マイクロＲＮＡ
「ｍｉＲ」、「ｍｉＲＮＡ」及び「マイクロＲＮＡ」という用語は同義的に使用され、内因性遺伝子に由来する約１７～２５ヌクレオチド（ｎｔ）長の非コードＲＮＡのクラスを指す。
インビボで存在するｍｉＲＮＡの３つの形態、初期ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）、未成熟ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）、及び成熟ｍｉＲＮＡが存在する。初期ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）は、約数百塩基～１ｋｂ超のステムループ構造化転写産物として発現される。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ転写産物は、ステムループの塩基近くのステムの両方の鎖を開裂するDroshaと呼ばれるＲＮアーゼＩＩエンドヌクレアーゼにより核中で開裂される。Droshaは、ＲＮＡ二本鎖を粘着切断で開裂し、５’リン酸及び２ｎｔオーバーハングを３’末端に残す。開裂産物の成熟前ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）は約６０～約１１０ｎｔ長であり、折り畳み様式で形成されるヘアピン構造を有する。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、Ｒａｎ－ＧＴＰ及びエクスポーチン－５により核から細胞質に輸送される。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、細胞質中でDicerと呼ばれる別のＲＮアーゼＩＩエンドヌクレアーゼによりさらにプロセシングされる。Dicerは５’リン酸及び３’オーバーハングを認識し、ステムループジャンクションにおいてループを開裂除去してｍｉＲＮＡ二本鎖を形成する。ｍｉＲＮＡ二本鎖はＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合し、そこでアンチセンス鎖が優先的に分解され、センス鎖成熟ｍｉＲＮＡはＲＩＳＣをその標的部位に指向する。成熟ｍｉＲＮＡはｍｉＲＮＡの生物活性形態であり、約１８～約２５ｎｔ長である。
マイクロＲＮＡは、それらの標的遺伝子のメッセージ（ｍＲＮＡ）中の特異的配列との塩基対合（完全又は不完全）に関与することにより機能する。マイクロＲＮＡがそれらの標的と１００％マッチする場合、すなわち、相補性が完全である場合、標的ｍＲＮＡは開裂され、ｍｉＲＮＡはｓｉＲＮＡのように作用する。マッチが不完全である場合、すなわち、相補性が部分的である場合、標的ｍＲＮＡの翻訳は遮断される。
ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡを分解し、又はその翻訳を抑制し、標的遺伝子の発現の転写後の下方調節、抑制、又はサイレンシングを引き起こす。動物において、ｍｉＲＮＡは、必ずしもそれらの標的部位と完全な相同性を有さず、部分的な相同性は翻訳抑制をもたらす一方、植物において、ｍｉＲＮＡは標的部位と完全な相同性を示す傾向があり、メッセージ（ｍＲＮＡ）分解が優勢である。
マイクロＲＮＡはゲノム中で広く分布しており、遺伝子調節を支配し、多くの生理学的及び病理学的プロセスに活性的に関与する。例えば、あるｍｉＲＮＡの調節モダリティは、細胞増殖、分化、及びアポトーシスを制御することが見出され；異常なｍｉＲＮＡプロファイルは、腫瘍形成と関連する。さらに、ウイルス感染は、「細胞生存促進」遺伝子をサイレンシングするように標的化されるｍｉＲＮＡの増加、及びアポトーシス（プログラム細胞死）と関連する遺伝子を抑制するｍｉＲＮＡの減少を引き起こすことが示唆され、したがって、アポトーシスシグナリングの獲得に向かう均衡が傾く。
ほぼ３分の１のヒト遺伝子の発現レベルがｍｉＲＮＡにより調節されること、及びユニーク遺伝子発現のｍｉＲＮＡ調節がそれぞれの特異的細胞タイプについての特定のシグナリング経路に結び付くことが考えられる。例えば、アポトーシスシグナリング経路は、生存促進遺伝子メッセージを脱安定化するように標的化されるｍｉＲＮＡの群により指示され得、代替的なアポトーシス促進遺伝子の優勢性の獲得及びしたがって死滅プログラムの活性化を可能とする。別の例は、癌成長の制御であり；近年の発見は、細胞が新生物になるのを防止することにおいてもｍｉＲＮＡが不可欠であることを示している。例えば、２つの癌遺伝子cMyc及びcRasは、発現が癌において下方調節される１つのｍｉＲＮＡ種による制御を共有することが見出されている。換言すると、このｍｉＲＮＡの欠落はcMyc及びcRasの無限の発現を可能とし、したがってそれら２つの遺伝子が癌細胞中に豊富に存在するようになることを許容し、それらが無秩序な細胞増殖能を獲得し、新生物成長のための準備を整えるのを可能とする。
複数の経路の組織的オーケストレーションは、特定の細胞状態を制御するように機能することが考えられ、分子制御の階層的順序及びリダンダンシーにより機能的に操作されるある分子「ハブ」が関与し得る。実際、多数のｍｉＲＮＡは、それらの「ハブ」が細胞中で、それら自体又はそれらの機能的な拮抗物のいずれかの発現を単に抑制することにより主要又は副次的な機能のいずれかを発揮し得ることを確保するように作動し得る。したがって、１つの遺伝子産物は、１つの細胞のタイプにおける、１つのシグナリング経路のための主要な「ハブ」として機能し得、及び別の細胞タイプにおいて、それは、副次的な「ハブ」であり得、又は全く使用され得ない。この場合、「ハブ」遺伝子発現のマイクロＲＮＡ制御は、異なるタイプの細胞作動モダリティについての主要又は副次的な「ハブ」として機能し、又は全く機能しない種々の分子についてのそのような多用途性を提供するための適切な機序であり得る。
遺伝子調節における、並びに多くの生理学的及び病理学的プロセスにおけるｍｉＲＮＡの役割を考慮すると、それらの相互作用方式及びそれらの発現パターンに関する情報を入手することが望ましい。推定ｍｉＲＮＡのどの群が特定の細胞タイプにおいて作動中であるか、又は特定のプロセス若しくは目的の病態と関連するかを定量し、同定するシステム及び方法は、どのようにそれぞれの細胞状態が進化し、維持されるか、及びどのように維持機能不全がキー遺伝子の発現を調節するｍｉＲＮＡのユニークセットの不適切な減少又は増加により推進されるかの理解に有用な情報を提供し得る。このような理解は、多数の障害、例として、癌の診断及び特徴付けにおいて有用であることを証明し得る。
血液及び他の体液、例えば、乳汁、血液、血清、血漿、腹水、嚢胞液、胸膜液、腹腔液、脳脊髄液、涙液、尿、唾液、痰中のｍｉＲＮＡのレベルは、変更された病状、生理学的機序及び組織損傷に応答して変化することが公知である。腫瘍細胞はｍｉＲＮＡを循環中に放出すること及び腫瘍発現ｍｉＲＮＡの血液レベルは癌を有する患者及び健常対象間で正確に区別することができることが実証されている。
まとめると、ｍｉＲＮＡは、癌発症及び進行における異なる役割を有し、腫瘍抑制因子又は癌遺伝子並びに腫瘍転移のキー活性化因子又は抑制因子として作用する。ｍｉＲＮＡ及びそれらの標的エフェクターのバリエーションは、細胞表現型及び疾患感受性に影響し得る。したがって、黒色腫における機能不全ｍｉＲＮＡ発現のパターンの同定は、黒色腫診断、疾患予後診断及び治療応答のモニタリングのための新規バイオマーカーを同定するための有価な情報を提供する。
ｍｉＲＮＡ命名
本明細書において使用される、ｍｉＲＮＡ命名の番号付与は、例を使用して以下のとおりである：hsa-mir-121:最初の３文字は生物、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）を意味する。mir-121は、成熟ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ遺伝子及びさらには初期転写産物の予測ステムループ部分を指す。同一の成熟配列を発現する区別される前駆体配列及びゲノム遺伝子座は、hsa-mir-121-1及びhsa-mir-121-2の形態の名称を得る。文字入り接尾辞は、密接に関連する成熟配列を示し、例えば、hsa-miR-121a及びhsa-miR-121bは、それぞれ前駆体hsa-mir-121a及びhsa-mir-121bから発現される。
ｍｉＲＮＡクローニング研究は、同一の予測前駆体から生じる２つの約２２ｎｔ配列のｍｉＲＮＡを同定することがある。どれが優勢的に発現されるｍｉＲＮＡを相対的存在量が明らかに示す場合、成熟配列は、miR-56(優勢産物)及びmiR-56*(前駆体の逆側アームから)形態の名称を割り当てられる。どの配列が優勢的なものであるかを決定するためにデータが十分でない場合、miR-142-5p(５’アームから)及びmiR-142-3p(３’アームから)などの名称になる。旧型の慣習は、miR-142-s及びmiR-142-asを使用したことがある。
これらの見識に合致しないｍｉＲＮＡは、一部の場合、再命名されている。しかしながら、適応されるこれらの規則のいくつかの公開された例外が存在する。例えば、異なる生物は、わずかに異なる命名慣習を有し、植物において、公開名称は、MIR121形態のものである。ウイルスｍｉＲＮＡも、わずかに異なる命名スキームを採用する。
miRBaseは、公開ｍｉＲＮＡ配列及びアノテーションの検索可能なデータベース(www.mirbase.org)である。それぞれのmiRBase配列エントリーは、名称又はＩＤに加えてユニークアクセッション番号を有する。アクセッション番号は、エントリーについての唯一の真に安定的な識別因子であり、ｍｉＲＮＡ名は、配列間の関係が明らかになる時に公開されたものから変化し得る。アクセッション化されたシステムの利点は、そのような変化をデータベース中で追跡することができることであり、名称が一致したままで進化することを可能とする一方、使用者にデータ及び履歴への十分なアクセスを提供する。
ｍｉＲＮＡ黒色腫バイオマーカー
・黒色腫の存在若しくは不存在及び／又は
・黒色腫の病期分類／予後診断及び／又は
・黒色腫の治療のモニタリング
の決定において有用な、生物試料中で発現される遺伝子分類器としてのユニークなｍｉＲＮＡのコレクションが、提供される。
本発明において有用なｍｉＲＮＡは、表１、２及び３に同定される。これらのｍｉＲＮＡは、対象が黒色腫を有するか否か、黒色腫の病期及び／又は対象における黒色腫の治療のモニタリングを決定するための予測値を有するとして同定される。これらの発現は、黒色腫の存在並びに／又は治療及び／若しくは薬剤、より具体的には、黒色腫の外科的切除及び／若しくはＤＮＡ損傷治療剤に対する応答と相関する。
ｍｉＲＮＡの表
分類モデルを使用するｍｉＲＮＡ発現の計測
種々の方法が、ｍｉＲＮＡを同定し、疾患を診断する試行において利用されてきた。核酸マーカーについて、それらとしては、ｍＲＮＡ発現プロファイル、マイクロＲＮＡプロファイル、ＦＩＳＨ、遺伝子発現連鎖分析（ＳＡＧＥ）、メチル化プロファイル、遺伝子発現アレイ、及びシーケンシング法（例えば、ＮＧＳ）が挙げられる。
発現レベル
本文脈において、「マイクロＲＮＡの発現のレベル」及び「マイクロＲＮＡのレベル」という用語は、試料中で検出される「規定のマイクロＲＮＡの量」の尺度として同義的に使用される。「発現」という用語は、絶対的又は相対的計測値のいずれかで表現することができ、定量的及び定性的方法の両方により得られる値を指す。
「発現レベル」という用語は、規定の疾患を罹患する対象において、正常対象におけるその発現と比べて、又は特定の治療法に異なって応答し、若しくは異なる予後診断を有する患者におけるその発現と比べて高い又は低いレベルに発現が活性化されるｍｉＲＮＡを指す。この用語は、同一の疾患の異なる病期においてより高い又は低いレベルに発現が活性化されるｍｉＲＮＡも含む。示差的に発現されるｍｉＲＮＡは、核酸レベル若しくはＲＮＡレベルにおいて活性化若しくは阻害され得、又は異なるＲＮＡ産物をもたらす選択的スプライシングに供され得ることも理解される。
ｍｉＲＮＡ「発現レベル」は、２つ以上のｍｉＲＮＡ若しくはそれらの遺伝子産物間の発現の比較；又は２つ以上のｍｉＲＮＡ若しくはそれらのｍｉＲＮＡ産物間の発現の比の比較；又はさらには同一遺伝子の２つの異なってプロセシングされた産物（正常対象及び疾患を罹患する対象間で、又は同一疾患の種々の病期間で異なる）の比較を含み得る。ｍｉＲＮＡ発現レベルは、例えば、正常及び疾患細胞のうち、又は異なる疾患イベント若しくは病期を受けた細胞のうち、ｍｉＲＮＡの時間的又は細胞発現パターンの定量的、及び定性的な差の両方を含む。
定量の１つの手法は、実施例に記載されており、すなわち、NanoString nCounter Analysis Systemである。Nanostringは、分子を直接計数することにより核酸含有量を計測する無増幅技術である。しかしながら、ｍｉＲＮＡは、多数の他の手法で、例えば、マイクロアレイ、次世代シーケンシング、ｑＲＴ－ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、ノザンブロット、ドットブロット、ＲＮアーゼ保護アッセイ、定量的質量分析又は種々の定量的ＰＣＲベース法、例えば、実施例において使用されるTaqManアッセイ若しくはUniRTアッセイにより定量することができる。
ある例の実施形態において、表１及び／又は２及び／又は３に引用されるｍｉＲＮＡの全部又は一部を分類スコア、病期分類スコア及び／又はｍｉＲＮＡ発現シグネチャーにおいて使用することができる。例えば、表１、２又は３のｍｉＲＮＡを含む分類スコア、病期分類スコア及び／又はｍｉＲＮＡ発現シグネチャーは、本明細書に提供される方法を使用して生成することができ、表１、２又は３に記載のマーカーの１つ、及び全ての間並びにそれらの間のあらゆる組合せを含み得る（例えば、１７個の選択マーカー、１８個の選択マーカー、２２個の選択マーカー、２８個の選択マーカー、３２個の選択マーカー、３８個の選択マーカー、４８個の選択マーカーなど）。一部の実施形態において、発現シグネチャーは、少なくとも１７、１８、２０、２２、２８、３０、３８、４０、又は４８個のマーカーを含む。他の実施形態において、発現シグネチャーは、１７、１８、２０、２２、２８、３０、３８、４０、又は４８個以下のマーカーを含む。一例の実施形態において、分類スコア、病期分類スコア及び／又はｍｉＲＮＡ発現シグネチャーは、表１、２又は３に列記される複数のマーカーを含む。一部の実施形態において、発現シグネチャーは、表１、２又は３に列記されるマーカーの少なくとも約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％を含む。選択される分類スコア、病期分類スコア及び／又はｍｉＲＮＡ発現シグネチャーは、本明細書に記載の方法及び当分野において公知の同様の方法を使用して提供されるｍｉＲＮＡからアセンブルすることができる。一実施形態において、分類スコア、病期分類スコア及び／又はｍｉＲＮＡ発現シグネチャーは、表１、２又は３の全てのｍｉＲＮＡを含有する。好ましいｍｉＲＮＡは、
（ａ）hsa-miR-424-5p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-337-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-431-5p、hsa-miR-4532、hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-1258、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-450a-5p、hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-548ad-3p、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-4787-3p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-522-3p、hsa-miR-1269a、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-553、hsa-miR-3131、hsa-miR-1264、hsa-miR-764、hsa-miR-3928-3p、hsa-miR-548l、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-1973、hsa-miR-624-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-1-5p、hsa-miR-1302；
（ｂ）hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-337-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-652-3p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-105-5p、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-521、hsa-miR-4787-3p、hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-3127-5p
（ｃ）hsa-miR-1258、hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-4532、hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-1302、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p、hsa-miR-1264、hsa-miR-154-5p及びhsa-miR-431-5p
である。
他の実施形態において、さらなるマーカーを使用して分類スコア、病期分類スコア及び／又はｍｉＲＮＡ発現シグネチャーの精度を改善することができる。ある例の実施形態において、表１、２又は３のｍｉＲＮＡを含む分類スコア、病期分類スコア及び／又はｍｉＲＮＡ発現シグネチャーは、本明細書に提供される方法を使用して生成することができ、表１、２又は３に記載のマーカーの全て並びに最大８００個のマーカーのそれぞれの及びさらなるマーカーを含み得る。一部の実施形態において、発現シグネチャーは、少なくとも４８、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０又は８００個のマーカーを含む。一部の実施形態において、発現シグネチャーは、表１、２又は３に列記されるマーカーの少なくとも約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％を含む。選択される分類スコア、病期分類スコア及び／又はｍｉＲＮＡ発現シグネチャーは、本明細書に記載の方法及び当分野において公知の同様の方法を使用して提供されるｍｉＲＮＡからアセンブルすることができる。
データセット
「データセット」という用語は、無細胞血漿からＲＮＡを単離し、Nanostring nCounter遺伝子発現分析を実施することにより生成された８００個のマイクロＲＮＡ遺伝子発現値と比較した個々の患者のＲＮＡの行列を指す。対照は、障害を有さない対象からの少なくとも１つのｍｉＲＮＡ遺伝子産物のレベルである。データセットのサイズは、遺伝子のタイプ及び分析される患者に応じて変動する。関連因子としては、技術プラットフォームの感度並びに病態又は病状間の遺伝子発現の差の尺度及び一致度が挙げられる。
分類スコアの計測
数学的モデル
ｍｉＲＮＡ発現分類スコアの作出
患者訓練セットデータは、好ましくは、診断、病期、予後診断、再発の見込み、長期生存率、臨床アウトカム、治療応答、癌分類及び遺伝子又は分子状態により特徴付けされた組織試料に由来する。患者試料からの発現プロファイル、及び対応する決定スコアは、数学的に導出されたスコア決定閾値の同側上の訓練セット中の患者試料の特徴と相関付けすることができる。分類器スカラー出力の閾値は、訓練データセット内で観察される交差検証下で感度及び特異度の合計を最大化するように最適化される。
黒色腫病期分類
黒色腫進行は、以下の臨床病期分類を使用して分類される：
●０期：黒色腫は、皮膚の上層（上皮）中の細胞に限定され、より深い層（真皮）に侵入していない。これは、上皮内黒色腫としても公知である。
○治療：外科的切除
●１期：黒色腫は、２つの手法で定義することができる：２ｍｍで潰瘍形成も、転移も、リンパ節転移もなし；又は最大１ｍｍで潰瘍形成があるが、転移もリンパ節転移もない。
○治療：外科的切除。黒色腫が１～４ｍｍ厚であり、及び／又は急速な成長の徴候を示す場合には隣接リンパ節の切除も考慮することができる。
●２期：黒色腫は、厚さ及び潰瘍形成により定義される。リンパ節転移も器官への拡散もない。
○治療：外科的切除が主な治療であるが、隣接リンパ節の切除も、さらなる拡散を予防する治療選択である。薬物治療又は放射線も、癌再発のリスクを低下させるために要求され得る。
●３期：黒色腫は任意の厚さであり得、リンパ節が転移されている。
○治療：リンパ節の外科的切除が通常要求される。薬物治療及び放射線も考慮することができる。
●４期：黒色腫は任意の厚さであり得、遠位リンパ節及び器官、例えば、肺、肝臓、脳又は骨に拡散している。
○治療：全身薬物療法、例として、免疫療法、化学療法及び標的療法。症状を緩和するために外科手術及び放射線も使用することができる。
黒色腫の病期の決定は、対象が本発明の方法に従って黒色腫と診断された後、又は対象が診断される前に実施することができ、但し、病期分類を表３からの少なくとも１つのｍｉＲＮＡ（Mel18）の存在に従って決定することを条件とする。
病期分類スコアの計測
Mel18（表３）病期分類シグネチャー中の遺伝子を使用してロジスティック回帰、多クラスアルゴリズム（Ｉ対ＩＩ対ＩＩＩ対ＩＶ）、例えば、ＫＮＮ、最近傍セントロイド又はＳＶＭ、又は二分決定木法（例えば、Ｉ対４、４対３、１対２、３対３）などの方法により個体の黒色腫進行の病期を評価することができる。
疾患の状態のモニタリング
好ましい方法は、黒色腫発症を診断する目的のためにｍｉＲＮＡの発現を検出することであるが、例えば、黒色腫病態のモジュレートを対象とする治療的、アジュバント又は予防的治療の有効性をモニタリングするために前記ｍｉＲＮＡのレベルの逆の変化の検出がある状況下で望ましい場合がある。
したがって、本発明の方法は、黒色腫発症のリスクがあると考えられる個体の１回限りの試験として、若しくは継続モニターとして、並びに／又は黒色腫発症の阻害若しくはそうでなければ減速を対象とする治療的及び／若しくは予防的治療レジメの有効性のモニターとして有用である。これらの状況において、生物試料の任意の１つ以上のクラスにおけるｍｉＲＮＡ発現レベルのモジュレーションのマッピングは、個体の状態並びに／又は現在使用中の治療的及び／若しくは予防的レジメの有効性の有価な指標因子である。したがって、本発明の方法は、分類スコアの値に基づく対象における黒色腫の状態のモニタリング及び事前の分類スコアとの比較まで及ぶと理解すべきである。
治療応答のモニタリング
黒色腫発症の阻害又はそうでなければ減速を対象とする治療的又は予防的治療レジメの有効性のモニタリングにおいて、ｍｉＲＮＡ発現レベルのモジュレーションを評価することができる。例えば、対象の個々の病態の改善の逆の又は他の形態を示すために利用することができる治療レジメの開始に続く分類スコアのスクリーニング。逆に、ｍｉＲＮＡ発現レベルのモジュレーションは、有害黒色腫アウトカムを示す黒色腫の存在及び／又は病期分類の増加及び／又は病期分類の無変化を示し得る。
「有害黒色腫アウトカム」という用語は、黒色腫の存在及び／若しくは疾患進行の増加及び／若しくは患者の病態の無変化を示し得る、治療レジメの開始に続く分類スコアのスクリーニング、分類スコアと事前の分類スコアとの比較並びに／又は他の臨床的評価及びｍｉＲＮＡ発現レベルのモジュレーションの決定を指す。
治療の方法
本明細書において使用される「治療すること」又は「治療」という用語は、本明細書に記載の治療有効量の薬剤及び／又は黒色腫の外科的切除を施与して規定の疾患又は病態の少なくとも１つの症状を軽減し、又は排除することを含む。一実施形態において、本発明の疾患又は病態は、黒色腫である。
任意の疾患又は感染を「治療すること」又はその「治療」という用語は、一実施形態において、疾患又は感染を改善すること（すなわち、疾患又は感染物質若しくは細菌の成長を停止させ、又はその臨床的症状の少なくとも１つの顕在化、程度若しくは重症度を軽減すること）を指す。別の実施形態において、「治療すること」又は「治療」は、少なくとも１つの身体パラメータを改善することを指し、それは対象により認識されなくてよい。さらに別の実施形態において、「治療すること」又は「治療」は、疾患又は感染を身体的に（例えば、認識可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば、身体パラメータの安定化）又はその両方でモジュレートすることを指す。さらなる実施形態において、「治療すること」又は「治療」は、疾患の進行を減速させ、又は感染を軽減することに関する。
薬剤／治療薬
「薬剤」という用語は、任意の分子、例として、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、化合物及び小分子を意味する。特に、薬剤という用語は、化合物、例えば、試験化合物又は薬物候補化合物を含む。
ｍｉＲＮＡ遺伝子発現の阻害に好適な化合物としては、二本鎖ＲＮＡ（例えば、短鎖又は小分子干渉ＲＮＡ又は「ｓｉＲＮＡ」）、アンチセンス核酸、アンタゴニストマイクロＲＮＡ、例えば、アンタゴｍｉｒ、及び酵素ＲＮＡ分子、例えば、リボザイムが挙げられる。これらの化合物のそれぞれは、所与のｍｉＲＮＡ遺伝子産物に標的化させ、標的ｍｉＲＮＡ遺伝子産物の発現を妨害する（例えば、その翻訳を阻害し、その開裂又は破壊を誘導する）ことができる。
例えば、所与のｍｉＲＮＡ遺伝子の発現は、ｍｉＲＮＡ遺伝子産物の少なくとも一部と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列相同性を有する単離二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子によるｍｉＲＮＡ遺伝子のＲＮＡ干渉を誘導することにより阻害することができる。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子は、短鎖又は小分子干渉ＲＮＡ又はｓｉＲＮＡである。本方法において有用なｓｉＲＮＡは、約１７ヌクレオチド～約２９ヌクレオチド長、好ましくは、約１９～約２５ヌクレオチド長の短鎖二本鎖ＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡは、標準的なワトソンクリック塩基対合相互作用（以下、「塩基対合」）により、一緒にアニールされたセンスＲＮＡ鎖及び相補的アンチセンスＲＮＡ鎖を含む。センス鎖は、標的ｍｉＲＮＡ遺伝子産物内に含有される核酸配列と実質的に同一である核酸配列を含む。
本明細書において使用されるアンタゴｍｉｒ又は「アンタゴニストマイクロＲＮＡ」は、相補性及びハイブリダイゼーションに基づきｍｉＲＮＡ機能をアンタゴナイズするために使用される遺伝子操作オリゴヌクレオチド（化学的修飾と一緒の場合もある）を指す。
本明細書において使用される、標的ｍＲＮＡ内に含有される標的配列と「実質的に同一である」ｓｉＲＮＡ中の核酸配列は、標的配列と同一であり、又は１若しくは２つのヌクレオチドだけ標的配列と異なる核酸配列である。ｓｉＲＮＡのセンス及びアンチセンス鎖は、２つの相補的一本鎖ＲＮＡ分子を含み得、又は２つの相補的部分が塩基対合しており、一本鎖「ヘアピン」区域により共有結合している単一分子を含み得る。
所与のｍｉＲＮＡ遺伝子の発現は、アンチセンス核酸により阻害することもできる。本明細書において使用される「アンチセンス核酸」は、標的ＲＮＡの活性を変更する、ＲＮＡ－ＲＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡ又はＲＮＡペプチド核酸相互作用により標的ＲＮＡに結合する核酸分子を指す。本方法における使用に好適なアンチセンス核酸は、一般に、ｍｉＲＮＡ遺伝子産物中の連続核酸配列に相補的である核酸配列を含む一本鎖核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡキメラ、ペプチド核酸（ＰＮＡ））である。アンチセンス核酸は、ｍｉＲＮＡ遺伝子産物中の連続核酸配列に５０～１００％相補的、７５～１００％相補的、又は９５～１００％相補的である核酸配列を含み得る。いかなる理論によっても拘束されるものではないが、アンチセンス核酸は、ＲＮアーゼＨ又はｍｉＲＮＡ遺伝子産物／アンチセンス核酸二本鎖を消化する別の細胞ヌクレアーゼを活性化させることが考えられる。
所与のｍｉＲＮＡ遺伝子の発現は、酵素核酸により阻害することもできる。本明細書において使用される「酵素核酸」は、ｍｉＲＮＡ遺伝子産物の連続核酸配列に対する相補性を有する基質結合領域を含み、ｍｉＲＮＡ遺伝子産物を特異的に開裂させ得る核酸を指す。酵素核酸基質結合領域は、例えば、ｍｉＲＮＡ遺伝子産物中の連続核酸配列に５０～１００％相補的、７５～１００％相補的、又は９５～１００％相補的であり得る。酵素核酸は、塩基、糖、及び／又はリン酸基における修飾も含み得る。本方法における使用のための例示的な酵素核酸は、リボザイムである。
「治療有効量」は、医師又は他の臨床従事者により求められている対象の生物学的又は医学的応答を誘発する薬物、化合物、抗菌薬、抗体、又は医薬剤の量を意味する。特に、黒色腫に関して、「有効量」という用語は、前記対象における少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを改変する化合物又は薬剤の有効量を含むものとする。
一実施形態において、本発明は、対象における黒色腫を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の薬剤を投与することを含み、前記薬剤は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを直接的又は間接的に改変し、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、
hsa-miR-424-5p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-337-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-431-5p、hsa-miR-4532、hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-1258、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-450a-5p、hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-548ad-3p、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-4787-3p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-522-3p、hsa-miR-1269a、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-553、hsa-miR-3131、hsa-miR-1264、hsa-miR-764、hsa-miR-3928-3p、hsa-miR-548l、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-1973、hsa-miR-624-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-1-5p、hsa-miR-1302、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-660-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-652-3p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-105-5p、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-521、hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-3127-5p
から選択される方法を提供する。
一実施形態において、対象における黒色腫を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の薬剤を投与することを含み、前記薬剤は、ｍｉＲＮＡの発現レベルを直接的又は間接的に改変し、前記ｍｉＲＮＡは、
hsa-miR-424-5p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-337-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-431-5p、hsa-miR-4532、hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-1258、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-450a-5p、hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-548ad-3p、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-4787-3p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-522-3p、hsa-miR-1269a、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-553、hsa-miR-3131、hsa-miR-1264、hsa-miR-764、hsa-miR-3928-3p、hsa-miR-548l、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-1973、hsa-miR-624-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-1-5p、hsa-miR-1302
からなる方法。
一実施形態において、対象における黒色腫を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の薬剤を投与することを含み、前記薬剤は、ｍｉＲＮＡの発現レベルを直接的又は間接的に改変し、前記ｍｉＲＮＡは、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-337-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-652-3p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-105-5p、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-521、hsa-miR-4787-3p、hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-3127-5p
からなる方法。
一実施形態において、対象における黒色腫を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の薬剤を投与することを含み、前記薬剤は、ｍｉＲＮＡの発現レベルを直接的又は間接的に改変し、前記ｍｉＲＮＡは、
hsa-miR-1258、hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-4532、hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-1302、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p、hsa-miR-1264、hsa-miR-154-5p及びhsa-miR-431-5p
からなる方法。
別の実施形態において、前記薬剤は、以下の１つ以上：
（ｉ）ｓｉＲＮＡ
（ｉｉ）アンチセンス核酸
（ｉｉｉ）アンタゴニストマイクロＲＮＡ、例として、アンタゴｍｉｒ
（ｉｖ）酵素ＲＮＡ分子、例として、リボザイム
（ｖ）ｍｉＲＮＡアゴニスト
（ｖｉ）抗ｍｉＲＮＡ抗体
（ｖｉｉ）アルデスロイキン
（ｖｉｉｉ）コビメチニブ
（ｉｘ）Cotellic（コビメチニブ）
（ｘ）ダブラフェニブ
（ｘｉ）ダカルバジン
（ｘｉｉ）DTIC-Dome（ダカルバジン）
（ｘｉｉｉ）ＩＬ－２（アルデスロイキン）
（ｘｉｖ）Imlygic（タリモジーン・ラヘルパレプベク）
（ｘｖ）インターロイキン－２(アルデスロイキン)
（ｘｖｉ）Intron A（組換えインターフェロンアルファ－２ｂ）
（ｘｖｉｉ）イピリムマブ
（ｘｖｉｉｉ）Keytruda（ペムブロリズマブ）
（ｘｉｘ）Mekinist（トラメチニブ）
（ｘｘ）ニボルマブ
（ｘｘｉ）Opdivo（ニボルマブ）
（ｘｘｉｉ）ペグインターフェロンアルファ－２ｂ
（ｘｘｉｉｉ）PEG-Intron（ペグインターフェロンアルファ－２ｂ）
（ｘｘｉｖ）ペムブロリズマブ
（ｘｘｖ）Proleukin（アルデスロイキン）
（ｘｘｖｉ）組換えインターフェロンアルファ－２ｂ
（ｘｘｖｉｉ）Sylatron（ペグインターフェロンアルファ－２ｂ）
（ｘｘｖｉｉｉ）Tafinlar（ダブラフェニブ）
（ｘｘｉｘ）タリモジーン・ラヘルパレプベク
（ｘｘｘ）トラメチニブ
（ｘｘｘｉ）ベムラフェニブ
（ｘｘｘｉｉ）Yervoy（イピリムマブ）
（ｘｘｘｉｉｉ）Zelboraf（ベムラフェニブ）
である。
さらなる実施形態において、本発明は、黒色腫の治療において有効な医薬品の製造のための、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを直接的又は間接的に改変する薬剤の使用であって、前記少なくとも１つのマイクロＲＮＡは、
hsa-miR-424-5p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-337-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-431-5p、hsa-miR-4532、hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-1258、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-450a-5p、hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-548ad-3p、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-4787-3p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-522-3p、hsa-miR-1269a、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-553、hsa-miR-3131、hsa-miR-1264、hsa-miR-764、hsa-miR-3928-3p、hsa-miR-548l、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-1973、hsa-miR-624-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-1-5p、hsa-miR-1302、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-660-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-652-3p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-105-5p、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-521、hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-3127-5p
から選択される使用を提供する。
一実施形態において、ｍｉＲＮＡの発現レベルを直接的又は間接的に改変する薬剤の使用であって、前記ｍｉＲＮＡは、
hsa-miR-424-5p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-337-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-431-5p、hsa-miR-4532、hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-1258、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-450a-5p、hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-548ad-3p、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-4787-3p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-522-3p、hsa-miR-1269a、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-553、hsa-miR-3131、hsa-miR-1264、hsa-miR-764、hsa-miR-3928-3p、hsa-miR-548l、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-1973、hsa-miR-624-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-1-5p、hsa-miR-1302
からなる使用。
一実施形態において、ｍｉＲＮＡの発現レベルを直接的又は間接的に改変する薬剤の使用であって、前記ｍｉＲＮＡは、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-337-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-652-3p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-105-5p、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-521、hsa-miR-4787-3p、hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-3127-5p
からなる使用。
一実施形態において、ｍｉＲＮＡの発現レベルを直接的又は間接的に改変する薬剤の使用であって、前記ｍｉＲＮＡは、
hsa-miR-1258、hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-4532、hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-1302、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p、hsa-miR-1264、hsa-miR-154-5p及びhsa-miR-431-5p
からなる使用。
再燃又は再発
黒色腫は、それが治療された後に再び生じる場合、再燃又は再発と呼ばれる。再発性黒色腫は、局所的に（元の原発性黒色腫腫瘍の部位又はその付近に）、又は身体の別の部分に現れ得る。黒色腫は、それが最初に治療されてから１０年を超えるほど多くの年数の後に再び生じ得る。これは、最初の原発性黒色腫と無関連である新たな原発性黒色腫の発症と同一でない。
本発明は、既に黒色腫と診断された対象における再燃又は再発について黒色腫の状態をモニタリングする方法であって、
（ｉ）生物試料中のマイクロＲＮＡ発現レベルを検出すること、
（ｉｉ）前記マイクロＲＮＡの発現レベルを含むデータセットからの１つ以上のアルゴリズムに基づき生物試料の分類スコア（ＣＳ）を算出すること、及び
（ｉｉｉ）分類スコアの値に基づき生物を黒色腫として、又は黒色腫でないとして分類し、黒色腫を有する者と有さない者とを分ける既に決定された分類閾値と比較すること
を含み、
マイクロＲＮＡは、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-152-3p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-1537-3p、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-154-5p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-1-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-181b-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-1910-5p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-1973、
hsa-miR-1302、hsa-miR-199b-5p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-205-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-219a-2-3p、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-3127-5p. hsa-miR-521、
hsa-miR-3131、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-331-3p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-337-5p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-3928-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-424-5p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-431-5p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-450a-5p、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-4532、hsa-miR-764
から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡを含む方法を提供する。
一実施形態において、前記マイクロＲＮＡは、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-205-5p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-219a-2-3p、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-2682-5p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-27a-3p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-299-3p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-301a-3p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-3131、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-1973、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-497-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-521、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-522-3p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-548ad-3p、hsa-miR-764
からなる。
さらなる実施形態において、前記マイクロＲＮＡは、
hsa-miR-1258、hsa-miR-3131、
hsa-miR-1264、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-764
からなる。
さらに別の実施形態において、前記マイクロＲＮＡは、
hsa-miR-1258、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p
hsa-miR-299-3p
からなる。
検出方法：キット／アレイ
マイクロＲＮＡプロファイリングのためのプラットフォーム
新規遺伝子試験の開発における重要な因子は、標的目的遺伝子についての高い感度及び特異度を提供する検出技術の選択である。臨床状況において、プラットフォームは自動化可能であるべきであり、複数の試料を並行して分析し得る。任意選択としては、
（ｉ）長きにわたり「ゴールドスタンダード」と考えられ、アッセイに使用される定量的リアルタイム若しくはデジタルドロップレットＰＣＲ、例えば、Oncotype DX（Genomic Health, Redwood CA）；
（ｉｉ）アレイベース法、例えば、Agilent又はAffymetrixマイクロアレイ（MammaPrint（Agendia,Irvine CA）に使用されるもの及びMyPRSアッセイ（Signal Genetics, San Diego,CA）
（ｉｉｉ）遺伝子存在量の計数ベース計測値を生成する方法、例えば、RNA-seq（例えば、Illumina, CA）及びnCounter（Nanostring, WA）
（ｉｖ）又はマイクロＲＮＡ若しくは次世代シーケンシング実験における短鎖ＲＮＡの分析に一般に使用される試料分析のための資源の検出のための固定化プローブ
が挙げられる。
「Ｑ－ＰＣＲ」又は「ｑ－ＰＣＲ」という用語は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を指す。Ｑ－ＰＣＲは、試験試料中の規定のＤＮＡ（及びＲＮＡ）種の量を定量する高感度法である。ＰＣＲ技術によるＲＮＡの定量はＲＮＡを逆転写させることを要求するため、それは、定量的ＰＣＲを使用して規定のＲＮＡを定量することを示すために「ｑＲＴ－ＰＣＲ」又は「ＲＴ－Ｑ－ＰＣＲ」として称されることが多い。Ｑ－ＰＣＲ及びｑＲＴ－ＰＣＲ技術の詳細な説明は、参照により本明細書に組み込まれるBustin, S. A. (ed.) A-Z of quantitative PCR, IUL Biotechnology Series 5 (2004) 882 pagesに見出すことができる。
本明細書において使用される「プライマー」という用語は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成を誘導する条件下、すなわち、ヌクレオチド及び誘導剤、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で好適な温度及びｐＨにおいて配置された場合に合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを指し、精製制限消化物におけるような天然存在であるか合成により産生されるかを問わない。プライマーは、一本鎖又は二本鎖のいずれでもよく、誘導剤の存在下で所望の伸長産物の合成をプライミングするのに十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、多くの因子、例として、温度、プライマー源及び方法の使用に依存する。例えば、予後診断又は診断用途のため、標的配列の複雑性に応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、１５～２５個以上のヌクレオチドを含有するが、それはより少ないヌクレオチドを含有し得る。
本明細書におけるプライマーは、特定の標的ＤＮＡ配列の異なる鎖に「実質的に」相補的であるように選択される。これは、プライマーがそれらのそれぞれの鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを意味する。したがって、プライマー配列は、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片がプライマーの５’末端に付着していてよく、プライマー配列の残部が鎖に相補的である。或いは、非相補的塩基又はより長い配列がプライマー中に散在していてよく、但し、プライマー配列がそれとハイブリダイズし、それにより伸長産物の合成のためのテンプレートを形成するために鎖の配列と十分な相補性を有することを条件とする。
本明細書において使用される「生物試料」は、ｍｉＲＮＡを含む生物組織又は体液の試料を意味し得る。このような試料としては、血液、血漿又は血清である体液、特に血漿が挙げられる。このような試料としては、限定されるものではないが、動物から単離された組織が挙げられる。生物試料としては、組織の切片、例えば、生検物及びオートプシー試料、組織学的目的のために採取された冷凍切片、血液、血漿、血清、痰、糞便、粘液、尿、浸出液、羊水、腹水、毛髪、及び皮膚を挙げることもできる。生物試料としては、外植片並びに患者組織に由来する初代及び／又は形質転換細胞培養物も挙げられる。生物試料は、動物から細胞の試料を取り出すことにより提供することができるが、既に単離された細胞（例えば、別の者により、別の時点において、及び／又は別の目的のために単離されたもの）を使用することにより、又はインビボで本明細書に記載の方法を実施することにより達成することもできる。保管組織、例えば、治療歴又はアウトカム歴を有するものを使用することもできる。
本明細書において使用される「対象」という用語は、任意の動物であり得る。一例において、動物は、脊椎動物である。例えば、動物は、哺乳動物、鳥類、節足動物、脊索動物、両生類又は爬虫類であり得る。例示的な対象としては、限定されるものではないが、ヒト、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、ウシ、ニワトリ、ウマ、ロバ、ブタ）、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ）、実験試験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲野生動物（例えば、キツネ、シカ）が挙げられる。一例において、哺乳動物は、ヒトである。
一実施形態において、本発明は、分子アレイであって、複数の
（ｉ）表１に列記されるマイクロＲＮＡのいずれか１つ以上に対応するヌクレオチド配列若しくはそれと少なくとも８０％の同一性を示す配列を含む核酸分子又は前記核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント若しくはホモログ；又は
（ｉｉ）中程度のストリンジェンシー条件下で（ｉ）の配列のいずれか１つ以上にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む核酸分子又は前記核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント若しくはホモログ；又は
（ｉｉｉ）中程度のストリンジェンシー条件下で（ｉ）の配列のいずれか１つ以上にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む核酸プローブ若しくはオリゴヌクレオチド又は前記核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント若しくはホモログ
を含み、
（ｉ）～（ｉｉｉ）の前記マイクロＲＮＡの発現のレベルを使用して対象における黒色腫の存在若しくは不存在を示す分類スコア（ＣＳ）又は対象における黒色腫の病期を示す病期分類スコア（ＳＳ）を算出する分子アレイを提供する。
好ましくは、前記同一性の割合は、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。
低ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションのための少なくとも約１％ｖ／ｖ～少なくとも約１５％ｖ／ｖのホルムアルデヒド及び少なくとも約１Ｍ～少なくとも約２Ｍの塩、並びに洗浄条件のための少なくとも約１Ｍ～少なくとも約２Ｍの塩を含み、包含する。必要により代替的ストリンジェンシー条件、例えば、ハイブリダイゼーションのための少なくとも約１６％ｖ／ｖ～少なくとも約３０％ｖ／ｖのホルムアルデヒド及び少なくとも約０．５Ｍ～少なくとも約０．９Ｍの塩、並びに洗浄条件のための少なくとも約０．５Ｍ～少なくとも約０．９Ｍの塩を含み、包含する中程度のストリンジェンシー、又はハイブリダイゼーションのための少なくとも約３１％ｖ／ｖ～少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアルデヒド及び少なくとも約０．０１Ｍ～少なくとも約０．１５Ｍの塩、並びに洗浄条件のための少なくとも約０．０１Ｍ～少なくとも約０．１５Ｍの塩を含み、包含する高ストリンジェンシーを適用することができる。一般に、洗浄は、Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％［１９］＝－１２℃において実施される。しかしながら、二本鎖ＤＮＡのＴｍは、ミスマッチ塩基対の数が１％増加するごとに１℃だけ減少する(Bonner et al (1973) J. MoI. Biol. 81 : 123)。
一実施形態において、本発明は、黒色腫の診断の評価、病期の評価並びに提案治療に対する対象及び／又は疾患感受性の評価のための診断キットであって、
（ａ）少なくとも１つの「フォワード」増幅プライマー；
（ｂ）少なくとも１つの「リバース」増幅プライマー；及び
（ｃ）マイクロＲＮＡの捕捉及び／若しくは検出のための少なくとも１つのプローブ又は
（ｄ）マイクロＲＮＡ若しくは次世代シーケンシング実験における短鎖ＲＮＡの分析に一般に使用される試料分析のための資源の検出のための（１つ以上の）固定化プローブ
を含み、プライマーは、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-138-5p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-152-3p、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-1537-3p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-154-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-1-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-181b-5p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-1910-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-1973、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-199b-5p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-521、
hsa-miR-3127-5p. hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-3131、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-331-3p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-337-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-553、
hsa-miR-3928-3p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-424-5p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-431-5p、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-450a-5p、hsa-miR-764
から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡのヌクレオチド配列の特異的増幅を可能とするように設計される診断キットを提供する。
一実施形態において、前記マイクロＲＮＡは、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-199b-5p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-205-5p、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-219a-2-3p、
hsa-miR-1258、hsa-miR-2682-5p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-27a-3p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-299-3p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-301a-3p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-3131、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-4532、
hsa-miR-454-3p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-4787-3p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-497-5p、hsa-miR-553、
hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-521、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-522-3p、hsa-miR-660-5p、
hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-764
からなる。
さらなる実施形態において、前記マイクロＲＮＡは、
hsa-miR-1258、hsa-miR-3131、
hsa-miR-1264、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1269a、hsa-miR-34a-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-3928-3p、
hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-424-5p、
hsa-miR-138-5p、hsa-miR-431-5p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-450a-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-1-5p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-520d-3p、
hsa-miR-1973、hsa-miR-522-3p、
hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p、
hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-548l、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-553、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-624-3p、
hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-76
からなる。
さらに別の実施形態において、前記マイクロＲＮＡは、
hsa-miR-1258、hsa-miR-152-3p、
hsa-miR-1264、hsa-miR-154-5p、
hsa-miR-1302、hsa-miR-181b-5p、
hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-4532、
hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-454-3p、
hsa-miR-299-3p、hsa-miR-497-5p、
hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-548a-5p、
hsa-miR-424-5p、hsa-miR-548ad-3p
hsa-miR-431-5p
からなる。
別の実施形態において、前記マイクロＲＮＡは、
hsa-let-7e-5p、hsa-miR-299-3p、
hsa-miR-105-5p、hsa-miR-301a-3p、
hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-3127-5p、
hsa-miR-127-5p、hsa-miR-331-3p、
hsa-miR-152-3p、hsa-miR-337-5p、
hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4787-3p、
hsa-miR-154-5p、hsa-miR-521、
hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-652-3p、
hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-660
からなる。
一実施形態において、対象は、ヒトである。
本開示の一実施形態において、捕捉プローブは、アレイ上に固定化されている。「アレイ」は、担体又は基板に付着しているペプチド又は核酸プローブを有する固体担体又は基板を意図する。アレイは、典型的には、異なる既知の位置で基板の表面に結合している複数の異なる捕捉プローブを含む。本開示のアレイは、内在性遺伝子発現産物に特異的に結合し得る複数の捕捉プローブを有する基板を含む。
アレイは、事実上任意の形状の表面又はさらには多数の表面上に制作することができる。アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマー表面、線維、例えば、光ファイバー、ガラス又は任意の他の適切な基板上のプローブ（例えば、核酸結合プローブ）であり得る。アレイは、デバイス上の診断又は他の操作を可能とするようにパッケージングすることができる。
別の実施形態において、キットは、表１、２又は３に列記される内在性遺伝子のそれぞれの検出及び／又は定量に十分なオリゴヌクレオチドプライマーのセットを含む。オリゴヌクレオチドプライマーは、凍結乾燥若しくは再構成形態で提供することができ、又はヌクレオチド配列のセットとして提供することができる。キットは、表１、２又は３に列記される遺伝子からの発現産物の増幅に十分な試薬及び説明書をさらに含み得る。
即時アクセスを容易にするため、例えば、比較、再検討、回収、及び／又は修正のため、分子シグネチャー／発現プロファイルは、典型的には、データベースに記録される。最も典型的には、データベースは、コンピュータデバイスによりアクセス可能なリレーショナルデータベースであるが、他のフォーマット、例えば、手作業によりアクセス可能な発現プロファイルのインデックスファイルを写真、アナログ又はデジタル画像処理読み出し、スプレッドシートなどとして使用することができる。最初に記録される発現パターンが事実上アナログであるかデジタルであるかにかかわらず、発現パターン、発現プロファイル（集合的発現パターン）、及び分子シグネチャー（相関発現パターン）は、デジタル的に保存され、データベースを介してアクセスされる。典型的には、データベースは、中心施設において編集及び維持され、アクセスは局所的に及び／又は遠隔的に利用可能である。
本発明は、以下の非限定的な図面及び実施例を参照することによりさらに記載される。
黒色腫診断
アルゴリズムの作出
データベース作出：試料調製及びマイクロＲＮＡ発現プロファイリング
黒色腫を有する個体を診断するために好適な循環マイクロＲＮＡのパネルを同定するため、悪性黒色腫と診断された３６人の個体及び１２人の正常対照（すなわち、黒色腫を有さない）から０．５～２ｍｌの血漿を得た。本試験において使用された４８人の個体の詳細を表４に提供する。
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control（カタログ番号／ID:219610）を組み込むQIAGEN miRNeasy Serum/Plasma Kit（カタログ番号／ID:217184）を製造業者の推奨に従って使用して無細胞マイクロＲＮＡ精製を実施した。ＲＮＡを１００μｌの水中で溶出させ、２０μｌに濃縮し；３μｌをNanoString Technologies（Seattle, WA, USA）からのマルチプレックス化nCounterプラットフォーム上のプロファイリングに使用した。
nCounter microRNA Assayは、miRBaseからキュレートされた８００個のヒトマイクロＲＮＡを検出する。製造業者の説明書に従って規定のＤＮＡタグ（ｍｉＲタグ）をそれぞれの成熟マイクロＲＮＡの３’末端上にライゲートすることによりＲＮＡ試料を調製した。過剰のタグを３７℃における制限消化により除去した。５μｌのそれぞれのマイクロＲＮＡ－ｍｉＲ－タグ試料をハイブリダイゼーション緩衝液中２０μｌのnCounter Reporterプローブ及び５μｌのnCounter Captureプローブ（３０?μｌの全反応容量のため)と６５℃において１６～２０時間合わせることにより、ハイブリダイゼーションを実施した。nCounter Prep Station上で２ステップ磁気ビーズベース精製を使用して過剰のプローブを除去した。
nCounter Digital Analyzerを使用して、個々の蛍光バーコードを計数し、標的分子を評価することにより、規定の標的分子の存在量を定量した。ＣＣＤカメラを使用して試料カートリッジ中の固定化蛍光レポーターの画像を取得した後にnCounter Digital Analyzerを使用してデータを収集した。
データ処理及び正規化
未加工Nanostring遺伝子カウントを、陰性対照調整によりバックグラウンドノイズについて調整した。それぞれの試料中に存在する出発材料の量の変動を管理するため、データを２つのスパイクインプローブ；cel-miR-254及びosa-miR-414に正規化した。
正常及び黒色腫クラス間の統計的比較のためにデータを調製するため、voom変換を適用した。この方法は、対数カウントの平均分散関係を推定し、それぞれの観察についての正確な重みを生成し、それらを下流の遺伝子選択のためにlimma経験ベイズ分析パイプライン中に入れる。
遺伝子発現分析の経験ベイズ法は、統合推定値に向かう推定試料分散の低減と類似する。これは、特に試料計測値の数がそれぞれにおいて分析される遺伝子の数に対して小さい場合、はるかに安定的なクラス間及びクラス内の発現レベル分散の評価をもたらす。
マイクロＲＮＡシグネチャー１開発：黒色腫対正常対照
voom+limma分析(Law CW, Chen Y, Shi W, Smyth GK:voom: Precision weights unlock linear model analysis tools for RNA-seq read counts. Genome Biol 2014，15(2):R29)を使用して黒色腫患者血漿及び正常対照血漿の遺伝子発現プロファイルを比較した。少なくとも５つの試料において１５の最小の百万当たりのカウント（ＣＰＭ）を有する全ての遺伝子を評価した。このアプローチは、遺伝子発現プロファイルを比較する他の技術、例として、ｔ検定と比較して最小のＦＤＲで真の示差的発現を検出する最も正確な方法をもたらすことを実証した。
正規化されたマイクロＲＮＡ血漿データセット中のそれぞれの遺伝子についての倍率変化、ｐ値及び偽発見率（ＦＤＲ）を算出した。＜０．０１のＦＤＲ及び＞２．０の倍率変化を有する遺伝子を同定した（ｎ＝３８）。図１は、フィルタリング前後のそれぞれの遺伝子についてのＦＤＲ及び倍率変化（ＬＵＧ ＦＣ）間の関係を示す。この３８遺伝子のセットをMEL38と称する（表５）。
分類アルゴリズムを訓練するためのMEL38遺伝子シグネチャー及び血漿マイクロＲＮＡデータベースの使用
黒色腫又は正常としての試料の分類におけるMEL38遺伝子シグネチャーの使用を実証するため、品質管理を合格したデータベースからの４６個の試料を使用してサポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズムを訓練した。
予測規則は、表６に示される重み（ｗｉ）及び有用遺伝子の発現（ｘｉ）の内側の和により定義する。発現は、voom正規化Nanostring遺伝子発現データについての対数強度である。試料は、和が閾値よりも大きい；すなわち、Σｉｗｉｘｉ＞閾値の場合に黒色腫のクラスに分類する。サポートベクターマシン予測因子についての閾値は、１１である。この閾値は、結果の所望の感度及び特異度に応じて変動し得る。
図２は、48-MEL38発見データベース中のそれぞれの試料についての３８遺伝子ＳＶＭスコアを示す。＞１１のスコアは、黒色腫結果に対応する。図３は、黒色腫状態及び黒色腫病期（Ｉ～ＩＶ）によりグループ化された訓練系列における試料についてのMEL38ＳＶＭスコアを示す。
MEL38遺伝子セットは、最近傍セントロイドアルゴリズムを用いて使用することもでき、そこでは新たな試料からのMEL38遺伝子発現データを黒色腫及び正常「テンプレート」又はセントロイドに対して相関させる。新たな試料が最大相関を有するセントロイドが結果である。セントロイドデータを表７に示す。
別のタイプのアルゴリズムは、複合共変量予測因子である。予測規則は、表８に示される重み（ｗｉ）及び有用遺伝子の発現（ｘｉ）の内側の和により定義する。発現は、voom正規化Nanostring遺伝子発現データについての対数強度である。試料は、和が閾値よりも大きい；すなわち、Σｉｗｉｘｉ＞閾値の場合、黒色腫のクラスに分類する。複合共変量予測因子についての閾値は、１３７．０５９である。
他の監視学習モデル、例として、フィードフォワードニューラルネットワークの訓練が想定される。超平面を２つのクラス：黒色腫又は非黒色腫間にフィットさせる上記のＳＶＭとは対照的に、ニューラルネットワークは、多層全結合逆伝播モデルを生成するためにより多くの訓練データを要求し得る。訓練されたニューラルネットワークは、ニューラルネットワークの不活性化部分を削減することにより、又はニューラルネットワークの複数の層を単一計算ステップに融合することにより最適化することができる。推定のため、適切に重み付けされたニューラルネットワークは、生物試料の未確認データに提供し、未確認生物試料が黒色腫クラスに属するより高い確率を有するか非黒色腫クラスに属するより高い確率を有するかを分類する。
黒色腫診断マイクロＲＮＡシグネチャー（MEL38）の検証
４８人の個体の発見系列から同定された循環マイクロＲＮＡの診断有意性を検証するため、公的に利用可能なデータレポジトリNCBI GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)から、「黒色腫」及び「マイクロＲＮＡ」という語句を検索することにより追加のゲノムデータセットを得た。
検証１：黒色腫を有し、又は有さない個体からの末梢血
他のグループが多試料血漿ベースマイクロＲＮＡプロファイリング研究をこれまで公開していないため、本出願のために生成された発見系列の正確な組成にマッチした検証コホートを見出すことが可能でなかった。見出された最も好適な検証データセットは、黒色腫患者（ｎ＝３５）及び正常対照（ｎ＝２２）の末梢血マイクロＲＮＡプロファイルを表すアクセッションGSE20994であった。Sanger MirBaseのリリース13.0(febit Homo Sapiens miRBase 13.0、Hummingbird Diagnostics，Heidelberg，Germany. NCBI GEO Platform ID GPL9040)に基づきカスタムマイクロＲＮＡオリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用してデータを生成した。
Nanostring nCounterヒトマイクロＲＮＡコードセット及びfebitヒト（Homo sapiens）miRBASE 13.0プラットフォーム間の正確なマイクロＲＮＡ配列を比較することにより、MEL38中の３８個の遺伝子のうち２８個が末梢血検証データセットにマッチした。主成分分析を使用して正常及び黒色腫試料間の差を可視化し、図６に示す（青色四角＝正常、緑色球体＝黒色腫）。
黒色腫を有し、又は有さない個体を階層化するそれらのマイクロＲＮＡの能力を決定するため、追加の特徴選択も遺伝子リストの改変も用いずに３つの交差検証分類モデルを試験した。試験された分類アルゴリズムは、最近傍セントロイド分類、複合共変量予測及びサポートベクターマシン分類であった。この分析の結果を表９～１１に示す。
受信者動作特性曲線分析を交差検証され、部分的再訓練されたＳＶＭ分類に対して実施し、ＡＵＣ＝０．９６のＡＵＣをもたらした（図４）。
追加の試料パーミュテーション分析を実施して結果の全体の有意性を決定した。１００回のパーミュテーションに基づき、偶然のみで表７に示される分類精度を観察する確率は、Ｐ＜０．０１である。
次いで、追加の部分的再訓練も遺伝子選択も用いずに発見系列分析（図６）から得られたＳＶＭ重みを使用して２８／３８遺伝子ＳＶＭモデルを検証系列データに適用した。この分類器試験方法の結果を図５及び表１２に示す。
この方法のＡＵＣは０．７９４（Ｐ＜０．０００１）であり、２８遺伝子サブセットモデルについての最適分類閾値は、＞９．２５であると決定された。これは、７１％の感度（９５％ＣＩ：５３．７～８５．４）及び８６％の特異度（９５％ＣＩ：６５．１～９７．１）を与えた。
他の分類閾値及び関連性能データを算出し、表１２に示し、作製された予測の感度又は特異度に対する多遺伝子診断スコアの分類閾値の調整の影響を実証した。
一般線形モデルを使用して訓練及び独立検証系列における個体についての循環マイクロＲＮＡシグネチャーの統計的分析を実施した（表１３）。訓練系列における個体についてのＳＶＭスコアは、黒色腫及び正常試料間の高い有意差を示し、（Ｐ＜０．００１）、年齢との関連も性別との関連も示さなかった。これらの結果は、独立検証系列において類似しており、病期との関連は、シグネチャーの部分的再訓練を用いて又は用いずにＰ＜０．００１及びＰ＝０．００２であった。
次いで、両方の系列の黒色腫患者のみのサブセットにおいて、腫瘍厚、黒色腫タイプ（表在型、結節型又はメラニン欠乏型）、病期（Ｉ～ＩＶ）、年齢及び性別（利用可能な場合）を、ＳＶＭ分類スコアとのそれらの関連について調査した。試験された一般線形モデルのいずれにおいても統計的に有意な試験変数は見出されなかった。
これらのデータは、本試験において開発された多遺伝子分類スコアが、年齢とも性別とも腫瘍特徴、例えば、厚さ、サブタイプ又は病期とも無関係に病状（すなわち、黒色腫の存在又は不存在）と有意に関連することを示す。
まとめると、MEL38マイクロＲＮＡ遺伝子シグネチャーの２２遺伝子サブセットは、７１～９７％の感度（どのようにモデルを適用するかに依存する）及び８６％の特異度で黒色腫を有し、又は有さない個体の独立系列を階層化し得る。
これらの結果に対するいくつかの重要な警告は、（ｉ）分類器は、使用されるmirBaseの旧バージョンに起因して全シグネチャーのサブセットに基づくこと、（ｉｉ）Nanostringでも他のデジタル的方法でもなくマイクロアレイを使用して遺伝子を計測したこと、及び（ｉｉ）標本タイプは、血漿ではなく全末梢血であったことである。発見系列に使用されたものと比較されたこれらの方法の差は、遺伝子シグネチャー及び分類法の「ストレス試験」を表す。
診断分類に要求されるMEL38の最小セットの評価
試料を正常又は黒色腫のいずれかとして分類するために要求される遺伝子の最小のセットを決定するため、ＰＡＭ分析を実施した(Tibshirani,2002,Diagnosis of multiple cancer types by shrunken centroids of gene expression)。この方法は、遺伝子シグネチャーの異なるサブセットを評価し、それぞれのサブシグネチャーの交差検証性能を報告し、最近傍セントロイド分類器と事実上類似する（表７）。
４８人の個体の訓練系列に適用すると、３８個の遺伝子のうち１６個のサブセットが偶然と比べて有意な分類精度（すなわち、＞５０％の精度）を達成するために要求された。これらの１６個の遺伝子は、hsa-miR-1258、hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-4532、hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-1302、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p、hsa-miR-1264、hsa-miR-154-5pである。
この分析を確認するため、上記で分析された検証系列中に存在するMEL38シグネチャーからの２８個の遺伝子から開始して全血マイクロＲＮＡプロファイルの独立検証系列に対して同一のＰＡＭ分析プロセスを実施した。２８個の遺伝子から開始して、症例の８９％が黒色腫又は正常として正確に分類される。使用される遺伝子の数が少なくなればなるほど分類誤差が増加し、ｎ＝４つの遺伝子で５０％超の誤分類率をもたらす。したがって、偶然よりも高い精度で分類結果を生成するために少なくとも４つの遺伝子のセットが要求される。
４つのマイクロＲＮＡの最小のセットは、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-497-5p及びhsa-miR-431-5pである。これら４つの遺伝子の３つは、訓練系列ＰＡＭ分析から同定された最小の１６セットと重複する。したがって、循環マイクロＲＮＡを使用する黒色腫の診断に要求される遺伝子の最小セットの組合せは、以下のMEL17である：
hsa-miR-1258、hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-4532、hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-1302、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p、hsa-miR-1264、hsa-miR-154-5p及びhsa-miR-431-5p。
図７は、１８個の遺伝子組合せの最小セットを同定するために使用された訓練及び検証系列の交差検証ＰＡＭ結果を説明する。これらのグラフは、ｘ軸上に遺伝子数及びｙ軸上に対応する分類精度を示す。
検証２：黒色腫細胞系、正常皮膚細胞系及びそれぞれから単離されたエキソソーム
MEL38遺伝子シグネチャーの追加のインビトロ検証として、Affymetrix microlRNA GeneChipデータセット(GEO ID:GSE35387)を分析した。この試験は、正常メラノサイト、黒色腫細胞及びそれらのエキソソームのマイクロＲＮＡ発現プロファイルをプロファイリングした。エキソソームは、腫瘍により体液中に分泌される小型膜ベシクルである。腫瘍エキソソームは、インタクトで機能的なｍＲＮＡ、小分子ＲＮＡ（例として、ｍｉＲＮＡ）、及び腫瘍成長を優先するように細胞環境を変化させ得るタンパク質を含有する。
黒色腫細胞、黒色腫エキソソーム、正常メラノサイト及び正常エキソソーム間のMEL38中の遺伝子の発現レベルを比較することにより、MEL38シグネチャー中に存在する循環マイクロＲＮＡの起源を推定することが可能である。遺伝子配列を使用してNanostring及びAffymetrixプラットフォーム間でマイクロＲＮＡプローブをマッチさせることにより、３８個の遺伝子のうち２６個が同定された。交差検証ＳＶＭモデルは、黒色腫（細胞又はエキソソーム）の、正常（細胞対エキソソーム）プロファイルからの１００％の分離を示した（図９）。さらに、２６遺伝子データセットの階層クラスタリングは、正常メラノサイト細胞及びエキソソームからの黒色腫細胞／エキソソームのロバストな階層化を示した（図８）。
検証３：黒色腫組織及び良性母斑生検物におけるマイクロＲＮＡ発現
本試験において検出された循環マイクロＲＮＡの起源を試験する別の手法として、ホルマリン固定パラフィン包埋黒色腫（ｎ＝１６）及びメラノサイト母斑（ｎ＝３）試料から生成されたマイクロＲＮＡプロファイルの既に公開されたデータセットを、EBI ArrayExpress(アクセッションE-MTAB-4915)からダウンロードした。
MEL38遺伝子のうちの１３個は、病状間で示差的に発現され（Ｐ＜０．０５）、２１個は、｜＞１．５｜の倍率変化の差を有した。黒色腫及び母斑ＦＦＰＥ組織中で計測された３８個全ての遺伝子（MEL38）を使用した階層クラスタリングは、図１０に示されるとおり、病状に基づく試料の分離を示した。さらに、３８個全ての遺伝子を使用した交差検証ＳＶＭは、黒色腫プロファイルを母斑から完全に分離し得、遺伝子シグネチャーの病状の有意性を裏付けた。図１１は、このデータセットについてのMEL38ＳＶＭスコアを示す。
検証４：黒色腫組織及び良性母斑生検物中のマイクロＲＮＡ発現
黒色腫の組織学的診断を支援するためのバイオマーカーとして機能するMelaseq MEL38シグネチャーの能力を探索するため、データセットGSE35579をNCBI Gene Expression Omnibusからダウンロードした。このデータセットは、University of EdinburghのMelton研究室によりIlluminaマイクロＲＮＡビーズチップ(NCBIプラットフォームID:GPL15183)[8]のカスタムバージョンを使用して生成された。
データセットの説明において記述したとおり、１１個の良性母斑、２０個の原発性黒色腫及び２１個の転移性黒色腫生検物を含む６１個のＦＦＰＥ試料から全ＲＮＡを得た。使用されたマイクロＲＮＡプラットフォームは、４７０個の十分にアノテートされたヒトマイクロＲＮＡを含む７３５個の標的を含有した。標的アノテーションファイル及び個々のプローブ配列を使用してMEL38に対する標的マッチングを実施した。３８個のマイクロＲＮＡのうち２７個がこのプロセスから同定された（７１％）。
このデータセット中に存在する標本タイプを区別するMEL38のこのサブセットの能力を、良性対黒色腫（原発性及び転移性）の二分クラスを使用するサポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズムの部分的再訓練により探索した。これは、交差検証を使用するが、追加の遺伝子選択もフィルタリングも用いずに存在するデータに対するＳＶＭアルゴリズムの訓練を含む。観察された分類精度は、交差検証法に応じて９４～９６％であった（１つを除く、１０倍又は０．６３２＋bootstrap）。黒色腫状態の予測についての感度及び特異度は、それぞれ０．９７及び０．８５であった。分類器の陽性予測値は０．９６であり、その陰性予測値は０．８９であった。
クラスラベルを１００回並び替えた別個のパーミュテーションステップにより予測因子がデータにおけるランダムノイズをピックアップしているという仮説の包括的な試験についてのｐ値。それぞれのパーミュテーションのため、試料を分類し、それぞれの分類器の交差検証誤分類率を、正確に予測された試料の割合として計算した。２７マイクロＲＮＡサブセット分類器の包括的な有意性は、Ｐ＜０．０１である。
部分的再訓練された分類器の結果を可視化するため、重み付けされたマイクロＲＮＡ存在量計測値の和を取ることにより最終的な２７マイクロＲＮＡ ＳＶＭをデータセットに適用し、試料当たりの分類スコアをもたらした。これらのスコアを図１２に示す。
良性母斑クラスについての平均分類スコアは、原発性及び転移性黒色腫クラスの組合せについての６．７と比較して３．３であった。黒色腫カテゴリー内で、分類器は１つのクラスとして検出するように訓練されたにもかかわらず、転移性黒色腫は、原発性黒色腫についての５．４と比較して７．３の平均分類スコアを有した。原発性対転移性腫瘍分類スコアの差のｔ検定は、結果が統計的に有意であることを示した（Ｐ＝２．０３×１０－５）。
これらのデータは、Mel38の２７遺伝子サブセットのみが利用可能である場合であっても、それが依然として良性母斑と黒色腫とを区別し得ると考えられることを示す。これらは、転移性黒色腫試料が有意に高い（すなわち、より黒色腫様の）マイクロＲＮＡプロファイルを有することも明らかにする。
マイクロＲＮＡシグネチャー１（MEL38）開発及び検証のまとめ
皮膚黒色腫を有し、及び有さない個体からの４８個の血漿試料から生成されたNanostring nCounterプロファイルを比較することにより、新規系列の３８個の循環マイクロＲＮＡを発見した。発見系列（データベース）において、それらの遺伝子は、正常対照及び黒色腫患者血漿間で示差的に発現され、２倍以上の差であり、Ｐ＜０．００５の統計的有意性であった。これらの選択基準は、それぞれの遺伝子について偽発見の１００回の機会の１回未満に対応する。
３８遺伝子シグネチャーの診断能を、遺伝子選択においてもアルゴリズム訓練プロセスにおいても使用されなかったマイクロＲＮＡプロファイルの独立系列において評価した。これらのデータは、同様に黒色腫を有し、又は有さない５１人の個体の系列から採取された末梢血から生成した。利用可能な３８遺伝子セットのサブセットを使用した交差検証分類は、高程度の分離；９７％の感度及び８６％の特異度を示した。シグネチャーの部分再訓練を用いない場合、感度は７９％であった。
３８遺伝子シグネチャー中のマイクロＲＮＡの潜在的な起源を探索するため、黒色腫細胞、正常メラノサイト及び実験由来エキソソームのマイクロＲＮＡプロファイルの分析を実施した。データのクラスタリングは、細胞及びそれぞれのエキソソーム間の発現パターンと類似して正常メラノサイトと黒色腫細胞プロファイルとの区別される分離を示した。これは、MEL38シグネチャーを含む黒色腫を有する個体の血液中で検出されたマイクロＲＮＡが、黒色腫又は正常メラノサイト細胞から生じたことを示唆する。
最後に、MEL38シグネチャー中の遺伝子を、悪性黒色腫及び良性母斑の組織生検物間で比較した。３８個の遺伝子を使用した試料の階層クラスタリングは、黒色腫と母斑との分離を示し、ここでも、本試験において同定されたマイクロＲＮＡが病状間で異なるレベルを示し、したがって、妥当な診断マーカーであるという仮説を支持した。
ｍｉＲＮＡ発現病期分類スコアの作出
マイクロＲＮＡシグネチャー２開発：悪性黒色腫の臨床病期（Ｉ～ＩＶ）に相関する発現レベルを有する循環マイクロＲＮＡの同定
黒色腫の病期と相関する発現のパターンを有する規定の血漿マイクロＲＮＡを同定するため、黒色腫を有する個体からの血漿プロファイルをＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ期にグループ化した（表８参照）。voom＋limma分析を、最小検出閾値を合格した全ての遺伝子に対して実施して病期の任意のペア（すなわち、１対２、２対３、３対４、１対３、２対４）間で有意差を有するものを同定した。有意性は、ＦＤＲ＜０．１及び２以上の発現の倍率変化と定義した。これは、さらなる評価のための３７個の候補遺伝子のセットを同定した。
次に、腫瘍病期について上方又は下方調節の線形パターンを有する遺伝子を同定するため、Ｉ期に対するそれぞれの遺伝子の病期当たりの平均発現を病期と相関させた。相関係数＜－０．７又は＞０．７を有する遺伝子をさらなる分析のために選択した。シグネチャー１（MEL38）に既に存在する８つの遺伝子と、上位５つの正及び上位５つの負に相関する遺伝子を選択し、１８個の遺伝子の総黒色腫病期分類シグネチャーを与えた（表１４）。それぞれの遺伝子の、Ｉ期におけるそれらの発現に対する平均倍率変化を図１３に示す。
これら１８個の遺伝子の全て又はサブセットを用いると、MEL38遺伝子シグネチャーを使用して、又は慣用の方法により疾患と既に診断された患者における黒色腫の病期を同定することが可能である。正確な病期分類には、少なくとも２つの遺伝子、例として、１つの正及び１つの負に相関する遺伝子、例えば、hsa-miR-199b-5p（相関係数：－０．９８；すなわち、発現は病期が増加するにつれて減少する）及びhsa-miR-3127-5p（相関：０．９５；すなわち、発現は、病期が増加するにつれて増加する）が要求される。
遺伝子シグネチャー間の重複：
開発された２つの遺伝子シグネチャーの目的は異なるが（診断と病期分類）、図１４に示されるとおり、８つのマイクロＲＮＡの重複が観察された。両方のシグネチャーに共通する８つの遺伝子は、黒色腫患者及び正常対照間で異なり、疾患進行（病期）と相関する発現のパターンも有する。
黒色腫患者試料中のMEL38の計測
マイクロＲＮＡシグネチャーMEL38を、処理前及び処理１２～１４日後（すなわち、外科的切除）に得られた４つの黒色腫患者試料と２つの非黒色腫対照中で計測した。MEL38スコアの値及び選択された個々の遺伝子を時点間で比較した。
患者及び方法
４人の黒色腫患者からの血漿をＥＤＴＡチューブ中に外科的切除前（Ｔ１）及びさらにフォローアップ来院の間の１２～１４日後（Ｔ２）に、Cureline Inc (California、USA)により回収した。２つの非黒色腫対照試料も得た。標本及び臨床データを表１５に示す。全ての生検物は、委託病理学者（個人的に依頼）により明確なマージンを有すると確認された。それぞれの患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。
マイクロＲＮＡ単離及びNanostringプロファイリングを、Canopy Biosciences(St Louis, MO, USA)により実施した。miR-254及びmiR-414に対応するスパイクインオリゴヌクレオチドをそれぞれの試料に添加して試料間変動を管理した。
データ分析、例として、陰性及び陽性対照調整及びハウスキーピング遺伝子発現へのスケーリングも上記のとおり実施した。nSolver 4.0(Nanostring Inc, Seattle, USA) 及びRstudio(R:A language and environment for statistical computing:R Foundation for Statistical Computing, 2010)を使用してデータ処理を実施した。MEL38遺伝子サポートベクターマシン（ＳＶＭ）分類アルゴリズムを、それぞれの試料からの対応する遺伝子に適用し、スコアを０～１０にスケーリングした。バックグラウンドを超えて検出されたMEL38遺伝子の５０％未満を有する個々の試料を、Bioconductor ‘impute.knn’ function with default settings (Gentleman RC, Carey VJ, Bates DM, Bolstad B, Dettling M, Dudoit S, et al. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol 2004; 5 (10):R80)により処理した。
結果
病変切除前後の４人の黒色腫患者及び２人の非黒色腫対照からのNanostringマイクロＲＮＡプロファイルを生成し、合計１０個の試料をもたらした。スパイクイン遺伝子正規化前、未加工データを視覚的に試験した。スパイクインmir-414は、mir-254よりも実質的に低く有価でない発現を示し、このオリゴヌクレオチドの設計又は実験室プロセスのエラーを示唆した。mir-254についての未加工データは、本発明者らのより早期の研究において観察された強度及び試料間変動と酷似しており、したがって、本試験における正規化にはmir-254のみを使用した。
黒色腫診断時（Ｔ１）に回収された血漿から生成されたMEL38スコアは、図１５に示されるとおり、２つの正常非黒色腫対照よりも有意に高かった。切除前血漿についての平均MEL38スコアは、対照試料についての３．９５と比較して８．８４であった（Ｔ検定、Ｐ値＜０．００１）。
切除後（Ｔ２）血漿試料の平均MEL38スコアは、７．４７であった。Ｔ２対非黒色腫対照試料のｔ検定、差も統計的に有意である（Ｐ＝０．０１１）が、Ｔ１切除前試料よりも低い程度であり、Ｔ２試料のより「正常様」状態を反映することを示した。
次に、４人全ての患者からのＴ１及びＴ２MEL38スコアに対して対応のある片側ｔ検定を実施した。患者適合時点間の平均MEL38変化は－１５％であり、それは対応のある片側Ｔ検定に基づき統計的に有意であった（Ｐ＝０．０３０）。一般線形モデルをＴ１／Ｔ２データ点に適用して患者年齢、腫瘍病期及び血漿回収間の日数と、MEL38スコアとの関連を検定した。変数は、統計的有意性を達成せず（データ示さず）、Ｔ１対Ｔ２スコアはＰ＝０．０６４において最も近かった。概して、これらのデータは、MEL38シグネチャーにより定量されるとおり、外科的切除後のこれら４人の患者の循環マイクロＲＮＡプロファイルの「正規化」を示唆する。
最後に、黒色腫対非黒色腫を分類するために要求される最小遺伝子サブセットを以下のとおり同定した。
訓練系列：黒色腫対非黒色腫：Mel38の１７遺伝子サブセットを使用して黒色腫対非黒色腫分類器を訓練した。元の訓練系列に基づき、これは８３％の交差検証精度を達成した（８３％の感度、８１％の特異度）。
黒色腫Ｔ１対Ｔ２：訓練された１７遺伝子分類アルゴリズムを、黒色腫切除前後に回収された血液から生成された臨床データセットデータに適用した場合、Melaseqスコアの平均１１％の低減が時点間で観察された。３人の患者はそれらの１７遺伝子分類器スコアの低減を示し、１人の患者は増加を示した。この結果についての対応のあるｔ検定のｐ値は、０．０６５であった（有意傾向がある）。
黒色腫対非黒色腫：臨床データセット＃２は、２つの非黒色腫対照試料も含んだ。１７遺伝子分類器を使用した切除前黒色腫患者試料（ｎ＝５）及び２つの非黒色腫試料間の比較は、有意な結果をもたらした（Ｐ＝０．０２０）。これは、計測数の低減にかかわらず、MEL38のMEL17サブセットが病状に基づき血液試料を階層化し得ることを示す。
MEL17：
hsa-miR-1258、hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-4532、hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-1302、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p、hsa-miR-1264、hsa-miR-154-5p及びhsa-miR-431-5p。
結論
本試験において分析された４人の患者において、１５％のMEL38スコア及び１１％のMEL17スコアの平均低減が、診断及び１２～１４日間のフォローアップ来院間で観察された。Ｔ１及びＴ２時点間のMEL38の差は有意に異なり、それぞれの時点は、正常非黒色腫対照試料と有意に異なる。これらの観察は、切除１２～１４日後に、完全に腫瘍が切除された黒色腫患者の循環マイクロＲＮＡプロファイルが変更され、黒色腫切除後により「正常様」になったことを示唆する。
図１６を参照すると、本発明を具体化するシステム１０００を説明するブロック図である。公衆通信ネットワーク１００２、例えば、インターネットを、セキュアサーバ１００４及びエンドポイントデバイス１００６間のメッセージングに用いる。一般に、ユーザエンドポイントデバイス１００６は、例えば、ウェブブラウザソフトウェア及び／又は他の接続アプリケーションを使用してインターネット１００２を介して通信する能力を有する任意の好適なコンピューティング、通信及び／又は処理アプライアンスであり得る。さらに、例示的なシステム１０００は、全ての処理デバイス及びシステム間の通信のために単一共有インセキュアネットワーク１００２を含む一方、本発明の実施形態は、他のタイプの通信及び／又は取引ネットワーク、例えば、金融取引ネットワーク、プライベートネットワーク、仮想プライベートネットワーク（ＶＰＮ）、携帯電話ネットワーク、又はそれらの混合及び／又は他の形態の通信システムを含み得る。
したがって、「ネットワークインターフェース」という用語が本明細書全体にわたり使用される場合、特に文脈により要求されない限り、それは、１つ以上の対応する物理的ハードウェア又は仮想通信ネットワークを介して情報を他のデバイスと交換するために要求される種々の通信プロトコルを実装する物理的ハードウェア及び／又はネットワークインターフェースソフトウェア（プロトコルスタック）の組合せを指すことが理解される。
システム１０００において説明されるとおり、セキュアサーバ１００４は、公衆ネットワーク１００２を介して通信し得る。セキュアサーバ１００４は、さらなる不揮発性メモリ／ストレージデバイス１３３０にインターフェースされ、又はそうでなければ動作的に関連するプロセッサ１３２８を含む。プロセッサ１３２８は、セキュアサーバ１００４の動作に関するプログラム命令及び一時データを含有する揮発性ストレージ１３３２にもインターフェースされる。
プロセッサ１３２８は、通信インターフェース１３３４と動作可能に関連付けられ、それを介してそれは公衆ネットワーク１００２上でエンドポイントデバイス１００６と通信し得る。
使用において、揮発性ストレージ１３３２は、下記のシステム１０００の種々の機能エレメントを含む、本発明の特徴を具体化する処理及び動作を実施するように構成されるプログラム命令の対応する本体１３３６を含む。セキュアサーバ１００４は、回線終端装置（ＮＴＵ）１３４０を介して遠隔通信サービスプロバイダネットワーク１３３８、例えば、公衆交換電話網（ＰＳＴＮ）にも連結されている。これは、セキュアサーバ１００４がＰＳＴＮ１３３８を介してエンドユーザとの通信に関与するのを可能とする。このような通信は、音声テレフォニーコール、自動化テレフォニーコール、及びＳＭＳメッセージングを含み得る。例示的なシステム１０００において、ＰＳＴＮ１３３８は、携帯電話基地局１３４２に接続して示し、それはエンドポイントデバイス１００６を介してセキュアサーバ１００４にもアクセスしているエンドユーザのモバイルデバイス１００７との通信を容易にする。
本明細書において、「プロセッサ」、「コンピュータ」などのような用語は、文脈により特に要求されない限り、ある範囲の考えられる、ハードウェア及びソフトウェアの組合せを含むデバイス、機器及びシステムの実装を指すものとして理解すべきである。これとしては、シングルプロセッサ及びマルチプロセッサデバイス及び機器、例として、ポータブルデバイス、デスクトップコンピュータ、及び種々のタイプのサーバシステム、例として、同一場所に配置しても分布してもよい協調ハードウェア及びソフトウェアプラットフォームが挙げられる。ハードウェアとしては、慣用のパーソナルコンピュータアーキテクチャ、又は他の汎用ハードウェアプラットフォームを挙げることができる。ソフトウェアとしては、種々のアプリケーション及びサービスプログラムと組み合わせた市販のオペレーティングシステムソフトウェアを挙げることができる。或いは、コンピューティング又は処理プラットフォームは、カスタムハードウェア及び／又はソフトウェアアーキテクチャを含み得る。スケーラビリティの向上のため、コンピューティング及び処理システムは、サービス需要に応答して物理的ハードウェアリソースが動的にアロケートするのを可能とするクラウドコンピューティングプラットフォームを含み得る。これらのバリエーションの全てが本発明の範囲に収まる一方、説明及び理解の容易性のため、本明細書に記載の例示的実施形態は、シングルプロセッサ汎用コンピューティングプラットフォーム、一般に利用可能なオペレーティングシステムプラットフォーム、及び／又は広く利用可能な消費者製品、例えば、デスクトップＰＣ、ノートブック又はラップトップＰＣ、スマートフォン、タブレットコンピュータなどをベースとする。
特に、「処理装置」という用語は、本明細書（特許請求の範囲を含む）において、特定の定義済みタスク、例えば、データの生成及び伝送、データの受容及び処理、又はデータの受容及び検証を実施するように構成されるハードウェア及びソフトウェアの任意の好適な組合せを指すために使用される。このような処理装置は、単一の処理デバイス上で単一の場所において実行する実行コードモジュールを含み得、又は複数の処理デバイス上で複数の場所において実行する協調実行コードモジュールを含み得る。例えば、本発明の一部の実施形態において、処理は、セキュアサーバ１００４上でコード実行することにより完全に実施することができる一方、他の実施形態において、対応する処理は、エンドポイントデバイス１００６上で実行するコードモジュールにより協調的に実施することができる。例えば、本発明の実施形態は、セキュアサーバ１００４に機能性を提供するためにエンドポイントデバイス１００６上で実行するコードモジュールと協調的に動作するように構成されたセキュアサーバ１００４において、又は別のサードパーティシステムにおいてインストールされたアプリケーションプログラミングインターフェース（ＡＰＩ）コードモジュールを用い得る。
本発明の特徴を具体化するソフトウェアコンポーネントは、ソフトウェアエンジニアリングの当業者に知られている任意の好適なプログラミング言語、開発環境、又は言語及び開発環境の組合せを使用して開発することができる。例えば、好適なソフトウェアは、Ｃプログラミング言語、Javaプログラミング言語、Ｃ＋＋プログラミング言語、Ｇｏプログラミング言語、及び／又はネットワーク若しくはウェブベースサービスの実装に好適なある範囲の言語、例えば、JavaScript、HTML、PHP、ASP、JSP、Ruby、Pythonなどを使用して開発することができる。これらの例は、限定的なものではなく、システム需要に従って簡便な言語又は開発システムを用いることができることが認識される。
例示的なシステム１０００において、エンドポイントデバイス１００６は、それぞれプロセッサを含む。プロセッサは、通信インターフェース、１つ以上のユーザ入出力（Ｉ／Ｏ）インターフェース、及びローカルストレージ（揮発性及び不揮発性ストレージの組合せを含み得る）にインターフェースされ、又はそうでなければ動作可能に関連付けられる。不揮発性ストレージとしては、ソリッドステート不揮発性メモリ、例えば、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、フラッシュメモリなどを挙げることができる。揮発性ストレージとしては、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）を挙げることができる。ストレージは、エンドポイントデバイス１００６の動作に関するプログラム命令及び一時データを含有する。一部の実施形態において、エンドポイントデバイス１００６は、追加の周辺インターフェース、例えば、高容量不揮発性ストレージ、例えば、ハードディスクドライブ、光学ドライブなどへのインターフェースを含み得る（図１６には示さず）。
エンドポイントデバイスストレージは、デバイスの正常動作に関するプログラム及びデータコンテンツを含有し得る。これは、オペレーティングシステムプログラム及びデータ（例えばWindows、Android、iOS、MacOS又はUnixベースオペレーティングシステムに関連付けられる）、並びに本発明と一般に無関連の別の実行アプリケーションソフトウェアを含み得る。ストレージは、プロセッサにより実行される場合、エンドポイントデバイス１００６に本発明の実施形態に関する動作を実施するように命令するプログラム命令を含み得、例えば、下記のものなどである。
図１６にも示されるとおり、セキュアサーバ１００４は、プロセッサ１３２８を含む。プロセッサ１３２８は、ハードディスクドライブであり得、及び／又はソリッドステート不揮発性メモリ、例えば、ＲＯＭ、フラッシュメモリなどを含み得る不揮発性メモリ／ストレージデバイス１３３０にインターフェースされ、又はそうでなければ動作的に関連付けられる。プロセッサ１３２８は、セキュアサーバ１００４の動作に関するプログラム命令及び一時データを含有する揮発性ストレージ１３３２、例えば、ＲＡＭにもインターフェースされる。
慣用の構成において、ストレージデバイス１３３０は、エンドポイントデバイス１００６の正常動作に関する公知のプログラム及びデータコンテンツを維持する。例えば、ストレージデバイス１３３０は、オペレーティングシステムプログラム及びデータ、並びにエンドポイントデバイス１００６の意図される機能に必要な他の実行アプリケーションソフトウェアを含有し得る。ストレージデバイス置１３３０は、プロセッサ１３２８により実行される場合、エンドポイントデバイス１００６に本発明の実施形態に関する動作を実施するように命令するプログラム命令も含有し、例えば、以下に詳細に記載されるものである。動作において、ストレージデバイス１３３０上に保持される命令及びデータは、オンデマンド実行のために揮発性メモリ１３３２に転送される。
プロセッサ１３２８は、慣用の様式で通信インターフェース１３３４とも動作的に関連付けられる。通信インターフェース１３３４は、データ通信ネットワーク１００２へのアクセスを容易にする。
使用において、揮発性ストレージ１３３２は、ストレージデバイス１３３０から転送され、本発明の特徴を具体化する処理及び他の動作を実施するように構成されたプログラム命令の対応する本体１３３６を含有する。
セキュアサーバ１００４は、ストレージデバイス１３３０中又はクラウドストレージ、例えば、Amazon Web Services若しくはMicrosoft Azure上又は他のコンテンツデリバリネットワーク（ＣＤＮ）又はエンドポイントデバイス１００６のローカルストレージ上に保存された生物試料に対応する臨床従事者により得られたデータにユーザがアクセスするのを可能とする。試料からの収集データは、データファイル中に、又はセキュアサーバ１００４若しくはエンドポイントデバイス１００６によりアクセス可能なデータベース中でデータ記録として保存される。データファイルは、コンピュータ１１０にコピーし、又はアップロードし、ローカルストレージデバイス上に保存することができる。
（１つ以上の）訓練マシン学習モデル（例えば、モデルファイルの形態）は、セキュアサーバ１００４のストレージデバイス１３３０又はエンドポイントデバイス１００６のローカルストレージ上に保存することができる。プロセッサ１３２８又はエンドポイントデバイス１００６のプロセッサは、新たな未確認生物試料データが供給された機械学習エンジンを介してプログラム命令を実行して機械学習推定を実施する。推定のため、生物試料に対応するデータは、前述の（１つ以上の）訓練機械学習モデルに従って分類される。分類は、データベース又はデータファイルと関連付けられた別個のファイル中にデータ記録で記録することができる。

Claims (14)

  1. 対象における黒色腫を検出し、診断するための組成物であって、
    前記検出し、診断することは、
    （ｉ）生物試料中のマイクロＲＮＡ発現レベルを検出すること、
    （ｉｉ）前記マイクロＲＮＡの前記発現レベルを含むデータセットに由来する１つ以上のアルゴリズムに基づき前記生物試料の分類スコア（ＣＳ）を算出すること、及び
    （ｉｉｉ）前記分類スコアの値に基づき前記生物試料を黒色腫として、又は黒色腫でないとして分類すること
    を含み、
    前記組成物は、以下のマイクロＲＮＡ
    hsa-miR-1258、hsa-miR-3131、
    hsa-miR-1264、hsa-miR-337-5p、
    hsa-miR-1269a、hsa-miR-34a-5p、
    hsa-miR-1302、hsa-miR-3928-3p、
    hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-424-5p、
    hsa-miR-138-5p、hsa-miR-431-5p、
    hsa-miR-152-3p、hsa-miR-450a-5p、
    hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4532、
    hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
    hsa-miR-1-5p、hsa-miR-4787-3p、
    hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
    hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-520d-3p、
    hsa-miR-1973、hsa-miR-522-3p、
    hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548a-5p、
    hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p、
    hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-548l、
    hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-553、
    hsa-miR-299-3p、hsa-miR-624-3p、
    hsa-miR-301a-3p、および、hsa-miR-764
    からなる、組成物。
  2. 対象における黒色腫の病期を決定するための組成物であって、
    前記決定することは、
    （ｉ）生物試料中のマイクロＲＮＡ発現レベルを検出すること、
    （ｉｉ）前記マイクロＲＮＡの前記発現レベルを含むデータセットに基づき前記生物試料の病期分類スコア（ＳＳ）を算出すること、及び
    （ｉｉｉ）前記病期分類スコアの値に基づき前記生物試料を黒色腫の病期として分類すること
    を含み、
    前記組成物は、以下のマイクロＲＮＡ
    hsa-miR-1258、hsa-miR-3131、
    hsa-miR-1264、hsa-miR-337-5p、
    hsa-miR-1269a、hsa-miR-34a-5p、
    hsa-miR-1302、hsa-miR-3928-3p、
    hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-424-5p、
    hsa-miR-138-5p、hsa-miR-431-5p、
    hsa-miR-152-3p、hsa-miR-450a-5p、
    hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4532、
    hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
    hsa-miR-1-5p、hsa-miR-4787-3p、
    hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
    hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-520d-3p、
    hsa-miR-1973、hsa-miR-522-3p、
    hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548a-5p、
    hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p、
    hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-548l、
    hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-553、
    hsa-miR-299-3p、hsa-miR-624-3p、
    hsa-miR-301a-3p、および、hsa-miR-764
    からなる、組成物。
  3. 前記黒色腫の前記病期分類は、Ｉ又はＩＩ又はＩＩＩ又はＩＶ期である、請求項２に記載の組成物。
  4. 既に黒色腫と診断された対象における再燃又は再発について黒色腫の状態をモニタリングするための組成物であって、
    前記モニタリングすることは、
    （ｉ）生物試料中のマイクロＲＮＡ発現レベルを検出すること、
    （ｉｉ）前記マイクロＲＮＡの前記発現レベルを含むデータセットからの１つ以上のアルゴリズムに基づき前記生物試料の分類スコア（ＣＳ）を算出すること、及び
    （ｉｉｉ）前記分類スコアの値に基づき前記生物試料を黒色腫として、又は黒色腫でないとして分類し、黒色腫を有する者と有さない者とを分ける既に決定された分類閾値と比較すること
    を含み、
    前記組成物は、以下のマイクロＲＮＡ
    hsa-miR-1258、hsa-miR-3131、
    hsa-miR-1264、hsa-miR-337-5p、
    hsa-miR-1269a、hsa-miR-34a-5p、
    hsa-miR-1302、hsa-miR-3928-3p、
    hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-424-5p、
    hsa-miR-138-5p、hsa-miR-431-5p、
    hsa-miR-152-3p、hsa-miR-450a-5p、
    hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4532、
    hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
    hsa-miR-1-5p、hsa-miR-4787-3p、
    hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
    hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-520d-3p、
    hsa-miR-1973、hsa-miR-522-3p、
    hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548a-5p、
    hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p、
    hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-548l、
    hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-553、
    hsa-miR-299-3p、hsa-miR-624-3p、
    hsa-miR-301a-3p、および、hsa-miR-764
    からなる、組成物。
  5. 前記生物試料は、固形組織、血漿、血液、皮膚、エキソソーム、尿、乳汁、血清、腹水、嚢胞液、胸膜液、腹腔液、脳脊髄液、涙液、唾液、痰、毛髪又はそれらの組合せである、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記対象は、ヒトである、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 分子アレイ又は一連の試薬であって、複数の
    （ｉ）以下のマイクロＲＮＡ
    hsa-miR-1258、hsa-miR-3131、
    hsa-miR-1264、hsa-miR-337-5p、
    hsa-miR-1269a、hsa-miR-34a-5p、
    hsa-miR-1302、hsa-miR-3928-3p、
    hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-424-5p、
    hsa-miR-138-5p、hsa-miR-431-5p、
    hsa-miR-152-3p、hsa-miR-450a-5p、
    hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4532、
    hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
    hsa-miR-1-5p、hsa-miR-4787-3p、
    hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
    hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-520d-3p、
    hsa-miR-1973、hsa-miR-522-3p、
    hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548a-5p、
    hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p、
    hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-548l、
    hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-553、
    hsa-miR-299-3p、hsa-miR-624-3p、
    hsa-miR-301a-3p、および、hsa-miR-764
    にそれぞれ結合し得る１５～２５長さのヌクレオチド配列をそれぞれ含む核酸分子；又は
    （ｉｉ）（ｉ）の配列のそれぞれに相補的な１５～２５長さのヌクレオチド配列をそれぞれ含む核酸分子；又は
    （ｉｉｉ）（ｉ）の配列のそれぞれにハイブリダイズし得る１５～２５長さのヌクレオチド配列をそれぞれ含む核酸プローブ若しくはオリゴヌクレオチド
    からなり、
    （ｉ）～（ｉｉｉ）の前記マイクロＲＮＡの発現のレベルを使用して対象における黒色腫の存在若しくは不存在を示す分類スコア（ＣＳ）又は対象における黒色腫の病期を示す病期分類スコア（ＳＳ）を算出する分子アレイ又は一連の試薬。
  8. 黒色腫の診断、黒色腫の病期の評価又は提案治療に対する疾患感受性の評価のための診断キットであって、
    ａ．少なくとも１つの「フォワード」増幅プライマー；及び／又は
    ｂ．少なくとも１つの「リバース」増幅プライマー；及び／又は
    ｃ．複数のマイクロＲＮＡのための検出若しくは捕捉プローブ
    を含み、
    前記プライマーは、
    hsa-miR-1258、hsa-miR-3131、
    hsa-miR-1264、hsa-miR-337-5p、
    hsa-miR-1269a、hsa-miR-34a-5p、
    hsa-miR-1302、hsa-miR-3928-3p、
    hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-424-5p、
    hsa-miR-138-5p、hsa-miR-431-5p、
    hsa-miR-152-3p、hsa-miR-450a-5p、
    hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-4532、
    hsa-miR-154-5p、hsa-miR-454-3p、
    hsa-miR-1-5p、hsa-miR-4787-3p、
    hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-497-5p、
    hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-520d-3p、
    hsa-miR-1973、hsa-miR-522-3p、
    hsa-miR-205-5p、hsa-miR-548a-5p、
    hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-548ad-3p、
    hsa-miR-2682-5p、hsa-miR-548l、
    hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-553、
    hsa-miR-299-3p、hsa-miR-624-3p、
    hsa-miR-301a-3p、および、hsa-miR-764
    からなる、前記複数のマイクロＲＮＡのヌクレオチド配列の特異的増幅を可能とする、診断キット。
  9. 患者における黒色腫を検出し、診断するためのシステムであって、
    前記システムは、
    少なくとも１つのプロセッサ；及び
    前記プロセッサによる実行のためのプログラム命令を含有する少なくとも１つのストレージ媒体
    を含み、前記プログラム命令は、
    （ｉ）前記患者からの生物試料中のマイクロＲＮＡ発現レベルを検出すること
    （ｉｉ）前記マイクロＲＮＡの前記発現レベルを含むデータセットに由来する１つ以上のアルゴリズムに基づき前記生物試料の分類スコア（ＣＳ）を算出すること、及び
    （ｉｉｉ）前記分類スコアの値に基づき前記生物試料を黒色腫として又は黒色腫でないとして分類すること
    を含むステップを前記プロセッサに実行させ、
    前記マイクロＲＮＡは、
    hsa-miR-1258、hsa-miR-219a-2-3p、
    hsa-miR-1264、hsa-miR-2682-5p、
    hsa-miR-1269a、hsa-miR-27a-3p、
    hsa-miR-1302、hsa-miR-299-3p、
    hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-301a-3p、
    hsa-miR-138-5p、hsa-miR-3131、
    hsa-miR-152-3p、hsa-miR-337-5p、
    hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-34a-5p、
    hsa-miR-154-5p、hsa-miR-3928-3p、
    hsa-miR-1-5p、hsa-miR-424-5p、
    hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-431-5p、
    hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-450a-5p、
    hsa-miR-1973、hsa-miR-4532、
    hsa-miR-205-5p、hsa-miR-454-3p、
    hsa-miR-4787-3p、hsa-miR-548ad-3p、
    hsa-miR-497-5p、hsa-miR-548l、
    hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-553、
    hsa-miR-522-3p、hsa-miR-624-3p、
    hsa-miR-548a-5p、および、hsa-miR-764
    からなる、システム。
  10. 前記１つ以上のアルゴリズムは、前記データセットからの試料を使用して訓練された訓練サポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズムを含み、前記ＳＶＭは、前記マイクロＲＮＡの重み及び発現の内側の和が所定の閾値よりも大きい場合に前記生物試料を黒色腫に対応するクラスに属するとして分類するように構成される、請求項９に記載のシステム。
  11. 前記１つ以上のアルゴリズムは、最近傍セントロイド分類器を含み、前記最近傍セントロイド分類器は、前記生物試料の前記マイクロＲＮＡのセントロイドが前記マイクロＲＮＡの正常セントロイドではなく前記マイクロＲＮＡの黒色腫セントロイドに近い場合に黒色腫クラスを前記生物試料に割り当てるように構成される、請求項９に記載のシステム。
  12. 前記１つ以上のアルゴリズムは、複合共変量予測因子を含み、前記複合共変量予測因子は、前記マイクロＲＮＡの重み及び発現の内側の和が所定の閾値よりも高い場合に前記生物試料を黒色腫に対応するクラスに属するとして分類するように構成され、前記マイクロＲＮＡの重み及び発現の内側の和が所定の閾値よりも高い場合に前記生物試料を黒色腫に対応するクラスに属するとして分類するように構成される、請求項９に記載のシステム。
  13. 黒色腫の病期を決定するためのシステムであって、
    前記システムは、
    少なくとも１つのプロセッサ；及び
    前記プロセッサによる実行のためのプログラム命令を含有する少なくとも１つのストレージ媒体
    を含み、前記プログラム命令は、
    （ｉ）生物試料中のマイクロＲＮＡ発現レベルを検出すること、
    （ｉｉ）前記マイクロＲＮＡの前記発現レベルを含むデータセットに基づき前記生物試料の病期分類スコア（ＳＳ）を算出すること、及び
    （ｉｉｉ）前記病期分類スコアの値に基づき前記生物試料を黒色腫の病期として分類すること
    を含むステップを前記プロセッサに実行させ、
    前記マイクロＲＮＡは、
    hsa-miR-1258、hsa-miR-219a-2-3p、
    hsa-miR-1264、hsa-miR-2682-5p、
    hsa-miR-1269a、hsa-miR-27a-3p、
    hsa-miR-1302、hsa-miR-299-3p、
    hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-301a-3p、
    hsa-miR-138-5p、hsa-miR-3131、
    hsa-miR-152-3p、hsa-miR-337-5p、
    hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-34a-5p、
    hsa-miR-154-5p、hsa-miR-3928-3p、
    hsa-miR-1-5p、hsa-miR-424-5p、
    hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-431-5p、
    hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-450a-5p、
    hsa-miR-1973、hsa-miR-4532、
    hsa-miR-205-5p、hsa-miR-454-3p、
    hsa-miR-4787-3p、hsa-miR-548ad-3p、
    hsa-miR-497-5p、hsa-miR-548l、
    hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-553、
    hsa-miR-522-3p、hsa-miR-624-3p、
    hsa-miR-548a-5p、および、hsa-miR-764
    からなる、システム。
  14. 前記病期分類スコアを、ロジスティック回帰モデル、４つの病期分類クラスを含む多クラスアルゴリズム、最近傍セントロイド分類器、サポートベクターマシン及び二分決定木分類器からなる群からの任意のアルゴリズムにより算出する、請求項１３に記載のシステム。
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