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JP7365050B2 - 融合タンパク質、及びそれを用いた高密度リポタンパク質の測定キット - Google Patents
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融合タンパク質、及びそれを用いた高密度リポタンパク質の測定キット Download PDF

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Description

本発明は、変性高密度リポタンパク質の測定の標準品にするための融合タンパク質、それを形成するための核酸やベクターや細胞、及び変性高密度リポタンパク質の測定方法並びに測定キットに関するものである。
血中のコレステロールには、いわゆる善玉コレステロール（高比重リポタンパク質；ＨＤＬ:High Density Lipoprotein）と、いわゆる悪玉コレステロール（低比重リポタンパク質：ＬＤＬ:Low Density Lipoprotein）がある。血中でのそれらの濃度は、中性脂肪の濃度とともに、健康診断の指標として汎用されている。
本来のＨＤＬは、主要構成タンパク質であるＡｐｏＡ Ｉとリン脂質とを主成分とするもので、ＬＤＬの酸化を抑制するだけでなく、ＮＯの増加などを介して酸化ＬＤＬによる細胞毒性を軽減し、抗動脈硬化効果を発揮するものである。しかし、ＨＤＬも酸化などの修飾を受ける。動脈硬化患者の血中には、変性ＨＤＬが高値に存在することがわかっている。非特許文献１には、冠動脈疾患患者で、変性ＨＤＬが増えており、それがＬＯＸ－１を介して血管に作用することが、開示されている。
変性ＨＤＬは、本来ＨＤＬが有する抗動脈硬化作用を失っているだけでなく、動脈硬化発症、進展において、重要であることが分かってきた。非特許文献２には、ヒトの動脈硬化巣にはＨＤＬのアポタンパク質であるＡｐｏＡ Ｉが変性したものが多量に蓄積していることが、開示されている。
これらの結果は、実際の患者で測定したものであるから、変性ＨＤＬが、ヒトの病態において大きな意義を持っていると考えられる。従って、善玉コレステロールの中でも変性ＨＤＬが動脈硬化等の各種疾患の原因となる可能性があるから、単にＨＤＬの量のみでなく、変性ＨＤＬの量と質とを測定する必要がある。
従来の変性ＨＤＬの測定方法として、抗変性ＨＤＬ抗体によって測定するという測定法が知られている。この方法では、抗体の認識する特定のエピトープの量しか測定できない。しかもエピトープの量が測定できるだけであり、肝心の様々な変性を受けたＨＤＬを同時に、かつ生理活性を反映する形で測定できないという問題がある。
また、測定の際の検量線作成のリファレンスにも問題がある。例えば、4-hydroxynonenal（ＨＮＥ）により修飾されたＨＤＬを測定する場合は、ＨＮＥ修飾ＨＤＬをリファレンスとして用い、malondialdehyde（ＭＤＡ）により修飾されたＨＤＬを測定する場合はＭＤＡ修飾ＨＤＬをリファレンスとして用いることになる。したがって、様々な変性を受けたＨＤＬを単一の測定法で測定しようとしても、抗体が違うだけでなく、リファレンスが異なるために実質的に測定することが不可能である。これを解決するには銅イオンなどの存在下でＨＤＬの酸化を行う方法がある（以下、酸化ＨＤＬとよぶ）。しかし、酸化ＨＤＬやＨＮＥやＭＤＡにより修飾して作製したＨＤＬは、不安定で長期保存できないばかりか、不安定であるが故に測定毎に検量線作成をし直さなければならない。さらに、ロット間での品質のばらつきを生じ易く、再現的に調製して測定することが不可能である。そのため標準品のロット差を考慮して試験結果を補正しなければならず正確性に問題がある。従って、たとえ試験検体中の真の変性ＨＤＬの濃度が同じであったとしても、長期にわたる試験、大規模な試験、及び測定試験間ごとに、一定の測定値を得ることが困難であり、測定値自体の示す意味に信憑性の問題がある。
Besler C et al.: "Mechanisms underlying adverse effects of HDL on eNOS-activating pathways in patients with coronary artery disease.", J Clin Invest., Vol.121, p.2693-708, 2011 Huang Y et al.: "An abundant dysfunctional apolipoprotein A1 in human atheroma.’’, Nat Med, Vol.20, p.193-203, 2014
本発明者らは前記の課題を解決するための方策について、鋭意検討を重ねた。その結果、ＬＯＸ－１と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体により同時に認識されるＨＤＬを測定することにより様々な変性を受けたＨＤＬを測定できること、及びＬＯＸ－１に対する抗体（抗ＬＯＸ－１抗体）のＬＯＸ－１結合部位等のようにＬＯＸ－１に対して特異的に結合するタンパク質とＡｐｏＡ Ｉとを融合させた融合タンパク質が、ＬＯＸ－１と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体に対して変性ＨＤＬと同様の特異的結合性を示すばかりか、安定な標準品として使用できることを見出し、本発明を完成させた。
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、善玉のはずのＨＤＬが変性ＨＤＬとなって動脈硬化発症、進展に影響を及ぼすのでＨＤＬの質を測定するために用いられ、また、様々な変性を受けたＨＤＬを同時に認識でき、受容体結合活性を測定して生理活性そのものを測定するために用いられるもので、脂質を含まず、長期保存が可能で、再現的に調整でき、測定試験間ごとのばらつきを低減して信頼性を高くすることができるリファレンスとなり得る融合タンパク質、それを形成するための核酸やベクターや細胞、及び、ＬＯＸ－１と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体により認識される高密度リポタンパク質を正確に再現性・信頼性良く測定する方法並びに測定キットを提供することを目的とする。
前記の目的を達成するためになされた本発明の融合タンパク質は、レクチン様酸化ＬＤＬ受容体：ＬＯＸ－１へ結合するＬＯＸ－１結合タンパク配列に、アポリポタンパク質Ａ１：ＡｐｏＡ Ｉの全タンパク配列又は部分フラグメントタンパク配列が、直接又はスペーサを介して連結されている。
この融合タンパク質は、例えば、前記ＬＯＸ－１結合タンパク配列が、抗ＬＯＸ－１抗体、又はそれのＬＯＸ－１結合ドメイン配列であるというものである。
この融合タンパク質は、前記抗ＬＯＸ－１抗体、又はＬＯＸ－１結合ドメイン配列が、ＬＯＸ－１に抗原抗体反応により結合する抗体への活性部位を有していてもよい。
この融合タンパク質は、前記抗ＬＯＸ－１抗体が、前記活性部位を、Ｆｖ型抗体の活性部位とするものであってもよい。
この融合タンパク質は、前記ＡｐｏＡ Ｉの部分フラグメントタンパク配列が、ヒトＡｐｏＡ Ｉにおけるアミノ酸番号３１－２６７ａａの領域を含むものであることが好ましい。
前記の目的を達成するためになされた本発明の核酸は、前記の融合タンパク質をコードするものである。
前記の目的を達成するためになされた本発明のベクターは、前記の核酸が導入されているものである。
前記の目的を達成するためになされた本発明の細胞は、前記のベクターを有するものである。
前記の目的を達成するためになされた本発明の検体試料中の変性高密度リポタンパク質の測定方法は、ＬＯＸ－１と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体とに対して、変性高密度リポタンパク質が結合することによる変性高密度リポタンパク質の測定方法であって、請求項１～３の何れかに記載の融合タンパク質を変性高密度リポタンパク質の標準品として用いつつ前記標準品と検体試料中の変性高密度リポタンパク質とを、光学的検知及び／又は放射線量検知で、前記標準品との比較によって求めるというものである。
前記の目的を達成するためになされた本発明の変性高密度リポタンパク質測定キットは、ＬＯＸ－１と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体とに対して、変性高密度リポタンパク質が結合することによる変性高密度リポタンパク質の測定キットであって、前記の融合タンパク質を変性高密度リポタンパク質の標準品として用いつつ、光学的検知及び／又は放射線量検知で測定するためのものである。
この変性高密度リポタンパク質測定キットは、検体試料中の前記変性高密度リポタンパク質の濃度及び質を、光学的検知及び／又は放射線量検知で、前記標準品との比較によって求めるためのものである。
この変性高密度リポタンパク質測定キットは、ＬＯＸ－１及び／又は抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体をさらに含むことが好ましい。
この変性高密度リポタンパク質測定キットは、例えば前記検体試料が、全血、血漿又は血清である。
本発明の融合タンパク質は、善玉のはずのＨＤＬが変性ＨＤＬとなって、動脈硬化の発症や進展に影響を及ぼすので、変性ＨＤＬの質を測定するために、測定のリファレンスとなる普遍的な標準品として用いられる。
この融合タンパク質は、脂質を含まない、人工的な融合組換タンパク質であり、長期保存が可能で、再現的に調製でき、ヒトから採取した全血やそれを処理した血漿・血清のような検体試料に対して、測定日や測定時刻がずれても、測定試験間ごとのばらつきを低減して、信頼性を高めて信憑性のある実測値を得るのに用いられる標準品である。
従来の変性脂質の測定は、脂質の不安定性のために測定が容易でないという問題があり、さらに検体試料の迅速な処理が必要であった。検体試料自体の不安定性の問題は保存方法の適正化や測定時間の短縮により解消することが可能であるものの、測定の基準となる標準品が不安定で測定の安定性・再現性を担保できないという問題があった。しかし、この融合タンパク質は、脂質を有さずに、測定系のＬＯＸ－１タンパク質と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体の両方に親和性を持つ人工的なタンパク質を組換えＤＮＡ技術により作製し、これを安定かつ再現的に生産可能な標準品である。
この融合タンパク質は、それを形成するための核酸、それが導入されたベクター、それを有する動物細胞のような細胞を用いれば、同じ品質のものを適時に調製される。
この融合タンパク質を用いた本発明の変性高密度リポタンパク質の測定方法は、変性ＨＤＬに結合するＬＯＸ－１を利用した基質特異的な測定である。この測定方法は、様々な変性を起こしたＨＤＬを、単一の方法で検出・測定できるので、極めて簡便である。
一概に変性ＨＤＬと言っても実際の変性の種類は様々であり、同時に定量すればよいわけではなく、変性ＨＤＬが実際にどの程度の生物活性を持つかが、重要である。そこで、ＬＯＸ－１受容体が様々な変性ＨＤＬに結合し得ること、ＬＯＸ－１受容体への結合程度により生物活性を評価できることを利用し、変性高密度リポタンパク質の測定方法では、変性ＨＤＬの量と質とを検出・測定することができる。
この測定方法は、前記の融合タンパク質を定量や質の測定の対照となる標準品として用いるものである。この測定方法は、この融合タンパク質を、ＬＯＸ－１結合タンパク質として抗ＬＯＸ－１抗体の可変領域を中心としたＬＯＸ－１認識部分として用い、これとＡｐｏＡ Ｉタンパク質とのキメラタンパク質を作製し、それを用いて、検体試料中の変性ＨＬＤを測定するというものである。
この測定方法によれば、変性ＨＤＬに対して様々なエピトープを同時に認識でき、受容体結合活性を測定して生理活性そのものを測定するために用いることができるので、変性ＨＤＬの量及び質を正確にかつ再現性・信頼性良く測定できる。
また、この測定方法のために用いられる本発明の変性高密度リポタンパク質の測定キットによれば、簡便かつ迅速に、性ＨＤＬの量及び質を正確にかつ再現性・信頼性良く測定でき、動脈硬化や血栓症をはじめとする各種心疾患や虚血性疾患の検査や予測に役立ち、それらの疾患の予防に資することができる。
この測定キットは、ＬＯＸ－１を固相化して、ＬＯＸ－１に結合するＡｐｏＡ Ｉ含有リポタンパク質活性を受容体結合アッセイとしてＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ：Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）により評価するというものであり、汎用性が高い。
本発明を適用する融合タンパク質のアミノ酸配列を一文字標記で表した図である。 ＬＯＸ－１又はＤｅｃｔｉｎ－１が、ＨＤＬ、酸化ＨＤＬ、ＬＤＬ、酸化ＬＤＬに結合するか否かを試験した結果のグラフを示す図である。 本発明を適用する融合タンパク質及びＬＯＸ－１結合と、本発明を適用外の人工酸化ＨＤＬ及びＬＯＸ－１結合との試験を行った結果の対比にグラフを示す図である。 人工酸化ＨＤＬと、融合タンパク質のＬＯＸ－１への反応性をロット間で比較したＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。 ヒト血漿中のＬＯＸ－１結合変性ＨＤＬを検出した結果を示すグラフである。
以下、本発明を実施するための形態について、詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの形態に限定されるものではない。
本発明の融合タンパク質は、ＬＯＸ－１へ結合するＬＯＸ－１結合タンパク配列に、ＡｐｏＡ Ｉの全タンパク配列又は部分フラグメントタンパク配列が、直接又はスペーサを介して連結されているキメラタンパク質である。
そのためこの融合タンパク質は、ＬＯＸ－１に対する特異的結合性と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体に対する特異的結合性とを備えている。この融合タンパク質は、例えば、ＬＯＸ－１と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイによる変性ＨＤＬ測定において、従来の標準品（人工酸化ＨＤＬ）に代えて、安定であって精度を管理し易い標準品として使用できる。
この融合タンパク質は、脂質を有していないため、安定である。また、組換えＤＮＡ技術による大量生産が可能であり、同一ロットの標準品を大量に得ることができる。
この融合タンパク質は、ＡｐｏＡ Ｉの全長である全タンパク配列より低分子であるその部分フラグメントタンパク配列を有していると、全タンパク配列を有するよりも組換えＤＮＡ操作による調製を行い易い。
この融合タンパク質は、ＬＯＸ－１結合タンパク配列が、例えば抗ＬＯＸ－１抗体、又はそれの一部であってＬＯＸ－１に特異的に結合し得るＬＯＸ－１結合ドメイン配列であり、抗体やそれと構造上・機能上の関連を持つ免疫グロブリンＩｇが挙げられる。その免疫グロブリンＩｇは、そのアイソタイプのクラスやサブクラスが限定されず、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３等のようなＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等が、挙げられる。
ＬＯＸ－１結合タンパク配列が全長の免疫グロブリンＩｇからなる抗ＬＯＸ－１抗体である場合、ＬＯＸ－１に結合する抗体であれば特に限定されず、例えば動物由来のものでヒト、マウス、ウシ等に由来のものが挙げられ、より具体的にはヒトＬＯＸ－１に対して特異的に結合するマウス抗ＬＯＸ－１モノクローナル抗体＃１０－１（“LOX-1-MT1-MMP axis is crucial for RhoA and Rac1 activation induced by oxidized low-density lipoprotein in endothelial cells.”, Sugimoto K., et al., Cardiovasc Res, Vol.84, p124-136, 2009 参照）が挙げられる。
またＬＯＸ－１結合タンパク配列が、免疫グロブリン可変領域を含む抗体の機能的断片となる抗ＬＯＸ－１抗体の一部とするＬＯＸ－１結合ドメイン配列である場合、ＶH、ＶL、Ｆｖ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）2等が挙げられる。
この融合タンパク質は、例えば抗ＬＯＸ－１抗体、又はＬＯＸ－１結合ドメイン配列が、ＬＯＸ－１に抗原抗体反応により結合する抗体への活性部位、好ましくはＦｖ型抗体の活性部を有していてもよい。Ｆｖ型抗体（ｓｃＦｖ、ＶH－ＶL）は、図１に示すように、重鎖可変領域（ＶH）と軽鎖可変領域（ＶL）とが連結された抗体の機能的断片である。
この融合タンパク質中、ＡｐｏＡ Ｉの全タンパク配列又は部分フラグメントタンパク配列は、ＡｐｏＡ Ｉとして作用するものであれば特に限定されず、例えば動物由来のものでヒト、マウス、ウシ等に由来のものが挙げられる。
この融合タンパク質は、より具体的な一例としては、図１に一文字表記で、配列番号１に三文字表記で示した通りのものであり、ＬＯＸ－１へ結合するＬＯＸ－１結合タンパク配列として抗ＬＯＸ－１抗体（＃１０－１）のＬＯＸ結合ドメイン（破線部分）と、ＡｐｏＡ Ｉの部分フラグメントタンパク配列として抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体結合タンパクであるヒトＡｐｏＡ Ｉにおけるアミノ酸番号３１－２６７ａａの領域とを有するものである。
この融合タンパク質中、ＬＯＸ－１へ結合するＬＯＸ－１結合タンパク配列や、ＡｐｏＡ Ｉの全タンパク配列又は部分フラグメントタンパク配列は、天然由来のものに限定されず、その機能を発現する限り、アミノ酸の一部が置換、欠損、挿入された変異タンパク質配列であってもよい。
この融合タンパク質は、ＬＯＸ－１結合タンパク配列のＮ末端側にＡｐｏＡ Ｉの全タンパク配列又は部分フラグメントタンパク配列のＣ末端側が結合して連結していてもよく、ＬＯＸ－１結合タンパク配列のＣ末端側にＡｐｏＡ Ｉの全タンパク配列又は部分フラグメントタンパク配列のＮ末端側が結合して連結していてもよい。それらは、アミド結合で直接結合して連結していてもよく、ＡｐｏＡ ＩやＬＯＸ－１の作用を阻害しないポリペプチドであるスペーサ基を介したアミド結合で間接的に連結していてもよく、ポリペプチド及び／又は非ポリペプチドのスペーサ基を介してアミド結合以外のエーテル結合等の共有結合で間接的に結合していてもよい。
本発明を適用外の酸化ＨＤＬ含有タンパク質と本発明を適用する融合タンパク質とを対比する。この融合タンパク質は、酸化脂質が不安定でリファレンスや標準品として不適当な生体由来の酸化ＨＤＬと異なり、酸化ＨＤＬを人工タンパク質に置換したものであり、リン脂質を有しないから安定かつ再現的に生産可能なものである。
この融合タンパク質の製造方法は、特に限定されず、公知の遺伝子技術によって調製してもよく、化学合成によって調製してもよい。
遺伝子技術によれば、例えば、その融合タンパク質をコードする核酸を調製し、その核酸を導入したベクターを作製し、そのベクターを用いて宿主細胞、例えば、ＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞のような動物細胞、酵母、大腸菌のような細菌などから製造することができる。
一態様であるこの融合タンパク質を、抗ＬＯＸ－１抗体と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体結合タンパク質であるヒトＡｐｏＡ Ｉとから作製する概要を、説明する。
より具体的には、この融合タンパク質は、ＬＯＸ－１へ結合するＬＯＸ－１結合タンパク配列（例えば抗ＬＯＸ－１抗体の全アミノ酸配列である全長又はそれの一部でありＬＯＸ－１へ結合するアミノ酸配列である部分断片）をコードするＤＮＡと、ＡｐｏＡ Ｉの全タンパク配列である全長又はそれの一部であり抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体に結合する部分フラグメントタンパク配列である部分断片をコードするＤＮＡを、それぞれ抗ＬＯＸ－１抗体とＡｐｏＡ Ｉから、既知の塩基配列情報を基にして、ＰＣＲ等の操作により、又は化学合成により取得する。
次に、ＬＯＸ－１結合タンパク質部分をコードするＤＮＡとＡｐｏＡ Ｉの全長又は部分断片をコードするＤＮＡとをフレームが一致するように連結して、融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子を調製する。
次いで、制限酵素と連結酵素とを用いて、このキメラ遺伝子を、大腸菌プラスミドのようなベクターに適宜組み込み、融合タンパク質発現ベクターとなる組換えベクターを調製する。この組換えベクターの概要を説明する。
この組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換して、融合タンパク質発現細胞となる組換え細胞を作製する。
さらに、この組換え細胞を培養する。その培養物から、融合タンパク質を、遠心分離、塩析、膜分離、アフィニティクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィーなどの適切な分離方法により、精製して採取する。
検体試料中の変性高密度リポタンパク質の測定方法は、この融合タンパク質を標準品として用い、ＬＯＸ－１と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体とに対して、変性高密度リポタンパク質が特異的に結合するという反応を利用して、測定するというものである。
具体的には、(1)この融合タンパク質を標準品として濃度や活性と光学強度や放射線量等の測定値との相関関係の基準となる検量線や対比表や換算式等を作成する。例えば、段階的に希釈した融合タンパク質の標準溶液を調製し、イムノアッセイを行い、濃度毎に、吸光度のような光学強度や放射線強度のような放射線量等の標準液測定値を測定し、融合タンパク質の濃度と、標準液測定値との検量線又は対比表等を作成する。
(2)一方、ヒトの全血や血漿や血清のような検体試料の変性ＨＤＬについて測定する。例えば、標準液での測定と同様なイムノアッセイを行い、検体試料の変性ＨＤＬによる光学強度や放射線量等の測定値を求める。
(3)次いで、変性ＨＤＬによる光学強度や放射線量等の測定値と、検量線や対比表等との比較や、測定値の換算式への代入により、変性ＨＤＬの量や質を包括的に検出・測定するというものである。例えば、変性ＨＤＬによる光学強度や放射線量等の測定値を、検量線や対比表に当てはめ又は換算式に代入して、融合タンパク質相当量を、変性ＨＤＬの量や質について融合タンパク質に対する相対値として、得る。この検量線や対比表から得られた換算式に代入して、融合タンパク質相当量を、算出してもよい。
この変性高密度リポタンパク質の測定方法は、ＬＯＸ－１と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体を用いたイムノアッセイが用いられる。このようなイムノアッセイは、サンドイッチ法、競合法など公知の方法で行われる。
この変性高密度リポタンパク質の測定方法は、検体試料を測定するには、例えばＬＯＸ－１及び抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体の何れか一方が支持体に固定化されている、いわゆる固相法により、行われる。支持体は、マイクロプレートの各ウェル、及び／又はビーズが挙げられる。
この変性高密度リポタンパク質の測定方法は、ＬＯＸ－１と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体とを用いたイムノアッセイとして、従来のように測定のリファレンスとして酸化ＨＤＬを用いる酸化ＨＤＬ測定法に代えて、又はそれにさらに付加して、行うことができる。
この変性高密度リポタンパク質の測定方法は、例えば、ＬＯＸ－１をマイクロプレートのウェル等の支持体に固相化した例で説明すると、そのウェルにヒトから採取した全血や血漿や血清のような検体試料を加え、検体試料中に存する変性ＨＤＬをＬＯＸ－１上に捕捉させる。次に、そこへ標識された抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体を添加し又は予め添加しておき、捕捉された変性ＨＤＬに、その抗体を結合させる。結合した抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体の標識を指標にして、検体試料中の変性ＨＤＬを光学的検知及び／又は放射線量検知で測定することができる。
この標識は、光学的検知及び／又は放射線量検知により測定するためのもので、例えば酵素（エンザイムイムノアッセイ、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、蛍光物質（蛍光イムノアッセイ、ＦＩＡ）、放射性物質（ラジオイムノアッセイ、ＲＩＡ）などが挙げられる。
抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体を標識することに代えて、抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体を非標識とし、抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体に結合する標識２次抗体を用いてもよい。抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体は、モノクローナルであってもよく、ポリクローナルであってもよい。
ＬＯＸ－１は公知の方法（例えば、特開平９－９８７８７号公報など）により、調製できる。抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体は、市販のものを用いてもよい。
この変性高密度リポタンパク質の測定方法で測定できる変性ＨＤＬとして、例えば、ＨＣｌＯ－ＨＤＬ、ＨＮＥ－ＨＤＬ、Carbamylated ＨＤＬ及びＭＤＡ－ＨＤＬなどが挙げられる。これらの変性ＨＤＬは、血管壁の血管内皮細胞を障害し、動脈硬化や血栓形成を引き起こす心疾患や虚血疾患等の動脈硬化性疾患のような各種疾患の発症リスクを高めるものである。
この変性高密度リポタンパク質の測定方法は、動脈硬化性疾患のリスク評価指標、特に脳梗塞との強い関係性や頚動脈内膜肥厚との関連のような評価指標、さらに動脈硬化進展のサロゲートマーカー、動脈硬化治療効果判定指標として、診断、治療法の選択、診察結果の数値化に、用いることができる。
この変性高密度リポタンパク質の測定方法によれば、単なるＨＤＬ・ＬＤＬの測定結果による健康診断のみでは測定し得ない変性ＨＤＬの量や質を測定して、必要に応じて変性ＬＤＬの測定と共に、変性コレステロールの適切な評価・診療に供することができる。
この変性高密度リポタンパク質の測定方法は、ＬＯＸ－１と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体とに対して、変性高密度リポタンパク質が結合することによる本発明の変性高密度リポタンパク質の測定キットを用いて行うことができる。
この変性高密度リポタンパク質の測定キットは、一方では、前記の融合タンパク質を変性高密度リポタンパク質の標準品として用いつつ、融合タンパク質の濃度毎に光学強度を光学的に測定して、検量線や対比表や換算式などを作成し、他方では、検体試料例えばヒトの全血や血漿や血清について、ＬＯＸ－１又は抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体のいずれかがマイクロプレートの各ウェルやビーズのような支持体に固定化されＬＯＸ－１又は抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体の他の片方が添加されているいわゆる固相法により、光学強度を光学的に測定して、検量線や対比表などと比較して又は換算式に代入して、検体試料中の変性ＨＤＬの濃度を検出・測定するのに、用いられる。
この変性高密度リポタンパク質の測定キットは、必要に応じた支持体例えばマイクロプレートのウェル上にＬＯＸ－１が固定され、それに結合する融合タンパク質と、その融合タンパク質に結合する抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体と、緩衝液とを有し、また必要に応じた別な支持体例えば変性ＨＤＬを測定すべき検体試料を添加可能なマイクロマイクロプレートのウェル上にＬＯＸ－１が固定され、ＬＯＸ－１に変性ＨＤＬが結合したらそれに結合する抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体と、緩衝液とを有している。抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体は、標識され、又は標識されずに二次標識と共存する。
以下に、本発明を適用する融合タンパク質と、それを用いた変性高密度リポタンパク質の測定キットとを作製し、そのキットによる変性高密度リポタンパク質の測定方法を行った詳細について説明する。
先ず、以下のようにして本発明の融合タンパク質を調製した。
（調製例１）融合タンパク質の調製
ＬＯＸ－１タンパク質と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体の両方に親和性を持つタンパク質を得るため、先ず、抗ＬＯＸ－１抗体遺伝子（可変領域（Ｆｖ領域））とＡｐｏＡ Ｉ遺伝子からなる融合タンパク質遺伝子を作製した。Ｆｖ型抗体遺伝子は、マウスモノクローナル抗ヒトＬＯＸ－１抗体(＃１０－１)産生ハイブリドーマのｃＤＮＡからクローニングした可変領域遺伝子をもとに作製したａｎｔｉ－ＬＯＸ－１－Ｆｖ遺伝子を用いた(”LOX-1-MT1-MMP axis is crucial for RhoA and Rac1 activation induced by oxidized low-density lipoprotein in endothelial cells.”, Sugimoto K, et al., Cardiovasc Res, Vol.84, p127-136, 2009に記載)。ＡｐｏＡ Ｉ遺伝子はヒト肝臓ｃＤＮＡよりクローニングした。
（調製方法２）ＡｐｏＡ Ｉ遺伝子のクローニング
ヒトＡｐｏＡ Ｉ全長遺伝子（GenBank accession no. NM000039.2; 1,239 bp）を、Human MTC Panel II (Clontech)の肝臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、プライマーセットApoAI-F (CACCATGAAAGCTGCGGTGCTGACCTTG)（配列番号２）, ApoAI-R (CTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTAC)（配列番号３）、PrimeSTAR HS DNA Polymerase (TAKARA#R010A)を用いてＰＣＲを行い、ＡｐｏＡ Ｉ全長遺伝子を得た。次に、この全長遺伝子をpcDNA Gateway Directional TOPO Expression kit (Invitrogen)を用いてpcDNA6.2/V5/GW/D-TOPO vector (Invitorgen)にサブクローニングし、ABI PRISM Cycle sequencing kitにより塩基配列を確認した。
（調製方法３）Ｆｖ型抗ＬＯＸ－１抗体とＡｐｏＡ Ｉとの融合タンパク質の作製
Ｆｖ型抗ＬＯＸ－１抗体のＣ末端側とＡｐｏＡ ＩのＮ末端側とがリンカー配列を介して連結された融合タンパク質を、以下の手順により作製した。
上記のＦｖ型抗ＬＯＸ－１抗体発現ベクターを鋳型とし、フォワードプライマー（Fv-H-Fプライマー：CACCATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTA）（配列番号４）及び３’末端にリンカー配列の一部を含むリバースプライマー（Fv-L-Linker-Rプライマー：ACCAGAGCCGCCGCCGCCGCTACCACCACCACCTTTCAACTCCAGCTTGGTCCC）（配列番号５）、PrimeSTAR HS DNA Polymerase (TAKARA#R010A)を用いてＰＣＲを行い、Ｆｖ型抗ＬＯＸ－１抗体遺伝子を再増幅した。
また、上記で調製したＡｐｏＡ Ｉ全長遺伝子を鋳型とし、リンカー配列の一部を５’末端に含むフォワードプライマー（Linker-ApoAI-Fプライマー：AGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGATCCCGGCATTTCTGGCAGCAAGATGAAC）（配列番号６）及びリバースプライマー(ApoAI-Rプライマー：CTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTC)（配列番号７）、PrimeSTAR HS DNA Polymerase (TAKARA#R010A)を用いてＰＣＲを行い、ＡｐｏＡ Ｉをコードする遺伝子を再増幅した。
これらを、ｏｖｅｒｌａｐ－ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ法を用いることにより、Ｆｖ型抗体とＡｐｏＡ Ｉ(55-801bp)をそれぞれリンカー配列を介してＶＬのＣ末端側とＡｐｏＡ ＩのＮ末端側を連結させ、この融合タンパク質遺伝子をpEF6-V5-His vector (Invitrogen)に挿入した。
続いて、KOD-Plus- Mutagenesis Kit (TOYOBO#SMK-101)、Linker Rプライマー(GGATCCACCACCACCAGAGCCGCCG)（配列番号８）、ApoA1-31aa Fプライマー(CCCTGGGATCGAGTGAAGGACCTGG)（配列番号９）を用いて、ＡｐｏＡ Ｉの翻訳後切断部位Gln24(“cDNA cloning of human apoA-I: amino acid sequence of preproapoA-I.”, Law SW., et al., Biochem Biophys Res Commun, Vol.112, p257-264, 1983 参照)を含む19-30番目のアミノ酸配列を欠失させた。ABI PRISM Cycle sequencing kitにより塩基配列を確認し、これをタンパク質発現系に用いた。
融合タンパク質の発現はExpi293 Expression System (Invitrogen)を用いて行い、培地中に分泌された融合タンパク質をNi Sepharose excel resin (GE)を用いてHis精製した。得られたタンパク質はPBS中で透析した後、0.22μmのフィルターろ過滅菌を行い実験に使用した。
（試験例１）ＬＯＸ－１結合変性ＨＤＬ検出系の構築
まず、ヒトＥＤＴＡ血漿からＫＢｒ密度勾配遠心法により分離したＨＤＬまたはＬＤＬを、濃度が３ｍｇ/ｍｌとなるようにＰＢＳで調整し、硫酸銅を７．５μＭとなるように添加した後、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター内で１６時間インキュベーションした。続いて、この溶液を、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液を外液として透析し、ヒト酸化ＨＤＬ、酸化ＬＤＬとした。
受容体ＬＯＸ－１に、この酸化ＨＤＬが結合するかどうかをＬＯＸ－１タンパク質と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより検討した。
ＬＯＸ－１及び抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ
組換えヒトＬＯＸ－１（６１－２７３ａａ）または対照としてＬＯＸ－１と同じファミリーに属するタンパク質Ｄｅｃｔｉｎ－１を、ＥＬＩＳＡプレートに４℃で終夜固相化した。ＰＢＳで洗浄した後、３％ＢＳＡ含有ＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７.４）によりブロッキングした。ＰＢＳで３回洗浄後、酸化ＨＤＬ、ＨＤＬ、酸化ＬＤＬ、ＬＤＬをそれぞれ添加しインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ニワトリ抗ＡｐｏＡ Ｉモノクローナル抗体（chicken monoclonal anti-ApoB antibody）あるいはＨＲＰ標識抗ＡｐｏＡ Ｉポリクローナル抗体（Sheep polyclonal anti-ApoB antibody-HRP）を添加した。ニワトリ抗ＡｐｏＡ Ｉモノクローナル抗体を用いる場合には、ニワトリ抗ＡｐｏＡ Ｉモノクローナル抗体を添加し、室温で１時間反応させた後、ＰＢＳで洗浄した後、二次抗体HRP-labeled Donkey anti-chicken IgYを添加し、室温で１時間インキュベートした。
抗体反応後ＰＢＳで５回洗浄し、TMB solutionをプレートに添加し室温で反応させた。２Ｍ硫酸で反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度をSpectraMax 340PC384 (Molecular Devices)を用いて測定し、結合した酸化ＨＤＬを検出した。
その結果を、図２に示す。図２は、ＬＯＸ－１結合変性ＨＤＬ検出系が構築できるかを調べるため、ＬＯＸ－１又はＤｅｃｔｉｎ－１へのＨＤＬ、酸化ＨＤＬ、ＬＤＬ、酸化ＬＤＬの結合を、抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体で検出した結果を示すグラフである。図２から明らかな通り、酸化ＨＤＬのLOX-1への濃度依存性の結合が観察され、酸化していないＨＤＬ並びにＬＤＬ及び酸化ＬＤＬのＬＯＸ－１への結合は検出されなかった。一方、ｄｅｃｔｉｎ－１は、酸化ＨＤＬにもＨＤＬにも結合しなかった。これにより、ＬＯＸ－１に結合する変性ＨＤＬをＥＬＩＳＡで検出できることが分かった。
（試験例２）人工酸化ＨＤＬ-ＬＯＸ－１結合と融合タンパク質-ＬＯＸ－１結合との対比
前記の試験例１で作製した人工酸化ＨＤＬと、前記調製例１で作製した融合タンパク質とを夫々用い、前記試験例１の方法に準じ、人工酸化ＨＤＬ又は融合タンパク質のＬＯＸ－１及び抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体への結合を検討した。その結果を、図３中に、●で示す。図３から明らかな通り、作製した融合タンパク質は、ＬＯＸ－１と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体に同時に結合し、同図中、△で示すように、ＬＯＸ－１を固相化していない場合には検出されなかった。このように、融合タンパク質も人工酸化ＨＤＬと同様の方法で、ＥＬＩＳＡで検出できることが分かった。
なお、人工酸化ＨＤＬは、脂質を含んでいるため脂質が空気に触れて酸素で容易く酸化し経時的に化学変化を起こして劣化してしまうので、再現性に劣る。しかし、作製した融合タンパク質を用いれば、脂質を有しておらず空気に触れても酸化し難く経時的に化学変化を起こし難く高品質のまま維持でき、再現性に長ける。従って、この融合タンパク質を用いた測定によれば、常に同じ結果が得られる尺度となるので、普遍的な検量線や対比表や換算式作成の標準品となり得る。
（試験例３）人工酸化ＨＤＬ、融合タンパク質のロット間比較
ヒト血漿より調製したＨＤＬを人工的に酸化させた酸化ＨＤＬについて、ロット間の違いにより測定値にどの程度影響するのかを、ＬＯＸ－１と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（上記（試験例１））により検討した。また、本実施例で作製した融合タンパク質でのロット間の違いも同様に検討し、融合タンパク質の有用性を検証した。その結果を、図４に示す。図中、〇、●、▲はロットが異なる人工酸化ＨＤＬ又は融合タンパク質を示す。人工酸化ＬＤＬ（ｏｘＨＤＬ）は３つの異なるロットで反応性に差が見られた。一方、融合タンパク質ではロット間でほとんど差はみられなかった。
（試験例６）ヒト血液中の変性ＨＤＬの検出
前記試験例１の方法に準じ、ヒト血液中の変性ＨＤＬ検出を試みた。測定検体には、健常人ボランティア６名から採取したＥＤＴＡ血漿を用いた。
結果を図５に示す。すなわち、ＬＯＸ－１と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、ヒト血液中の変性ＨＤＬを検出できることが示された。
この試験により、作製した人工組換タンパク質が、ＬＯＸ－１とＡｐｏＡ Ｉ抗体の両方を同時に認識できるかどうかを、ＬＯＸ－１タンパク質と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、確認できた。このことから、作製した人工組換タンパク質は、ＬＯＸ－１とＡｐｏＡ Ｉ抗体に同時に結合し、抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体により検出されることが分かった。従って、安定かつ再現的に生産可能な標準検体の作製に成功したことが分かった。
このように、高密度リポタンパク質の測定の標準品にするための融合タンパク質、それを形成するための核酸やベクターや細胞、及び高密度リポタンパク質の測定方法並びに測定キットについて、詳細に説明した通り、本発明によれば、変性ＨＤＬを正確、かつ簡便に再現性よく迅速に検出して測定できる。
このような変性ＨＤＬの測定は、その量のみならず質を検知するものであるから、血液中のＨＤＬ・ＬＤＬの測定が健康診断の指標として用いられているのと同様に、いずれ標準的な測定方法になるであろう。
この変性ＨＤＬの測定によれば、これまで見逃されてきた動脈硬化や血栓形成のような動脈硬化性疾患や心疾患等のリスクの評価法を提供することができるようになる。また、動脈硬化性疾患や心疾患等の生活習慣病の一次予防、診察、治療方針の検討、治療、治療効果判定、二次予防に役立てることができる。
本発明の融合タンパク質は、高密度リポタンパク質を正確に再現性・信頼性良く測定する方法並びに測定キットの標準品として、有用である。この高密度リポタンパク質を形成するための核酸やベクターや細胞は、高密度リポタンパク質の調製のために有用である。
この融合タンパク質を用いた本発明の高密度リポタンパク質を正確に再現性・信頼性良く測定する方法並びに測定キットは、動脈硬化性疾患や心疾患等の予防、診療を行う際の重要な情報を得るのに有用である。

Claims (13)

  1. ＬＯＸ－１へ結合するＬＯＸ－１結合タンパク配列を有するタンパク質に、ＡｐｏＡ Ｉの全タンパク配列又は部分フラグメントタンパク配列を有するタンパク質が、直接又はスペーサを介して連結されていることを特徴とする融合タンパク質。
  2. 前記ＬＯＸ－１結合タンパク配列が、抗ＬＯＸ－１抗体、又はそれのＬＯＸ－１結合ドメイン配列であることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 前記抗ＬＯＸ－１抗体、又はＬＯＸ－１結合ドメイン配列が、ＬＯＸ－１に抗原抗体反応により結合する抗体への活性部位を有していることを特徴とする請求項２に記載の融合タンパク質。
  4. 前記抗ＬＯＸ－１抗体が、前記活性部位を、Ｆｖ型抗体の活性部位とすることを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質。
  5. 前記ＡｐｏＡ Ｉの部分フラグメントタンパク配列が、ヒトＡｐｏＡ Ｉにおけるアミノ酸番号３１－２６７ａａの領域を含むものである請求項１～４の何れかに記載の融合タンパク質。
  6. 請求項１～５の何れかに記載の融合タンパク質をコードするものであることを特徴とする核酸。
  7. 請求項６に記載の核酸が導入されていることを特徴とするベクター。
  8. 請求項７に記載のベクターを有することを特徴とする細胞。
  9. ＬＯＸ－１と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体とに対して、変性高密度リポタンパク質が結合することによる変性高密度リポタンパク質の測定方法であって、請求項１～３の何れかに記載の融合タンパク質を変性高密度リポタンパク質の標準品として用いつつ前記標準品と検体試料中の変性高密度リポタンパク質とを、光学的検知及び／又は放射線量検知で、前記標準品との比較によって求めることを特徴とする検体試料中の変性高密度リポタンパク質の測定方法。
  10. ＬＯＸ－１と抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体とに対して、変性高密度リポタンパク質が結合することによる変性高密度リポタンパク質の測定キットであって、請求項１～３の何れかに記載の融合タンパク質を変性高密度リポタンパク質の標準品として有し、
    光学的検知及び／又は放射線量検知で測定するためのものであることを特徴とする変性高密度リポタンパク質測定キット。
  11. 検体試料中の前記変性高密度リポタンパク質の濃度及び質を、光学的検知及び／又は放射線量検知で、前記標準品との比較によって求めるためのものであることを特徴とする請求項１０に記載の変性高密度リポタンパク質の測定キット。
  12. ＬＯＸ－１及び／又は抗ＡｐｏＡ Ｉ抗体をさらに含む請求項１０～１１の何れかに記載の変性高密度リポタンパク質の測定キット。
  13. 前記検体試料が、全血、血漿又は血清であることを特徴とする請求項１１に記載の変性高密度リポタンパク質の測定キット。
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