JP7395251B2 - 改善された凝乳特性を有するキモシン変異体 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、改善された凝乳特性を有するキモシンの変異体に関する。

背景技術
哺乳類の胃の凝乳酵素である、キモシン（ＥＣ３．４．２３．４）およびペプシン（ＥＣ３．４．２３．１）は、広いクラスのペプチダーゼに属するアスパラギン酸プロテアーゼである。

胃粘膜細胞で産生される場合、キモシンおよびペプシンはそれぞれ、酵素的に不活性なプレ－プロキモシンおよびプレ－ペプシノーゲンとして生じる。キモシンが分泌されると、Ｎ末端ペプチドフラグメントである、プレ－フラグメント（シグナルペプチド）が切断され、プロ－フラグメントを含むプロキモシンが得られる。プロキモシンは酵素の実質的に不活性な形態であるが、プロ－フラグメントの自己触媒除去により活性キモシンへと酸性条件下で活性化される。この活性化は、適切なｐＨ条件下で胃管腔においてインビボにて、または酸性条件下でインビトロにて起こる。

ウシ、すなわちボス・タウラス（Bos taurus）の、プレ－プロキモシン、プロキモシンおよびキモシンの構造的および機能的特性は広く研究されてきた。ウシプレ－プロキモシン分子のプレ－部分は１６個のａａ残基を含み、対応するプロキモシンのプロ－部分は４２個のａａ残基の長さを有する。活性ウシキモシンは３２３ａａを含む。

キモシンは哺乳類種、例えばウシ、ラクダ、ヤギ（caprines）、バッファロー、ヒツジ、ブタ、ヒト、サルおよびラットにおいて、天然に生成される。

ウシおよびラクダキモシンは長年にわたって酪農業界に市販されてきた。

凝乳酵素、例えばキモシンおよびペプシンによる乳の酵素的凝固は、チーズの製造における最も重要な工程の１つである。酵素的な乳の凝固は、次の２相工程である：タンパク質分解酵素であるキモシンまたはペプシンが、κ－カゼインを攻撃し、カゼインミセル構造の準安定状態をもたらす第１相、および、続いて乳が凝固し、凝固物を形成する第２相（参考文献１）。

ＷＯ０２／３６７５２Ａ２（Chr.Hansen）は、ラクダキモシンの組換え生成を記載している。
ＷＯ２０１３／１７４８４０Ａ１（Chr.Hansen）は、ウシおよびラクダキモシンの突然変異体／変異体を記載している。
ＷＯ２０１３／１６４４７９Ａ２（ＤＳＭ）は、ウシキモシンの突然変異体を記載している。

以下に列挙した参考文献は、本文脈において、キモシンの突然変異体を記載する参考文献として参照される：
- Suzuki et al: Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71;
- Suzuki et al: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569;
- van den Brink et al: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310;
- Pitts et al: Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83;
- M.G. Williams et al: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997;
- Strop et al: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Val111phe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871;
- Chitpinityol et al: Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139;
- Zhang et al: Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286。

上述の先行技術文献のいずれも、以下に記載するように、変異体の元となった親と比較して、改善された比凝固活性または増加したＣ／Ｐ比を有するキモシン変異体を直接かつ明確に記載していない。

発明の概要
本発明によって解決されるべき問題は、親ポリペプチドと比較した場合に、改善された比凝固活性もしくは増加したＣ／Ｐ比のいずれか、またはその両方を有するキモシンの変異体を提供することである。

異なる変異体の知的設計および比較分析に基づいて、本発明者らは、多くのアミノ酸位置を同定し、このアミノ酸位置は、親ペプチド内でのこれらの位置の１または複数における変異体を作製することによって、増強された比凝固活性もしくは増加したＣ／Ｐ比のいずれか、またはその両方を有する改善されたキモシン変異体を得ることができるという意味で、本明細書において重要である。

変異体または突然変異を特定するために本明細書で使用されるアミノ酸の番号付けは、成熟ペプチドに基づく。当該技術分野で知られているように、異なる哺乳動物種から得られた異なる天然野生型キモシンポリペプチド配列（例えばウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、またはラット）は、比較的高い配列類似性／同一性を有している。図１において、これは、本明細書で関連する異なるキモシン配列のアラインメントによって例示される。この比較的近い配列関係を考慮して、異なる天然野生型キモシンの３次元構造も比較的類似していると考えられる。

本文脈において、天然に得られた野生型キモシン（例えばウシキモシンまたはラクダキモシン）は、本明細書において親ポリペプチドの一例、すなわち、本発明の変異体キモシンポリペプチドを生成するために改変が成される親ポリペプチドであり得る。

理論に制限されることなく、本明細書で議論されたキモシンに関連するアミノ酸位置は、任意の本明細書に関連する目的のキモシン酵素（例えばウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、ラットなどのキモシン）において一般的に重要であり、それは、これらの位置の１または複数における変異体を作製することによって、一般的に改善されたキモシン変異体（例えば改善されたウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタまたはラットキモシン変異体）を得ることができるという意味で、重要であると考えられる。

本明細書で議論されるように、目的の親キモシンポリペプチド（例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど）のアミノ酸位置を決定するための参照配列として、本明細書における配列番号２の公知のヒトコブラクダ（Camelius dromedarius）成熟キモシン配列が本明細書で使用される。それを本明細書では代わりにラクダキモシンと呼ぶことができる。当該配列はまた、本明細書の図１に示される。

本文脈において、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する親キモシンポリペプチド（例えばヒツジまたはラット由来）は、本明細書に記載したアミノ酸位置のいずれかにおける変異体を作製することによって改善されるために、例えばウシまたはラクダキモシンに関して、本明細書において十分な構造として見ることができると考えられる。

本発明の実施形態を以下に説明する。

定義
本明細書に関連する用語のすべての定義は、本明細書に関連する技術的内容に関する当業者によって理解され得るものに従う。

用語「キモシン」は、ＥＣ３．４．２３．４クラスの酵素に関する。キモシンは高い特異性を有し、カゼインのκ－鎖における単一１０４－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ－｜－Ｍｅｔ－Ａｌａ－１０７結合の切断によって、主に乳を凝固させる。副活性（side-activity）として、キモシンはまた、α－カゼインをＰｈｅ２３とＰｈｅ２４との間で、およびβ－カゼインを主にＬｅｕ１９２とＴｙｒ１９３との間で切断する（参考文献２、３）。得られたペプチドαＳ１（１－２３）およびβ（１９３－２０９）は、微生物培養物から成熟チーズに加えられるプロテアーゼによってさらに分解されることになる（参考文献４）。当該技術分野で使用されるキモシンの代替名は、レンニンである。

用語「キモシン活性」は、本文脈において当業者によって理解される、キモシン酵素のキモシン活性に関する。当業者は、本明細書において関連するキモシン活性の決定方法を知っている。

当該技術分野において知られているように、本明細書で関連するいわゆるＣ／Ｐ比は、比凝固活性（Ｃ）をタンパク質分解活性（Ｐ）で割ることによって決定される。当該技術分野において知られているように、より高いＣ／Ｐ比は、一般に、チーズの収率が向上する可能性がある、非特異的タンパク質分解による、例えばチーズ製造中のタンパク質の損失が低減されることを意味する。

用語「単離された変異体」は、人間の行為によって改変された変異体を意味する。一態様において、当該変異体は、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより決定されるように、少なくとも１％純粋、例えば、少なくとも５％純粋、少なくとも１０％純粋、少なくとも２０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、および少なくとも９０％純粋である。

用語「成熟ポリペプチド」は、翻訳および任意の翻訳後修飾、例えばＮ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化などの後の、その最終形態のペプチドを意味する。本文脈において、本明細書で関連する成熟キモシンポリペプチドは活性キモシンポリペプチド配列、すなわちプレ－部分および／またはプロ－部分の配列を有さないものとして見られる。本明細書で関連する成熟ポリペプチドの例は、例えば、配列番号１のアミノ酸位置５９～アミノ酸位置３８１である、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチド、あるいは、配列番号２のアミノ酸位置５９～アミノ酸位置３８１である、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドである。

用語「親」または「キモシン活性を有する親ポリペプチド」は、本発明の酵素変異体を生成するために改変が成されるポリペプチドを意味する。この親は、天然に存在する（野生型）ポリペプチドまたはその変異体であり得る。

用語「配列同一性」は、２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間での関連性に関する。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite、Rice et al.、2000、Trends Genet.16:276-277）に実装されるような、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（NeedlemanおよびWunsch、1970、J.Mol.Biol.48:443-453）、好ましくはバージョン３．０．０以降、を用いて決定される。使用された任意のパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ伸長ペナルティ、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性」（-nobriefオプションを用いて得られる）の出力がパーセント同一性として使用され、そして次の通りに計算される：
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメントにおけるギャップの総数）

本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite、Rice et al.、2000、上記参照）に実装されるような、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（NeedlemanおよびWunsch、1970、上記参照）、好ましくはバージョン３．０．０以降、を用いて決定される。使用された任意のパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ伸長ペナルティ、およびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性」（-nobriefオプションを用いて得られる）の出力がパーセント同一性として使用され、そして次の通りに計算される：
（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメントにおけるギャップの総数）。

用語「変異体」は、改変、すなわち、置換、挿入、および／または欠失を、１または複数の（いくつかの）位置に含む、キモシン活性を有するペプチドを意味する。置換とは、ある位置を占めるアミノ酸の、異なるアミノ酸での置き換えを意味し；欠失とは、ある位置を占めるアミノ酸の除去を意味し；そして挿入とは、ある位置を占めるアミノ酸に隣接して１～３個のアミノ酸を付加することを意味する。アミノ酸は天然または非天然アミノ酸であってもよく、例として、例えばＤ－アラニンの、例えば特にＤ－異性体（またはＤ－型）による置換が、理論的に可能であり得る。

用語「野生型」ペプチドとは、天然に存在するヌクレオチド配列またはペプチド配列、すなわち、人間の行為による標的化された突然変異に供されていないヌクレオチド配列またはペプチド配列をいう。

本明細書で関連する様々なキモシン配列のアラインメント。本文脈において当業者によって理解されるように、配列番号３の成熟ポリペプチド（ウシキモシン－すなわち配列番号３のアミノ酸位置５９～３８１）と、例えばヒツジ、フタコブラクダ（C. bactrianus）、ヒトコブラクダ、ブタまたはラットキモシンの成熟ポリペプチド配列との、本明細書で関連する配列同一性パーセンテージは、上述の配列同一性パーセンテージに比較的類似している。 緑色で示された、結合したκ－カゼインのモデルを有するラクダキモシン（詳細、ＰＤＢ：４ＡＡ９）の３次元構造。κ－カゼインは、残基１０５と１０６との間の切断可能な結合でキモシン基質の結合溝に配置されている。変異Ｒ２４２Ｅ、Ｙ２４３Ｅ、Ｎ２４９Ｄ、Ｇ２５１Ｄ、Ｎ２５２Ｄ、Ｒ２５４Ｅ、Ｓ２７３Ｄ、Ｑ２８０Ｅ、Ｆ２８２Ｅは青色で強調されている。 緑色で示された、結合したκ－カゼインのモデルを用いたウシキモシン（ＰＤＢ：４ＡＡ８）の３次元構造。κ－カゼインは、残基１０５と１０６との間の切断可能な結合でキモシン基質の結合溝に配置されている。位置Ｈ２９２およびＱ２９４は黄色で強調されている。 ラクダキモシン（詳細、ＰＤＢ：４ＡＡ９）の３次元構造。タンパク質Ｎ末端の残基Ｙ１１、Ｌ１２、およびＤ１３、ならびに潜在的なＹ１１相互作用パートナーＤ２９０が紫色で強調されている。

発明の詳細な説明
目的のキモシンのアミノ酸位置の決定
先に述べたように、本明細書で関連する目的のキモシンポリペプチド（例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど）のアミノ酸位置を決定するための参照配列として、本明細書に配列番号２として開示された公知のラクダキモシン配列が使用される。

別のキモシンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２に開示されたポリペプチドとアラインされ、そしてアラインメントに基づいて、配列番号２に開示されたポリペプチドにおける任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号が、本明細書の実施例１に記載のＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いて決定される。

上記のよく知られたコンピュータープログラムに基づいて、本明細書で関連する目的のキモシンポリペプチド（例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど）のアミノ酸位置を決定することは、当業者にとって日常的な作業である。

本明細書の図１には、アラインメントの一例が示されている。単なる一例として、図１において、例えば、本明細書で使用されるウシ参照配列番号３は位置５０に「Ｇ」を有し、かつ「ヒトコブラクダ（Camelus dromedarius）」（本明細書の配列番号２）はこの位置５０に「Ａ」を有することがわかる。

変異体の命名法
本発明の変異体を説明する際に、以下に記載した命名法が参照を容易にするために適用される。認められたＩＵＰＡＣの一文字または三文字のアミノ酸の略号が使用される。
以下、この「命名法」セクションで論じた特定の変異体は、本明細書で関連する本発明の変異体でなくてもよく、すなわち、この「命名法」セクションは単に、本明細書で関連する使用された命名法それ自体を説明する。

置換
アミノ酸置換のために、次の命名法が使用される：元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。従って、位置２２６でのアラニンによるスレオニンの論理的置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」または「Ｔ２２６Ａ」として指定される。複数の突然変異は、追加の印（「＋」）により分離され、例えば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」または「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」はそれぞれ、位置２０５および４１１での、アルギニン（Ｒ）によるグリシン（Ｇ）の、およびフェニルアラニン（Ｆ）によるセリン（Ｓ）の置換を表す。置換、例えば指定された「２２６Ａ」は、位置２２６でのアラニンによる親アミノ酸（例えばＴ、Ｑ、Ｓまたは別の親アミノ酸）の置換を意味する。

欠失
アミノ酸欠失に関しては、次の命名法が使用される：元のアミノ酸、位置、＊。従って、位置１９５でのグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５＊」または「Ｇ１９５＊」として指定される。複数の欠失は、追加の印（「＋」）により分離され、例えば、「Ｇｌｙ１９５＊＋Ｓｅｒ４１１＊」または「Ｇ１９５＊＋Ｓ４１１＊」となる。

挿入
アミノ酸挿入に関しては、次の命名法が使用される：元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸。従って、位置１９５でのグリシンの後へのリシンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」または「Ｇ１９５ＧＫ」と指定される。複数のアミノ酸の挿入は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸＃１、挿入されたアミノ酸＃２；など］と指定される。例えば、位置１９５でのグリシンの後へのリシンおよびアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」または「Ｇ１９５ＧＫＡ」として示される。
そのような場合、挿入されたアミノ酸残基（複数）は、挿入されたアミノ酸残基（複数）の前のアミノ酸残基の位置番号に小文字を付加することによって、番号付けされる。したがって、上記例において、配列は次の通りである：

複数の改変
複数の改変を含む変異体は、追加の印（「＋」）によって分離され、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」または「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、それぞれ、位置１７０および１９５でのアルギニンおよびグリシンについての、チロシンおよびグルタミン酸の置換を表す。

異なる置換
異なる置換が１つの位置に導入され得る場合、その異なる置換はコンマによって分離され、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」または「Ｒ１７０Ｙ，Ｅ」は、位置１７０でのチロシンまたはグルタミン酸による、アルギニンの置換を表す。したがって、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」または「Ｙ１６７Ｇ，Ａ＋Ｒ１７０Ｇ，Ａ」は、以下の変異体を指定する：
「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、および「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」。

キモシン活性を有する好ましい親ポリペプチド
好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号３（ウシキモシン）および／または配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも８０％、例えば８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。

単なる一例として、本明細書で好適な関連する親ポリペプチドは、例えばウシキモシンＡであり得る。当該技術分野において知られているように、ウシキモシンＡは、本明細書における配列番号３のウシキモシンＢと比較して、１個のアミノ酸の差異のみを有し得る。

好ましい実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号３（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有し、より好ましくは親ポリペプチドは、配列番号３（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有し、さらにより好ましくは親ポリペプチドは、配列番号３（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９７％の配列同一性を有する。親ポリペプチドは、配列番号３（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドであることが好ましい場合がある。

本文脈において当業者によって理解されるように、本明細書で関連するキモシン活性を有する親ポリペプチドは、例えばすでに、例えば対応する野生型キモシンの変異体であり得る。

例として、配列番号３の成熟野生型ウシキモシンポリペプチドと比較して、例えば５～１０の改変（例えば置換）を有するウシキモシン変異体は、依然として、配列番号３（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有する親ペプチドであってもよい。

換言すると、一般的には、本明細書で関連する単離されたキモシンポリペプチド変異体は、本明細書で請求された位置以外の位置における改変（例えば置換）を含み得る。

本文脈において当業者によって理解されるように、親ポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダ）と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドであってもよい。好ましい実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号２および／または配列番号３の成熟ポリペプチドと少なくとも９２％の配列同一性を有し、より好ましくは親ポリペプチドは、配列番号２および／または配列番号３の成熟ポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有し、さらにより好ましくは親ポリペプチドは、配列番号２および／または配列番号３の成熟ポリペプチドと少なくとも９７％の配列同一性を有する。親ポリペプチドは、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドであることが好ましい場合がある。

本文脈において当業者によって理解されるように、単離されたキモシン変異体は、上記で与えられた以外のアミノ酸位置における改変（例えば置換）を含み得る。

例として、配列番号２の野生型ラクダキモシンポリペプチドと比較して、例えば５～１０の改変（例えば置換）を有するウシキモシン変異体は、依然として、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有する親ポリペプチドであろう。

単離されたウシキモシン変異体が、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと比較して３０未満のアミノ酸改変（例えば置換）を含むことが好ましい場合があり、または、単離されたラクダキモシン変異体が、配列番号２の成熟ポリペプチドと比較して２０未満のアミノ酸改変（例えば置換）を含むことが好ましい場合があり、または、単離されたウシキモシン変異体が、配列番号２の成熟ポリペプチドと比較して１０未満のアミノ酸改変（例えば置換）を含むことが好ましい場合があり、または、単離されたラクダキモシン変異体が、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと比較して５未満のアミノ酸改変（例えば置換）を含むことが好ましい場合がある。

単離されたキモシンポリペプチド変異体を作製する方法
上記で論じた通り、当該技術分野において知られているように、当業者は、その共通の一般的知識に基づいて、キモシンおよびキモシン変異体を日常的に生成および精製し得る。
換言すれば、当業者が、本明細書で関連する目的のキモシン活性を有する親ポリペプチド（例えばウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、またはラット由来）を保有したならば、本開示によって導かれた場合に、斯かる目的の親キモシンの変異体を作製することは、当業者にとって日常的な作業である。

キモシン（変異体または親）を生成および単離するための好適な方法の例は、例えばＷＯ０２／３６７５２Ａ２（Chr.Hansen）に記載されたような、よく知られた、例えば真菌組み換え発現／生成に基づく技法によるものであり得る。

キモシン活性を有する親ポリペプチドにおける１または複数の位置で、改変を行うことも、当業者にとって日常的な作業であり、ここで、当該改変は、本明細書中に開示される少なくとも１つのアミノ酸位置における置換、欠失または挿入を含んでいる。
当業者に知られているように、これは例えば、いわゆる部位特異的突然変異誘発、および組み換え発現／生成に基づく技法によって行われ得る。

本明細書で関連する親ポリペプチド（例えばラクダまたはウシ野生型キモシン）および／または本明細書で関連する変異体が、キモシン活性を有するか否かを決定することはまた、当業者にとって日常的な作業である。当該技術分野において知られているように、キモシン特異性は、いわゆるＣ／Ｐ比によって決定することができ、この比は比凝固活性（Ｃ）をタンパク質分解活性（Ｐ）で割ることによって決定される。
当該技術分野において知られているように、より高いＣ／Ｐ比は、一般に、非特異的タンパク質分解による例えばチーズ製造中のタンパク質の損失が低減されること、すなわちチーズの収率が向上されることを意味する。

乳凝固活性の決定
乳凝固活性は、国際酪農連盟によって開発された標準的な方法（ＩＤＦ法）である、ＲＥＭＣＡＴ法を用いて決定され得る。乳凝固活性は、０．５ｇ／Ｌ（ｐＨ≒６．５）の塩化カルシウム溶液での、低温、低脂肪乳粉末から調製された標準乳基質の目視可能な凝集に必要とされる時間から決定される。レンネット試料の凝固時間は、既知の凝乳活性を有し、かつＩＤＦ標準１１０Ｂによって当該試料と同じ酵素組成を有する、参照標準の凝固時間と比較される。試料および参照標準は、同一の化学的および物理的条件下で測定される。変異体試料は、８４ｍＭの酢酸緩衝液ｐＨ５．５を用いて約３ＩＭＣＵ／ｍｌに調整される。その後、２００μｌの酵素調製物が、一定の攪拌下で３２℃±１℃の一定温度を維持することができる水浴中に配置され、ガラス試験管中の１０ｍｌの予熱した乳（３２℃）に加えられる。
レンネットの総凝乳活性（強度）は、以下の式に従って、試料と同じ酵素組成を有する標準に対して国際凝乳単位（ＩＭＣＵ）／ｍｌで計算される：

Ｓ標準：レンネットについての国際参照標準の凝乳活性
Ｔ標準：標準希釈について得られた秒での凝固時間
Ｄ試料：試料についての希釈係数
Ｄ標準：標準についての希釈係数
Ｔ試料：酵素の添加から凝集の時間までの希釈されたレンネット試料について得られた秒での凝固時間

凝固活性決定のために、μＩＭＣＵ法が、ＲＥＭＣＡＴ法の代わりに使用され得る。ＲＥＭＣＡＴと比較して、μＩＭＣＵアッセイにおけるキモシン変異体の凝集時間が、ＵＶ／ＶＩＳプレートリーダーで８００ｎｍにおける９６－ウェルマイクロタイタープレートでのＯＤ測定によって決定される。既知の凝固強度を有する参照標準の種々の希釈の標準曲線が、各プレートに対して記録される。８４ｍＭの酢酸緩衝液、０．１％のｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ｐＨ５．５）により酵素を希釈することによって、試料が調製される。３２℃での反応は、４％（ｗ／ｗ）低温、低脂肪乳粉末および７．５％（ｗ／ｗ）塩化カルシウム（ｐＨ≒６．５）を含有する標準乳基質の２５０μＬを、２５μＬの酵素試料に添加することによって開始される。国際凝乳単位（ＩＭＣＵ）／ｍｌでのキモシン変異体の乳凝固活性が、標準曲線に対する試料の凝集時間に基づいて決定される。

総タンパク質含有量の決定
総タンパク質含有量は、好ましくは、Thermo Scientific製のＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用し、供給業者の取扱説明書に従って決定され得る。

比凝固活性の計算
比凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇ総タンパク質）は、凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｌ）を総タンパク質含有量（ｍｇ総タンパク質／ｍｌ）で割ることによって決定された。

タンパク質分解活性の決定
全タンパク質分解活性は、好ましくは、蛍光標識したＢｏｄｉｐｙ－ＦＬカゼイン（EnzChek; Molecular Bioprobes、E6638）を基質として使用することで計測され得る。カゼイン誘導体にｐＨ非感受性緑色蛍光Ｂｏｄｉｐｙ－ＦＬを大量に標識すると、この共役体の蛍光がほぼ完全に消えた。プロテアーゼを触媒とした加水分解によって蛍光Ｂｏｄｉｐｙ－ＦＬが放出される。この方法は非常に感度がよく、この実験に不可欠であった。なぜなら、基準が、これまでに知られているあらゆる凝固剤のうちで全タンパク質分解活性が最も低いからである。０．０４ｍｇ／ｍｌの基質溶液は、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、および０．１％のＢｒｉｊを含んでいる０．２Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ６．５中に調製される。キモシン変異体は、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、および０．１％のＢｒｉｊを含んでいる２０ｍＭのマロン酸バッファー中に溶解される。基準とキモシン変異体の溶液の両方では、２０μＬが黒色の３８４ウェルＣｏｒｎｉｎｇ平底ポリスチレンマイクロタイタープレート中で混合され、そして、蛍光が３２Ｃにて１０時間継続的に蛍光光度計により記録された。蛍光変化の直線部分の勾配が、全タンパク質分解活性を決定するために使用される。

Ｃ／Ｐ比の決定
Ｃ／Ｐ比は、凝固活性（Ｃ）をタンパク質分解活性（Ｐ）で割ることによって計算される。

比凝固活性とＣ／Ｐ比に対する位置および突然変異の影響の統計解析
統計学的機械学習アプローチおよびＰＣＡに基づく分析は、好ましくは、多重置換変異体に存在する単一突然変異の影響、すなわち、特定の凝乳活性、および凝固と全タンパク質分解活性との比（Ｃ／Ｐ）、を決定するために使用され得る。

本発明の好ましい実施形態
先に概説されたとおり、および以下の実施例で例示されたとおり、本開示の発明者らは、対応する親ポリペプチドと同じ条件下で比較したときに、改善された凝固活性および／またはＣ／Ｐ比を有する、多くの好ましいキモシンポリペプチド変異体を作製した。

好ましい態様において、本発明は、キモシン活性を有する親ポリペプチドと比較して、１もしくは複数の位置に改変を含む単離されたキモシンポリペプチド変異体であって、ここで、該改変が、以下の位置：Ｄ５９、Ｖ３０９、Ｓ１３２、Ｎ２４９、Ｌ１６６、Ｎ２４９、Ｑ５６、Ｙ１３４、Ｋ２９５、Ｍ１５７、Ｍ２５６、Ｒ２４２、Ｉ９６、Ｈ７６、Ｓ１６４、Ｓ２７３、Ｇ２５１、Ｙ１１、Ｌ１６６、Ｋ１９、Ｙ２１、Ｓ７４、Ｙ２４３、Ｎ２４９、Ｓ２７３、Ｑ２８０、Ｆ２８２、Ｌ２９５、Ｎ２５２、Ｒ２５４、Ｇ７０、Ｖ１３６、Ｌ２２２、Ｋ２３１、Ｎ２９１のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置における置換、欠失または挿入を含んでおり；
ここで、
（ｉ）：親ポリペプチドのアミノ酸位置は、配列番号２のポリペプチドと親ポリペプチドとのアラインメントによって決定され；そして
（ｉｉ）：親ポリペプチドは、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有し；
ここで、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、対応する親ポリペプチドよりも高い比凝固活性および／またはＣ／Ｐ比を有する、
単離されたキモシンポリペプチド変異体に関する。

より具体的には、本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、親ポリペプチドの比凝固活性の少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１６０％または２００％といった比凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇ総タンパク質）を有する。これに代えて、またはこれに加えて、本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、親ポリペプチドのＣ／Ｐ比の少なくとも２００％、例えば、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも７５０％または少なくとも１０００％といったＣ／Ｐ比を有する。

先に指定されるように、親ポリペプチドは、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも８０％、少なくとも例えば８２％、８５％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％といった配列同一性を有し得る。

前記改変は、以下の：Ｄ５９Ｎ、Ｖ３０９Ｉ、Ｓ１３２Ａ、Ｎ２４９Ｅ、Ｌ１６６Ｖ、Ｎ２４９Ｄ、Ｑ５６Ｈ、Ｙ１３４Ｇ、Ｋ２９５Ｌ、Ｍ１５７Ｌ、Ｍ２５６Ｌ、Ｒ２４２Ｅ、Ｉ９６Ｌ、Ｈ７６Ｑ、Ｓ１６４Ｇ、Ｓ２７３Ｙ、Ｇ２５１Ｄ、Ｙ１１Ｉ、Ｒ２４２Ｄ、Ｌ２２２Ｖ、Ｙ１１Ｖ、Ｌ１６６Ｉ、Ｋ１９Ｔ、Ｙ２１Ｓ、Ｓ７４Ｄ、Ｙ２４３Ｅ、Ｎ２４９Ｄ、Ｓ２７３Ｄ、Ｑ２８０Ｅ、Ｆ２８２Ｅ、Ｌ２９５Ｋ、Ｎ２５２Ｄ、Ｒ２５４Ｅ、Ｇ７０Ｄ、Ｖ１３６Ｉ、Ｌ２２２Ｉ、Ｋ２３１Ｎ、Ｎ２９１Ｑから成るリストから選択される置換を含み得る。

関連する実施形態において、本発明は、単離されたキモシンポリペプチド変異体に関し、ここで、改変は、以下を含む置換のうちの１もしくは複数の組み合わせを含む：
Ｙ１１Ｖ、Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｖ、Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｅ、Ｌ２５３Ｉ；
Ｙ１１Ｉ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｖ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｌ２５３Ｉ；
Ｙ１１Ｉ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ；
Ｙ１１Ｉ、Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｅ、Ｇ２５１Ｄ；
Ｈ７６Ｑ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｈ７６Ｑ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｎ２４９Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｈ７６Ｑ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｈ７６Ｑ、Ｓ１３２Ａ、Ｌ２２２Ｉ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ、Ｖ３０９Ｉ；
Ｙ２１Ｓ、Ｈ７６Ｑ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｄ５９Ｎ、Ｓ１３２Ａ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｄ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｄ５９Ｎ、Ｈ７６Ｑ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１３２Ａ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｉ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｈ７６Ｑ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｄ５９Ｎ、Ｈ７６Ｑ、Ｓ１３２Ａ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｖ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｈ７６Ｑ、Ｓ１６４Ｇ、Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｄ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｙ２１Ｓ、Ｄ５９Ｎ、Ｈ７６Ｑ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｎ２４９Ｄ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｇ２５１Ｄ；
Ｄ５９Ｎ、Ｈ７６Ｑ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｓ２２６Ｔ、Ｒ２４２Ｅ；
Ｈ７６Ｑ、Ｌ１３０Ｉ、Ｌ２２２Ｉ、Ｓ２２６Ｔ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｙ２１Ｓ、Ｄ５９Ｎ、Ｈ７６Ｑ、Ｉ９６Ｌ、Ｌ２２２Ｉ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｈ７６Ｑ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｎ２４９Ｄ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ、Ｖ３０９Ｉ；
Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ；
Ｙ１１Ｖ、Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｌ２５３Ｉ；
Ｋ１９Ｓ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｅ、Ｇ２５１Ｄ；
Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｉ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｄ；
Ｈ７６Ｑ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｋ１９Ｔ、Ｉ９６Ｌ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｌ２５３Ｉ；
Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｖ、Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｄ、Ｌ２５３Ｉ；
Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７４Ｙ；
Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２５２Ｄ、Ｎ１００Ｑ、Ｎ２９１Ｑ；
Ｒ２４２Ｅ、Ｒ２５４Ｅ、Ｑ２８０Ｅ、Ｎ１００Ｑ、Ｎ２９１Ｑ；
Ｒ２４２Ｅ、Ｑ２８０Ｅ、Ｎ１００Ｑ、Ｎ２９１Ｑ；
Ｒ２４２Ｅ、Ｒ２５４Ｅ、Ｓ２７３Ｄ、Ｑ２８０Ｅ、Ｎ１００Ｑ、Ｎ２９１Ｑ；
Ｒ６７Ｑ、Ｓ１３２Ａ、Ｌ２２２Ｉ、Ｋ２３１Ｎ、Ｒ２４２Ｅ、Ｖ２４８Ｉ；
Ｒ６７Ｑ、Ｉ９６Ｌ、Ｌ１３０Ｉ、Ｍ１５７Ｌ、Ｋ２３１Ｎ、Ｒ２４２Ｅ；
Ｒ６７Ｑ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ２２２Ｉ、Ｋ２３１Ｎ、Ｖ２４８Ｉ；
Ｒ６７Ｑ、Ｉ９６Ｌ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ２２２Ｉ、Ｋ２３１Ｎまたは
Ｒ６７Ｑ、Ｇ７０Ｄ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ２２２Ｉ、Ｎ２９１Ｑ。

任意選択で、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、グリコシル化パターンを変更する置換、例えば、位置Ｎ１００、Ｎ２５２、Ｎ２９１、より具体的にはＮ１００Ｑ、Ｎ２５２Ｑおよび／またはＮ２９１Ｑのうちの１もしくは複数における置換などをさらに含んでもよい。

単離されたキモシンポリペプチド変異体を作製するのに適した方法
本発明はさらに、本開示による単離されたポリペプチドを作製する方法に関する。

関連する実施形態として、本発明は、単離されたキモシンポリペプチド変異体を作製する方法に関し、ここで、該方法は、以下のステップ：
（ａ）：親ポリペプチド内の１もしくは複数の位置で改変を行い、ここで、該改変が、以下の位置：Ｄ５９、Ｖ３０９、Ｓ１３２、Ｎ２４９、Ｌ１６６、Ｎ２４９、Ｑ５６、Ｙ１３４、Ｋ２９５、Ｍ１５７、Ｍ２５６、Ｒ２４２、Ｉ９６、Ｈ７６、Ｓ１６４、Ｓ２７３、Ｇ２５１、Ｙ１１、Ｌ１６６、Ｋ１９、Ｙ２１、Ｓ７４、Ｙ２４３、Ｎ２４９、Ｓ２７３、Ｑ２８０、Ｆ２８２、Ｌ２９５、Ｎ２５２、Ｒ２５４、Ｇ７０、Ｖ１３６、Ｌ２２２、Ｋ２３１、Ｎ２９１のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置における置換、欠失または挿入を含み；
（ｂ）：ステップ（ａ）の改変されたポリペプチドを生成し、そして単離すること、
を含み、さらにここで、
（ｉ）：親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号２（ラクダキモシン）のポリペプチドと親ポリペプチドとのアラインメントによって決定され；そして、
（ｉｉ）：親ポリペプチドが、配列番号３（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有し、および／または配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する。

より具体的には、前記改変は、置換：Ｄ５９Ｎ、Ｖ３０９Ｉ、Ｓ１３２Ａ、Ｎ２４９Ｅ、Ｌ１６６Ｖ、Ｎ２４９Ｄ、Ｑ５６Ｈ、Ｙ１３４Ｇ、Ｋ２９５Ｌ、Ｍ１５７Ｌ、Ｍ２５６Ｌ、Ｒ２４２Ｅ、Ｉ９６Ｌ、Ｈ７６Ｑ、Ｓ１６４Ｇ、Ｓ２７３Ｙ、Ｇ２５１Ｄ、Ｙ１１Ｉ、Ｒ２４２Ｄ、Ｌ２２２Ｖ、Ｙ１１Ｖ、Ｌ１６６Ｉ、Ｋ１９Ｔ、Ｙ２１Ｓ、Ｓ７４Ｄ、Ｙ２４３Ｅ、Ｎ２４９Ｄ、Ｓ２７３Ｄ、Ｑ２８０Ｅ、Ｆ２８２Ｅ、Ｌ２９５Ｋ、Ｎ２５２Ｄ、Ｒ２５４Ｅ、Ｇ７０Ｄ、Ｖ１３６Ｉ、Ｌ２２２Ｉ、Ｋ２３１Ｎ、Ｎ２９１Ｑのうちの１もしくは複数であってもよい。

さらなる関連態様において、本発明は、先に指定した単離されたキモシンポリペプチド変異体を作製する方法に関し、ここで、該単離されたキモシンポリペプチド変異体は、以下の：
Ｙ１１Ｖ、Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｖ、Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｅ、Ｌ２５３Ｉ；
Ｙ１１Ｉ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｖ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｌ２５３Ｉ；
Ｙ１１Ｉ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ；
Ｙ１１Ｉ、Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｅ、Ｇ２５１Ｄ；
Ｈ７６Ｑ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｈ７６Ｑ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｎ２４９Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｈ７６Ｑ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｈ７６Ｑ、Ｓ１３２Ａ、Ｌ２２２Ｉ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ、Ｖ３０９Ｉ；
Ｙ２１Ｓ、Ｈ７６Ｑ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｄ５９Ｎ、Ｓ１３２Ａ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｄ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｄ５９Ｎ、Ｈ７６Ｑ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１３２Ａ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｉ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｈ７６Ｑ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｄ５９Ｎ、Ｈ７６Ｑ、Ｓ１３２Ａ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｖ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｈ７６Ｑ、Ｓ１６４Ｇ、Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｄ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｙ２１Ｓ、Ｄ５９Ｎ、Ｈ７６Ｑ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｎ２４９Ｄ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｇ２５１Ｄ；
Ｄ５９Ｎ、Ｈ７６Ｑ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｓ２２６Ｔ、Ｒ２４２Ｅ；
Ｈ７６Ｑ、Ｌ１３０Ｉ、Ｌ２２２Ｉ、Ｓ２２６Ｔ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｙ２１Ｓ、Ｄ５９Ｎ、Ｈ７６Ｑ、Ｉ９６Ｌ、Ｌ２２２Ｉ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｈ７６Ｑ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｎ２４９Ｄ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ、Ｖ３０９Ｉ；
Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ；
Ｙ１１Ｖ、Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｌ２５３Ｉ；
Ｋ１９Ｓ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｅ、Ｇ２５１Ｄ；
Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｉ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｄ；
Ｈ７６Ｑ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｙ；
Ｋ１９Ｔ、Ｉ９６Ｌ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｌ２５３Ｉ；
Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｖ、Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｄ、Ｌ２５３Ｉ；
Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７４Ｙ；
Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２５２Ｄ、Ｎ１００Ｑ、Ｎ２９１Ｑ；
Ｒ２４２Ｅ、Ｒ２５４Ｅ、Ｑ２８０Ｅ、Ｎ１００Ｑ、Ｎ２９１Ｑ；
Ｒ２４２Ｅ、Ｑ２８０Ｅ、Ｎ１００Ｑ、Ｎ２９１Ｑ；
Ｒ２４２Ｅ、Ｒ２５４Ｅ、Ｓ２７３Ｄ、Ｑ２８０Ｅ、Ｎ１００Ｑ、Ｎ２９１Ｑ；
Ｒ６７Ｑ、Ｓ１３２Ａ、Ｌ２２２Ｉ、Ｋ２３１Ｎ、Ｒ２４２Ｅ、Ｖ２４８Ｉ；
Ｒ６７Ｑ、Ｉ９６Ｌ、Ｌ１３０Ｉ、Ｍ１５７Ｌ、Ｋ２３１Ｎ、Ｒ２４２Ｅ；
Ｒ６７Ｑ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ２２２Ｉ、Ｋ２３１Ｎ、Ｖ２４８Ｉ；
Ｒ６７Ｑ、Ｉ９６Ｌ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ２２２Ｉ、Ｋ２３１Ｎまたは
Ｒ６７Ｑ、Ｇ７０Ｄ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ２２２Ｉ、Ｎ２９１Ｑ、
に対応する位置を含めた位置の１もしくは複数の組み合わせにおける置換を含む。

好ましい実施形態として、親ポリペプチドは、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有していてもよい。

さらに、本発明は、食品または飼料製品を製造する方法であって、本明細書中に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を（単数もしくは複数の）食品または飼料原料に添加すること、および食品または飼料製品を得るためのさらなる製造ステップを実施することを含む方法に関する。

本発明のさらなる関連態様は、食品または飼料製品を製造する方法であって、本明細書中に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を（単数もしくは複数の）食品または飼料原料に添加すること、および食品または飼料製品を得るためのさらなる製造ステップを実施することを含み、特にここで、該食品または飼料製品が、本発明のキモシンポリペプチドを含む乳製品、あるいは食品または飼料製品である方法に関係する。

本発明のさらなる関連態様は、乳製品、例えば、チーズなど、例えば、パスタフィラータ、チェダー、コンチネンタルタイプチーズ、ソフトチーズまたはホワイトブラインチーズなど、を製造する工程における本発明によるキモシンポリペプチド変異体に関する。
先に述べたように、本明細書中に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、当該技術分野に従って、例えば、目的の乳製品（例えば、チーズ製品など）を製造するために使用され得る。

先に述べたように、本発明の一態様は、食品または飼料製品を製造する方法であって、本明細書中に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を（単数もしくは複数の）食品または飼料原料に添加すること、および該食品または飼料製品を得るためのさらなる製造ステップを実施することを含む方法に関する。

好ましくは、前記食品または飼料製品は乳製品であり、ここで、当該方法は、本明細書中に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を乳に添加すること、および乳製品を得るためのさらなる製造ステップを実施することを含む。

前記乳は、例えば豆乳、ヒツジ乳、ヤギ乳、バッファロー乳、ヤク乳、ラマ乳、ラクダ乳または牛乳であってもよい。

前記乳製品は、例えば発酵乳製品、例えばクワルク（quark）またはチーズであってもよい。

当該技術分野で知られているとおり、成長、精製、試験、および一般的な取り扱いは酵素の性能に影響を及ぼす可能性があり、よって、本発明の酵素もまた同様である。したがって、本発明は、キモシンポリペプチド変異体、これらを作製する方法、およびこれらを含む製品に関し、ここで、該キモシンポリペプチド変異体は、同じ条件下、および好ましくは、同じ条件下で作製され、そして別の方法で取り扱われた後に、対応する親ポリペプチドと比較したとき、改善された凝固活性および／またはＣ／Ｐ比を有する。

実施例
実施例１：キモシンタンパク質配列および変異体配列のアラインメントおよび番号付け
キモシンタンパク質配列を、ＥＢＩ（ＥＢＩ、ツール、複数の配列アラインメント、CLUSTALW”、http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）によって提供され、Larkin MA、Blackshields G、Brown NP、Chenna R、McGettigan PA、McWilliam H、Valentin F、Wallace IM、Wilm A、Lopez R、Thompson JD、Gibson TJ、Higgins DG(2007). Bioinformatics 23(21)、2947-2948に記載された、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いてアラインした。

複数の配列アラインメントのためのＣｌｕｓｔａｌＷ２設定は、タンパク質重量マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ、ＧＡＰ ｏｐｅｎ＝１０、ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＳＩＯＮ＝０．５、ＧＡＰ ＤＩＳＴＡＮＣＥＳ＝８、Ｎｏ Ｅｎｄ Ｇａｐｓ、ＩＴＥＲＡＴＩＯＮ＝ｎｏｎｅ、ＮＵＭＩＴＥＲ＝１、ＣＬＵＳＴＥＲＩＮＧ＝ＮＪ、であった。

参照配列として、ウシキモシンＢプレプロキモシンを使用し（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ００７９４－配列番号３として本明細書に開示される）、ここで、Ｎ－末端メチオニンは番号１を有し（ＭＲＣＬ……）、そしてＣ－末端イソロイシン（タンパク質配列中…ＬＡＫＡＩ）は番号３８１を有する。変異体を、ウシＢプレ－プロ－キモシンに対してアラインし、そして、対応するウシキモシン残基に従って、残基に番号を付した。

実施例２：キモシン変異体の設計
キモシン変異体を異なる戦略を用いて設計した。

ラクダキモシンに言及される場合、本明細書における配列番号２のポリペプチドを含むラクダキモシンに言及される。配列番号２のラクダキモシンは、そのラクダキモシン変異体を作製するために使用される、本明細書で関連するキモシン活性を有する親ポリペプチドとして見られる。

ウシキモシンに言及される場合、本明細書における配列番号１のポリペプチドを含むウシキモシンに言及される。配列番号１のウシキモシンは、そのウシキモシン変異体を作製するために使用される、関連するキモシン活性を有する親ポリペプチドとして見られる。

ラクダキモシンの変異体１８０～２６９および３６７～４６１は、ウシキモシンＢと比較して２５％以上の同一性を有する多くの組の公知のアスパラギン酸プロテアーゼ配列の、アラインメントに基づいて設計された。一般に、変異は、種間で高レベルのアミノ酸変異を有する領域に導入されたが、保存された領域は変更されなかった。アミノ酸置換は、比凝固活性およびＣ／Ｐ比に対して有益な効果を示す可能性が高い変化を同定するために、系統学的、構造的および実験的情報に基づいて選択された。複数の変異を各変異体構築物に導入して、種々の置換の間の共変動の影響を最小限にするために、各単一突然変異が複数の変異体構築物に存在することを確実にした。実験データの機械学習および統計解析を使用して、キモシン変異体の測定された凝固性能に対するアミノ酸置換の相対的寄与を決定した（参考文献１４、１５）。

変異体２７１～３６６を、ウシキモシン（ＰＤＢコード：４ＡＡ８）およびラクダキモシン（ＰＤＢコード：４ＡＡ９）の詳細な構造分析に基づいて設計した。変異を、それぞれのアミノ酸側鎖の化学的性質、およびカゼイン基質結合または一般的酵素特性のいずれかに対するその予想される影響に基づいて選択した。変異体２７１～３４６におけるアミノ酸置換の大部分は、基質結合溝内にまたはそれに構造的に近接しているいずれかの配列位置で、あるいは結合したカゼイン基質と接触する二次構造要素で、作製された。さらに、変化は、これらの領域の電荷プロファイルを変更する、タンパク質表面上の位置で成され（参考文献５）、それゆえ、酵素性能に影響を及ぼすことが予想される。変異体３４７～３６６は、ウシおよびラクダキモシンにおけるＮ－末端配列の異なる構造配座に基づいて作製された。アミノ酸置換は、ラクダキモシンのＮ－末端と相互作用する基質結合溝内の位置で成された。

実施例３：キモシン変異体酵素材料の調製
すべてのキモシン変異体を、合成遺伝子として合成し、真菌発現ベクター、例えばｐＧＡＭｐＲ－Ｃにクローニングした（ＷＯ０２／３６７５２Ａ２に記載）

ベクターを大腸菌（E.coli）に形質転換し、プラスミドＤＮＡを当業者に既知の標準的な分子生物学プロトコルを用いて精製した。変異体プラスミドを個々に、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）またはアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）株に形質転換し、タンパク質を本質的にＷＯ０２／３６７５２Ａ２に記載のように産生し、標準的なクロマトグラフィー技法を用いて精製した。酵素ライブラリスクリーニングのために、すべてのキモシン変異体を２０～６０ｍＬの発酵により生成した。変異体４３３、４３６、４５３、および４５７に関するより詳細な特徴づけのために、それぞれの酵素を７０Ｌ規模で再び発酵させた。

当該技術分野において知られているように、当業者は、その共通の一般的知識に基づいて、キモシンおよびキモシン変異体－例えば本明細書中に記載のウシおよびラクダキモシン変異体を、生成および精製することができる。

実施例４：特定のキモシン活性の決定
４．１ 乳凝固活性の決定
乳凝固活性を、国際酪農連盟によって開発された標準的な方法（ＩＤＦ法）である、ＲＥＭＣＡＴ法を用いて決定した。
乳凝固活性を、０．５ｇ／Ｌ（ｐＨ≒６．５）の塩化カルシウム溶液での、低温、低脂肪乳粉末から調製された標準乳基質の目視可能な凝集に必要とされる時間から決定する。レンネット試料の凝固時間を、既知の凝乳活性を有し、かつＩＤＦ標準１１０Ｂによって当該試料と同じ酵素組成を有する、参照標準の凝固時間と比較する。試料および参照標準を、同一の化学的および物理的条件下で測定した。変異体試料を、８４ｍＭの酢酸緩衝液ｐＨ５．５を用いて約３ＩＭＣＵ／ｍｌに調整した。その後、２０μｌの酵素調製物を、一定の攪拌下で３２℃±１℃の一定温度を維持することができる水浴中に配置した、ガラス試験管中の１ｍｌの予熱した乳（３２℃）に加えた。レンネットの総凝乳活性（強度）を、以下の式に従って、試料と同じ酵素組成を有する標準に対して国際凝乳単位（ＩＭＣＵ）／ｍｌで計算した：

Ｓ標準：レンネットについての国際参照標準の凝乳活性
Ｔ標準：標準希釈について得られた秒での凝固時間
Ｄ試料：試料についての希釈係数
Ｄ標準：標準についての希釈係数
Ｔ試料：酵素の添加から凝集の時間までの希釈されたレンネット試料について得られた秒での凝固時間

ライブラリ１および３変異体、ならびに構造設計による変異体の凝固活性決定のために、μＩＭＣＵ法を、ＲＥＭＣＡＴ法の代わりに使用した。ＲＥＭＣＡＴと比較して、μＩＭＣＵアッセイにおけるキモシン変異体の凝集時間を、ＵＶ／ＶＩＳプレートリーダーで８００ｎｍにおける９６－ウェルマイクロタイタープレートでのＯＤ測定によって決定した。既知の凝固強度を有する参照標準の種々の希釈の標準曲線を、各プレートに対して記録した。８４ｍＭの酢酸緩衝液、０．１％のｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ｐＨ５．５）により酵素を希釈することによって、試料を調製した。３２℃での反応を、４％（ｗ／ｗ）低温、低脂肪乳粉末および７．５％（ｗ／ｗ）塩化カルシウム（ｐＨ≒６．５）を含有する標準乳基質の２５０μＬを、２５μＬの酵素試料に添加することによって、開始した。国際凝乳単位（ＩＭＣＵ）／ｍｌでのキモシン変異体の乳凝固活性を、標準曲線に対する試料の凝集時間に基づいて決定した。

４．２ 総タンパク質含有量の決定
総タンパク質含有量を、Thermo Scientific製のＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用し、供給業者の取扱説明書に従って決定した。

４．３ 比凝固活性の計算
比凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇ総タンパク質）を、凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｌ）を総タンパク質含有量（ｍｇ総タンパク質／ｍｌ）で割ることによって決定した。

実施例５ タンパク質分解活性の決定
全タンパク質分解活性は、蛍光標識したＢｏｄｉｐｙ－ＦＬカゼイン（EnzChek; Molecular Bioprobes、E6638）を基質として使用することで計測した。カゼイン誘導体にｐＨ非感受性緑色蛍光Ｂｏｄｉｐｙ－ＦＬを大量に標識すると、この共役体の蛍光がほぼ完全に消えた。プロテアーゼを触媒とした加水分解によって蛍光Ｂｏｄｉｐｙ－ＦＬが放出される。この方法は非常に感度がよく、この実験に不可欠であった。なぜなら、ＣＨＹＭＡＸ Ｍが、これまでに知られているあらゆる凝固剤のうちで全タンパク質分解活性が最も低いからである。０．０４ｍｇ／ｍｌの基質溶液を、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、および０．１％のＢｒｉｊを含んでいる０．２Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ６．５中に調製した。キモシン変異体を、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、および０．１％のＢｒｉｊを含んでいる２０ｍＭのマロン酸バッファー中に溶解した。基質とキモシン変異体の溶液の両方に関して、２０μＬを黒色の３８４ウェルＣｏｒｎｉｎｇ平底ポリスチレンマイクロタイタープレート中で混合し、そして、蛍光を３２℃にて１０時間継続的に蛍光光度計により記録した。蛍光変化の直線部分の勾配を、全タンパク質分解活性を決定するために使用した。

実施例６ 比凝固活性とＣ／Ｐ比に対する位置および突然変異の影響の統計解析
統計学的機械学習アプローチおよびＰＣＡに基づく分析を、位置Ｐｈｅ１０５とＭｅｔ１０６との間のκ－カゼインの切断に対する、多重置換ライブラリ１～３の変異体に存在するすべての単一突然変異の影響、すなわち、特定の凝乳活性、および凝固と全タンパク質分解活性との比（Ｃ／Ｐ）を決定するために使用した。

結果
多重置換ライブラリ１
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシンの変異体を生成し、上記のように分析した。すべての変異体は、表に記載した変異を除いて、ラクダキモシン（配列番号２）と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン（ＣＨＹ－ＭＡＸ Ｍ）を参照として含む。

凝固活性は、μＩＭＣＵ法を使用して決定した。

表１：ラクダキモシン変異体１８０～２２２の酵素活性。数値は、野性型ラクダキモシン（ＣＨＹ－ＭＡＸ Ｍ）に対する％切断として示す。

表１には、比凝固活性（Ｃ）、非特異的タンパク質分解活性（Ｐ）、ならびにＣ／Ｐ比に関するデータと共にラクダキモシン変異体を示す。４３個の変異体のうち１７個が、野性型ラクダキモシン（ＣＨＹ－ＭＡＸ Ｍ）と比較して１０％～５０％増強された比凝固活性を示す。すべての変異体が有意に増強されたＣ／Ｐ比を有し、最良の変異体、１９０は、野性型ラクダキモシンと比較して約１５倍の改善を示した。

多重置換ライブラリ１の突然変異分析
比凝固活性（Ｃ）およびＣ／Ｐ比に対する位置および突然変異の影響の統計解析を、ライブラリ１のタンパク質分解データに基づいて行った。増強された特定の凝固およびＣ／Ｐに関して最も有益な突然変異を、それぞれ表２および３に示す。

表２：統計解析に基づく増強された比凝固活性に対する突然変異の寄与（平均）および標準偏差（ｓｄ）

表２に示した結果に基づいて、突然変異Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１３２Ａ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｄ、Ｓ２７３Ｙ、およびＶ３０９Ｉがキモシンの比凝固活性を増強すると結論づけられる。その結果、これらの突然変異がチーズ製造においてより少ないキモシン用量を可能にすると予想できる。

表３：統計解析に基づく増加したＣ／Ｐ比に対する突然変異の寄与（平均）および標準偏差（ｓｄ）

表３に示した結果に基づいて、突然変異Ｈ７６Ｑ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、およびＳ２７３ＹがキモシンのＣ／Ｐ比を増加させると結論づけられる。その結果、これらの突然変異が、それぞれのキモシン変異体を使用するチーズ製造において収量増大をもたらすと予想できる。

多重置換ライブラリ２
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するもう１セットのラクダキモシン変異体を生成し、上記のように分析した。すべての変異体は、表に記載した変異を除いて、ラクダキモシン（配列番号２）と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン（ＣＨＹ－ＭＡＸ Ｍ）を参照として含む。

凝固活性は、ＲＥＭＣＡＴ法を使用して決定した。

表４：ラクダキモシン変異体２２３～２６９の酵素活性。数値は、野性型ラクダキモシン（ＣＨＹ－ＭＡＸ Ｍ）に対する％切断として示す。

表４には、比凝固活性（Ｃ）、非特異的タンパク質分解活性（Ｐ）、ならびにＣ／Ｐ比に関するデータと共にラクダキモシン変異体を示す。４７個の変異体のうち８個が、野性型ラクダキモシン（ＣＨＹ－ＭＡＸ Ｍ）と比較して１０％～７８％増強された比凝固活性を示す。さらに、４３個の変異体が有意に増強されたＣ／Ｐ比を有し、最良の変異体、２５３は、野性型ラクダキモシンと比較して約３３倍の改善を示した。

多重置換ライブラリ２の突然変異分析
比凝固活性（Ｃ）およびＣ／Ｐ比に対する位置および突然変異の影響の統計解析を、ライブラリ２のタンパク質分解データに基づいて行った。増強された特定の凝固およびＣ／Ｐに関して最も有益な突然変異を、それぞれ表５および６に示す。

表５：統計解析に基づく増強された比凝固活性に対する突然変異の寄与（平均）および標準偏差（ｓｄ）

表５に示した結果に基づいて、突然変異Ｄ５９Ｎ、Ｈ７６Ｑ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｄ、Ｎ２４９Ｅ、およびＳ２７３Ｙがキモシンの比凝固活性を増強すると結論づけられる。その結果、これらの突然変異がチーズ製造においてより少ないキモシン用量を可能にすると予想できる。

表６：統計解析に基づく増加したＣ／Ｐ比に対する突然変異の寄与（平均）および標準偏差（ｓｄ）

表６に示した結果に基づいて、突然変異Ｙ１１Ｉ、Ｙ１１Ｖ、Ｋ１９Ｔ、Ｈ７６Ｑ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｉ、Ｌ２２２Ｖ、Ｒ２４２Ｄ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、およびＳ２７３ＹがキモシンのＣ／Ｐ比を増加させると結論づけられる。その結果、これらの突然変異が、それぞれのキモシン変異体を使用するチーズ製造において収量増大をもたらすと予想できる。

ラクダキモシンにおける構造に基づく変異
ラクダキモシン（配列番号２）の変異体を、タンパク質構造分析によって決定された位置におけるアミノ酸変化により作製した（表７）。突然変異Ｎ１００ＱおよびＮ２９１Ｑを、これらの変異体および参照ラクダキモシン（ＣａｍＵＧｌｙ）の両方のＮ－グリコシル化部位に導入して、非グリコシル化された均質なタンパク質試料を得た。

凝固活性は、μＩＭＣＵ法を使用して決定した。

表７：ラクダキモシン変異体２７１～３０８の酵素活性。数値は、非グリコシル化ラクダキモシン（ＣａｍＵＧｌｙ）に対する％切断として示す。

表７に示した結果に基づいて、突然変異Ｙ２１Ｓ、Ｓ７４Ｄ、Ｒ２４２Ｅ、Ｙ２４３Ｅ、Ｎ２４９Ｄ、Ｇ２５１Ｄ、Ｓ２７３Ｄ、Ｑ２８０Ｅ、Ｆ２８２Ｅ、およびＬ２９５Ｋが、キモシンのＣ／Ｐ比を増加させると結論づけられる。突然変異Ｒ２４２ＥおよびＮ２４９Ｄもまた、増強された比凝固活性をもたらす。表７に示す増加したＣ／Ｐ比を有する１０個の変異体のうちの７個が、図２に見られるように、結合溝に近接して位置するタンパク質表面上の異なる領域に突然変異（Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｄ、Ｇ２５１Ｄ、Ｙ２４３Ｅ、Ｓ２７３Ｄ、Ｑ２８０Ｅ、Ｆ２８２Ｅ）を担持する。この領域は、位置Ｐ１０～Ｐ４（参考文献１０）においてその正に荷電した配列Ａｒｇ９６～Ｈｉｓ１０２（参考文献５、１６～１８）と相互作用することによって、κ－カゼイン基質の結合を支持することが示唆されている。突然変異により導入された負電荷は、これらの相互作用を強化し、そして、カゼインの増強された特異性（Ｃ／Ｐ）をもたらし得る。結果は、この領域における単一アミノ酸置換がＣ／Ｐを有意に増加させ得ることを示す。

ラクダキモシンにおける負電荷の組み合わせ
ラクダキモシン（配列番号２）のより多くの変異体を、上記の表面領域（Ｒ２４２Ｅ、Ｙ２４３Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｎ２５２Ｄ、Ｒ２５４Ｅ、Ｓ２７３Ｄ、Ｑ２８０Ｅ）に、負電荷を導入する突然変異の組み合わせにより作製した。突然変異Ｎ１００ＱおよびＮ２９１Ｑを、これらの変異体および参照ラクダキモシン（ＣａｍＵＧｌｙ）の両方のＮ－グリコシル化部位に導入して、非グリコシル化された均質なタンパク質試料を得た（表８）。

凝固活性は、μＩＭＣＵ法を使用して決定した。

表８：ラクダキモシン変異体３０９～３２３の酵素活性。数値は、非グリコシル化ラクダキモシン（ＣａｍＵＧｌｙ）に対する％切断として示す。

表８に示したすべての変異体が、非グリコシル化ラクダキモシンと比較して、増加したＣ／Ｐ比を明らかにしている。これらの変異体（３０９、３１０、３２１、３２２、３２３）のうちのいくつかは、単一負電荷の突然変異（２８６）を有する最良の変異体よりさらに高いＣ／Ｐを有する。キモシン構造上の領域と相互作用するＰ１０－Ｐ４に負電荷を導入することによって引き起こされるＣ／Ｐ増加作用は、それぞれの突然変異の組み合わせによってさらに増強され得ると結論づけられる。

ウシキモシンにおける構造に基づく変異
ウシキモシン（配列番号１）の変異体を、タンパク質構造解析によって決定された位置におけるアミノ酸変化により作製した（表９）。突然変異Ｎ２５２ＱおよびＮ２９１Ｑを、これらの変異体および参照ウシキモシン（ＢｏｖＵＧｌｙ）の両方のＮ－グリコシル化部位に導入して、非グリコシル化された均質なタンパク質試料を得た。

凝固活性は、μＩＭＣＵ法を使用して決定した。

表９：ウシキモシン変異体３２５～３４６の酵素活性。数値は、非グリコシル化ウシキモシン（ＢｏｖＵＧｌｙ）に対する％切断として示す。

表９のデータでは、変異Ｑ５６Ｈ、Ｙ１３４Ｇ、およびＫ２９５Ｌが増強された比凝固活性につながり、および変異Ｈ２９２ＮおよびＱ２９４Ｅが高められたＣ／Ｐ比をもたらすことを実証している。Ｈ２９２とＱ２９４の両方が、基質結合溝を部分的に覆うループに位置し（図３）、そしてそれは、カゼイン基質特異性（Ｃ／Ｐ）に関するこれらの位置のそれぞれの突然変異に関して観察された影響の原因を明らかにする。特に、置換Ｈ２９２ＮはＣ／Ｐを増大させ、そして、Ｄ２４９ＮならびにＫ２９５ＬはウシキモシンのＣ／Ｐを減少させたが、Ｃ／Ｐに対する逆の効果が、ラクダキモシンにおけるそれぞれの復帰変異原性Ｎ２９２Ｈ、Ｎ２４９Ｄ、およびＬ２９５Ｋによって観察された（表７）。このことは、これらのアミノ酸変化が種を超えてキモシン特異性に対して類似の効果を発揮することを実証している。

ラクダキモシンＮ－末端の変異
ラクダキモシン（配列番号２）の変異体を、基質結合溝内のＮ－末端配列Ｙ１１－Ｄ１３の分子相互作用のタンパク質構造解析によって決定された位置におけるアミノ酸変化により作製した（表１０）。突然変異Ｎ１００ＱおよびＮ２９１Ｑを、これらの変異体および参照ラクダキモシン（ＣａｍＵＧｌｙ）の両方のＮ－グリコシル化部位に導入して、非グリコシル化された均質なタンパク質試料を得た。

凝固活性は、μＩＭＣＵ法を使用して決定した。

表１０：ラクダキモシン変異体３４７～３６６の酵素活性。数値は、非グリコシル化ラクダキモシン（ＣａｍＵＧｌｙ）に対する％切断として示す。

ラクダキモシン構造の分析は、Ｎ－末端配列Ｙ１１－Ｄ１３、ならびにＹ１１の潜在的な相互作用パートナーである位置Ｄ２９０における変異を導いた（図４）。カゼイン基質は、結合溝内に結合するためにＮ－末端キモシン配列と競合するので、結合溝とモチーフＹ１１－Ｄ１３との相互作用を変化させるアミノ酸置換は、種々のカゼイン基質に対する酵素活性に、したがって、Ｃ／Ｐ比に、影響を与えることが期待される。それぞれの変異体３４７～３６６の結果は、比凝固活性およびＣ／Ｐの両方に関して優秀な変異を示す。特に、変異体３５３および３５５は、増加したＣ／Ｐ比を明らかにしている。そのため、アミノ酸置換Ｙ１１ＩおよびＹ１１Ｖが増加したＣ／Ｐ比をもたらすと結論づけられる。キモシン結合溝は主に疎水性アミノ酸から成るので（参考文献９）、両方の突然変異は、改善された疎水性相互作用によって結合溝におけるＮ－末端の結合を促進し、これにより、カゼインの非特異的結合および加水分解（Ｐ）を阻害するであろう。

多重置換ライブラリ３
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の別のセットを生成し、上述のように分析した。すべての変異体は、表に記載した変異を除いて、ラクダキモシン（配列番号２）と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン（ＣＨＹ－ＭＡＸ Ｍ）が参照として含まれる。

凝固活性は、μＩＭＣＵ法を使用して決定した。

表１１：ラクダキモシン変異体３６７～４１６の酵素活性。数値は、野性型ラクダキモシン（ＣＨＹ－ＭＡＸ Ｍ）に対する％切断として示す。

表１１には、比凝固活性（Ｃ）、非特異的タンパク質分解活性（Ｐ）ならびにＣ／Ｐ比に関するデータと共にラクダキモシン変異体が示されている。５０個の変異体のうち６個が、野性型ラクダキモシン（ＣＨＹ－ＭＡＸ Ｍ）と比較して、１０％～２９％増強された比凝固活性を明らかにしている。そして一方、２３個の変異体が、１０％超増加したＣ／Ｐ比を有し、最良の変異体、４１１は、野性型ラクダキモシン（ＣＨＹ－ＭＡＸ Ｍ）と比較して、約６倍の改善を示している。

多重置換ライブラリ３の突然変異分析
凝固活性（Ｃ）およびＣ／Ｐ比に対する位置および突然変異の影響の統計解析を、ライブラリ３のタンパク質分解データに基づいて行った。増強された凝固およびＣ／Ｐに最も有益な突然変異を、表１２および１３に示す。

表１２：統計解析に基づく増強された凝固活性に対する突然変異の寄与（平均）および標準偏差（ｓｄ）

表１２に示した結果に基づいて、突然変異Ｉ９６Ｌ、Ｓ１３２Ａ、Ｍ１５７Ｌ、Ｋ２３１Ｎ、Ｒ２４２Ｅ、Ｍ２５６Ｌ、およびＮ２９１Ｑがキモシンの比凝固活性を増強すると結論づけられる。その結果、これらの突然変異が、チーズ製造においてより少ないキモシン用量を可能にすると予想できる。

表１３：統計解析に基づく増加したＣ／Ｐ比に対する突然変異の寄与（平均）および標準偏差（ｓｄ）

表１３に示した結果に基づいて、突然変異Ｙ１１Ｖ、Ｇ７０Ｄ、Ｉ９６Ｌ、Ｖ１３６Ｉ、Ｌ２２２Ｉ、Ｋ２３１Ｎ、Ｒ２４２Ｅ、およびＮ２９１ＱがキモシンのＣ／Ｐ比を増加させると結論づけられる。その結果、これらの突然変異が、それぞれのキモシン変異体を使用するチーズ製造において収量増大をもたらすと予想できる。

多重置換ライブラリ４
野性型と比較して複数の置換をそれぞれ有するもう１セットのラクダキモシン変異体を生成し、上記のように分析した。すべての変異体は、表に記載した変異を除いて、ラクダキモシン（配列番号２）と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン（ＣＨＹ－ＭＡＸ Ｍ）は参照として含む。

凝固活性は、ＲＥＭＣＡＴ法を用いて決定した。

表１４：ラクダキモシン変異体４１７～４６１の酵素活性。数値は、野性型ラクダキモシン（ＣＨＹ－ＭＡＸ Ｍ）に対する％切断として示す。

表１４には、比凝固活性（Ｃ）、非特異的タンパク質分解活性（Ｐ）、ならびにＣ／Ｐ比に関するデータと共にラクダキモシン変異体を示す。４５個の変異体のうち１１個が、野性型ラクダキモシン（ＣＨＹ－ＭＡＸ Ｍ）と比較して１４％～５３％増強された比凝固活性を示す。さらに、４５個の変異体すべてが１０％超増加したＣ／Ｐ比を有し、最良の変異体、４５０は、野性型ラクダキモシン（ＣＨＹ－ＭＡＸ Ｍ）と比較して約１７倍の改善を示す。

多重置換ライブラリ４の突然変異分析
凝固活性（Ｃ）およびＣ／Ｐ比に対する位置および突然変異の影響の統計解析を、ライブラリ４のタンパク質分解データに基づいて行った。増強された凝固およびＣ／Ｐに関して最も有益な突然変異を、それぞれ表１５および１６に示す。

表１５：統計解析に基づく増強された凝固活性に対する突然変異の寄与（平均）および標準偏差（ｓｄ）

表１５に示した結果に基づいて、突然変異Ｙ１１Ｖ、Ｄ５９Ｎ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｅ、およびＧ２５１Ｄがキモシンの比凝固活性を増強すると結論づけられる。その結果、これらの突然変異がチーズ製造においてより少ないキモシン用量を可能にすると予想できる。

表１６：統計解析に基づく増加したＣ／Ｐ比に対する突然変異の寄与（平均）および標準偏差（ｓｄ）

表１６に示した結果に基づいて、突然変異Ｙ１１Ｉ、Ｙ１１Ｖ、Ｋ１９Ｔ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｅ、およびＬ２５３ＩがキモシンのＣ／Ｐ比を増加させると結論づけられる。その結果、これらの突然変異が、それぞれのキモシン変異体を使用するチーズ製造において収量増大をもたらすと予想できる。

多重置換ライブラリ４からの選択した変異体を７０Ｌ単位で再び発酵させ、その後、精製およびそれらのタンパク質分解プロファイルに関して特徴づけを続けた（表１７）。

表１７：７０Ｌの発酵からの選択したラクダキモシン変異体の酵素活性。数値は、野性型ラクダキモシン（ＣＨＹ－ＭＡＸ Ｍ）に対する％切断として示す。

表１７には、比凝固活性（Ｃ）、非特異的タンパク質分解活性（Ｐ）、ならびにＣ／Ｐ比に関するデータと共に、７０Ｌの発酵からのラクダキモシン変異体を示す。４個の変異体すべてが、野性型ラクダキモシン（ＣＨＹ－ＭＡＸ Ｍ）と比較して、５１％～１１７％増強された比凝固活性を示す。４個の変異体すべてが、１３倍超増加したＣ／Ｐ比を有し、最良の変異体、４５７は、野性型ラクダキモシン（ＣＨＹ－ＭＡＸ Ｍ）と比較して約３０倍の改善を示す。

参考文献

Claims (24)

1. キモシン活性を有する親ポリペプチドと比較して、１もしくは複数の位置に改変を含む単離されたキモシンポリペプチド変異体であって、ここで、該改変が、位置Ｙ１１に対応するアミノ酸位置における置換を含んでおり；
   ここで、
   前記置換はＹ１１Ｉ又はＹ１１Ｖであり、
   （ｉ）：親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号２のポリペプチドと親ポリペプチドとのアラインメントによって決定され；そして
   （ｉｉ）：親ポリペプチドが、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと１００％の配列同一性を有し；
   ここで、該単離されたキモシンポリペプチド変異体が、親ポリペプチドよりも高いＣ／Ｐ比を有する、
   単離されたキモシンポリペプチド変異体。
2. 前記単離されたキモシンポリペプチド変異体が、親ポリペプチドの比凝固活性の少なくとも８５％の比凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇ総タンパク質）を有する、請求項１に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
3. 前記単離されたキモシンポリペプチド変異体が、親ポリペプチドの比凝固活性の少なくとも９０％の比凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇ総タンパク質）を有する、請求項１に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
4. 前記単離されたキモシンポリペプチド変異体が、親ポリペプチドの比凝固活性の少なくとも１００％の比凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇ総タンパク質）を有する、請求項１に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
5. 前記単離されたキモシンポリペプチド変異体が、親ポリペプチドの比凝固活性の少なくとも１１０％の比凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇ総タンパク質）を有する、請求項１に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
6. 前記単離されたキモシンポリペプチド変異体が、親ポリペプチドの比凝固活性の少なくとも１２０％の比凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇ総タンパク質）を有する、請求項１に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
7. 前記単離されたキモシンポリペプチド変異体が、親ポリペプチドの比凝固活性の少なくとも１３０％の比凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇ総タンパク質）を有する、請求項１に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
8. 前記単離されたキモシンポリペプチド変異体が、親ポリペプチドのＣ／Ｐ比の少なくとも２００％のＣ／Ｐ比を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
9. 前記単離されたキモシンポリペプチド変異体が、親ポリペプチドのＣ／Ｐ比の少なくとも４００％のＣ／Ｐ比を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
10. 前記単離されたキモシンポリペプチド変異体が、親ポリペプチドのＣ／Ｐ比の少なくとも５００％のＣ／Ｐ比を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
11. 前記単離されたキモシンポリペプチド変異体が、親ポリペプチドのＣ／Ｐ比の少なくとも７５０％のＣ／Ｐ比を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
12. 前記単離されたキモシンポリペプチド変異体が、親ポリペプチドのＣ／Ｐ比の少なくとも１０００％のＣ／Ｐ比を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
13. 前記改変が、以下の：Ｋ１９、Ｄ５９、Ｉ９６、Ｖ１３６、Ｍ１５７、Ｓ１６４、Ｌ１６６、Ｌ２２２、Ｒ２４２、Ｎ２４９、Ｋ２３１、Ｇ２５１、Ｍ２５６、及びＮ２９１から成る群から選択される更なる置換を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
14. 前記改変が、以下の：Ｄ５９Ｎ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ１６６Ｉ、Ｎ２４９Ｄ、Ｍ１５７Ｌ、Ｍ２５６Ｌ、Ｒ２４２Ｄ、Ｒ２４２Ｅ、Ｉ９６Ｖ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｓ１６４Ｎ、Ｇ２５１Ｄ、Ｌ２２２Ｉ、Ｋ１９Ｔ、Ｖ１３６Ｉ、Ｋ２３１Ｎ、及びＮ２９１Ｑから成る群から選択される更なる置換を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
15. 前記改変が、以下の組み合わせ：
    Ｙ１１Ｖ、Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、及びＬ２５３Ｉ；
    Ｙ１１Ｉ、Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｖ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｄ、及びＧ２５１Ｄ；
    Ｙ１１Ｉ、Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｇ２５１Ｄ、及びＩ２６３Ｖ；
    Ｙ１１Ｖ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｇ２５１Ｄ、及びＬ２５３Ｖ；
    Ｙ１１Ｖ、Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｎ、Ｌ１６６Ｉ、Ｌ２２２Ｉ、及びＧ２５１Ｄ；
    Ｙ１１Ｉ、Ｋ１９Ｔ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｖ、Ｒ２４２Ｅ、及びＧ２５１Ｄ；
    Ｙ１１Ｖ、Ｋ１９Ｔ、Ｅ８３Ｓ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、及びＧ２５１Ｄ；
    Ｙ１１Ｖ、Ｋ１９Ｔ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｉ、及びＲ２４２Ｅ；
    Ｙ１１Ｖ、Ｅ８３Ｓ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｌ２５３Ｉ、及びＩ２６３Ｌ；
    Ｙ１１Ｖ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｄ、Ｌ２５３Ｉ、及びＩ２６３Ｌ；
    Ｙ１１Ｖ、Ｅ８３Ｓ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｌ２５３Ｉ、及びＩ２６３Ｌ；
    Ｙ１１Ｉ、Ｎ１００Ｑ、及びＮ２９１Ｑ；
    Ｙ１１Ｖ、Ｒ６７Ｑ、Ｍ１５７Ｌ、Ｖ２４８Ｉ、及びＭ２５６Ｌ；
    Ｙ１１Ｖ、Ｒ６７Ｑ、Ｎ１００Ｑ、Ｌ１３０Ｉ、Ｖ１３６Ｉ、及びＭ１５７Ｌ；
    Ｙ１１Ｖ、Ｒ６７Ｑ、Ｌ１３０Ｉ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ２２２Ｉ、及びＫ２３１Ｎ；又は
    Ｙ１１Ｖ、Ｒ６７Ｑ、Ｌ１３０Ｉ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ２２２Ｉ、及びＲ２４２Ｅ；
    を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
16. 請求項１～１５のいずれか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体を作製する方法であって、以下のステップ：
    （ａ）：親ポリペプチド内の１もしくは複数の位置で改変を行うこと、
    ここで、該改変が、位置Ｙ１１に対応するアミノ酸位置に置換を含み、前記置換はＹ１１Ｉ又はＹ１１Ｖである；並びに、
    （ｂ）：ステップ（ａ）の改変されたポリペプチドを生成し、そして単離すること、
    を含み、ここで、
    （ｉ）：親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号２（ラクダキモシン）のポリペプチドと親ポリペプチドとのアラインメントによって決定され；そして、
    （ｉｉ）：親ポリペプチドが、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと１００％の配列同一性を有する、方法。
17. 前記改変が、以下の：Ｄ５９、Ｎ２４９、Ｌ１６６、Ｍ１５７、Ｍ２５６、Ｒ２４２、Ｉ９６、Ｓ１６４、Ｇ２５１、Ｌ２２２、Ｋ１９、Ｖ１３６、Ｋ２３１、及びＮ２９１から成る群から選択される更なる置換を含む、請求項１６に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体を作製する方法。
18. 前記改変が、以下の：Ｄ５９Ｎ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ１６６Ｉ、Ｎ２４９Ｄ、Ｍ１５７Ｌ、Ｍ２５６Ｌ、Ｒ２４２Ｄ、Ｒ２４２Ｅ、Ｉ９６Ｖ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｓ１６４Ｎ、Ｇ２５１Ｄ、Ｌ２２２Ｉ、Ｋ１９Ｔ、Ｖ１３６Ｉ、Ｋ２３１Ｎ、及びＮ２９１Ｑから成る群から選択される更なる置換を含む、請求項１６又は１７に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体を作製する方法。
19. 前記改変が、以下の組み合わせ：
    Ｙ１１Ｖ、Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、及びＬ２５３Ｉ；
    Ｙ１１Ｉ、Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｖ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｄ、及びＧ２５１Ｄ；
    Ｙ１１Ｉ、Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｇ２５１Ｄ、及びＩ２６３Ｖ；
    Ｙ１１Ｖ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｇ２５１Ｄ、及びＬ２５３Ｖ；
    Ｙ１１Ｖ、Ｋ１９Ｔ、Ｄ５９Ｎ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｎ、Ｌ１６６Ｉ、Ｌ２２２Ｉ、及びＧ２５１Ｄ；
    Ｙ１１Ｉ、Ｋ１９Ｔ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｖ、Ｒ２４２Ｅ、及びＧ２５１Ｄ；
    Ｙ１１Ｖ、Ｋ１９Ｔ、Ｅ８３Ｓ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、及びＧ２５１Ｄ；
    Ｙ１１Ｖ、Ｋ１９Ｔ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ１６６Ｖ、Ｌ２２２Ｉ、及びＲ２４２Ｅ；
    Ｙ１１Ｖ、Ｅ８３Ｓ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｌ２５３Ｉ、及びＩ２６３Ｌ；
    Ｙ１１Ｖ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｎ２４９Ｄ、Ｌ２５３Ｉ、及びＩ２６３Ｌ；
    Ｙ１１Ｖ、Ｅ８３Ｓ、Ｉ９６Ｌ、Ｓ１６４Ｇ、Ｌ２２２Ｉ、Ｒ２４２Ｅ、Ｌ２５３Ｉ、及びＩ２６３Ｌ；
    Ｙ１１Ｉ、Ｎ１００Ｑ、及びＮ２９１Ｑ；
    Ｙ１１Ｖ、Ｒ６７Ｑ、Ｍ１５７Ｌ、Ｖ２４８Ｉ、及びＭ２５６Ｌ；
    Ｙ１１Ｖ、Ｒ６７Ｑ、Ｎ１００Ｑ、Ｌ１３０Ｉ、Ｖ１３６Ｉ、及びＭ１５７Ｌ；
    Ｙ１１Ｖ、Ｒ６７Ｑ、Ｌ１３０Ｉ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ２２２Ｉ、及びＫ２３１Ｎ；又は
    Ｙ１１Ｖ、Ｒ６７Ｑ、Ｌ１３０Ｉ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ２２２Ｉ、及びＲ２４２Ｅ；
    を含む、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体を作製する方法。
20. 食品または飼料製品を製造する方法であって、請求項１～１５のいずれか１項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を（単数もしくは複数の）食品または飼料原料に添加することを含む方法。
21. 前記食品または飼料製品が乳製品である、請求項２０に記載の方法。
22. チーズを製造する工程における請求項１～１５のいずれか１項に記載のキモシンポリペプチド変異体の使用。
23. パスタフィラータ、チェダー、コンチネンタルタイプチーズを製造する工程における請求項１～１５のいずれか１項に記載のキモシンポリペプチド変異体の使用。
24. ソフトチーズまたはホワイトブラインチーズを製造する工程における請求項１～１５のいずれか１項に記載のキモシンポリペプチド変異体の使用。

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