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JP7395254B2 - How to detect microorganisms - Google Patents
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Description

本発明は、試料に含まれ得る微生物の検出方法等に関する。 The present invention relates to a method for detecting microorganisms that may be contained in a sample.

試料中に含まれる微生物を検出することは臨床診断、食品衛生などにおいて重要である。しかしながら、試料を直接検出に供すると核酸の増幅又は検出中に反応阻害などが起こり、正しい測定結果が得られないことがある。この点はとりわけ、夾雑物を多く含む生体試料を対象として微生物を検出する方法において大きな問題である。そこで、試料中に含まれる微生物を検出する際に、試料を直接検出に供するのではなく、何らかの前処理を行うことが一般的である。これは、試料中に含まれる夾雑物の除去や測定に供するための標識作業などを目的としており、試料中の微生物をより正確に検出するために必要な操作と考えられている。 Detecting microorganisms contained in a sample is important in clinical diagnosis, food hygiene, etc. However, if a sample is directly subjected to detection, reaction inhibition may occur during nucleic acid amplification or detection, and correct measurement results may not be obtained. This point is particularly a big problem in methods for detecting microorganisms in biological samples containing many contaminants. Therefore, when detecting microorganisms contained in a sample, it is common to perform some kind of pretreatment rather than directly subjecting the sample to detection. This is intended to remove contaminants contained in the sample and to label the sample for measurement, and is considered a necessary operation for more accurately detecting microorganisms in the sample.

特に、微生物を検出する方法が微生物由来の核酸を検出する方法である場合、前処理として、試料中の核酸を精製することが一般的に行われる（例えば、特許文献１、非特許文献１）。これは、核酸を検出するために、例えば、ＰＣＲなどの核酸増幅反応に供する場合、試料中の夾雑物により反応が阻害されることを抑制するためである。精製法の一つとして核酸抽出法があり、核酸抽出法としてはＢＯＯＭ法を原理とした方法等がある。 In particular, when the method for detecting microorganisms is a method for detecting nucleic acids derived from microorganisms, purifying the nucleic acids in the sample is generally performed as a pretreatment (for example, Patent Document 1, Non-Patent Document 1) . This is to prevent the reaction from being inhibited by impurities in the sample when the sample is subjected to a nucleic acid amplification reaction such as PCR to detect nucleic acids. One of the purification methods is the nucleic acid extraction method, and examples of the nucleic acid extraction method include methods based on the BOOM method.

しかしながら、核酸抽出は、操作が非常に複雑、操作時間が長い、有機溶媒を使用する、試薬コストが高いといった課題があった。特に、核酸抽出は操作が煩雑であるとともに、タンパク質変性作用がある毒性の高い試薬を必要とすることがある。また、核酸抽出は、操作によって反応容器を移して行うことがあるため、操作性が悪いとともにコンタミリスクがあった。 However, nucleic acid extraction has problems such as extremely complicated operations, long operation times, use of organic solvents, and high reagent costs. In particular, nucleic acid extraction is a complicated operation and may require highly toxic reagents that have protein denaturing effects. Furthermore, since nucleic acid extraction may be performed by moving the reaction container depending on the operation, there is a risk of contamination as well as poor operability.

ところで、抗酸菌等の一部の細菌は、ミコール酸を含む脂質層を有した強固な細胞壁を持つことが知られており、通常、他の微生物よりも検出精度が低い。これまでにも、このような強固な細胞壁を有する抗酸菌の検査を行う手法の検討がなされているが（例えば、特許文献２）、より高感度に検査を行うための更なる前処理法の検討が求められている。 By the way, some bacteria such as acid-fast bacteria are known to have strong cell walls with a lipid layer containing mycolic acid, and detection accuracy is usually lower than that of other microorganisms. Up until now, methods for testing acid-fast bacteria that have strong cell walls have been studied (for example, Patent Document 2), but further pretreatment methods for testing with higher sensitivity have been proposed. There is a need for consideration.

特開２０１６－０６７２９１JP2016-067291 特開２０１０－２３３５０３JP2010-233503

R. Boom et al, Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids, Journal of Clinical Microbiology, 1990, vol.28, no.3, p.495-503.R. Boom et al, Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids, Journal of Clinical Microbiology, 1990, vol.28, no.3, p.495-503.

本発明は、試料に含まれ得る微生物の検出方法であって、フェノール等の有機溶媒を使用する一般的な核酸抽出方法を必要とすることなく、試料を前処理する工程を含み、該前処理によって調製された検出対象試料液を微生物の検出方法に供することができる微生物の検出方法の提供を一つの目的とする。また、その前処理、検出対象試料液の調製、又は微生物の検出を実施するための試薬又はキットの提供を一つの目的とする。 The present invention is a method for detecting microorganisms that may be contained in a sample, and includes a step of pretreating the sample without requiring a general nucleic acid extraction method using an organic solvent such as phenol. One object of the present invention is to provide a method for detecting microorganisms in which a sample solution to be detected prepared by the above method can be subjected to the method for detecting microorganisms. Another purpose is to provide reagents or kits for pretreatment, preparation of a sample solution to be detected, or detection of microorganisms.

本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、試料（生体試料、食品試料等）を水又はアルカリ性溶液で懸濁した後、懸濁液に含まれる微生物を濃縮し、さらにアルカリ性溶液を添加後、懸濁液中の微生物を溶菌又は破砕する、簡便な、有機溶媒を必須としない、試料の前処理方法によって、試料中の微生物の検出が可能であることを見出し本発明を完成させた。代表的な本発明は以下のとおりである。 As a result of intensive studies in view of the above issues, the present inventors have found that after suspending a sample (biological sample, food sample, etc.) in water or an alkaline solution, the microorganisms contained in the suspension are concentrated, and then the alkaline solution is They discovered that it is possible to detect microorganisms in a sample by a simple sample pretreatment method that does not require an organic solvent, by lysing or crushing the microorganisms in suspension after addition, and completed the present invention. Ta. Representative examples of the present invention are as follows.

［項１］
試料に含まれ得る微生物の検出方法であって、以下の工程Ａ～Ｆ：
（Ａ）試料を水又はアルカリ性溶液に懸濁する工程、
（Ｂ）前記工程Ａで得られた懸濁液に含まれる微生物を濃縮する工程、
（Ｃ）前記工程Ｂで得られた濃縮物にアルカリ性溶液を添加する工程、
（Ｄ）前記工程Ｃで得られた懸濁液に含まれる微生物を溶菌又は破砕する工程、
（Ｅ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液を必要に応じて精製する工程、
（Ｆ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液、或いは前記工程Ｅで得られた精製液の一部又は全部を微生物の検出に供する工程、
を包含し、少なくとも前記工程Ａ～Ｅが同一の反応容器内で行われる方法。
［項２］
前記反応容器の容量が、５０ｍＬ以下である、項１に記載の方法。
［項３］
前記反応容器中にビーズが含まれている、項１又は２に記載の方法。
［項４］
前記ビーズがジルコニアビーズである項３に記載の方法。
［項５］
前記工程Ａ及び／又は工程Ｃにおいて、アルカリ性溶液が、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、及び炭酸カルシウム水溶液からなる群より選択される少なくとも一つである、項１～４のいずれかに記載の方法。
［項６］
前記工程Ａ及び／又は工程Ｃにおいて、アルカリ性溶液のｐＨが８．０以上である、項１～５のいずれかに記載の方法。
［項７］
前記工程Ｂにおいて微生物を濃縮する工程が、遠心分離処理を含む、項１～６のいずれかに記載の方法。
［項８］
前記工程Ｄにおいて溶菌又は破砕する工程が、撹拌処理、ビーズ破砕処理、超音波処理、加熱処理、及びアルカリ処理からなる群より選択される少なくとも一つの処理を含む、項１～７のいずれかに記載の方法。
［項９］
前記工程Ｄにおいて溶菌又は破砕する工程が、加熱処理を含む、項１～８のいずれかに記載の方法。
［項１０］
前記工程Ｄにおいて溶菌又は破砕する工程が、ビーズ破砕処理を含む、項１～８のいずれかに記載の方法。
［項１１］
前記工程Ｄにおいて溶菌又は破砕する工程が、加熱処理及びビーズ破砕処理を含む、項１～８のいずれかに記載の方法。
［項１２］
前記工程Ｅにおいて溶菌液又は破砕液を精製する工程が、遠心分離処理を含む、項１～１１のいずれかに記載の方法。
［項１３］
微生物の検出が、微生物由来の核酸の検出である、項１～１２のいずれかに記載の方法。
［項１４］
微生物由来の核酸の検出が、微生物由来の核酸の増幅をさらに含む項１３に記載の方法。
［項１５］
前記核酸の増幅が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＳＤＡ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、ＲＴ－ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、及びＴＲＣ法からなる群より選択される少なくとも一つを含む、項１４に記載の方法。
［項１６］
検出対象微生物が、Mycobacterium属に分類される微生物の少なくとも一つである、項１～１５のいずれかに記載の方法。
［項１７］
検出対象微生物が、M. abscessus、M. africanum、M. agri、M. aichiense、M. algericum、M. alvei、M. arabiense、M. aromaticivorans、M. arosiense、M. arupense、M. asiaticum、M. aubagnense、M. aurum、M. austroafricanum、M. avium、M. bacteremicum、M. boenickei、M. bohemicum、M. bolletii、M. botniense、M. bouchedurhonense、M. bourgelatii、M. bovis、M. branderi、M. brisbanense、M. brumae、M. canariasense、M. caprae、M. celatum、M. chelonae、M. chimaera、M. chitae、M. chlorophenolicum、M. chubuense、M. colombiense、M. conceptionense、M. confluentis、M. conspicuum、M. cookii、M. cosmeticum、M. crocinum、M. diernhoferi、M. doricum、M. duvalii、M. elephantis、M. europaeum、M. fallax、M. farcinogenes、M. flavescens、M. florentinum、M. fluoranthenivorans、M. fortuitum、M. frederiksbergense、M. gadium、M. gastri、M. genavense、M. gilvum、M. goodii、M. gordonae、M. haemophilum、M. hassiacum、M. heckeshornense、M. heidelbergense、M. hiberniae、M. hippocampi、M. hodleri、M. holsaticum、M. houstonense、M. immunogenum、M. insubricum、M. interjectum、M. intermedium、M. intracellulare、M. iranicum、M. kansasii、M. komossense、M. koreense、M. kubicae、M. kumamotonense、M. kyorinense、M. lacus、M. lentiflavum、M. leprae、M. lepraemurium、M. litorale、M. llatzerense、M. madagascariense、M. mageritense、M. malmoense、M. mantenii、M. marinum、M. marseillense、M. massiliense、M. microti、M. minnesotense、M. monacense、M. montefiorense、M. moriokaense、M. mucogenicum、M. murale、M. neoaurum、M. nebraskense、M. neworleansense、M. nonchromogenicum、M. noviomagense、M. novocastrense、M. obuense、M. pallens、M. palustre、M. paraffinicum、M. parafortuitum、M. paragordonae、M. parakoreense、M. parascrofulaceum、M. paraseoulense、M. paratuberculosis、M. parmense、M. peregrinum、M. phlei、M. phocaicum、M. pinnipedii、M. porcinum、M. poriferae、M. pseudoshottsii、M. psychrotolerans、M. pulveris、M. pyrenivorans、M. rhodesiae、M. riyadhense、M. rufum、M. rutilum、M. salmoniphilum、M. saskatchewanense、M. scrofulaceum、M. sediminis、M. senegalense、M. senuense、M. seoulense、M. septicum、M. setense、M. sherrisii、M. shimoidei、M. shinjukuense、M. shottsii、M. simiae、M. smegmatis、M. sphagni、M. stomatepiae、M. szulgai、M. terrae、M. thermoresistibile、M. timonense、M. tokaiense、M. triplex、M. triviale、M. tuberculosis、M. tusciae、M. ulcerans、M. vaccae、M. vanbaalenii、M. vulneris、M. wolinskyi、M. xenopi、及びM. yongonenseからなる群より選択される少なくとも一つである、項１６に記載の方法。
［項１８］
試料の前処理方法、又は、微生物の検出方法に供される検出対象試料液の調製方法であって、以下の工程Ａ～Ｅ：
（Ａ）試料を水又はアルカリ性溶液に懸濁する工程、
（Ｂ）前記工程Ａで得られた懸濁液に含まれる微生物を濃縮する工程、
（Ｃ）前記工程Ｂで得られた濃縮物にアルカリ性溶液を添加する工程、
（Ｄ）前記工程Ｃで得られた懸濁液に含まれる微生物を溶菌又は破砕する工程、
（Ｅ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液を必要に応じて精製する工程、
を包含し、前記工程Ａ～Ｅが同一の反応容器内で行われる方法。
［項１９］
項１８に記載の試料の前処理方法又は検出対象試料液の調製方法、或いは項１～１７のいずれかに記載の微生物の検出方法のための試薬であって、
前記工程Ａ及び／又は工程Ｃに使用するためのアルカリ性溶液、
前記工程Ｄに使用するためのビーズ、或いは
前記工程Ｆに使用するためのプライマーミックス及び／又はＤＮＡポリメラーゼ、
を含む、試薬。
［項２０］
項１９に記載の試薬の少なくとも一つを含む、項１８に記載の試料の前処理方法又は検出対象試料液の調製方法、或いは項１～１７のいずれかに記載の微生物の検出方法のためのキット。
［項２１］
前記工程Ａ～Ｄ、工程Ａ～Ｅ、又は工程Ａ～Ｆで使用するための反応容器をさらに含む、項２０に記載のキット。 [Section 1]
A method for detecting microorganisms that may be contained in a sample, comprising the following steps A to F:
(A) suspending the sample in water or an alkaline solution;
(B) a step of concentrating the microorganisms contained in the suspension obtained in step A;
(C) adding an alkaline solution to the concentrate obtained in step B;
(D) a step of lysing or crushing the microorganisms contained in the suspension obtained in step C;
(E) a step of purifying the lysate or disrupted solution obtained in step D as necessary;
(F) a step of subjecting part or all of the lysis solution or disruption solution obtained in step D, or the purified solution obtained in step E, to the detection of microorganisms;
, wherein at least the steps A to E are performed in the same reaction vessel.
[Section 2]
Item 2. The method according to Item 1, wherein the reaction container has a capacity of 50 mL or less.
[Section 3]
Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein beads are contained in the reaction vessel.
[Section 4]
4. The method according to item 3, wherein the beads are zirconia beads.
[Section 5]
In step A and/or step C, the alkaline solution is at least one selected from the group consisting of a potassium hydroxide aqueous solution, a sodium hydroxide aqueous solution, a calcium hydroxide aqueous solution, a potassium carbonate aqueous solution, a sodium carbonate aqueous solution, and a calcium carbonate aqueous solution. The method according to any one of Items 1 to 4, wherein the method is:
[Section 6]
Item 6. The method according to any one of Items 1 to 5, wherein in the step A and/or step C, the alkaline solution has a pH of 8.0 or higher.
[Section 7]
Item 7. The method according to any one of Items 1 to 6, wherein the step of concentrating the microorganisms in step B includes centrifugation treatment.
[Section 8]
Any one of items 1 to 7, wherein the step of lysing or crushing the bacteria in step D includes at least one treatment selected from the group consisting of stirring treatment, bead crushing treatment, ultrasonic treatment, heat treatment, and alkali treatment. Method described.
[Section 9]
Item 9. The method according to any one of Items 1 to 8, wherein the step of lysing or crushing in step D includes heat treatment.
[Section 10]
Item 9. The method according to any one of Items 1 to 8, wherein the step of lysing or crushing in step D includes bead crushing treatment.
[Section 11]
Item 9. The method according to any one of Items 1 to 8, wherein the step of lysing or crushing the bacteria in step D includes heat treatment and bead crushing treatment.
[Section 12]
Item 12. The method according to any one of Items 1 to 11, wherein the step of purifying the lysis solution or disruption solution in step E includes centrifugation treatment.
[Section 13]
13. The method according to any one of Items 1 to 12, wherein the detection of microorganisms is the detection of nucleic acids derived from microorganisms.
[Section 14]
14. The method according to item 13, wherein the detection of the microorganism-derived nucleic acid further includes amplification of the microorganism-derived nucleic acid.
[Section 15]
The amplification of the nucleic acid includes at least one selected from the group consisting of PCR method, LAMP method, LCR method, TMA method, SDA method, RT-PCR method, RT-LAMP method, NASBA method, and TRC method. The method according to item 14.
[Section 16]
Item 16. The method according to any one of Items 1 to 15, wherein the target microorganism to be detected is at least one microorganism classified into the genus Mycobacterium.
[Section 17]
The microorganisms to be detected are M. abscessus, M. africanum, M. agri, M. aichiense, M. algericum, M. alvei, M. arabiense, M. aromaticivorans, M. arosiense, M. arupense, M. asiaticum, M. aubagnense, M. aurum, M. austroafricanum, M. avium, M. bacteremicum, M. boenickei, M. bohemicum, M. bolletii, M. botniense, M. bouchedurhonense, M. bourgelatii, M. bovis, M. branderi , M. brisbanense, M. brumae, M. canariasense, M. caprae, M. celatum, M. chelonae, M. chimaera, M. chitae, M. chlorophenolicum, M. chubuense, M. colombiense, M. conceptionense, M. confluentis, M. conspicuum, M. cookii, M. cosmeticum, M. crocinum, M. diernhoferi, M. doricum, M. duvalii, M. elephantis, M. europaeum, M. fallax, M. farcinogenes, M. flavescens , M. florentinum, M. fluoranthenivorans, M. fortuitum, M. frederiksbergense, M. gadium, M. gastri, M. genavense, M. gilvum, M. goodii, M. gordonae, M. haemophilum, M. hassiacum, M. heckeshornense, M. heidelbergense, M. hiberniae, M. hippocampi, M. hodleri, M. holsaticum, M. houstonense, M. immunogenum, M. insubricum, M. interjectum, M. intermedium, M. intracellulare, M. iranicum , M. kansasii, M. komossense, M. koreense, M. kubicae, M. kumamotonense, M. kyorinense, M. lacus, M. lentiflavum, M. leprae, M. lepraemurium, M. litorale, M. llatzerense, M. madagascariense, M. mageritense, M. malmoense, M. mantenii, M. marinum, M. marseillense, M. massiliense, M. microti, M. minnesotense, M. monacense, M. montefiorense, M. moriokaense, M. mucogenicum , M. murale, M. neoaurum, M. nebraskense, M. neworleansense, M. nonchromogenicum, M. noviomagense, M. novocastrense, M. obuense, M. pallens, M. palustre, M. paraffinicum, M. parafortuitum, M. paragordonae, M. parakoreense, M. parascrofulaceum, M. paraseoulense, M. paratuberculosis, M. parmense, M. peregrinum, M. phlei, M. phocaicum, M. pinnipedii, M. porcinum, M. poriferae, M. pseudoshottsii , M. psychrotolerans, M. pulveris, M. pyrenivorans, M. rhodesiae, M. riyadhense, M. rufum, M. rutilum, M. salmoniphilum, M. saskatchewanense, M. scrofulaceum, M. sediminis, M. senegalense, M. senuense, M. seoulense, M. septicum, M. setense, M. sherrisii, M. shimoidei, M. shinjukuense, M. shottsii, M. simiae, M. smegmatis, M. sphagni, M. stomatepiae, M. szulgai , M. terrae, M. thermoresistibile, M. timonense, M. tokaiense, M. triplex, M. triviale, M. tuberculosis, M. tusciae, M. ulcerans, M. vaccae, M. vanbaalenii, M. vulneris, M. 17. The method according to item 16, which is at least one selected from the group consisting of M. wolinskyi, M. xenopi, and M. yongonense.
[Section 18]
A method for preparing a sample liquid to be detected to be subjected to a sample pretreatment method or a microorganism detection method, comprising the following steps A to E:
(A) suspending the sample in water or an alkaline solution;
(B) a step of concentrating the microorganisms contained in the suspension obtained in step A;
(C) adding an alkaline solution to the concentrate obtained in step B;
(D) a step of lysing or crushing the microorganisms contained in the suspension obtained in step C;
(E) a step of purifying the lysate or disrupted solution obtained in step D as necessary;
, wherein the steps A to E are performed in the same reaction vessel.
[Section 19]
A reagent for the method for pretreatment of a sample or the method for preparing a sample liquid to be detected according to item 18, or the method for detecting a microorganism according to any one of items 1 to 17,
an alkaline solution for use in step A and/or step C;
Beads for use in the step D, or primer mix and/or DNA polymerase for use in the step F,
Reagents, including.
[Section 20]
A method for pretreatment of a sample or a method for preparing a sample liquid to be detected according to item 18, or a method for detecting microorganisms according to any one of items 1 to 17, comprising at least one of the reagents described in item 19. kit.
[Section 21]
21. The kit according to item 20, further comprising a reaction vessel for use in steps A to D, steps A to E, or steps A to F.

本発明によれば、簡便な試料の前処理によって、微生物の検出、特に核酸検出に基づく微生物の検出、に適した液（検出対象試料液）を、有機溶媒を必須とせずに調製でき、この検出対象試料液を直接、微生物の検出に供することができる。また、試料の前処理の過程及び検出対象試料液を調製する過程において実効的なタンパク質変性剤が必須ではないため、薬傷の危険性もない。また、試料の前処理及び検出対象試料液の調製は、同一の反応容器内で行われるので、操作性の向上、資材コストの削減、コンタミリスクの回避も期待できる。 According to the present invention, a liquid suitable for microorganism detection, particularly microorganism detection based on nucleic acid detection (detection target sample liquid) can be prepared by simple sample pretreatment without requiring an organic solvent. The sample liquid to be detected can be directly used to detect microorganisms. Furthermore, since an effective protein denaturant is not essential in the process of sample pretreatment and the process of preparing the sample liquid to be detected, there is no risk of chemical injury. In addition, since the pretreatment of the sample and the preparation of the sample liquid to be detected are performed in the same reaction vessel, improvements in operability, reduction in material costs, and avoidance of contamination risks can be expected.

以下、上述の代表的な発明を中心に説明する。 Hereinafter, the above-mentioned typical inventions will be mainly explained.

［微生物の検出方法］
生体試料、食品、環境試料等の一部を採取し、採取試料に微生物の検出が可能になる程度にまで各種の前処理を施し、得られた前処理物に含まれる微生物を検出することが一般的に行われている。本発明の一実施形態は、試料に含まれ得る微生物の検出方法であって、以下の工程Ａ～Ｆ：
（Ａ）試料を水又はアルカリ性溶液に懸濁する工程、
（Ｂ）前記工程Ａで得られた懸濁液に含まれる微生物を濃縮する工程、
（Ｃ）前記工程Ｂで得られた濃縮物にアルカリ性溶液を添加する工程、
（Ｄ）前記工程Ｃで得られた懸濁液に含まれる微生物を溶菌又は破砕する工程、
（Ｅ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液を必要に応じて精製する工程、
（Ｆ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液、或いは前記工程Ｅで得られた精製液の一部又は全部を微生物の検出に供する工程、
を包含し、少なくとも前記工程Ａ～Ｅが同一の反応容器内で行われる方法、である。 [Method for detecting microorganisms]
It is possible to collect a part of a biological sample, food, environmental sample, etc., apply various pretreatments to the sample to the extent that it is possible to detect microorganisms, and then detect the microorganisms contained in the obtained pretreated material. This is commonly done. One embodiment of the present invention is a method for detecting microorganisms that may be contained in a sample, which includes the following steps A to F:
(A) suspending the sample in water or an alkaline solution;
(B) a step of concentrating the microorganisms contained in the suspension obtained in step A;
(C) adding an alkaline solution to the concentrate obtained in step B;
(D) a step of lysing or crushing the microorganisms contained in the suspension obtained in step C;
(E) a step of purifying the lysate or disrupted solution obtained in step D as necessary;
(F) a step of subjecting part or all of the lysis solution or disruption solution obtained in step D, or the purified solution obtained in step E, to the detection of microorganisms;
and at least steps A to E are performed in the same reaction vessel.

［試料］
本発明において使用できる試料は、検出目的の微生物を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。試料は工程Ａにおいて懸濁される。試料としては、例えば、生体試料や食品、環境試料等が挙げられる。なお、本発明でいう微生物とは、広義の意味で小さな生物を示し、バクテリア、真菌、ウイルス、寄生虫、線虫等を含むがこれらに限定されない。また、微生物の検出とは、微生物そのものの有無だけでなく、微生物構成成分（タンパク質、核酸、脂質等）及びそれらをコードする遺伝子等を検出することも含む。検出の対象となる微生物は生きた微生物、死んだ微生物のいずれであってもよいが、生きた微生物が好ましい。 [sample]
The sample that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it may contain the microorganism to be detected. The sample is suspended in step A. Examples of the sample include biological samples, foods, and environmental samples. Note that the term "microorganism" as used in the present invention refers to small organisms in a broad sense, and includes, but is not limited to, bacteria, fungi, viruses, parasites, nematodes, and the like. Furthermore, the detection of microorganisms includes not only the presence or absence of microorganisms themselves, but also the detection of microorganism components (proteins, nucleic acids, lipids, etc.) and genes encoding them. The microorganism to be detected may be either a living microorganism or a dead microorganism, but a living microorganism is preferable.

生体試料の例として、特に制限されないが、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルス等が挙げられる。さらに挙げると、血液、血漿、血清、血液培養液、尿、唾液、羊水、膿、髄液、胸水、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、直腸拭い液、喀痰、組織切片、皮膚、吐瀉物、糞便、鼓膜切開液、肺胞洗浄液、胃洗浄液、腸洗浄液、子宮頸管拭い液、尿道擦過物、臓器抽出液、組織抽出液分離培養コロニー、気管支洗浄液、カテーテル洗浄液等が挙げられる。本発明は、夾雑物を多く含む生体試料を対象とする場合であっても、感度のよい微生物検出が可能である。このような観点から、本発明が対象とする生体試料としては、例えば、排泄物、吐瀉物、糞便、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、喀痰が好適であり、糞便、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰がより好適であり、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰が更に好適であり、喀痰がとりわけ好適であり、これらの中でも哺乳動物由来、殊にヒト由来のものがより一層好適である。 Examples of biological samples include, but are not limited to, animal and plant tissues, body fluids, excreta, cells, bacteria, viruses, and the like. Additionally, blood, plasma, serum, blood cultures, urine, saliva, amniotic fluid, pus, cerebrospinal fluid, pleural effusions, throat swabs, nasal swabs, nasopharyngeal swabs, rectal swabs, sputum, tissue sections, and skin. , vomit, feces, myringotomy fluid, alveolar lavage fluid, gastric lavage fluid, intestinal lavage fluid, cervical swab fluid, urethral scrapings, organ extracts, tissue extracts, isolated culture colonies, bronchial lavage fluids, catheter lavage fluids, and the like. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention enables highly sensitive microorganism detection even when the target is a biological sample containing many contaminants. From this point of view, suitable biological samples targeted by the present invention include, for example, excrement, vomit, feces, throat swabs, nasal cavity swabs, nasopharyngeal swabs, and sputum; liquid, nasal cavity swab, and sputum are more preferred; throat swab, nasal cavity swab, and sputum are even more preferred; sputum is particularly preferred; among these, those derived from mammals, especially humans are more preferred. This is even more suitable.

食品の例として、水、アルコール飲料、清涼飲料水、加工食品、野菜、畜産物、海産物、卵、乳製品、生肉、生魚、惣菜等が挙げられる。また、食品を試料とする場合、その食品の一部あるいは全部を使用できるだけでなく、食品表面を拭き取ったものも使用できる。さらに、調理器具等の食品接触部又は人接触部やドアノブ等の人接触部を拭き取ったものあるいはそれらを洗浄した洗浄液も試料として用いることができる。液体成分が多い試料については、必要に応じて、乾燥、限外ろ過、蒸留等を行い、液体成分の一部あるいは全部を除去した試料を用いてもよい。 Examples of foods include water, alcoholic beverages, soft drinks, processed foods, vegetables, livestock products, seafood, eggs, dairy products, raw meat, raw fish, and prepared foods. Furthermore, when food is used as a sample, not only a part or all of the food can be used, but also a product obtained by wiping the surface of the food can be used. Furthermore, food-contact parts such as cooking utensils, human-contact parts such as doorknobs, and cleaning liquid used to clean them can also be used as samples. For samples containing a large amount of liquid components, a sample may be used in which part or all of the liquid components have been removed by drying, ultrafiltration, distillation, etc., as necessary.

環境試料の例として、水、氷、土壌等が挙げられる。ここでいう水とは、例として、水道水、海水あるいは川、滝、湖、池等から採取した水等が挙げられる。また、施設の壁面、床面、設備や備品、便器等を拭き取ったものあるいはそれらを洗浄した洗浄液も試料として用いることができる。液体成分が多い試料については、必要に応じて、乾燥、限外ろ過、蒸留等を行い、液体成分の一部あるいは全部を除去した試料を用いてもよい。 Examples of environmental samples include water, ice, soil, etc. Examples of water here include tap water, seawater, or water collected from rivers, waterfalls, lakes, ponds, and the like. Furthermore, the walls, floors, equipment, fixtures, toilet bowls, etc. of the facility that have been wiped down, or the cleaning liquid that has been used to clean them, can also be used as samples. For samples containing a large amount of liquid components, a sample may be used in which part or all of the liquid components have been removed by drying, ultrafiltration, distillation, etc., as necessary.

試料の採取方法は、特に制限されず、試料の種類、大きさ、目的に応じて公知の方法を用いることができる。例えば、綿棒、スワブ、白金耳、スポイト、へら、さじなどの採取具を用いた採取方法である。 The sample collection method is not particularly limited, and known methods can be used depending on the type, size, and purpose of the sample. For example, collection methods include collection tools such as cotton swabs, swabs, platinum loops, droppers, spatulas, and spoons.

試料は、本発明の工程Ａに供する前に、必要に応じて前処理を実施してもよい。例えば、液体成分が多い試料については、乾燥、限外ろ過、蒸留等を行い、液体成分の一部あるいは全部を除去した試料を用いてもよい。例えば、粘性の高い試料（喀痰など）については、セミアルカリプロテアーゼ（ＳＡＰ）処理やＮＡＬＣ－ＮａＯＨ処理を施してもよい。これらの処理を行った検体も試料として、本発明に使用することができる。 The sample may be pretreated as necessary before being subjected to Step A of the present invention. For example, for a sample containing a large amount of liquid component, a sample may be used in which part or all of the liquid component has been removed by drying, ultrafiltration, distillation, or the like. For example, highly viscous samples (such as sputum) may be treated with semi-alkaline protease (SAP) or NALC-NaOH. Specimens subjected to these treatments can also be used as samples in the present invention.

［工程Ａ］
工程Ａでは、試料をそのまま、又は試料の一部を採取して、水又はアルカリ性溶液に懸濁する。水、アルカリ性溶液のどちらを使用するかは、試料によって適宜選択することができる。例えば、ｐＨ調整や夾雑物除去を目的として、アルカリ性溶液を選択できる。アルカリ性溶液を使用することで、目的の微生物以外の夾雑物を分解又は溶解しやすくなる。なお、採取された試料や前処理された試料において試料中の微生物がが水又はアルカリ性溶液に含有され、次の工程Ｂに供することができる場合、本工程を省略しても差し支えない。 [Process A]
In step A, the sample is taken as it is or a portion of the sample is taken and suspended in water or an alkaline solution. Whether to use water or an alkaline solution can be appropriately selected depending on the sample. For example, an alkaline solution can be selected for the purpose of pH adjustment and impurity removal. By using an alkaline solution, it becomes easier to decompose or dissolve contaminants other than the target microorganisms. Note that if the microorganisms in the collected sample or pretreated sample are contained in water or an alkaline solution and can be subjected to the next step B, this step may be omitted.

水としては、例えば精製水、滅菌水、水道水等が挙げられるが、不純物が少ない点で精製水又は滅菌水が好ましい。また、試料が水の場合は、必要に応じて精製水又は滅菌水で希釈することもできるし、工程Ａを省略することもできるが、アルカリ性溶液を使用することが好ましい。 Examples of water include purified water, sterilized water, tap water, etc., but purified water or sterilized water is preferable because it contains fewer impurities. Further, when the sample is water, it can be diluted with purified water or sterilized water as necessary, or Step A can be omitted, but it is preferable to use an alkaline solution.

アルカリ性溶液としては、例えば水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液及び炭酸カルシウム水溶液からなる群より選択される少なくとも一つが挙げられ、水酸化カリウム水溶液及び／又は水酸化ナトリウム水溶液が好ましい。これらのアルカリ性溶液は、微生物の検出に不適切な大きな影響を与えない。 Examples of the alkaline solution include at least one selected from the group consisting of potassium hydroxide aqueous solution, sodium hydroxide aqueous solution, calcium hydroxide aqueous solution, potassium carbonate aqueous solution, sodium carbonate aqueous solution, and calcium carbonate aqueous solution, and potassium hydroxide aqueous solution and /or an aqueous sodium hydroxide solution is preferred. These alkaline solutions do not have an unsuitably large effect on the detection of microorganisms.

また、アルカリ性溶液として緩衝作用を持つ緩衝液を使用してもよい。緩衝液として、例えば、当該分野で周知のＴｒｉｓ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、ＰＢＳ、アミノ酸緩衝液、リン酸緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されない。 Furthermore, a buffer solution having a buffering effect may be used as the alkaline solution. Buffers include, for example, Tris, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricine, Bicine, TAPS, CHES, CAPSO, CAPS, PBS, amino acid buffers, phosphorus, etc. well known in the art. Examples include, but are not limited to, acid buffers and the like.

アルカリ性溶液のｐＨは、７．０以上、８．０以上、９．０以上、１０．０以上、１１．０以上等とすることができ、また、１４．０以下、１３．０以下、１２．５以下、１２．０以下、１１．０以下等とすることができ、８．０～１４．０が好ましく、９．０～１３．０がより好ましい。なお、ここでいうアルカリ性溶液のｐＨとは、試料を懸濁する前のアルカリ性溶液のｐＨをいうが、工程Ａで得られるアルカリ性溶液添加後の懸濁液のｐＨも上記範囲にあることが好ましい。 The pH of the alkaline solution can be 7.0 or higher, 8.0 or higher, 9.0 or higher, 10.0 or higher, 11.0 or higher, etc., and can also be 14.0 or lower, 13.0 or lower, 12 It can be .5 or less, 12.0 or less, 11.0 or less, etc., preferably 8.0 to 14.0, and more preferably 9.0 to 13.0. Note that the pH of the alkaline solution here refers to the pH of the alkaline solution before suspending the sample, but it is preferable that the pH of the suspension obtained in step A after addition of the alkaline solution is also within the above range. .

水又はアルカリ性溶液に対する試料の量は、以降の工程を行うことができる量であれば制限されず、例えば、水又はアルカリ性溶液に対して、８０％（ｖ／ｖ）以下が好ましく、５０％（ｖ／ｖ）以下がより好ましく、４０％（ｖ／ｖ）以下がさらに好ましく、下限としては０．１％（ｖ／ｖ）以上、０．５％（ｖ／ｖ）以上、１％（ｖ／ｖ）以上とすればよい。 The amount of sample relative to water or alkaline solution is not limited as long as the subsequent steps can be carried out. For example, the amount of sample relative to water or alkaline solution is preferably 80% (v/v) or less, and 50% (v/v) or less relative to water or alkaline solution. v/v) or less, more preferably 40% (v/v) or less, and the lower limits are 0.1% (v/v) or more, 0.5% (v/v) or more, 1% (v/v) or less. /v) or more.

工程Ａにおいて、必要に応じてさらに添加剤等を加えてもよい。添加剤として、ＥＤＴＡ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルポリピロリドン、エタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられるが、これらに限定されない。添加剤の添加量は、各添加剤が有効にはたらく範囲内であれば、特に制限されない。 In step A, additives and the like may be further added as necessary. Additives include, but are not limited to, EDTA, polyvinylpyrrolidone, polyvinylpolypyrrolidone, ethanol, isopropanol, dimethyl sulfoxide, lithium salts, sodium salts, potassium salts, and the like. The amount of additives added is not particularly limited as long as each additive is within a range that works effectively.

工程Ａにおける懸濁は、公知の方法で実施できる。例えば、試料、及び水又はアルカリ性溶液を含んだチューブを手動で振動させて懸濁する方法（タッピング）、ピペットマン等によるピペッティング、転倒混和、ボルテックスミキサー等による懸濁などである。 Suspension in step A can be carried out by a known method. Examples include a method of manually shaking and suspending a tube containing a sample and water or an alkaline solution (tapping), pipetting with a pipetman or the like, mixing by inversion, suspension with a vortex mixer, or the like.

［工程Ｂ］
工程Ｂでは、工程Ａで得られた懸濁液に含まれる微生物を濃縮する。濃縮とは、懸濁液中に含まれる微生物を集菌するあるいはその微生物の濃度を上げることである。濃縮後、濃縮物を得るために不要な成分、例えば遠心分離による濃縮により微生物が沈降する場合における上清、の一部若しくは全部の除去を行ってもよい。濃縮方法は、目的の微生物を濃縮できれば特に制限はなく、例えば、遠心分離や磁性ビーズ分離、加熱乾燥、凍結乾燥等による処理で実施できるがこれらに限定されない。 [Process B]
In step B, the microorganisms contained in the suspension obtained in step A are concentrated. Concentration refers to collecting microorganisms contained in a suspension or increasing the concentration of the microorganisms. After concentration, some or all of the components unnecessary to obtain the concentrate, such as the supernatant when microorganisms are precipitated by centrifugal concentration, may be removed. The concentration method is not particularly limited as long as the target microorganism can be concentrated, and examples thereof include, but are not limited to, centrifugation, magnetic bead separation, heat drying, freeze drying, and the like.

遠心分離は、懸濁液に遠心力をかけることで、比重の異なる物質を分離あるいは分画する方法である。目的の微生物が沈降物にならないほどの遠心力をかければ、目的の微生物は上清に残り、夾雑物等は沈降物として分離される。一方で、目的の微生物が沈降物になるほどの遠心力をかければ、目的の微生物は沈降物として分離され、沈降物にならない夾雑物等は上清に残る。好ましくは目的の微生物が沈降物となる遠心分離である。遠心分離での遠心力は、目的の微生物や懸濁液中の物質に応じて適宜選択できる。遠心力は、例えば２，０００ｇ以上、５，０００ｇ以上、７，０００ｇ以上、８，０００ｇ以上、９，０００ｇ以上、１０，０００ｇ以上、１３，０００ｇ以上等とでき、目的の微生物を沈降物とする場合には５，０００ｇ以上が好ましく、８，０００ｇ以上がより好ましく、１０，０００ｇ以上がさらに好ましく、１３，０００ｇ以上がより一層好ましいが、これらに限定されない。遠心力の上限値は、本発明の効果を奏する限り、特に限定されないが、一例として、５０，０００ｇ以下とすることができ、好ましくは２０，０００ｇ以下とすることができる。また、遠心分離を行う時間も目的の微生物や懸濁液中の物質に応じて適宜選択できる。一般的に遠心分離を行う時間を長くすれば、沈降物はできやすくなるが、時間を要する。したがって、遠心分離を行う時間は短いほうが好ましく、例えば１０分以内、５分以内、３分以内等とすることができるが、これらに限定されない。
例えば、目的の微生物が沈降物となる遠心力で遠心分離を行い、その上清の一部若しくは全部を除くことで、目的の微生物が濃縮される。 Centrifugation is a method of separating or fractionating substances with different specific gravity by applying centrifugal force to a suspension. If a centrifugal force is applied that does not cause the target microorganisms to become sediment, the target microorganisms will remain in the supernatant, and impurities will be separated as sediment. On the other hand, if a centrifugal force is applied that is sufficient to cause the target microorganism to become a sediment, the target microorganism will be separated as a sediment, and impurities that do not become a sediment will remain in the supernatant. Preferably, centrifugation is used in which the target microorganism becomes a precipitate. The centrifugal force in centrifugation can be appropriately selected depending on the target microorganism and the substance in the suspension. The centrifugal force can be, for example, 2,000 g or more, 5,000 g or more, 7,000 g or more, 8,000 g or more, 9,000 g or more, 10,000 g or more, 13,000 g or more, etc., and the desired microorganisms are separated from the sediment. In the case of 5,000 g or more, more preferably 8,000 g or more, even more preferably 10,000 g or more, and even more preferably 13,000 g or more, but the amount is not limited thereto. The upper limit of the centrifugal force is not particularly limited as long as the effects of the present invention are achieved, but as an example, it can be 50,000 g or less, preferably 20,000 g or less. Furthermore, the time for centrifugation can be appropriately selected depending on the target microorganism and the substance in the suspension. Generally, the longer the time for centrifugation, the easier the formation of sediment, but it takes more time. Therefore, the time for centrifugation is preferably short, and can be, for example, within 10 minutes, within 5 minutes, within 3 minutes, but is not limited thereto.
For example, the target microorganisms are concentrated by performing centrifugation using centrifugal force that causes the target microorganisms to become precipitates, and removing part or all of the supernatant.

［工程Ｃ］
工程Ｃでは、工程Ｂで得られた濃縮物にアルカリ性溶液を添加する。濃縮物は、工程Ｂによって微生物が濃縮されたものであり、固形物及び／又は液体物であり得る。固形物であれば、アルカリ性溶液を添加した後、懸濁することで懸濁液を調製する。液体物であれば、アルカリ性溶液を添加した後、懸濁することで溶液を均一化してもよい。 [Process C]
In step C, an alkaline solution is added to the concentrate obtained in step B. The concentrate is one in which microorganisms are concentrated in step B, and can be a solid and/or a liquid. If it is a solid substance, a suspension is prepared by adding an alkaline solution and then suspending it. If it is a liquid, the solution may be homogenized by adding an alkaline solution and then suspending it.

工程Ｃにおいてアルカリ性溶液としては、前記工程Ａで説明したと同様のアルカリ性溶液を使用できる。また、工程Ｃでは、工程Ａで説明したと同様に、添加剤等を懸濁液に更に加えてもよい。 As the alkaline solution in step C, the same alkaline solution as explained in step A above can be used. Furthermore, in step C, additives and the like may be further added to the suspension in the same manner as described in step A.

また、工程Ｃにおいて、濃縮物に対して添加するアルカリ性溶液の量は特に制限されないが、後述する工程Ｄにおける懸濁液に含まれる微生物を溶菌又は破砕する工程で、アルカリ処理としてはたらく量が好ましい。例えば、工程Ｂにおいて得られる濃縮物が液体物の場合、その濃縮物１５０μＬに対して、工程Ｃで添加するアルカリ性溶液の量は、一例として１５０μＬ以下、好ましくは１００μＬ以下、より好ましくは７５μＬ以下とすることができる。下限値としては、例えば、１μＬ以上、好ましくは５μＬ以上、より好ましくは１０μＬ以上とすることができる。更に、工程Ｃで用いるアルカリ性液のｐＨとしては、例えば、アルカリ性溶液を添加した後の懸濁液のｐＨが、８．０～１４．０が好ましく、９．０～１３．０がより好ましい。 In addition, the amount of alkaline solution added to the concentrate in step C is not particularly limited, but it is preferable that the amount acts as an alkaline treatment in the step of lysing or crushing microorganisms contained in the suspension in step D, which will be described later. . For example, when the concentrate obtained in Step B is a liquid, the amount of alkaline solution added in Step C to 150 μL of the concentrate is, for example, 150 μL or less, preferably 100 μL or less, and more preferably 75 μL or less. can do. The lower limit can be, for example, 1 μL or more, preferably 5 μL or more, and more preferably 10 μL or more. Further, as for the pH of the alkaline solution used in Step C, for example, the pH of the suspension after adding the alkaline solution is preferably 8.0 to 14.0, more preferably 9.0 to 13.0.

工程Ｃでは、工程Ｂで得られた濃縮物にアルカリ性溶液を添加した後、懸濁（混合）させることが好ましい。工程Ｃにおける懸濁は、公知の方法で実施できる。例えば、濃縮物とアルカリ性溶液を含んだチューブを手動で振動させて懸濁する方法（タッピング）、ピペットマン等によるピペッティング、転倒混和、ボルテックスミキサー等による懸濁などである。 In step C, it is preferable to add an alkaline solution to the concentrate obtained in step B and then suspend (mix) the mixture. Suspension in step C can be carried out by a known method. For example, there are methods of suspending by manually vibrating a tube containing a concentrate and an alkaline solution (tapping), pipetting with a pipetman or the like, mixing by inversion, suspension with a vortex mixer, or the like.

［工程Ｄ］
工程Ｄでは、工程Ｃで得られた懸濁液に含まれる微生物を溶菌又は破砕する。この工程では、微生物に含まれる核酸、タンパク質、脂質等が液中に放出されうる。放出された核酸、タンパク質、脂質等をターゲットにすることで、後の、微生物の検出が感度よく効率的に実施できる。 [Process D]
In step D, the microorganisms contained in the suspension obtained in step C are lysed or crushed. In this step, nucleic acids, proteins, lipids, etc. contained in the microorganism may be released into the liquid. By targeting released nucleic acids, proteins, lipids, etc., subsequent detection of microorganisms can be carried out with high sensitivity and efficiency.

工程Ｄは、撹拌処理、ビーズ破砕処理、超音波処理、加熱処理、及びアルカリ処理の少なくとも一つの処理を含む方法により好ましく実施できる。 Step D can be preferably carried out by a method including at least one of stirring treatment, bead crushing treatment, ultrasonic treatment, heat treatment, and alkali treatment.

撹拌処理は懸濁液を撹拌して微生物を破砕する方法である。撹拌処理は、転倒混和、ボルテックスミキサー、撹拌機などにより行うことができる。 Stirring treatment is a method of stirring a suspension to crush microorganisms. The stirring process can be performed using inversion mixing, a vortex mixer, a stirrer, or the like.

ビーズ破砕処理は、懸濁液にビーズを加えて撹拌することで微生物を破砕する方法である。用いるビーズの種類は特に制限はなく微生物破砕用のものであれば使用でき、例えば、ジルコニアビーズ、ガラスビーズ等が挙げられるが、ジルコニアビーズがより好ましい。また、ビーズのサイズは例えば５ｍｍ以下が好ましく、複数のサイズのビーズを組み合わせて使用してもよい。複数のサイズのビーズを用いることで、破砕効率の向上が期待できる。処理時間は例えば１０秒間～１０分間、好ましくは２０秒間～５分間、より好ましくは３０秒～３分間である。
なお、ビーズ破砕処理に用いるビーズは、工程Ａ～Ｄのいずれの段階で反応容器に加えてもよいが、工程Ａを行う段階、特に試料、水、又はアルカリ性溶液を反応容器に加える前、から反応容器に含めておくと、以降の工程でビーズを導入する操作を要しないため好ましい。工程Ａ～Ｅにおいて反応容器にビーズが含まれていても前処理が可能である。 Bead crushing treatment is a method of crushing microorganisms by adding beads to a suspension and stirring. There are no particular restrictions on the type of beads used, as long as they are used to disrupt microorganisms, and examples include zirconia beads and glass beads, with zirconia beads being more preferred. Further, the size of the beads is preferably 5 mm or less, for example, and beads of a plurality of sizes may be used in combination. By using beads of multiple sizes, it is expected that the crushing efficiency will be improved. The treatment time is, for example, 10 seconds to 10 minutes, preferably 20 seconds to 5 minutes, more preferably 30 seconds to 3 minutes.
Note that the beads used for bead crushing treatment may be added to the reaction vessel at any stage from Steps A to D, but they may be added to the reaction vessel at any stage from Step A to Step A, especially before adding the sample, water, or alkaline solution to the reaction vessel. It is preferable to include the beads in the reaction container because it eliminates the need for an operation to introduce beads in subsequent steps. In steps A to E, pretreatment is possible even if beads are contained in the reaction vessel.

超音波処理は、懸濁液に超音波を当てることで、微生物を破砕する方法である。例えば、超音波ホモジナイザーは簡便に細胞壁を壊すことができ、微生物が破砕されやすい。処理時間は例えば１０秒間～２分間、好ましくは１０秒間～１分間であり、１回のみでも複数回（例えば２～６回、２～４回等）繰り返してもよい。 Ultrasonication is a method of crushing microorganisms by applying ultrasonic waves to a suspension. For example, an ultrasonic homogenizer can easily break cell walls and easily disrupt microorganisms. The treatment time is, for example, 10 seconds to 2 minutes, preferably 10 seconds to 1 minute, and may be repeated once or multiple times (eg, 2 to 6 times, 2 to 4 times, etc.).

加熱処理は、懸濁液に熱を加えることで微生物を溶菌させる方法である。加熱温度は特に制限されないが、一例として７５℃以上とすることができ、８０℃以上が好ましい。加熱時間は例えば１０秒間～３０分間、好ましくは２０秒間～２０分間、より好ましくは３０秒間～１０分間である。 Heat treatment is a method of lysing microorganisms by applying heat to a suspension. Although the heating temperature is not particularly limited, it can be set to 75°C or higher as an example, and preferably 80°C or higher. The heating time is, for example, 10 seconds to 30 minutes, preferably 20 seconds to 20 minutes, more preferably 30 seconds to 10 minutes.

アルカリ処理は、懸濁液にアルカリ性物質を加えて微生物を溶菌する方法である。アルカリ性物質は、懸濁液中の微生物を溶菌できる程度のアルカリ性であり、微生物の検出を阻害しないもの、あるいは阻害しうるとしても検出に供される前に簡便に除去できるものであれば、特に制限されない。アルカリ性物質は、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム又は炭酸カルシウムであってもよく、これらを単独で又は複数種を組み合わせて使用でき、好適にはこれらの水溶液（アルカリ性溶液）である。懸濁液にアルカリ性溶液が添加される場合アルカリ性溶液のｐＨは、７．０以上、８．０以上、９．０以上、１０．０以上、１１．０以上等とすることができ、また、１４．０以下、１３．０以下、１２．５以下、１２．０以下、１１．０以下等とすることができ、ｐＨ８．０～１４．０であることが好ましく、ｐＨ９．０～１３．０であることがより好ましい。 Alkaline treatment is a method of adding an alkaline substance to a suspension to lyse microorganisms. The alkaline substance is particularly suitable as long as it is alkaline enough to lyse microorganisms in suspension and does not inhibit the detection of microorganisms, or even if it does, it can be easily removed before being subjected to detection. Not restricted. The alkaline substance may be, for example, potassium hydroxide, sodium hydroxide, calcium hydroxide, potassium carbonate, sodium carbonate, or calcium carbonate, and these can be used alone or in combination. It is an aqueous solution (alkaline solution). When an alkaline solution is added to the suspension, the pH of the alkaline solution can be 7.0 or higher, 8.0 or higher, 9.0 or higher, 10.0 or higher, 11.0 or higher, etc. The pH may be 14.0 or less, 13.0 or less, 12.5 or less, 12.0 or less, 11.0 or less, preferably pH 8.0 to 14.0, and preferably pH 9.0 to 13. More preferably, it is 0.

また、工程Ｃで得られた懸濁液中のアルカリ性溶液が溶菌作用を有するときは、当該懸濁液をそのまま、静置等する、或いは撹拌処理等の他の処理を併用することによって溶菌することができ、このような態様は本工程のアルカリ処理を省略又は簡便にできるため好ましい。例えば、工程Ｃにおいて得られる懸濁液が溶菌に適したアルカリ性（例えばｐＨ８．０～１４．０、ｐＨ９．０～１３．０等）であるときは、工程Ｄとしての操作を省略することもできる。 In addition, when the alkaline solution in the suspension obtained in step C has a bacteriolytic effect, the bacteriolysis can be carried out by leaving the suspension as it is, or by using other treatments such as stirring in combination. This embodiment is preferable because the alkali treatment in this step can be omitted or simplified. For example, if the suspension obtained in Step C is alkaline enough for bacteriolysis (for example, pH 8.0 to 14.0, pH 9.0 to 13.0, etc.), Step D may be omitted. can.

工程Ｄでは、一つ又は複数の処理を連続して行ってもよいし、可能であれば複数の処理を組み合わせて同時に行ってもよい。複数の処理を組み合わせることは、より溶菌又は破砕されやすくなるので好ましい。一実施形態において、工程Ｃで溶菌に適したアルカリ性溶液に懸濁し、工程Ｄにおいて他の処理、例えば撹拌処理、ビーズ破砕処理、超音波処理、加熱処理等を行う。また、他の実施形態では、工程Ｃで得られた懸濁液に撹拌処理及びビーズ破砕処理を行う。さらに別の実施形態では、工程Ｃで得られた懸濁液にビーズ破砕処理を行う。なかでも、強固な細胞壁を有するMycobacterium属の微生物を検出する場合には、工程Ｄにおいて、加熱処理（例えば、約８０℃以上で１０分間程度）とビーズ破砕処理を組み合わせて行うことが好ましく、上記のような加熱処理を先に行い、次いでビーズ破砕処理を行うことがより好ましい。 In step D, one or more treatments may be performed successively, or a plurality of treatments may be combined and performed simultaneously if possible. Combining a plurality of treatments is preferable because the bacterium becomes more easily lysed or crushed. In one embodiment, in Step C, it is suspended in an alkaline solution suitable for bacteriolysis, and in Step D, it is subjected to other treatments, such as stirring treatment, bead crushing treatment, ultrasonication treatment, heat treatment, etc. In another embodiment, the suspension obtained in step C is subjected to a stirring process and a bead crushing process. In yet another embodiment, the suspension obtained in step C is subjected to bead crushing treatment. In particular, when detecting microorganisms of the genus Mycobacterium that have strong cell walls, it is preferable to perform heat treatment (for example, at about 80° C. or higher for about 10 minutes) and bead crushing treatment in combination in step D. It is more preferable to perform the heat treatment first, and then perform the bead crushing treatment.

［工程Ｅ］
本発明では工程Ｅとして、工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液を精製する工程を設けてもよい。工程Ｅで該液が精製されることによって、微生物の検出をより高感度に行うことができる。ここでいう精製とは、工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液中の核酸、タンパク質、脂質等の純度を上げることをいう。すなわち、該液中に放出された核酸、タンパク質、脂質等以外の夾雑物の量を低減し、工程Ｅで得られる精製液における核酸、タンパク質、脂質等の純度を工程Ｄで得られた液より上げることをいう。精製する方法は特に制限されないが、限外ろ過処理、分離処理等が挙げられ、これらの処理は単独でも複数組み合わせてもよい。工程数を小さく、前処理を簡便にする観点からは工程Ｅを設けないこともできる。 [Process E]
In the present invention, step E may include a step of purifying the lysate or disrupted solution obtained in step D. By purifying the liquid in step E, microorganisms can be detected with higher sensitivity. Purification here refers to increasing the purity of nucleic acids, proteins, lipids, etc. in the lysis solution or disruption solution obtained in step D. That is, the amount of contaminants other than nucleic acids, proteins, lipids, etc. released into the solution is reduced, and the purity of nucleic acids, proteins, lipids, etc. in the purified solution obtained in Step E is lower than that in the solution obtained in Step D. It means to raise. The method of purification is not particularly limited, but includes ultrafiltration treatment, separation treatment, etc., and these treatments may be used alone or in combination. From the viewpoint of reducing the number of steps and simplifying pretreatment, step E may not be provided.

限外ろ過とは、目的に応じた孔径を有するフィルター等を用いて目的物とそれ以外の夾雑物を分離する方法である。例えば、溶液中に放出された微生物由来の核酸、タンパク質、脂質等を選択的に分離するため、それらが通過する大きさの孔を有するフィルターを用いることが好ましい。該フィルターを用いることで、核酸、タンパク質、脂質等の小分子はろ液として通過し、孔よりも大きい夾雑物を除去することができる。 Ultrafiltration is a method of separating a target substance from other impurities using a filter having a pore size depending on the purpose. For example, in order to selectively separate nucleic acids, proteins, lipids, etc. derived from microorganisms released into a solution, it is preferable to use a filter having pores large enough to allow them to pass through. By using this filter, small molecules such as nucleic acids, proteins, and lipids can pass through as a filtrate, and contaminants larger than the pores can be removed.

分離とは、物理的あるいは化学的な方法で核酸、タンパク質、脂質等を選択的に収集することをいう。例えば、遠心分離、ＨＰＬＣ等をはじめとするクロマトグラフィー、磁気分離、電気分離等が挙げられるが、これらに限定されない。一例として遠心分離にて選択的に分離する場合、核酸、タンパク質、脂質等が沈降物にならない程度の遠心力を加えることが好ましい。該遠心力を加えて処理することで、核酸、タンパク質、脂質等の目的物は上清に残るため、上清をのちの検出に使用することができる。遠心力は、５，０００ｇ以上が好ましく、８，０００ｇ以上がより好ましく、１０，０００ｇ以上がさらに好ましく、１３，０００ｇ以上がより一層好ましいが、これらに限定されない。遠心力の上限値は、本発明の効果を奏する限り、特に限定されないが、一例として、５０，０００ｇ以下とすることができ、好ましくは２０，０００以下とすることができる。また、遠心分離を行う時間は１０分以内が好ましく、５分以内がより好ましく、３分以内がさらに好ましいが、これらに限定されない。 Separation refers to selectively collecting nucleic acids, proteins, lipids, etc. by physical or chemical methods. Examples include, but are not limited to, centrifugation, chromatography including HPLC, magnetic separation, electrical separation, and the like. For example, when selectively separating by centrifugation, it is preferable to apply centrifugal force to an extent that nucleic acids, proteins, lipids, etc. do not become precipitates. By applying the centrifugal force and processing, target substances such as nucleic acids, proteins, and lipids remain in the supernatant, so the supernatant can be used for later detection. The centrifugal force is preferably 5,000 g or more, more preferably 8,000 g or more, even more preferably 10,000 g or more, even more preferably 13,000 g or more, but is not limited thereto. The upper limit of the centrifugal force is not particularly limited as long as the effects of the present invention are achieved, but as an example, it can be 50,000 g or less, preferably 20,000 g or less. Further, the time for centrifugation is preferably within 10 minutes, more preferably within 5 minutes, even more preferably within 3 minutes, but is not limited thereto.

［反応容器］
本発明では、少なくとも工程Ａ～Ｅを同一の反応容器内で行い、工程Ａ～Ｆを同一の反応容器内で行ってもよい。反応容器は、工程Ａ～Ｅ又は工程Ａ～Ｆを実施できる形態であれば、特に制限されず、材質、形、色、容量等は目的に合わせて選択することができる。例えば、工程Ｂあるいは工程Ｅにおいて遠心分離を行う場合、該反応容器は遠心分離機に適応可能であることが好ましい。したがって、該反応容器の容量は、例えば、５０ｍＬ以下、好ましくは２５ｍＬ以下、より好ましくは１５ｍＬ以下、更に好ましくは５ｍＬ以下、更により好ましくは２ｍＬ以下又は１．５ｍＬ以下である。本発明の方法では、少なくとも工程Ａ～Ｅを同一容器で行うことで、懸濁操作の不足や溶液の分注ロス等の発生を抑制することができる。また、複数の反応容器を用いて溶液等を移す操作をすると、操作回数が１回以上増えるとともに、資材コストの増加、コンタミリスクの増加、試料からの感染リスクの増加等のデメリットがあり、本発明ではこれらのデメリットが小さい。したがって、同一の反応容器内で各工程を行う本発明は、操作性、安全性等の観点からも非常に優れている。 [Reaction container]
In the present invention, at least steps A to E may be performed in the same reaction container, and steps A to F may be performed in the same reaction container. The reaction container is not particularly limited as long as it has a form that allows steps A to E or steps A to F to be carried out, and the material, shape, color, capacity, etc. can be selected depending on the purpose. For example, when centrifuging is performed in Step B or E, the reaction vessel is preferably adaptable to a centrifuge. Therefore, the capacity of the reaction vessel is, for example, 50 mL or less, preferably 25 mL or less, more preferably 15 mL or less, even more preferably 5 mL or less, even more preferably 2 mL or less, or 1.5 mL or less. In the method of the present invention, by performing at least steps A to E in the same container, it is possible to prevent insufficient suspension operations and loss of solution dispensing. In addition, when transferring solutions etc. using multiple reaction containers, the number of operations increases by one or more, and there are disadvantages such as increased material cost, increased risk of contamination, and increased risk of infection from samples. In the invention, these disadvantages are small. Therefore, the present invention, in which each step is performed in the same reaction vessel, is very superior from the viewpoints of operability, safety, etc.

また、反応容器中にビーズが含まれていてもよい。特定の好ましい実施形態では、最初の工程Ａの段階から反応容器中にビーズが充填された状態で本発明の方法を実施することができる。本発明では、反応容器がビーズを含む状態で工程Ａを行い、次いで、その同じ反応容器内で工程Ｂの濃縮工程（例えば、遠心分離処理）以降の工程を行っても、良好な検出結果が得られている（試験例１～３）。このため、ビーズを反応容器に供給すると汚染が懸念される等の理由により工程Ｂ以降におけるビーズ供給操作を回避したい場合等があり、そのような場合でも、本発明において工程Ａの段階からビーズを含んだ反応容器を使用しておけば、ビーズ供給による汚染の心配がなく、そのため、工程Ｄにおいてビーズ破砕処理を容易に実施することができる。用いるビーズの種類は特に制限はなく微生物破砕用のものであれば使用でき、例えば、ジルコニアビーズ、ガラスビーズ等が挙げられるが、ジルコニアビーズがより好ましい。また、ビーズのサイズは例えば粒子径５ｍｍ以下が好ましく、複数のサイズのビーズを組み合わせて使用してもよい。複数のサイズのビーズを用いることで、破砕効率の向上が期待できる。 Furthermore, beads may be included in the reaction vessel. In certain preferred embodiments, the method of the invention can be carried out with the reaction vessel filled with beads from the initial stage of step A. In the present invention, good detection results can be obtained even if step A is performed in a state where the reaction container contains beads, and then the steps after the concentration step (e.g., centrifugation treatment) of step B are performed in the same reaction container. (Test Examples 1 to 3). For this reason, there are cases where it is desired to avoid the bead supply operation after step B due to concerns about contamination when beads are supplied to the reaction vessel. By using a reaction vessel containing the beads, there is no need to worry about contamination due to bead supply, and therefore, the bead crushing treatment in step D can be carried out easily. There are no particular restrictions on the type of beads used, as long as they are used to disrupt microorganisms, and examples include zirconia beads and glass beads, with zirconia beads being more preferred. Further, the size of the beads is preferably, for example, a particle diameter of 5 mm or less, and beads of a plurality of sizes may be used in combination. By using beads of multiple sizes, it is expected that the crushing efficiency will be improved.

［工程Ｆ］
工程Ｆでは、工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液、或いは工程Ｅで得られた精製液の一部又は全部を微生物の検出に供し、微生物を検出する。該液を検出対象試料液として直接、微生物の検出に供してもよい。該液に必要に応じて各種標識、核酸増幅、核酸検出等のための、微生物検出用試薬等を添加することで微生物を検出できる。また、該液を含む工程Ａ～Ｅと同一の反応容器にこのような試薬等を添加してもよい、つまり工程Ｆも工程Ａ～Ｅと同一の反応容器で行ってもよい。あるいは、該液をこのような試薬等を予め含んだ検出用容器に添加してもよい。なお、微生物の検出を阻害しない限りにおいて、適宜の、他の成分を加えたり、他の処理を加えたりできる。 [Process F]
In step F, part or all of the lysate or disrupted solution obtained in step D or the purified solution obtained in step E is subjected to microbial detection to detect microorganisms. The liquid may be directly used to detect microorganisms as a sample liquid to be detected. Microorganisms can be detected by adding various labels, microorganism detection reagents for nucleic acid amplification, nucleic acid detection, etc. to the liquid as necessary. Further, such reagents and the like may be added to the same reaction vessel containing the liquid as Steps A to E, that is, Step F may also be carried out in the same reaction vessel as Steps A to E. Alternatively, the liquid may be added to a detection container containing such reagents and the like in advance. Note that other appropriate components or other treatments may be added as long as they do not inhibit the detection of microorganisms.

微生物の検出は、例えば核酸検出法、抗原検査法、抗体検査法、培養同定法、質量分析法、生化学的性状試験等により行えるが、検出の精度及び検出に要する時間の点で核酸検出法が好ましい。 Microorganisms can be detected by, for example, nucleic acid detection methods, antigen testing methods, antibody testing methods, culture identification methods, mass spectrometry, biochemical property tests, etc. However, in terms of detection accuracy and time required, nucleic acid detection methods are preferred. is preferred.

核酸を検出する方法は、さらに、微生物由来の核酸の増幅を含むことが好ましい。核酸増幅を行うことで、より高感度に目的の微生物由来の核酸を検出することができる。核酸増幅の方法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＳＤＡ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、ＲＴ－ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＲＣ法等が挙げられ、これらは単独で又は組み合わせて利用される。これらの技術は既に当該技術分野において確立されており、目的に合わせて適宜選択できる。好ましい核酸増幅はＰＣＲ法である。 Preferably, the method for detecting nucleic acids further includes amplification of microbial-derived nucleic acids. By performing nucleic acid amplification, nucleic acids derived from target microorganisms can be detected with higher sensitivity. Methods for nucleic acid amplification include PCR method, LAMP method, LCR method, TMA method, SDA method, RT-PCR method, RT-LAMP method, NASBA method, TRC method, etc., and these methods can be used alone or in combination. be done. These techniques have already been established in the technical field, and can be selected as appropriate depending on the purpose. A preferred nucleic acid amplification method is PCR.

ＰＣＲ法は、主にＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応であり、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの乖離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって標的核酸を増幅する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｂｓｔ、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｔｂｒ、Ｔｆｉ、Ｔｆｌ、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ、ＤＥＥＰＶＥＮＴやその変異体が挙げられる。 The PCR method is a reaction mainly catalyzed by DNA polymerase, which involves (1) DNA denaturation (dissociation from double-stranded DNA to single-stranded DNA) by heat treatment, (2) application of primers to template single-stranded DNA. The three steps of annealing and (3) extension of the primer using DNA polymerase constitute one cycle, and the target nucleic acid is amplified by repeating this cycle. Examples of DNA polymerases include Taq, Tth, Bst, KOD, Pfu, Pwo, Tbr, Tfi, Tfl, Tma, Tne, Vent, DEEPVENT, and variants thereof.

［検出対象の微生物（検出対象微生物）］
本発明において、検出の対象となる微生物は、特に制限されないが、例えば、Mycobacterium属に分類される微生物（結核菌群（Mycobacterium tuberculosis complex）、非結核性抗酸菌等）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile、Clostridioides difficile）、ノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、パラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）、肺炎クラミジア（Chlamydophila pneumoniae）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、オウム病クラミジア（Chlamydia psittaci）、ウレアプラズマ、ＨＩＶ、ＨＰＶ等であり、検出対象微生物は１種単独でも複数種組み合わせてもよい。なお、目的の微生物の形態、性状、性質等に合わせて、各工程を本発明の範囲内で適宜変更してもよい。 [Microorganisms to be detected (microorganisms to be detected)]
In the present invention, the microorganisms to be detected are not particularly limited, but include, for example, microorganisms classified in the genus Mycobacterium (Mycobacterium tuberculosis complex, non-tuberculous mycobacteria, etc.), Clostridium difficile difficile, Clostridioides difficile), norovirus, rotavirus, sapovirus, influenza virus, respiratory syncytial virus, adenovirus, Mycoplasma pneumoniae, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Chlamydophila pneumoniae ), Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Ureaplasma, HIV, HPV, etc. The microorganisms to be detected may be one type alone or a combination of multiple types. Note that each step may be changed as appropriate within the scope of the present invention depending on the form, properties, properties, etc. of the target microorganism.

例えば、Mycobacterium属に分類される微生物の一つである、結核菌群は、ミコール酸を細胞壁に多く含み、外的因子に対して高い抵抗性を示すため、工程Ｄの溶菌又は破砕する工程において複数種の処理を行うこと（なかでも、加熱処理とビーズ破砕処理を相前後又は並行して行うこと）が好ましいが、特に限定されない。 For example, Mycobacterium tuberculosis, which is one of the microorganisms classified in the genus Mycobacterium, contains a large amount of mycolic acid in its cell wall and exhibits high resistance to external factors. Although it is preferable to perform multiple types of treatments (among them, heat treatment and bead crushing treatment to be performed one after the other or in parallel), there is no particular limitation.

Mycobacterium属に分類される微生物としては、特に限定されないが、例えば、M. abscessus、M. africanum、M. agri、M. aichiense、M. algericum、M. alvei、M. arabiense、M. aromaticivorans、M. arosiense、M. arupense、M. asiaticum、M. aubagnense、M. aurum、M. austroafricanum、M. avium、M. bacteremicum、M. boenickei、M. bohemicum、M. bolletii、M. botniense、M. bouchedurhonense、M. bourgelatii、M. bovis、M. branderi、M. brisbanense、M. brumae、M. canariasense、M. caprae、M. celatum、M. chelonae、M. chimaera、M. chitae、M. chlorophenolicum、M. chubuense、M. colombiense、M. conceptionense、M. confluentis、M. conspicuum、M. cookii、M. cosmeticum、M. crocinum、M. diernhoferi、M. doricum、M. duvalii、M. elephantis、M. europaeum、M. fallax、M. farcinogenes、M. flavescens、M. florentinum、M. fluoranthenivorans、M. fortuitum、M. frederiksbergense、M. gadium、M. gastri、M. genavense、M. gilvum、M. goodii、M. gordonae、M. haemophilum、M. hassiacum、M. heckeshornense、M. heidelbergense、M. hiberniae、M. hippocampi、M. hodleri、M. holsaticum、M. houstonense、M. immunogenum、M. insubricum、M. interjectum、M. intermedium、M. intracellulare、M. iranicum、M. kansasii、M. komossense、M. koreense、M. kubicae、M. kumamotonense、M. kyorinense、M. lacus、M. lentiflavum、M. leprae、M. lepraemurium、M. litorale、M. llatzerense、M. madagascariense、M. mageritense、M. malmoense、M. mantenii、M. marinum、M. marseillense、M. massiliense、M. microti、M. minnesotense、M. monacense、M. montefiorense、M. moriokaense、M. mucogenicum、M. murale、M. neoaurum、M. nebraskense、M. neworleansense、M. nonchromogenicum、M. noviomagense、M. novocastrense、M. obuense、M. pallens、M. palustre、M. paraffinicum、M. parafortuitum、M. paragordonae、M. parakoreense、M. parascrofulaceum、M. paraseoulense、M. paratuberculosis、M. parmense、M. peregrinum、M. phlei、M. phocaicum、M. pinnipedii、M. porcinum、M. poriferae、M. pseudoshottsii、M. psychrotolerans、M. pulveris、M. pyrenivorans、M. rhodesiae、M. riyadhense、M. rufum、M. rutilum、M. salmoniphilum、M. saskatchewanense、M. scrofulaceum、M. sediminis、M. senegalense、M. senuense、M. seoulense、M. septicum、M. setense、M. sherrisii、M. shimoidei、M. shinjukuense、M. shottsii、M. simiae、M. smegmatis、M. sphagni、M. stomatepiae、M. szulgai、M. terrae、M. thermoresistibile、M. timonense、M. tokaiense、M. triplex、M. triviale、M. tuberculosis、M. tusciae、M. ulcerans、M. vaccae、M. vanbaalenii、M. vulneris、M. wolinskyi、M. xenopi、M. yongonense等を挙げることができる。本発明の検出方法では、これらのMycobacterium属の任意の微生物を検出することができるが、なかでもM. avium、M. intracellulare、M. africanum、M. bovis、M. microti、及びM. tuberculosisからなる群より選択される少なくとも一つが高感度に検出できるので好ましい。 Microorganisms classified in the genus Mycobacterium include, but are not particularly limited to, M. abscessus, M. africanum, M. agri, M. aichiense, M. algericum, M. alvei, M. arabiense, M. aromaticivorans, M. arosiense, M. arupense, M. asiaticum, M. aubagnense, M. aurum, M. austroafricanum, M. avium, M. bacteremicum, M. boenickei, M. bohemicum, M. bolletii, M. botniense, M. bouchedurhonense , M. bourgelatii, M. bovis, M. branderi, M. brisbanense, M. brumae, M. canariasense, M. caprae, M. celatum, M. chelonae, M. chimaera, M. chitae, M. chlorophenolicum, M. chubuense, M. colombiense, M. conceptionense, M. confluentis, M. conspicuum, M. cookii, M. cosmeticum, M. crocinum, M. diernhoferi, M. doricum, M. duvalii, M. elephantis, M. europaeum. , M. fallax, M. farcinogenes, M. flavescens, M. florentinum, M. fluoranthenivorans, M. fortuitum, M. frederiksbergense, M. gadium, M. gastri, M. genavense, M. gilvum, M. goodii, M. gordonae, M. haemophilum, M. hassiacum, M. heckeshornense, M. heidelbergense, M. hiberniae, M. hippocampi, M. hodleri, M. holsaticum, M. houstonense, M. immunogenum, M. insubricum, M. interjectum , M. intermedium, M. intracellulare, M. iranicum, M. kansasii, M. komossense, M. koreense, M. kubicae, M. kumamotonense, M. kyorinense, M. lacus, M. lentiflavum, M. leprae, M. lepraemurium, M. litorale, M. llatzerense, M. madagascariense, M. mageritense, M. malmoense, M. mantenii, M. marinum, M. marseillense, M. massiliense, M. microti, M. minnesotense, M. monacense. , M. montefiorense, M. moriokaense, M. mucogenicum, M. murale, M. neoaurum, M. nebraskense, M. neworleansense, M. nonchromogenicum, M. noviomagense, M. novocastrense, M. obuense, M. pallens, M. palustre, M. paraffinicum, M. parafortuitum, M. paragordonae, M. parakoreense, M. parascrofulaceum, M. paraseoulense, M. paratuberculosis, M. parmense, M. peregrinum, M. phlei, M. phocaicum, M. pinnipedii , M. porcinum, M. poriferae, M. pseudoshottsii, M. psychrotolerans, M. pulveris, M. pyrenivorans, M. rhodesiae, M. riyadhense, M. rufum, M. rutilum, M. salmoniphilum, M. saskatchewanense, M. scrofulaceum, M. sediminis, M. senegalense, M. senuense, M. seoulense, M. septicum, M. setense, M. sherrisii, M. shimoidei, M. shinjukuense, M. shottsii, M. simiae, M. smegmatis , M. sphagni, M. stomatepiae, M. szulgai, M. terrae, M. thermoresistibile, M. timonense, M. tokaiense, M. triplex, M. triviale, M. tuberculosis, M. tusciae, M. ulcerans, M. vaccae, M. vanbaalenii, M. vulneris, M. wolinskyi, M. xenopi, M. yongonense, etc. The detection method of the present invention can detect any microorganisms of the genus Mycobacterium, including M. avium, M. intracellulare, M. africanum, M. bovis, M. microti, and M. tuberculosis. At least one selected from the group consisting of: is preferable because it can be detected with high sensitivity.

［試料の前処理方法］
本発明の一実施形態は、微生物の検出ための試料の前処理方法であって、以下の工程Ａ～Ｅ：
（Ａ）試料を水又はアルカリ性溶液に懸濁する工程、
（Ｂ）前記工程Ａで得られた懸濁液に含まれる微生物を濃縮する工程、
（Ｃ）前記工程Ｂで得られた濃縮物にアルカリ性溶液を添加する工程、
（Ｄ）前記工程Ｃで得られた懸濁液に含まれる微生物を溶菌又は破砕する工程、
（Ｅ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液を必要に応じて精製する工程、
を包含し、前記工程Ａ～Ｅが同一の反応容器内で行われる方法、である。
この方法によって、微生物の検出に適した検出対象試料液を簡便に得ることができる。この方法の詳細は、本発明の検出方法における詳細と同様である。 [Sample pretreatment method]
One embodiment of the present invention is a method for pretreatment of a sample for detection of microorganisms, comprising the following steps A to E:
(A) suspending the sample in water or an alkaline solution;
(B) a step of concentrating the microorganisms contained in the suspension obtained in step A;
(C) adding an alkaline solution to the concentrate obtained in step B;
(D) a step of lysing or crushing the microorganisms contained in the suspension obtained in step C;
(E) a step of purifying the lysate or disrupted solution obtained in step D as necessary;
, and the steps A to E are performed in the same reaction vessel.
By this method, a detection target sample liquid suitable for detecting microorganisms can be easily obtained. The details of this method are similar to the details of the detection method of the present invention.

［検出対象試料液の調製方法］
本発明の一実施形態は、微生物の検出方法に供される検出対象試料液の調製方法であって、以下の工程Ａ～Ｅ：
（Ａ）試料を水又はアルカリ性溶液に懸濁する工程、
（Ｂ）前記工程Ａで得られた懸濁液に含まれる微生物を濃縮する工程、
（Ｃ）前記工程Ｂで得られた濃縮物にアルカリ性溶液を添加する工程、
（Ｄ）前記工程Ｃで得られた懸濁液に含まれる微生物を溶菌又は破砕する工程、
（Ｅ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液を必要に応じて精製する工程、
を包含し、前記工程Ａ～Ｅが同一の反応容器内で行われる方法、である。
この方法によって調製される検出対象試料液は、上記工程Ｆに記載された溶菌液、破砕液、又は精製液として利用できる。この方法の詳細は、本発明の検出方法における詳細と同様である。 [Preparation method of sample liquid to be detected]
One embodiment of the present invention is a method for preparing a detection target sample solution to be subjected to a method for detecting microorganisms, which includes the following steps A to E:
(A) suspending the sample in water or an alkaline solution;
(B) a step of concentrating the microorganisms contained in the suspension obtained in step A;
(C) adding an alkaline solution to the concentrate obtained in step B;
(D) a step of lysing or crushing the microorganisms contained in the suspension obtained in step C;
(E) a step of purifying the lysate or disrupted solution obtained in step D as necessary;
, and the steps A to E are performed in the same reaction vessel.
The detection target sample solution prepared by this method can be used as a lysis solution, a disruption solution, or a purification solution as described in step F above. The details of this method are similar to the details of the detection method of the present invention.

［試薬］
本発明の一実施形態は、本発明の試料の前処理方法、検出対象試料液の調製方法、又は微生物の検出方法のための試薬である。試薬の種類、個数について、これらの方法が実施できれば特に制限されない。
例えば、工程Ａ～Ｅ又は工程Ａ～Ｆに使用するための反応容器；工程Ａ及び／又は工程Ｃに使用するためのアルカリ性溶液；工程Ｄに使用するためのビーズ；工程Ｆに使用するための核酸増幅酵素、オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、マグネシウム塩等の１種又は２種以上；等が挙げられる。核酸増幅酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡリガーゼ、ヘリカーゼ；が試薬のひとつとして挙げられる。これらの試薬は本発明の効果が得られる限りにおいて公知のものを適宜使用できる。また、本発明の試薬の詳細は、本発明の検出方法における詳細と同様である。 [reagent]
One embodiment of the present invention is a reagent for a sample pretreatment method, a method for preparing a sample liquid to be detected, or a method for detecting microorganisms according to the present invention. The type and number of reagents are not particularly limited as long as these methods can be implemented.
For example, a reaction vessel for use in steps A to E or steps A to F; an alkaline solution for use in step A and/or step C; beads for use in step D; Examples include one or more of nucleic acid amplification enzymes, oligonucleotide primers, deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs), magnesium salts, and the like. Reagents for nucleic acid amplification enzymes include DNA polymerase, RNA polymerase, reverse transcriptase (RNA-dependent DNA polymerase), DNA ligase, and helicase. As these reagents, known ones can be used as appropriate as long as the effects of the present invention can be obtained. Further, the details of the reagent of the present invention are the same as those of the detection method of the present invention.

［キット］
本発明の一実施形態は、前記試薬を含む、本発明の試料の前処理方法、検出対象試料液の調製方法、又は微生物の検出方法のためのキットである。キットの構成について、前記試薬の少なくとも一つを含み、本発明の方法が実施できれば特に制限されない。
例えば、前記工程Ａ及び／又は工程Ｃに使用するためのアルカリ性溶液、前記工程Ｄに使用するためのビーズ、のいずれか一つを少なくとも含む、本発明の試料の前処理方法、検出対象試料液の調製方法、又は微生物の検出方法のためのキットが挙げられる。また、例えば、前記工程Ｆに使用するためのプライマーミックス及び／又はＤＮＡポリメラーゼ、のいずれか一つを少なくとも含む、本発明の微生物の検出方法のためのキットが挙げられる。 これらのキットはさらに、前記工程Ａ～Ｄ、工程Ａ～Ｅ、又は工程Ａ～Ｆで使用するための反応容器を含んでもよい。本発明のキットの構成要素の詳細は本発明の検出方法における詳細と同様である。 [kit]
One embodiment of the present invention is a kit for the sample pretreatment method, the method for preparing a sample liquid to be detected, or the method for detecting microorganisms of the present invention, which includes the reagent. The composition of the kit is not particularly limited as long as it contains at least one of the above reagents and can carry out the method of the present invention.
For example, the sample pretreatment method of the present invention includes at least one of an alkaline solution for use in the step A and/or the step C, and beads for use in the step D, and a sample solution to be detected. Examples include kits for methods for preparing microorganisms and methods for detecting microorganisms. Another example is a kit for the method for detecting microorganisms of the present invention, which includes at least one of a primer mix and/or a DNA polymerase for use in step F. These kits may further include reaction vessels for use in steps A to D, A to E, or A to F above. The details of the components of the kit of the present invention are the same as those in the detection method of the present invention.

以下に試験例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は試験例に限定されるものではない。 The present invention will be specifically explained below with reference to test examples, but the present invention is not limited to the test examples.

〔試験例１：反応容器の検討〕
（１－１）概要
工程Ａ～Ｅを同一の反応容器で行う場合と、複数の反応容器で行う場合における微生物検出結果を比較した。 [Test Example 1: Examination of reaction container]
(1-1) Overview The microbial detection results were compared between when steps A to E were performed in the same reaction vessel and when they were performed in multiple reaction vessels.

（１－２）試料
結核菌群、M. avium、M. intracellulareがすべて陰性であるヒト由来喀痰をＮＡＬＣ－ＮａＯＨ処理し、該処理液にM. avium菌体を１５００ＣＦＵ／ｍＬとなるように添加した液を試料とした。 (1-2) Sample Human sputum that was negative for Mycobacterium tuberculosis, M. avium, and M. intracellulare was treated with NALC-NaOH, and M. avium cells were added to the treated solution at a concentration of 1500 CFU/mL. The liquid was used as a sample.

（１－３）同一の反応容器を用いた方法
同一の反応容器で以下に示す工程Ａ～Ｆを行った。
工程Ａ：反応容器としてジーンキューブ（Ｒ）専用イージー・ビーズを使用した。該容器はジルコニアビーズを含む（以下の試験例においても同様）。該容器を工程Ａから工程Ｅまで使用した。該容器に滅菌水２４０μＬ、試料約１６０μＬを分注、懸濁した。
工程Ｂ：懸濁液について１３，０００ｇ、３分間の遠心分離を行い、上清の一部を廃棄して容器に約１００μＬ残した。
工程Ｃ：容器内に残った沈渣及び上清にｐＨが約１２～１３の水酸化カリウム水溶液を約１００μＬ添加して混合した。
工程Ｄ：得られた混合液を８０℃、１０分間加熱後、ボルテックスミキサーによる撹拌を１分間行い、ビーズ破砕を行った。
工程Ｅ：得られた破砕液について１３，０００ｇ、３分間の遠心分離を行った。
工程Ｆ：工程Ｅで得られた上清を検出対象試料液とし、その一部を２０μＬずつ０．５ｍＬチューブに分注した。該チューブをＧＥＮＥＣＵＢＥ（Ｒ）にセットし、ジーンキューブ（Ｒ）ＭＡＩ（東洋紡社）を使用してM. aviumの検出を行った。装置及び試薬の操作、取扱いは、それぞれの添付文書にしたがって行った。 (1-3) Method using the same reaction vessel The following steps A to F were performed in the same reaction vessel.
Step A: Easy Beads exclusively for GeneCube (R) were used as the reaction vessel. The container contains zirconia beads (the same applies to the following test examples). The container was used from Step A to Step E. 240 μL of sterilized water and about 160 μL of the sample were dispensed into the container and suspended.
Step B: The suspension was centrifuged at 13,000 g for 3 minutes and a portion of the supernatant was discarded leaving approximately 100 μL in the container.
Step C: About 100 μL of an aqueous potassium hydroxide solution having a pH of about 12 to 13 was added to the precipitate and supernatant remaining in the container and mixed.
Step D: After heating the obtained liquid mixture at 80° C. for 10 minutes, stirring was performed using a vortex mixer for 1 minute to crush beads.
Step E: The obtained crushed liquid was centrifuged at 13,000 g for 3 minutes.
Step F: The supernatant obtained in Step E was used as the sample solution to be detected, and a portion of it was dispensed in 20 μL portions into 0.5 mL tubes. The tube was set in GENECUBE(R), and M. avium was detected using GeneCUBE(R) MAI (Toyobo Co., Ltd.). The equipment and reagents were operated and handled according to their respective package inserts.

（１－４）複数の反応容器を用いた方法
複数の反応容器を用いて以下に示す工程Ａ～Ｆを行った。
工程Ａ：一つ目の反応容器として１．５ｍＬマイクロチューブ（ザルスタット社）を使用した。該容器を工程Ａから工程Ｃまで使用した。該容器に滅菌水２４０μＬ、試料約１６０μＬを分注、懸濁した。
工程Ｂ：懸濁液について１３，０００ｇ、３分間の遠心分離を行い、上清の一部を廃棄して容器に約１００μＬ残した。
工程Ｃ：容器内に残った沈渣及び上清にｐＨが約１２～１３の水酸化カリウム水溶液を約１００μＬ添加して混合した。
工程Ｄ：得られた混合液の全量を二つ目の反応容器であるジーンキューブ（Ｒ）専用イージー・ビーズに移し、８０℃、１０分間加熱後、ボルテックスミキサーによる撹拌を１分間行い、ビーズ破砕を行った。
工程Ｅ：得られた破砕液について１３，０００ｇ、３分間の遠心分離を行った。
工程Ｆ：工程Ｅで得られた上清を検出対象試料液とし、その一部を２０μＬずつ０．５ｍＬチューブに分注した。該チューブをＧＥＮＥＣＵＢＥ（Ｒ）にセットし、ジーンキューブ（Ｒ）ＭＡＩ（東洋紡社）を使用してM. aviumの検出を行った。装置及び試薬の操作、取扱いは、それぞれの添付文書にしたがって行った。 (1-4) Method using multiple reaction vessels The following steps A to F were performed using multiple reaction vessels.
Step A: A 1.5 mL microtube (Sarstedt) was used as the first reaction vessel. The container was used from Step A to Step C. 240 μL of sterilized water and about 160 μL of the sample were dispensed into the container and suspended.
Step B: The suspension was centrifuged at 13,000 g for 3 minutes and a portion of the supernatant was discarded leaving approximately 100 μL in the container.
Step C: About 100 μL of an aqueous potassium hydroxide solution having a pH of about 12 to 13 was added to the precipitate and supernatant remaining in the container and mixed.
Step D: Transfer the entire amount of the obtained mixture to the second reaction container, Easy Beads exclusively for GeneCube (R), heat at 80°C for 10 minutes, and then stir with a vortex mixer for 1 minute to crush the beads. I did it.
Step E: The obtained crushed liquid was centrifuged at 13,000 g for 3 minutes.
Step F: The supernatant obtained in Step E was used as the sample solution to be detected, and a portion of it was dispensed in 20 μL portions into 0.5 mL tubes. The tube was set in GENECUBE(R), and M. avium was detected using GeneCUBE(R) MAI (Toyobo Co., Ltd.). The equipment and reagents were operated and handled according to their respective package inserts.

（１－５）結果
同一の反応容器で各工程を行った場合（１－３）と、複数の反応容器で各工程を行った場合（１－４）でのM. avium検出結果(陽性率)を比較した。 (1-5) Results M. avium detection results (positive rate) when each step was performed in the same reaction container (1-3) and when each step was performed in multiple reaction containers (1-4) ) were compared.

表１が同一の反応容器で各工程を行った場合と、複数の反応容器で各工程を行った場合での陽性率である。複数の反応容器を使用した場合、陽性率は４３．８％程度と低かった一方、同一の反応容器で各工程を行った場合、陽性率は１００％であった。これは容器から懸濁液を移す際のロスを抑制できたことが一因であると考えられるが、そのようなロスの抑制から予想される以上に高い陽性率を達成することができた。本発明の検出方法により予想以上に高い陽性率を達成できることが確認できた。 Table 1 shows the positive rate when each step was performed in the same reaction container and when each step was performed in multiple reaction containers. When multiple reaction vessels were used, the positive rate was as low as about 43.8%, whereas when each step was performed in the same reaction vessel, the positive rate was 100%. This is thought to be due in part to the suppression of loss when transferring the suspension from the container, but we were able to achieve a higher positive rate than expected from such suppression of loss. It was confirmed that the detection method of the present invention could achieve a higher positive rate than expected.

Figure 0007395254000001
Figure 0007395254000001

〔試験例２：従来方法との比較１〕
（２－１）概要
本発明の検出方法における試料の前処理方法（工程Ａ～Ｅ）と従来技術における試料の前処理方法（核酸抽出法）を比較した。従来方法として、ジーンキューブ（Ｒ）専用前処理セット（東洋紡社）及びＧＥＮＥＣＵＢＥ（Ｒ）（東洋紡社）による核酸抽出を用いた。 [Test Example 2: Comparison with conventional method 1]
(2-1) Overview The sample pretreatment method (steps A to E) in the detection method of the present invention was compared with the sample pretreatment method (nucleic acid extraction method) in the prior art. As a conventional method, nucleic acid extraction using a pretreatment set exclusively for GeneCube (R) (Toyobo Co., Ltd.) and GENECUBE (R) (Toyobo Co., Ltd.) was used.

（２－２）試料
結核菌群、M. avium、M. intracellulareがすべて陰性であるヒト由来喀痰をＮＡＬＣ－ＮａＯＨ処理し、該処理液にM. bovis菌体を７５００ＣＦＵ／ｍＬあるいはM. intracellulare菌体を１５００ＣＦＵ／ｍＬとなるように添加した液を試料とした。 (2-2) Sample Human sputum that is negative for Mycobacterium tuberculosis, M. avium, and M. intracellulare is treated with NALC-NaOH, and 7500 CFU/mL of M. bovis cells or M. intracellulare is added to the treated solution. A sample was prepared by adding 1,500 CFU/mL of 1,500 CFU/mL.

（２－３）本発明の検出方法における検出対象試料液の調製（試料の前処理）
同一の反応容器で以下に示す工程Ａ～Ｅを行った。
工程Ａ：反応容器としてジーンキューブ（Ｒ）専用イージー・ビーズを使用した。該容器を工程Ａから工程Ｅまで使用した。該容器にｐＨが約１１の水酸化カリウム約１０００μＬを分注した。該溶液に試料約４００μＬを懸濁した。
工程Ｂ：懸濁液について１３，０００ｇ、３分間の遠心分離を行い、上清の一部を廃棄して容器に約１５０μＬ残した。
工程Ｃ：容器内に残った沈渣及び上清にｐＨが約１２～１３の水酸化カリウム水溶液を約５０μＬ添加して混合した。
工程Ｄ：得られた混合液を８０℃、１０分間加熱後、ボルテックスミキサーによる撹拌を３分間行い、ビーズ破砕を行った。
工程Ｅ：得られた破砕液について１３，０００ｇ、３分間の遠心分離を行った。 (2-3) Preparation of sample liquid to be detected in the detection method of the present invention (sample pretreatment)
Steps A to E shown below were performed in the same reaction vessel.
Step A: Easy Beads exclusively for GeneCube (R) were used as the reaction vessel. The container was used from Step A to Step E. About 1000 μL of potassium hydroxide having a pH of about 11 was dispensed into the container. Approximately 400 μL of the sample was suspended in the solution.
Step B: The suspension was centrifuged at 13,000 g for 3 minutes and a portion of the supernatant was discarded leaving about 150 μL in the container.
Step C: About 50 μL of an aqueous potassium hydroxide solution having a pH of about 12 to 13 was added to the precipitate and supernatant remaining in the container and mixed.
Step D: After heating the obtained liquid mixture at 80° C. for 10 minutes, stirring was performed using a vortex mixer for 3 minutes to crush beads.
Step E: The obtained crushed liquid was centrifuged at 13,000 g for 3 minutes.

（２－４）従来技術の検出対象試料液の調製（核酸抽出法）
ジーンキューブ（Ｒ）専用前処理セットを用いて試料から核酸抽出を行った。各試薬の操作、取扱いは、それぞれの取扱説明書にしたがって行った。なお、構成試薬である洗浄液は、エタノール溶液（６０～１００％（ｖ／ｖ））であった。さらに、構成試薬である溶解吸着液はグアニジン塩を含んでいた。 (2-4) Preparation of sample liquid to be detected using conventional technology (nucleic acid extraction method)
Nucleic acid was extracted from the sample using a pretreatment set exclusively for GeneCube (R). Each reagent was operated and handled according to its instruction manual. Note that the cleaning solution as a constituent reagent was an ethanol solution (60 to 100% (v/v)). Furthermore, the dissolving and adsorbing solution, which is a constituent reagent, contained a guanidine salt.

（２－５）微生物の検出
工程Ｅで得られた上清を検出対象試料液とし、その一部を２０μＬずつ０．５ｍＬチューブに分注し、該チューブをＧＥＮＥＣＵＢＥ（Ｒ）にセットし、ジーンキューブ（Ｒ）ＭＴＢ（東洋紡社）あるいはジーンキューブ（Ｒ）ＭＡＩ（東洋紡社）を使用して、M. bovis又はM. intracellulareの検出を行った（工程Ｆ）。従来技術の方法でも同様にして、得られた核酸抽出液を検出対象試料液とし、ジーンキューブ（Ｒ）ＭＴＢ（東洋紡社）あるいはジーンキューブ（Ｒ）ＭＡＩ（東洋紡社）を使用して、M. bovis又はM. intracellulareの検出を行った。装置及び各試薬の操作、取扱いは、それぞれの添付文書にしたがって行った。 (2-5) Detection of microorganisms Use the supernatant obtained in step E as the sample solution to be detected, dispense a portion of 20 μL into 0.5 mL tubes, set the tubes in GENECUBE (R), and M. bovis or M. intracellulare was detected using Cube (R) MTB (Toyobo Co., Ltd.) or GeneCube (R) MAI (Toyobo Co., Ltd.) (Step F). In the same manner with the conventional method, the obtained nucleic acid extract was used as the sample solution to be detected, and GeneCube (R) MTB (Toyobo) or GeneCube (R) MAI (Toyobo) was used to detect M. bovis or M. intracellulare was detected. The device and each reagent were operated and handled in accordance with their respective package inserts.

（２－６）結果
表２がM. bovis菌体を含む試料を前処理（工程Ａ～Ｅ又は核酸抽出）して得られた検出対象試料液をジーンキューブ（Ｒ）ＭＴＢで検出した結果である。表３がM. intracellulare菌体を含む試料を前処理（工程Ａ～Ｅ又は核酸抽出）して得られた検出対象試料液をジーンキューブ（Ｒ）ＭＡＩで検出した結果である。本発明における前処理（工程Ａ～Ｅ）で調製された検出対象試料液と、ジーンキューブ（Ｒ）専用前処理セットによる前処理で調製された検出対象試料液（核酸抽出液）を測定した際の各試薬の検出結果（陽性率）は同等であることを確認した。なお、ジーンキューブ（Ｒ）専用前処理セットは、エタノールやグアニジン塩を含む一方で、本発明における前処理（工程Ａ～Ｅ）はそれらの有機溶媒や毒性が懸念される試薬は必要としない。したがって、本発明は、従来技術と同等の性能を得ながら、操作性の向上、安全性の向上が期待できることを確認した。 (2-6) Results Table 2 shows the results of detecting the detection target sample liquid obtained by pre-processing (steps A to E or nucleic acid extraction) a sample containing M. bovis cells using GeneCube (R) MTB. be. Table 3 shows the results of detecting a sample solution to be detected obtained by pre-processing (steps A to E or nucleic acid extraction) a sample containing M. intracellulare cells using GeneCube (R) MAI. When measuring the detection target sample liquid prepared in the pretreatment (steps A to E) of the present invention and the detection target sample liquid (nucleic acid extract) prepared in the pretreatment with GeneCube (R) dedicated pretreatment set. It was confirmed that the detection results (positive rate) of each reagent were equivalent. Note that while the pretreatment set exclusively for GeneCube (R) contains ethanol and guanidine salts, the pretreatment in the present invention (Steps A to E) does not require these organic solvents or reagents that are concerned about toxicity. Therefore, it has been confirmed that the present invention can be expected to improve operability and safety while achieving performance equivalent to that of the conventional technology.

Figure 0007395254000002
Figure 0007395254000002

Figure 0007395254000003
Figure 0007395254000003

〔試験例３：従来方法との比較２〕
（３－１）概要
本発明の微生物検出方法（工程Ａ～Ｆ）と従来技術における微生物検出方法を比較した。従来方法として、アンプリコア マイコバクテリウム 検体処理 試薬セットＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）及びコバス（Ｒ）ＴａｑＭａｎ（Ｒ）ＭＡＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いた。 [Test Example 3: Comparison with conventional method 2]
(3-1) Overview The microorganism detection method of the present invention (steps A to F) was compared with the microorganism detection method of the prior art. As a conventional method, Amplicor Mycobacterium Sample Processing Reagent Set II (Roche Diagnostics) and Cobas (R) TaqMan (R) MAI (Roche Diagnostics) were used.

（３－２）試料
結核菌群、M. avium、M. intracellulareがすべて陰性であるヒト由来喀痰をＮＡＬＣ－ＮａＯＨ処理し、該処理液にM. intracellulare菌体を１５０～３００００ＣＦＵ／ｍＬとなるように添加した液を試料とした。 (3-2) Sample Human sputum that is negative for Mycobacterium tuberculosis, M. avium, and M. intracellulare is treated with NALC-NaOH, and M. intracellulare cells are added to the treated solution at a concentration of 150 to 30,000 CFU/mL. The liquid added to the sample was used as a sample.

（３－３）本発明の方法
同一の反応容器で以下に示す工程Ａ～Ｆを行った。
工程Ａ：反応容器としてジーンキューブ（Ｒ）専用イージー・ビーズを使用した。該容器を工程Ａから工程Ｅまで使用した。該容器にｐＨが約１１の水酸化カリウム約１０００μＬを分注した。該溶液に試料約４００μＬを懸濁した。
工程Ｂ：懸濁液について１３，０００ｇ、３分間の遠心分離を行い、上清の一部を廃棄して容器に約１５０μＬ残した。
工程Ｃ：容器内に残った沈渣及び上清にｐＨが約１２～１３の水酸化カリウム水溶液を約５０μＬ添加して混合した。
工程Ｄ：得られた混合液を８０℃、１０分間加熱後、ボルテックスミキサーによる撹拌を３分間行い、ビーズ破砕を行った。
工程Ｅ：得られた破砕液について１３，０００ｇ、３分間の遠心分離を行った。
工程Ｆ：工程Ｅで得られた上清を検出対象試料液とし、その一部を２０μＬずつ０．５ｍＬチューブに分注した。該チューブをＧＥＮＥＣＵＢＥ（Ｒ）にセットし、ジーンキューブ（Ｒ）ＭＡＩ（東洋紡社）を使用してM. intracellulareの検出を行った。装置及び試薬の操作、取扱いは、それぞれの添付文書にしたがって行った。 (3-3) Method of the present invention Steps A to F shown below were performed in the same reaction vessel.
Step A: Easy Beads exclusively for GeneCube (R) were used as the reaction vessel. The container was used from Step A to Step E. About 1000 μL of potassium hydroxide having a pH of about 11 was dispensed into the container. Approximately 400 μL of the sample was suspended in the solution.
Step B: The suspension was centrifuged at 13,000 g for 3 minutes and a portion of the supernatant was discarded leaving about 150 μL in the container.
Step C: About 50 μL of an aqueous potassium hydroxide solution having a pH of about 12 to 13 was added to the precipitate and supernatant remaining in the container and mixed.
Step D: After heating the obtained liquid mixture at 80° C. for 10 minutes, stirring was performed using a vortex mixer for 3 minutes to crush beads.
Step E: The obtained crushed liquid was centrifuged at 13,000 g for 3 minutes.
Step F: The supernatant obtained in Step E was used as the sample solution to be detected, and a portion of it was dispensed in 20 μL portions into 0.5 mL tubes. The tube was set in GENECUBE (R), and M. intracellulare was detected using GeneCUBE (R) MAI (Toyobo). The equipment and reagents were operated and handled according to their respective package inserts.

（３－４）従来技術の方法
アンプリコア マイコバクテリウム 検体処理 試薬セットＩＩを用いて試料を処理し、得られた検出対象試料液をコバス（Ｒ）ＴａｑＭａｎ（Ｒ）４８及びコバス（Ｒ）ＴａｑＭａｎ（Ｒ）ＭＡＩを使用してM. intracellulareの検出を行った。装置及び各試薬の操作、取扱いは、それぞれの添付文書にしたがって行った。なお、アンプリコア マイコバクテリウム 検体処理 試薬セットＩＩは毒性の高い試薬を含むことをＳＤＳで確認した。また、アンプリコア マイコバクテリウム 検体処理 試薬セットＩＩによる検体処理は、１時間以上を要した。 (3-4) Method of Prior Art Amplicor Mycobacterium Sample Processing A sample was processed using Reagent Set II, and the obtained detection target sample liquid was subjected to cobas (R) TaqMan (R) 48 and cobas (R) TaqMan ( R) Detection of M. intracellulare was performed using MAI. The device and each reagent were operated and handled in accordance with their respective package inserts. In addition, it was confirmed by SDS that Amplicor Mycobacterium Specimen Processing Reagent Set II contains highly toxic reagents. Further, sample processing using Amplicor Mycobacterium Sample Processing Reagent Set II required more than 1 hour.

（３－５）結果
M. intracellulare菌体濃度が異なる試料を前処理して得られた各検出対象試料液について、本発明の方法及び従来技術の方法における結果（陽性率）を比較した。
表４が本発明あるいは従来技術での各菌体濃度の試料を前処理して得られた検出対象試料液における結果（陽性率）である。本発明の方法では、菌体濃度７５０ＣＦＵ／ｍＬ以上で陽性率１００％であった。一方で、従来技術の方法では３０００ＣＦＵ／ｍＬ以上で陽性率１００％であった。したがって、本発明は、従来技術よりも感度よく微生物の検出が可能であることを確認できた。また、検出対象試料液調製（前処理）の時間について、本発明の検出方法における調製法（工程Ａ～Ｅ）が約３０分であるのに対して従来技術の方法が１時間以上であった。したがって、操作時間の観点からも本発明のほうが有意であることを確認した。 (3-5) Results
The results (positive rate) of the method of the present invention and the method of the prior art were compared for each sample solution to be detected obtained by pretreating samples with different M. intracellulare cell concentrations.
Table 4 shows the results (positive rate) of sample liquids to be detected obtained by pre-treating samples with various bacterial cell concentrations according to the present invention or the prior art. In the method of the present invention, the positive rate was 100% when the bacterial cell concentration was 750 CFU/mL or higher. On the other hand, the conventional method had a positive rate of 100% at 3000 CFU/mL or more. Therefore, it was confirmed that the present invention can detect microorganisms with higher sensitivity than the conventional technology. In addition, regarding the time for preparing the sample liquid to be detected (pretreatment), the preparation method (steps A to E) in the detection method of the present invention takes about 30 minutes, whereas the method of the prior art took more than 1 hour. . Therefore, it was confirmed that the present invention is more significant also from the viewpoint of operation time.

Figure 0007395254000004
Figure 0007395254000004

本発明の検出方法における工程Ａ～Ｅで調製した液（検出対象試料液）を核酸増幅反応に直接供したところ（工程Ｆ）、驚くべきことに、優れた結果が得られた（試験例１～３）。この結果は、本発明の検出方法における検体の前処理方法（工程Ａ～Ｅ）で後の検出反応に悪影響を及ぼす夾雑物等を高度に除去でき、その結果、核酸増幅及び検出反応において夾雑物による反応阻害が抑制されたことを示唆する。 Surprisingly, excellent results were obtained when the solutions prepared in steps A to E in the detection method of the present invention (detection target sample solutions) were directly subjected to a nucleic acid amplification reaction (step F) (Test Example 1 ~3). This result shows that the sample pretreatment method (steps A to E) in the detection method of the present invention can highly remove contaminants that have an adverse effect on the subsequent detection reaction, and as a result, contaminants can be removed during the nucleic acid amplification and detection reaction. This suggests that the reaction inhibition caused by

また、試験例１～３では、ミコール酸を細胞壁に多く含み、外的因子に対して高い抵抗性を示すMycobacterium属に分類される微生物の検出を行った。該微生物は、上記の特徴的な細胞壁を有するため、他の微生物と比較して核酸抽出等が煩雑とされているが、本発明によれば、簡便な方法で該微生物を核酸抽出法と同程度に検出できた。したがって、本発明は他の様々な種類の微生物でも検出を行うことが可能であり、臨床診断等の場面で非常に有益である。 Furthermore, in Test Examples 1 to 3, microorganisms classified as Mycobacterium, which contain a large amount of mycolic acid in their cell walls and exhibit high resistance to external factors, were detected. Because this microorganism has the above-mentioned characteristic cell wall, nucleic acid extraction is said to be more complicated than other microorganisms. However, according to the present invention, the microorganism can be extracted using a simple method similar to the nucleic acid extraction method. It was detected to a certain degree. Therefore, the present invention can detect various other types of microorganisms, and is very useful in clinical diagnosis and the like.

本発明の方法を用いることで、核酸精製することなく、試料中に含まれる微生物由来の核酸を検出することができるため、臨床診断の分野に大きく貢献できる。 By using the method of the present invention, it is possible to detect microbial-derived nucleic acids contained in a sample without purifying the nucleic acid, and therefore it can greatly contribute to the field of clinical diagnosis.

Claims (19)

試料に含まれ得る微生物の検出方法であって、以下の工程Ａ～Ｆ：
（Ａ）試料を水又はアルカリ性溶液に懸濁する工程、
（Ｂ）前記工程Ａで得られた懸濁液に含まれる微生物を濃縮する工程、
（Ｃ）前記工程Ｂで得られた濃縮物に、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、及び炭酸カルシウム水溶液からなる群より選択される少なくとも一つであるｐＨ１２～１３のアルカリ性溶液を添加する工程、
（Ｄ）前記工程Ｃで得られたアルカリ性の懸濁液に含まれる微生物を溶菌又は破砕する工程、
（Ｅ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液を必要に応じて精製する工程、
（Ｆ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液、或いは前記工程Ｅで得られた精製液の一部又は全部を微生物の検出に供する工程、
を包含し、少なくとも前記工程Ａ～Ｅが同一の反応容器内で行われ、
前記工程Ｄにおいて溶菌又は破砕する工程が、ビーズ破砕処理を含む、方法。 A method for detecting microorganisms that may be contained in a sample, comprising the following steps A to F:
(A) suspending the sample in water or an alkaline solution;
(B) a step of concentrating the microorganisms contained in the suspension obtained in step A;
(C) At least one selected from the group consisting of potassium hydroxide aqueous solution, sodium hydroxide aqueous solution, calcium hydroxide aqueous solution, potassium carbonate aqueous solution, sodium carbonate aqueous solution, and calcium carbonate aqueous solution is added to the concentrate obtained in step B. adding an alkaline solution with a pH of 12 to 13 ;
(D) a step of lysing or crushing the microorganisms contained in the alkaline suspension obtained in step C;
(E) a step of purifying the lysate or disrupted solution obtained in step D as necessary;
(F) a step of subjecting part or all of the lysis solution or disruption solution obtained in step D, or the purified solution obtained in step E, to the detection of microorganisms;
and at least the steps A to E are performed in the same reaction vessel ,
A method , wherein the step of lysing or crushing in step D includes bead crushing treatment . 前記反応容器の容量が、５０ｍＬ以下である、請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the reaction vessel has a capacity of 50 mL or less. 前記反応容器中にビーズが含まれている、請求項１又は２に記載の方法。 3. The method according to claim 1 or 2, wherein beads are included in the reaction vessel. 前記ビーズがジルコニアビーズである請求項１～３のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the beads are zirconia beads. 前記工程Ａにおいて、アルカリ性溶液が、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、及び炭酸カルシウム水溶液からなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１～４のいずれかに記載の方法。 In the step A, the alkaline solution is at least one selected from the group consisting of a potassium hydroxide aqueous solution, a sodium hydroxide aqueous solution, a calcium hydroxide aqueous solution, a potassium carbonate aqueous solution, a sodium carbonate aqueous solution, and a calcium carbonate aqueous solution. The method according to any one of Items 1 to 4. 前記工程Ａにおいて、アルカリ性溶液のｐＨが８．０以上である、請求項１～５のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 5, wherein in the step A, the alkaline solution has a pH of 8.0 or more. 前記工程Ｂにおいて微生物を濃縮する工程が、遠心分離処理を含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 5 , wherein the step of concentrating microorganisms in step B includes centrifugation treatment. 前記工程Ｄにおいて溶菌又は破砕する工程が、撹拌処理、超音波処理、加熱処理、及びアルカリ処理からなる群より選択される少なくとも一つの処理をさらに含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。 According to any one of claims 1 to 7, the step of lysing or crushing the bacteria in step D further includes at least one treatment selected from the group consisting of stirring treatment, ultrasonic treatment, heat treatment, and alkali treatment. Method. 前記工程Ｄにおいて溶菌又は破砕する工程が、加熱処理をさらに含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 7 , wherein the step of lysing or crushing the bacteria in step D further includes heat treatment . 前記工程Ｅを含み、前記工程Ｅにおいて溶菌液又は破砕液を精製する工程が、遠心分離処理を含む、請求項１～９のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 9 , which includes the step E, and wherein the step of purifying the lysis solution or the disrupted solution in the step E includes centrifugation treatment. 微生物の検出が、微生物由来の核酸の検出である、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 10 , wherein the detection of microorganisms is the detection of nucleic acids derived from microorganisms. 微生物由来の核酸の検出が、微生物由来の核酸の増幅をさらに含む請求項１１に記載の方法。 12. The method according to claim 11 , wherein detecting the microorganism-derived nucleic acid further comprises amplifying the microorganism-derived nucleic acid. 前記核酸の増幅が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＳＤＡ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、ＲＴ－ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、及びＴＲＣ法からなる群より選択される少なくとも一つを含む、請求項１２に記載の方法。 The amplification of the nucleic acid includes at least one selected from the group consisting of PCR method, LAMP method, LCR method, TMA method, SDA method, RT-PCR method, RT-LAMP method, NASBA method, and TRC method. 13. The method according to claim 12 . 検出対象微生物が、Mycobacterium属に分類される微生物の少なくとも一つである、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。 14. The method according to claim 1, wherein the microorganism to be detected is at least one microorganism classified into the genus Mycobacterium. 検出対象微生物が、M. abscessus、M. africanum、M. agri、M. aichiense、M. algericum、M. alvei、M. arabiense、M. aromaticivorans、M. arosiense、M. arupense、M. asiaticum、M. aubagnense、M. aurum、M. austroafricanum、M. avium、M. bacteremicum、M. boenickei、M. bohemicum、M. bolletii、M. botniense、M. bouchedurhonense、M. bourgelatii、M. bovis、M. branderi、M. brisbanense、M. brumae、M. canariasense、M. caprae、M. celatum、M. chelonae、M. chimaera、M. chitae、M. chlorophenolicum、M. chubuense、M. colombiense、M. conceptionense、M. confluentis、M. conspicuum、M. cookii、M. cosmeticum、M. crocinum、M. diernhoferi、M. doricum、M. duvalii、M. elephantis、M. europaeum、M. fallax、M. farcinogenes、M. flavescens、M. florentinum、M. fluoranthenivorans、M. fortuitum、M. frederiksbergense、M. gadium、M.
gastri、M. genavense、M. gilvum、M. goodii、M. gordonae、M. haemophilum、M. hassiacum、M. heckeshornense、M. heidelbergense、M. hiberniae、M. hippocampi、M. hodleri、M. holsaticum、M. houstonense、M. immunogenum、M. insubricum、M. interjectum、M. intermedium、M. intracellulare、M. iranicum、M. kansasii、M. komossense、M. koreense、M. kubicae、M. kumamotonense、M. kyorinense、M. lacus、M. lentiflavum、M. leprae、M. lepraemurium、M. litorale、M. llatzerense、M. madagascariense、M. mageritense、M. malmoense、M. mantenii、M. marinum、M. marseillense、M. massiliense、M. microti、M. minnesotense、M. monacense、M. montefiorense、M. moriokaense、M. mucogenicum、M. murale、M. neoaurum、M. nebraskense、M. neworleansense、M. nonchromogenicum、M. noviomagense、M. novocastrense、M. obuense、M. pallens、M. palustre、M. paraffinicum、M. parafortuitum、M. paragordonae、M. parakoreense、M. parascrofulaceum、M. paraseoulense、M. paratuberculosis、M. parmense、M. peregrinum、M. phlei、M. phocaicum、M. pinnipedii、M. porcinum、M. poriferae、M. pseudoshottsii、M. psychrotolerans、M. pulveris、M. pyrenivorans、M. rhodesiae、M. riyadhense、M. rufum、M. rutilum、M. salmoniphilum、M. saskatchewanense、M. scrofulaceum、M. sediminis、M. senegalense、M. senuense、M. seoulense、M. septicum、M. setense、M. sherrisii、M. shimoidei、M. shinjukuense、M. shottsii、M. simiae、M. smegmatis、M. sphagni、M. stomatepiae、M. szulgai、M. terrae、M. thermoresistibile、M. timonense、M. tokaiense、M. triplex、M. triviale、M. tuberculosis、M. tusciae、M. ulcerans、M. vaccae、M. vanbaalenii、M. vulneris、M. wolinskyi、M. xenopi、及びM. yongonenseからなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１４に記載の方法。 The microorganisms to be detected are M. abscessus, M. africanum, M. agri, M. aichiense, M. algericum, M. alvei, M. arabiense, M. aromaticivorans, M. arosiense, M. arupense, M. asiaticum, M. aubagnense, M. aurum, M. austroafricanum, M. avium, M. bacteremicum, M. boenickei, M. bohemicum, M. bolletii, M. botniense, M. bouchedurhonense, M. bourgelatii, M. bovis, M. branderi , M. brisbanense, M. brumae, M. canariasense, M. caprae, M. celatum, M. chelonae, M. chimaera, M. chitae, M. chlorophenolicum, M. chubuense, M. colombiense, M. conceptionense, M. confluentis, M. conspicuum, M. cookii, M. cosmeticum, M. crocinum, M. diernhoferi, M. doricum, M. duvalii, M. elephantis, M. europaeum, M. fallax, M. farcinogenes, M. flavescens , M. florentinum, M. fluoranthenivorans, M. fortuitum, M. frederiksbergense, M. gadium, M.
gastri, M. genavense, M. gilvum, M. goodii, M. gordonae, M. haemophilum, M. hassiacum, M. heckeshornense, M. heidelbergense, M. hiberniae, M. hippocampi, M. hodleri, M. holsaticum, M. houstonense, M. immunogenum, M. insubricum, M. interjectum, M. intermedium, M. intracellulare, M. iranicum, M. kansasii, M. komossense, M. koreense, M. kubicae, M. kumamotonense, M. kyorinense, M. lacus, M. lentiflavum, M. leprae, M. lepraemurium, M. litorale, M. llatzerense, M. madagascariense, M. mageritense, M. malmoense, M. mantenii, M. marinum, M. marseillense, M. massiliense, M. microti, M. minnesotense, M. monacense, M. montefiorense, M. moriokaense, M. mucogenicum, M. murale, M. neoaurum, M. nebraskense, M. neworleansense, M. nonchromogenicum, M. noviomagense, M. novocastrense, M. obuense, M. pallens, M. palustre, M. paraffinicum, M. parafortuitum, M. paragordonae, M. parakoreense, M. parascrofulaceum, M. paraseoulense, M. paratuberculosis, M. parmense, M. peregrinum, M. phlei, M. phocaicum, M. pinnipedii, M. porcinum, M. poriferae, M. pseudoshottsii, M. psychrotolerans, M. pulveris, M. pyrenivorans, M. rhodesiae, M. riyadhense, M. rufum, M. rutilum, M. salmoniphilum, M. saskatchewanense, M. scrofulaceum, M. sediminis, M. senegalense, M. senuense, M. seoulense, M. septicum, M. setense, M. sherrisii, M. shimoidei, M. shinjukuense, M. shottsii, M. simiae, M. smegmatis, M. sphagni, M. stomatepiae, M. szulgai, M. terrae, M. thermoresistibile, M. timonense, M. tokaiense, M. triplex, M. triviale, M. tuberculosis, M. tusciae, M. ulcerans, M. vaccae, M. vanbaalenii, M. vulneris, M. wolinskyi, M. xenopi, and M. yongonense. 15. The method of claim 14 . 試料の前処理方法、又は、微生物の検出方法に供される検出対象試料液の調製方法であって、以下の工程Ａ～Ｅ：
（Ａ）試料を水又はアルカリ性溶液に懸濁する工程、
（Ｂ）前記工程Ａで得られた懸濁液に含まれる微生物を濃縮する工程、
（Ｃ）前記工程Ｂで得られた濃縮物に、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、及び炭酸カルシウム水溶液からなる群より選択される少なくとも一つであるｐＨ１２～１３のアルカリ性溶液を添加する工程、
（Ｄ）前記工程Ｃで得られたアルカリ性の懸濁液に含まれる微生物を溶菌又は破砕する工程、
（Ｅ）前記工程Ｄで得られた溶菌液又は破砕液を必要に応じて精製する工程、
を包含し、
前記工程Ａ～Ｅが同一の反応容器内で行われ、
前記工程Ｄにおいて溶菌又は破砕する工程が、ビーズ破砕処理を含む、方法。 A method for preparing a sample liquid to be detected to be subjected to a sample pretreatment method or a microorganism detection method, comprising the following steps A to E:
(A) suspending the sample in water or an alkaline solution;
(B) a step of concentrating the microorganisms contained in the suspension obtained in step A;
(C) At least one selected from the group consisting of potassium hydroxide aqueous solution, sodium hydroxide aqueous solution, calcium hydroxide aqueous solution, potassium carbonate aqueous solution, sodium carbonate aqueous solution, and calcium carbonate aqueous solution is added to the concentrate obtained in step B. adding an alkaline solution with a pH of 12 to 13 ;
(D) a step of lysing or crushing the microorganisms contained in the alkaline suspension obtained in step C;
(E) a step of purifying the lysate or disrupted solution obtained in step D as necessary;
encompasses,
The steps A to E are performed in the same reaction vessel ,
A method , wherein the step of lysing or crushing in step D includes bead crushing treatment . 請求項１６に記載の試料の前処理方法又は検出対象試料液の調製方法、或いは請求項１～１５のいずれかに記載の微生物の検出方法のための試薬であって、
前記工程Ａ及び／又は工程Ｃに使用するためのアルカリ性溶液、
前記工程Ｄに使用するためのビーズ、或いは
前記工程Ｆに使用するためのプライマーミックス及び／又はＤＮＡポリメラーゼ、
を含む、試薬。 A reagent for the sample pretreatment method or the detection target sample liquid preparation method according to claim 16 , or the microorganism detection method according to any one of claims 1 to 15 ,
an alkaline solution for use in step A and/or step C;
Beads for use in the step D, or primer mix and/or DNA polymerase for use in the step F,
Reagents, including. 請求項１７に記載の試薬の少なくとも一つを含む、請求項１６に記載の試料の前処理方法又は検出対象試料液の調製方法、或いは請求項１～１５のいずれかに記載の微生物の検出方法のためのキット。 The method for pretreatment of a sample or the method for preparing a sample liquid to be detected according to claim 16 , or the method for detecting microorganisms according to any one of claims 1 to 15 , which comprises at least one of the reagents according to claim 17. kit for. 前記工程Ａ～Ｄ、工程Ａ～Ｅ、又は工程Ａ～Ｆで使用するための反応容器をさらに含む、請求項１８に記載のキット。 19. The kit of claim 18 , further comprising a reaction vessel for use in steps AD, steps AE, or steps AF.
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KULSKI,J.K. et al.，Preparation of Mycobacterial DNA from Blood Culture Fluids by Simple Alkali Wash and Heat Lysis Method for PCR Detection，Journal of Clinical Microbiology，1996年，Vol.34, No.8，pp.1985-1991

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