JP7396269B2

JP7396269B2 - 神経再生誘導チューブ

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Publication number: JP7396269B2
Application number: JP2020511407A
Authority: JP
Inventors: 乾一張本; 博一坂口; 論山田
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2019-02-22
Filing date: 2020-02-14
Publication date: 2023-12-12
Anticipated expiration: 2040-02-14
Also published as: WO2020170961A1; JPWO2020170961A1; US20220125569A1; US12115058B2

Description

本発明は、神経再生誘導チューブに関する。

従来、神経組織の中枢側と末梢側との間に欠損部位が生じた場合において神経再生を誘導して治療する医療機器として、神経再生誘導チューブが知られている。神経再生誘導チューブを用いることによって、神経再生の障害となる結合組織が損傷部位に侵入することが抑制される。

図１５は、従来の神経再生誘導チューブの使用例を説明する図である。図１５に示す神経再生誘導チューブ３００には、一端側に神経細胞２００およびシュワン細胞２１０が配置される。神経再生誘導チューブ３００では、内部においてシュワン細胞２１１が増殖する。この増殖したシュワン細胞２１１の内部を、軸索２０１が延びていく。この間、神経再生誘導チューブ３００により結合組織の進入が抑制されることにより、軸索２０１が伸長しようとする経路が阻害されることが抑制される。このようにして、神経再生誘導チューブ３００を用いた神経再生が進んでいく。

ところで、神経再生では、軸索２０１とシュワン細胞２１１が神経再生誘導チューブ３００内に効率的に進入することが、神経再生を促進するのに重要である。特に、神経再生誘導チューブ３００の長さが長いほど、チューブ内にシュワン細胞２１１が接着しやすく、軸索２０１がチューブ内をまっすぐ早く延びることが重要となる。神経再生を促進させる技術として、神経再生誘導チューブの長手方向に沿って延びる繊維の束を、神経再生誘導チューブ内に配置したものが知られている（例えば、特許文献１を参照）。特許文献１では、繊維の束が、シュワン細胞が接着するための足場となり、またチューブ内における軸索の伸長をガイドしている。

特開２００５－２３７４７６号公報

神経再生のさらなる効率化のため、軸索の伸長速度をさらに向上させる技術が求められている。

本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、軸索の伸長速度を向上することができる神経再生誘導チューブを提供することを目的とする。

上記課題を解決するため、本発明にかかる神経再生誘導チューブは、管状をなす本体部と、前記本体部に収容され、該本体部の長手方向に延びる複数の繊維と、を備え、前記複数の繊維の少なくとも一部の繊維は、当該繊維の長手方向に延びる軸部と、当該繊維の長手方向に連続し、前記軸部から突出する凸条部であって、前記軸部からの高さが０．５μｍ以上である、少なくとも三本の凸条部と、を有する異形断面繊維であることを特徴とする。

また、本発明にかかる神経再生誘導チューブは、上記の発明において、前記異形断面繊維の断面において、当該断面に内接する円の直径に対する、当該断面に外接する円の直径の比である異型度が１．５～１２．０であることを特徴とする。

また、本発明にかかる神経再生誘導チューブは、上記の発明において、前記凸条部の高さが１．０μｍ以上であることを特徴とする。

また、本発明にかかる神経再生誘導チューブは、上記の発明において、前記異形断面繊維は、１０本以下の前記凸条部を有することを特徴とする。

また、本発明にかかる神経再生誘導チューブは、上記の発明において、前記異形断面繊維は、前記凸条部を３本有するＹ断面繊維、または前記凸条部を４本有するＸ断面繊維である、ことを特徴とする。

また、本発明にかかる神経再生誘導チューブは、上記の発明において、前記複数の繊維は、互いに異なる断面形状をなす繊維を含むことを特徴とする。

また、本発明にかかる神経再生誘導チューブは、上記の発明において、前記本体部および前記複数の繊維の少なくとも一方が生体吸収性高分子からなることを特徴とする。

本発明の神経再生誘導チューブによれば、シュワン細胞の遊走性および軸索伸長速度を向上させ、軸索伸長方向を直進させることによって効率的な神経再生を実現することができるという効果を奏する。

図１は、本発明の一実施の形態にかかる神経再生誘導チューブを模式的に示す斜視図である。図２は、本発明の一実施の形態にかかる神経再生誘導チューブに収容される異形断面繊維の一例を示す斜視図である。図３は、図２に示す異形断面繊維の断面を示す図である。図４は、本発明の一実施の形態にかかる神経再生誘導チューブに収容される異形断面繊維の他の例を示す斜視図である。図５は、図４に示す異形断面繊維の断面を示す図である。図６は、本発明の一実施の形態にかかる神経再生誘導チューブの使用例を説明する図である。図７は、実験例で採用した織組織の組織図を示す図である。図８は、実験例１の異形断面繊維の断面を示す図である。図９は、実験例２の異形断面繊維の断面を示す図である。図１０は、比較実験例２の異形断面繊維の断面を示す図である。図１１は、細胞接着評価の結果を示す図である。図１２は、神経突起成長評価の結果を示す図である。図１３は、軸索成長速度評価の結果（神経突起成長速度）を示す図である。図１４は、軸索成長直進性評価の結果（アスペクト比）を示す図である。図１５は、従来の神経再生誘導チューブの使用例を説明する図である。

以下、本発明を実施するための形態を図面とともに詳細に説明する。なお、以下の実施の形態により本発明が限定されるものではないが、当業者には容易に理解されるように、本実施の形態の記載中の定義や、好ましい態様、バリエーションについての記載は、同時に上位概念としての本発明の神経再生チューブの説明と解釈し得るものである。また、以下の説明において参照する各図は、本発明の内容を理解でき得る程度に形状、大きさ、および位置関係を概略的に示してあるに過ぎない。すなわち、本発明は各図で例示された形状、大きさ、および位置関係のみに限定されるものではない。さらに、図面の記載において、同一の部分には同一の符号を付している。

（実施の形態）
本発明の実施の形態にかかる神経再生誘導チューブについて、図１～図３を参照して説明する。図１は、本発明の一実施の形態にかかる神経再生誘導チューブを模式的に示す斜視図である。図１に示す神経再生誘導チューブ１は、筒状をなす本体部１０と、本体部１０の内部に設けられ、本体部１０の中心軸方向に延びる異形断面繊維１１（又は１１Ａ）とを有する。

本体部１０は、生体吸収性材料を用いて形成される。本体部１０は、例えば、外周の直径が０．５ｍｍ以上４．０ｍｍ以下の円筒をなす。本体部１０の肉厚は、使用態様によって適宜調整可能である。生体吸収性材料とは酸、アルカリ、または酵素によって分解される生分解性材料であり、体内においてその分解物が代謝や排出などによって消失する材料である。生体吸収性高分子とは、生体吸収性材料のうち、生物由来もしくは人工的に合成された高分子体である。例えば、コラーゲンやゼラチンなどのタンパク質またはそれらの誘導体、キトサンなどの多糖類またはそれらの誘導体、乳酸、グリコール酸、カプロラクトンから選ばれる１種類以上のモノマーの共重合体、またはラクチド重合体などの脂肪族ポリエステルが挙げられる。また、本体部は体液が浸潤し内外で物質交換ができるよう多孔質である事が好ましい。

異形断面繊維１１（又は１１Ａ）は、本体部１０の長手方向に沿って延びる繊維状をなす。異形断面繊維１１の断面であって、長手方向と直交する平面を切断面とする断面は、円や楕円とは異なる異形をなす。異形断面繊維１１（又は１１Ａ）は、生体吸収性材料を用いて形成される。

図２は、本発明の一実施の形態にかかる神経再生誘導チューブに収容される異形断面繊維の一例を示す斜視図である。図３は、図２に示す異形断面繊維の断面を示す図である。図２に示す異形断面繊維１１は、円柱状の軸部１１０と、軸部から突出する三本の凸条部１１１とを有する。三本の凸条部１１１は、軸部１１０に対して互いに異なる方向に突出している。異形断面繊維１１は、長手方向と直交する平面を切断面とする断面が、略Ｙ字状をなすＹ断面繊維である。ここでいうＹ字状とは、隣り合う凸条部１１１同士のなす角度が、互いに同じである、１２０°（および２４０°、３６０°）の回転対称性を有する形状であってもよいし、角度が互いに同じではない、３６０°以外の回転対称性を有しない形状であってもよい。
凸条部を有することで繊維の表面積が増加し、また凸条部同士が障害となり繊維間に空間が形成され、シュワン細胞や軸索が繊維上に接着できる領域を増加させることができる。繊維を束ねて充填する際に繊維同士が接着して細胞や軸索の接着領域が減少することを抑制するためには、凸条部が三本以上あることが好ましく、凸条部が異なる２種類以上の繊維を混合することがより好ましく、その際は円形繊維と凸条部を有する繊維と混合することがさらに好ましい。

各凸条部１１１は、軸部１１０に対する高さが、０．５μｍ以上、好ましくは１．０μｍ以上である。ここで、凸条部１１１の高さとは、繊維断面に内接する内接円の接線に対して直交する方向の、該接線から、繊維断面の外縁までの距離のうちの最大の距離（例えば図３の高さｈ₁）である。本実施の形態では、繊維の断面において、軸部１１０の外形が、繊維断面の内接円に相当する。

また、異形断面繊維１１において、長手方向と直交する平面を切断面とする断面に外接する円Ｓ₁の直径ｄ₁と、断面に内接する円Ｓ₂の直径ｄ₂の比（ｄ₁／ｄ₂）として求められる異型度が１．５以上１２．０以下である。異型度は、繊維断面を電子顕微鏡で撮像した画像からランダムに抽出した２０本の繊維の直径ｄ１と直径ｄ２とを計測し、その平均値から算出することができる。

図４は、本発明の一実施の形態にかかる神経再生誘導チューブに収容される異形断面繊維の他の例を示す斜視図である。図５は、図４に示す異形断面繊維の断面を示す図である。図４に示す異形断面繊維１１Ａは、円柱状の軸部１２０と、軸部から突出する四本の凸条部１２１とを有する。四本の凸条部１２１は、軸部１２０に対して互いに異なる方向に突出している。異形断面繊維１１Ａは、断面が、略Ｘ字状をなすＸ断面繊維である。ここでいうＸ字状とは、隣り合う凸条部１２１同士のなす角度が、互いに同じである、９０°（および１８０°、２７０°、３６０°）の回転対称性を有する形状であってもよいし、角度が互いに同じではない、３６０°以外の回転対称性を有しない形状であってもよい。

各凸条部１２１は、軸部１２０に対する高さが、０．５μｍ以上、好ましくは１．０μｍ以上である。ここで、凸条部１２１の高さとは、断面に内接する内接円の接線に対して直交する方向の、該接線から、繊維断面の外縁までの距離のうちの最大の距離（例えば図５の高さｈ₂）である。本実施の形態では、繊維の断面において、軸部１２０の外形が、繊維断面の内接円に相当する。

また、異形断面繊維１１Ａにおいて、長手方向と直交する平面を切断面とする断面に外接する円Ｓ₃の直径ｄ₃と、断面に内接する円Ｓ₄の直径ｄ₄の比（ｄ₃／ｄ₄）として求められる異型度が１．５以上１２．０以下である。
異形度が大きいほど繊維表面積が大きく、繊維を束ねた際に形成される空間も大きくなり、シュワン細胞や軸索がチューブ内部に侵入しやすくなることから、異形度は１．５以上が好ましく、異形度が大きすぎると凸条部が折れたりすることで潰れ安くなるため１２．０以下が好ましい。

このほか、断面において１０本以下の凸条部を有する異形断面繊維を配設することができる。
本体部１０には、異形断面繊維１１、１１Ａ、または１０本以下の凸条部を有する異形断面繊維が、単独、もしくは断面の形状が異なる二種以上の繊維の組み合わせで５本以上５０００００本以下の範囲で設けられる。
また、異形断面繊維と、従来の円形又は楕円形の繊維とを組み合わせて、本体部１０に収容した構成としてもよい。すなわち、本実施の形態にかかる神経再生誘導チューブ１には、少なくとも一部の繊維において、上述した異形断面繊維が採用される。

図６は、本発明の一実施の形態にかかる神経再生誘導チューブの使用例を説明する図である。神経再生誘導チューブ１の一端側に神経細胞２００およびシュワン細胞２１０を配置すると、内部においてシュワン細胞２１１が深部に向かって移動しつつ増殖する。その後、チューブ内に配置されたシュワン細胞２１１の内部を、軸索２０１が延びていく。この際、異形断面繊維とすることによって、軸索２０１の伸張性が向上される。このようにして、神経再生誘導チューブ１を用いた神経再生が進んでいく。

上述した実施の形態では、神経再生誘導チューブ１が、筒状の本体部１０と、本体部１０の内部に設けられ、軸部１１０（又は１２０）に対する高さが、０．５μｍ以上の凸条部１１１（又は１２１）とを有する構成とした。本実施の形態によれば、異形断面繊維を採用することによって、シュワン細胞が遊走するための表面積を大きくすることができる。本実施の形態にかかる神経再生誘導チューブ１を用いて神経再生を行うことによって、軸索の伸張性を向上し、効率的な神経再生を実現することができる。

（実験例）
以下、シュワン細胞の接着性、軸索の伸張性を評価するための実験例について説明する。なお、本実験例により本発明が限定して解釈されるわけではない。

［サンプル準備］
経糸として単糸径１４．７μｍの丸断面繊維を用い、全ての実験例、比較実験例で同じ経糸密度になるように準備した。緯糸として表１に記載の糸を用い、織条件は、共通の織組織として８枚朱子組織、緯糸密度として、表１の各緯糸の緯糸カバーファクター（以下緯糸ＣＦと記載）が１３００になるように緯糸密度を調整して織物サンプルを作製した。図７は、実験例で採用した織組織の組織図を示す図である。本実験例では、図７の組織図に示す８枚朱子組織を採用した。
ここで、緯糸ＣＦは以下の式により算出する。
緯糸ＣＦ＝√Ａ×Ｎ
Ａ：緯糸の繊度（デシテックス）、
Ｎ：緯糸の本数（本／２．５４ｃｍ）
作製した織物サンプルをφ１５ｍｍのポンチで打ち抜き円形の織片を作成した。９９．５％エタノール（富士フィルム和光純薬株式会社製）に作成した織片を１０分ほど浸して滅菌し、その後、安全キャビネット内で風乾させた。織片はさらに１００μｇ／ｍｌに調製したアテロコラーゲン溶液（ＫＯＫＥＮ社製）に３０分浸し、その後、安全キャビネット内で風乾させた。軸索成長速度および直進性評価の場合にはさらに、５０μｇ／ｍｌに調製したラット由来のラミニン（シグマ社製）水溶液に２時間浸漬し、その後、安全キャビネット内で風乾させた。その後、２４穴ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）の１ウェル内に織片をセットし、さらにオートクレーブで滅菌した外径φ１４ｍｍ、内径φ１２ｍｍ、高さ１０ｍｍの筒型金属器具を重しとしてのせた。各サンプルにつき３つウェルを準備し、ｎ＝３で下記の項目について評価した。

＜実験例１＞
図８は、実験例１の異形断面繊維の断面を示す図である。実験例１では、図８に示すような、凸条部が３本ある略Ｙ字形の断面を有する異形断面繊維を緯糸として用いて各評価を行った。

＜実験例２＞
図９は、実験例２の異形断面繊維の断面を示す図である。実験例２では、図９に示すような、凸条部が４本ある略Ｘ字形の断面を有する異形断面繊維を緯糸として用いて各評価を行った。

＜比較実験例１＞
比較実験例１では、断面が真円形の繊維を緯糸として用いて各評価を行った。

＜比較実験例２＞
図１０は、比較実験例２の異形断面繊維の断面を示す図である。比較実験例２では、図１０に示すような、０．５μｍ以上の凸条部が２本と０．５μｍ未満の凸状部が２本程度を有する略楕円形の異形断面繊維を緯糸として用いて各評価を行った。

［細胞接着評価］
シュワン細胞であるＩＭＳ３２（コスモ・バイオ株式会社製）をＩＭＳ３２専用培地（コスモ・バイオ株式会社製）に懸濁し、１２５０００個／１ｍｌ／ウェルとなるように播種し、３７℃、飽和蒸気圧、５％ＣＯ_２雰囲気下で２４時間培養した。その後、ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ（株式会社同仁化学研究所製）を用いて細胞数を測定した。具体的には、ＩＭＳ専用培地に１０％のＷＳＴ－８を添加した溶液を調製し、培養上清を除去したウェルに１ｍｌ添加した。３７℃、飽和蒸気圧、５％ＣＯ_２雰囲気下で１時間培養した後、培地上清を１００μｌ、９６穴ウェルプレートのウェルにそれぞれ回収し、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５、モルキュラーデバイス社製）で４８０ｎｍの吸光度を測定した。各実験例について測定した結果を図１１に示す。図１１は、細胞接着評価の結果を示す図である。図１１からも分かるように、略Ｙ字形または略Ｘ字形の異形断面繊維は、円形断面の繊維と同等の、しかし略楕円形断面の繊維よりも多くのシュワン細胞が接着しているといえる。

［神経突起成長評価］
ＰＣ１２（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）の細胞を１％馬血清（フナコシ株式会社製）、１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ（コスモ・バイオ株式会社製）入りのＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で懸濁し、１０００個／１ｍｌ／ウェルとなるように播種した。３７℃、飽和蒸気圧、５％ＣＯ_２雰囲気下で培養し、３日または４日置きに培地を交換した。
１４日目に上清を除去した後、まず４％パラフォルムアルデヒドリン酸緩衝液（富士フイルム和光純薬株式会社製）を１ｍｌずつ加えて、１０分間静置後に上清を除去し、ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬株式会社製）１ｍｌの注入と除去とを３回繰り返して洗浄した。次に２％に調製したギムザ染色液（富士フイルム和光純薬株式会社製）を１ｍｌ添加して１０分静置し、上清を除去したのち、純水１ｍｌの注入と除去とを３回繰り返して洗浄し、風乾させた。
顕微鏡（Ｈｉｒｏｘ社製、ＫＨ－１３００）で染色した織片サンプルを撮影し、付属の画像処理ソフト（２ＤＭｅｓｕｒｅ）を用いて、細胞本体から伸びる細長い突起の長さについて、細胞の核から突起の先端が到達した点との直線距離を測定した。各実験例について測定した結果を図１２に示す。図１２は、神経突起成長評価の結果を示す図である。図１２からも分かるように、略Ｙ字形または略Ｘ字形の異形断面繊維は、略楕円形状断面の繊維よりも神経突起長が長いといえる。

［軸索成長速度および直進性評価］
生後１４日目のラット胎児の脊髄から採取した後根神経節（ＤＲＧ）を１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ（コスモ・バイオ株式会社製）入りのＮｅｕｒｏＭｅｄｉｕｍ－Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で懸濁し、ウェルプレートの各ウェルに一つずつ播種した。３７℃、飽和蒸気圧、５％ＣＯ_２雰囲気下で４日間培養した。
培養開始から４日後に上清を除去した後、まず４％パラフォルムアルデヒドリン酸緩衝液（富士フイルム和光純薬社）を１ｍｌずつ加えて、１０分間静置後に、上清を除去し、ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬株式会社製）１ｍｌの注入と除去とを３回繰り返して洗浄した。その後、ブロッキング溶液（ブロッキングワン：ナカライテスク株式会社製）に一晩浸漬させた後、ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬株式会社製）１ｍｌを注入と除去を３回繰り返して洗浄した。その後、抗β－チューブリンのマウス抗体（プロメガ株式会社製）で標識し、ＡＬＫＡＬＩＮＥＰＨＯＳＰＨＡＴＡＳＥ染色キット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）で染色を行った。染色後、蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社製）を用いて、染色された領域を写真撮影した。画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ）を用いて、ＤＲＧを中心から軸索が到達した点の直進距離（μｍ）を計測した。軸索成長速度は、直進距離を培養日数で除して求めた。また、軸索が伸長したエリアの長軸と短軸を計測し、長軸を短軸で除したアスペクト比を直進性評価の指標とした。

図１３は、軸索成長速度評価の結果（神経突起成長速度）を示す図である。図１４は、軸索成長直進性評価の結果（アスペクト比）を示す図である。図１３から分かるように、略Ｙ字形または略Ｘ字形の異形断面繊維は、略楕円形状断面の繊維よりも神経突起成長速度が速いといえる。また、図１４から分かるように、略Ｙ字形または略Ｘ字形の異形断面繊維は、略楕円形状断面の繊維よりもアスペクト比が高く、軸索成長直進性が高いといえる。

本発明の神経再生誘導チューブは、軸索の伸張性を向上することが可能である。従って、本発明は、効率的な神経再生を実現できることから、産業上非常に有用である。

１神経再生誘導チューブ
１０本体部
１１、１１Ａ異形断面繊維
１１０、１２０軸部
１１１、１２１凸条部

Claims

管状をなす本体部と、
前記本体部に収容され、該本体部の長手方向に延びる複数の繊維と、
を備え、
前記複数の繊維の少なくとも一部の繊維は、
当該繊維の長手方向に延びる軸部と、
当該繊維の長手方向に連続し、前記軸部から突出する凸条部であって、前記軸部からの高さが０．５μｍ以上である、少なくとも三本の凸条部と、
を有する異形断面繊維である
ことを特徴とする神経再生誘導チューブ。
前記異形断面繊維の断面において、当該断面に内接する円の直径に対する、当該断面に外接する円の直径の比である異型度が１．５～１２．０である
ことを特徴とする請求項１に記載の神経再生誘導チューブ。
前記凸条部の高さが１．０μｍ以上である
ことを特徴とする請求項１または２に記載の神経再生誘導チューブ。
前記異形断面繊維は、１０本以下の前記凸条部を有する
ことを特徴とする請求項１～３のいずれか一つに記載の神経再生誘導チューブ。
前記異形断面繊維は、前記凸条部を３本有するＹ断面繊維、または前記凸条部を４本有するＸ断面繊維である、
ことを特徴とする請求項４に記載の神経再生誘導チューブ。
前記複数の繊維は、互いに異なる断面形状をなす繊維を含む
ことを特徴とする請求項１～５のいずれか一つに記載の神経再生誘導チューブ。
前記本体部および前記複数の繊維の少なくとも一方が生体吸収性高分子からなる
ことを特徴とする請求項１～６のいずれか一つに記載の神経再生誘導チューブ。