JP7399451B2 - バラタナゴ類の判別方法及び判別キット - Google Patents
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Description
特許法第３０条第２項適用 （１）発行者：応用生態工学会福岡事務局、刊行物名：応用生態工学会福岡２０１８、プログラム、発行年月日：２０１８年１２月４日
本発明は、バラタナゴ類の判別方法及び判別キットに関する。
ニッポンバラタナゴ（Ｒｈｏｄｅｕｓ ｏｃｅｌｌａｔｕｓ ｋｕｒｕｍｅｕｓ）はコイ科タナゴ亜科に属する小型の純淡水魚である。ニッポンバラタナゴは西日本の平野部に分布しており、農業用水路やため池に生息している。現在、ニッポンバラタナゴは環境省レッドリスト２０１９において絶滅危惧ＩＡ類として取り扱われる等、絶滅の危機に瀕している。その最大の要因が外来種の近縁亜種である、タイリクバラタナゴ（Ｒｈｏｄｅｕｓ ｏｃｅｌｌａｔｕｓ ｏｃｅｌｌａｔｕｓ）との交雑に伴う雑種化である。
ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ、及びその交雑個体は、形態的に酷似しており、判別が困難である。そのため、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）（例えば、非特許文献１参照）やマイクロサテライトＤＮＡ（例えば、非特許文献２参照）等のＤＮＡ情報による判別が行われている。
阿部 司ら、「山陽地方におけるニッポンバラタナゴの在来集団」、魚類学雑誌、６０巻、１号、第４９～５５頁、２０１３年。
Shirai Y et al., "Isolation and characterization of new microsatellite markers for rose bitterlings, Rhodeus ocellatus.", Mol Ecol Resour., Vol. 9, Issue 3, pp. 1031-1033, 2009.
しかしながら、ｍｔＤＮＡを用いた解析では、コスト及び労力は比較的に低いが、母系の遺伝子型しか解析できず、個体の遺伝子型がホモ接合型かヘテロ接合型かを判別することができない。また、マイクロサテライトＤＮＡを用いた解析方法では、個体の遺伝子型を判別できるものの、コスト及び技術的難易度が高い。タイリクバラタナゴの侵入の監視は環境調査等においても重要な課題であるが、現在、コストを抑えながら、簡便且つ確実にニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びそれらの交雑種のうちいずれのバラタナゴであるかを判別できる方法は存在しない。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、簡便且つ確実な新規のバラタナゴ類の判別方法及び判別キットを提供する。
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１） ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びそれらの交雑種のうちいずれのバラタナゴであるかを判別する方法であって、
対象バラタナゴの核ＤＮＡを鋳型として、以下に示す４種類のプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅産物を得る核ＤＮＡ増幅工程と、
１）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＡ；
２）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＢ；
３）バラタナゴの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＣ；
４）バラタナゴの５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＤ；
前記センスプライマーＡ及び前記アンチセンスプライマーＤにより増幅された増幅産物Ｘが検出された場合には、ニッポンバラタナゴであると判別し、
前記センスプライマーＣ及び前記アンチセンスプライマーＢにより増幅された増幅産物Ｙが検出された場合には、タイリクバラタナゴであると判別し、
前記増幅産物Ｘ及び前記増幅産物Ｙが検出された場合には、ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴの交雑種であると判別する判別工程と、
を含む、バラタナゴ類の判別方法。
（２） 前記センスプライマーＣが配列番号３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、（１）に記載のバラタナゴ類の判別方法。
（３） 前記アンチセンスプライマーＤが配列番号４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、（１）又は（２）に記載のバラタナゴ類の判別方法。
（４） 前記核ＤＮＡ増幅工程の前に、又は、前記判別工程の後に、
対象バラタナゴのミトコンドリアＤＮＡを鋳型として、以下に示す２種のプライマーセットを用いてＰＣＲ法で増幅産物を得るミトコンドリアＤＮＡ増幅工程と、
５）ニッポンバラタナゴのシトクロームｂ遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーＥ及びアンチセンスプライマーＦからなるプライマーセット；
６）タイリクバラタナゴのシトクロームｂ遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーＧ及びアンチセンスプライマーＨからなるプライマーセット；
前記センスプライマーＥ及び前記アンチセンスプライマーＦにより増幅された増幅産物Ｗが検出された場合には、ミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型がニッポンバラタナゴであると判別し、
前記センスプライマーＧ及び前記アンチセンスプライマーＨにより増幅された増幅産物Ｖが検出された場合には、ミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型がタイリクバラタナゴであると判別するミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型判別工程と、
を更に含む、（１）～（３）のいずれか一つに記載のバラタナゴ類の判別方法。
（５） 前記センスプライマーＥは、配列番号５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド有し、前記アンチセンスプライマーＦは、配列番号６で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、（４）に記載のバラタナゴ類の判別方法。
（６） 前記センスプライマーＧは、配列番号７で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド有し、前記アンチセンスプライマーＨは、配列番号８で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、（４）又は（５）に記載のバラタナゴ類の判別方法。
（１） ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びそれらの交雑種のうちいずれのバラタナゴであるかを判別する方法であって、
対象バラタナゴの核ＤＮＡを鋳型として、以下に示す４種類のプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅産物を得る核ＤＮＡ増幅工程と、
１）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＡ；
２）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＢ；
３）バラタナゴの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＣ；
４）バラタナゴの５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＤ；
前記センスプライマーＡ及び前記アンチセンスプライマーＤにより増幅された増幅産物Ｘが検出された場合には、ニッポンバラタナゴであると判別し、
前記センスプライマーＣ及び前記アンチセンスプライマーＢにより増幅された増幅産物Ｙが検出された場合には、タイリクバラタナゴであると判別し、
前記増幅産物Ｘ及び前記増幅産物Ｙが検出された場合には、ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴの交雑種であると判別する判別工程と、
を含む、バラタナゴ類の判別方法。
（２） 前記センスプライマーＣが配列番号３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、（１）に記載のバラタナゴ類の判別方法。
（３） 前記アンチセンスプライマーＤが配列番号４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、（１）又は（２）に記載のバラタナゴ類の判別方法。
（４） 前記核ＤＮＡ増幅工程の前に、又は、前記判別工程の後に、
対象バラタナゴのミトコンドリアＤＮＡを鋳型として、以下に示す２種のプライマーセットを用いてＰＣＲ法で増幅産物を得るミトコンドリアＤＮＡ増幅工程と、
５）ニッポンバラタナゴのシトクロームｂ遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーＥ及びアンチセンスプライマーＦからなるプライマーセット；
６）タイリクバラタナゴのシトクロームｂ遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーＧ及びアンチセンスプライマーＨからなるプライマーセット；
前記センスプライマーＥ及び前記アンチセンスプライマーＦにより増幅された増幅産物Ｗが検出された場合には、ミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型がニッポンバラタナゴであると判別し、
前記センスプライマーＧ及び前記アンチセンスプライマーＨにより増幅された増幅産物Ｖが検出された場合には、ミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型がタイリクバラタナゴであると判別するミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型判別工程と、
を更に含む、（１）～（３）のいずれか一つに記載のバラタナゴ類の判別方法。
（５） 前記センスプライマーＥは、配列番号５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド有し、前記アンチセンスプライマーＦは、配列番号６で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、（４）に記載のバラタナゴ類の判別方法。
（６） 前記センスプライマーＧは、配列番号７で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド有し、前記アンチセンスプライマーＨは、配列番号８で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、（４）又は（５）に記載のバラタナゴ類の判別方法。
（７） 以下に示す４種のプライマーを含むプライマーセットを備える、バラタナゴ類の判別キット。
１）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＡ；
２）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＢ；
３）バラタナゴの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＣ；
４）バラタナゴの５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＤ
（８） 前記センスプライマーＣが配列番号３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、（７）に記載のバラタナゴ類の判別キット。
（９） 前記アンチセンスプライマーＤが配列番号４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、（７）又は（８）に記載のバラタナゴ類の判別キット。
（１０） 以下に示す２種のプライマーセットを更に備える、（７）～（９）のいずれか一つに記載のバラタナゴ類の判別キット。
５）ニッポンバラタナゴのシトクロームｂ遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーＥ及びアンチセンスプライマーＦからなるプライマーセット；
６）タイリクバラタナゴのシトクロームｂ遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーＧ及びアンチセンスプライマーＨからなるプライマーセット
（１１） 前記センスプライマーＥは、配列番号５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド有し、前記アンチセンスプライマーＦは、配列番号６で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、（１０）に記載のバラタナゴ類の判別キット。
（１２） 前記センスプライマーＧは、配列番号７で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド有し、前記アンチセンスプライマーＨは、配列番号８で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、（１０）又は（１１）に記載のバラタナゴ類の判別キット。
１）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＡ；
２）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＢ；
３）バラタナゴの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＣ；
４）バラタナゴの５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＤ
（８） 前記センスプライマーＣが配列番号３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、（７）に記載のバラタナゴ類の判別キット。
（９） 前記アンチセンスプライマーＤが配列番号４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、（７）又は（８）に記載のバラタナゴ類の判別キット。
（１０） 以下に示す２種のプライマーセットを更に備える、（７）～（９）のいずれか一つに記載のバラタナゴ類の判別キット。
５）ニッポンバラタナゴのシトクロームｂ遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーＥ及びアンチセンスプライマーＦからなるプライマーセット；
６）タイリクバラタナゴのシトクロームｂ遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーＧ及びアンチセンスプライマーＨからなるプライマーセット
（１１） 前記センスプライマーＥは、配列番号５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド有し、前記アンチセンスプライマーＦは、配列番号６で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、（１０）に記載のバラタナゴ類の判別キット。
（１２） 前記センスプライマーＧは、配列番号７で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド有し、前記アンチセンスプライマーＨは、配列番号８で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、（１０）又は（１１）に記載のバラタナゴ類の判別キット。
上記態様のバラタナゴ類の判別方法及び判別キットによれば、ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びそれらの交雑種のうちいずれのバラタナゴであるかを簡便且つ確実に判別することができる。
以下、本発明の一実施形態に係る（以下、「本実施形態」という）バラタナゴ類の判別方法及び判別キットについて、詳細を説明する。
＜バラタナゴ類の判別方法＞
本実施形態のバラタナゴ類の判別方法（以下、単に「本実施形態の判別方法」と略記する場合がある）は、ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びそれらの交雑種のうちいずれのバラタナゴであるかを判別する方法である。本実施形態の判別方法は、核ＤＮＡ増幅工程と、判別工程とを含む。
核ＤＮＡ増幅工程では、対象バラタナゴの核ＤＮＡを鋳型として、以下に示す４種類のプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅産物を得る。
１）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＡ；
２）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＢ；
３）バラタナゴの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＣ；
４）バラタナゴの５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＤ
本実施形態のバラタナゴ類の判別方法（以下、単に「本実施形態の判別方法」と略記する場合がある）は、ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びそれらの交雑種のうちいずれのバラタナゴであるかを判別する方法である。本実施形態の判別方法は、核ＤＮＡ増幅工程と、判別工程とを含む。
核ＤＮＡ増幅工程では、対象バラタナゴの核ＤＮＡを鋳型として、以下に示す４種類のプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅産物を得る。
１）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＡ；
２）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＢ；
３）バラタナゴの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＣ；
４）バラタナゴの５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＤ
判別工程では、前記センスプライマーＡ及び前記アンチセンスプライマーＤにより増幅された増幅産物Ｘが検出された場合には、ニッポンバラタナゴであると判別する。
前記センスプライマーＣ及び前記アンチセンスプライマーＢにより増幅された増幅産物Ｙが検出された場合には、タイリクバラタナゴであると判別する。
前記増幅産物Ｘ及び前記増幅産物Ｙが検出された場合には、ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴの交雑種であると判別する。
前記センスプライマーＣ及び前記アンチセンスプライマーＢにより増幅された増幅産物Ｙが検出された場合には、タイリクバラタナゴであると判別する。
前記増幅産物Ｘ及び前記増幅産物Ｙが検出された場合には、ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴの交雑種であると判別する。
発明者らは、ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴの核ＤＮＡ中のリボソームＲＮＡ遺伝子の内部転写スペーサー（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ １；ＩＴＳ１）領域に着目し、各亜種の塩基配列を解析した結果、ＩＴＳ１領域に各亜種に特異的な変異を有することを見出し、各亜種に特異的なプライマーを設計することで、本発明を完成するに至った。
本実施形態の判別方法は、後述する実施例に示すように、各亜種に特異的なプライマーを含むプライマーセットを用いることで、ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びそれらの交雑種のうちいずれのバラタナゴであるかを簡便且つ確実に判別することができる。
本実施形態の判別方法は、後述する実施例に示すように、各亜種に特異的なプライマーを含むプライマーセットを用いることで、ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びそれらの交雑種のうちいずれのバラタナゴであるかを簡便且つ確実に判別することができる。
［核ＤＮＡ増幅工程］
核ＤＮＡ増幅工程では、対象バラタナゴの核ＤＮＡを鋳型として、以下に示す４種類のプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅産物を得る。
１）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＡ；
２）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＢ；
３）バラタナゴの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＣ；
４）バラタナゴの５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＤ
核ＤＮＡ増幅工程では、対象バラタナゴの核ＤＮＡを鋳型として、以下に示す４種類のプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅産物を得る。
１）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＡ；
２）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＢ；
３）バラタナゴの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＣ；
４）バラタナゴの５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＤ
対象バラタナゴの核ＤＮＡを増幅するためには、まず、バラタナゴ類の核ＤＮＡを調製して試料とする。試料は、核ＤＮＡを含んでいればよく、バラタナゴ類の全ＤＮＡを試料としても使用してもよい。或いは、バラタナゴ類の核ＤＮＡを抽出して試料として用いてもよい。
試料の調製は、生体のバラタナゴ類の組織から行ってもよい。或いは、バラタナゴ類の死骸の組織から試料を調製することもできる。或いは、バラタナゴ類の糞やバラタナゴ類から剥がれた組織等から試料を調製してもよい。バラタナゴ類の試料からＤＮＡを抽出する方法は、公知の方法が使用できる。具体的には、フェノール法又は市販の核酸抽出用のキット（ＱＩＡＧＥＮ社製、タカラバイオ社製等）により、バラタナゴ類の試料からＤＮＡを抽出する。
次いで、調製した試料を鋳型として、核ＤＮＡ中のＩＴＳ１領域を増幅させる。具体的には、上記４種類のプライマーを用いてＤＮＡ増幅により、核ＤＮＡ中のＩＴＳ１領域を含むＤＮＡ断片を増幅させることができる。より具体的には、センスプライマーＡ及びアンチセンスプライマーＤによって、ニッポンバラタナゴに特異的な変異を有するＩＴＳ１領域を含むＤＮＡ断片（後述する増幅産物Ｘ）が増幅される。センスプライマーＣ及びアンチセンスプライマーＢによって、タイリクバラタナゴに特異的な変異を有するＩＴＳ１領域を含むＤＮＡ断片（後述する増幅産物Ｙ）が増幅される。センスプライマーＣ及びアンチセンスプライマーＤによって、ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴに共通する１８ＳｒＲＮＡ遺伝子－ＩＴＳ１領域－５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の全長または一部が増幅される。
増幅工程で用いられるプライマーの長さは、標的とする各領域を増幅することができれば特に制限されないが、１５塩基以上４０塩基以下であり、１５塩基以上３５塩基以下であってもよく、１５塩基以上３０塩基以下であってもよく、１５塩基以上２５塩基以下であってもよい。
センスプライマーＡは、ニッポンバラタナゴに特異的な変異を有するＩＴＳ１領域を増幅し得るものであれば特に限定されないが、例えば、配列番号１（５’－ＴＴＴＴＣＣＡＣＣＣＣＡＧＴＧ－３’）で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマー等が挙げられる。
アンチセンスプライマーＢは、タイリクバラタナゴに特異的な変異を有するＩＴＳ１領域を増幅し得るものであれば特に限定されないが、例えば、配列番号２（５’－ＣＡＧＡＣＡＡＣＧＧＧＧＴＧＧＧ－３’）で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマー等が挙げられる。
センスプライマーＣは、バラタナゴ類において共通する配列である１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の全部又は一部を増幅することができれば特に制限されない。センスプライマーＣは、１８ＳｒＲＮＡ遺伝子にハイブリダイズし得る配列であって、１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列を有するものである。例えば、配列番号３（５’－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＡＧ－３’）で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマー等が挙げられる。
アンチセンスプライマーＤは、バラタナゴ類において共通する配列である５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の全部又は一部を増幅することができれば特に制限されない。アンチセンスプライマーＤは、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子にハイブリダイズし得る配列であって、５．８ＳｒＲＮＡの塩基配列の一部に相補的な配列を有するものである。例えば、配列番号４（５’－ＧＴＣＣＴＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡＴＴＡＧＴＴＣ－３’）で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマー等が挙げられる。
ＰＣＲによって増幅された増幅産物の長さは選択したプライマーによって規定される。増幅産物の長さは１０塩基対以上１０００塩基対以下とすることができ、電気泳動及び観察のしやすさから１００塩基対以上７００塩基対以下が好ましい。
ＤＮＡを増幅する方法としては、一般的なＰＣＲ法に限定されず、リアルタイムＰＣＲ法、ＰＣＲ－ＳＳＰ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｉｍｅｒｓ）法、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法等の公知の方法を用いることができる。
［判別工程］
判別工程では、上記核ＤＮＡ増幅工程で得られた増幅産物を検出することで、ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びそれらの交雑種のうちいずれのバラタナゴであるかを判別する。
具体的には、前記センスプライマーＡ及び前記アンチセンスプライマーＤにより増幅された増幅産物Ｘが検出された場合には、ニッポンバラタナゴであると判別する。
前記センスプライマーＣ及び前記アンチセンスプライマーＢにより増幅された増幅産物Ｙが検出された場合には、タイリクバラタナゴであると判別する。
前記増幅産物Ｘ及び前記増幅産物Ｙが検出された場合には、ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴの交雑種であると判別する。
なお、上記増幅産物の検出では、ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴに共通する１８ＳｒＲＮＡ遺伝子－ＩＴＳ１領域－５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の全長または一部からなるＤＮＡ断片（以下、「増幅産物Ｚ」と称する場合がある）も検出される。
判別工程では、上記核ＤＮＡ増幅工程で得られた増幅産物を検出することで、ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びそれらの交雑種のうちいずれのバラタナゴであるかを判別する。
具体的には、前記センスプライマーＡ及び前記アンチセンスプライマーＤにより増幅された増幅産物Ｘが検出された場合には、ニッポンバラタナゴであると判別する。
前記センスプライマーＣ及び前記アンチセンスプライマーＢにより増幅された増幅産物Ｙが検出された場合には、タイリクバラタナゴであると判別する。
前記増幅産物Ｘ及び前記増幅産物Ｙが検出された場合には、ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴの交雑種であると判別する。
なお、上記増幅産物の検出では、ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴに共通する１８ＳｒＲＮＡ遺伝子－ＩＴＳ１領域－５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の全長または一部からなるＤＮＡ断片（以下、「増幅産物Ｚ」と称する場合がある）も検出される。
上記核ＤＮＡ増幅工程で得られた増幅産物の検出方法としては、例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により、増幅された遺伝子断片を観察することにより行ってもよい。或いは、ＳＹＢＲグリーン等のインターカレーター色素の存在下でＤＮＡ増幅反応を行い、インターカレーター色素の蛍光を検出する、リアルタイムＰＣＲ法により行ってもよい。
本実施形態の判別方法は、対象バラタナゴの母系の遺伝子型を特定するための工程を更に含むことができる。具体的には、本実施形態の判別方法は、上記核ＤＮＡ増幅工程の前、又は、上記判別工程の後に、以下に示すミトコンドリアＤＮＡ増幅工程及びミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型判別工程を更に含むことができる。
［ミトコンドリアＤＮＡ増幅工程］
ミトコンドリア増幅工程では、対象バラタナゴのミトコンドリアＤＮＡを鋳型として、以下に示す２種のプライマーセットを用いてＰＣＲ法で増幅産物を得る。
５）ニッポンバラタナゴのシトクロームｂ遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーＥ及びアンチセンスプライマーＦからなるプライマーセット；
６）タイリクバラタナゴのシトクロームｂ遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーＧ及びアンチセンスプライマーＨからなるプライマーセット
ミトコンドリア増幅工程では、対象バラタナゴのミトコンドリアＤＮＡを鋳型として、以下に示す２種のプライマーセットを用いてＰＣＲ法で増幅産物を得る。
５）ニッポンバラタナゴのシトクロームｂ遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーＥ及びアンチセンスプライマーＦからなるプライマーセット；
６）タイリクバラタナゴのシトクロームｂ遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーＧ及びアンチセンスプライマーＨからなるプライマーセット
対象バラタナゴのミトコンドリアＤＮＡを増幅するためには、まず、バラタナゴ類のミトコンドリアＤＮＡを調製して試料とする。試料は、ミトコンドリアＤＮＡを含んでいればよく、バラタナゴ類の全ＤＮＡを試料としても使用してもよい。或いは、バラタナゴ類のミトコンドリアＤＮＡを抽出して試料として用いてもよい。
試料の調製は、生体のバラタナゴ類の組織から行ってもよい。或いは、バラタナゴ類の死骸の組織から試料を調製することもできる。或いは、バラタナゴ類の糞やバラタナゴ類から剥がれた組織等から試料を調製してもよい。バラタナゴ類の試料からＤＮＡを抽出する方法は、上述した「核ＤＮＡ増幅工程」において例示された方法と同様の方法が挙げられる。
次いで、調製した試料を鋳型として、ミトコンドリアＤＮＡのシトクロームｂ遺伝子を増幅させる。具体的には、上記２種類のプライマーセットを用いてＤＮＡ増幅により、ミトコンドリアＤＮＡのシトクロームｂ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅させることができる。より具体的には、センスプライマーＥ及びアンチセンスプライマーＦによって、ニッポンバラタナゴに特異的な変異を有するシトクロームｂ遺伝子を含むＤＮＡ断片（後述する増幅産物Ｗ）が増幅される。センスプライマーＧ及びアンチセンスプライマーＨによって、タイリクバラタナゴに特異的な変異を有するシトクロームｂ遺伝子を含むＤＮＡ断片（後述する増幅産物Ｖ）が増幅される。
増幅工程で用いられるプライマーの長さは、ミトコンドリアＤＮＡのシトクロームｂ遺伝子を増幅することができれば特に制限されないが、１５塩基以上４０塩基以下であり、１５塩基以上３５塩基以下であってもよく、１５塩基以上３０塩基以下であってもよく、１５塩基以上２５塩基以下であってもよい。
センスプライマーＥ及びアンチセンスプライマーＦは、ニッポンバラタナゴに特異的な変異を有するシトクロームｂ遺伝子を増幅し得るものであれば特に限定されない。センスプライマーＥ及びアンチセンスプライマーＦは、それぞれニッポンバラタナゴに特異的な変異を有するシトクロームｂ遺伝子にハイブリダイズし得る配列であって、ニッポンバラタナゴに特異的な変異を有するシトクロームｂ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列を有するものである。例えば、配列番号５（５’－ＡＣＣＣＴＡＴＡＴＡＧＧＡＧＡＣＡＣＣＣ－３’）で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマー及び配列番号６（５’－ＣＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＣＧＧＧＧＴＡ－３’）で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマー等が挙げられる。
センスプライマーＧ及びアンチセンスプライマーＨは、タイリクバラタナゴに特異的な変異を有するシトクロームｂ遺伝子を増幅し得るものであれば特に限定されない。センスプライマーＥ及びアンチセンスプライマーＦは、それぞれタイリクバラタナゴに特異的な変異を有するシトクロームｂ遺伝子にハイブリダイズし得る配列であって、タイリクバラタナゴに特異的な変異を有するシトクロームｂ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列を有するものである。例えば、配列番号７（５’－ＧＧＴＴＴＡＴＴＴＣＴＧＧＣＴＡＴＧＣＡＣ－３’）で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマー及び配列番号８（５’－ＧＴＴＴＣＣＴＴＡＴＡＴＡＡＡＴＡＧＧＡＣＣＣＡ－３’）で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマー等が挙げられる。
ＰＣＲによって増幅された増幅産物の長さは選択したプライマーによって規定される。増幅産物の長さは１０塩基対以上１０００塩基対以下とすることができ、電気泳動及び観察のしやすさから１００塩基対以上７００塩基対以下が好ましい。
ＤＮＡを増幅する方法としては、上述した「核ＤＮＡ増幅工程」において例示された方法と同様の方法が挙げられる。
［ミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型判別工程］
ミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型判別工程では、上記ミトコンドリアＤＮＡ増幅工程で得られた増幅産物を検出することで、対象バラタナゴのミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型、すなわち、母系の遺伝子型を判別する。
具体的には、前記センスプライマーＥ及び前記アンチセンスプライマーＦにより増幅された増幅産物Ｗが検出された場合には、ミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型がニッポンバラタナゴであると判別する。
前記センスプライマーＧ及び前記アンチセンスプライマーＨにより増幅された増幅産物Ｖが検出された場合には、タイリクバラタナゴであると判別する。
ミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型判別工程では、上記ミトコンドリアＤＮＡ増幅工程で得られた増幅産物を検出することで、対象バラタナゴのミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型、すなわち、母系の遺伝子型を判別する。
具体的には、前記センスプライマーＥ及び前記アンチセンスプライマーＦにより増幅された増幅産物Ｗが検出された場合には、ミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型がニッポンバラタナゴであると判別する。
前記センスプライマーＧ及び前記アンチセンスプライマーＨにより増幅された増幅産物Ｖが検出された場合には、タイリクバラタナゴであると判別する。
上記ミトコンドリアＤＮＡ増幅工程で得られた増幅産物の検出方法としては、上述した「判別工程」において例示された方法と同様の方法が挙げられる。
本実施形態の判別方法は、後述する実施に示すように、上記核ＤＮＡ増幅工程及び上記判別工程に加えて、ミトコンドリアＤＮＡ増幅工程及びミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型判別工程を含むことで、ホモ接合型のニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴ、並びにヘテロ接合型の交雑種のいずれの遺伝子型であるかを判別できるだけでなく、ミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型からハプロタイプがニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴのいずれであるかも判別することができる。これにより、後述する実施例に示すように、特定の地域に生息するバラタナゴ類について、タイリクバラタナゴの遺伝的侵入率を正確に把握することができる。
＜バラタナゴ類の判別キット＞
本実施形態のバラタナゴ類の判別キット（以下、単に「本実施形態の判別キット」と略記する場合がある）は、以下に示す４種のプライマーを含むプライマーセットを備える。
１）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＡ；
２）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＢ；
３）バラタナゴの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＣ；
４）バラタナゴの５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＤ
本実施形態のバラタナゴ類の判別キット（以下、単に「本実施形態の判別キット」と略記する場合がある）は、以下に示す４種のプライマーを含むプライマーセットを備える。
１）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＡ；
２）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＢ；
３）バラタナゴの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＣ；
４）バラタナゴの５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＤ
本実施形態の判別キットは、上記プライマーセットを用いることで、ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びそれらの交雑種のうちいずれのバラタナゴであるかを簡便且つ確実に判別することができる。
本実施形態の判別キットにおいて、センスプライマーＡ、アンチセンスプライマーＢ、センスプライマーＣ及びアンチセンスプライマーＤは、上述した「バラタナゴ類の判別方法」で例示されたものと同様のものが挙げられる。
本実施形態の判別キットは、以下に示す２種のプライマーセットを更に備えることができる。
５）ニッポンバラタナゴのシトクロームｂ遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーＥ及びアンチセンスプライマーＦからなるプライマーセット；
６）タイリクバラタナゴのシトクロームｂ遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーＧ及びアンチセンスプライマーＨからなるプライマーセット
５）ニッポンバラタナゴのシトクロームｂ遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーＥ及びアンチセンスプライマーＦからなるプライマーセット；
６）タイリクバラタナゴのシトクロームｂ遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーＧ及びアンチセンスプライマーＨからなるプライマーセット
本実施形態の判別キットは、上記２種のプライマーセットを更に備えることで、対象バラタナゴの母系の遺伝子型を特定することができる。
センスプライマーＥ、アンチセンスプライマーＦ、センスプライマーＧ及びアンチセンスプライマーＨは、上述した「バラタナゴ類の判別方法」で例示されたものと同様のものが挙げられる。
本実施形態の判別キットは、プローブを更に備えていてもよい。
プローブとしては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いることもできる。使用可能な蛍光物質としては、ＦＡＭ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＶＩＣ（登録商標）等が挙げられる。また、使用可能な消光物質としては、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）等が挙げられる。
上記のプローブの存在下でＤＮＡ増幅反応を行うと、プローブが増幅対象のＤＮＡ断片にアニーリングする。そして、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが分解される。その結果、プローブ分子上で近接して存在していた消光物質と蛍光物質が離れ、蛍光物質が蛍光を発するようになる。この蛍光を定量することにより、ＤＮＡ増幅反応の進行を定量的に測定することができる。
本実施形態のキットにおけるプローブの長さは、センスプライマー及びアンチセンスプライマーよりも先に鋳型ＤＮＡにアニーリングすることができれば（センスプライマー及びアンチセンスプライマーよりも融解温度（Ｔｍ）が高ければ）特に制限されず、例えば１５塩基以上４０塩基以下であってもよく、１５塩基以上３５塩基以下であってもよく、１５塩基以上３０塩基以下であってもよく、１５塩基以上２５塩基以下であってもよい。
本実施形態のキットを用いることにより、上述した「バラタナゴ類の判別方法」をリアルタイムＰＣＲ法により実施することができる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
１．サンプルの収集
ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びその交雑個体のサンプルは、２０１７年から２０１８年までの期間に、ハンドネット又はキャスティングネットを使用して、九州の５つの河川（六角川、筑後川、菊池川、瑞梅寺川及び鹿島川）、並びに、本州東部の夷隅川で収集された。これらのサンプリング場所は、以前の研究に基づいて選択された。捕獲された各個体から尾びれの一部を切り取り、切り取った組織は直ちに９９％エタノールで固定された。その後、捕獲された全ての個体は、各サンプリング場所で直ちに放流された。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、固定した組織から全ＤＮＡを分離した。
１．サンプルの収集
ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びその交雑個体のサンプルは、２０１７年から２０１８年までの期間に、ハンドネット又はキャスティングネットを使用して、九州の５つの河川（六角川、筑後川、菊池川、瑞梅寺川及び鹿島川）、並びに、本州東部の夷隅川で収集された。これらのサンプリング場所は、以前の研究に基づいて選択された。捕獲された各個体から尾びれの一部を切り取り、切り取った組織は直ちに９９％エタノールで固定された。その後、捕獲された全ての個体は、各サンプリング場所で直ちに放流された。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、固定した組織から全ＤＮＡを分離した。
２．ミトコンドリアＤＮＡにおける種特異的プライマーを用いたジェノタイピング
ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴのミトコンドリアシトクロームｂ遺伝子の参照塩基配列を日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）から入手した。ニッポンバラタナゴのアクセッション番号は、ＡＢ１０９０００、ＡＢ１０９０１０、ＡＢ３６６５０４－ＡＢ３６６５０７、ＡＢ７６９５１１－ＡＢ７６９５１５である。タイリクバラタナゴのアクセッション番号は、ＡＢ１０９００９、ＡＢ３６６５１２－ＡＢ３６６５１３、ＡＢ６２０１３３、ＡＢ７６９５１６－ＡＢ７６９５１９、ＫＦ４１０７７６である。これらの塩基配列をＭＥＧＡ７ソフトウェア（参考文献１：「Kumar S et al., “MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets.”, Mol Biol Evol., Vol. 33, Issue 7, pp. 1870-1874, 2016.）を使用して分析し、ミトコンドリアシトクロームｂ遺伝子における各亜種に特異的な変異（種間変異）を特定した。
ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴのミトコンドリアシトクロームｂ遺伝子の参照塩基配列を日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）から入手した。ニッポンバラタナゴのアクセッション番号は、ＡＢ１０９０００、ＡＢ１０９０１０、ＡＢ３６６５０４－ＡＢ３６６５０７、ＡＢ７６９５１１－ＡＢ７６９５１５である。タイリクバラタナゴのアクセッション番号は、ＡＢ１０９００９、ＡＢ３６６５１２－ＡＢ３６６５１３、ＡＢ６２０１３３、ＡＢ７６９５１６－ＡＢ７６９５１９、ＫＦ４１０７７６である。これらの塩基配列をＭＥＧＡ７ソフトウェア（参考文献１：「Kumar S et al., “MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets.”, Mol Biol Evol., Vol. 33, Issue 7, pp. 1870-1874, 2016.）を使用して分析し、ミトコンドリアシトクロームｂ遺伝子における各亜種に特異的な変異（種間変異）を特定した。
特定された種間変異に基づいて、以下に示す亜種特異的プライマーセットを設計した。各プライマーの塩基配列を表１に示す。表１において、「ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｒｏｋ＿ｃｙｔｂ＿Ｆ」及び「ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｒｏｋ＿ｃｙｔｂ＿Ｒ」は、ニッポンバラタナゴのミトコンドリアシトクロームｂ遺伝子の増幅産物を得るためのプライマーセットであり、「ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｒｏｏ＿ｃｙｔｂ＿Ｆ」及び「ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｒｏｏ＿ｃｙｔｂ＿Ｒ」は、タイリクバラタナゴのミトコンドリアシトクロームｂ遺伝子の増幅産物を得るためのプライマーセットである。
表１に示すプライマーセットを用いて、「１．」で得られた各組織から分離された全ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行なった。具体的には、５μＬのＫＯＤ Ｏｎｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ －Ｂｌｕｅ－（東洋紡社製）、０．５μＬの各プライマー（混合物の総容量に対する濃度が１０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ））、２．５μＬの超純水及び０．５μＬの鋳型ＤＮＡを含む１０μＬの反応混合物を調製し、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲの条件は、９８℃で３０秒間インキュベートした後、次に示すサイクルを３０サイクル実行した：９８℃で１０秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で１５秒間。サイクル終了後、７２℃で２分間保持した。ＰＣＲで増幅された増幅産物を分離するために、２μＬの各ＰＣＲ産物を含む反応溶液を、臭化エチジウムを含む１０質量％アガロースゲルを用いて１００Ｖで２５分間電気泳動した。増幅産物の分子量は１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．，）を使用して決定した。
まず、塩基配列が既知であるニッポンバラタナゴ（六角川から採取されたサンプルＮｏ．１）及びタイリクバラタナゴ（夷隅川から採取されたサンプルＮｏ．２５）を使用して、２つの亜種からの増幅産物のパターンの違いを検証した。結果を図１に示す。図１において「Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｗ」はニッポンバラタナゴ特異的な増幅産物であり、「Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｖ」はタイリクバラタナゴ特異的な増幅産物である。
図１から、シトクロームｂ遺伝子の２亜種に特異的な増幅産物が得られることが確認された。ニッポンバラタナゴ特異的な増幅産物は、３４８塩基対（ｂｐ）であり、タイリクバラタナゴ特異的な増幅産物は１９３ｂｐであった。
図１から、シトクロームｂ遺伝子の２亜種に特異的な増幅産物が得られることが確認された。ニッポンバラタナゴ特異的な増幅産物は、３４８塩基対（ｂｐ）であり、タイリクバラタナゴ特異的な増幅産物は１９３ｂｐであった。
次に、他の３４のサンプルについて、上記ｍｔＤＮＡのＰＣＲによるジェノタイピングを行い、ｍｔＤＮＡの遺伝子型を同定した。
３．核ＤＮＡにおける種特異的プライマーを用いたジェノタイピング
次いで、ニッポンバラタナゴ（六角川から採取されたサンプルＮｏ．１）及びタイリクバラタナゴ（夷隅川から採取されたサンプルＮｏ．３１）の核ＤＮＡ中のリボソームＲＮＡ遺伝子の内部転写スペーサー（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ １；ＩＴＳ１）領域の配列を分析した。「Kanno K et al., “Morphological, distributional, and genetic characteristics of Cottus pollux in the Kyushu Island, Japan: indication of fluvial and amphidromous life histories within a single lineage”, Ichthyological Research, Vol. 65, Issue 4, pp.462-470, 2018.（参考文献２）」に記載の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列を有するフォワードプライマー（１８ＳｒＲＮＡＦ；５’－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＡＧ－３’（配列番号３））及び５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列を有するリバースプライマー（５．８ＳｒＲＮＡＲ；５’－ＧＴＣＣＴＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡＴＴＡＧＴＴＣ－３’（配列番号４））を用いてＰＣＲを行い、３４４ｂｐのＩＴＳ１領域の増幅産物を得た。具体的には、５μＬのＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ（登録商標） ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ社製）、０．５μＬの各プライマー（混合物の総容量に対する濃度が１０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ））、３．５μＬの超純水及び０．５μＬの鋳型ＤＮＡを含む１０μＬの反応混合物を調製して、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９８℃で３０秒間インキュベートした後、次に示すサイクルを３０サイクル実行した：９８℃で１５秒間、５０℃で１５秒間、７２℃で１５秒間。サイクル終了後、７２℃で２分間保持した。
次いで、ニッポンバラタナゴ（六角川から採取されたサンプルＮｏ．１）及びタイリクバラタナゴ（夷隅川から採取されたサンプルＮｏ．３１）の核ＤＮＡ中のリボソームＲＮＡ遺伝子の内部転写スペーサー（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ １；ＩＴＳ１）領域の配列を分析した。「Kanno K et al., “Morphological, distributional, and genetic characteristics of Cottus pollux in the Kyushu Island, Japan: indication of fluvial and amphidromous life histories within a single lineage”, Ichthyological Research, Vol. 65, Issue 4, pp.462-470, 2018.（参考文献２）」に記載の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列を有するフォワードプライマー（１８ＳｒＲＮＡＦ；５’－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＡＧ－３’（配列番号３））及び５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列を有するリバースプライマー（５．８ＳｒＲＮＡＲ；５’－ＧＴＣＣＴＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡＴＴＡＧＴＴＣ－３’（配列番号４））を用いてＰＣＲを行い、３４４ｂｐのＩＴＳ１領域の増幅産物を得た。具体的には、５μＬのＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ（登録商標） ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ社製）、０．５μＬの各プライマー（混合物の総容量に対する濃度が１０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ））、３．５μＬの超純水及び０．５μＬの鋳型ＤＮＡを含む１０μＬの反応混合物を調製して、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９８℃で３０秒間インキュベートした後、次に示すサイクルを３０サイクル実行した：９８℃で１５秒間、５０℃で１５秒間、７２℃で１５秒間。サイクル終了後、７２℃で２分間保持した。
ＰＣＲで増幅された増幅産物を確認するために、２μＬの各ＰＣＲ産物を含む反応溶液を、臭化エチジウムを含む１質量％アガロースゲルを用いて１００Ｖで２５分間電気泳動した。
得られた増幅産物は、ＥｘｏＳＡＰ－ＩＴ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｌｅａｎｕｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を使用して精製した。次いで、得られた精製物をプライマーと混合し、ＦＡＳＭＡＣ ＤＮＡシーケンシングサービス（ＦＡＳＭＡＣ）でシーケンスした。使用したプライマーは、上記１８ＳｒＲＮＡＦ、上記５．８ＳｒＲＮＡＲ、バラタナゴ共通ＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマー（Ｒｏ＿ＩＴＳ１＿Ｆ２；５’－ＣＧＣＣＴＴＧＧＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＣＣ－３’（配列番号９））、タイリクバラタナゴＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマー（Ｒｏｏ＿ＩＴＳ１＿Ｒ２；５’－ＧＡＡＣＧＡＣＡＣＡＧＡＣＡＡＣＧＧＧＧＴＧＧＧ－３’（配列番号１０））であった。シークエンスにより新しく得られた塩基配列はＤＤＢＪに登録した（アクセッション番号：ＬＣ４８５３２５－ＬＣ４８５３２６）。得られた塩基配列を、ＭＥＧＡ７ソフトウェア（上記参考文献１参照）を使用して分析し、ＩＴＳ１領域における各亜種に特異的な変異（種間変異）を特定した。
特定された種間変異に基づいて、以下に示す亜種特異的プライマーセットを設計した。各プライマーの塩基配列を表２に示す。表２において、「ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｒｏｋ＿ＩＴＳ１＿ｓｈｏｒｔＦ」は、ニッポンバラタナゴのＩＴＳ１領域の増幅産物を得るためのフォワードプライマーであり、「ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｒｏｏ＿ＩＴＳ１＿ｓｈｏｒｔＲ」は、タイリクバラタナゴのＩＴＳ１領域の増幅産物を得るためのリバースプライマーである。
核ＤＮＡに基づいてニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴを判別するために、以下に示す４種のプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。
１）Ｒｏｋ＿ＩＴＳ１＿ｓｈｏｒｔＦ（配列番号１）
２）Ｒｏｏ＿ＩＴＳ１＿ｓｈｏｒｔＲ（配列番号２）
３）１８ＳｒＲＮＡＦ（配列番号３）
４）５．８ＳｒＲＮＡＲ（配列番号４）
１）Ｒｏｋ＿ＩＴＳ１＿ｓｈｏｒｔＦ（配列番号１）
２）Ｒｏｏ＿ＩＴＳ１＿ｓｈｏｒｔＲ（配列番号２）
３）１８ＳｒＲＮＡＦ（配列番号３）
４）５．８ＳｒＲＮＡＲ（配列番号４）
これらのプライマーによって、１８ＳｒＲＮＡＦ及び５．８ＳｒＲＮＡＲにより増幅された共通の増幅産物（ＵＮＩＦ）（約４６０ｂｐ程度、ニッポンバラタナゴでは４６４ｂｐ、タイリクバラタナゴでは４５６ｂｐ）、並びに、ＩＴＳ１領域のマーカーである亜種特異的な増幅産物（Ｒｏｋ＿ＩＴＳ１＿ｓｈｏｒｔＦ及び５．８ＳｒＲＮＡＲにより増幅されたニッポンバラタナゴ特異的な増幅産物（ＲＯＫＦ）は１３４ｂｐ、１８ＳｒＲＮＡＦ及びＲｏｏ＿ＩＴＳ１＿ｓｈｏｒｔＲにより増幅されたタイリクバラタナゴ特異的な増幅産物（ＲＯＯＦ）は３３６ｂｐ）を得ることができる。
ＰＣＲサイクル以外は、上記「２．ミトコンドリアＤＮＡにおける種特異的プライマーを用いたジェノタイピング」と同様の方法を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲサイクルは、９８℃で３０秒間インキュベートした後、次に示すサイクルを３０サイクル実行した：９８℃で１０秒間、５０℃で１５秒間、７２℃で１５秒間。サイクル終了後、７２℃で２分間保持した。ＰＣＲで増幅された増幅産物を分離するために、２μＬの各ＰＣＲ産物を含む反応溶液を、臭化エチジウムを含む１０質量％アガロースゲルを用いて１００Ｖで２５分間電気泳動した。増幅産物の分子量は１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．，）を使用して決定した。
まず、塩基配列が既知であるニッポンバラタナゴ（六角川から採取されたサンプルＮｏ．１）及びタイリクバラタナゴ（夷隅川から採取されたサンプルＮｏ．３１）を使用して、２つの亜種からの増幅産物のパターンの違いを検証した。結果を図２に示す。
図２から、ニッポンバラタナゴではＵＮＩＦ及びＲＯＫＦが検出され、一方で、タイリクバラタナゴではＵＮＩＦ及びＲＯＯＦが検出された。このことから、共通の増幅産物に加えて、各亜種に特異的な増幅産物が検出されることが確認された。ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴの交雑個体では、ＵＮＩＦ、ＲＯＫＦ及びＲＯＯＦの３種類の増幅産物が検出された。
以上のことから、本プライマーセットを使用してＰＣＲ解析を行なうことで、ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及び交雑個体の簡易的判別が可能であることが示唆された。
図２から、ニッポンバラタナゴではＵＮＩＦ及びＲＯＫＦが検出され、一方で、タイリクバラタナゴではＵＮＩＦ及びＲＯＯＦが検出された。このことから、共通の増幅産物に加えて、各亜種に特異的な増幅産物が検出されることが確認された。ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴの交雑個体では、ＵＮＩＦ、ＲＯＫＦ及びＲＯＯＦの３種類の増幅産物が検出された。
以上のことから、本プライマーセットを使用してＰＣＲ解析を行なうことで、ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及び交雑個体の簡易的判別が可能であることが示唆された。
次に、他の３４のサンプルについて、上記核ＤＮＡのＰＣＲによるジェノタイピングを行い、ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びそれらの交雑種のうちいずれであるかを同定した。
４．バラタナゴ類の判別
上記「２．ミトコンドリアＤＮＡにおける種特異的プライマーを用いたジェノタイピング」及び「３．核ＤＮＡにおける種特異的プライマーを用いたジェノタイピング」の分析結果をまとめて、各個体の遺伝子型を以下の６種類に分類した。結果を図３に示す。図３において、「ｓｔ．１」、「ｓｔ．２」、「ｓｔ．３」、「ｓｔ．４」、「ｓｔ．５」、「ｓｔ．６」はそれぞれ六角川、筑後川、菊池川、瑞梅寺川、鹿島川及び夷隅川で収集したサンプルを示す。
（１）母系の遺伝子型がニッポンバラタナゴ（ｍａｔ－Ｒｏｋ）、核ＤＮＡの遺伝子型がニッポンバラタナゴ（ｈｏｍｏ－Ｒｏｋ）
（２）母系の遺伝子型がニッポンバラタナゴ（ｍａｔ－Ｒｏｋ）、核ＤＮＡの遺伝子型が交雑種（ｈｅｔｅｒｏ）
（３）母系の遺伝子型がニッポンバラタナゴ（ｍａｔ－Ｒｏｋ）、核ＤＮＡの遺伝子型がタイリクバラタナゴ（ｈｏｍｏ－Ｒｏｏ）
（４）母系の遺伝子型がタイリクバラタナゴ（ｍａｔ－Ｒｏｏ）、核ＤＮＡの遺伝子型がニッポンバラタナゴ（ｈｏｍｏ－Ｒｏｋ）
（５）母系の遺伝子型がタイリクバラタナゴ（ｍａｔ－Ｒｏｏ）、核ＤＮＡの遺伝子型が交雑種（ｈｅｔｅｒｏ）
（６）母系の遺伝子型がタイリクバラタナゴ（ｍａｔ－Ｒｏｏ）、核ＤＮＡの遺伝子型がタイリクバラタナゴ（ｈｏｍｏ－Ｒｏｏ）
上記「２．ミトコンドリアＤＮＡにおける種特異的プライマーを用いたジェノタイピング」及び「３．核ＤＮＡにおける種特異的プライマーを用いたジェノタイピング」の分析結果をまとめて、各個体の遺伝子型を以下の６種類に分類した。結果を図３に示す。図３において、「ｓｔ．１」、「ｓｔ．２」、「ｓｔ．３」、「ｓｔ．４」、「ｓｔ．５」、「ｓｔ．６」はそれぞれ六角川、筑後川、菊池川、瑞梅寺川、鹿島川及び夷隅川で収集したサンプルを示す。
（１）母系の遺伝子型がニッポンバラタナゴ（ｍａｔ－Ｒｏｋ）、核ＤＮＡの遺伝子型がニッポンバラタナゴ（ｈｏｍｏ－Ｒｏｋ）
（２）母系の遺伝子型がニッポンバラタナゴ（ｍａｔ－Ｒｏｋ）、核ＤＮＡの遺伝子型が交雑種（ｈｅｔｅｒｏ）
（３）母系の遺伝子型がニッポンバラタナゴ（ｍａｔ－Ｒｏｋ）、核ＤＮＡの遺伝子型がタイリクバラタナゴ（ｈｏｍｏ－Ｒｏｏ）
（４）母系の遺伝子型がタイリクバラタナゴ（ｍａｔ－Ｒｏｏ）、核ＤＮＡの遺伝子型がニッポンバラタナゴ（ｈｏｍｏ－Ｒｏｋ）
（５）母系の遺伝子型がタイリクバラタナゴ（ｍａｔ－Ｒｏｏ）、核ＤＮＡの遺伝子型が交雑種（ｈｅｔｅｒｏ）
（６）母系の遺伝子型がタイリクバラタナゴ（ｍａｔ－Ｒｏｏ）、核ＤＮＡの遺伝子型がタイリクバラタナゴ（ｈｏｍｏ－Ｒｏｏ）
図３から、六角川、筑後川及び菊池川（ｓｔ．１～３）で採取された全ての個体は、ニッポンバラタナゴ（上記分類（１）：ｍａｔ－Ｒｏｋ、ｈｏｍｏ－Ｒｏｋ）に分類された。夷隅川（ｓｔ．６）で採取された全ての個体は、タイリクバラタナゴ（上記分類（６）：ｍａｔ－Ｒｏｏ、ｈｏｍｏ－Ｒｏｏ）に分類された。瑞梅寺川及び鹿島川（ｓｔ．４及び５）で採取された個体は、亜種及び交雑種が存在していた。瑞梅寺川で採取された個体は、４個体のタイリクバラタナゴ（上記分類（６）：ｍａｔ－Ｒｏｏ、ｈｏｍｏ－Ｒｏｏ）及び２個体の交雑種（上記分類（５）：ｍａｔ－Ｒｏｏ、ｈｅｔｅｒｏ）に分類された。鹿島川で採取された個体は、１個体のタイリクバラタナゴ（上記分類（６）：ｍａｔ－Ｒｏｏ、ｈｏｍｏ－Ｒｏｏ）、５個体が交雑種（上記分類（２）：ｍａｔ－Ｒｏｋ、ｈｅｔｅｒｏ；上記分類（３）：ｍａｔ－Ｒｏｋ、ｈｏｍｏ－Ｒｏｏ；上記分類（５）：ｍａｔ－Ｒｏｏ、ｈｅｔｅｒｏ）に分類された。
上記プライマーセットを使用するバラタナゴ類の判別方法は、従来のＤＮＡ配列分析（９ステップ及び８．５時間）及びマイクロサテライトＤＮＡ分析（６ステップ及び６時間）よりも少ない労力（３ステップ及び３．５時間）で簡便にバラタナゴ類を判別することができる（図４参照）。これは、本バラタナゴ類の判別方法は、ＰＣＲによる増幅工程とアガロースゲルを使用したＤＮＡ分離工程のみからなることによるものである。さらに、本判別方法では、増幅チェックの工程を省略しており、増幅後のチェックで通常使用される試薬の使用も必要としないことから、従来の方法よりも安価に分析を行うことができる。
本判別方法は、従来のミトコンドリアＤＮＡのみの分析方法と比較して、交雑種及びタイリクバラタナゴをより高い感度で検出することができる。図３の鹿島川（ｓｔ．５）で採取された個体について、従来のミトコンドリアＤＮＡのみの分析方法で分類した場合には、ハプロタイプについて６個体中２個体のタイリクバラタナゴが検出され、タイリクバラタナゴの遺伝的侵入率は３３％となる。しかしながら、本判別方法では、これらの２個体から、ハプロタイプがタイリクバラタナゴであることだけでなく、核ＤＮＡ分析を使用することで、４個体のヘテロ接合型も検出することができ、これにより、タイリクバラタナゴの遺伝的侵入率が１００％であることが導き出せる。
本実施形態のバラタナゴ類の判別方法及び判別キットによれば、簡便且つ確実にバラタナゴ類を判別することができる。本実施形態のバラタナゴ類の判別方法及び判別キットは環境調査や生態学的研究に用いることができる。
Claims (2)
- ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びそれらの交雑種のうちいずれのバラタナゴであるかを判別する方法であって、
対象バラタナゴの核ＤＮＡを鋳型として、以下の１）～４）に示す４種類のプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅産物を得る核ＤＮＡ増幅工程と、
前記核ＤＮＡ増幅工程で得られた増幅産物を電気泳動して検出することで、ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びそれらの交雑種のうちいずれのバラタナゴであるかを判別する判別工程とを含み、
１）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＡ；
２）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＢ；
３）バラタナゴの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列番号３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＣ；
４）バラタナゴの５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列番号４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＤ；
前記判別工程で、前記センスプライマーＡ及び前記アンチセンスプライマーＤにより増幅された増幅産物Ｘが検出された場合には、ニッポンバラタナゴであると判別し、
前記センスプライマーＣ及び前記アンチセンスプライマーＢにより増幅された増幅産物Ｙが検出された場合には、タイリクバラタナゴであると判別し、
前記増幅産物Ｘ及び前記増幅産物Ｙが検出された場合には、ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴの交雑種であると判別し、
さらに、前記核ＤＮＡ増幅工程の前に、又は、前記判別工程の後に、
対象バラタナゴのミトコンドリアＤＮＡを鋳型として、以下に示す２種のプライマーセットを用いてＰＣＲ法で増幅産物を得るミトコンドリアＤＮＡ増幅工程と、
前記ミトコンドリアＤＮＡ増幅工程で得られた増幅産物を電気泳動して検出することで、対象バラタナゴのミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型を判別するミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型判別工程と、を含み、
５）ニッポンバラタナゴのシトクロームｂ遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーＥ及びアンチセンスプライマーＦからなるプライマーセット；
６）タイリクバラタナゴのシトクロームｂ遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーＧ及びアンチセンスプライマーＨからなるプライマーセット；
前記センスプライマーＥは、配列番号５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有し、前記アンチセンスプライマーＦは、配列番号６で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有し、
前記センスプライマーＧは、配列番号７で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有し、前記アンチセンスプライマーＨは、配列番号８で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有し、
前記ミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型判別工程で、前記センスプライマーＥ及び前記アンチセンスプライマーＦにより増幅された増幅産物Ｗが検出された場合には、ミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型がニッポンバラタナゴであると判別し、
前記センスプライマーＧ及び前記アンチセンスプライマーＨにより増幅された増幅産物Ｖが検出された場合には、ミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型がタイリクバラタナゴであると判別する、バラタナゴ類の判別方法。 - 以下の１）～４）に示す４種のプライマーを含むプライマーセットと、５）及び６）に示す２種のプライマーセットとを備える、バラタナゴ類の判別キット。
１）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＡ；
２）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＢ；
３）バラタナゴの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列番号３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーＣ；
４）バラタナゴの５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列番号４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーＤ
５）ニッポンバラタナゴのシトクロームｂ遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーＥ及びアンチセンスプライマーＦからなるプライマーセット；
６）タイリクバラタナゴのシトクロームｂ遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーＧ及びアンチセンスプライマーＨからなるプライマーセット
前記センスプライマーＥは、配列番号５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド有し、前記アンチセンスプライマーＦは、配列番号６で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有し、
前記センスプライマーＧは、配列番号７で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有し、前記アンチセンスプライマーＨは、配列番号８で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する。
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