JP7419243B2 - アフリカブタ熱ウイルスおよび古典的ブタ熱ウイルスの化学的緩和 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１８年３月３日に出願された「中鎖脂肪酸を用いたアフリカブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）および古典的ブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）などのウイルスの不活化(INACTIVATION OF VIRUSES SUCH AS AFRICAN SWINE FEVER VIRUS (ASFV) AND CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS (CSFV) WITH MEDIUM CHAIN FATTY ACIDS)」という名称の米国仮特許出願第６２／６３７，８２５号並びに２０１８年１２月１７日に出願された「アフリカブタ熱ウイルスの化学的緩和(CHEMICAL MITIGATION OF AFRICAN SWINE FEVER VIRUS)」という名称の米国仮特許出願第６２／７８０，７４０号の優先件を主張するものである。

本発明は、広くは、動物飼料、飼料成分、およびペットフード中のアフリカブタ熱ウイルスおよび／または古典的ブタ熱ウイルスの抑制方法に関する。

中鎖脂肪酸は、特定の家畜病原体、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）およびサルモネラ菌属種に対して有効であることが示されている（引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる、２０１７年１２月１４日に出願された米国特許出願第２０１７／０３５４１６７号）。

アフリカブタ熱ウイルスおよび古典的ブタ熱ウイルスは、経口経路で伝染することが知られている外来の動物疾病である。特に、アフリカブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）は、世界で最大の養豚国である中国から急速に拡散している、極めて大型の複雑なＤＮＡウイルスである。ＡＳＦＶは、ブタで高い死亡率を生じ、現在、北米およびほとんどの欧州諸国で外来動物疾病となっている。現在、有効なワクチンは存在せず、このウイルスは経口経路で伝染することが知られている。ＡＳＦＶは、渡洋輸送を模した様々な環境条件に曝された飼料および飼料成分中で生存することができる。ＡＳＦＶは、極めてユニークな二本鎖ＤＮＡウイルスであり、アスファウイルス科(Asfarviridae)およびアスフィウイルス(Asfivirus)属の唯一のウイルスである。重要なことに、ＡＳＦＶには適当な代替ウイルスが存在しない。古典的ブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）は、フラビウイルス科(Flaviviridae)の一本鎖ＲＮＡウイルスである。ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）は、どちらのウイルスにも関連がなく、コロナウイルス科（Coronaviridae）である。これらの３つのウイルスのゲノムは大きさが非常に異なり、ＣＳＦＶの１２．３ｋｂおよびＡＳＦＶの１９０ｋｂに比べてＰＥＤＶは２８ｋｂである。ウイルスは環境中での安定性および消毒剤に対する感受性に関して大きく異なることがよく知られている。同じ科のウイルスであっても不活化率に関して異なる特徴を有する場合があり、これらの３つのウイルスに同じ科のものはない。発表されている研究で、外来動物疾患を引き起こす数種のウイルス間で安定性を比較し、かなりの違いがあることが示されている。さらに、他の従前に発表されている研究で、ＰＥＤＶ、ＡＳＦＶおよびウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ、同じ科で、ＣＳＦＶの代替として使用されるウイルス）間で、飼料成分中での安定性に関してかなりの違いが示されている。飼料成分中での安定性に関する違いは、ＭＣＦＡおよび緩和に対する感受性に関する差異と予測される。よって、他のウイルスまたは細菌に対する緩和剤の効果を、そのウイルス自体に対するその緩和剤の直接的エビデンスなしに、ＡＳＦＶまたはＣＳＦＶに対して拡張または解釈することはできない。

動物飼料および飼料成分中でＡＳＦＶおよびＣＳＦＶの緩和（例えば、不活化）に有効であるとともにブタおよび他の動物に対する経口投与に安全な処理が必要とされる。

本願は、動物飼料または動物飼料成分中のアフリカブタ熱ウイルスおよび／または古典的ブタ熱ウイルスの抑制方法を記載する。これらの方法は、飼料または飼料成分に化学的緩和剤を導入することを含んでなる。化学的緩和剤は、中鎖脂肪酸および／または精油を含んでなり（から本質的になり、またはさらには、からなり）、この化学的緩和剤は、飼料または飼料成分に、１００重量％とする動物飼料または飼料成分の総重量に対して２重量％未満（一般には少なくとも約０．１２５重量％）の含有率で導入される。

別の態様において、動物飼料または動物飼料成分中でのアフリカブタ熱ウイルスおよび／または古典的ブタ熱ウイルスの抑制に使用するための化学的緩和剤が提供される。化学的緩和剤は、中鎖脂肪酸および／または精油を含んでなる。

本明細書にはまた、アフリカブタ熱ウイルスおよび／または古典的ブタ熱ウイルスに対して抵抗性を有する動物飼料および／または動物飼料成分も処理される。これらの飼料または飼料成分は、１００重量％とする動物飼料または飼料成分の総重量に対して約０．１２５重量％～２重量％未満の化学的緩和剤を含んでなる。化学的緩和剤は、中鎖脂肪酸および／または精油を含んでなる。本発明において使用するための処理された動物飼料または動物飼料成分の例としては、ブタ完全食、血粉、ブタ肉骨粉（ＭＢＭ）、噴霧乾燥動物血漿、羽毛粉、鳥類血粉、家禽副産物粉、ビタミンＤ、塩酸リジン、塩化コリン、大豆粕、ドライペットキブル、およびそれらの混合物が挙げられる。

本特許または出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれる。本特許または特許出願の写しはカラー図面とともに、請求し、必要な費用を支払えば特許庁によって提供される。

図１は、種々の濃度の１：１：１ ＭＣＦＡ混合物に曝したＡＳＦＶ（ＢＡ７１Ｖ株）の用量応答不活化曲線を示すグラフであり、データは、陽性対照と比較したウイルス濃度の減少率ともに、０．１２５％～２．０％のＭＣＦＡ濃度に曝した後の力価として示す。 図２は、３０日越境輸送モデルの過程でのＡＳＦＶジョージア２００７ゲノムの検出を示す一連のグラフであり、データは、接種後１、８、１７および３０日目の２倍複製の平均サイクル閾値（Ｃｔ）として示す。 図３は、非処理対照（白いバー）および２８ｄｐｉのＭＣＦＡで処理したサンプル（黒いバー）において３０日越境輸送モデルの終了時にｑＰＣＲにより測定した場合のＡＳＦＶ ＤＮＡの量を示すグラフである。 図４は、種々の濃度の１：１：１ ＭＣＦＡ Ｃ６：Ｃ８：Ｃ１０混合物に曝したＣＳＦＶ（Ｂｒｅｓｃｉａ単離株）の用量応答不活化曲線を示すグラフであり、データは、陽性対照と比較したウイルス濃度の減少率とともに、０．１２５％～２．０％のＭＣＦＡ濃度に曝した後の力価として示す。 図５Ａは、ＭＣＦＡに曝したおよび曝していないブタ腎臓細胞に対するＣＳＦＶ Ｂｒｅｓｃｉａの間接的蛍光抗体検出に関する実験から得られた陽性対照画像である。図５Ｂは、０．６２５％ＭＣＦＡで処理したブタ腎臓細胞に対するＣＳＦＶ Ｂｒｅｓｃｉａの間接的蛍光抗体検出に関する実験から得られた画像である。図５Ｃは、ＭＣＦＡに曝したおよび曝していないブタ腎臓細胞に対するＣＳＦＶ Ｂｒｅｓｃｉａの間接的蛍光抗体検出に関する実験から得られた陰性対照画像である。

本発明は一般に、動物飼料、飼料成分、およびペットフードにおけるアフリカブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）および／または古典的ブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）を抑制する方法に関する。より具体的には、本発明は、種々のタイプの動物およびペットフード成分、ならびに完全飼料ミールおよびペットフード製品中でのＡＳＦＶおよび／またはＣＳＦＶの抑制において使用するための化学的緩和剤に関する。一般に、化学的緩和剤は、中鎖脂肪酸および／または精油を含んでなる。本明細書で使用する場合、「抑制する」または「抑制すること」は、非処理対照と比較した場合の標的微生物（すなわち、ＡＳＦＶまたはＣＳＦＶ）の測定可能なレベルの減少または微生物の増殖率の減少を指す。１以上の態様において、本発明による方法は、動物飼料または動物飼料成分中のＡＳＦＶおよび／またはＣＳＦＶを、例えば、ＲＴ－ＰＣＲおよび／または細胞培養におけるウイルス単離による検出レベルを下回る濃度に抑制するために、有効量の化学的緩和剤を使用する。本明細書で使用する場合、「有効量」は、所望の性能改善を達成するために十分な、有効化合物（例えば、中鎖脂肪酸および／または精油）の生物学的に利用可能なレベルを提供し得る量を指す。好ましい態様において、本発明による方法は、有利には、動物飼料成分の輸送および保管に使用するのに適している。

本発明の１以上の態様において使用するための化学的緩和剤は、中鎖脂肪酸および／または精油を含み得る。１以上の態様において、化学的緩和剤は、中鎖脂肪酸、より具体的には、少なくとも１種類の中鎖脂肪酸を含んでなる（から本質的になる、またはさらには、からなる）。中鎖脂肪酸は、６～１２個の炭素原子の脂肪族テールを有する酸である。１以上の態様において、本発明において使用するための中鎖脂肪酸としては、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、および／またはラウリン酸が含まれる。よって、特定の態様において、化学的緩和剤は、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される。しかしながら、ある特定の他の態様においては、化学的緩和剤はラウリン酸を含まない。よって、このような態様においては、化学的緩和剤は、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択され得る。１以上の態様において、中鎖脂肪酸の混合物が使用され得る。例えば、１以上の態様において、２種類以上の中鎖脂肪酸の混合物が、飼料または飼料成分に導入され得る。１以上の態様において、カプロン酸、カプリル酸、およびカプリン酸の混合物は、約１：１：１の重量比（等分）で飼料または飼料成分に導入される。この組合せは、中鎖脂肪酸の溶解度を高め、経口投与した際にウイルスの不活化およびブタの成長の改善に有効である。しかしながら、他の重量比のカプロン酸、カプリル酸、およびカプリン酸を含んでなる混合物が使用され得ることも本発明の範囲内にある。

１以上の態様において、化学的緩和剤は、精油、より具体的には、少なくとも１種類の精油を含んでなる（から本質的になる、またはさらには、からなる）。精油は、植物に由来する揮発性芳香化合物を含有する、濃縮された疎水性の液体である。本発明の１以上の態様において使用され得るいくつかの異なる精油が存在する。これらの精油の非網羅的一覧として、沈香油（アガー油）、アジョワン油、アンジェリカルート油、アニス油、アギ(Asafoetida)、ペルーバルサム、バジル油、ベイ油、ベルガモット油、ブラックペッパー、ブチュー油、バーチ、樟脳、カンナビスフラワー精油、キャラウェイ油、カルダモン種子油、ニンジン種子油、シダーウッド油、カモミール油、カラムスルート、シナモン油、シスタス種、シトロン、シトロネラ油、クラリセージ、クローブ油、コーヒー、コリアンダー、コストマリー油（バイブルリーフ油）、コスタスルート、クランベリー種子油、キュベブ、クミン油／ブラックシードオイル、サイプレス、シプリオール、カレーリーフ、ダバナ油、ディル油、エレカンパン、ユーカリ油、フェンネル種子油、フェヌグリーク油、ファー、フランキンセンス油、ガランガル、ガルバナム、ゼラニウム油、ジンジャー油、ゴールデンロッド、グレープフルーツ油、ヘナ油、ヘリクリサム、ヒッコリーナッツ油、セイヨウワサビ油、ヒソップ、アイダホタンジー、ジャスミン油、ジュニパーベリー油、ゲッケイジュ、ラベンダー油、リーダム、レモン油、レモングラス、ライム、リツェア・クベバ油、リナロエ、マンダリン、マジョラム、メラレウカ・シー・ティー・トゥリー油、メリッサ油（レモンバーム）、ハッカ油／ミント油、モリンガ油、マウンテン・セイボリー、ヨモギ油、カラシ油（精油）、ミルラ油、マートル、ニーム油またはニームトゥリー油、ネロリ、ナツメグ、オレンジ油、オレガノ油、オリス油、パロサント、パセリ油、パチョリ油、エゴマ精油、ペニローヤル油、ペパーミント油、プチグレン、パイン油、ラベンサラ、レッドシダー、ローマンカモミール、ローズ油、ローズヒップ油、ローズマリー油、ローズウッド油、セージ油、サンダルウッド油、サッサフラス油、セイバリー油、ゴミシ油、スペアミント油、スパイクナード、トウヒ、スターアニス油、タンジェリン、タラゴン油、ティートゥリー油、タイム油、ツガ、ウコン、バレリアン、ベチバー油（クス油）、ベイスギ、ウィンターグリーン、ヤロー油、イランイラン、およびガジュツが含まれる。１以上の態様において、化学的緩和剤は、ニンニク含油樹脂、ウコン含油樹脂、トウガラシ含油樹脂、ローズマリー抽出物、ワイルドオレガノ精油、およびそれらの混合物からなる群から選択される。１以上の態様において、精油の混合物を使用することができる。例えば、１以上の態様において、２種類以上の精油の混合物を飼料または飼料成分に導入することができる。１以上の態様において、等分のニンニク含油樹脂、ウコン含油樹脂、トウガラシ含油樹脂、ローズマリー抽出物、およびワイルドオレガノ精油を含んでなる精油の混合物が飼料または飼料成分に導入される。しかしながら、他の重量比のニンニク含油樹脂、ウコン含油樹脂、トウガラシ含油樹脂、ローズマリー抽出物、およびワイルドオレガノ精油を含んでなる混合物が使用され得ることも本発明の範囲内にある。

１以上の態様において、中鎖脂肪酸および精油、より具体的には、１種類以上の中鎖脂肪酸および１種類以上の精油を含んでなる（から本質的になる、またはさらには、からなる）混合物が化学的緩和剤として使用され得る。しかしながら、特定の他の態様において、中鎖脂肪酸以外には、精油も他のタイプの緩和剤も使用されない。さらに、本発明の態様は、動物飼料、飼料成分、またはペットフードに導入されないホルムアルデヒドなどの毒性化学物質の使用を避ける。よって、１以上の態様において、化学的緩和剤は、１種類以上の中鎖脂肪酸から本質的になる（またはさらには、からなる）。特定の好ましい態様において、化学的緩和剤は、カプロン酸、カプリル酸、およびカプリン酸の混合物から本質的になる（またはさらには、からなる）。

いずれの有効量の化学的緩和剤も使用可能であるが、１以上の態様では、化学的緩和剤は、動物飼料（ペットフードを含む）または飼料成分に、１００重量％とする飼料または飼料成分の総重量に対して約０．０１重量％～約１０重量％、好ましくは約０．０５重量％～約５重量％、より好ましくは約０．１重量％～約２重量％、最も好ましくは約０．５重量％～約０．９重量％の含有率で導入される。有利には、本明細書に記載の化学的緩和剤、特に、中鎖脂肪酸は、従来技術で他の微生物に関して有効であることが示されている用量よりもずっと低い０．６重量％（ＡＳＦＶに関して）および０．５％重量％（ＣＳＦＶに関して）といった低い含有率で、ＡＳＦＶおよびＣＳＦＶの有効な（すなわち、４－対数減衰の）不活化剤である。よって、１以上の態様において、化学的緩和剤は、動物飼料または飼料成分に、１００重量％とする飼料または飼料成分の総重量に対して２重量％未満、１．５重量％未満、１重量％未満、０．９重量％未満、０．８重量％未満、０．７重量％未満、または０．６重量％未満の含有率で導入される。１以上の態様において、例えば、４－対数減衰のＡＳＦＶまたはＣＳＦＶが必要でない場合には、より低用量も使用可能である。１以上のこのような態様において、化学的緩和剤は、動物飼料（ペットフードを含む）または飼料成分に、１００重量％とする飼料または飼料成分の総重量に対して約０．１２５重量％～約０．５重量％の含有率で導入され得る。しかしながら、特定の他の態様において、化学的緩和剤は、動物飼料または飼料成分に、１００重量％とする飼料または飼料成分の総重量に対して少なくとも０．１２５重量％、少なくとも０．２５重量％、少なくとも０．５重量％、少なくとも０．６重量％、少なくとも０．７重量％、少なくとも０．８重量％、少なくとも０．９重量％，または少なくとも１重量％の含有率で導入される。

１以上の態様において、中鎖脂肪酸および／または精油に加えて重硫酸ナトリウムもまた動物飼料または飼料成分に加えてよい。重硫酸ナトリウムは、ＦＤＡにより「一般に安全と認められる」（ＧＲＡＳ）および「天然物」であると見なされる酸性塩である。１以上の態様において、重硫酸ナトリウムは溶解させて溶液とし、細菌増殖を防止または低減するために動物飼料または飼料成分の表面に適用される。１以上の態様において、重硫酸ナトリウム溶液は、ドライペットフードまたはペットフード成分の表面に適用される。例えば、この溶液は、ドライドッグフード（キブル）またはドライキャットフードの表面に適用され得る。１以上の態様において、この溶液は、飼料または成分の表面に、１００重量％とする飼料または飼料成分の総重量に対して約０．１重量％～約２重量％、より好ましくは約０．１５重量％～約１．５重量％、いっそうより好ましくは約０．２重量％～約１重量％の含有率で重硫酸ナトリウムを提供するように適用され得る。

本発明に従って使用される化学的緩和剤は、広範な動物飼料または動物飼料成分を処理するために使用することができる。しかしながら、１以上の態様において、本発明による方法は、ブタ飼料および飼料成分との併用のために特に適している。このような態様において、動物飼料または動物飼料成分は、ブタ完全食、血粉、ブタ肉骨粉（ＭＢＭ）、および噴霧乾燥動物血漿からなる群から選択され得る。１以上の態様において、動物飼料成分は、ビタミンＤ、塩酸リジン、塩化コリン、および大豆粕からなる群から選択される成分を含んでなり得る。他の態様において、化学的緩和剤は、ペットフードおよびペットフード成分とともに使用され得る。１以上の態様において、ペットフードおよびペットフード成分は、ドライドッグフード（キブル）および／またはキャットフードを含んでなる。用語「ペットフード」は、ペットにより消費されることを意図したいずれの組成物も意味し、「ドライ」フードは一般に、当技術分野で、約２０％未満（好ましくは約１５％未満、より好ましくは約１０％未満）の水分含量を有するペットフードを指す。用語「キブル」は、当技術分野で、ドライペットフードのペレットを指して使用される。

本発明の１以上の態様による方法は、動物またはペット飼料の製造において使用され得る。よって、本発明の一態様において、１００重量％とする飼料の総重量に対して約０．０１重量％～約１０重量％、より好ましくは約０．０５重量％～約５重量％、いっそうより好ましくは約０．１重量％～約２重量％、最も好ましくは約０．５重量％～約０．９重量％の化学的緩和剤または化学的緩和剤混合物（本明細書に記載の化学的緩和剤および混合物など）を含んでなる動物飼料またはペットフードが提供される。１以上の態様において、１００重量％とする飼料の総重量に対して２重量％未満、１．５重量％未満、１重量％未満、０．９重量％未満、０．８重量％未満、０．７重量％未満、または０．６重量％未満の化学的緩和剤または化学的緩和剤混合物（本明細書に記載の化学的緩和剤および混合物など）を含んでなる動物飼料またはペットフードが提供される。１以上の態様において、１００重量％とする飼料の総重量に対して約０．１２５重量％～約０．５重量％の化学的緩和剤または化学的緩和剤混合物（本明細書に記載の化学的緩和剤および混合物など）を含んでなる動物飼料またはペットフードが提供される。１以上の態様において、１００重量％とする飼料の総重量に対して少なくとも０．５重量％、少なくとも０．６重量％、少なくとも０．７重量％、少なくとも０．８重量％、少なくとも０．９重量％、または少なくとも１重量％の化学的緩和剤または化学的緩和剤混合物（本明細書に記載の化学的緩和剤および混合物など）を含んでなる動物飼料またはペットフードが提供される。

本発明の態様は、飼料および飼料成分の輸送、特に、国際輸送および保管において使用するために特に好適である。本発明の以前には、中鎖脂肪酸は、米国産業にとって外来の疾病、特に、ウイルスに対する有効な緩和剤であると示されたことはなかった。飼料または成分は、加工の時点でＡＳＦＶおよび／またはＣＳＦＶに汚染されることがある。有利には、本発明の態様は、これらの汚染の蔓延を不活化および抑制するために特に好適である。よって、１以上の態様において、本発明による方法は、加工後に飼料または飼料成分に化学的緩和剤を導入することを含んでなる。化学的緩和剤は、均質な混合物を提供するために十分な時間、飼料または飼料成分と混合され得る。１以上の態様において、本発明による方法は、加工後少なくとも約９０日の輸送および保管、加工後少なくとも約６０日の輸送および保管、加工後少なくとも約４０日の輸送および保管、または加工後少なくとも約３０日の輸送および保管の間、飼料および／または成分中でＡＳＦＶおよび／またはＣＳＦＶを防止または低減し得る。

本発明の態様は有利には、動物またはペット飼料および成分中でＡＳＦＶおよび／またはＣＳＦＶを防止または低減する安全な代替法を提供する。有害な化学物質を使用する従前の方法は、動物のタンパク質およびアミノ酸代謝に対して悪影響を示していた。従前の方法とは異なり、本発明は一般に、無害な化学的緩和剤を、ＡＳＦＶおよび／またはＣＳＦＶの有効な緩和を達成することが見出された用量で使用する。本発明に従って使用される化学的緩和剤は、労働者の安全または環境に本質的にリスクのない天然の代替法である。

本発明の種々の態様のさらなる利点は、本明細書の開示および以下の実施例を検討すれば当業者には自明であろう。本明細書に記載の種々の態様は、本明細書において特に断りのない限り、必ずしも互いに排他的ではないことが認識されるであろう。例えば、１つの態様において記載または描写されている特徴は、他の態様に含まれてもよいが、必ずしも含まれない。よって、本発明は、本明細書に記載の特定の態様の様々な組合せおよび／または統合を包含する。

本明細書で使用する場合、「および／または」という句は、２つ以上の項目の列挙で使用される場合、列挙されている項目のいずれか１つはそれ自体で使用することもできるし、または列挙されている項目の２つ以上の組合せを使用することもできることを意味する。例えば、組成物が成分Ａ、Ｂおよび／またはＣを含有するまたは除外すると記載されている場合、その組成物はＡ単独；Ｂ単独；Ｃ単独；ＡとＢの組合せ；ＡとＣの組合せ；ＢとＣの組合せ；またはＡ、Ｂ、およびＣの組合せを含有または除外する場合がある。

本明細書はまた、本発明の種々の態様に関する特定のパラメーターを定量化するために数値範囲を使用する。数値範囲が示される場合、そのような範囲は、その範囲の下方の値が列挙されているだけのクレーム限定ならびにその範囲の上方の値が列挙されているだけのクレーム限定に文言上の補助を与えると解釈されるものと理解されるべきである。例えば、開示される約１０～約１００の数値範囲は、「約１０以上」（上限がない）と示されているクレームおよび「約１００以下」（下限がない）と示されているクレームに文言上の補助を与える。
本発明は以下の通りである。
［１］動物飼料または動物飼料成分中のアフリカブタ熱ウイルスおよび／または古典的ブタ熱ウイルスの抑制方法であって、
前記飼料または飼料成分に化学的緩和剤を導入することを含んでなり、前記化学的緩和剤は中鎖脂肪酸および／または精油を含んでなり、
前記化学的緩和剤は、１００重量％とする動物飼料または飼料成分の総重量に対して約０．１２５重量％～２重量％未満の含有率で導入される、方法。
［２］前記中鎖脂肪酸が、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される、上記［１］に記載の方法。
［３］前記化学的緩和剤が、２種類以上の中鎖脂肪酸の混合物である、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記化学的緩和剤が、カプロン酸、カプリル酸、およびカプリン酸を含んでなる中鎖脂肪酸の混合物を含んでなる、上記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記化学的緩和剤が、およそ等量のカプロン酸、カプリル酸、およびカプリン酸を含んでなる中鎖脂肪酸の混合物を含んでなる、上記［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記精油が、ニンニク含油樹脂、ウコン含油樹脂、トウガラシ含油樹脂、ローズマリー抽出物、ワイルドオレガノ精油、およびそれらの混合物からなる群から選択される、上記［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記化学的緩和剤が、中鎖脂肪酸の混合物と精油とを含んでなる、上記［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記動物飼料または動物飼料成分が、ブタ完全食、血粉、ブタ肉骨粉（ＭＢＭ）、噴霧乾燥動物血漿、羽毛粉、鳥類血粉、家禽副産物粉、ビタミンＤ、塩酸リジン、塩化コリン、および大豆粕からなる群から選択される、上記［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記動物飼料または動物飼料成分が、ドライペットキブルであり、前記ドライペットキブルの表面に重硫酸ナトリウムを適用することをさらに含んでなる、上記［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記重硫酸ナトリウムが、１００重量％とする動物飼料または飼料成分の総重量に対して約０．１重量％～約２重量％の含有率で前記ドライペットキブルの表面に適用される、上記［９］に記載の方法。
［１１］動物飼料または動物飼料成分中のアフリカブタ熱ウイルスおよび／または古典的ブタ熱ウイルスの抑制において使用するための化学的緩和剤であって、中鎖脂肪酸および／または精油を含んでなる、化学的緩和剤。
［１２］前記中鎖脂肪酸が、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される、上記［１１］に記載の化学的緩和剤。
［１３］２種類以上の中鎖脂肪酸の混合物である、上記［１］または［１２］に記載の化学的緩和剤。
［１４］カプロン酸、カプリル酸、およびカプリン酸を含んでなる中鎖脂肪酸の混合物を含んでなる、上記［１１］～［１３］のいずれかに記載の化学的緩和剤。
［１５］およそ等量のカプロン酸、カプリル酸、およびカプリン酸を含んでなる中鎖脂肪酸の混合物を含んでなる、上記［１１］～［１４］のいずれかに記載の化学的緩和剤。
［１６］前記精油が、ニンニク含油樹脂、ウコン含油樹脂、トウガラシ含油樹脂、ローズマリー抽出物、ワイルドオレガノ精油、およびそれらの混合物からなる群から選択される、上記［１１］～［１５］のいずれかに記載の化学的緩和剤。
［１７］中鎖脂肪酸の混合物と精油とを含んでなる、上記［１１］～［１６］のいずれかに記載の化学的緩和剤。
［１８］およそ等量のニンニク含油樹脂、ウコン含油樹脂、トウガラシ含油樹脂、ローズマリー抽出物、およびワイルドオレガノ精油を含んでなる、上記［１１］～［１７］のいずれかに記載の化学的緩和剤。
［１９］アフリカブタ熱ウイルスおよび／または古典的ブタ熱ウイルスに対する抵抗性を有する、処理された動物飼料または動物飼料成分であって、１００重量％とする動物飼料または飼料成分の総重量に対して約０．１２５重量％～２重量％未満の化学的緩和剤を含んでなり、前記化学的緩和剤は中鎖脂肪酸および／または精油を含んでなり、ここで、前記動物飼料または動物成分はブタ完全食、血粉、ブタ肉骨粉（ＭＢＭ）、噴霧乾燥動物血漿、羽毛粉、鳥類血粉、家禽副産物粉、ビタミンＤ、塩酸リジン、塩化コリン、大豆粕、ドライペットキブル、およびそれらの混合物からなる群から選択される、動物飼料または動物飼料成分。
［２０］上記［１９］に記載のアフリカブタ熱ウイルスおよび／または古典的ブタ熱ウイルスに対する抵抗性を有する処理された動物飼料または動物飼料成分であって、前記動物飼料または動物飼料成分がドライペットキブルであり、前記ドライペットキブルはその表面の重硫酸ナトリウムをさらに含んでなる、動物飼料または動物飼料成分。

以下の実施例は、飼料および飼料成分中のＡＳＦＶおよびＣＳＦＶに対する化学的緩和戦略の有効性を示す。しかしながら、これらの実施例は説明のために示され、本発明の全範囲で限定と見なされるべきものはないと理解されるべきである。
種々の濃度の中鎖脂肪酸混合物（ＭＣＦＡ）をＡＳＦＶ（ＢＡ７１ｖ単離株）およびＣＳＦＶ（Ｂｒｅｓｃｉａ単離株）と希釈および混合するためのプロトコールおよび手順を開発した。本研究は、それらの各細胞培養物、ベロ細胞およびブタ腎臓細胞で行った。第１段階として、ＭＣＦＡを等容量のＣ６：Ｃ８：Ｃ１０（カプロン酸：カプリル酸：カプリン酸）を１：１：１の容量比となるように混合することによって調製する。第２に、ＭＣＦＡ処理物を１０％～０．６２５％の範囲の濃度で調製し、標準的な高濃度のウイルス（１０^６ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）と混合する。ＭＣＦＡはこれらの実験に使用された細胞培養物を破壊せず、各アッセイにおいて陽性対照および陰性対照を含んでいたことが確認されている。予備的結果は、ＭＣＦＡが１０％～０．６２５％で試験した総ての用量でＣＳＦＶおよびＡＳＦＶの両方を効果的に不活化することを示した。

実施例Ｉ
アフリカブタ熱ウイルスの試験
特定のプロトコールおよび手順を用いて、２０％ＤＭＳＯ中の種々の濃度の中鎖脂肪酸混合物をＡＳＦＶ（ＢＡ７１ｖ単離株）とベロ細胞において希釈および混合した。第１段階として、等容量のＣ６：Ｃ８：Ｃ１０を２０％ＤＭＳＯ中１：１：１の容量比となるように混合することによって中鎖脂肪酸を調製した。第２に、中鎖脂肪酸を２％～０．１２５％の範囲の濃度で調製し、標準的な高濃度ＡＳＦＶ（１０^６ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）と混合した。ウイルスの用量応答不活化を決定するために各アッセイに陽性対照を含めた。

結果（表１、図１）は、中鎖脂肪酸処理が、０．７％～２．０％の間で試験した総ての用量で、間接的蛍光抗体試験によって検出不能なレベルにまでＡＳＦＶを効果的に不活化することを示した。０．６％～０．１２５％の中鎖脂肪酸濃度ではＡＳＦＶの用量依存的減少が見られる。細胞培養物で試験した中鎖脂肪酸の最低濃度（０．１２５％中鎖脂肪酸）では、ウイルス力価におよそ０．７５ｌｏｇ_１０ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの減少が見られる。０．２５％の中鎖脂肪酸を含有する場合、ウイルス力価はおよそ９８．２％減少する。０．６％の中鎖脂肪酸を含有する場合には、ウイルス力価のおよそ４－対数減衰が見られる。ウイルス力価の４－対数減衰は、ウイルスの不活化に関して国際獣疫事務局（ＯＩＥ）が記載している標準である。まとめると、本発明者らは、中鎖脂肪酸は細胞培養物中のＡＳＦＶの有効な不活化剤であること、およびおよそ４－対数減衰に必要とされる用量は０．６％であり、１％の標準含有率よりもずっと低い用量であることを示した。

９種類の高リスク成分中、１％（重量％）の中鎖脂肪酸含有率も、様々な環境温度および湿度条件を模した３０日越境輸送モデルにおいてＡＳＦＶジョージア２００７単離株を用い、ＡＳＦＶ生存に関して試験した。ＡＳＦＶジョージア２００７は、現在、中国で循環している高病原性ＡＳＦＶ単離株である。高リスク飼料成分には、大豆粕（通常）、大豆粕（オーガニック）、大豆油粕、コリン、モイストキャットフード、モイストドッグフード、ドライドッグフード、ポークソーセージの皮、および完全飼料が含まれる。ＡＳＦＶ ＤＮＡの検出および定量はｑＰＣＲにより行い、非処理の接種飼料と中鎖脂肪酸で処理した接種飼料を比較した。最初の試験では、飼料を、接種後日数（ｄｐｉ）０日のＡＳＦＶ接種直前に、Ｃ６：Ｃ８：Ｃ１０を１：１：１比で含む１％中鎖脂肪酸で処理した。ＰＣＲ結果は、総ての非処理対照サンプルおよび０ｄｐｉのＭＣＦＡ処理サンプルが１、８、１７および３０日目にＡＳＦＶ ＤＮＡ陽性であったことを示した（図２）。図２で、非処理対照（白四角）および０ｄｐｉのＡＳＦＶ接種直前にＭＣＦＡで処理したサンプル（黒四角）に関するデータを示す。総てのサンプルが３０日越境輸送モデルの終了時に検出可能なＡＳＦＶ ＤＮＡを有した。Ｃｔ値＞４０を陰性と見なした。注：ＰＣＲはウイルスＤＮＡを検出するが、その感染力を調べるものではない。

第２の試験では、ＡＳＦＶ ＤＮＡの検出および定量を非処理の接種飼料と２８ｄｐｉに１：１：１の１％中鎖脂肪酸で処理した、中鎖脂肪酸処理した接種飼料を比較した。結果は、総ての非処理サンプルおよび２８ｄｐｉの中鎖脂肪酸処理サンプルが３０ｄｐｉにＡＳＦＶ ＤＮＡ陽性であったことを示した（図３）。図３で、データは、２反復の平均サイクル閾値（Ｃｔ）として示す。総てのサンプルが越境輸送モデルの終了時にＡＳＦＶ ＤＮＡ陽性であった。Ｃｔ値＞４０を陰性と見なした。

次に、非処理の接種飼料および０ｄｐｉおよび２８ｄｐｉの両方において１％中鎖脂肪酸で処理した接種飼料を、ＰＣＲにより検出されたＡＳＦＶ ＤＮＡに感染力があるかどうかを判定するために、ブタ肺胞マクロファージでのウイルス単離によって試験した。ウイルス単離は、総ての無処理陽性対照には感染性ウイルスが存在したが、０ｄｐｉまたは２８ｄｐｉのいずれかに中鎖脂肪酸で処理したいずれのサンプルにも感染性ウイルスは検出できなかったことを示した（表２）。感染性ウイルスは、陽性の無処理サンプルにおいて、ＡＳＦＶ ｐ３０タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いて検出された。

０ｄｐｉまたは２８ｄｐｉのいずれかにおいて中鎖脂肪酸で処理したサンプルを、次にさらに、感染性ウイルスの存在を評価するために養豚ブタ生物検定モデルで試験した。中鎖脂肪酸で処理した飼料から得たサンプルを筋肉内に注射した（これが感染力のあるＡＳＦＶを検出するための最も高感度の方法であったため）。用いるブタの頭数を減らすために１つまたは２つのサンプルをブタに注射した。プールしたサンプルは定量的ＰＣＲ結果に基づいた。０ｄｐｉに中鎖脂肪酸で処理した総ての飼料サンプルにおいて、ブタ生物検定で感染性ＡＳＦＶは陰性であった（表３）。２８ｄｐｉに中鎖脂肪酸で処理した飼料サンプルは、２サンプルを除く総てのサンプルで、ブタ生物検定において感染性ＡＳＦＶが陰性であった（表３）。これら２つの飼料サンプル（一方または両方に感染性ＡＳＦＶが存在した可能性がある）は、大豆粕（オーガニック）およびドライドッグフードであった。これらの２つのサンプルを、脾臓のウイルス単離でＡＳＦＶが検出された１頭のブタに注射した。総合すると、本発明者らのデータは、中鎖脂肪酸は細胞培養物および飼料成分中の感染性ＡＳＦＶの有効な緩和剤であることを裏づける。

実施例ＩＩ
古典的ブタ熱ウイルスの試験
細胞培養物中のＣＳＦＶに対するＭＣＦＡの効果を表４、ならびに図４および図５Ａ～５Ｃに示す。種々のレベルの中鎖脂肪酸処理（１：１：１比のＣ６：Ｃ８：Ｃ１０）を、細胞培養モデルにおいてＣＳＦＶ Ｂｒｅｓｃｉａ単離株のウイルス力価の不活化または低減における有効性に関して試験した。１０％～０．５％で試験したＭＣＦＡレベルは、ＣＳＦウイルス力価を、ブタ腎臓細胞での間接的蛍光抗体試験によって検出可能なレベルを下回るレベルに低減した。図５Ｂに示されるように、ＣＳＦＶは、ＭＣＦＡ処理後に検出可能であった。ＣＳＦＶウイルス力価の用量依存的低減が、０．４％～０．１２５％のレベルでＭＣＦＡに曝した後に示された。試験した最低のＭＣＦＡ含有率（０．１２５％）は、緩和を行わなかった陽性対照と比較して、ウイルス力価に８２．２％の低減をもたらした。

また、越境輸送環境条件に曝した飼料成分中でのＣＳＦＶ生存に対するＭＣＦＡの効果も試験した。１％ＭＣＦＡ混合物（１：１：１比のＣ６：Ｃ８：Ｃ１０）を、２種類の飼料成分中でＣＳＦＶを不活化するその能力に関して試験したところ、輸送を模した３７日越境輸送モデルでＣＳＦＶの生存を裏づけた。試験したこれら２つの成分には、大豆粕（通常）およびポークソーセージの皮が含まれていた。ＭＣＦＡ混合物を飼料成分に、接種後日数（ｄｐｉ）０日のＣＳＦＶ接種（１０^５ＴＣＩＤ_５０）前に加え飼料成分中にＭＣＦＡを混合するためにボルテックスで撹拌した。１ｄｐｉという早期に、ＭＣＦＡで処理したサンプルはウイルス単離および力価測定で陰性であったが、陽性対照は、大豆粕（通常）およびポークソーセージの皮に関してそれぞれ１０^４．３ ＴＣＩＤ_５０および１０^３．７ ＴＣＩＤ_５０の検出可能なＣＳＦＶ力価を有していた。３７ｄｐｉまで、総てのサンプル（無処理陽性対照を含む）はウイルス単離および力価測定で陰性であった。ＭＣＦＡで処理した、および処理しなかった大豆粕（通常）サンプルからの上清を３７日越境輸送モデルの終了時に採取し、３週齢のブタ生物検定において筋肉内注射により試験した。無処理の大豆粕サンプルはブタ生物検定でＣＳＦＶ陽性であったが、ＭＣＦＡで処理した大豆粕サンプルはブタ生物検定でＣＳＦＶ陰性であり、越境輸送の条件に曝した大豆粕中でのＣＳＦＶの感染性の排除におけるＭＣＦＡの有効性が証明された。

Claims (23)

1. 動物飼料または動物飼料成分中のアフリカブタ熱ウイルスの抑制方法であって、
   前記飼料または飼料成分に化学的緩和剤を導入することを含んでなり、前記化学的緩和剤は中鎖脂肪酸を含んでなり、
   前記化学的緩和剤は、１００重量％とする動物飼料または飼料成分の総重量に対して０．１２５重量％～２重量％未満の含有率で導入される、方法。
2. 前記化学的緩和剤がさらに精油を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記中鎖脂肪酸が、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記化学的緩和剤が、２種類以上の中鎖脂肪酸の混合物である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記化学的緩和剤が、カプロン酸、カプリル酸、およびカプリン酸を含んでなる中鎖脂肪酸の混合物を含んでなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記化学的緩和剤が、およそ等量のカプロン酸、カプリル酸、およびカプリン酸を含んでなる中鎖脂肪酸の混合物を含んでなる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記精油が、ニンニク含油樹脂、ウコン含油樹脂、トウガラシ含油樹脂、ローズマリー抽出物、ワイルドオレガノ精油、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２または請求項２を直接的または間接的に引用する請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記化学的緩和剤が、中鎖脂肪酸の混合物と精油とを含んでなる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記動物飼料または動物飼料成分が、ブタ完全食、血粉、ブタ肉骨粉（ＭＢＭ）、噴霧乾燥動物血漿、羽毛粉、鳥類血粉、家禽副産物粉、ビタミンＤ、塩酸リジン、塩化コリン、および大豆粕からなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記動物飼料または動物飼料成分が、ドライペットキブルであり、前記ドライペットキブルの表面に重硫酸ナトリウムを適用することをさらに含んでなる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記重硫酸ナトリウムが、１００重量％とする動物飼料または飼料成分の総重量に対して０．１重量％～２重量％の含有率で前記ドライペットキブルの表面に適用される、請求項１０に記載の方法。
12. 動物飼料または動物飼料成分中のアフリカブタ熱ウイルスの抑制において使用するための化学的緩和剤であって、中鎖脂肪酸を含んでなる、化学的緩和剤。
13. 前記化学的緩和剤がさらに精油を含む、請求項１２に記載の化学的緩和剤。
14. 前記中鎖脂肪酸が、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１２または１３に記載の化学的緩和剤。
15. ２種類以上の中鎖脂肪酸の混合物である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の化学的緩和剤。
16. カプロン酸、カプリル酸、およびカプリン酸を含んでなる中鎖脂肪酸の混合物を含んでなる、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の化学的緩和剤。
17. およそ等量のカプロン酸、カプリル酸、およびカプリン酸を含んでなる中鎖脂肪酸の混合物を含んでなる、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の化学的緩和剤。
18. 前記精油が、ニンニク含油樹脂、ウコン含油樹脂、トウガラシ含油樹脂、ローズマリー抽出物、ワイルドオレガノ精油、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１３または請求項１３を直接的または間接的に引用する請求項１４～１７のいずれか一項に記載の化学的緩和剤。
19. 中鎖脂肪酸の混合物と精油とを含んでなる、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の化学的緩和剤。
20. およそ等量のニンニク含油樹脂、ウコン含油樹脂、トウガラシ含油樹脂、ローズマリー抽出物、およびワイルドオレガノ精油を含んでなる、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の化学的緩和剤。
21. アフリカブタ熱ウイルスに対する抵抗性を有する、処理された動物飼料または動物飼料成分であって、１００重量％とする動物飼料または飼料成分の総重量に対して０．１２５重量％～２重量％未満の化学的緩和剤を含んでなり、前記化学的緩和剤は中鎖脂肪酸を含んでなり、ここで、前記動物飼料または動物成分はブタ完全食、血粉、ブタ肉骨粉（ＭＢＭ）、噴霧乾燥動物血漿、羽毛粉、鳥類血粉、家禽副産物粉、ビタミンＤ、塩酸リジン、塩化コリン、大豆粕、ドライペットキブル、およびそれらの混合物からなる群から選択される、動物飼料または動物飼料成分。
22. 前記化学的緩和剤がさらに精油を含む、請求項２１に記載の処理された動物飼料または動物飼料成分。
23. 請求項２１に記載のアフリカブタ熱ウイルスに対する抵抗性を有する処理された動物飼料または動物飼料成分であって、前記動物飼料または動物飼料成分がドライペットキブルであり、前記ドライペットキブルはその表面の重硫酸ナトリウムをさらに含んでなる、動物飼料または動物飼料成分。
    

Images