JP7423331B2

JP7423331B2 - 皮膚光老化抑制・改善剤のスクリーニング方法

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Publication number: JP7423331B2
Application number: JP2020016178A
Authority: JP
Inventors: 奈緒美齊藤
Original assignee: Naris Cosmetics Co Ltd
Current assignee: Naris Cosmetics Co Ltd
Priority date: 2020-02-03
Filing date: 2020-02-03
Publication date: 2024-01-29
Anticipated expiration: 2040-02-03
Also published as: JP2021124313A

Description

皮膚は、加齢に伴い老化して弾力を喪失し、ハリの低下や、シワ、たるみ等の変化を生じる。特に顔面など慢性的な紫外線の影響を受けやすい部位では、顕著にシワやたるみ、シミが形成する。これら紫外線暴露部で起こる皮膚老化は特に光老化と呼ばれ、この防止および改善は皮膚外用剤研究者にとって、最も大きな課題の一つである。

皮膚の支持組織である真皮は膠原線維（コラーゲン線維）、弾性線維（エラスチン線維）等の細胞外基質が主となり構成される。コラーゲン線維は皮膚の強度、エラスチン線維は皮膚の柔軟性、弾力性に寄与する。光老化部真皮では、コラーゲン線維の減少、エラスチン線維の異常沈着（線維肥厚や無定形塊蓄積など）が生じていることが知られており、これら線維の異常は皮膚の強度や柔軟性の喪失をもたらす。光老化部位では皮膚の硬度が増加しており、また特に光老化により生じたシワ部位では皮膚の弾力性が低下していることが報告されていることから、光老化の進行には異常沈着したエラスチン線維が関与すると考えられる（非特許文献１、２）

エラスチン線維は、前駆体であるトロポエラスチンタンパク質から切断され生成するエラスチンタンパク質がミクロフィブリル上に連なり、架橋されることで弾力性を持った線維として形成される。また形成されたエラスチン線維はエラスターゼ等の細胞外基質切断酵素により切断され、ターンオーバーが生じることも知られている。光老化部で観察されるエラスチン線維の肥厚・無定形塊蓄積は、長期間の紫外線への暴露によりエラスチン線維を構成するエラスチンタンパク質が変性し、その結果エラスターゼ等分解酵素による分解速度が低下し、変性したエラスチン線維が真皮で異常沈着することで生じると考えられる。

従来用いられてきたシワ、たるみ、ハリ等を改善する光老化改善剤は、コラーゲン線維、エラスチン線維を増加させるまたはそれらの分解を抑制することを目的としたものが多く用いられてきた。しかしながら、特にエラスチン線維を対象にしたものにおいては、エラスチン線維を増加またはその分解を抑制することにより、光老化部位で生じた弾力性の低下を補うためにエラスチン線維を増加させることを目的としたものである。そのため、光老化部位で生じるエラスチン線維の異常沈着を抑制することは出来ず、光老化の進行に対して根本的な改善をもたらすものではなかった。

一方でタンパク質のニトロ化は、生体内で発生した活性窒素種によって生じるタンパク質翻訳後修飾のひとつであり、タンパク質を構成する芳香族アミノ酸のチロシン、トリプトファンの残基中のベンゼン環にニトロ基が付与されたものである。ニトロ化反応はアミノ酸中のベンゼン環が、活性窒素種により形成されるニトロニウムイオン（ＮＯ_２ ^＋）や二酸化窒素ラジカルなどと求電子置換反応をおこすことで生じる（非特許文献３）。生体内に存在する多くのタンパク質中のトリプトファンの含有率はチロシンのそれよりもはるかに小さく、タンパク質のニトロ化反応は主にチロシン残基に生じると考えられている（非特許文献４）。タンパク質のニトロ化が生じると、酵素やチロシンキナーゼ型受容体の機能低下を引き起こすことで、細胞機能に影響を及ぼすことが知られる（非特許文献５）。また、タンパク質中のニトロチロシンは加齢に伴う数々の疾患（動脈硬化や脳虚血疾患など）で蓄積することが知られており、これらの疾患に関与することが報告されている（非特許文献６）。ニトロチロシンは皮膚中に存在することが知られており、特に角層中に存在するニトロチロシンは皮膚色と関連する（特許文献１、特許文献２）。しかしながら光老化部皮膚でのエラスチンの異常沈着との関係については知られていなかった。

特開２０１７－１８１４２３特開２０１７－１７８８９９

Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、２０１９、２８（８）：９１４－９２１Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．、２００７、４７（３）：２３３－９Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、２００９、２２（５）：８９４－８９８Ｆｒｏｎｔ．Ｃｈｅｍ．、２０１６、３：７０Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２００８、５７（４）：８８９－９８Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００、２９０（５４９３）：９８５－９

このような状況下、本発明者は光老化部皮膚でのエラスチンの異常沈着にかかわる新たな因子を探索したところ、光老化部皮膚で異常沈着しているエラスチン線維の構成アミノ酸にはニトロ化修飾が生じていることを見出した。そこで鋭意検討の結果、エラスチンのニトロ化は紫外線照射により増加すること、またニトロ化はエラスチンの凝集を促進する特性があること、およびエラスターゼによる分解に対して抵抗性を付与することを見出した。つまり、紫外線照射によりエラスチン線維に生成したニトロ化物が光老化部でのエラスチン線維の異常沈着に寄与することを突き止めた。

更に発明者は、さらにニトロ化して凝集したエラスチン線維は硬度が増加し、弾力性が低下すること、加えて真皮に存在する線維芽細胞の活性にも影響を及ぼすことを見出した。

以上の新知見から、ニトロ化物の生成を抑制する、またニトロ化物を分解することで皮膚真皮中のニトロ化エラスチンの存在量を制御することにより、光老化に伴うエラスチン線維の異常沈着を抑制し、皮膚の硬化および皮膚弾力性の低下、それに伴うシワ、たるみの形成、ハリの低下等を予防又は改善することができる物質を評価、選択することができると確信し、本発明に至った。

皮膚の硬化、皮膚弾力性の低下を抑制することにより、光老化に伴う皮膚のシワ、たるみ、ハリの低下を予防および改善することができる物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。

エラスチンタンパク質のアミノ酸残基に生じるニトロ化物量、およびニトロ化により惹起されるエラスチンタンパク質の凝集を指標とすることで上記課題を解決した。

本発明は、以下のスクリーニング方法を提供するものである。
〔１〕ニトロ化物量を指標とした光老化改善剤のスクリーニング方法
〔２〕ニトロ化物量を指標としたシワ、ハリ、たるみ改善剤のスクリーニング方法
〔３〕ニトロ化物量を指標とした皮膚の弾力性低下改善剤のスクリーニング方法
〔４〕ニトロ化物量を指標とした皮膚の硬化抑制剤のスクリーニング方法
〔５〕ニトロ化物量を指標とした細胞外基質タンパク質の凝集改善剤のスクリーニング方法
〔６〕前記ニトロ化物量の指標が、ニトロ化物量の減少である〔１〕乃至〔５〕いずれかに記載のスクリーニング方法。
〔７〕前記ニトロ化物量の減少が、ニトロ化物の新規生成の抑制、または既存のニトロ化物の分解を作用機序とする〔１〕乃至〔６〕いずれかに記載のスクリーニング方法。
〔８〕前記ニトロ化物が芳香族アミノ酸のニトロ化物またはこれを構成アミノ酸とするニトロ化タンパク質である〔１〕乃至〔７〕いずれかに記載のスクリーニング方法。
〔９〕前記芳香族アミノ酸のニトロ化物がニトロチロシン、３，５－ジニトロチロシン、ニトロトリプトファン、ニトロフェニルアラニン、２，４－ジニトロフェニルアラニン、ニトロシステインから選択される少なくとも１種以上である〔１〕乃至〔８〕いずれかに記載のスクリーニング方法。
〔１０〕前記細胞外基質タンパク質がエラスチンである〔５〕記載のスクリーニング方法。
〔１１〕ニトロ化に起因するエラスチンの凝集を指標とした光老化改善剤のスクリーニング方法
〔１２〕ニトロ化に起因するエラスチンの凝集を指標としたシワ、ハリ、たるみ改善剤のスクリーニング方法
〔１３〕ニトロ化に起因するエラスチンの凝集を指標とした皮膚の弾力性低下改善剤のスクリーニング方法
〔１４〕ニトロ化に起因するエラスチンの凝集を指標とした皮膚の硬化抑制剤のスクリーニング方法

本発明によれば、ニトロ化物量を指標に用いることにより、光老化に伴うエラスチン線維の異常沈着を抑制する新たな物質のスクリーニング方法が提供される。加えて、ニトロ化物量またはエラスチンの凝集を指標とすることで、皮膚の硬度の増加、皮膚弾力性の低下を抑制することができ、それに伴うシワ、たるみの形成、ハリの低下を改善する新たな物質のスクリーニング方法が提供される。

非露光部および光老化部皮膚切片中のエラスチン線維、ニトロチロシンの局在を示す図である。ＵＶ－Ａの照射により増加したニトロ化タンパク質量を示す図である。ＵＶ－Ａの照射により増加したニトロ化エラスチン量を示す図である。ニトロ化エラスチンの凝集を示す図である。ニトロ化エラスチン線維の凝集を示す図である。エラスターゼによるニトロ化エラスチンの分解率を示す図である。ニトロ化エラスチンゲルシートの硬度を示す図である。ニトロ化エラスチンゲルシートの弾力性を示す図である。ニトロ化エラスチンファイバー上で培養した線維芽細胞の遺伝子発現量を示す図である。各種被験物質のニトロチロシン生成抑制活性を示す図である。各種被験物質のニトロチロシンの分解活性を示す図である。

本発明は、エラスチン線維の凝集を抑制し、皮膚の硬化および皮膚弾力性の低下、それに伴うシワ、たるみの形成、ハリの低下といった光老化の兆候を予防又は改善することができる物質を評価、選択する方法である。

本発明で指標となるニトロ化物は、化合物としてのニトロ基含有化合物のほか、ニトロ化されたペプチド或いはタンパク質が挙げられる。ニトロ基含有化合物としてはニトロチロシンや３，５－ジニトロチロシン、ニトロトリプトファン、ニトロフェニルアラニン、２，４－ジニトロフェニルアラニン、Ｓ－ニトロシステイン等、ニトロ化タンパク質を構成するアミノ酸残基となりうる化合物が挙げられる。またニトロ化されたペプチドあるいはタンパク質としては、前述のアミノ酸残基となりうる化合物を構成物中に含むペプチドまたはタンパク質が挙げられる。

本発明の「ニトロ化物量を指標とする」とは、任意の方法を用いてニトロ化物の存在量を効果判定の基準にするという趣旨である。例えば、被験物質の存在により、ニトロ化物量を無添加群より減少させることができる場合、効果ありと判定することができる。なおこの時のニトロ化物量の減少は、ニトロ化物の新規生成の抑制による場合、または既存のニトロ化物の分解による場合のどちらでもあり得る。いずれの作用機序に起因するかは後述する方法により選別することができる。

ニトロ化物の新規生成の抑制を作用機序とするニトロ化物量減少物質をスクリーニングする場合は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、またはこれらの含有物とニトロ化試薬とを混合し、ニトロ化物を生成させる系において、被験物質の存在の有無により系中に生成されるニトロ化物を減少させる物質を選択すればよい。この場合において、例えばアミノ酸としては、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、システイン等を用いることができる。ペプチドとしては、前述のアミノ酸を含むアミノ酸が約２－５０個程度連続して結合した構造をとる物質を用いることができる。タンパク質としては、前述のアミノ酸を構成物中に含みペプチドよりも分子量が大きな物質であり、例えばエラスチンやコラーゲン等の細胞外基質タンパク質のほか、アルブミンやカゼイン、スキムミルク等のタンパク質試薬等を用いることができる。また、これらの含有物としては、例えばテープストリッピングや研磨材等により収集した角層や、真皮線維芽細胞等の培養細胞の細胞破砕物などの混合物を用いることができる。
ニトロ化試薬としては、ペルオキシナイトライト等の活性窒素種を直接用いるほか、試験系中に活性窒素種を発生させることができる化合物群を混合して用いても良い。例えば、一酸化窒素とスーパーオキシドアニオンを混合する、またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）とＮａＮＯ_２、過酸化水素等と混合することによる。加えて、ニトロニウムイオンを発生させるテトラニトロメタンや硝酸などの試薬等を用いることもできる。このほか、塩化ニトロイルやニトロソペルオキシカルボキシレート、またアジ化ナトリウムおよびカタラーゼ等の試薬を用いることもできる。ニトロ化自体は公知の手法を用いることができる。また本発明では、化合物あるいはタンパク質含有物と被験物質、ニトロ化試薬を混合する順番やタイミングは問わず、両者が試験系中で共存するタイミングがあればよい。

既存のニトロ化物の分解を作用機序とするニトロ化物量減少物質をスクリーニングする場合は、任意のニトロ化物と被験物質を混合したとき、一定時間後にニトロ化物の存在量を減少させるものを選択すればよい。ニトロ化物と被験物質を混合する順番やタイミングは問わず、両者が試験系中で共存するタイミングがあればよい。
この場合に使用するニトロ化物は前述のニトロ化物をそのまま使用する他、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、またはこれらの含有物とニトロ化試薬とを反応さてニトロ化物としたものを使用することができる。この場合は、両者を十分に反応させ、反応が終了したものを用いることが好ましい。

ニトロ化物の測定方法は、公知の方法で行うことができる。例えば、吸光度法、免疫染色法、ウエスタンブロッティング、放射免疫測定（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＥＬＩＳＡ、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、質量分析法、ＮＭＲ法等を用いて直接的に存在量を測定することができる。また、ニトロ化物としてニトロ化ペプチド或いはニトロ化タンパク質量を測定する場合は、例えばニトロ化ペプチド或いはニトロ化タンパク質を酵素処理等にて分解し、得られた単離ニトロ基や単離ニトロ化アミノ酸残基の量を測定したものをニトロ化ペプチド量あるいはニトロ化タンパク質量とし、これらをニトロ化物量として把握しても良い。
また、ニトロ化物の新規生成の抑制を作用機序とするニトロ化物量減少物質をスクリーニングする場合には、上記の直接的な測定方法に加え間接的にニトロ化物量を測定する方法も用いることができる。間接的なニトロ化物測定方法として、反応後に系中に残存するニトロ化試薬の存在量や、被験物質とニトロ化試薬が反応して生成した反応副産物の存在量を測定することで、系中に存在するニトロ化物量を間接的に推定することもできる。例えば、被験物質を未添加の試験系と比較して、被験物質が存在する系中において反応後系中にニトロ化試薬の存在量が多い場合、反応していないニトロ化試薬が多く反応生成物のニトロ化物の存在量が少ないことが推定される。また、被験物質を未添加の試験系と比較して、被験物質が存在する系中において、被験物質とニトロ化試薬の反応により生成する反応副産物の存在量が多い場合、ニトロ化物量の存在量が少ないことが推定される。このようにニトロ化物の新規生成の抑制を作用機序とするニトロ化物量減少物質をスクリーニングする場合のニトロ化物の測定方法には、直接的な測定に加えて間接的な測定によりニトロ化物量を把握してもよい。

本発明における「ニトロ化に起因するエラスチンの凝集を指標」とした試験で用いるエラスチンは、特に限定されないが、ヒト、ラット、ウシ、ウサギ、サケ等を含む脊椎動物から抽出された、成熟したエラスチン線維あるいはそれを構成するエラスチンタンパク質を用いることができる。エラスチンタンパク質としては成熟したエラスチン線維から抽出された可溶性エラスチンタンパク質または不溶性エラスチンタンパク質、またはエラスチン線維の前駆体タンパク質であるトロポエラスチンタンパク質、およびそれらの加水分解物等が用いられる。また、上記生物のトロポエラスチン遺伝子を大腸菌や酵母等の微生物細胞にトランスフェクションし、人工的に産生させたリコンビナントのトロポエラスチンタンパク質やエラスチン線維、あるいは大腸菌やコムギ胚芽、培養細胞など抽出液中の酵素を用いた無細胞系にて産生されたリコンビナントのトロポエラスチンタンパク質やエラスチン線維を用いることもできる。加えて、これらの方法にて作製されたトロポエラスチンタンパク質を用い、人工的に架橋し調製したエラスチン線維を用いてもよい。

本発明における「ニトロ化に起因するエラスチンの凝集」とは、エラスチンがニトロ化されたことによって生じるエラスチン線維又はエラスチンタンパク質の分子若しくは複合体を含む重合集合体が形成された状態をさし、可視的な沈殿物が形成される程度にまで達したものも含まれる。エラスチンの重合集合体の重合形態は、分子間イオン結合、疎水相互作用、ファンデルワールス力等によるものを含まれる。

本発明でいう「ニトロ化に起因するエラスチンの凝集を指標とする」とは、ニトロ化によって生じるエラスチンの凝集の有無、程度を効果判定の基準にするという趣旨である。例えば、被験物質の添加により、エラスチンタンパク質またはエラスチン線維にニトロ化処理を行った際の重合集合体の形成を抑制することができる場合、効果ありと判定することができる。凝集の評価方法としては、公知の方法を用いることができる。電気泳動やゲル浸透クロマトグラフィー、限外濾過法、質量分析計等にてタンパク質の重合集合体の分子量を評価する方法において凝集の有無や程度を判断することができ、例えばニトロ化処理を行ったエラスチンタンパク質の分子量が、ニトロ化処理を行っていないエラスチンタンパク質のそれと比べて２倍以上大きい分子量の物質が増加した場合、重合集合体が増加・形成されたと判断することができる。また、チオフラビンＴ等、凝集分子間に保持される凝集指示薬等を用いることで凝集の有無や程度を判断することもできる。あるいは凝集にともなう溶液の屈折率の変化や凝集沈殿物の発生を光散乱法や吸光度法、または凝集に伴う分子形態の変化を顕微鏡等にて目視で直接評価することで凝集の形成を判断することもできる。ニトロ化処理を行ったエラスチン線維については、走査型電子顕微鏡等の微細構造を観察できる顕微鏡を用いて分子同士が隣接し接触した凝集形態に変化したことを直接観察することで凝集の有無や程度を判断することができる。凝集の評価方法は、上記に限定されない。

被験物質は、特に制限はない。動物由来エキス、菌類の培養物、又はこれらの酵素等処理物、化合物又はその誘導体等であっても被検物質として用いることが出来、液状の他、粉末状、ジェル状等であっても差し支えない。被験物質に応じてニトロ化量の分析方法、およびエラスチンの凝集の分析方法を適宜選択すればよい。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

＜実験１＞非露光部および光老化部皮膚切片中のエラスチン線維およびニトロチロシンの局在
以下の手順で、皮膚切片中のエラスチン線維、ニトロチロシンを検出した。
インフォームドコンセントを得たのちに採取した光老化部皮膚（前腕部、６０代男性由来）、正常皮膚（腹部、３０代男性由来）をホルマリン固定したのちパラフィンに包埋して切片を作成し、一次抗体に抗ニトロチロシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、エラスチン抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）、二次抗体にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗マウス抗体（Ａｂｃａｍ社）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識抗ウサギ抗体（Ｉｖｎｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡（キーエンス社）にて蛍光像を観察した。
図１に示すように、非露光部皮膚では、エラスチン線維は真皮全体に分布しており、ニトロチロシンとは共局在していない。一方、露光部皮膚では真皮上部にエラスチン線維が多数沈着しており、かつその一部にニトロチロシンが共局在していることが確認され、露光部皮膚にニトロ化エラスチンが存在することが示唆された。

＜実験２＞ＵＶ照射によるニトロ化タンパク質量の増加
以下の手順で、ＵＶを照射した線維芽細胞で生じるニトロ化タンパク質を検出した。
ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清１０％を加えたダルベッコＭＥＭ（Ｄ－ＭＥＭ）培地に懸濁し、３０ｍｍ培養ディッシュに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２／９５％空気の加湿条件で５日間培養した。培地を捨て、ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ＰＢＳ（－））を添加した後、ＵＶクロスリンカー（ＡｎａｌｙｔｉｋＪｅｎａ社）を用いて２Ｊ／ｃｍ^２の強度で細胞にＵＶ－Ａを照射した。ディッシュ中のＰＢＳ（－）を捨て、新しい血清含有Ｄ－ＭＥＭ培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２／９５％空気の加湿条件で３日間培養した。培養終了後、培地を捨て、ＰＢＳ（－）で細胞を洗浄した後、ＲＩＰＡＢｕｆｆｅｒ（０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０．５％デオキシコール酸、１ｍＭＰｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、１０μｇ／ｍＬアプロチニン）を添加して細胞を溶解し回収した後、９５℃で５分間加熱し、超音波破砕処理を行った。細胞破砕物中の総タンパク質量はＢＣＡ法、ニトロチロシン量はＮＷＬＳＳ^ＴＭＮｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅＥＬＩＳＡ（ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＳｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ社）にて定量した。
図２に示すように、ＵＶ－Ａを照射したサンプルでは、無照射のコントロールのサンプルに対して線維芽細胞破砕物中のニトロチロシン量が増加していることが確認され、ＵＶ－Ａ照射によりニトロ化タンパク質が増加することが示された。

＜実験３＞ＵＶ照射によるニトロ化エラスチンタンパク質量の増加
以下の手順で、ＵＶを照射した線維芽細胞で生じるニトロ化エラスチンを検出した。
ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清１０％を加えたダルベッコＭＥＭ（Ｄ－ＭＥＭ）培地に懸濁し、３０ｍｍ培養ディッシュに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２／９５％空気の加湿条件で５日間培養した。培地を捨て、ＰＢＳ（－）を添加した後、ＵＶクロスリンカー（ＡｎａｌｙｔｉｋＪｅｎａ社）を用いて１－２Ｊ／ｃｍ^２の強度で細胞にＵＶ－Ａを照射した。ディッシュ中のＰＢＳ（－）を捨て、新しい血清含有Ｄ－ＭＥＭ培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２／９５％空気の加湿条件で１－３日間培養した。これを５回繰り返しながら、計１７日間培養した。培養終了後、培地を捨て、ＰＢＳ（－）で細胞を洗浄した後、ＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（０．５％ＳＤＳ、２ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍＬアプロチニン）を添加して細胞を溶解し回収した後、９５℃で５分間加熱し、超音波破砕処理を行った。ここに５倍量のＩＰＢｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１ｍＭＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍＬアプロチニン）を添加し混合したものをＴｏｔａｌＦｒａｃｔｉｏｎとした。ＴｏｔａｌＦｒａｃｔｉｏｎの細胞破砕物２００μｇとマグネチックビーズ標識抗ニトロチロシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）２０μＬを混合し、４℃で一晩転倒混和した。遠心分離にてビーズ標識抗体複合体を分離後、上清を破棄し沈査に２×ＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒ（０．１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ＳＤＳ、１０％２－メルカプトエタノール、２０％グリセロール、０．１％ブロモフェノールブルー）を２５μＬ添加し、９５℃で５分間加熱処理したものをＩＰＦｒａｃｔｉｏｎとした。７．５％ポリアクリルアミドゲルにＴｏｔａｌＦｒａｃｔｉｏｎ、ＩＰＦｒａｃｔｉｏｎの細胞破砕物を等量ずつアプライし、２時間程度電気泳動した。ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜にトランスファー後、５％スキムミルクで３０分間ブロッキングし、抗エラスチン抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）を添加して４℃で一晩インキュベートした。抗体を洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウス抗体（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を添加して室温で２時間インキュベートした後、抗体を洗浄し、ＰＶＤＦ膜上に発光基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を滴下し、ｉＢｒｉｇｈｔＣＬ１５００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて化学発光を検出した。
図３に示すように、同サンプルからニトロチロシン抗体にて免疫沈降を行いニトロチロシンを単離回収したところ、免疫沈降を行う前のサンプル（ＴｏｔａｌＦｒａｃｔｉｏｎ）ではＵＶ－Ａ照射に関わらずサンプル中のトロポエラスチン量にはほとんど差がなかったが、免疫沈降サンプル（ＩＰＦｒａｃｔｉｏｎ）では、無照射に対しＵＶ－Ａ照射サンプルでは線維芽細胞破砕物中のエラスチンタンパク質量が増加していることが示された。つまり、線維芽細胞へのＵＶ－Ａ照射により、エラスチンタンパク質にニトロ化が増加したことが確認された。

＜実験４＞ニトロ化処理によるエラスチンの凝集
以下の手順で、Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ処理したトロポエラスチンタンパク質の分子量の変化およびエラスチン線維の形態変化を検出した。
＜分子量変化の検出＞
０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にトロポエラスチンタンパク質（ＳＩＧＭＡ社）を１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を１００μＭになるよう添加した。３７℃で１日間インキュベートした後、１０×ＢｌｕｅｎａｔｉｖｅＰＡＧＥＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒ（５％（ｗ／ｖ）ＣＢＢ－Ｇ２５０、０．５Ｍ６－ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃａｃｉｄ、０．１ＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、５０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を１／１０量添加し、４℃で１０分間静置した。４－１６％ポリアクリルアミドグラジエントゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に２０μＬずつアプライし、泳動槽の陽極側にＡｎｏｄｅＢｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０））、陰極側にＣａｔｈｏｄｅＢｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＴｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ７．０）、１５ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、０．０２％ＣＢＢ－Ｇ２５０）を満たし、泳動槽を冷却しながら１５０ｍＡで電気泳動した。途中、泳動を停止しＣａｔｈｏｄｅＢｕｆｆｅｒをＣＢＢ－Ｇ２５０を含まないものに置換し、再度電気泳動した。泳動終了後のゲルを固定液（５０％メタノール、１０％酢酸）に一晩浸漬して固定および脱色処理した後、銀染色キット（ＡＴＴＯ社）を用いて銀染色を行った。
＜線維形態の観察＞
エラスチンファイバーシート（細胞外基質研究所社）を０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に浸し、Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を１００μＭになるよう添加した。３７℃で３日間インキュベートした後、蒸留水にてエラスチンファイバーシートを洗浄・乾燥し、Ａｕ蒸着後、走査型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ社）にて線維形態を観察した。
図４に示すように、Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ処理により約４８０ｋＤａ以下の領域のバンドが薄く、約４８０ｋＤａ以上の高分子量側の領域（Ａ）のバンドが濃くなった。トロポエラスチンタンパク質は単量体では分子量約７０ｋＤａのタンパク質であるため、複数の分子が高度に会合したトロポエラスチンタンパク質の重合集合体が増加していることが確認された。また、図５に示すように、Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ処理によりエラスチンファイバーの線維が束なり合一した。以上の結果から、ニトロ化処理はエラスチンに凝集を生じさせることが示された。

＜実験５＞エラスターゼによるエラスチンタンパク質の分解
以下の手順で、Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ処理したエラスチンのエラスターゼによる分解を測定した。
オルセイン標識不溶性エラスチン（ＳＩＧＭＡ社）を１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（０．２ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭＣａＣｌ_２）によく懸濁し、好中球エラスターゼ（ＳＩＧＭＡ）を０．５ｕｎｉｔｓ／ｍＬになるよう添加し、３７℃で一晩インキュベートした。遠心分離後に上清を９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに回収し、５９５ｎｍの吸光度からエラスチン分解率を算出した。
図６に示すように、Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ処理はエラスターゼによるエラスチンの分解率を抑制することが確認された。

＜実験６＞ニトロ化処理によるエラスチンゲルシートの硬度および弾力性の変化
以下の手順で、テトラニトロメタン処理したエラスチンゲルシートの硬度および弾力性を測定した。
エラスチンゲルシート（細胞外基質研究所社）を０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に浸漬し、ＥｔＯＨに溶解した１０％テトラニトロメタン溶液を０．１％の濃度になるよう添加した。室温にて２０分インキュベートした後、尿素水溶液を終濃度４Ｍになるよう添加し、反応を停止した。溶液を捨て、シートを蒸留水にて洗浄後、ＰＢＳ（－）に浸漬した。ゲル硬度は引張試験機（細胞外基質研究所社）を用いてヤング率を測定した。弾力性は、Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社）にて測定した。
図７に示すように、テトラニトロメタン（ＴＮＭ）処理したエラスチンゲルシートでは硬度（ヤング率）が増加し、また図８に示すように、弾力性（回復率；Ｕｒ／Ｕｆ）が低下することが確認された。

＜実験７＞ニトロ化エラスチン線維上で培養した線維芽細胞の遺伝子発現量の変化
以下の手順で、Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ処理したエラスチン線維上で培養した線維芽細胞の遺伝子発現量を測定した。
３０φガラスシャーレ（アズワン社）にシリコン支持シート（細胞外基質研究所社）を敷き、その上にエラスチンファイバーシート（細胞外基質研究所社）を重ねた。０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を１００μＭになるよう滴下した。３７℃で３日間インキュベートした後、蒸留水にてエラスチンファイバーシートを洗浄した。ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清１０％を加えたダルベッコＭＥＭ（Ｄ－ＭＥＭ）培地に懸濁し、２４ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ内に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２／９５％空気の加湿条件で７日間培養した。ＴｏｔａｌＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＪｅｎａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、ＴｏｔａｌＲＮＡを抽出した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、Ｉ型コラーゲン、トロポエラスチン、フィブリリン－１、ファイブリン５、およびＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ；ハウスキーピング遺伝子として使用）の発現量を遺伝子特異的プライマー及びＰｏｗｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ（７５００ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ社）にて測定し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。つまり、被験物質添加による遺伝子発現量の変化は、コントロール群のＣＳＥのＣｔ値をＧＡＰＤＨのＣｔ値で補正した値を１とし、それに対する相対量として求めた。
図９に示すように、ニトロ化処理したエラスチンファイバー上で培養した線維芽細胞では、コントロールに対してコラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）、フィブリリン－１（Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ－１）、ファイブリン５（Ｆｉｂｕｌｉｎ－５）の遺伝子発現量にはほぼ変化がなかったが、トロポエラスチン（Ｔｒｏｐｏｅｌａｓｔｉｎ）の遺伝子発現量は増加することが確認された。

上記の結果より、エラスチンのニトロ化は紫外線照射により増加すること、またニトロ化はエラスチンの凝集を促進する特性があること、およびエラスターゼによる分解に対して抵抗性を付与することを見出した。加えてこれらの物性変化の結果、エラスチン線維は硬化し、弾力性が減少することも見出した。つまり、紫外線照射によりエラスチン線維に生成したニトロ化物が光老化部でのエラスチン線維の異常沈着に寄与することを突き止めた。本発明のエラスチン線維の凝集を抑制し、皮膚の硬化および皮膚弾力性の低下、それに伴うシワ、たるみの形成、ハリの低下といった光老化の兆候を予防又は改善することができる物質を評価及び／又は選択する方法は、上記知見に基づくものである。

＜実施例１＞ニトロチロシン生成抑制物質のスクリーニング方法
以下の手順で、ニトロ化物であるニトロチロシンの生成抑制活性を測定した。
＜被験物質の調製＞
原体（ウーロン茶、煎茶、プーアール茶、ほうじ茶、紅茶、碁石茶（登録商標）、酒かす（月桂冠社製））に１０倍の重量の５０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液を加えて６０℃、４時間加熱抽出した。抽出物の乾燥残分に対して、エタノール、水を重量比で１：３０：６９となるように加えて希釈したものを被験物質とした。バラ乳酸菌発酵物に関しては、バラ科バラ属に属するゴールデンハートの花弁に２倍の重量の１％グルコース水溶液を添加したものを高圧蒸気滅菌処理し、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｈｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）の菌液を１％重量添加して３０℃で２週間静置培養した。高圧蒸気滅菌処理を行った後、ろ過液の乾燥残分に対してエタノール、水を重量比で１：３０：６９となるように加えて希釈したものを被験物質とした。
＜ニトロチロシン生成抑制試験＞
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液に、被験物質または対照物質を１０ｐｐｍの濃度になるよう添加した後、Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ発生剤であるＳＩＮ－１（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を終濃度が３ｍＭになるよう添加した。３７℃で一晩インキュベートしたのち、反応溶液中のＢＳＡのアミノ酸残基に生じたニトロチロシン量をＮＷＬＳＳ^ＴＭＮｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅＥＬＩＳＡ（ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＳｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ社）を用いて定量した。
図１０に示すように、ニトロ化剤であるＳＩＮ－１の添加により、ＳＩＮ－１未添加に比べてニトロチロシン量は大きく増加した。ＳＩＮ－１とともに番茶、サケカスエキスを添加した場合では被験物質の未添加と同程度のニトロチロシン量が生成しておりニトロチロシン生成抑制作用は確認されなかったが、ウーロン茶、煎茶、プーアール茶、ほうじ茶、紅茶、碁石茶、バラ乳酸菌発酵物エキスでは、ニトロチロシンの生成量が被験物質未添加に比べて抑制されており、ニトロチロシン生成抑制作用が確認された。以上の結果から、この方法を用いてニトロ化物の生成抑制剤を選択することができ、本スクリーニング方法を用いることで、タンパク質の凝集蓄積改善剤、皮膚の硬化抑制剤、皮膚の弾力性抑制剤、シワ、ハリ、タルミ改善剤等、光老化を改善する物質を選択することが可能である。

＜実施例２＞ニトロ化物分解物質のスクリーニング方法
以下の手順で、ニトロ化物であるニトロチロシンの分解活性を測定した。
＜被験物質の調製＞
実施例１と同様に調製した。
＜ニトロチロシン分解活性試験＞
３－ニトロチロシンを０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、５μｇ／ｍＬの濃度の溶液を調製した。リン酸緩衝液または３－ニトロチロシン溶液を９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに分注し、被験物質または対照物質を各ｗｅｌｌに終濃度が１００ｐｐｍになるよう添加した。３７℃で７２時間インキュベートしたのち、プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定し、ニトロチロシン残存率を算出した。
図１１に示すように、無添加のコントロールではニトロチロシン残存率が１００％であった。また、ほうじ茶、煎茶もニトロチロシン残存率はほぼ１００％であり、ニトロチロシン分解活性はないことが確認された。他方、碁石茶、酒かす、バラ乳酸菌発酵物の添加ではニトロチロシン残存率は８０－９０％程度に減少しており、これらの被験物質にはニトロチロシン分解作用があることが確認された。以上の結果から、この方法を用いてニトロ化物分解剤を選択することができ、本スクリーニング方法を用いることで、タンパク質の凝集蓄積改善剤、皮膚の硬化抑制剤、皮膚の弾力性抑制剤、シワ、ハリ、タルミ改善剤等、光老化を改善する物質を選択することが可能である。

＜実施例３＞エラスチンの凝集抑制物質のスクリーニング方法
以下の手順で、エラスチンの凝集を評価した。
＜被験物質の調製＞
実施例１と同様に調製した。
＜エラスチンの凝集抑制試験＞
０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にトロポエラスチンタンパク質（ＳＩＧＭＡ社）を１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、被験物質または対照物質を終濃度が１００ｐｐｍになるよう添加したのちＰｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を終濃度が１００μＭになるよう添加した。３７℃で１日間インキュベート後、１０×ＢｌｕｅｎａｔｉｖｅＰＡＧＥＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒ（５％（ｗ／ｖ）ＣＢＢ－Ｇ２５０、０．５Ｍ６－ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃａｃｉｄ、０．１ＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、５０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を１／１０量添加し、４℃で１０分間静置した。４－１６％ポリアクリルアミドグラジエントゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に２０μＬずつアプライし、泳動槽の陽極側にＡｎｏｄｅＢｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０））、陰極側にＣａｔｈｏｄｅＢｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＴｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ７．０）、１５ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、０．０２％ＣＢＢ－Ｇ２５０）を満たし、泳動槽を冷却しながら１５０ｍＡで電気泳動した。途中、泳動を停止しＣａｔｈｏｄｅＢｕｆｆｅｒをＣＢＢ－Ｇ２５０を含まないものに置換し、再度電気泳動した。泳動終了後のゲルを固定液（５０％メタノール、１０％酢酸）に一晩浸漬して固定および脱色処理した後、銀染色キット（ＡＴＴＯ社）を用いて銀染色を行った。
トロポエラスチンタンパク質は単量体では分子量約７０ｋＤａのタンパク質であり、凝集処理により複数の分子が会合した高分子量の重合集合体が形成される。よって、被験物質の処理により７０ｋＤａ以上の分子量のバンドが減少している場合、被験物質にはエラスチンタンパク質の凝集抑制作用があると判断される。この方法を用いることでエラスチンの凝集抑制剤を選択することができ、本スクリーニング方法を用いることで、皮膚の硬化抑制剤、皮膚の弾力性抑制剤、シワ、ハリ、タルミ改善剤等、光老化を改善する物質を選択することが可能である。

Claims

ニトロ化エラスチン量の減少を指標としたエラスチン線維の異常沈着改善剤のスクリーニング方法。
ニトロ化エラスチン量の減少を指標としたエラスチン線維の異常沈着改善によるシワ、ハリ、たるみ改善剤のスクリーニング方法。
前記ニトロ化エラスチン量の減少が、既存のニトロ化エラスチンの分解を作用機序とする請求項１又は請求項２に記載のスクリーニング方法。