JP7428866B2

JP7428866B2 - 細胞回収方法及び細胞培養装置

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Publication number: JP7428866B2
Application number: JP2019114230A
Authority: JP
Inventors: 大地堀井; 晴紀竹内; 佳雅須田; 雄士占部
Original assignee: Sinfonia Technology Co Ltd
Current assignee: Sinfonia Technology Co Ltd
Priority date: 2019-06-20
Filing date: 2019-06-20
Publication date: 2024-02-07
Anticipated expiration: 2039-06-20
Also published as: KR20220024054A; TW202100740A; WO2020255930A1; EP3988639A4; JP2021000007A; EP3988639A1; TWI897704B; TW202506987A; CN114026217A; TWI868137B; US20220356437A1

Description

本発明は、液状の培地が入れられた容器内で培養され、当該容器の内面に付着している細胞を回収する細胞回収方法、及び、当該細胞回収方法を実行可能な細胞培養装置に関する。

液状の培地が入れられた容器内で細胞を培養する場合、培養過程で細胞を他の容器に移し替える継代の際や、培養終了後に細胞を収穫する際には、容器内の細胞を回収する必要がある。このような細胞回収作業は、従来、次のように行われていた。すなわち、容器内の培地を排出してから剥離液を容器に供給し、剥離液の作用によって容器の内面に付着している細胞を剥離させる。次に、細胞を含む剥離液を遠沈管に移し替え、遠心分離機によって遠沈管内の細胞と剥離液とを分離することで細胞を回収していた。

近年、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞の培養を自動で行う細胞培養装置の開発が進められているが、遠心分離機をこのような細胞培養装置に導入すると、装置が大型になるとともにコストが増大するという問題があった。そこで、特許文献１に記載の細胞培養装置では、遠心分離機を必要としない細胞回収方法が採用されている。具体的には、剥離液の供給後、細胞の付着力が弱まった時点で剥離液を排出し、続けて容器内に培地を供給する。そして、このときの培地の流れる勢いによって、細胞を容器の内面から剥離している。こうすることで、細胞を剥離液から分離する必要がなくなるので、遠心分離機が不要となる。

特開２０１７－６０５８号公報

しかしながら、特許文献１に記載の細胞回収方法では、付着力の弱まった細胞を培地の流れる勢いによって容器の内面から剥離させているため、細胞に無理な力がかかり、細胞にダメージを与えるおそれがあった。また、特許文献１では、剥離液の作用が十分に及ぶ前に細胞を剥離させているので、剥離された細胞は塊状となっている。このため、細胞回収後に細胞を含む培地（細胞懸濁液）をチューブポンプに通すことで細胞塊を崩壊させている。この工程でも、細胞がチューブポンプで扱かれることによって、細胞にダメージを与えるおそれがあった。

本発明は、上述の課題を鑑みて、遠心分離機が不要な細胞回収方法において細胞へのダメージを抑えることを目的とする。

本発明に係る細胞回収方法は、液状の培地が入れられた容器内で培養され、前記容器の内面に付着している細胞を回収する細胞回収方法であって、前記容器から前記培地を排出する培地排出工程と、前記培地の排出後に、前記細胞を前記容器の内面から剥離させるための剥離液を前記容器に供給する剥離液供給工程と、前記細胞が前記容器の内面から完全に剥離する前に、前記剥離液を前記容器から排出する剥離液排出工程と、前記剥離液の排出後に、前記剥離液の残液の作用によって前記細胞が剥離するまで待機する待機工程と、前記待機工程の終了後、前記細胞を回収するための回収液を前記容器に供給する回収液供給工程と、を実行することを特徴とする。

本発明に係る細胞回収方法では、剥離液を排出した後、剥離液の残液の作用によって細胞が剥離するまで待機してから、回収液を供給するようにしている。このため、細胞を剥離液から分離する必要がなく、遠心分離機を不要とすることができる。また、剥離液の残液の作用で細胞が剥離するまで待機しているので、容器の内面に付着している細胞を、回収液の流れる勢いによって無理に剥離させる必要がない。さらに、剥離液の残液の作用で細胞が十分にばらけた状態となるので、細胞塊をチューブポンプなどで崩壊させる必要がない。したがって、本発明によれば、遠心分離機を不要としつつ、細胞へのダメージを抑えることができる。

本発明に係る細胞培養装置は、上記細胞回収方法を実行可能な細胞培養装置であって、前記容器に前記培地を給排する培地給排装置と、前記容器に前記剥離液を給排する剥離液給排装置と、前記容器に前記回収液を給排する回収液給排装置と、制御部と、を備え、前記制御部が前記培地給排装置、前記剥離液給排装置及び前記回収液給排装置の動作を制御することによって、前記細胞回収方法が実行されることを特徴とする。

本発明に係る細胞培養装置によれば、人手を介さずに自動で上記細胞回収方法を実行することができる。

本発明に係る細胞培養装置において、少なくとも２つの前記容器が接続経路を介して接続されており、ある前記容器において前記細胞回収方法が実行された後、前記ある容器に気体を圧送することで、前記ある容器内の前記細胞を含む前記回収液が他の前記容器に移し替えられるとよい。

このような構成によれば、細胞懸濁液（細胞を含む回収液）をある容器から他の容器に移し替える継代の際に、細胞懸濁液をチューブポンプなどを通過させずに移し替えることができる。したがって、細胞へのダメージを抑えることができる。

本発明の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示した概略正面図である。培養部の構成を示す正面図である。細胞培養装置の内部に形成される培養回路を示した図である。継代の一連の流れを示すフローチャートである。細胞回収作業を示す模式図である。

以下、本発明の好適な実施の形態について、図面を参照しつつ説明する。

（細胞培養装置の構成）
本実施形態に係る細胞培養装置１は、図１に示すように、冷蔵保存部２と、加温部３と、培養部４と、制御部５とを含んでいる。細胞培養装置１は、制御部５に入力され保存されたデータに従い、細胞を培養する装置である。なお、以下の説明において、図１の紙面に垂直な方向に沿って前後方向が定義される。

冷蔵保存部２及び加温部３は、内部に培地又は試薬が収容された容器を配置する棚が形成された筐体である。また、図示は省略するが、冷蔵保存部２及び加温部３の前面には、筐体の前面に設けられた開口を開閉可能な扉が設けられている。冷蔵保存部２は、冷却機構（不図示）を備え、内部の温度は常温より低い任意の温度に保たれている。加温部３は、培養部４の内部に配置され、加温部３の内部の温度は、培養部４の内部の温度とほぼ等しい。また、冷蔵保存部２の内部に配置された容器及び加温部３の内部に配置された容器は、内部の液体が流出可能となるようにチューブが接続されており、後述のポンプ１０２によって流出可能である。容器としては、ボトル、バッグなどが挙げられる。

培養部４は、図１及び図２に示すように、前面に第１開閉部２１を有する第１部屋１１と、前面に第２開閉部２２を有する第２部屋１２と、環境調整部１３と、を含む。第１部屋１１及び第２部屋１２の壁面、並びに、第１開閉部２１及び第２開閉部２２は、それぞれ断熱材からなる。これにより、第１部屋１１及び第２部屋１２の内部の温度は、第１開閉部２１及び第２開閉部２２が閉じられている状態において、一定に維持される。また、図２に示すように、第１部屋１１の内部には密閉容器５０が設置され、第２部屋１２の内部には密閉容器６０が設置されている。密閉容器５０及び６０は内部が無菌状態であり、容器としては、フラスコや多層式容器、バッグなどが挙げられる。また、本実施形態において、密閉容器５０及び６０は、ＣＯ₂透過性を有する材質からなる。ただし、密閉容器５０及び６０を、ＣＯ₂を透過しない材料で構成してもよい。また、密閉容器６０の容積は、密閉容器５０の容積よりも大きい。これは、密閉容器５０で培養され濃度が高くなった細胞を、密閉容器６０に移してさらに培養する場合、密閉容器６０に収容される培地の量は、密閉容器５０に収容される培地の量より多くする必要があるためである。ただし、密閉容器６０の容積を密閉容器５０の容積より大きくすることは必須ではなく、密閉容器６０の容積が密閉容器５０の容積より小さくても同じでもよい。なお、図２における点線部分は、第１部屋１１及び第２部屋１２の内部に配置されていることを意味する。

環境調整部１３は、加温装置及びＣＯ₂供給装置を内蔵しており、制御部５から送られた信号に従い、第１部屋１１及び第２部屋１２の内部の温度及びＣＯ₂濃度を調整可能である。また、第１部屋１１及び第２部屋１２の内部には、温度及びＣＯ₂濃度を検知するセンサ２３が配置されている。センサ２３が検知した情報は、制御部５へ出力される。なお、環境調整部１３には、その他の内部環境を調整する装置が内蔵されていてもよい。この場合、センサ２３は、その他の内部環境を併せて検知可能なセンサである。

さらに、培養部４は、図２に示すように、密閉容器５０と密閉容器６０とを互いに接続する接続経路３０と、接続経路３０を介して密閉容器５０と密閉容器６０との間で細胞を移動させる駆動部４０とを備えている。接続経路３０は、ともに内部が無菌状態であるチューブ７１及び攪拌部３２からなる。攪拌部３２は、チューブ７１を介して密閉容器５０及び６０と接続されている。また、駆動部４０は、ポンプ１０１と、ポンプ１０１に接続され、内部に気体が収容されたガスタンク３３とからなる。ガスタンク３３は、チューブ７２を介して密閉容器５０及び６０と接続されている。なお、ガスタンク３３の内部に収容された気体は、例えば、ＣＯ₂が挙げられるが、その他の気体でもよく、複数種類の気体からなる混合気体でもよい。なお、図２では、一部のチューブ及びポンプの記載を省略している。

（培養回路）
図３は、密閉容器５０、６０の内部の無菌状態を維持しながら、密閉容器５０、６０の内部での細胞の培養を可能とする閉鎖系の培養回路７０を示す。培養回路７０には、既に説明した密閉容器５０、６０、攪拌部３２及びガスタンク３３の他に、培地容器３４、剥離液容器３５及び廃液容器３６などが設けられており、これら各部がチューブ７１～７４によって接続された構成となっている。以下、詳細に説明する。

攪拌部３２は、チューブ７１を介して、密閉容器５０、６０と接続されている。チューブ７１のうち、密閉容器５０と攪拌部３２との間にはバルブＶ１が配置され、密閉容器６０と攪拌部３２との間にはバルブＶ２が配置されている。また、ガスタンク３３は、チューブ７２を介して、密閉容器５０、６０と接続されている。チューブ７２のうち、密閉容器５０とガスタンク３３との間にはバルブＶ３が配置され、密閉容器６０とガスタンク３３との間にはバルブＶ４が配置されている。

培地容器３４及び剥離液容器３５は、加温部３の内部に配置されている。培地容器３４には、細胞を培養するための液状の培地が収容されている。剥離液容器３５には、密閉容器５０、６０の内面に付着している細胞を剥離させるための剥離液が収容されている。図示は省略するが、培地容器３４は、チューブを介して冷蔵保存部２の内部に配置された培地タンクと接続されており、適宜、培地タンクから培地容器３４に培地が供給される。同様に、剥離液容器３５は、チューブを介して冷蔵保存部２の内部に配置された剥離液タンクと接続されており、適宜、剥離液タンクから剥離液容器３５に培地が供給される。

培地容器３４及び剥離液容器３５は、それぞれ、チューブ７３を介して、密閉容器５０、６０及び攪拌部３２と接続されている。チューブ７３のうち、培地容器３４及び剥離液容器３５と、密閉容器５０、６０及び攪拌部３２との間の部分には、ポンプ１０２が配置されている。チューブ７３には、バルブＶ５～Ｖ９が配置されている。バルブＶ５は、培地容器３４とポンプ１０２との間に配置されており、培地容器３４からの培地の供給状態を切り換える。バルブＶ６は、剥離液容器３５とポンプ１０２との間に配置されており、剥離液容器３５からの剥離液の供給状態を切り換える。バルブＶ７は、密閉容器５０とポンプ１０２との間に配置されており、密閉容器５０への培地又は剥離液の供給状態を切り換える。バルブＶ８は、密閉容器６０とポンプ１０２との間に配置されており、密閉容器６０への培地又は剥離液の供給状態を切り換える。バルブＶ９は、攪拌部３２とポンプ１０２との間に配置されており、攪拌部３２への培地又は剥離液の供給状態を切り換える。

廃液容器３６は、密閉容器５０、６０及び攪拌部３２からの廃液が排出される容器である。廃液容器３６には、外気と連通するガス抜き部３７が形成されており、廃液容器３６の内部の気体は、ガス抜き部３７を通って大気開放される。ガス抜き部３７には、必要に応じて逆止弁やフィルターなどが取り付けられることもある。

廃液容器３６は、チューブ７４を介して、密閉容器５０、６０及び攪拌部３２と接続されている。チューブ７４には、バルブＶ１０～Ｖ１２が配置されている。バルブＶ１０は、密閉容器５０とポンプ１０３との間に配置されており、密閉容器５０からの廃液の排出状態を切り換える。バルブＶ１１は、密閉容器６０とポンプ１０３との間に配置されており、密閉容器６０からの廃液の排出状態を切り換える。バルブＶ１２は、攪拌部３２とポンプ１０３との間に配置されており、攪拌部３２からの廃液の排出状態を切り換える。なお、密閉容器５０、６０及び攪拌部３２からの廃液が重力によって廃液容器３６に至る構成となっている場合には、ポンプ１０３を省略することも可能である。

（細胞回収作業）
本発明に係る細胞回収方法の一例として、密閉容器５０で培養した細胞を密閉容器６０へ移し替える継代時の作業について、図４及び図５を参照しつつ説明する。図４は、継代の一連の流れを示すフローチャートであり、図５は、細胞回収作業を示す模式図である。本実施形態では、制御部５がポンプ１０１～１０３の駆動及びバルブＶ１～Ｖ１２の開閉を適宜制御することにより、自動で継代が行われる。なお、培養や継代に関する各種条件は、作業者によって予め制御部５に入力される。継代を始めるに当たって、全てのバルブＶ１～Ｖ１２は閉状態とされており、培養回路７０の内部は無菌状態に維持されているものとする。

密閉容器５０から密閉容器６０への継代を行う際には、まず、図５のａ図に示すように、密閉容器５０から培地Ｍを排出する（ステップＳ１１）。具体的には、制御部５は、バルブＶ１０を開状態にし、ポンプ１０３を駆動させることで、密閉容器５０内の培地Ｍをチューブ７４を介して廃液容器３６に排出する。このとき、細胞Ｃは密閉容器５０の内面に付着しているため、培地Ｍと一緒には排出されない。密閉容器５０内の培地Ｍが排出されたら、制御部５は、バルブＶ１０を閉状態にし、ポンプ１０３を停止させる。

次に、図５のｂ図に示すように、密閉容器５０に剥離液Ｌを供給する（ステップＳ１２）。具体的には、制御部５は、バルブＶ６、Ｖ７を開状態にし、ポンプ１０２を駆動させることで、剥離液容器３５内の剥離液Ｌをチューブ７３を介して密閉容器５０に供給する。密閉容器５０に剥離液Ｌが所定量供給されたら、制御部５は、バルブＶ６、Ｖ７を閉状態にし、ポンプ１０２を停止させる。

密閉容器５０への剥離液Ｌの供給が終わったら、その状態で、第１所定時間だけ待機する（ステップＳ１３）。この第１所定時間は、密閉容器５０の内面に付着している細胞Ｃが、剥離液Ｌの化学的作用によって完全に剥離する直前の状態となるまでの時間である。第１所定時間は、細胞Ｃの種類や剥離液Ｌの種類によって適宜決められるが、例えば２～３分程度である。

第１所定時間が経過したら（ステップＳ１３：ＹＥＳ）、図５のｃ図に示すように、密閉容器５０から剥離液Ｌを排出する（ステップＳ１４）。具体的には、制御部５は、バルブＶ１０を開状態にし、ポンプ１０３を駆動させることで、密閉容器５０内の剥離液Ｌをチューブ７４を介して廃液容器３６に排出する。このとき、細胞Ｃは密閉容器５０の内面に付着しているため、剥離液Ｌと一緒には排出されない。仮に剥離液Ｌを排出するまでに一部の細胞Ｃが剥離していた場合には、その一部の細胞Ｃが剥離液Ｌと一緒に排出されることはあり得るが、そのような細胞Ｃはあったとしてもごくわずかである。密閉容器５０内の剥離液Ｌが排出されたら、制御部５は、バルブＶ１０を閉状態にし、ポンプ１０３を停止させる。

密閉容器５０から剥離液Ｌが排出されたら、その状態で、第２所定時間だけ待機する（ステップＳ１５）。ステップＳ１４において剥離液Ｌは基本的に全量が密閉容器５０から排出されるが、実際には、図５のｄ図に示すように、剥離液Ｌの残液が表面張力によって密閉容器５０の内面や細胞Ｃに付着している。第２所定時間は、ステップＳ１３を経て完全に剥離する直前の状態となっている細胞Ｃが、剥離液Ｌの残液の化学的作用によって完全に剥離するまでの時間である。第２所定時間は、細胞Ｃの種類や剥離液Ｌの種類によって適宜決められるが、例えば２～３分程度である。

第２所定時間が経過したら（ステップＳ１５：ＹＥＳ）、図５のｅ図に示すように、密閉容器５０に新鮮な培地Ｍを供給する（ステップＳ１６）。具体的には、制御部５は、バルブＶ５、Ｖ７を開状態にし、ポンプ１０２を駆動させることで、培地容器３４内の培地Ｍをチューブ７３を介して密閉容器５０に供給する。ステップＳ１５によって密閉容器５０の内面に付着していた細胞Ｃは完全に剥離し、細胞Ｃが塊状ではなくばらけた状態となっている。したがって、液状の培地Ｍを供給すると、密閉容器５０内の細胞Ｃが培地Ｍに混ざり細胞懸濁液Ｓとなる。なお、剥離液Ｌの残液はわずかな量なので、培地Ｍを供給することによって十分に薄められ、後の工程で問題になることはない。密閉容器５０に培地Ｍが所定量供給されたら、制御部５は、バルブＶ５、Ｖ７を閉状態とし、ポンプ１０２を停止させる。

次に、密閉容器５０内の細胞懸濁液Ｓを攪拌部３２に移動させる（ステップＳ１７）。具体的には、制御部５は、バルブＶ１、Ｖ３を開状態とし、ポンプ１０１を駆動させることで、ガスタンク３３内のＣＯ₂をチューブ７２を介して密閉容器５０に圧送する。これによって、密閉容器５０内の細胞懸濁液Ｓがチューブ７１を通って攪拌部３２へと移動する。細胞懸濁液Ｓが攪拌部３２へ移動した後、制御部５は、バルブＶ１、Ｖ３を閉状態とし、ポンプ１０１を停止させる。

続けて、攪拌部３２内の細胞懸濁液Ｓの濃度調整を行う（ステップＳ１８）。具体的には、攪拌部３２で攪拌されることにより濃度が均一となった細胞懸濁液Ｓのうちの微量が不図示の細胞カウント部へと運ばれ、細胞懸濁液Ｓの濃度が測定される。制御部５は、この測定結果を受けて、細胞懸濁液Ｓを所定の濃度にするために必要な培地Ｍの追加量を計算する。それから、制御部５は、バルブＶ５、Ｖ９を開状態とし、ポンプ１０２を駆動することで、培地容器３４から所定量の培地Ｍを攪拌部３２へ供給する。これにより、攪拌部３２の内部に収容されている細胞懸濁液Ｓの所定の濃度にすることができる。攪拌部３２に培地Ｍが所定量供給されたら、制御部５は、バルブＶ５、Ｖ９を閉状態とし、ポンプ１０２を停止する。

最後に、攪拌部３２内の濃度調整された細胞懸濁液Ｓを新しい密閉容器６０に移動させる（ステップＳ１９）。具体的には、制御部５は、バルブＶ１～Ｖ３を開状態とし、ポンプ１０１を駆動させることで、ガスタンク３３内のＣＯ₂を密閉容器５０を経由させて攪拌部３２に圧送する。これによって、攪拌部３２内の細胞懸濁液Ｓがチューブ７１を通って密閉容器６０へと移動する。細胞懸濁液Ｓが密閉容器６０へ移動した後、制御部５は、バルブＶ１～Ｖ３を閉状態とし、ポンプ１０１を停止させる。以上で継代が完了する。密閉容器５０、６０を新しい密閉容器に交換すれば、継代を繰り返し行うことも可能である。

ここで、密閉容器５０、６０を新しい密閉容器に交換する際、密閉容器５０、６０につながるチューブ、攪拌部３２などを新しいものに交換してもよいし、チューブ、攪拌部３２などの内部を洗浄し、再利用してもよい。密閉容器５０、６０を交換する際には、培養回路７０の内部の無菌状態を維持しながら、密閉容器５０、６０をチューブから取り外すとともに、別の新しい密閉容器を内部の無菌状態を維持しながら、チューブに接続する。その際には、例えば、ＢｉｏＷｅｌｄｅｒ（ザルトリウス・ステディム・ジャパン社製）、ＯＰＴＡ無菌コネクタ―（ザルトリウス・ステディム・ジャパン社製）などの溶着機を用いるとよい。

以上説明した継代の作業におけるステップＳ１１～Ｓ１６は、本発明に係る細胞回収方法に相当する。詳細には、ステップＳ１１が本発明の培地排出工程に相当し、ステップＳ１２が本発明の剥離液供給工程に相当し、ステップＳ１４が本発明の剥離液排出工程に相当し、ステップＳ１５が本発明の待機工程に相当し、ステップＳ１６が本発明の回収液供給工程に相当する。また、本発明の回収液として、培地Ｍが使用されている。また、培地容器３４、廃液容器３６、チューブ７３、７４、ポンプ１０２、１０３、バルブＶ５、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ１０、Ｖ１１によって、本発明の培地給排装置及び回収液給排装置が構成される。また、剥離液容器３５、廃液容器３６、チューブ７３、７４、ポンプ１０２、１０３、バルブＶ６、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ１０、Ｖ１１によって、本発明の剥離液給排装置が構成される。

（効果）
本実施形態では、剥離液Ｌを排出した後、剥離液Ｌの残液の作用によって細胞Ｃが剥離するまで待機してから、回収液としての培地Ｍを供給するようにしている。このため、細胞Ｃを剥離液Ｌから分離する必要がなく、遠心分離機を不要とすることができる。また、剥離液Ｌの残液の作用で細胞Ｃが剥離するまで待機しているので、密閉容器５０の内面に付着している細胞Ｃを、培地Ｍの流れる勢いによって無理に剥離させる必要がない。さらに、剥離液Ｌの残液の作用で細胞Ｃが十分にばらけた状態となるので、細胞塊をチューブポンプなどで崩壊させる必要がない。したがって、本実施形態によれば、遠心分離機を不要としつつ、細胞Ｃへのダメージを抑えることができる。

本実施形態では、制御部５がポンプ１０１～１０３の駆動及びバルブＶ１～Ｖ１２の開閉を適宜制御することにより、本発明に係る細胞回収方法が実行される。したがって、人手を介さずに自動で本発明に係る細胞回収方法を実行することができる。

本実施形態では、少なくとも２つの密閉容器５０、６０が接続経路３０を介して接続されており、密閉容器５０において本発明に係る細胞回収方法が実行された後、密閉容器５０に気体（ＣＯ₂）を圧送することで、密閉容器５０内の細胞懸濁液Ｓが他の密閉容器６０に移し替えられる。このような構成によれば、細胞懸濁液Ｓを密閉容器５０から密閉容器６０に移し替える継代の際に、細胞懸濁液Ｓをチューブポンプなどを通過させずに移し替えることができる。したがって、細胞Ｃへのダメージを抑えることができる。

（他の実施形態）
上記実施形態に種々の変更を加えた変形例について説明する。

上記実施形態では、本発明に係る細胞回収方法を継代時の作業に適用した例について説明したが、本発明に係る細胞回収方法を培養終了後に細胞を収穫する際に適用してもよい。

上記実施形態では、本発明の回収液として、液状の培地を使用するものとしたが、回収液の種類はこれに限定されるものではない。例えば、細胞を収穫する際の細胞回収作業では、回収液として凍結液を使用すれば、細胞回収後に細胞を凍結保存することができる。

上記実施形態では、本発明に係る細胞回収方法の各工程が制御部５によって自動で実行されるものとした。しかしながら、少なくとも一部の工程を作業者が行うようにしてもよい。

１：細胞培養装置
５：制御部
３０：接続経路
５０、６０：密閉容器（容器）
Ｃ：細胞
Ｍ：培地（回収液）
Ｌ：剥離液
Ｓ：細胞懸濁液

Claims

液状の培地が入れられた容器内で培養され、前記容器の内面に付着している細胞を回収する細胞回収方法であって、
前記容器から前記培地を排出する培地排出工程と、
前記培地の排出後に、前記細胞を前記容器の内面から剥離させるための剥離液を前記容器に供給する剥離液供給工程と、
前記剥離液を供給してから前記剥離液の作用によって前記細胞が前記容器の内面から完全に剥離する直前の状態となるまでの時間である第１所定時間だけ待機する第１待機工程と、
前記第１待機工程の後、前記剥離液を前記容器から排出する剥離液排出工程と、
前記剥離液を排出してから前記剥離液の残液の作用によって前記細胞が完全に剥離するまでの時間である第２所定時間だけ待機する第２待機工程と、
前記第２待機工程の終了後、前記細胞を前記容器から回収するための回収液を前記容器に供給する回収液供給工程と、
を実行することを特徴とする細胞回収方法。