JP7429057B2 - Ｃａｓ９ターゲッティングをガイドする配列に関する方法および組成物 - Google Patents

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特許法第３０条第２項適用 ２０１４年１０月１６日、下記のウエブサイトにて公開 ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌ．ｃｏｍ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｃｅｌｌ／ｆｕｌｌｔｅｘｔ／Ｓ１０９７－２７６５（１４）００７５１－５

［優先権の陳述］
本出願は、２０１４年１月２４日に出願された米国仮出願第６１／９３１，５１５号の、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）の下での利益を主張し、その内容全体は、参照により本明細書中に援用される。
［本発明の分野］
本発明は、合成ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓシステムおよびゲノム編成のためのその使用方法に関する。

Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）は、関連配列（ｃａｓ）と組み合わせて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成し、多くの細菌において適応免疫を与える。ＣＲＩＳＰＲが仲介する免疫付与は、プラスミドおよびファージなどの侵襲性遺伝因子由来のＤＮＡの、新規の「スペーサー」としての取り込みを介して生じる。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、超可変配列により隔てられた短いＤＮＡリピートのアレイからなり、ｃａｓ遺伝子が隣接し、配列特異的ターゲッティングおよび干渉を介して、ファージおよびプラスミドなどの侵襲性遺伝因子に対する適応免疫を提供する（Ｂａｒｒａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１５：１７０９－１７１２；Ｂｒｏｕｎｓ ｅｔ ａｌ．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９６０－４；Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ．２０１０．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２７：１６７－７０；Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ａｎｄ Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２２：１８４３－１８４５；Ｂｈａｙａ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．４５：２７３－２９７；Ｔｅｒｎｓ ａｎｄ Ｔｅｒｎｓ．２０１１．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４：３２１－３２７；Ｗｅｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．４６：３１１－３３９；Ｂａｒｒａｎｇｏｕ Ｒ．２０１３．ＲＮＡ．４：２６７－２７８）。典型的に、侵襲性ＤＮＡ配列は、新規の「スペーサー」として獲得され（Ｂａｒｒａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１５：１７０９－１７１２）、それぞれがＣＲＩＳＰＲリピートと対になり、ＣＲＩＳＰＲ座において新規のリピート－スペーサーユニットとして挿入される。続いて、リピート－スペーサーアレイは、長いｐｒｅ－ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）として転写され（Ｂｒｏｕｎｓ ｅｔ ａｌ．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９６０－４）、配列特異的認識を駆動する低分子干渉ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）へ処理される。具体的には、ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼにより仲介される配列特異的核酸切断のために、ヌクレアーゼを相補標的に向かってガイドする（Ｇａｒｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｎａｔｕｒｅ．４６８：６７－７１；Ｈａｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２９：１３５５－１３５８；Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３９：９２７５－９２８２；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７：８１６－８２１；Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９：Ｅ２５７９－Ｅ２５８６；Ｍａｇａｄａｎ ｅｔ ａｌ．２０１２．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．７：ｅ４０９１３；Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．２０１３．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．１０：８４１－８５１）。これらの広範なシステムは、細菌のほぼ半数（約４６％）および大多数の古細菌（約９０％）で生じる。それらは、ｃａｓ遺伝子含有量、ｃｒＲＮＡ生合成を駆動する生化学的プロセスにおける組織化および多様性、および、標的の認識および切断を仲介するＣａｓタンパク質複合体に基づいて、３つの主なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのタイプ（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：４６７－４７７；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．４１：４３６０－４３７７）に分類される。Ｉ型およびＩＩ型では、特別なＣａｓエンドヌクレアーゼがｐｒｅ－ｃｒＲＮＡを処理し、それから、ｃｒＲＮＡに相補の核酸を認識および切断することのできる巨大な多重－Ｃａｓタンパク質複合体にアセンブルする。異なるプロセスは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに関する。ここで、ｐｒｅ－ＣＲＮＡは、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）がｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズするメカニズムにより処理される。ハイブリダイズしたｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＲＮａｓｅＩＩＩにより切断され、各スペーサーの５’末端を除去する第二のイベントが続き、ｔｒａｃｒＲＮＡとＣａｓ９の両方と結合したままの成熟ｃｒＲＮＡが生産される。成熟複合体は、それから、複合体内のスペーサー配列と相補の標的ｄｓＤＮＡ配列（「プロトスペーサー」配列）を探して両鎖を切断する。ＩＩ型システムでの複合体による標的の認識および切断は、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体上のスペーサー配列と標的「プロトスペーサー」配列との間で相補の配列を必要とするだけでなく、プロトスペーサー配列の３’末端に位置するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列も必要とする。必要とされる正確なＰＡＭ配列は、異なるＩＩ型システム間で相違し得る。

本開示は、合成ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの効率および特異性を高め、ゲノム編成および他の用途の効率および特異性を改善する、方法および組成物を提供する。

本発明の一態様は、５’から３’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む随意的な抗－ジッパー配列；少なくとも約３個のヌクレオチドを含むバルジ配列；ＮＮＡＮＮのヌクレオチド配列を含む抗－ステッチ配列；Ｔ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ（またはＵ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ））、ＴＣＡＡＡＣ、（またはＵＣＡＡＡＣ）、ＴＡＡＧＧＣ（またはＵＡＡＧＧＣ）、ＧＡＴＡＡＧＧ（またはＧＡＵＡＡＧＧ）、ＧＡＴＡＡＧＧＣＴＴ（またはＧＡＵＡＡＧＧＣＵＵ）、ＴＣＡＡＧ（またはＵＣＡＡＧ）、ＴＣＡＡＧＣＡＡ（またはＵＣＡＡＧＣＡＡ）、Ｔ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）（またはＵ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｕ））、ＧＡＴＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣ、ＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ、ＴＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣ、またはＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣのヌクレオチド配列を含むネクサス配列；および、少なくとも１つのヘアピンを有するヌクレオチド配列を含むヘアピン配列を含む、合成トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＤＮＡ）構築物を提供し、前記ヘアピンは、少なくとも３個の一致する塩基対を含み、
ここで、抗－ジッパー配列は、存在する場合は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、抗－ステッチ配列のすぐ上流に位置し、抗－ステッチ配列は、ネクサス配列のすぐ上流に位置し、および、ネクサス配列は、ヘアピン配列のすぐ上流に位置する。

本発明の第２の態様は、３’から５’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む随意的なジッパー配列（存在する場合はｔｒａｃｒＲＮＡの抗－ジッパーにハイブリダイズする）、少なくとも２個のヌクレオチド（例えば、（－ＮＮ－）のヌクレオチド配列）を含むバルジ配列、ｔｒａｃｒＲＮＡの抗－ステッチにハイブリダイズするＮＮＴＮＮ（またはＮＮＵＮＮ）のヌクレオチド配列を含むステッチ配列、ヌクレオチドＧまたはＧＴＴを含むＧ_Ｒ１、および、５’末端および３’末端を有するスペーサー配列であって、その３’末端に標的ＤＮＡと１００％の同一性を有する少なくとも７個のヌクレオチドを含むスペーサー配列を含む、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）構築物を提供し、ジッパー配列は、存在する場合は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、ステッチ配列のすぐ上流に位置し、ステッチ配列は、Ｇ_Ｒ１のすぐ上流に位置し、および、Ｇ_Ｒ１は、スペーサー配列のすぐ上流に位置する。

本発明の第３の態様は、本発明の２以上のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物をコードするヌクレオチド配列を含む合成ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイを提供し、ここで、２以上のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物は、前記ヌクレオチド配列上で互いにすぐ隣に位置し、前記２以上のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のジッパー配列は、存在する場合は同一であり、前記２以上のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のステッチ配列は同一であり、前記２以上のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のスペーサー配列は、同一または非同一である。

本発明の第４の態様は、本発明の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物および本発明の合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物を含む、キメラ核酸構築物を提供し、ここで、存在する場合は、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のジッパー配列は、前記合成ｔｒａｃｒ核酸構築物の抗－ジッパー配列と少なくとも約７０％相補でありハイブリダイズし、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のステッチ配列は、前記合成ｔｒａｃｒ核酸構築物の抗－ステッチ配列と１００％相補でありハイブリダイズし、および、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のバルジ配列および合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のバルジ配列は、非相補である。

本発明の第５の態様は、本開示のキメラ核酸構築物または前記キメラ核酸構築物を含む発現カセットを、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの存在下で標的ＤＮＡと接触させ、それにより、標的ＤＮＡに対するスペーサー配列のハイブリダイゼーションにより規定される領域内で、標的ＤＮＡの部位特異的切断を生じさせるステップを含む、二本鎖標的ＤＮＡの部位特異的切断のための方法を提供する。

本発明の第６の態様は、トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸分子およびＣＲＩＳＰＲ核酸分子を、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの存在下で標的ＤＮＡと接触させるステップを含む、二本鎖標的ＤＮＡの部位特異的切断のための方法を提供し、
ここで、（ａ）ｔｒａｃｒ核酸分子は、５’から３’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む随意的な抗－ジッパー配列；少なくとも約３個のヌクレオチドを含むバルジ配列；ＮＮＡＮＮのヌクレオチド配列を含む抗－ステッチ配列；ＴＮＡＮＮＣ、Ｔ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ、ＴＣＡＡＡＣ、ＴＡＡＧＧＣ、ＧＡＴＡＡＧＧ、ＧＡＴＡＡＧＧＣＴＴ、ＴＣＡＡＧ、ＴＣＡＡＧＣＡＡ、Ｔ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）、ＧＡＴＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣ、ＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ、ＴＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣ、またはＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣのヌクレオチド配列を含むネクサス配列；および、少なくとも２つのヘアピンを有するヌクレオチド配列を含むヘアピン配列を含む、ヌクレオチド配列によりコードされ、各ヘアピンは、少なくとも３個の一致する塩基対を含み、抗－ジッパー配列は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、抗－ステッチ配列のすぐ上流に位置し、抗－ステッチ配列は、ネクサス配列のすぐ上流に位置し、および、ネクサス配列は、ヘアピン配列のすぐ上流に位置する；および
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ核酸分子は、３’から５’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む随意的なジッパー配列、少なくとも２個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列（例えば（－ＮＮ－）のヌクレオチド配列）を含むバルジ配列、ＮＮＴＮＮ（またはＮＮＵＮＮ）のヌクレオチド配列を含むステッチ配列、ヌクレオチドＧまたはＧＴＴを含むＧ_Ｒ１、および、５’末端および３’末端を有するスペーサー配列であって、その３’末端に標的ＤＮＡと１００％の同一性を有する少なくとも７個のヌクレオチドを含むスペーサー配列を含む、ヌクレオチド配列によりコードされ、ジッパー配列は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、ステッチ配列のすぐ上流に位置し、ステッチ配列は、Ｇ_Ｒ１のすぐ上流に位置し、および、Ｇ_Ｒ１は、スペーサー配列のすぐ上流に位置する、および、
さらにここで、抗－ジッパー配列およびジッパー配列が存在する場合は、それらは互いにハイブリダイズし、抗－ステッチ配列およびステッチ配列は互いにハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ核酸分子のスペーサー配列は、標的ＤＮＡの少なくとも一部（例えば、前記標的ＤＮＡの少なくとも約７個の連続したヌクレオチド（例えば、約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個など、および、その中の任意の範囲または変動）（標的ＤＮＡ上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する）と、少なくとも約８０％相補でありハイブリダイズし、それにより、標的ＤＮＡに対するＣＲＩＳＰＲ核酸分子のスペーサー配列の相補結合により規定される領域内で、標的ＤＮＡの部位特異的切断を生じさせる。したがって、代表的な実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ核酸分子のスペーサー配列は、ＰＡＭに隣接する標的ＤＮＡ配列の一部にハイブリダイズし、標的配列は、標的ＤＮＡ配列の約７個～約２０個の連続したヌクレオチドを含む、から本質的になる、またはからなることができる。

本発明の第７の態様は、二本鎖標的ＤＮＡを、以下を含むキメラ核酸と接触させるステップを含む、二本鎖標的ＤＮＡの部位特異的切断のための方法を提供する。
（ａ）５’から３’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む随意的な抗－ジッパー配列；少なくとも約３個のヌクレオチドを含むバルジ配列；ＮＮＡＮＮのヌクレオチド配列を含む抗－ステッチ配列；ＴＮＡＮＮＣ、Ｔ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ、ＴＣＡＡＡＣ、ＴＡＡＧＧＣ、ＧＡＴＡＡＧＧ、ＧＡＴＡＡＧＧＣＴＴ、ＴＣＡＡＧ、ＴＣＡＡＧＣＡＡ、Ｔ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）、ＧＡＴＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣ、ＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ、ＴＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣ、またはＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣのヌクレオチド配列を含むネクサス配列；および、少なくとも１つのヘアピンを有するヌクレオチド配列を含むヘアピン配列を含む、第一のヌクレオチド配列（前記ヘアピンは、少なくとも３個の一致する塩基対を含み、および、存在する場合は、抗－ジッパー配列はバルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、抗－ステッチ配列のすぐ上流に位置し、抗－ステッチ配列は、ネクサス配列のすぐ上流に位置し、および、ネクサス配列は、ヘアピン配列のすぐ上流に位置する）；
（ｂ）３’から５’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む随意的なジッパー配列（存在する場合は、第一のヌクレオチド配列の抗－ジッパー配列にハイブリダイズする）、少なくとも２個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列（例えば（－ＮＮ－）のヌクレオチド配列）を含むバルジ配列、ＮＮＴＮＮ（またはＮＮＵＮＮ）のヌクレオチド配列を含むステッチ配列、ヌクレオチドＧまたはＧＴＴを含むＧ_Ｒ１、および、５’末端および３’末端を有するスペーサー配列であって、その３’末端に標的ＤＮＡと１００％の相補性を有する少なくとも７個のヌクレオチドを含むスペーサー配列を含む、第二のヌクレオチド配列（ジッパー配列は、存在する場合は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、ステッチ配列のすぐ上流に位置し、ステッチ配列は、Ｇ_Ｒ１のすぐ上流に位置し、および、Ｇ_Ｒ１は、スペーサー配列のすぐ上流に位置する）；および、
（ｃ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、第三のヌクレオチド配列、
ここで、抗－ジッパー配列およびジッパー配列が存在する場合は、それらは互いにハイブリダイズし、抗－ステッチ配列は、ステッチ配列にハイブリダイズし、第二のヌクレオチド配列のスペーサー配列は、標的ＤＮＡの少なくとも一部（例えば、前記標的ＤＮＡの少なくとも約７個の連続したヌクレオチド、好ましくは約２０個までの連続したヌクレオチド）（標的ＤＮＡ上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する）とハイブリダイズし、それにより、標的ＤＮＡに対する第二のヌクレオチド配列のスペーサー配列の相補結合により規定される領域内で、標的ＤＮＡの部位特異的切断を生じさせる。

本発明の第８の態様は、二本鎖（ｄｓ）標的ＤＮＡに対する、目的ポリペプチドの部位特異的ターゲッティングの方法を含み、本開示のキメラ核酸構築物または前記キメラ核酸構築物を含む発現カセットを、標的ＤＮＡと接触させ、それにより、Ｃａｓ９に融合した目的ポリペプチドを、標的ＤＮＡ上の特異的部位にターゲッティングするステップを含み、前記部位は、標的ＤＮＡに対するスペーサー配列のハイブリダイゼーションにより規定される。

本発明の第９の態様は、二本鎖（ｄｓ）標的ＤＮＡに対する、目的ポリペプチドの部位特異的ターゲッティングの方法を含み、
トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸分子およびＣＲＩＳＰＲ核酸分子を、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの存在下で、標的ＤＮＡと接触させるステップを含み、ここで、
（ａ）ｔｒａｃｒ核酸分子は、５’から３’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む随意的な抗－ジッパー配列；少なくとも約３個のヌクレオチドを含むバルジ配列；ＮＮＡＮＮのヌクレオチド配列を含む抗－ステッチ配列；Ｔ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ、ＴＣＡＡＡＣ、ＴＡＡＧＧＣ、ＧＡＴＡＡＧＧ、ＧＡＴＡＡＧＧＣＴＴ、ＴＣＡＡＧ、ＴＣＡＡＧＣＡＡ、Ｔ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）、ＧＡＴＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣ、ＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ、ＴＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣ、またはＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣのヌクレオチド配列を含むネクサス配列；および、少なくとも１つのヘアピンを有するヌクレオチド配列を含むヘアピン配列を含む、ヌクレオチド配列によりコードされ、前記ヘアピンは、少なくとも３個の一致する塩基対を含み、抗－ジッパー配列は、存在する場合は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、抗－ステッチ配列のすぐ上流に位置し、抗－ステッチ配列は、ネクサス配列のすぐ上流に位置し、および、ネクサス配列は、ヘアピン配列のすぐ上流に位置する；および、
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ核酸分子は、３’から５’の方向に、抗－ジッパー配列にハイブリダイズする少なくとも約３個のヌクレオチドを含む随意的なジッパー配列、少なくとも２個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列（例えば（－ＮＮ－）のヌクレオチド配列）を含むバルジ配列、ＮＮＴＮＮのヌクレオチド配列を含むステッチ配列、ヌクレオチドＧまたはＧＴＴを含むＧ_Ｒ１、および５’末端および３’末端を有するスペーサー配列であって、その３’末端に標的ＤＮＡと１００％の同一性を有する少なくとも７個のヌクレオチドを含むスペーサー配列を含む、ヌクレオチド配列によりコードされ、ジッパー配列は、存在する場合は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、ステッチ配列のすぐ上流に位置し、ステッチ配列は、Ｇ_Ｒ１のすぐ上流に位置し、および、Ｇ_Ｒ１は、スペーサー配列のすぐ上流に位置する、および、
さらにここで、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＨＮＨ活性部位モチーフ内の変異、ＲｕｖＣ活性部位モチーフ内の変異を含み、目的ポリペプチドに融合され、抗－ジッパー配列およびジッパー配列は、存在する場合は、互いにハイブリダイズし、抗－ステッチ配列は、ステッチ配列にハイブリダイズし、スペーサー配列は、標的ＤＮＡ上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する標的ＤＮＡの少なくとも一部にハイブリダイズし、それにより、標的ＤＮＡに対するＣＲＩＳＰＲ核酸分子のスペーサー配列のハイブリダイゼーションにより規定される領域内で、目的ポリペプチドの標的ＤＮＡに対する部位特異的ターゲッティングを生じさせる。

さらに本明細書で提供されるのは、本発明の核酸構築物、核酸アレイ、核酸分子および／またはヌクレオチド配列を含む、発現カセット、細胞およびキットである。

本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の説明において詳細に示される。

ネクサスモジュールに関する多重配列アライメントを示す。 ネクサスモジュールに関する最大尤度ツリーを示す。 図３Ａ～図３Ｄは、ネクサスモジュールに関するコンセンサス配列を示す。図３Ａは、Ｓｔｈ Ｃｒ１グループに関するコンセンサス配列を示し、図３Ｂは、Ｓｔｈ Ｃｒ３グループに関するコンセンサス配列を示し、図３Ｃは、Ｌｒｈグループに関するコンセンサス配列を示し、図３Ｄは、Ｌｂｕグループに関するコンセンサス配列を示す。 Ｃａｓ９ヌクレアーゼに関する最大尤度ツリーを示す。 抗－ステッチモジュールに関する多重配列アライメントを示す。 図６Ａ～図６Ｄは、抗－ステッチモジュールに関するコンセンサス配列を示す。図６Ａは、Ｓｔｈ Ｃｒ１グループに関するコンセンサス配列を示し、図６Ｂは、Ｓｔｈ Ｃｒ３グループに関するコンセンサス配列を示し、図６Ｃは、Ｌｒｈグループに関するコンセンサス配列を示し、図６Ｄは、Ｌｂｕグループに関するコンセンサス配列を示す。 バルジモジュールに関する多重配列アライメントを示す。 図８Ａ～図８Ｄは、バルジモジュールに関するコンセンサス配列を示す。図８Ａは、Ｓｔｈ Ｃｒ１グループに関するコンセンサス配列を示し、図８Ｂは、Ｓｔｈ Ｃｒ３グループに関するコンセンサス配列を示し、図８Ｃは、Ｌｒｈグループに関するコンセンサス配列を示し、図８Ｄは、Ｌｂｕグループに関するコンセンサス配列を示す。 ジッパーモジュールに関する多重配列アライメントを示す。 ジッパーモジュールに関する最大尤度ツリーを示す。 バルジ、抗－ステッチおよびネクサスモジュールに関する多重配列アライメントを示す。 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲ３のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム因子の配列および構造の詳細を示し、Ｓｔｈ ＣＲ１グループを表す。 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム因子の配列および構造の詳細を示し、Ｌｂｕグループを表す。 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＣＲ１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム因子の配列および構造の詳細を示し、Ｓｔｈ ＣＲ１グループを表す。 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ Ｍ１ ＧＡＳのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム因子の配列および構造の詳細を示し、Ｓｔｈ ＣＲ３グループを表す。 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム因子の配列および構造の詳細を示し、Ｌｒｈグループを表す。 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム因子の配列および構造の詳細を示し、Ｌａｎグループを表す。 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム因子の配列および構造の詳細を示し、Ｌｃａグループを表す。 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム因子の配列および構造の詳細を示し、Ｌｇａグループを表す。 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム因子の配列および構造の詳細を示し、Ｌｊｅグループを表す。 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム因子の配列および構造の詳細を示し、Ｌｐｅグループを表す。 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ Ｍ１ ＧＡＳのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム因子の配列および構造の詳細を示す。 ｔｒａｃｒＲＮＡ（左）、ＣＲＩＳＰＲリピート（中央）およびＣａｓ９（右）配列クラスタリングの間のコングルエンスを示す。配列に基づく３つの系統樹にわたり、３つのファミリーへの一貫したグルーピングが見られる。 図２４Ａ～図２４Ｂは、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡファミリーを示す。図２４Ａは、様々なＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種由来のＣａｓ９タンパク質配列に基づく系統樹を示す。配列は、青、橙および緑で３つのファミリーにクラスタリングした。図２４Ｂは、各ファミリーに関する予測のガイドＲＮＡのコンセンサス配列および二次構造を示す。各コンセンサスＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡと塩基対合したｃｒＲＮＡ（左）からなる。完全に保存された塩基はカラーで、可変の塩基は黒で（可能性のある塩基は２個）、または黒い点で表され（可能性のある塩基は少なくとも３個）、および、常に存在するわけでない塩基位置は丸で囲われている。位置の間の丸は、一部のファミリーメンバーのみに存在する塩基対合を示す。 ＣＲＩＳＰＲリピート配列アライメントを示す。各クラスターに関し、Ｓｔｈ３（上）、Ｓｔｈ１（中央）およびＬｂ（下）ファミリーの各ファミリーの下に指定される保存されたコンセンサスのヌクレオチドとともに、ＣＲＩＳＰＲリピート配列アライメントが示される。 ｔｒａｃｒＲＮＡ配列アライメントを示す。各クラスターに関し、Ｓｔｈ３（上）、Ｓｔｈ１（中央）およびＬｂ（下）ファミリーの各ファミリーの下に指定される保存されたコンセンサスのヌクレオチドとともに、実験的決定またはコンピューター的予測のｔｒａｃｒＲＮＡ配列アライメントが示される。 ｓｇＲＮＡネクサス配列アライメントを示す。普遍的に保存された残基は赤で色が付けられている。図２４Ｂに要約されるネクサスステムを構成する相補ヌクレオチドに下線が引かれている。ネクサスループを構成するヌクレオチドは、ギャップの中央にある。 図２８Ａ～図２８Ｂは、自己ターゲッティングアッセイスキームを示す。ｐＣａｓ９プラスミドを介して直交性Ｃａｓ９タンパク質が提供され（図２８Ａ）、図３に記載のとおりに用いた。ｐｓｇＲＮＡプラスミドを介して様々なｓｇＲＮＡキメラが提供され（図２８Ｂ）、図３に記載の所望のＣａｓ９それぞれと組み合わせて用いた。 図２９Ａ～図２９Ｃは、ｓｇＲＮＡ直交性を示す。図２９Ａは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ３－Ｃａｓ９（上、青）およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ１－Ｃａｓ９（下、橙）のｓｇＲＮＡ配列を示す。図２９Ｂは、プロトスペーサー－ターゲッティングスキームを示す。各ｓｇＲＮＡに関する予想ＰＡＭが示される。三角は各Ｃａｓ９の推定切断部位を示す。図２９Ｃは、Ｅ．ｃｏｌｉでのＣａｓ９：キメラ－ｓｇＲＮＡ直交性。キメラｓｇＲＮＡ。ＳｔｈＣＲＩＳＰＲ３ Ｃａｓ９（青）および／またはＳｔｈＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９（橙）を発現しているＥ．ｃｏｌｉにおいて、各ｓｇＲＮＡ（左）を形質転換アッセイ（右）に供した。低い形質転換効率は、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムの致死自己ターゲッティングを介した機能性Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ対を示す。値は、３つの非依存的実験のＳ．Ｅ．Ｍ．および幾何平均を反映する。 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉでの、最初の、野生型ＣＲＩＳＰＲスペーサー配列と一致するプロトスペーサー配列を含むプラスミドを形質転換することの不能性としての、相補ＤＮＡに対するＣＲＩＳＰＲ干渉を示す。ＰＡＭ（薄い灰色のイタリック体のヌクレオチド）およびその変異体（単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）；黒の下線ヌクレオチド）が隣接する太字の配列は、プロトスペーサーである。少ない形質転換体の数は、相補標的ＤＮＡの形質転換を妨げる活性のＬｇａ ＣＲＩＳＰＲシステムを表す。 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉでの、最初の野生型ＣＲＩＳＰＲスペーサー配列と一致するプロトスペーサー配列を含むプラスミドを形質転換することの不能性としての、相補ＤＮＡに対するＣＲＩＳＰＲ干渉を示す。ＰＡＭ（薄い灰色のイタリック体のヌクレオチド）およびその変異体（ＳＮＰｓ、黒の下線ヌクレオチド）が隣接する太字の配列は、プロトスペーサーである。少ない形質転換体の数は、相補標的ＤＮＡの形質転換を妨げる活性のＬｃａ ＣＲＩＳＰＲシステムを表す。 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓでの、最初の野生型ＣＲＩＳＰＲスペーサー配列と一致するプロトスペーサー配列を含むプラスミドを形質転換することの不能性としての、相補ＤＮＡに対するＣＲＩＳＰＲ干渉を示す。ＰＡＭ（薄い灰色のイタリック体のヌクレオチド）およびその変異体（ＳＮＰｓ、黒の下線ヌクレオチド）が隣接する太字の配列は、プロトスペーサーである。少ない形質転換体の数は、相補標的ＤＮＡの形質転換を妨げる活性のＬｒａ ＣＲＩＳＰＲシステムを表す。

ここで、本発明の実施態様が示される添付の図面および実施例を参照して、以下に本発明を説明する。当該説明は、本発明が実施され得る全ての異なる方法または本発明に加えられ得る全ての特徴の、詳細一覧であることを目的としない。例えば、一実施態様に関して説明される特徴を他の実施態様に援用し得て、特定の実施態様に関して説明される特徴をその実施態様から消去し得る。したがって、本発明は、本発明の一部の実施態様において、本明細書に示される任意の特徴または特徴の組み合わせは、除外または省略することができることを期待する。加えて、本明細書に示唆される様々な実施態様に対する非常に多くの変更および追加は、本開示に照らして当業者に明らかであり、本発明から逸脱しない。それ故に、以下の説明は、本発明の一部の特定の実施態様を説明することを目的とし、その全ての並べ替え、組み合わせおよび変更を徹底的に特定することは目的としない。

別段の定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における通常の知識を有する者により一般に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書において本発明の説明で用いられる専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のみであり、本発明の限定を意図しない。

本明細書中の刊行物、特許出願、特許文献および他の引用文献は全て、引用文献が示されている文および／または段落と関連のある教示に関して、それらの全体で参照により援用される。

文脈が別段の提示をしない限り、本明細書に記載の本発明の様々な特徴は任意の組み合わせで用いることができることが、明確に意図される。さらに、本発明は、本発明の一部の実施態様において、本明細書に示される任意の特徴または特徴の組み合わせを除外または省略することができることも期待する。説明するために、明細書が、組成物は構成要素Ａ、ＢおよびＣを含むと記述する場合、Ａ、ＢまたはＣのいずれか、またはそれらの組み合わせは、単独または任意の組み合わせで省略および放棄することができることが、明確に意図される。

本発明の説明および添付の請求項で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の提示をしない限り、複数形も同様に含むことを意図する。

また、本明細書において用いられる「および／または」は、１つまたは複数の関連する挙げられた事項の任意および全てのあり得る組み合わせ、および、選択的（「または」）に解釈する場合は、組み合わせの欠如を言及および包含する。

本明細書において用いられる用語「約」は、用量または期間などの測定可能な値を言及する場合、規定量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または実に±０．１％の変動を言及する。

本明細書において用いられる「ＸおよびＹの間（ｂｅｔｗｅｅｎ Ｘ ａｎｄ Ｙ）」および「約ＸおよびＹの間（ｂｅｔｗｅｅｎ ａｂｏｕｔ Ｘ ａｎｄ Ｙ）」などの語句は、ＸおよびＹを含むと解釈すべきである。本明細書において用いられる「約ＸおよびＹの間（ｂｅｔｗｅｅｎ ａｂｏｕｔ Ｘ ａｎｄ Ｙ）」などの語句は「約Ｘおよび約Ｙの間（ｂｅｔｗｅｅｎ ａｂｏｕｔ Ｘ ａｎｄ ａｂｏｕｔ Ｙ）」を意味し、「約ＸからＹまで（ｆｒｏｍ ａｂｏｕｔ Ｘ ｔｏ Ｙ）」などの語句は「約Ｘから約Ｙまで（ｆｒｏｍ ａｂｏｕｔ Ｘ ｔｏ ａｂｏｕｔ Ｙ）」を意味する。

本明細書において用いられる「バルジ配列」は、合成ｔｒａｃｒ核酸構築物および合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物／ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイに含まれる、非相補（非ハイブリダイズ）ヌクレオチド配列を指す。合成ｔｒａｃｒ核酸構築物において、バルジ配列は、抗－ジッパーおよび抗－ステッチ配列の間に位置し、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物／ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ内の対応するバルジ配列と非相補（１００％非同一性）である、約３個のヌクレオチド～約６個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６個のヌクレオチド；例えば、約３～約６個のヌクレオチド、約３～約５個のヌクレオチド、約３～約４個のヌクレオチドなど）からなる。合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物／ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイのバルジ配列は、ジッパーとステッチ配列との間およびジッパーとステッチ配列との間に位置し、少なくとも２個のヌクレオチド（例えば、（－ＮＮ－）のヌクレオチド配列）（例えば、約２、３、４、５、６個のヌクレオチド；例えば、約２～約６個のヌクレオチド、約２～約５個のヌクレオチド、約２～約４個のヌクレオチド；約３～約６個のヌクレオチド、約３～約５個のヌクレオチドなど）を含み、から本質的になり、またはからなる。バルジ配列のヌクレオチド組成物は、それらが相補でなく（例えば、１００％非同一性）、それにより互いにハイブリダイズしない限り、任意の一連の少なくとも２個（合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物／ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ）または３個以上（合成ｔｒａｃｒ核酸構築物）のヌクレオチドであってよい。合成ｔｒａｃｒ核酸構築物および合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物／ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ上のバルジ配列の非相補性の結果として、抗－ジッパーとジッパー配列および抗－ステッチとステッチ配列が並び、ハイブリダイズする場合（キメラ核酸構築物でのように）、突出またはバルジが、キメラ核酸構築物の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物側に形成される（例えば、図１２～図１６を参照）。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、バルジ構造は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの機能に関与し得ると考えられる。

本明細書において用いられる用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記述された特徴、整数、ステップ、操作、因子、および／または構成要素の存在を特定するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、操作、因子、構成要素、および／またはそれらの群の存在または追加を妨げない。

本明細書において用いられる暫定の語句「から本質的になる」は、請求項の範囲が、請求項に挙げられた特定の物質またはステップおよび特許請求の範囲に記載された発明の基本的かつ新規の特徴（単数または複数）を実質的に影響しないものを包含すると解釈されることを意味する。したがって、用語「～から本質的になる」は、本発明の請求項において用いられる場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されることを意図しない。

「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムにおいて二本鎖ＤＮＡ切断を触媒するエンドヌクレアーゼの大きなグループを指す。これらのポリペプチドは、当技術分野でよく知られていて、それらの構造（配列）の多くが特徴付けられている（例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２；ＷＯ／２０１３／１８８６３８を参照）。ｄｓＤＮＡの切断を触媒するためのドメインは、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインである。ＲｕｖＣドメインは（－）鎖にニックを入れる役割があり、ＨＮＨドメインは（＋）鎖にニックを入れる役割がある（例えば、Ｇａｓｉｕｎａｓｅｔａｌ．ＰＮＡＳ １０９（３６）：Ｅ２５７９－Ｅ２５８６（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ４，２０１２）を参照）。

本明細書において用いられる「キメラ」は、少なくとも２つの構成要素が異なる起源（例えば、異なる生物、異なるコード領域）から得られた核酸分子またはポリペプチドを指す。

本明細書において用いられる「相補」は、コンパレーターヌクレオチド配列と１００％の相補性または同一性を意味することができ、または、１００％未満の相補性（例えば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％などの相補性）を意味することができる。

本明細書において用いられる用語「相補」または「相補性」は、塩基対合による、許容される塩および温度条件下でのポリヌクレオチドの自然な結合を指す。例えば、配列「Ａ－Ｇ－Ｔ」は、相補配列「Ｔ－Ｃ－Ａ」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、ヌクレオチドの一部のみが結合する「部分的」であり得て、または、一本鎖分子間に全体的相補性が存在する場合は完全であり得る。核酸鎖間の相補性の度合いは、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に重大な効果を有する。

本明細書において用いられる「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔ）」、「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」、「接触した（ｃｏｎｔａｃｔｅｄ）」およびそれらの文法的変更は、所望の反応（例えば、目的ポリペプチドの部位特異的ターゲッティング、組込み、形質転換、部位特異的切断（ニック、開裂）、増幅など）を行なうのに適切な条件下で、所望の反応の構成要素を一緒に配置することを指す。そのような反応を行なうための方法および条件は、当技術分野でよく知られている（例えば、 Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９：Ｅ２５７９－Ｅ２５８６；Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．４ｔｈ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照）。

本発明のヌクレオチド配列の「フラグメント」または「一部」は、参照核酸またはヌクレオチド配列に対して、長さが短くなった（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多くのヌクレオチド短くなった）ヌクレオチド配列を意味すると理解され、および、参照核酸またはヌクレオチド配列と同一のまたはほぼ同一の（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の）連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、から本質的になり、および／または、からなる。本発明に係るそのような核酸フラグメントまたは一部は、適切な場合は、それが構成要素となる、より大きなポリヌクレオチドに含まれ得る。したがって、例えば、標的ＤＮＡの少なくとも一部にハイブリダイズすること（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ ｔｏ）（またはハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ ｔｏ）、およびそれらの他の文法的変更）は、標的ＤＮＡの連続したヌクレオチドの長さと同一または実質的に同一のヌクレオチド配列に対するハイブリダイゼーションを指す。

本明細書において用いられる「Ｇ_Ｒ１」は、合成ＣＲＩＳＰＥＲ核酸構築物またはｃｒＲＮＡのリピート部分に含まれる、単一ヌクレオチド（Ｇ）または短い３個のヌクレオチド配列（ＧＴＴ）である。Ｇ_Ｒ１は、本開示の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物またはｔｒａｃｒＲＮＡの抗－リピートとハイブリダイズしない。しかしながら、非標準的なワトソンクリック塩基対合スキームでは、Ｇ_Ｒ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡの抗－ＣＲＩＳＰＲリピート部分の末端でＵと揺らぎ塩基対を形成し得る。

本明細書において用いられる用語「遺伝子」は、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗－ミクロＲＮＡアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＡＭＯ）などを生産するのに用いることが可能な核酸分子を指す。遺伝子は、機能性タンパク質または遺伝子産物を生産するのに用いることが可能であってよく、または不可能であってよい。遺伝子は、コード領域および非コード領域（例えば、イントロン、制御因子、プロモーター、エンハンサー、終止配列および／または５’および３’非翻訳領域）の両方を含んでよい。遺伝子は、「分離」され得て、それにより、その天然の状態では核酸と結合して通常は見られる構成要素から、実質的にまたは本質的にフリーである核酸が意味される。そのような構成要素は、他の細胞物質、組み換え生産による培養培地、および／または核酸の化学合成で用いられる様々な化学物質を含む。

本明細書において用いられる「ヘアピン配列」は、ヘアピンを含むヌクレオチド配列である。ヘアピン（例えば、ステム－ループ、フィード－バック）は、いずれか側に一本鎖領域がさらに隣接する二本鎖を形成するヌクレオチドの領域を含む二次構造を有する核酸分子を指す。そのような構造は当技術分野でよく知られている。当技術分野で知られているように、二本鎖領域は、塩基対合内にいくつかのミスマッチを含んでよく、または完全に相補であってよい。本開示の一部の実施態様では、核酸構築物のヘアピン配列は、合成ｔｒａｃｒ核酸構築物の３’末端で「ネクサス配列」のすぐ下流に位置する。いかなる特定の理論にも拘束されずに、ヘアピンは、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体へのＣａｓ９結合に関与し得ると考えられる（例えば、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物－合成

「異種」または「組み換え」ヌクレオチド配列は、それが導入される宿主細胞と天然には関係しないヌクレオチド配列であり、天然起源ヌクレオチド配列の非天然起源多重コピーを含む。

相同性を有する異なる核酸またはタンパク質は、本明細書において「ホモログ」と呼ぶ。ホモログという用語は、同一および他の種由来の相同配列および同一および他の種由来のオルソロガス配列を含む。「相同性」は、位置同一性（すなわち配列類似性または同一性）のパーセントの観点からの、２以上の核酸および／またはアミノ酸配列の間の類似性のレベルを指す。また、相同性は、異なる核酸またはタンパク質間の類似の機能特性の概念を指す。したがって、本発明の組成物および方法は、本発明のヌクレオチド配列およびポリペプチド配列に対するホモログをさらに含む。本明細書において用いられる「オルソロガス」は、種分化の間に共通の祖先遺伝子から生じる異なる種における相同ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列を指す。本発明のヌクレオチド配列のホモログは、本発明の前記ヌクレオチド配列と実質的な配列同一性（例えば、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％）を有する。したがって、例えば、本発明で有用なＣａｓ９ポリペプチドのホモログは、本明細書に提供されるＣａｓ９配列のいずれか１つと約７０％相同またはそれより高くてよい。

本明細書において用いられる、ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）、ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）、およびそれらの文法的変更は、２つの完全に相補のヌクレオチド配列またはいくつかのミスマッチの塩基対が存在し得る実質的に相補の配列の結合を指す。ハイブリダイゼーションの条件は当技術分野でよく知られていて、ヌクレオチド配列の長さおよびヌクレオチド配列間の相補性の度合いに基づき変化する。一部の実施態様では、ハイブリダイゼーションの条件は、高ストリンジェンシーであってよく、または、それらは、ハイブリダイズされる配列の長さおよび相補性の量に応じて、中ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシーであってよい。ヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションの目的に関して低、中および高ストリンジェンシーを構成する条件は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９：Ｅ２５７９－Ｅ２５８６；Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．４ｔｈ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照）。

本明細書において用いられる用語「増大する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「増大する（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」、「増大した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」「増強した（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」「増強する（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」および「増強（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」（およびそれらの文法的変更）は、コントロールと比べて、少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれよりも多い上昇を表す。

用語「侵襲性外因性遺伝因子」、「侵襲性外因性核酸」または「侵襲性外因性ＤＮＡ」は、細菌にとって外因性であるＤＮＡ（例えば、制限されないが、ウイルス、バクテリオファージ、および／またはプラスミドを含む病原体由来の遺伝因子）を意味する。

「天然」または「野生型」の核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、天然起源または内因性の核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたはアミノ酸配列を指す。したがって、例えば、「野生型ｍＲＮＡ」は、生物において天然起源または内因性であるｍＲＮＡである。「相同」核酸配列は、それが導入される宿主細胞と天然に関連するヌクレオチド配列である。

本明細書において用いられる「ネクサス配列」は、合成ｔｒａｃｒ核酸構築物内の「抗－ステッチ配列」のすぐ下流に位置するヌクレオチド配列を指す。ネクサスは、長さが約６～１０個のヌクレオチドであり、高保存配列：ＴＮＡＮＮＣを含む。一部の実施態様では、ネクサスは、Ｔ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ（またはＵ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ））、ＧＡＴＡＡＧＧＣＴＴ（またはＧＡＵＡＡＧＧＣＵＵ）、ＴＣＡＡＧＣＡＡ（またはＵＣＡＡＧＣＡＡ）、またはＴ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）（またはＵ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｕ））のヌクレオチド配列であってよい。いかなる特定の理論にも拘束されずに、配列保存に基づき、ネクサスは、Ｃａｓ９直交性および認識において重要であり得ると考えられる。

また、本明細書において用いられる用語「核酸」、「核酸分子」、「核酸構築物」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド」は、直鎖または分岐の一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡ、またはそれらのハイブリッドを指す。また、用語は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドも包含する。ｄｓＲＮＡが合成的に生産される場合は、一般的でない塩基、例えば、イノシン、５－メチルシトシン、６－メチルアデニン、ヒポキサンチンおよびその他もまた、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ、およびリボザイム対合に用いることができる。例えば、シチジンおよびウリジンのＣ－５プロピンアナログを含むポリヌクレオチドは、高アフィニティでＲＮＡと結合し、遺伝子発現の強力なアンチセンス阻害剤となることが示されている。他の修飾、例えば、ホスホジエステル主鎖、またはＲＮＡのリボース糖基内の２’－ヒドロキシに対する修飾もすることができる。本開示の核酸構築物は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよいが、好ましくはＤＮＡである。したがって、本発明の核酸構築物は、ＤＮＡの形態で記載され用いられ得るが、使用目的に応じて、ＲＮＡの形態で記載され用いられてもよい。

本明細書において用いられる「合成」核酸またはヌクレオチド配列は、天然に見いだされないが人の手により構築される（結果として天然の産物でない）核酸またはヌクレオチド配列を指す。

本明細書において用いられる用語「ヌクレオチド配列」は、ヌクレオチドのヘテロポリマーまたは核酸分子の５’から３’末端のこれらのヌクレオチドの配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含み、ｃＤＮＡ、ＤＮＡフラグメントまたは部分、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば化学合成）ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡを含み、そのいずれかは一本鎖または二本鎖であってよい。用語「ヌクレオチド配列」「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において交換可能に用いられて、ヌクレオチドのヘテロポリマーも指す。別段の指示がされる場合を除き、本明細書において提供される核酸分子および／またはヌクレオチド配列は、本明細書において、５’から３’の方向で左から右に示され、米国の配列規則（連邦規則法典第３７巻セクション１．８２１～１．８２５）および世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５に示されるヌクレオチドの特徴を表すための標準的なコードを用いて表される。本明細書において用いられる「５’領域」は、５’末端に最も近いポリヌクレオチドの領域を意味し得る。したがって、例えば、ポリヌクレオチドの５’領域内の因子は、ポリヌクレオチドの５’末端に位置する最初のヌクレオチドから、ポリヌクレオチドの半ばに位置するヌクレオチドまでのどこかに位置し得る。本明細書において用いられる「３’領域」は、３’末端に最も近いポリヌクレオチドの領域を意味し得る。したがって、例えば、ポリヌクレオチドの３’領域内の因子は、ポリヌクレオチドの３’末端に位置する最初のヌクレオチドから、ポリヌクレオチドの半ばに位置するヌクレオチドまでのどこかに位置し得る。

本明細書において用いられる用語「パーセント配列同一性」または「パーセント同一性」は、２つの配列が最適に並べられた場合の、試験（「対象」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）と比較した、参照（「クエリー」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）の直鎖ポリヌクレオチド配列内の同一のヌクレオチドのパーセンテージを指す。一部の実施態様では、「パーセント同一性」は、アミノ酸配列内の同一のアミノ酸のパーセンテージを指し得る。

「プロトスペーサー配列」は、標的二本鎖ＤＮＡを指し、具体的には、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のスペーサー配列と完全または実質的に相補である（およびハイブリダイズする）標的ＤＮＡの一部を指す。

本明細書において用いられる用語「低減させる（ｒｅｄｕｃｅ）」「低減した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」「低減する（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」「低減（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」「縮小する（ｄｉｍｉｎｉｓｈ）」「抑制する（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）」および「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」（およびそれらの文法的変更）は、例えば、コントロールと比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の減少を示す。特定の実施態様では、低減は検出可能な活性または量を生じ得ず、または本質的に生じ得ない（すなわち、些細な量、例えば、約１０％未満または実に５％未満）。したがって、一部の実施態様では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの変異は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を、コントロール（例えば野生型Ｃａｓ９）と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％低減させ得る。

本明細書において用いられる「リピート配列」は、例えば、「スペーサー配列」により隔てられた野生型ＣＲＩＳＰＲ座または合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のリピート配列を指す。リピート配列は、対応する抗－リピート配列に対して、相補（例えば、１００％塩基対マッチ）、または、実質的に相補、例えば、少なくとも７０％相補（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い）であり得る。

本開示の合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物の「リピート配列」は、随意的な「ジッパー配列」、「バルジ配列」、「ステッチ配列」、および「スペーサー配列」を含む。一部の実施態様では、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物は、Ｇ_Ｒ１（他の実施態様ではステッチ配列に含まれる）を含み得る。

本明細書において用いられる「ジッパー配列」は、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物内のバルジ配列の３’または（３’から５’の方向に）すぐ上流に位置するリピート配列の随意的な部分を指し、少なくとも約３個のヌクレオチド（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれよりも多くのヌクレオチド、またはそれらの中の任意の範囲または値）を含み、からなり、または、から本質的になる。一部の実施態様では、ジッパー配列は、「上側ステム（ｕｐｐｅｒ ｓｔｅｍ）」と呼ばれ得る。「ジッパー配列」は、合成ｔｒａｃｒ核酸構築物上に位置する対応し随意的でもある「抗－ジッパー配列」と、十分な相補性を共有し、したがって、存在する場合は、ジッパー配列と抗－ジッパー配列が接触する際に互いにハイブリダイズすることができ、それにより、２つの核酸構築物を一緒に結合させる。一部の実施態様では、ジッパー／抗－ジッパー配列は、「上側ステム」と呼ぶことができる。ジッパー配列は、対応する抗－ジッパー配列と、完全に相補（例えば１００％塩基対マッチ）または実質的に相補、例えば、少なくとも７０％相補（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い）であり得る。したがって、本発明の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物の抗－ジッパー配列は、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物または合成ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ内の対応するジッパー配列と完全に相補または実質的に相補である、少なくとも約３個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれよりも多いヌクレオチド、またはその中の任意の範囲または値）を含む、からなる、または本質的にからなる。抗－ジッパー配列はＲＮａｓｅＩＩＩ結合部位であり、したがって、ＲＮａｓｅＩＩＩ結合に関与することが当技術分野でよく知られているヌクレオチド配列を含む（例えば、Ｐｅｒｔｚｅｖ ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４（１３）：３７０８－３７２１（２００６）を参照）。

本明細書において用いられる「配列同一性」は、２つの最適に並べられたポリヌクレオチドまたはペプチド配列が、構成要素（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）のアライメントのウインドウ全体で不変である程度を指す。「同一性」は、制限されないが：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ （Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載のものを含む公知の方法により、容易に計算することができる。

本明細書において用いられる「スペーサー配列」は、標的ＤＮＡ（例えば「プロトスペーサー配列」）に相補のヌクレオチド配列である。スペーサー配列は、標的ＤＮＡと、完全に相補または実質的に相補（例えば、少なくとも７０％相補（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い））であり得る。代表的な実施態様では、スペーサー配列は、標的ＤＮＡと１００％の相補性を有する。さらなる実施態様では、標的ＤＮＡに対するスペーサー配列の３’領域の相補性は１００％であるが、スペーサーの５’領域では１００％よりも低く、したがって、標的ＤＮＡに対するスペーサー配列の全体的な相補性は１００％未満である。したがって、例えば、２０個のヌクレオチドスペーサー配列の３’領域における、最初の７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個などのヌクレオチド（シード配列）は、標的ＤＮＡと１００％相補であり得て、一方で、スペーサー配列の５’領域における残りのヌクレオチドは、標的ＤＮＡと実質的に相補（例えば、少なくとも約７０％相補）である。一部の実施態様では、スペーサー配列の最初の７～１２個のヌクレオチドは、標的ＤＮＡと１００％相補であり得て、一方で、スペーサー配列の５’領域における残りのヌクレオチドは、標的ＤＮＡと実質的に相補（例えば、少なくとも約７０％相補）である。他の実施態様では、スペーサー配列の最初の７～１０個のヌクレオチドは標的ＤＮＡと１００％相補であり得て、一方で、スペーサー配列の５’領域における残りのヌクレオチドは標的ＤＮＡと実質的に相補（例えば、少なくとも約７０％相補）である。代表的な実施態様では、スペーサー配列の最初の７個のヌクレオチドは標的ＤＮＡと１００％相補であり得て、一方で、スペーサー配列の５’領域における残りのヌクレオチドは標的ＤＮＡと実質的に相補（例えば、少なくとも約７０％相補）である。

本明細書において用いられる「ステッチ配列」は、約５個の長さのヌクレオチドを含み、から本質的になり、またはからなり、ＮＮＴＮＮのコンセンサスヌクレオチド配列を有する、ヌクレオチド配列を指す。「ステッチ配列」は、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物上で、（５’から３’の方向に）「バルジ配列」のすぐ上流および「Ｇ_Ｒ１」の下流に位置する。「ステッチ配列」は高ＡＴ含有量を有する傾向があり、合成ｔｒａｃｒ核酸構築物内に位置する「抗－ステッチ配列」にハイブリダイズする。一部の特定の実施態様では、ステッチ配列は、（５’から３’の方向に）ＮＮＴＮＮ、ＴＴＴＧＴ、ＴＴＴＴＡ、（Ｔ／Ｃ）（Ｔ／Ｃ）Ｔ（Ｔ／Ｃ）（Ｔ／Ｇ）、ＴＴＴＴＡ、ＴＴＴＣＡのヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、またはからなる。

本明細書において用いられる「抗－ステッチ配列」は、ステッチ配列と完全に相補でハイブリダイズするヌクレオチド配列（例えば、ＮＮＡＮＮ、ＡＣＡＡＡ、ＴＡＡＡＡ、（Ｔ／Ｃ）（Ａ／Ｇ）Ｔ（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｇ）、ＴＡＡＡＡ、ＴＧＡＡＡ）を指す。抗－ステッチ配列は、合成ｔｒａｃｒ核酸構築物上で、（５’から３’の方向に）バルジ配列のすぐ下流および「ネクサス配列」のすぐ上流に位置する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まずに、合成ｔｒａｃｒＲＮＡ構築物の抗－ステッチ配列との、合成ｃｒＲＮＡ構築物のステッチ配列のハイブリダイゼーションは、「バルジ配列」の後の再建塩基対合に関与すると考えられる。一部の実施態様では、ステッチ／抗－ステッチは、「下側ステム（ｌｏｗｅｒ ｓｔｅｍ）」と呼ぶことができる。

本明細書において用いられる、２つの核酸分子、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列の関連における語句「実質的に同一」または「実質的な同一性」は、最大一致に関して比較およびアライメントした場合、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いた測定または目視検査により、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する２以上の配列またはサブシーケンスを指す。本発明の一部の実施態様では、実質的な同一性は、少なくとも約５０残基～約１５０残基の長さである配列の領域にわたって存在する。したがって、本発明の一部の実施態様では、実質的な同一性は、少なくとも約３～約１５（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５残基の長さなど、またはその中の任意の値または任意の範囲）、少なくとも約５～約３０、少なくとも約１０～約３０、少なくとも約１６～約３０、少なくとも約１８～少なくとも約２５、少なくとも約１８、少なくとも約２２、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、またはそれよりも多くの残基の長さ、およびその中の任意の範囲である配列の領域にわたって存在する。代表的な実施態様では、配列は、少なくとも約２２個のヌクレオチドにわたって実質的に同一であり得る。一部の特定の実施態様では、配列は、少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一である。一部の実施態様では、本発明の配列は、少なくとも約１６個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチドにわたって、約７０％～約１００％同一であり得る。一部の実施態様では、本発明の配列は、少なくとも約１６個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチドにわたって、約７５％～約１００％同一であり得る。さらなる実施態様では、本発明の配列は、少なくとも約１６個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチドにわたって、約８０％～約１００％同一であり得る。さらなる実施態様では、本発明の配列は、少なくとも約７個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチドにわたって、約８０％～約１００％同一であり得る。一部の実施態様では、本発明の配列は、少なくとも約１８個のヌクレオチドにわたって、約７０％同一であり得る。他の実施態様では、配列は、約２２ヌクレオチドにわたって、約８５％同一であり得る。さらに他の実施態様では、配列は、約１６個のヌクレオチドにわたって、１００％相同であり得る。さらなる実施態様では、配列は、コード領域の長さ全体にわたって実質的に同一である。さらに、代表的な実施態様では、実質的に同一のヌクレオチドまたはタンパク質配列は、実質的に同一の機能（例えば、Ｃａｓ９ ＨＮＨおよび／またはＲｕｖＣニッカーゼ活性）を発揮する。

配列比較のために、典型的に、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列としての役割がある。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および比較配列がコンピューターに入力され、必要な場合はサブシーケンス座標が指定されて、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。それから、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する試験配列（単数または複数）のパーセント配列同一性を計算する。

比較ウインドウを並べるための最適な配列アライメントは当業者に広く知られ、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎのローカル相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎの類似性検索方法などのツールにより、および場合により、ＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、および、ＴＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムのコンピューター実施により、行ない得る。試験配列および参照配列のアライメントされた区分の「同一性分数」は、２つの並べられた配列が共有する同一の構成要素の数を、参照配列セグメント（すなわち、参照配列全体または参照配列のより小さな規定部分）内の構成要素の全数で割った数である。パーセント配列同一性は、同一性分数に１００をかけて表される。１つまたは複数のポリヌクレオチド配列の比較は、全長ポリヌクレオチド配列またはその一部に対して、または、より長いポリヌクレオチド配列に対して、され得る。本発明の目的に関し、「パーセント同一性」は、翻訳ヌクレオチド配列のためのＢＬＡＳＴＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０およびポリヌクレオチド配列のためのＢＬＡＳＴＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０を用いて決定されてもよい。

ＢＬＡＳＴ解析を行なうためのソフトウェアは、国立生物工学情報センターを通じて一般に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードと並べた場合に、一部の正の値の閾値スコアＴと一致する、または満たす、クエリー配列内の長さＷのショートワードを特定することにより、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を最初に特定するステップを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるためのサーチを始める種として作用する。それから、ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸びる。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（一致する残基のペアに関する恩恵スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に関するペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向でのワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘ低下した場合は停止し、１つまたは複数の負のスコアの残基アライメントの蓄積、またはいずれかの配列が終わりに到達したことに起因して、累積スコアは０以下になる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９）を参照）。

パーセント配列同一性の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３ ５７８７ （１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの評価基準は最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間で一致が偶然に生じる確率の示度を提供する。例えば、参照ヌクレオチド配列に対する試験ヌクレオチド配列の比較における最小和確率が約０．１未満～約０．００１未満である場合に、試験核酸配列は参照配列と類似すると考えられる。したがって、本発明の一部の実施態様では、参照ヌクレオチド配列に対する試験ヌクレオチド配列の比較における最小和確率は、約０．００１未満である。

また、２つのヌクレオチド配列は、２つの配列がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする場合に、実質的に相補であると考えることができる。一部の代表的な実施態様では、実質的に相補であると考えられる２つのヌクレオチド配列は、高ストリンジェントな条件下で、互いにハイブリダイズする。

サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験の関連における、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、異なる環境パラメーターの下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ ｃｈａｐｔｅｒ ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）に見られる。一般に、高ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定のイオン強度およびｐＨでの特異的配列に関する融点（Ｔ_ｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。

Ｔ_ｍは、標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする、（規定のイオン強度およびｐＨでの）温度である。非常にストリンジェントな条件は、特異的なプローブに関するＴ_ｍと等しくなるように選択される。サザンまたはノーザンブロットでのフィルターにおける、１００よりも多い相補残基を有する相補ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、１ｍｇのヘパリンを含む５０％ホルムアミド（４２℃）であり、ハイブリダイゼーションは一晩行われる。高ストリンジェントな洗浄条件の例は、０．１ ５Ｍ ＮａＣｌ、７２℃、約１５分である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、０．２×ＳＳＣ洗浄、６５℃、１５分である（ＳＳＣバッファーの説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（以下）を参照）。バックグラウンドのプローブシグナルを除去するために、高ストリンジェンシーな洗浄の前に低ストリンジェンシーな洗浄を行うことが多い。例えば、１００個を超えるヌクレオチドのデュプレックスに関する、中ストリンジェンシーな洗浄の例は、１×ＳＳＣ、４５℃、１５分である。例えば、１００個を超えるヌクレオチドのデュプレックスに関する、低ストリンジェンシーな洗浄の例は、４～６×ＳＳＣ、４０℃、１５分である。短いプローブ（例えば、約１０～５０個のヌクレオチド）に関しては、ストリンジェントな条件は典型的に、約１．０Ｍ未満のＮａイオンの塩濃度、典型的に、約０．０１～１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）（ｐＨ７．０～８．３）を含み、温度は典型的に、少なくとも約３０℃である。また、ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成することができる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、関係のないプローブについて見られるものより２倍の（またはそれより高い）シグナル・ノイズ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしないヌクレオチド配列は、それらがコードするタンパク質が実質的に同一であるならば、依然として実質的に同一である。これは、例えば、遺伝子コードにより許容される最大コドン縮退を用いてヌクレオチド配列のコピーが作られる場合に生じ得る。

以下は、本発明の参照ヌクレオチド配列と実質的に同一である相同ヌクレオチド配列をクローニングするために用いられ得る、ハイブリダイゼーション／洗浄条件のセットの例である。一実施態様では、参照ヌクレオチド配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ（５０℃）中、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄（５０℃）で、「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズする。別の実施態様では、参照ヌクレオチド配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ（５０℃）中、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄（５０℃）で、または、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ（５０℃）中、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄（５０℃）で、「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズする。また、さらなる実施態様では、参照ヌクレオチド配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ（５０℃）中、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄（５０℃）で、または７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ（５０℃）中、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄（６５℃）で、「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズする。

本発明の任意のヌクレオチド配列および／または組み換え核酸分子は、任意の目的の種での発現のためにコドン最適化され得る。コドン最適化は当技術分野で広く知られていて、種特異的なコドン使用頻度を用いたコドン使用バイアスに関するヌクレオチド配列の改変を含む。コドン使用頻度は、目的の種に関して最も高く発現される遺伝子の配列解析に基づいて作られる。ヌクレオチド配列が核内で発現される場合、コドン使用頻度は、目的の種に関して高発現の核遺伝子の配列解析に基づいて作られる。ヌクレオチド配列の改変は、種特有のコドン使用頻度を、天然のポリヌクレオチド配列に存在するコドンと比較することにより決定される。当分野において理解されるように、ヌクレオチド配列のコドン最適化は、天然のヌクレオチド配列と１００％未満の同一性（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％など）を有するが、依然としてオリジナルの天然のヌクレオチド配列によりコードされるものと同一の機能を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を生じさせる。したがって、本発明の代表的な実施態様では、本発明のヌクレオチド配列および／または組み換え核酸分子は、特定の目的の種での発現のためにコドン最適化され得る。

一部の実施態様では、本発明の組み換え核酸分子、ヌクレオチド配列およびポリペプチドは、「分離される」。「分離された」核酸分子、「分離された」ヌクレオチド配列または「分離された」ポリペプチドは、人の手によりその天然環境から離れて存在し、したがって天然の産物ではない、核酸分子、ヌクレオチド配列またはポリペプチドである。分離された核酸分子、ヌクレオチド配列またはポリペプチドは、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造上の構成要素または他のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと関連して一般に見いだされる核酸から、少なくとも部分的に切り離された、精製された形態で存在し得る。代表的な実施態様では、分離された核酸分子、分離されたヌクレオチド配列および／または分離されたポリペプチドは、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれよりも高い純度である。

他の実施態様では、分離された核酸分子、ヌクレオチド配列またはポリペプチドは、非天然の環境（例えば組み換え宿主細胞）内に存在し得る。したがって、例えばヌクレオチド配列に関しては、用語「分離された」は、それが天然に生じる染色体および／または細胞から切り離されることを意味する。また、ポリヌクレオチドは、それが天然に生じる染色体および／または細胞から切り離され、それから、それが天然に生じない遺伝的状況、染色体および／または細胞（例えば、異なる宿主細胞、異なる制御配列、および／または天然に見られるのと異なるゲノム内の位置）に挿入される場合もまた、分離される。したがって、組み換え核酸分子、ヌクレオチド配列およびそれらのコードされるポリペプチドは、人の手により、それらの天然環境から離れて存在し、したがって、天然の産物ではない点で「分離される」が、一部の実施態様では、組み換え宿主細胞内に導入され存在することができる。

本明細書に記載の任意の実施態様では、本発明のヌクレオチド配列および／または組み換え核酸分子は、様々な生物細胞での発現のための様々なプロモーターおよび他の制御因子と動作可能に関連することができる。したがって、代表的な実施態様では、本発明の組み換え核酸は、１つまたは複数のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、１つまたは複数のプロモーターをさらに含むことができる。

本明細書において用いられる「作動可能に連結」または「動作可能に関連」により、示された因子が互いに機能的に関連し、また一般に、物理的にも関連することを意味する。したがって、本明細書において用いられる用語「作動可能に連結」または「動作可能に関連」は、機能的に関係がある単一核酸分子上のヌクレオチド配列を指す。したがって、第二のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第一のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列が、第二のヌクレオチド配列と機能的関係で配置される状況を意味する。例えば、プロモーターがヌクレオチド配列の転写または発現を果たす場合に、プロモーターは前記ヌクレオチド配列と動作可能に関連する。当業者は、コントロール配列がその発現を方向付けるように機能する限り、コントロール配列（例えばプロモーター）は、それが動作可能に関連するヌクレオチド配列と隣接している必要はないことを理解するだろう。したがって、例えば、介在する非翻訳でなお転写される配列が、プロモーターとヌクレオチド配列との間に存在してよく、プロモーターは依然としてヌクレオチド配列に「作動可能に連結」していると考えることができる。

「プロモーター」は、プロモーターと動作可能に関連するヌクレオチド配列の転写をコントロールまたは制御するヌクレオチド配列（すなわち、コード配列）である。コード配列は、ポリペプチドおよび／または機能性ＲＮＡをコードし得る。典型的に、「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに関する結合部位を含むヌクレオチド配列を指し、転写の開始を管理する。一般に、プロモーターは、５’または対応するコード配列のコード領域のスタートに対して上流に見られる。プロモーター領域は、遺伝子発現のレギュレーターとして作用する他の因子を含んでよい。これらはＴＡＴＡボックスコンセンサス配列を含み、そして、ＣＡＡＴボックスコンセンサス配列を含むことが多い（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，（１９８１） Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：３４９）。植物では、ＣＡＡＴボックスはＡＧＧＡボックスで置き換えられ得る（Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｔ．Ｋｏｓｕｇｅ，Ｃ．Ｍｅｒｅｄｉｔｈ ａｎｄ Ａ．Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ（ｅｄｓ．），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．２１１－２２７）。

プロモーターは、組み換え核酸分子（すなわち、「キメラ遺伝子」または「キメラポリヌクレオチド」）の調製で用いるための、例えば、構成的、誘導性、時間的に制御された、発生学的に制御された、化学的に制御された、組織－好適および／または組織－特異的なプロモーターを含んでよい。これらの様々なタイプのプロモーターは、当技術分野で知られている。

プロモーターの選択は、発現のための時間的および空間的要求に応じて変化し、および、形質転換される宿主細胞にも応じて変化する。多くの異なる生物のためのプロモーターは、当技術分野でよく知られている。当分野に存在する広範囲の知識に基づき、適切なプロモーターを、特定の目的宿主生物のために選択することができる。したがって、例えば、モデル生物において、高度に構成的に発現された遺伝子の上流のプロモーターについて多くが知られ、そのような知識は、必要に応じて、他のシステムで容易に利用および実施することができる。

一部の実施態様では、本発明の核酸構築物は、「発現カセット」であってよく、または発現カセット内に含まれてよい。本明細書において用いられる「発現カセット」は、目的のヌクレオチド配列（例えば本発明の核酸構築物（例えば、合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲアレイ、キメラ核酸構築物；目的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列））を含む組み換え核酸分子を意味し、ここで、前記ヌクレオチド配列は、少なくともコントロール配列（例えばプロモーター）と動作可能に関連する。したがって、本発明の一部の態様は、本発明のヌクレオチド配列を発現するように設計された発現カセットを提供する。

目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであってよく、それの構成要素の少なくとも１つが、それの他の構成要素の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。また、発現カセットは、天然起源であるが異種発現に有用である組み換え型で得られたものであってもよい。

また、発現カセットは、場合により、選択された宿主細胞内で機能性の転写および／または翻訳終結領域（すなわち終結領域）を含んでもよい。様々な転写終結因子が発現カセットでの使用に利用可能であり、目的の異種ヌクレオチド配列を超えて転写の終結に関与し、ｍＲＮＡのポリアデニル化を修正する。終結領域は、転写開始領域に対して天然であり得て、作動可能に連結された目的のヌクレオチド配列に対して天然であり得て、宿主細胞に対して天然であり得て、または、別の起源（すなわち、プロモーターに対して、目的のヌクレオチド配列に対して、宿主に対して外因または異種、またはそれらの任意の組み合わせ）に由来し得る。

また、発現カセットは、形質転換された宿主細胞を選択するために用いることのできる選択可能なマーカーに関するヌクレオチド配列を含むこともできる。本明細書において用いられる「選択可能なマーカー」は、発現した場合に、マーカーを発現している宿主細胞に、区別できる表現型を与え、したがって、そのマーカーを有さないものからそのような形質転換された細胞が区別されるのを可能にする、ヌクレオチド配列を意味する。そのようなヌクレオチド配列は、マーカーが、化学的手段により、例えば選択剤（例えば抗生物質など）を用いることにより、選択することのできる形質を与えるかどうか、または、マーカーが単に、例えばスクリーニング（例えば蛍光）による、観察または試験を介して同定され得る形質であるかどうかに応じて、選択可能なマーカーまたはスクリーニング可能なマーカーのいずれかをコードし得る。もちろん、適切な選択可能なマーカーの多くの例が当技術分野で知られていて、本明細書に記載の発現カセットにおいて用いることができる。

発現カセットに加えて、本明細書に記載の核酸分子およびヌクレオチド配列は、ベクターとの関連で用いることができる。用語「ベクター」は、核酸（単数）（または核酸（複数））を細胞に移行、送達または導入するための組成物を指す。ベクターは、移行、送達または導入されるヌクレオチド配列（単数または複数）を含む核酸分子を含む。宿主生物の形質転換での使用のためのベクターは、当技術分野でよく知られている。ベクターの全般的なクラスの非限定的な例は、限定されないが、二本鎖または一本鎖の直鎖または環状型の、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、バクテリオファージ、人工染色体、またはアグロバクテリウムバイナリーベクターを含み、自己で伝染または動員が可能であってよく、または不可能であってよい。本明細書に定義されるベクターは、細胞ゲノムへの組込みにより原核生物または真核生物宿主を形質転換することができ、または、染色体外に存在することができる（例えば複製起点を有する自己複製プラスミド）。天然にまたは設計により、放線菌および関連種、細菌および真核生物（例えば、より高度の植物、哺乳類、酵母または真菌細胞）から選択され得る２つの異なる宿主生物での複製が可能であるＤＮＡビヒクルを意味する、シャトルベクターがさらに含まれる。一部の代表的な実施態様では、ベクター内の核酸は、宿主細胞での転写のための適切なプロモーターまたは他の制御因子の制御下であり、作動可能に連結されている。ベクターは、複数の宿主内で機能する二機能性発現ベクターであり得る。ゲノムＤＮＡの場合は、これは、それ自身のプロモーターまたは他の制御因子を含み得て、ｃＤＮＡの場合は、これは、宿主細胞での発現のための適切なプロモーターまたは他の制御因子の制御下であり得る。したがって、本発明の核酸分子および／または発現カセットは、本明細書に記載され、当技術分野で知られているように、ベクター内に含まれ得る。

目的のポリヌクレオチドの関連における「導入する（ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ）」、「導入する（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ）」、「導入された（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ）」（およびそれらの文法的変更）は、目的のヌクレオチド配列を、宿主生物または前記生物の細胞（例えば、宿主細胞）に、ヌクレオチド配列が細胞の内部に接近するような方法で提示することを意味する。１個よりも多いヌクレオチド配列が導入される場合は、これらのヌクレオチド配列は、単一のポリヌクレオチドまたは核酸構築物の一部として、または別個のポリヌクレオチドまたは核酸構築物として、集まることができ、同一または異なる発現構築物または形質転換ベクター上に位置することができる。したがって、これらのポリヌクレオチドは、細胞単一の形質転換イベントで、別個の形質転換／トランスフェクションイベントで、細胞に導入され得て、または、例えば、それらは従来の繁殖プロトコルにより生物に取り込まれ得る。したがって、本発明の一部の態様では、本発明の１つまたは複数の核酸構築物（例えば、合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲアレイ、キメラ核酸構築物；目的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列など）を、宿主生物または前記宿主生物の細胞に導入することができる。

本明細書において用いられる用語「形質転換」または「トランスフェクション」は、細胞への異種核酸の導入を指す。細胞の形質転換は、安定または一過的であり得る。したがって、一部の実施態様では、宿主細胞または宿主生物は、本発明の核酸分子により安定的に形質転換される。他の実施態様では、宿主細胞または宿主生物は、本発明の組み換え核酸分子により一過的に形質転換される。

ポリヌクレオチドの関連における「一過的に形質転換される」は、ポリヌクレオチドが細胞に導入されて、細胞のゲノム内に組込まれないことを意味する。

細胞内に導入されたポリヌクレオチドの関連における「安定に導入される（ｓｔａｂｌｙ ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ）」または「安定に導入された（ｓｔａｂｌｙ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ）」は、導入されたポリヌクレオチドが細胞のゲノム内に安定的に取り込まれ、したがって細胞がポリヌクレオチドで安定的に形質転換されることを意図する。

本明細書において用いられる「安定した形質転換」または「安定的に形質転換された」は、核酸分子が細胞内に導入されて、細胞のゲノム内に組込むことを意味する。したがって、組み込まれた核酸分子は、その子孫により、より具体的には、複数の後に続く世代の子孫により、受け継がれることが可能である。また、本明細書において用いられる「ゲノム」は、核およびプラスチドゲノムも含み、したがって、例えば葉緑体またはミトコンドリアゲノムへの核酸の組込みを含む。また、本明細書において用いられる安定した形質転換は、染色体外に例えばミニ染色体またはプラスミドとして維持される導入遺伝子も指し得る。

一過的な形質転換は、生物内に導入された１つまたは複数の導入遺伝子によりコードされるペプチドまたはポリペプチドの存在を検出することのできる、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはウエスタンブロットなどにより、検出され得る。細胞の安定した形質転換は、生物（例えば、植物、哺乳類、昆虫、古細菌、細菌など）に導入された導入遺伝子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を用いた、細胞のゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションアッセイなどにより、検出することができる。細胞の安定した形質転換は、植物または他の生物に導入された導入遺伝子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を用いた、細胞のＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーションアッセイなどにより、検出することができる。また、細胞の安定した形質転換は、例えば、導入遺伝子の標的配列（単数または複数）とハイブリダイズする特異的なプライマー配列を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当技術分野でよく知られている他の増幅反応により検出することもでき、導入遺伝子配列の増幅をもたらし、標準的な方法に従って検出することができる。また、形質転換は、当技術分野でよく知られているダイレクトシーケンスおよび／またはハイブリダイゼーションのプロトコルにより検出することもできる。

したがって、一部の実施態様では、ヌクレオチド配列、構築物、発現カセットは、一過的に発現することができ、および／または、それらは宿主生物のゲノム内に安定的に取り込まれ得る。

本発明の組み換え核酸分子／ポリヌクレオチドは、当業者に公知の任意の方法により、細胞内に導入することができる。本発明の一部の実施態様では、細胞の形質転換は、核形質転換を含む。他の実施態様では、細胞の形質転換は、プラスチド形質転換（例えば、葉緑体形質転換）を含む。またさらなる実施態様では、本発明の組み換え核酸分子／ポリヌクレオチドは、従来の繁殖技術を介して細胞に導入することができる。

真核生物および原核生物は両方とも、形質転換の手順は広く知られていて当分野においてルーチンであり、文献全体を通して記載される（例えば、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３－２３９；Ｒａｎｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ８：２２８１－２３０８（２０１３）を参照）。

したがって、ヌクレオチド配列は、当技術分野でよく知られている任意の数の方法で、宿主生物またはその細胞に導入することができる。本発明の方法は、１つまたは複数のヌクレオチド配列が生物内に導入されるためには、それらが生物の少なくとも１つの細胞の内部に接近しさえすれば、特定の方法に依存しない。１個よりも多いヌクレオチド配列が導入される場合は、それらは、単一の核酸構築物の一部として、または別個の核酸構築物として、集まることができ、同一または異なる核酸構築物上に位置することができる。したがって、ヌクレオチド配列は、単一の形質転換イベントで、または別個の形質転換イベントで、目的の細胞内に導入することができ、あるいは、関連する場合は、ヌクレオチド配列は、繁殖プロトコルの一部として植物内に取り込むことができる。

本発明は、標的ＤＮＡの部位特異的ニック、切断および／または改変のための、および、標的ＤＮＡに対する目的ポリペプチドの部位特異的ターゲッティングのための、増大した効率および増大した特異性を有する組成物および方法に関する。

本発明の核酸構築物およびヌクレオチド配列は、構築物または配列の全体的な構造または機能に影響を与えない代替の方法で表すことができる。したがって、例えば、ある場合には、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸（ｃｒＲＮＡ）は、揺らぎ塩基Ｇ_Ｒ１配列（Ｇ／Ｕ）およびステッチ配列を含むことができ、あるいは、ｃｒＲＮＡは、（Ｇ／Ｕ）揺らぎ塩基を含むステッチ配列を含むことができ、したがって、Ｇ_Ｒ１配列をさらに表さない。ある場合には、ＧＲ１は対合しない（すなわちＧ／ＡはＬｊｅとミスマッチである、図２０）。さらなる等価性は、以下に提供される等価表（表１）に示されるものを含む（図２２も参照）。

したがって、本発明の一態様では、合成トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＤＮＡ）構築物が提供され、前記構築物は、５’から３’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む、から本質的になる、またはからなる抗－ジッパー配列；少なくとも約３個のヌクレオチドを含むバルジ配列；ＮＮＡＮＮのヌクレオチド配列を含む抗－ステッチ配列；ＴＮＡＮＮＣ、Ｔ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ（またはＵ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ））、ＴＣＡＡＡＣ、（またはＵＣＡＡＡＣ）、ＴＡＡＧＧＣ（またはＵＡＡＧＧＣ）、ＧＡＴＡＡＧＧ（またはＧＡＵＡＡＧＧ）、ＧＡＴＡＡＧＧＣＴＴ（またはＧＡＵＡＡＧＧＣＵＵ）、ＴＣＡＡＧ（またはＵＣＡＡＧ）、ＴＣＡＡＧＣＡＡ（またはＵＣＡＡＧＣＡＡ）、Ｔ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）（またはＵ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｕ））、ＧＡＴＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣ、ＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ、ＴＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣ、またはＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣのヌクレオチド配列を含むネクサス配列；および、少なくとも１つのヘアピンを有するヌクレオチド配列を含むヘアピン配列を、含み、から本質的になり、またはからなり、前記ヘアピンは、少なくとも３個の一致する塩基対を含み、ここで、抗－ジッパー配列は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、抗－ステッチ配列のすぐ上流に位置し、抗－ステッチ配列は、ネクサス配列のすぐ上流に位置し、および、ネクサス配列は、ヘアピン配列のすぐ上流に位置する。一部の実施態様では、抗－ステッチ配列は、ＮＮＡＮＮ、ＡＣＡＡＡ、ＴＡＡＡＡ、（Ｔ／Ｃ）（Ａ／Ｇ）Ｔ（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｇ）、ＴＡＡＡＡ、ＴＧＡＡＡのヌクレオチド配列を、含む、から本質的になる、またはからなる。

さらなる実施態様では、５’から３’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む随意的な抗－ジッパー配列；少なくとも約３個のヌクレオチドを含むバルジ配列；ＮＮＡＮＮのヌクレオチド配列を含む抗－ステッチ配列；ＴＮＡＮＮＣ、Ｔ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ（またはＵ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ））、ＴＣＡＡＡＣ、（またはＵＣＡＡＡＣ）、ＴＡＡＧＧＣ（またはＵＡＡＧＧＣ）、ＧＡＴＡＡＧＧ（またはＧＡＵＡＡＧＧ）、ＧＡＴＡＡＧＧＣＴＴ（またはＧＡＵＡＡＧＧＣＵＵ）、ＴＣＡＡＧ（またはＵＣＡＡＧ）、ＴＣＡＡＧＣＡＡ（またはＵＣＡＡＧＣＡＡ）、Ｔ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）（またはＵ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｕ））、ＧＡＴＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣ、ＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ、ＴＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣ、またはＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣのヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、またはからなる、ネクサス配列、および、少なくとも１つのヘアピンを有するヌクレオチド配列を含むヘアピン配列を、含む、から本質的になる、またはからなる、合成トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸構築物が提供され、前記ヘアピンは、少なくとも３個の一致する塩基対を含み、ここで、抗－ジッパー配列は、存在する場合は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、抗－ステッチ配列のすぐ上流に位置し、抗－ステッチ配列は、ネクサス配列のすぐ上流に位置し、および、ネクサス配列は、ヘアピン配列のすぐ上流に位置する。

一部の実施態様では、合成ｔｒａｃｒ核酸構築物のバルジ配列は、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む、から本質的になる、またはからなる。一部の実施態様では、合成ｔｒａｃｒ核酸構築物のバルジ配列は、少なくとも約４個のヌクレオチドを含む、から本質的になる、またはからなる。他の実施態様では、合成ｔｒａｃｒ核酸構築物のバルジ配列は、５個のヌクレオチドを含む、から本質的になる、またはからなる。他の実施態様では、合成ｔｒａｃｒ核酸構築物のヘアピン配列は、少なくとも２個のヘアピンを含み、から本質的になり、またはからなり、各ヘアピンは、少なくとも３個の一致する塩基対を含む。

さらなる態様では、本発明は、３’から５’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む、から本質的になる、またはからなる随意的なジッパー配列、少なくとも２個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列（例えば、（－ＮＮ－）のヌクレオチド配列）を含む、から本質的になる、またはからなるバルジ配列、ＮＮＴＮＮ（またはＮＮＵＮＮ）のヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、またはからなるステッチ配列、ヌクレオチドＧまたはＧＴＴを含む、から本質的になる、またはからなるＧ_Ｒ１、および、５’末端および３’末端を有するスペーサー配列であって、その３’末端に標的ＤＮＡと１００％の同一性を有する少なくとも７個のヌクレオチドを含む、から本質的になる、またはからなるスペーサー配列を、含む、から本質的になる、またはからなる合成ＣＲＩＳＰＲ核酸（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）構築物を提供し、ジッパー配列は、存在する場合は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、ステッチ配列のすぐ上流に位置し、ステッチ配列は、Ｇ_Ｒ１のすぐ上流に位置し、および、Ｇ_Ｒ１は、スペーサー配列のすぐ上流に位置する。

さらなる実施態様では、３’から５’の方向に、抗－ジッパーにハイブリダイズする少なくとも３個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む随意的なジッパー配列、少なくとも約２個のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むバルジ配列、ＮＮＵＮＮのヌクレオチド配列を含むステッチ配列（、および５’末端および３’末端を有するスペーサー配列であって、その３’末端に標的ＤＮＡと１００％の同一性を有する少なくとも７個のヌクレオチドを含むスペーサー配列を、含む、から本質的になる、またはからなる合成ＣＲＩＳＰＲ核酸（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）構築物が提供され、ジッパー配列は、存在する場合は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、ステッチ配列のすぐ上流に位置し、ステッチ配列は、スペーサー配列のすぐ上流に位置する。

一部の実施態様では、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイが提供され、前記合成ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイは、本発明の２以上のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、２以上のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物は、前記ヌクレオチド配列上で互いにすぐ隣に位置し、前記２以上のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のステッチ配列は同一であり、前記２以上のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のスペーサー配列は同一または非同一であり、および、存在する場合は、前記２以上のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のジッパー配列は同一である。

他の態様では、本発明の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物および合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物を含むキメラ核酸構築物（またはガイド核酸構築物）が提供され、ここで、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のジッパー配列は、前記合成ｔｒａｃｒ核酸構築物の抗－ジッパー配列と少なくとも約７０％（例えば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％など）相補でありハイブリダイズし、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のステッチ配列は、前記合成ｔｒａｃｒ核酸構築物の抗－ステッチ配列と１００％同一でありハイブリダイズし、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のバルジ配列および合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のバルジ配列は、非相補である。

他の実施態様では、本発明の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物および合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物を含む、から本質的になる、またはからなるキメラ核酸構築物が提供され、ここで、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のステッチ配列のＮＮＵＮＮは、前記合成ｔｒａｃｒ核酸構築物の抗－ステッチ配列のＮＮＡＮＮと１００％相補でありハイブリダイズし、前記ステッチ配列の（Ｇ）は、前記抗－ステッチ配列のＵと揺らぎ塩基対合を形成し、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のバルジ配列および合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のバルジ配列は、非相補であり、ジッパー配列および抗－ジッパー配列が存在する場合は、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のジッパー配列は、前記合成ｔｒａｃｒ核酸構築物の抗－ジッパー配列にハイブリダイズする。

一部の実施態様では、キメラ核酸構築物は、場合により、ハイブリダイズしたジッパーおよび抗－ジッパー配列を連結するヌクレオチドを、ハイブリダイズした配列の末端（バルジ配列に対して遠位）にさらに含むことができる。さらなる実施態様では、ジッパーおよび抗－ジッパーが存在しない場合、キメラ核酸構築物は、場合により、合成ｔｒａｃ核酸配列のバルジ配列を合成ＣＲＩＳＰＲ核酸のバルジ配列に連結するヌクレオチドをさらに含むことができる。連結するヌクレオチドは、任意のヌクレオチド（例えば、Ｔ、Ａ、Ｇ、Ｃ）であってよく、ジッパー配列および抗－ジッパー配列またはバルジ配列を連結するヌクレオチドの数は、約３個～約７個であり得る。

さらなる態様では、本発明の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ、またはキメラ核酸構築物は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性（例えば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％など）を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、または、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を、さらに含むことができる。本発明で有用なＣａｓ９ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおいてＤＮＡ切断を触媒することが知られる任意のＣａｓ９ヌクレアーゼであってよい。当技術分野で知られているように、そのようなＣａｓ９ヌクレアーゼは、ＨＮＨモチーフおよびＲｕｖＣモチーフ（例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２；ＷＯ／２０１３／１８８６３８を参照）を含む。一部の実施態様では、ＨＮＨモチーフまたはＲｕｖＣモチーフは、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼと比較してそれらの活性を低下または消去する変異を含み得る。一部の実施態様では、片方のモチーフのみ（例えば、ＨＮＨモチーフまたはＲｕｖＣモチーフのいずれか）が突然変異される。他の実施態様では、両方の活性が低下または消去されるように両方のモチーフが突然変異される。ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異などを含む任意のタイプの変異を用いて、Ｃａｓ９ヌクレアーゼでのＨＮＨモチーフおよび／またはＲｕｖＣモチーフの活性を低下または消去することができる。

本開示は、様々なＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムおよびＣａｓ９ヌクレアーゼのグループ化を特定する。これらのグループ化は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ １（Ｓｔｈ ＣＲ１）グループ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ ３（Ｓｔｈ ＣＲ３）グループ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ＣＤ０３４（Ｌｂ）グループ、およびＣａｓ９ヌクレアーゼのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ（Ｌｒｈ）グループを含む。Ｓｔｈ ＣＲ１グループＣａｓ９ヌクレアーゼの非限定的な例は、配列番号１～９および５１のポリペプチド配列によりコードされるＣａｓ９ヌクレアーゼを含む。Ｓｔｈ ＣＲ３グループＣａｓ９ヌクレアーゼの非限定的な例は、配列番号１０～２３のポリペプチド配列によりコードされるＣａｓ９ヌクレアーゼを含む。ＬｂグループＣａｓ９ヌクレアーゼの非限定的な例は、配列番号２８、３０～３３、３５、４３、４４、４７、５０および５２のポリペプチド配列によりコードされるＣａｓ９ヌクレアーゼを含む。ＬｒｈグループＣａｓ９ヌクレアーゼの非限定的な例は、配列番号２４～２７、２９、３４、３６～４２、４５および５３のポリペプチド配列によりコードされるＣａｓ９ヌクレアーゼを含む。さらなるＣａｓ９ヌクレアーゼは、限定されないが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ ＣＲＬ ７０５のものを含む。本発明で有用なさらなるＣａｓ９ヌクレアーゼは、限定されないが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ ＫＣＴＣ ３５０１、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ ＷＰ ０１００１８９４９．１由来の、Ｃａｓ９を含む。

したがって、一部の実施態様では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ １（Ｓｔｈ ＣＲ１）グループ由来のＣａｓ９、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ ３（Ｓｔｈ ＣＲ３）グループ由来のＣａｓ９、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ＣＤ０３４（Ｌｂ）グループ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼ、および／または、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ（Ｌｒｈ）グループ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼを含み得る、から本質的になり得る、またはからなり得る。さらなる実施態様では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするアミノ酸配列は、配列番号１～配列番号５３のいずれか１つのアミノ酸配列であってよい。また、さらなる実施態様では、本開示の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ、および／またはキメラ核酸構築物で有用なＣａｓ９ヌクレアーゼは、配列番号１～配列番号５３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、またはからなる。

さらに、特定の実施態様では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、標的ＤＮＡを含む生物のためにコドン最適化されたヌクレオチド配列によりコードされ得る。さらに他の実施態様では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、少なくとも１つの核局在化配列を含み得る。

本発明者は、驚くべきことに、特定のグループのＣａｓ９ヌクレアーゼと合成ｔｒａｃｒ核酸構築物（ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＤＮＡ）のネクサス配列間の機能的対合を発見した。したがって、一部の実施態様では、ネクサス配列がＧＡＴＡＡＧＧＣまたはＧＡＴＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣである場合、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ １（ＳＴｈ ＣＲ１）グループ由来であり；ネクサス配列がＴＡＡＧＧＣまたはＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣである場合は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ ３（Ｓｔｈ ＣＲ３）グループ由来であり；ネクサス配列がＴＣＡＡＧＣまたはＴＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣである場合は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ＣＤ０３４（Ｌｂ）グループ由来であり；または、前記ネクサス配列がＴＣＡＡＡＣまたはＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣである場合は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ（Ｌｒｈ）グループ由来である。

本明細書に記載のように、本発明で有用なＣａｓ９ヌクレアーゼは、ＨＮＨモチーフおよび／またはＲｕｖＣモチーフに変異を含んでよく、それにより、それぞれのモチーフの活性が低下または消去される。当技術分野で知られているように、ＨＮＨモチーフ内の変異は、二本鎖標的ＤＮＡの（＋）鎖の部位特異的ニックを減少／消去し、ＲｕｃＶ活性部位の変異は、二本鎖標的ＤＮＡの（－）鎖の部位特異的ニックを低下／消去する。両方の活性部位の変異は、ＤＮＡの切断を低下／消去する（すなわち、標的ＤＮＡの部位特異的切断を低下／消去する）。したがって、一部の実施態様では、本開示の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ、および／またはキメラ核酸構築物は、ＲｕｖＣ活性部位モチーフ内に変異を有するＣａｓ９ヌクレアーゼを含む。他の実施態様では、本開示の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ、および／またはキメラ核酸構築物は、ＨＮＨ活性部位モチーフ内に変異を有するＣａｓ９ヌクレアーゼを含む。またさらなる実施態様では、本開示の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ、および／またはキメラ核酸構築物は、ＨＮＨ活性部位モチーフ内およびＲｕｖＣモチーフ内に変異を有するＣａｓ９ヌクレアーゼを含む。

またさらなる実施態様では、ＨＮＨおよびＲｕｖＣモチーフ内に変異を有し、それによりヌクレアーゼ活性が低下または消去されたＣａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼに融合された目的ポリペプチドをさらに含む。そのようなＣａｓ９－目的ポリペプチド融合タンパク質を用いて、目的ポリペプチドを特定の標的ＤＮＡへ向かわせる、または標的化することができる。

本開示の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ、および／またはキメラ核酸構築物を用いるための方法が、本明細書においてさらに提供される。したがって、一部の実施態様では、本開示のキメラ核酸構築物または本開示のキメラ核酸構築物を含む発現カセットを、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、配列番号１～５３）の存在下で標的ＤＮＡと接触させ、それにより、標的ＤＮＡに対するスペーサー配列の相補ハイブリダイゼーションにより規定される領域内で標的ＤＮＡの部位特異的切断を生じさせるステップを含む、二本鎖標的ＤＮＡの部位特異的切断のための方法が提供される。一部の実施態様では、部位特異的切断は、二本鎖標的ＤＮＡの（＋）鎖の部位特異的ニックであってよく、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ活性部位モチーフ内の変異を含み、それにより、二本鎖標的の（＋）鎖を切断して、部位－特異的なニックを二本鎖標的ＤＮＡの前記（＋）鎖に生じさせる。他の実施態様では、部位特異的切断は、二本鎖標的ＤＮＡの（－）鎖の部位特異的ニックであり、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＨＮＨ活性部位モチーフ内に点変異を含み、それにより、二本鎖標的ＤＮＡの（－）鎖を切断し、二本鎖標的ＤＮＡの前記（－）鎖に部位－特異的なニックを生じさせる。

さらなる実施態様では、二本鎖標的ＤＮＡの部位特異的切断のための方法が提供され、以下を含む：トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸分子およびＣＲＩＳＰＲ核酸分子を、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、配列番号１～５３）の存在下で標的ＤＮＡと接触させるステップ、ここで、（ａ）ｔｒａｃｒ核酸分子は、５’から３’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む抗－ジッパー配列；少なくとも約３個のヌクレオチドを含むバルジ配列；ＮＮＡＮＮのヌクレオチド配列を含む抗－ステッチ配列；ＴＮＡＮＮＣ、Ｔ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ、ＴＣＡＡＡＣ、ＴＡＡＧＧＣ、ＧＡＴＡＡＧＧ、ＧＡＴＡＡＧＧＣＴＴ、ＴＣＡＡＧ、ＴＣＡＡＧＣＡＡ、Ｔ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）、ＧＡＴＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣ、ＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ、ＴＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣ、またはＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣのヌクレオチド配列を含むネクサス配列；および、少なくとも１つのヘアピンを含む、から本質的になる、またはからなる、ヌクレオチド配列を含むヘアピン配列を含む、ヌクレオチド配列によりコードされ、前記ヘアピンは少なくとも３個の一致する塩基対を含み、抗－ジッパー配列は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、抗－ステッチ配列のすぐ上流に位置し、抗－ステッチ配列は、ネクサス配列のすぐ上流に位置し、および、ネクサス配列は、ヘアピン配列のすぐ上流に位置する；および、（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ核酸分子は、３’から５’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含むジッパー配列、少なくとも２個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含むバルジ配列、ＮＮＴＮＮ（またはＮＮＵＮＮ）のヌクレオチド配列を含むステッチ配列、ヌクレオチドＧまたはＧＴＴを含むＧ_Ｒ１、および５’末端および３’末端を有するスペーサー配列であって、その３’末端に標的ＤＮＡと１００％の同一性を有する少なくとも７個のヌクレオチドを含むスペーサー配列を含む、ヌクレオチド配列によりコードされ、ジッパー配列は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、ステッチ配列のすぐ上流に位置し、ステッチ配列は、Ｇ_Ｒ１のすぐ上流に位置し、および、Ｇ_Ｒ１は、スペーサー配列のすぐ上流に位置する、およびさらにここで、ｔｒａｃｒ核酸分子の抗－ジッパー配列および抗－ステッチ配列は、それぞれ、ＣＲＩＳＰＲ核酸分子のジッパー配列およびステッチ配列と、少なくとも約７０％相補でありハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ核酸分子のスペーサー配列は、標的ＤＮＡの一部（標的ＤＮＡ上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する）と少なくとも約８０％相補でありハイブリダイズし、それにより、標的ＤＮＡに対するＣＲＩＳＰＲ核酸分子のスペーサー配列の相補結合により規定される領域内で、標的ＤＮＡの部位特異的切断をもたらす。

他の実施態様では、二本鎖標的ＤＮＡを、以下を含むキメラ核酸と接触させるステップ含む、二本鎖標的ＤＮＡの部位特異的切断のための方法が提供される。（ａ）５’から３’の方向に、少なくとも約９個のヌクレオチドを含む抗－ジッパー配列；少なくとも約４個のヌクレオチドを含むバルジ配列；ＮＮＡＮＮのヌクレオチド配列を含む抗－ステッチ配列；ＴＮＡＮＮＣ、Ｔ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ、ＴＣＡＡＡＣ、ＴＡＡＧＧＣ、ＧＡＴＡＡＧＧ、ＧＡＴＡＡＧＧＣＴＴ、ＴＣＡＡＧ、ＴＣＡＡＧＣＡＡ、Ｔ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）、ＧＡＴＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣ、ＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ、ＴＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣ、またはＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣのヌクレオチド配列を含むネクサス配列；および、少なくとも１つのヘアピンを有するヌクレオチド配列を含むヘアピン配列を含む、第一のヌクレオチド配列（前記ヘアピンは、少なくとも３個の一致する塩基対を含み、抗－ジッパー配列は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、抗－ステッチ配列のすぐ上流に位置し、抗－ステッチ配列は、ネクサス配列のすぐ上流に位置し、ネクサス配列は、ヘアピン配列のすぐ上流に位置する）；（ｂ）３’から５’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含むジッパー配列、少なくとも２個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含むバルジ配列、ＮＮＴＮＮ（またはＮＮＵＮＮ）のヌクレオチド配列を含むステッチ配列、ヌクレオチドＧまたはＧＴＴを含むＧ_Ｒ１、および、５’末端および３’末端を有するスペーサー配列であって、その３’末端に標的ＤＮＡと１００％の同一性を有する少なくとも７個のヌクレオチドを含むスペーサー配列を含む、第二のヌクレオチド配列（ジッパー配列は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、ステッチ配列のすぐ上流に位置し、ステッチ配列は、Ｇ_Ｒ１のすぐ上流に位置し、および、Ｇ_Ｒ１は、スペーサー配列のすぐ上流に位置する）；および、（ｃ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、配列番号１～５３）をコードするアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、第三のヌクレオチド配列（ここで、第一のヌクレオチド配列の抗－ジッパー配列および抗－ステッチ配列は、第二のヌクレオチド配列のジッパー配列およびステッチ配列にハイブリダイズし、第二のヌクレオチド配列のスペーサー配列は、標的ＤＮＡの一部（標的ＤＮＡ上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する）にハイブリダイズし、それにより、標的ＤＮＡに対する第二のヌクレオチド配列のスペーサー配列の相補結合により規定される領域内で、標的ＤＮＡの部位特異的切断をもたらす）。

さらなる実施態様では、二本鎖（ｄｓ）標的ＤＮＡに対する、目的ポリペプチドの部位特異的ターゲッティングの方法が提供され、トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸分子およびＣＲＩＳＰＲ核酸分子を、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、配列番号１～５３）の存在下で標的ＤＮＡと接触させるステップを含み、ここで（ａ）ｔｒａｃｒ核酸分子は、５’から３’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む抗－ジッパー配列；少なくとも約３個のヌクレオチドを含むバルジ配列；ＮＮＡＮＮのヌクレオチド配列を含む抗－ステッチ配列；ＴＮＡＮＮＣ、Ｔ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ、ＴＣＡＡＡＣ、ＴＡＡＧＧＣ、ＧＡＴＡＡＧＧ、ＧＡＴＡＡＧＧＣＴＴ、ＴＣＡＡＧ、ＴＣＡＡＧＣＡＡ、Ｔ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）、ＧＡＴＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣ、ＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ、ＴＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣ、またはＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣのヌクレオチド配列を含むネクサス配列；および、少なくとも１つのヘアピンを有するヌクレオチド配列を含むヘアピン配列を含む、ヌクレオチド配列によりコードされ、前記ヘアピンは、少なくとも３個の一致する塩基対を含み、抗－ジッパー配列は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、抗－ステッチ配列のすぐ上流に位置し、抗－ステッチ配列は、ネクサス配列のすぐ上流に位置し、および、ネクサス配列は、ヘアピン配列のすぐ上流に位置する；および、（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ核酸分子は、３’から５’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含むジッパー配列、少なくとも２個のヌクレオチド（例えば（－ＮＮ－）のヌクレオチド配列）を含むバルジ配列、ＮＮＴＮＮのヌクレオチド配列を含むステッチ配列、ヌクレオチドＧまたはＧＴＴを含むＧ_Ｒ１、および５’末端および３’末端を有するスペーサー配列であって、その３’末端に標的ＤＮＡと１００％の同一性を有する少なくとも７個のヌクレオチドを含むスペーサー配列を含む、ヌクレオチド配列によりコードされ、ジッパー配列は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、ステッチ配列のすぐ上流に位置し、ステッチ配列は、Ｇ_Ｒ１のすぐ上流に位置し、および、Ｇ_Ｒ１は、スペーサー配列のすぐ上流に位置する、およびさらにここで、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＨＮＨ活性部位モチーフ内の変異、ＲｕｖＣ活性部位モチーフ内の変異を含み、および、目的ポリペプチドに融合され、抗－ジッパー配列は、ジッパー配列と約７０％相補でありハイブリダイズし、ステッチ配列は、ステッチ配列と１００％相補でありハイブリダイズし、スペーサー配列は、標的ＤＮＡ上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する標的ＤＮＡと約８０％相補でありハイブリダイズし、それにより、標的ＤＮＡに対するＣＲＩＳＰＲ核酸分子のスペーサー配列の相補結合により規定される領域で、標的ＤＮＡに対する目的ポリペプチドの部位特異的ターゲッティングをもたらす。

代表的な実施態様では、本明細書に記載のように、合成ｔｒａｃｒ核酸構築物に関して、合成ｔｒａｃｒ核酸分子のバルジ配列または第一のヌクレオチド配列は、約３個、４個または５個のヌクレオチドを含み得て、から本質的になり得て、またはからなり得る。他の実施態様では、バルジ配列は、５個のヌクレオチドを含み得て、から本質的になり得て、またはからなり得て、および、ヘアピン配列は、少なくとも２個のヘアピンを含み得て、から本質的になり得て、またはからなり得て、ここで、各ヘアピンは少なくとも３個の一致する塩基対を含む。

さらなる実施態様では、本発明は、トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸分子およびＣＲＩＳＰＲ核酸分子を、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの存在下で標的ＤＮＡと接触させるステップを含む二本鎖標的ＤＮＡの部位特異的切断のための方法を提供し、ここで、
（ａ）ｔｒａｃｒ核酸分子は、５’から３’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む随意的な抗－ジッパー配列；少なくとも約３個のヌクレオチドを含むバルジ配列；ＮＮＡＮＮのヌクレオチド配列を含む抗－ステッチ配列、ＴＮＡＮＮＣ、Ｔ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ、ＴＣＡＡＡＣ、ＴＡＡＧＧＣ、ＧＡＴＡＡＧＧ、ＧＡＴＡＡＧＧＣＴＴ、ＴＣＡＡＧ、ＴＣＡＡＧＣＡＡ、Ｔ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）、ＧＡＴＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣ、ＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ、ＴＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣ、またはＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣのヌクレオチド配列を含むネクサス配列、少なくとも１つのヘアピンを有するヌクレオチド配列を含むヘアピン配列を含むヌクレオチド配列によりコードされ、前記ヘアピンは、少なくとも３個の一致する塩基対を含む、および
抗－ジッパー配列は、存在する場合は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、抗－ステッチ配列のすぐ上流に位置し、抗－ステッチ配列は、ネクサス配列のすぐ上流に位置し、および、ネクサス配列は、ヘアピン配列のすぐ上流に位置する；および
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ核酸分子は、３’から５’の方向に、抗－ジッパーにハイブリダイズする少なくとも３個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む随意的なジッパー配列、（－ＮＮ－）のヌクレオチド配列を含むバルジ配列、ＮＮＵＮＮのヌクレオチド配列を含むステッチ配列、および５’末端および３’末端を有するスペーサー配列であって、その３’末端に標的ＤＮＡと１００％の同一性を有する少なくとも７個のヌクレオチドを含むスペーサー配列を含むヌクレオチド配列によりコードされ、および
ジッパー配列は、存在する場合は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、ステッチ配列のすぐ上流に位置し、ステッチ配列は、スペーサー配列のすぐ上流に位置し、および、
さらにここで、抗－ジッパーおよびジッパー配列が存在する場合は、抗－ジッパー配列はジッパー配列にハイブリダイズし、抗－ステッチ配列のＮＮＡＮＮは、ステッチ配列のＮＮＵＮＮに相補でありハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ核酸分子のスペーサー配列は標的ＤＮＡの一部（標的ＤＮＡ上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する）にハイブリダイズし、それにより、標的ＤＮＡに対するＣＲＩＳＰＲ核酸分子のスペーサー配列のハイブリダイゼーションにより規定される領域内で、標的ＤＮＡの部位特異的切断をもたらす。

またさらなる実施態様では、二本鎖標的ＤＮＡの部位特異的切断のための方法が提供され、その方法は、二本鎖標的ＤＮＡを、以下を含むキメラ核酸と接触させるステップを含む：
（ａ）５’から３’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む随意的な抗－ジッパー配列；少なくとも約３個のヌクレオチドを含むバルジ配列；ＮＮＡＮＮのヌクレオチド配列を含む抗－ステッチ配列、ＴＮＡＮＮＣ、Ｔ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ、ＴＣＡＡＡＣ、ＴＡＡＧＧＣ、ＧＡＴＡＡＧＧ、ＧＡＴＡＡＧＧＣＴＴ、ＴＣＡＡＧ、ＴＣＡＡＧＣＡＡ、Ｔ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）、ＧＡＴＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣ、ＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ、ＴＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣ、またはＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣのヌクレオチド配列を含むネクサス配列、少なくとも１つのヘアピンを有するヌクレオチド配列を含むヘアピン配列を含む、第一のヌクレオチド配列（前記ヘアピンは、少なくとも３個の一致する塩基対を含む）、
ここで、抗－ジッパー配列は、存在する場合は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、抗－ステッチ配列のすぐ上流に位置し、抗－ステッチ配列は、ネクサス配列のすぐ上流に位置し、および、ネクサス配列は、ヘアピン配列のすぐ上流に位置する；
（ｂ）３’から５’の方向に、抗－ジッパーにハイブリダイズする少なくとも３個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む随意的なジッパー配列、少なくとも２個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列（例えば、（－ＮＮ－）のヌクレオチド配列）を含むバルジ配列、ＮＮＵＮＮのヌクレオチド配列を含むステッチ配列、および５’末端および３’末端を有するスペーサー配列であって、その３’末端に標的ＤＮＡと１００％の同一性を有する少なくとも７個のヌクレオチドを含むスペーサー配列を含む、第二のヌクレオチド配列、および
ジッパー配列は、存在する場合は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、ステッチ配列のすぐ上流に位置し、ステッチ配列は、スペーサー配列のすぐ上流に位置する；および
（ｃ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、配列番号１～５３）をコードするアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、第三のヌクレオチド配列、
ここで、ジッパー配列および抗－ジッパー配列が存在する場合は、ジッパー配列は、抗－ジッパー配列にハイブリダイズし、抗－ステッチ配列のＮＮＡＮＮは、ステッチ配列のＮＮＵＮＮと相補でありハイブリダイズし、第二のヌクレオチド配列のスペーサー配列は、標的ＤＮＡの一部（標的ＤＮＡ上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する）にハイブリダイズし、それにより、標的ＤＮＡに対する第二のヌクレオチド配列のスペーサー配列のハイブリダイゼーションにより規定される領域内で、標的ＤＮＡの部位特異的切断をもたらす。

さらなる実施態様では、二本鎖（ｄｓ）標的ＤＮＡに対する、目的ポリペプチドの部位特異的ターゲッティングの方法が提供され、トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸分子およびＣＲＩＳＰＲ核酸分子を、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、配列番号１～５３）の存在下で標的ＤＮＡと接触させるステップを含み、
ここで、（ａ）ｔｒａｃｒ核酸分子は、５’から３’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む随意的な抗－ジッパー配列；少なくとも約３個のヌクレオチドを含むバルジ配列；ＮＮＡＮＮのヌクレオチド配列を含む抗－ステッチ配列、ＴＮＡＮＮＣ、Ｔ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ、ＴＣＡＡＡＣ、ＴＡＡＧＧＣ、ＧＡＴＡＡＧＧ、ＧＡＴＡＡＧＧＣＴＴ、ＴＣＡＡＧ、ＴＣＡＡＧＣＡＡ、Ｔ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）、ＧＡＴＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣ、ＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ、ＴＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣ、またはＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣのヌクレオチド配列を含むネクサス配列、少なくとも１つのヘアピンを有するヌクレオチド配列を含むヘアピン配列を含む、ヌクレオチド配列によりコードされ、前記ヘアピンは、少なくとも３個の一致する塩基対を含み、および
抗－ジッパー配列は、存在する場合は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、抗－ステッチ配列のすぐ上流に位置し、抗－ステッチ配列は、ネクサス配列のすぐ上流に位置し、および、ネクサス配列は、ヘアピン配列のすぐ上流に位置する；および
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ核酸分子は、３’から５’の方向に、抗－ジッパーにハイブリダイズする少なくとも３個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む随意的なジッパー配列、少なくとも２個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列（例えば、（－ＮＮ－）のヌクレオチド配列）を含むバルジ配列、ＮＮＵＮＮのヌクレオチド配列を含むステッチ配列、および５’末端および３’末端を有するスペーサー配列であって、その３’末端に標的ＤＮＡと１００％の同一性を有する少なくとも７個のヌクレオチドを含むスペーサー配列を含む、ヌクレオチド配列によりコードされ、および
ジッパー配列は、存在する場合は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、ステッチ配列のすぐ上流に位置し、ステッチ配列は、スペーサー配列のすぐ上流に位置し、および
さらにここで、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＨＮＨ活性部位モチーフ内の変異、ＲｕｖＣ活性部位モチーフ内の変異を含み、目的ポリペプチドに融合され、ジッパー配列および抗－ジッパー配列が存在する場合は、ジッパー配列は抗－ジッパー配列にハイブリダイズし、抗－ステッチ配列のＮＮＡＮＮは、ステッチ配列のＮＮＵＮＮと相補でありハイブリダイズし、スペーサー配列は、標的ＤＮＡ上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する標的ＤＮＡにハイブリダイズし、それにより、標的ＤＮＡに対するＣＲＩＳＰＲ核酸分子のスペーサー配列のハイブリダイゼーションにより規定される領域内で、標的ＤＮＡに対する目的ポリペプチドの部位特異的ターゲッティングをもたらす。

一部の実施態様では、ｔｒａｃｒ核酸分子およびａＣＲＩＳＰＲ核酸分子の抗－ジッパーおよびジッパー配列または第一のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列がハイブリダイズする場合、ハイブリダイズした配列は、場合により、バルジ配列に対して遠位であるハイブリダイズした配列の末端にさらなるヌクレオチドをさらに含むことができ、それにより、ハイブリダイズしたジッパーおよび抗－ジッパー配列を連結する。さらなる実施態様では、ジッパーおよび抗－ジッパーが存在しない場合、キメラ核酸構築物は、場合により、合成ｔｒａｃ核酸配列のバルジ配列を合成ＣＲＩＳＰＲ核酸のバルジ配列に連結するヌクレオチドをさらに含むことができる。連結ヌクレオチドは、任意のヌクレオチド（例えば、Ｔ、Ａ、Ｇ、Ｃ）であり得て、ジッパーおよび抗－ジッパー配列またはバルジ配列を連結するヌクレオチドの数は、約３～約７個であり得る。

制限されないが配列番号１～５３を含む、任意の野生型、突然変異型、コドン最適化Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、または、本明細書に記載の少なくとも１つの核局在化配列を含むものは、本発明の方法で用いることができる。

本明細書においてさらに提供されるのは、本発明の核酸構築物、核酸アレイ、核酸分子および／またはヌクレオチド配列を含む、発現カセットおよびベクターであり、本開示の方法で用いることができる。

さらなる態様では、本発明の核酸構築物、核酸アレイ、核酸分子、および／またはヌクレオチド配列は、宿主生物の細胞に導入することができる。本発明が有用である任意の細胞／宿主生物を用いることができる。例示的な宿主生物は、限定されないが、植物、細菌、古細菌、菌類、動物、哺乳類、昆虫、鳥類、魚類、両生類、刺胞動物、ヒト、または非ヒト霊長類を含む。特定の実施態様では、宿主生物は、制限されないが、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｚｅａｅ ｍａｙｄｉｓ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ、または、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａであってよい。さらなる実施態様では、本発明で有用な細胞は、制限されないが、幹細胞、体細胞、生殖細胞、植物細胞、動物細胞、細菌性細胞、古細菌細胞、真菌細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、両生類細胞、刺胞動物細胞、ヒト細胞、または非ヒト霊長類細胞であってよい。他の実施態様では、本発明で有用な細胞は、制限されないが、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｚｅａｅ ｍａｙｄｉｓ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ、または、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来の細胞を含む。

本発明のさらなる態様では、目的ポリペプチドは、制限されないが、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ジャイレース、デメチラーゼ、キナーゼ、ジスムターゼ、インテグラーゼ、トランスポゼース、テロメラーゼ、リコンビナーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ、ポリメラーゼ、ホスファターゼ、リガーゼ、ユビキシンリガーゼ、ホトリアーゼまたはグリコシラーゼを含んでよい。本発明の他の態様では、目的ポリペプチドは、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、アルキル化活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性 ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性またはテロメア修復活性、または脱アミノ化活性を有する。代表的な実施態様では、目的ポリペプチドは、キナーゼ活性、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキシンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、またはテロメア修復活性を有するポリペプチドであってよい。

本発明の核酸構築物、核酸分子、および／またはヌクレオチド配列を含むキットが、本明細書においてさらに提供される。

したがって、一態様では、二本鎖ＤＮＡの部位特異的切断のためのキットが提供され、そのキットは、本発明の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイまたはキメラ核酸構築物を含む。別の態様では、二本鎖（ｄｓ）標的ＤＮＡに対する目的ポリペプチドの部位特異的ターゲッティングのためのキットが提供され、そのキットは、本発明の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイまたはキメラ核酸構築物を含む。一部の態様では、キットは、１つまたは複数の発現カセットに包含された、本発明の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイおよび／またはキメラ核酸構築物を含んでよい。またさらなる態様では、キットは、本明細書に記載の本発明の核酸構築物、核酸アレイ、核酸分子、および／またはヌクレオチド配列で用いるためのＣａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、配列番号１～５３）をさらに含んでよい。

さらなる態様では、キットはプライマーを含んでよく、前記プライマーは、両方向にＣＲＩＳＰＲリピート配列の一部を含む。他の実施態様では、キットは、ＣＲＩＳＰＲアレイの境界（すなわち一方のリーダーエンドともう片方のトレーラーエンド）を含んで両方向にＣＲＩＳＰＲリピート配列を通って伸長するように設計された、プライマーを含んでよい。
さらなる実施態様では、キットは、使用のための説明書をさらに含んでよい。

ここで本発明は、以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例は本発明に対する請求項の範囲を限定することを意図しないが、特定の実施態様の例示であることが意図されることが、理解されるべきである。当業者が想到する例示された方法における任意の変更は、本発明の範囲内であることが意図される。

実施例１．ガイド配列内に同定されたモジュールの機能的役割の評価
Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）および関連するＣａｓタンパク質は、細菌および古細菌において侵襲性遺伝因子に対する適応免疫を与える^１。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムでは、シグネチャＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼＣａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲスペーサーに相補な配列を特異的に標的化し、２つのニッカーゼドメインを用いた二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を生じさせる（Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９，４６７－４７７（２０１１）；Ｇａｒｎｅａｕ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４６８，６７－７１（２０１０）；Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９，９２７５－９２８２（２０１１）；Ｇａｓｉｕｎａｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ Ａ １０９，Ｅ２５７９－Ｅ２５８６（２０１２）；Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－８２１（２０１２））。Ｃａｓ９－特異的プロトスペーサー－隣接モチーフ（ＰＡＭ）が隣接している限り、任意のＤＮＡ配列が標的とされ得る。Ｇａｒｎｅａｕ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４６８，６７－７１（２０１０）；Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９，９２７５－９２８２（２０１１）；Ｇａｓｉｕｎａｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ Ａ １０９，Ｅ２５７９－Ｅ２５８６（２０１２）；Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－８２１（２０１２）；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５０７，６２（２０１４））。Ｃａｓ９システムによるターゲッティングおよび切断は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）からなるＲＮＡデュプレックスに依拠する^８。この天然の複合体は、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡデュプレックスをミミックする合成のシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）キメラにより置き換えることができる（Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－８２１（２０１２））。Ｃａｓ９と組み合わせたｓｇＲＮＡは、エンジニアリングおよび工業上および翻訳上興味深い様々なモデルシステムへの異種移行に適した、便利で、コンパクトで、そしてポータブルな、配列－特異的なターゲッティングシステムを作る。

したがって、二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせるためのコンパクトで実践的な手段を提供するＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ技術は、革命的なゲノム編成を有し（Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８２３－８２６（２０１３）；Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８１９－８２３（２０１３）；Ｊｉａｎｇ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１，２３３－２３９（２０１３）；Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．＆Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２，３４７－３５５．（２０１４））、ハイスループットのゲノム全域にわたる遺伝子スクリーニングに新しい道を切り開き^{１３，１４}、転写調節のツールボックスを拡張した（Ｑｉ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５２，１１７３－１１８３（２０１３）；Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５４，４４２－４５１（２０１３））。さらに、進化的に離れたＣａｓ９：ｓｇＲＮＡの間の相互作用の不存在は（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ ｂｉｏｌｏｇｙ １０，７２６－７３７（２０１３）；Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２０１３）；Ｅｓｖｅｌｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１３））、共存する機能性ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが同時に機能する場合、多重の非依存性ターゲッティングが細胞内で達成されるのを可能にした（Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５，１７０９－１７１２（２００７）；Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０，１４０１－１４１２（２００８））。これらの分子機構の広範な使用にかかわらず、ｓｇＲＮＡガイドの重大な特性、および、機能的にオルソロガスなＣａｓ９エンドヌクレアーゼの定義におけるそれらの関与は、特徴付けが未だされていない。実際に、Ｃａｓ９ターゲッティングおよび切断の初期の注目は、スペーサー：標的相補性およびＰＡＭ配列感度に焦点が当てられ、一方で、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ相互作用を駆動する因子およびＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム間の直交性を指示する因子を定義する情報は不足したままである。したがって、我々は、ＣＲＩＳＰＲ技術に関する新しいエンジニアリングの道を切り開くために、Ｃａｓ９ターゲッティングおよび切断特異性を与えるｓｇＲＮＡ内の特性を同定および特徴付けに着手した。

したがって、本明細書に記載のガイド配列内に同定された様々なモジュール（例えば、合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、キメラ核酸構築物（ｔｒａｃｒ核酸－合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物）の機能的役割および意味合い（ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を評価するために、我々は、前述の機能性モジュールのそれぞれの改変または欠失を含む、ガイドの突然変異の変異体を設計した。我々は、代表的な機能性モデルとしてＳｔｈＣＲＩＳＰＲ３システムを選択し、天然のガイド配列を用いてポジティブの機能性コントロール（野生型、ＷＴ）を最初に確立した。それから我々は、ステッチが欠失した「ステッチ」変異体を試験し、機能の損失を観察した。それから、バルジが欠失した「バルジ」変異体を試験し、機能の損失を観察した。それから我々は、ネクサスが欠失した「ネクサス」変異体を試験し、機能の損失を観察した。それから我々は、第一のヘアピンが欠失した「ヘアピン」変異体を試験し、機能の損失を観察した。続いて我々は、配列特異性および可変性感受性を試験し、突然変異の構築物において、ネクサスの配列は特異的であり、一方で他の機能性モジュール、とりわけジッパー、バルジ、ヘアピンおよびステッチに関しては可変性許容性があることを確立した。これらの実験の結果を図１～２１に示す。

したがって、図１は、ネクサスモジュールに関する多重配列アライメントを示し、図２は、本研究を通して開発されたネクサスモジュールに関する最大尤度ツリーを提供する。図３Ａ～図３Ｄは、Ｓｔｈ Ｃｒ１グループ（図３Ａ）、Ｓｔｈ Ｃｒ３グループ（図３Ｂ）、Ｌｒｈグループ（図３Ｃ）およびＬｂｕグループ（図３Ｄ）のネクサスモジュールに関するコンセンサス配列を示す。

図５は、抗－ステッチモジュールに関する多重配列アライメントを示し、一方で、図６Ａ～図６Ｄは、Ｓｔｈ Ｃｒ１グループ（図６Ａ）、Ｓｔｈ Ｃｒ３グループ（図６Ｂ）、Ｌｒｈグループ（図６Ｃ）およびＬｂｕグループ（図６Ｄ）の抗－ステッチモジュールに関するコンセンサス配列を示す。

同様に、バルジモジュールに関する多重配列アライメントが図７に提供され、Ｓｔｈ Ｃｒ１グループのバルジモジュールに関するコンセンサス配列が図８Ａに示される。図８Ｂは、Ｓｔｈ Ｃｒ３グループのバルジモジュールに関するコンセンサス配列を示す。図８Ｃは、Ｌｒｈグループのコンセンサス配列を示し、図８Ｄは、Ｌｂｕグループのバルジモジュールに関するコンセンサス配列を示す。

ジッパーモジュールに関する多重配列アライメントが図９に示され、図１０は、ジッパーモジュールに関する最大尤度ツリーを示す。

図１１は、バルジ、抗－ステッチおよびネクサスモジュールに関する多重配列アライメントを示す。図４は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼに関する最大尤度ツリーを示す。

図１２～図２１は、様々なｃＲＮＡ：ｔｒａｃＲＮＡ構築物に関するガイド配列およびターゲッティングを示し、Ｓｔｈ ＣＲ１グループを表すＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲ３（図１２）；Ｌｂｕグループを表すＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ（図１３）；Ｓｔｈ ＣＲ１グループを表すＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲ１（図１４）；Ｓｔｈ ＣＲ３グループを表すＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ Ｍ１ ＧＡＳ（図１５）；Ｌｒｈグループを表すＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（図１６）；Ｌａｎグループを表すＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ（図１７）；Ｌｃａグループを表すＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ（図１８）；Ｌｇａグループを表すＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（図１９）；Ｌｊｅグループを表すＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ（図２０）；および、Ｌｐｅグループを表すＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓを含む（図２１）。図１２～図２１のそれぞれの下側は、標的配列（オープン構造）および隣接する（３’）ＰＡＭを含む、標的ｄｓＤＮＡを表す。各図の上側は、標的配列に相補の５’部分、およびＣＲＩＳＰＲリピートに由来する３’部分からなる、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を表し；そしてまた、抗－ＣＲＩＳＰＲリピート部分からなるｔｒａｃｒＲＮＡ、および、ネクサスおよび３’ヘアピンも示す。図１２～図２１のそれぞれに示されるように、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡデュプレックスの相補部分は、下側ステム（下の相補部分）、バルジ（ヘルニアミスマッチ（ｈｅｒｎｉａｔｅｄ ｍｉｓｍａｔｃｈ））および上側ステム（上の相補部分）からなる。

実施例２．様々なさらなるＩＩ型システムにおける、ガイドＲＮＡ配列の特性の決定
実施例１で説明した知見は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）活性をサポートするために必要なｓｇＲＮＡでの重要なモジュールを確立する。しかしながら、ゲノム編成に幅広く用いられるが、ＳｐｙＣａｓ９は、天然に見いだされた多くのＣａｓ９オルソロガス（ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ）の単なる１つにすぎない（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ ｂｉｏｌｏｇｙ １０，７２６－７３７（２０１３）；Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２０１３））。したがって、我々は次に、同じｓｇＲＮＡ配列の特性が、他のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムでも生じるかどうかを研究した。我々は、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓゲノム（ＩＩ型システムが優先的に生じる^２）から４１個のＣａｓ９配列をサンプリングし、それらの対応するＣＲＩＳＰＲリピートを同定し、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を予測した。Ｃａｓ９タンパク質配列は、３つの主な配列グループにクラスタリングされた（図２３）。期待したとおり、似たグループ化が、ＣＲＩＳＰＲ－リピートまたは予測ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のいずれかを用いてクラスタリングを行なった場合に見られ（図２４Ａ、図２３、図２５、図２６）、ｔｒａｃｒＲＮＡ内の抗－ＣＲＩＳＰＲリピートの存在、およびＣａｓ９およびｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡのペアの間の関係深い分子関係を与えた（Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９，４６７－４７７（２０１１）；Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４７１，６０２－６０７（２０１１）；Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２０１３））。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内に、我々は一貫して、ＳｐｙＣａｓ９に関して同定された機能性モジュールを観察し（図２４Ｂ）、ファミリー間の全体的なｓｇＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ構造は保存されていて、クラスター内で高レベルに配列が保存されていた。

下側ステム（すなわちステッチ／抗－ステッチ）と上側ステム（すなわちジッパー／抗－ジッパー）との間に方向のねじれを有するバルジの存在が、システムの多様性にわたって一貫して見られた。下側ステムの長さは、ファミリー内で高度に保存され、および、ファミリー間で可変であった。興味深いことに、最も高いレベルの保存はネクサス配列に関して見られた（図２４Ｂ、図２７）。ＧＣ－リッチのステムおよびオフセットのウラシルを有する、全般的なネクサスの形状は、２つのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓファミリー間で共有されていた。対照的に、独特な二重ステムのネクサス（図２４Ａ～Ｂ）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓシステムに特有で遍在した。意外なことに、ネクサス内のいくつかの塩基は、Ａ５２およびＣ５５を含む異なるファミリー間でさえ厳密に保存されていて（図２４Ａ～Ｂ）、このモジュールの重大な役割をさらに強調した。実際に、Ａ５２は、ＳｐｙＣａｓ９の結晶構造において、標的鎖の５’末端付近の残基１１０３－１１０７の主鎖と相互作用し、タンパク質主鎖とネクサスの相互作用がＰＡＭ結合に必要であり得ることを示唆する。

Ｃａｓ９タンパク質の直交性に対する、ガイドＲＮＡの構造の関係の決定。本明細書に記載の知見は、ｓｇＲＮＡの配列と構造の間の潜在的関係およびＣａｓ９タンパク質の多様性を示唆する。この観察は、Ｃａｓ９オルソロガスのグループを定義するｓｇＲＮＡモジュールを決定することを我々に駆り立てた。したがって、我々は、２つの天然に共存するオルソロガスのＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＩＩ型システム、すなわちＳｔｈ１ Ｃａｓ９およびＳｔｈ３ Ｃａｓ９由来のエンドヌクレアーゼを選択し（Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０，１４０１－１４１２（２００８））、ｓｇＲＮＡ組成物とＣａｓ９直交性との間の関連を調べた。一連の実験は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでの自己ターゲッティング活性に基づいて設計され（図２８Ａ～Ｂ）、ｓｇＲＮＡ内の特異的な変異が、オルソロガスであった（ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ）Ｃａｓ９での切断活性を促進することができるかどうか試験した。我々は、Ｓｔｈ１Ｃａｓ９およびＳｔｈ３Ｃａｓ９システムに関してオーバーラップするＣａｓ９標的部位を含むＥ．ｃｏｌｉゲノム内の領域を同定し、切断が１ヌクレオチドにおいて生じること（図２９Ｂ）、および、ＰＡＭ配列が好適にオーバーラップすることを確認した。我々は、２つのｓｇＲＮＡ主鎖のキメラバージョンを製造し、スペーサー、下側ステム（すなわちステッチ／抗ステッチ）－バルジ－上側ステム（すなわちジッパー／抗－ジッパー）、ネクサスおよびヘアピンを交換し（図２９Ｃ）、および、Ｓｔｈ１Ｃａｓ９またはＳｔｈ３Ｃａｓ９のいずれかにより、自己ターゲッティングを駆動する（Ｇｏｍａａ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＭＢｉｏ．５，ｅ００９２８－１３（２０１４））、それらの能力を試験した。初めに我々は、これらの２つのシステムが、このアッセイシステムにおいて実際に直交性であること、および、各ガイドは単独でその同起源Ｃａｓ９でのターゲッティングを駆動すること（図２９Ｃ）を確認した。次に我々は、スペーサー配列の交換は、Ｓｔｈ１Ｃａｓ９切断活性をサポートすることが可能な、ＣＲＩＳＰＲ３スペーサーおよびＣＲＩＳＰＲ１主鎖を有するｓｇＲＮＡをもたらすことを示した。しかしながら、Ｓｔｈ３Ｃａｓ９活性について逆は成り立たない。ＣＲＩＳＰＲ１スペーサーおよびＣＲＩＳＰＲ３主鎖を含むｓｇＲＮＡは、Ｓｔｈ３Ｃａｓ９活性をサポートしない（図２９Ｃ）。我々は、この一方向性の相互機能性は、ＳｔｈＣＲＩＳＰＲ１システムにおけるプロトスペーサーとＰＡＭとの間の空間に関する要件の柔軟性に起因すると仮定する（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１３．５３９７２６．（２０１４））（図２９Ｃ、上パネル）。それから我々は、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９との間の機能性は、２つの直交性システム間でネクサス－ヘアピンの組み合わせを交換するだけで変更することができることを示した。ｓｇＲＮＡの再プログラミングの主な結果は、オリジナルのＣａｓ９をガイドする能力がそのプロセスで失われることである（図２９Ｃ、下パネル）。これは、ＣＲＩＳＰＲリピート配列がオルソロガスのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの定義において重要な役割を果たすという標準的な考えと対照的である。しかしながら、これらの結果は、変更されたネクサス配列を有するキメラｓｇＲＮＡが、予測可能および一方向性の方法で直交性を再プログラムすることができることを示し、異なるＰＡＭと関連する直交性Ｃａｓ９タンパク質をさらに利用するために重大である（Ｅｓｖｅｌｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１３）））。

最近の構造的および生化学的データは、Ｃａｓ９によるＤＮＡ認識および切断のメカニズムに光を放ち始めている（Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－８２１（２０１２）；Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３，６１７６（２０１４）；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５６，９３５（２０１４））。ａｐｏ－、ＲＮＡ－結合およびタンパク質／ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体の電子顕微鏡写真は、ガイドＲＮＡと結合する際に、Ｃａｓ９は、劇的な立体構造変化を受けて、標的ＤＮＡ結合および切断の構造を促進することを示した（Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３，６１７６（２０１４）。結晶構造は、電子顕微鏡による画像と矛盾せずに、ＳｐｙＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ：ＤＮＡ：複合体およびａｐｏ－ＳｐｙＣａｓ９は、ＲＮＡ－およびＤＮＡ－結合ドメインの実質的な再編成が２つの構造間で行なわれて、著しく異なる構造を占めることを示す（Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３，６１７６（２０１４）；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５６，９３５（２０１４））。ネクサスは、ＳｐｙＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ：ＤＮＡ複合体において重大な位置を占め、タンパク質およびｓｇＲＮＡの多くの重要な構成要素を整合し、タンパク質およびＲＮＡの両方を適切に配置して、切断のための標的ＤＮＡデュプレックスを受け取る。ｓｇＲＮＡ：ＤＮＡと結合する際に、アルギニン－リッチのブリッジヘリックスが、ネクサスの塩基および下側ステムに結合する。加えて、ネクサスは、ＳｐｙＣａｓ９の２つのローブ（ｌｏｂｅ）由来の２つの小さな領域（我々は、Ｎｅｘｕｓ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ １（ＮＩＲ１）４４６－４９７、および、Ｎｅｘｕｓ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ ２（ＮＩＲ２）１１０５－１１３８として確立することを提案する）と相互作用する。これらの領域の両方ともａｐｏＳｐｙＣａｓ９構造内で無秩序であり、とりわけ、ＰＡＭ認識^２１において重要であるとして特定される２つのトリプトファン残基を含む。また、ＮＩＲ２は、下側ステムとも直接相互作用し、ネクサス－結合部位と反対の面は、標的鎖の３’末端にごく接近して存在し、ネクサスとの相互作用が、ＰＡＭ認識部位を整えるために必要であり得ることを示唆する。とりわけ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ Ｃａｓ９（ＡｎａＣａｓ９）ａｐｏ－構造（Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３，６１７６（２０１４））では、ＮＩＲ２が整えられ、約５０個のアミノ酸の挿入を含む。ＡｎａＣａｓ９が、より大きいネクサス（および場合によりＰＡＭ配列を伴う）を認識し得ると考える動機がある。

しかしながら、これらの結果は、ガイドＲＮＡ内に６個の異なる特徴があることを明らかにし、バルジおよびネクサスを、Ｃａｓ９ターゲッティングおよび切断をガイドする、構造－および配列－特異的な特性として確立する。これは、ｓｇＲＮＡ組成物の最適化のための基礎、および、先天性の免疫応答を潜在的に引き起こす二本鎖ＲＮＡのより小さな領域を含みアデノ－関連のウイルスなどへのパッケージングにより適している短い最小のガイドＲＮＡを設計するチャンスのあるデザインを提供する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに関するこの理解は、Ｂｒｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５６：３３３－３３９（２０１４））およびＮｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ １５６：９３５－９４９（２０１４）により裏付けられ、配列の改変は、改変された配列がＣａｓ９をガイドする能力に影響することが示されている。注目すべきことに、これらの研究は、ガイド内のネクサス配列が、相補ＤＮＡへ向かってＣａｓ９をガイドすること、およびその後の切断に、重大であることを確認する。

改変ネクサス配列を有するキメラｓｇＲＮＡを用いてＣａｓ９直交性を再プログラムする能力は、天然のＣａｓ９オルソロガス（ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ）の多様性を利用する潜在力を有する新規のＣａｓ９タンパク質の開発のための新しい道を切り開き、便利なパッケージングおよび送達のための短いＣａｓ９変異体を含む。加えて、キメラｍｇＲＮＡを用いてＣａｓ９を再プログラムする能力は、標的頻度（ｔａｒｇｅｔ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）の柔軟な管理（短いＰＡＭが頻発する）およびオフターゲットの切断の減少による特異性（より長いＰＡＭが稀に発生する）のための、様々なＰＡＭの増大した用途を可能にするであろう。またこれは、様々なキメラガイドとともに単一のＣａｓ９を使用することにより、または、スタンダードまたはキメラｓｇＲＮＡの異なる組み合わせとともに直交性システムを同時に使用することにより、多重の機会を広げる。まとめると、我々の知見は、Ｃａｓ９－依存性ＤＮＡターゲッティングのための新しい道を切り開き、および、次世代のＣＲＩＳＰＲに基づく技術の開発のためのステージをセットする。

実施例３。
ＣＲＩＳＰＲ１座およびＣＲＩＳＰＲ３座由来のｃａｓ９遺伝子を、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９由来のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ｐｗｔＣａｓ９－細菌にクローニングした（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃４４２５０））（Ｑｉ，Ｌ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５２，１１７３－１１８３（２０１３））。ｓｇＲＮＡ－発現プラスミドを構築するために、ｐｄＣａｓ９－細菌プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃４４２４９）（Ｉｄ．）内のＳｐｅＩ制限部位を除去し、ＣＲＩＳＰＲ１またはＣＲＩＳＰＲ３座に基づくｚｒａＰ－ターゲッティングｓｇＲＮＡをコードするｇＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ）を、ｐｇＲＮＡ－細菌プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ＃４４２５１）（Ｉｄ．）のＰＣＲ－増幅された主鎖と組み合わせた。形質転換分析のためにＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２を用いて、形質転換効率は、以前に説明されるとおりに（Ｇｏｍａａ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＭＢｉｏ．５，ｅ００９２８－１３（２０１４））、試験されたｓｇＲＮＡプラスミドに関する形質転換体の数を、ｐｓｇＲＮＡ－Ｃ１－Ｔ４コントロールプラスミドに関する形質転換体の数で割ることにより計算した。

プラスミド構築。Ｃａｓ９－発現プラスミドを構築するために、ＣＲＩＳＰＲ１座（Ｓｔｈ１－Ｃａｓ９）およびＣＲＩＳＰＲ３座（Ｓｔｈ３－Ｃａｓ９）由来のＣａｓ９遺伝子を、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９から抽出されたゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。各ＰＣＲ産物を、ギブソンアセンブリーによって、ｐｗｔＣａｓ９－細菌（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃４４２５０）（Ｑｉ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５２，１１７３－１１８３（２０１３））のＰＣＲ－増幅された主鎖と組み合わせた。ｓｇＲＮＡ－発現プラスミドを構築するために、プラスミドをＳｐｅＩで消化することによりｐｄＣａｓ９－細菌プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ＃４４２４９）（Ｉｄ．）内のＳｐｅＩ制限部位を除去し、平滑末端化し、再ライゲーションしてｐｄＣａｓ９ΔＳｐｅＩプラスミドを生産した。別個に、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９内のＣＲＩＳＰＲ１（Ｃ１）座またはＣＲＩＳＰＲ３（Ｃ３）座に基づくｚｒａＰ－ターゲッティングｓｇＲＮＡをコードするｇＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ）を、ギブソンアセンブリーによって、ｐｇＲＮＡ－細菌プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃４４２５１）（Ｉｄ．）のＰＣＲ－増幅された主鎖と組み合わせ、それにより、オリジナルのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｓｇＲＮＡ配列を、設計したｓｇＲＮＡ配列で置き換えた。それから、生じたｓｇＲＮＡプラスミドおよびｐｄＣａｓ９ΔＳｐｅＩ主鎖をＡａｔＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、各ｓｇＲＮＡプラスミドおよびｐｄＣａｓ９ΔＳｐｅＩプラスミドのゲル－抽出フラグメントを一緒にライゲーションして、ｐｓｇＲＮＡ－ＳｔｈＣ１およびｐｓｇＲＮＡ－ＳｔｈＣ３を形成した。ｓｇＲＮＡ配列を改変するために、５’リン酸化オリゴヌクレオチドを、ｐｓｇＲＮＡ－Ｃ１プラスミドまたはｐｓｇＲＮＡ－Ｃ３プラスミドのＳｐｅＩ／ＫｐｎＩまたはＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にアニールさせてライゲーションした。全てのプラスミド改変をシーケンシングにより確認した。

株および増殖条件。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ｓｕｂｓｔ．ＭＧ１６５５（遺伝子型：Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２ Ｆ λ－ ｉｌｖＧ－ ｒｆｂ－５Ｃ ｒｐｈ－１）を、全ての形質転換分析に用いた。株は、別段の指示がない限り、ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）中、３７℃および２５０ＲＰＭで好気的に増殖させた。培地は、必要に応じて抗生物質（３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）で補充した。

形質転換アッセイ。示された（ｉｎｄｉｃａｔｅｄ）Ｃａｓ９－発現プラスミドを保有する細胞の冷凍ストックを、単離のためにストリークして、個々のコロニーを３ｍｌのＬＢ培地に植菌して一晩培養した。生じた培養物を４５ｍｌのＬＢ培地に逆希釈し（ｂａｃｋ－ｄｉｌｕｔｅ）、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００ｃ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定してＡＢＳ_６００が０．６～０．８になるまで増殖させた。それから、培養物をピペッティングして、２００～４００μｌの１０％グリセロールに再懸濁する前に、氷冷１０％グリセロールで２回洗浄した。懸濁された細胞（５０μｌ）を、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、２５ｎｇの示されたｓｇＲＮＡ－発現プラスミドで形質転換し、３００μｌのＳＯＣ培地（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）中で、１時間回復させた。回復後、異なる量のＬＢ培地を含む２００μｌの培養物を、１００ｎｇ／ｍｌのアンヒドロテトラサイクリンを含むＬＢ寒天上にプレーティングした。形質転換効率は、以前に説明されるように（Ｇｏｍａａ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＭＢｉｏ． ５，ｅ００９２８－１３（２０１４））、試験されたＤｇＲＮＡプラスミドに関する形質転換体の数をｐｓｇＲＮＡ－Ｃ１－Ｔ４コントロールプラスミドに関する形質転換体の数で割ることにより計算した。形質転換効率の実験間のばらつきを減らすために、試験されたｓｇＲＮＡプラスミドおよびコントロールプラスミドを、同一バッチのエレクトロコンピテント細胞に形質転換した。同様に、図３０～図３２に関して、形質転換分析を用いて、活性のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを保有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株にプラスミドがエレクトロポレーションされる能力を試験した（Ｌｂｕ－Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、図３０；Ｌｒｈ－Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、図３２；Ｌｃａ－Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、図３１。プラスミドは、宿主のＣＲＩＳＰＲ座内の最初のスペーサー配列と同一のプロトスペーサー配列を含むように設計した。完全なＰＡＭでプロトスペーサーと隣接するように、様々なプラスミドを設計した（Ｌｇａに関してＮＴＡＡＣ；Ｌｃａに関してＮＮＧＡＡ；Ｌｒｈに関してＮＧＡＡＡ；ＰＡＭ領域は、図３０～図３２で下線がされたヌクレオチド、およびそれらの突然変異した変異体（効率が試験されたヌクレオチドはイタリック体である）。また、実験は、コントロールの非－ターゲッティング配列（図３０～図３２に示す各実験に関して最後から２番目のエントリー（ｅｎｔｒｙ）、および、標的配列がないコントロールプラスミド（図３０～図３２に示す各実験に関して最後のエントリーも含んだ。天然のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムがＤＮＡターゲッティングによるプラスミド取り込みを妨げる能力は、試験配列および２つの前述のコントロールの間の形質転換効率の違いとして測定される。

Claims (21)

1. （ａ）合成トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸構築物部分、および、（ｂ）合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物部分、を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
   前記合成ｔｒａｃｒ核酸構築物部分は、５’から３’の方向に、配列番号６９のヌクレオチド４～１１２を含み、
   ここで、前記合成ｔｒａｃｒ核酸構築物部分は、
   少なくとも４個のヌクレオチドを含む抗－ジッパー配列、ここで、前記少なくとも４個のヌクレオチドは、ＡＣＣＡのヌクレオチド配列（配列番号６９のヌクレオチド２５～２８）を含む；
   ＧＡのヌクレオチド配列（配列番号６９のヌクレオチド２９～３０）を含むバルジ配列；
   ＵＵＵＡＡＡＡＵのヌクレオチド配列（配列番号６９のヌクレオチド３１～３８）を含む抗－ステッチ配列；
   ＣＡＡＧＣＡＡＵＧＣＡＵＣＵＵＵＵＧＡＵＧＣＡＡＡＧＵＵＵＣのヌクレオチド配列（配列番号６９のヌクレオチド３９～６８）を含むネクサス配列、前記ネクサスは、二本鎖の二重ステムを含むヘアピン構造を形成する；および、
   ２つのヘアピンを有するヌクレオチド配列を含むヘアピン配列を含み、それぞれのヘアピンは、少なくとも５個の一致する塩基対を有するステムを含む、
   を含み、
   ここで、前記抗－ジッパー配列は、前記バルジ配列のすぐ上流に位置し、前記バルジ配列は、前記抗－ステッチ配列のすぐ上流に位置し、前記抗－ステッチ配列は、前記ネクサス配列のすぐ上流に位置し、および、前記ネクサス配列は、前記ヘアピン配列のすぐ上流に位置する；および、
   前記合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物部分は、３’から５’の方向に、
   少なくとも４個のヌクレオチドを含むジッパー配列、ここで、前記少なくとも４個のヌクレオチドは、ＵＧＧＵのヌクレオチド配列を含む；
   ＡＧＡＵＵＵＵＧのヌクレオチド配列を含むステッチ配列；および、
   ５’末端および３’末端を有し、その３’末端に標的ＤＮＡと１００％の相補性を有する少なくとも７個のヌクレオチドを含むスペーサー配列、
   を含み、
   前記ジッパー配列は、前記ステッチ配列のすぐ上流に位置し、前記ステッチ配列は、前記スペーサー配列のすぐ上流に位置する、
   ここで、
   前記合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物部分の前記ステッチ配列は、前記合成ｔｒａｃｒ核酸構築物部分の前記抗－ステッチ配列に１００％相補であってハイブリダイズし、前記合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物部分の前記ジッパー配列は、前記合成ｔｒａｃｒ核酸構築物部分の前記抗－ジッパー配列に少なくとも約９０％相補であってハイブリダイズし、前記ハイブリダイズされたジッパー配列と前記抗－ジッパー配列とは、前記バルジ配列に対する遠位端においてヌクレオチドによって連結され、
   ここで、前記ｓｇＲＮＡは、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するＣａｓ９ポリペプチドとともに機能する、
   ｓｇＲＮＡ。
2. 請求項１のｓｇＲＮＡであって、
   前記ｓｇＲＮＡは、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するＣａｓ９ポリペプチドと核酸－タンパク質複合体を形成することができる、
   ｓｇＲＮＡ。
3. 請求項１または２のｓｇＲＮＡであって、
   前記Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌｇａ）グループ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである、
   ｓｇＲＮＡ。
4. 請求項１～３のいずれか１項のｓｇＲＮＡであって、
   前記Ｃａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣ活性部位モチーフ内に変異を含む、
   ｓｇＲＮＡ。
5. 請求項１～４のいずれか１項のｓｇＲＮＡであって、
   前記Ｃａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨ活性部位モチーフ内に変異を含む、
   ｓｇＲＮＡ。
6. 請求項１～５のいずれか１項のｓｇＲＮＡであって、
   前記Ｃａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨ活性部位モチーフ内およびＲｕｖＣ活性部位モチーフ内に変異を含み、目的ポリペプチドに融合している、
   ｓｇＲＮＡ。
7. 請求項１～６のいずれか１項のｓｇＲＮＡをコードする、
   発現カセット。
8. 請求項７の発現カセットを含む、細胞（ただし、ヒト生殖細胞、ヒト受精卵、およびヒト胚を除く）。
9. 二本鎖標的ＤＮＡの部位特異的切断のための、非医療的方法であって、
   請求項１～６のいずれか１項のｓｇＲＮＡを、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの存在下で、標的ＤＮＡに接触させ、前記合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物部分の前記スペーサー配列が、前記標的ＤＮＡ上でプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する前記標的ＤＮＡの一部にハイブリダイズし、それにより、前記標的ＤＮＡに対する前記スペーサー配列の相補ハイブリダイゼーションにより規定される領域内で、前記標的ＤＮＡの部位特異的切断を生じさせる、
   方法（ただし、ヒト生殖細胞、ヒト受精卵、およびヒト胚に対する適用を除く）。
10. 請求項９の方法であって、
    前記部位特異的切断は、前記二本鎖標的ＤＮＡの（＋）鎖の部位特異的ニックであり、
    前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ活性部位モチーフ内の変異を含み、それにより、前記二本鎖標的の前記（＋）鎖を切断して、部位特異的ニックを前記二本鎖標的ＤＮＡの前記（＋）鎖内に生成する、または、
    前記部位特異的切断は、前記二本鎖標的ＤＮＡの（－）鎖の部位特異的ニックであり、
    前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＨＮＨ活性部位モチーフ内に点変異を含み、それにより、前記二本鎖標的ＤＮＡの前記（－）鎖を切断して部位特異的ニックを二本鎖標的ＤＮＡ前記（－）鎖内に生成する、
    方法。
11. 二本鎖（ｄｓ）標的ＤＮＡに対する、目的ポリペプチドの部位特異的ターゲッティングの非医療的方法であって、
    請求項６のｓｇＲＮＡを接触させ、それにより、前記Ｃａｓ９に融合された前記目的ポリペプチドを、前記標的ＤＮＡ上の特異的部位に対してターゲッティングするステップを含み、前記部位は、前記標的ＤＮＡに対する前記スペーサー配列の相補ハイブリダイゼーションにより規定される、
    方法（ただし、ヒト生殖細胞、ヒト受精卵、およびヒト胚に対する適用を除く）。
12. 請求項９または１０の方法であって、
    前記ＰＡＭは、ＣＴＡＡ、ＴＡＡ、またはＧＡＡのヌクレオチド配列を含む、
    方法。
13. 請求項９、１０または１２の方法であって、
    前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、前記標的ＤＮＡを含む生物のためにコドン最適化されたヌクレオチド配列によりコードされる、
    方法。
14. 請求項９、１０、１２または１３の方法であって、
    前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、少なくとも１つの核局在化配列を含む、
    方法。
15. 標的核酸の改変システムであって、
    （ａ）合成トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸構築物部分、および、（ｂ）合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物部分、を含むｓｇＲＮＡ、
    前記合成ｔｒａｃｒ核酸構築物部分は、５’から３’の方向に、配列番号６９のヌクレオチド４～１１２を含み、
    ここで、前記合成ｔｒａｃｒ核酸構築物部分は、
    少なくとも４個のヌクレオチドを含む抗－ジッパー配列、ここで、前記少なくとも４個のヌクレオチドは、ＡＣＣＡのヌクレオチド配列（配列番号６９のヌクレオチド２５～２８）を含む；
    ＧＡのヌクレオチド配列（配列番号６９のヌクレオチド２９～３０）を含むバルジ配列；
    ＵＵＵＡＡＡＡＵのヌクレオチド配列（配列番号６９のヌクレオチド３１～３８）を含む抗－ステッチ配列；
    ＣＡＡＧＣＡＡＵＧＣＡＵＣＵＵＵＵＧＡＵＧＣＡＡＡＧＵＵＵＣのヌクレオチド配列（配列番号６９のヌクレオチド３９～６８）を含むネクサス配列、前記ネクサスは、二本鎖の二重ステムを含むヘアピン構造を形成する；および、
    ２つのヘアピンを有するヌクレオチド配列を含むヘアピン配列を含み、それぞれのヘアピンは、少なくとも５個の一致する塩基対を有するステムを含む、
    を含み、
    ここで、前記抗－ジッパー配列は、前記バルジ配列のすぐ上流に位置し、前記バルジ配列は、前記抗－ステッチ配列のすぐ上流に位置し、前記抗－ステッチ配列は、前記ネクサス配列のすぐ上流に位置し、および、前記ネクサス配列は、前記ヘアピン配列のすぐ上流に位置する；および、
    前記合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物部分は、３’から５’の方向に、
    少なくとも４個のヌクレオチドを含むジッパー配列、ここで、前記少なくとも４個のヌクレオチドは、ＵＧＧＵのヌクレオチド配列を含む；
    ＡＧＡＵＵＵＵＧのヌクレオチド配列を含むステッチ配列；および、
    ５’末端および３’末端を有し、その３’末端に標的ＤＮＡと１００％の相補性を有する少なくとも７個のヌクレオチドを含むスペーサー配列、
    を含み、
    前記ジッパー配列は、前記ステッチ配列のすぐ上流に位置し、前記ステッチ配列は、前記スペーサー配列のすぐ上流に位置する、
    ここで、
    前記合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物部分の前記ステッチ配列は、前記合成ｔｒａｃｒ核酸構築物部分の前記抗－ステッチ配列に１００％相補であってハイブリダイズし、前記合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物部分の前記ジッパー配列は、前記合成ｔｒａｃｒ核酸構築物部分の前記抗－ジッパー配列に少なくとも約９０％相補であってハイブリダイズし、前記ハイブリダイズされたジッパー配列と前記抗－ジッパー配列とは、前記バルジ配列に対する遠位端においてヌクレオチドによって連結される；
    および、
    （ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するＣａｓ９ヌクレアーゼ、
    を含み、
    ここで、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは前記ｓｇＲＮＡと結合し、複合体を形成することができ、前記合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物部分の前記スペーサー配列が、前記標的ＤＮＡ上でプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する前記標的ＤＮＡの一部にハイブリダイズし、それにより、前記Ｃａｓ９が前記標的核酸に導かれ、前記標的核酸を改変する、
    システム。
16. 請求項１５のシステムであって、
    前記配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するＣａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌｇａ）グループ由来のＣａｓ９である、
    システム。
17. 請求項１５または１６のシステムであって、
    前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ活性部位モチーフ内に変異を含む、
    システム。
18. 請求項１５～１７のいずれか１項のシステムであって、
    前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＨＮＨ活性部位モチーフ内に変異を含む、
    システム。
19. 請求項１５～１８のいずれか１項のシステムであって、
    前記核酸の改変は、二本鎖標的ＤＮＡの部位特異的切断である、
    システム。
20. 請求項１５～１９のいずれか１項のシステムであって、
    前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＨＮＨ活性部位モチーフ内およびＲｕｖＣ活性部位モチーフ内に変異を含み、目的ポリペプチドに融合している、
    システム。
21. 請求項１５～２０のいずれか１項のシステムであって、
    前記ＰＡＭは、ＣＴＡＡ、ＴＡＡ、またはＧＡＡのヌクレオチド配列を含む、
    システム。