JP7429700B2 - 結石形成のリスクを減少させる治療に感受性のコンパニオンアニマルを特定する方法及び当該リスクを減少させるための組成物 - Google Patents

Description

膀胱結石は、ネコにおいて比較的一般的である。ストルバイト又はシュウ酸カルシウム膀胱結石などの下部尿路に影響を及ぼす疾患を有するネコは、典型的には、猫砂の外側での排尿、排尿のための緊張、任意の時間で少量の尿のみを産生する頻尿、尿中の血液及び生殖器リッキングなどの一つ以上の症状を有する。Ｘ線、及び腹部の超音波からの結果から、膀胱結石の発見につながる場合がある。尿のｐＨ等の尿検査結果、結晶の存在及び感染の不在は、シュウ酸カルシウム膀胱結石の診断につながる場合がある。膀胱結石は、手術、膀胱鏡検査（メスのネコの場合）、又は砕石術により除去することができる。結石の試料を分析して、診断を確定することができる。

歴史的に、ネコの膀胱結石は、リン酸マグネシウムアンモニウムであるストルバイトから作製された。ストルバイト酸膀胱結石を防止するために、ネコの食事の多くは、ネコがより酸性の尿を産生するように配合され、これがストルバイトを溶解し、及び／又はストルバイト結石の形成を予防する。こうした食事は、ストルバイト結石形成を防ぐのに非常に効果的である尿酸性化をもたらす。しかしながら、こうした食事の望ましくない結果は、ネコをシュウ酸カルシウム結石のリスク増大に導く高血中カルシウムレベルも生成することである。すなわち、ストルバイト形成を予防するために配合されたネコの食事の多くは、シュウ酸カルシウム結石を促進する条件も増加させる。

シュウ酸カルシウム結石は、ネコの死亡及び不快感の重要な原因である。シュウ酸カルシウム膀胱結石の発生率は、そのネコに非酸性食事を与えることによって低減することができるが、そのような食事は、ストルバイト膀胱結石のリスクを増加させる。高含水及び／又はクエン酸カリウムで補充された食事は、ｐＨが６．５を超える尿、約１．０２０の比重、及び結晶の非存在をもたらし、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させることができる。しかしながら、こうした食事は、シュウ酸カルシウム結石のリスクを著しく減少させるためには、しばしば不十分である。

シュウ酸カルシウム結石形成を低減するための戦略には、高血中カルシウムレベルをもたらす任意の根底にある状態に対処する戦略が含まれる。シュウ酸カルシウム結石は、シュウ酸カルシウム結晶から形成される。シュウ酸塩はグリオキシル酸の酸化の生成物である。

シュウ酸塩を形成するための基質であることに加えて、グリオキシル酸は、アミノドナーとしてＬ－アラニンを使用してアラニン－グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ２（ＡＧＴＸ２）によってグリシンに触媒され得る。ＡＧＴＸ２は、ＡＧＸＴ２遺伝子によってコードされ、クラスＩＩＩピリドキサール－リン酸依存性ミトコンドリアアミノトランスフェラーゼであり、これは無差別（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）アミノトランスフェラーゼと考えられている。ＡＧＴＸ２はメチルアルギニンの重要な調節因子であり、腎臓の血圧の制御に関与している。グリオキシル酸をシュウ酸塩以外の生成物に代謝することによって、ＡＧＸＴ、ＡＧＸＴ２などの酵素は、そうでなければシュウ酸塩生の成の基質として利用可能であるグリオキシル酸のレベルを減少させ、それに応じて、そのような酵素による活性はシュウ酸塩のレベルを減少させる。

ＡＧＸＴ２遺伝子の多型は、メチルアルギニン及びベータ－アミノイソブチラート代謝に影響を与え、ジメチルアルギニン及びベータ－アミノイソブチラートの濃度に影響を与える。さらに、ＡＧＸＴ２多型は、頸動脈硬化症と関連している。

対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）は、ＡＧＸＴ２の基質である。ＳＤＭＡは、ネコの（腎機能低下の前の）腎機能の変化と関連している（増加している）ことが示されており（Ｈａｌｌら、２０１４年、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｓｅｒｕｍ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ ａｎｄ Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ ａｓ Ｋｉｄｎｅｙ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｃａｔｓ ｗｉｔｈ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｊ Ｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ；２８：１６７６－１６８３；Ｈａｌｌら、２０１４、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｄｉｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ ａｎｄ ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ ａｓ ｋｉｄｎｅｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｇｅｒｉａｔｒｉｃ ｃａｔｓ ｆｅｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｏｄｓ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｗｉｔｈ ｆｉｓｈ ｏｉｌ、Ｌ－ｃａｒｎｉｔｉｎｅ、ａｎｄ ｍｅｄｉｕｍ－ｃｈａｉｎ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ Ｔｈｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０２ ５８８－５９６）、ＳＤＭＡとネコの結石形成との関係を示している（Ｈａｌｌら、２０１７年、Ｓｅｒｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｄｉｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ ａｎｄ ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ ｉｎ ｃａｔｓ ｗｉｔｈ ｋｉｄｎｅｙ ｓｔｏｎｅｓ ＰＬｏＳ ＯＮＥ １２（４）：ｅ０１７４８５４）。

ＳＤＭＡ及びＡＤＭＡがＡＧＸＴ２の基質であることに注目する一部の研究者は、ＡＧＸＴ２多型及びその濃度との関連を示している。例えば、Ｋｉｔｔｌｅら（２０１４，Ａｌａｎｉｎｅ－ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２（ＡＧＸＴ２）Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ Ｈａｖｅ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｅ Ｉｍｐａｃｔ ｏｎ Ｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ ａｎｄ ｂ－ａｍｉｎｏ ｉｓｏｂｕｔｙｒａｔｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（２）：ｅ８８５４４）は、特定の多型がジメチルアルギニン及びベータ－アミノイソブチラートの濃度の濃度に影響を与え、ｂ－アミノイソブチラート濃度及びＳＤＭＡ濃度と関連していたことを示した。

ジメチルアルギニン及びベータ－アミノイソブチラートとの有意なポジティブ相互作用が注目されている。メチルアルギニン及びＡＧＸＴ２多型との関連は、、Ｚｈｏｕら（２０１４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＡＧＸＴ２ Ｖ１４０Ｉ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｗｉｔｈ ｒｉｓｋ ｆｏｒ ｃｏｒｏｎａｒｙ Ｈｅａｒｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ、Ｊ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ．２１（１０）：１０２２－３０にも示された。特に、ＡＤＭＡの増加は、喫煙者及び糖尿病を有する集団におけるＡＧＸＴ２遺伝子型によって影響されることが示された。

尿シュウ酸カルシウム滴定試験（ＣＯＴＴ）は、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを評価するのに有用な方法である（Ｈａｌｌら、２０１７ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｄｉｅｔａｒｙ ｌｏｎｇ－ｃｈａｉｎ ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ａｌｔｅｒ ｓｅｒｕｍ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｌｏｗｅｒ ｒｉｓｋ ｏｆ ｕｒｉｎｅ ｓｔｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｔｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ １２（１０）：ｅ８８５４４）。尿試料中の１リットル当たりの結晶化を開始するために添加されるイオン化カルシウムの濃度及びシュウ酸塩の量は、比率［Ｃａ^＋２］／（添加されるＯｘ^－２）として計算される。インデックス値の増加は、シュウ酸カルシウム結晶化のリスクがより高い試料を示し、インデックス値の減少は、リスクがより低い試料を示す。シュウ酸カルシウム滴定試験（ＣＯＴＴ）の結果は、食事介入によって改善され、ネコのシュウ酸カルシウム結石の結石形成リスクを低下させることができる。

一塩基多型（ＳＮＰ）は、一般的なタイプの遺伝的変異である。ＳＮＰは、特定の座位における単一塩基対の変異である。すなわち、ＳＮＰは、ゲノム内の特定の位置で生じるＤＮＡ配列中の一塩基における差異である。典型的には、特定の位置でのＳＮＰについては、その位置のアレルと呼ばれる二つの可能性のあるヌクレオチド変異がある。集団内では、ゲノム内の特定の塩基位置に最もよく現れるヌクレオチド変異は、メジャーアレルと呼ばれ、その特定の塩基位置であまり一般的ではないヌクレオチド変異は、マイナーアレルと呼ばれる。ネコは、大部分の多細胞生物のように、２組の染色体を有する。したがって、各ネコは、各遺伝子又は遺伝子座の二つのコピー、したがって各ＳＮＰの二つのコピーを有する。したがって、ネコのゲノム中の各ＳＮＰについて、ネコは、二つのコピーのメジャーアレル、又は一つのコピーのマイナーアレルと一つのコピーのマイナーアレル、又は二つのコピーのマイナーアレルを有してもよい。

ＳＮＰは、生物学的マーカーとして作用し得る。一部のＳＮＰは、薬剤応答及び特定の疾患を発症するリスクの予測に有用であることが見出されている。ＳＮＰ遺伝子型判定は、ゲノム内のＳＮＰの検出を指す。ＳＮＰを検出し、ＳＮＰ遺伝子型判定を行う多数の方法がある。

少なくとも遺伝子マーカー又は表現型形質を有するネコの亜集団において、シュウ酸カルシウム膀胱結石を発症するリスクを減少させる組成物及び方法を含む、シュウ酸カルシウム膀胱結石を発症するリスクを減少させる改善された組成物及び方法に対するニーズがある。遺伝子マーカー又は表現型形質を有する少なくとも一つのネコの亜集団において、シュウ酸カルシウムの結石形成を予防する改善された組成物及び方法に対するニーズがある。シュウ酸カルシウム結石の発症の可能性又はリスクを減少させるために、治療から利益を得るネコを特定する方法を開発する必要性がある。そのような方法で有用なキット、試薬、その他の物品、及び組成物に対するニーズがある。

ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２のメジャーアレルＧの二つのコピーの存在について、ネコ対象から得られた生体試料を分析することを含む方法が提供される。ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２のメジャーアレルＧの二つのコピーを有するネコ対象は、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうネコ対象を示す。シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療は、ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーからなる群から選択される成分のうちの一つ以上の有効量を含む組成物を、ネコ対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、試料は、ＤＮＡシークエンシング、制限酵素消化、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ、又はリガーゼ連鎖反応を実行することによって分析される。一部の実施形態では、試料はゲノムＤＮＡ試料である。いくつかの実施形態では、試料は、ネコ対象の血液、唾液、卵胞根、鼻腔スワブ、又は口腔スワブ、好ましくは唾液から取得される。いくつかの実施形態では、試料は、全ゲノムＳＮＰチップを使用した解析、一本鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）アッセイ、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、自動蛍光シークエンシング；クランプ変性ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、モビリティシフト分析、制限酵素分析、ヘテロ二本鎖分析、化学ミスマッチ切断（ＣＭＣ）、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、ヌクレオチドミスマッチを認識するポリペプチドの使用、アレル特異的ＰＣＲ、配列解析、及びＳＮＰ遺伝子型解析から選択される少なくとも一つの核酸解析技術を実行することによって分析される。いくつかの実施形態では、試料は、ハイブリダイゼーションベースの方法、酵素ベースの方法、ＤＮＡの物理的特性に基づく増幅後の方法、及びシークエンシング方法から選択される少なくとも一つの核酸解析技術を実行することによって分析される。

ネコ対象から得られた生体試料を分析して、ネコ対象のベタイン濃度を決定することを含む方法が提供される。ネコ対象のベタイン濃度は、ポジティブ参照ベタイン濃度値又はポジティブ対照からの測定値と比較され得る。ポジティブ参照ベタイン濃度値は、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうネコのベタイン濃度を表す。ポジティブ対照試料は、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうネコのベタイン濃度を表す濃度のベタインを含有する。治療は、ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーからなる群から選択される成分のうちの一つ以上の有効量を含む組成物を、ネコ対象に投与することを含む。ポジティブ参照ベタイン濃度値又はポジティブ対照の測定ベタイン濃度以下であるベタイン濃度を有するネコ対象は、ネコ対象が治療から利益を得るであろうことを示す。

ネコ対象から得られた生体試料を分析して、ネコ対象の２－オキソアルギニン濃度を決定することを含む方法が提供される。ネコ対象の２－オキソアルギニン濃度は、ポジティブ参照２－オキソアルギニン濃度値、又はポジティブ対照からの測定値と比較され得る。ポジティブ参照２－オキソアルギニン濃度値は、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうネコの２－オキソアルギニン濃度を示す。ポジティブ対照試料は、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうネコの２－オキソアルギニン濃度を示す濃度の２－オキソアルギニンを含む。治療は、ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーからなる群から選択される成分のうちの一つ以上の有効量を含む組成物を、ネコ対象に投与することを含む。ポジティブ参照２－オキソアルギニン濃度値又はポジティブ対照の測定２－オキソアルギニン濃度以上である２－オキソアルギニン濃度を有するネコ対象は、ネコ対象が治療から利益を得るであろうことを示す。

ネコ対象におけるシュウ酸カルシウム結石形成のリスクを低減する方法が提供される。方法は、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうネコ対象としてネコ対象を特定するステップと、ベタイン、緑茶、コロハ及びトゥルシーのうちの一つ以上の有効量を含む組成物をネコ対象に投与するステップとを含む。ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２のメジャーアレルＧの二つのコピーの存在を検出し、及び／又はネコ対象のベタインレベルを検出し、ベタインレベルは、ネコ対象がシュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうことを示すことを決定し、及び／又は、ネコ対象の２－オキソアルギニンレベルを検出し、２－オキソアルギニンレベルは、ネコ対象がシュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうことを示すことを決定することによって、ネコ対象は、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうネコ対象として特定される。いくつかの実施形態では、ネコ対象は、有効量のベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーのうちの一つ以上を含む栄養組成物を与えられる。いくつかの実施形態では、ネコ対象は、有効量のベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーを含む栄養組成物を与えられる。いくつかの実施形態では、ネコ対象は、乾燥物質の１日摂取量に基づく栄養摂取量の割合、０．２５～１．０％のベタイン及び／又は０．２０～０．３０％の緑茶及び／又は０．０１％～０．０５％のコロハ及び／又は０．０００５～０．００３％のトゥルシーを含む栄養組成物を与えられる。いくつかの実施形態では、ネコ対象は、乾燥物質の１日摂取量に基づく栄養摂取量の割合、０．２５～１．０％のベタイン、０．２０～０．３０％の緑茶、０．０１％～０．０５％のコロハ及び０．０００５～０．００３％のトゥルシーを含む栄養組成物を与えられる。

乾燥物質の１日摂取量に基づいて１日あたり０．２５～１．０％の栄養摂取量に等しいベタインの量、及び／又は乾燥物質の１日摂取量に基づいて１日あたり０．２０～０．３０％の栄養摂取量に等しい緑茶の量、及び／又は乾燥物質の１日摂取量に基づいて１日あたり０．０１％～０．０５％の栄養摂取量に等しいコロハの量、及び／又は乾燥物質の１日摂取量に基づいて１日あたり０．０００５～０．００３％の栄養摂取量に等しいフェトゥルシーの量を含むネコ食物組成物が提供される。

図１は、ＧＧ遺伝子型が、ＡＡ遺伝子型の循環サイトカイン濃度よりも高い濃度を有することを示す、多変量分散分析法の結果を示す。

図２は、遺伝子型に基づいて異なるＣＯＴＴ値に対する食物の影響を示す。ＡＡ遺伝子型を有するネコは、ＧＧ遺伝子型を有するネコの試験食物を摂食した後のＣＯＴＴ値と比較して、強化食物を摂食した後、ＣＯＴＴ値を増加させた。ＧＧ表現型を有するネコは、対照と比較して、強化食物を食べた場合、ＣＯＴＴ値の減少を示した。

好適な実施形態の以下の説明は、本質的に単に例示的であり、いかなる点においても本発明、その適用、又は用途を制限することは意図されていない。

本発明で使用する場合、及び添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が別様を明確に規定しない限り、複数形を含む。

「ネコ」という用語は、飼いネコ又は家ネコ又はＦｅｌｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓとして知られるコンパニオンアニマルであるネコを含む。用語「ネコ（ｃａｔ）」は、用語「ネコ（ｆｅｌｉｎｅ）」の同義語である。

シュウ酸カルシウム膀胱結石の発症の可能性を減少させるための治療から利益を得るであろうネコ対象を特定する方法が提供される。シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させるための治療は、ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーからなる群から選択される成分のうちの一つ以上の有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、このような治療から利益を得るであろうネコ対象を特定して、シュウ酸カルシウム膀胱結石の発症の可能性を減少させる方法は、ネコ対象からの試料を分析して、ネコ対象がＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２（ｆｅｌＣａｔ８）のＧＧ遺伝子型を有するかどうかを決定することを含む。いくつかの実施形態では、このような治療から利益を得るであろうネコ対象を特定して、シュウ酸カルシウム膀胱結石の発症の可能性を減少させる方法は、ネコ対象からの試料を分析して、循環ベタインレベルが、治療から利益を得るであろうネコ対象を示すかどうかを決定する。いくつかの実施形態では、このような治療から利益を得るであろうネコ対象を特定して、シュウ酸カルシウム膀胱結石の発生の可能性を減少させる方法は、ネコ対象からの試料を分析して、循環２－オキソアルギニンのレベルが、治療から利益を得るであろうネコ対象を示すかどうかを決定することを含む。

シュウ酸カルシウム膀胱結石の発症の可能性を減少させるためにネコ対象を治療する方法が提供される。シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させるための治療は、ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーからなる群から選択される成分のうちの一つ以上の有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーからなる群から選択される成分のうちの一つ以上の有効量を、このような治療から利益を得るであろうネコ対象であると特定されているネコ対象に投与して、シュウ酸カルシウム膀胱結石の発症の可能性を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、シュウ酸カルシウム膀胱結石の発症の可能性を減少させる治療から利益を得るであろうネコ対象としてネコ対象を特定するステップ、及びベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーからなる群から選択される成分のうちの一つ以上の有効量を投与するステップを含む。ネコ対象がＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２（ｆｅｌＣａｔ８）についてＧＧ遺伝子型を有するかどうかを決定し、及び／又は循環ベタインのレベルがネコ対象が治療から利益を得ることを示すかどうかを決定し、及び／又は循環２－オキソアルギニンのレベルがネコ対象が治療から利益を得ることを示すかどうかを決定することによって、ネコ対象がシュウ酸カルシウム膀胱結石の発症の可能性を減少させる治療から利益を得るであろうネコ対象であることを特定することができる。

ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーからなる群から選択される成分のうちの一つ以上の有効量を含む組成物が提供される。方法において有用な組成物は、ネコ食物組成物であってもよい。あるいは、ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーからなる群から選択される１種以上の成分の有効量は、補助食品、トリーツ、又はおもちゃとして与えられてもよく、又はそうでなければ、毎日の栄養摂取のために動物に提供される食物に組み込まれない。

本明細書で使用される場合、「有効量（ａｎ ａｍｏｕｎｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」、「有効量（ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」、及び同様の用語は、特定の生物学的結果を達成するために有効なベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーのうちの一つ以上の量を指し、すなわち、シュウ酸カルシウム膀胱結石を発生する可能性を減少させる。特定の実施形態では、有効量の組成物は、治療に影響を及ぼすのに十分な時間で投与される。特定の実施形態では、方法は、効果的な治療及び維持をもたらすのに十分な期間、組成物の投与及び消費を含む。有効量は、ネコの理想的な体重、年齢、性別、活性レベル、組成物の代謝可能なエネルギー、及び組成物を摂食する頻度、例えば、１日１回、２回、又は３回、並びにネコに摂食される他の組成物を含む、いくつかの要因に基づいてもよい。いくつかの実施形態では、有効量は、乾燥重量パーセントとして総栄養摂取量に基づいて投与されるベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーのうちの一つ以上の量を指す。

「食物」、「食物組成物」、「ペットフード組成物」、又は「ネコ食物組成物」は、いくつかの実施形態では、それが摂食されるネコの栄養的に完全な食事でありうる。

本明細書で使用される場合、「成分」は、組成物の任意の要素を指す。

用語「栄養素」は、栄養を提供する物質を指す。いくつかの事例では、成分は、一つ以上の「栄養素」を含んでもよく、例えば、組成物は、タンパク質及び炭水化物の両方を含む重要な栄養素を含むトウモロコシを含んでもよい。

食物組成物は、ネコ食物の形態で提供され得る。一般的に知られているさまざまなタイプのキャットフードをネコの飼い主は入手することができる。キャットフードの選択としては、ウェットキャットフード、セミモイストキャットフード、ドライキャットフード、及びキャットのトリーツが挙げられるがこれらに限定されない。ウェットキャットフードは、一般的に約６５％を超える含水量を持つ。セミモイストキャットフードは一般的に約２０％～約６５％の含水量を持ち、湿潤剤、ソルビン酸カリウム、及び微生物増殖（細菌及びカビ）を防ぐためのその他の成分を含む場合がある。食物キブルを含むがこれに限定されないドライキャットフードは、一般的に約１５％未満の含水量を持つ。ペットのトリーツは、典型的には、セミモイスト、かむことができるトリーツ、任意の数の形態の乾燥したトリーツ、又は焼いた、押し出された、もしくは打ち抜かれたトリーツ、糖菓トリーツ、又は当業者に知られているその他の種類のトリーツであってもよい。

本明細書で使用される場合、「キブル」又は「食物キブル」という用語は、ネコの餌の特定のペレット様成分を指す。いくつかの実施形態では、食物キブルは１５重量％未満の含水量又は水分を有する。食物キブルは、硬いものから柔らかいものまでの広い範囲の質感に及びうる。食物キブルは、膨らんだものから高密度のものまで広い範囲の内部構造に及びうる。食物キブルは押し出しプロセス又は焼成プロセスによって形成されうる。非限定的な例では、食物キブルは均一な内部構造又は変動する内部構造を持ちうる。例えば、食物キブルは被覆したキブルを形成するためにコア及び被覆を含んでもよい。「キブル」又は「食物キブル」という用語が使用される時、それは被覆されていないキブル又は被覆されたキブルを指すことができることを理解すべきである。

本明細書で使用される場合、「押し出す」又は「押し出し」という用語は、前処理され、かつ／又は調製された成分混合物を、押出機を通して送るプロセスを指す。押し出しのいくつかの実施形態では、食物キブルは押し出しプロセスによって形成され、湿った成分及び乾燥した成分の混合物を含むキブル生地を、食物キブル形成するために熱及び圧力下で押し出すことができる。任意のタイプの押出機を使用することができ、その例としては、単軸スクリュー押出機及び二軸スクリュー押出機が挙げられるがこれらに限定されない。以下に記述される供給源、成分、及び成分のリストは、その組み合わせ及び混合物も企図され、本明細書の範囲内となるようにリストされている。

本明細書で意図されるように、組成物は、栄養的に完全かつバランスのとれたネコ食物組成物を包含することを意味するが、これらに限定されない。「栄養的に完全な食事」とは、食事に関して、健康なネコの通常の健康を維持するのに十分な栄養素を含み得る食事である。栄養的に完全なバランスの取れたキャットフード組成物は当業者によく知られている。例えば、栄養的に完全でバランスの取れた動物飼料組成物に好適な栄養素及び成分などの物質、ならびにそれらの推奨量は、例えばＯｆｆｉｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｏｆｆｉｃｉａｌｓ，Ｉｎｃ．（ＡＡＦＣＯ）、Ａｔｌａｎｔａ、Ｇａ．、（２０１２）に見つけることができる。

ネコに、有効量のベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーのうちの一つ以上を含む食事を与える際に、好ましい方法は、ネコに、成分としてベタイン、緑茶、コロハ、及び／又はトゥルシーを含有するネコ食物を供給することを含むことが企図される。他の実施形態では、ネコに、有効量のベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーの一つ以上の量を含む食事を与えることは、ネコに、補助食品又はトリーツとして、ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーの一つ以上を与えることによって達成される。キャットフード組成物中、又は別個の補助食品又はトリーツとして送達されるかにかかわらず、任意の手段によって、ネコにベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーのうちの一つ以上の有効量を提供することは、ネコに、ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーのうちの一つ以上の有効量を含む食事を与えることと考えられる。

トリメチルグリシンとも呼ばれるベタインは、三つのメチル基を有するグリシンからなる修飾アミノ酸である。

いくつかの実施形態において、トゥルシーは、植物カミメボウキ（Ｏｃｉｍｕｍ ｔｅｎｕｉｆｌｏｒｕｍ）及びその派生物を指す。トゥルシーはまた、ホーリーバジル、トゥルシー（ｔｕｌａｓｉ）、又はトゥルシー（ｔｈｕｌａｓｉ）としても知られている。トゥルシーは、インド亜大陸に自生し、東南アジアの熱帯地域全体に栽培植物として広く分布するシソ科の芳香多年生植物である。一例として、トゥルシーは、トゥルシー植物の葉、茎、種、及び根に由来する生成物を含みうる。トゥルシーは、粉砕した粉末、新たに粉砕した、噴霧乾燥した、凍結乾燥した、湿った根、抽出物、油、懸濁液、油及び水、又は溶液の形態であってもよい。トゥルシーは、調理されるか、又は生であってもよい。トゥルシーの植物化学的成分の一部は、オレイン酸、ウルソル酸、ロスマリン酸、オイゲノール、カルバクロール、リナロール、及びβ－カリオフィレンである。トゥルシー精油は、主にオイゲノール、β－エレメン、β－カリオフィレン、及びゲルマクレンからなる。

いくつかの実施形態において、緑茶は、植物種のチャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）に由来する。緑茶は、中国の雲南省に起源があると考えられている。緑茶は、抗酸化物質とアルカロイドの優れた供給源と考えられており、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｃ、Ｂ、Ｂ５、Ｈ及びＫなどのビタミン、マンガン、ならびに亜鉛、クロム、及びセレンなどのその他のミネラルを含有している。緑茶は、大量のカテキンＥＧＣＧを含む、約３０重量パーセントのポリフェノールである。カテキンは、細胞損傷を防ぐのに役立つと考えられる天然の抗酸化物質である。

いくつかの実施形態において、コロハは、マメ科の一年生植物であるフェネグリーク（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ ｆｏｅｎｕｍ－ｇｒａｅｃｕｍ）の植物を指す。コロハは、半乾燥作物として世界中で栽培されている一年生植物である。一例として、コロハは、コロハ植物の葉、茎、種、及び根に由来する生成物を含みうる。コロハは、粉砕した粉末、新たに粉砕した、噴霧乾燥した、凍結乾燥した、湿った根、抽出物、油、懸濁液、油及び水、又は溶液の形態であってもよい。コロハは、調理されるか、又は生であってもよい。コロハは、特にインドやカレーを摂取する場所で、一般的なスパイスとして使用されている。従来の医療従事者は、コロハが、糖尿病などの代謝障害及び栄養障害の管理に、去痰剤、消化促進剤、陣痛促進剤として、また固まったエネルギー及び冷たい炎症を解消するのに有用であると考えてきた。

本明細書で使用される場合、用語「補助食品（複数可）」は、以下に限定されないが、動物の栄養バランス又は総食の性能を改善するために別の飼料で使用される飼料を含む。補助食品として、限定されないが、他の餌に補助食品として無希釈に与えられ、別個に使用可能な動物の配給量の他の部による自由選択を提供し、又は動物の通常の餌で希釈し、混合して完全な餌を作製する組成物が挙げられる。例えば、ＡＡＦＣＯのガイドラインは、アメリカ飼料検査官協会（ＡＡＦＣＯ）、Ａｔｌａｎｔａ、Ｇａ（２０１２）に補助食品に関する議論を含んでいる。補助食品は、例えば、粉末、液体、シロップ、ピル、カプセルに入れられた組成物などを含む様々な形態でありうる。

リスク低減のための治療に対する応答性を示す遺伝要因

遺伝要因は、ネコにおけるシュウ酸カルシウム結石形成の可能性又はリスクを減少させる治療に対するポジティブ反応に関連していることが特定されている。ネココロニーのゲノムワイドな研究を通して、ＡＧＸＴ２遺伝子から下流にある一塩基多型（ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２、ｆｅｌＣａｔ８；Ａ１＿２１２０６９６０７、ｆｅｌＣａｔ５に対応する）が特定されており、ネコにおけるシュウ酸カルシウム結石形成、及びリスクを減少させるために有効な治療を施すことができるかどうかに関連する。特に、メジャーアレル（ＧＧ遺伝子型）の二つのコピーの存在は、ネコにおけるシュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させるための特定の治療に対する有益な応答と関連している。ＧＧ遺伝子型を有するネコは、ネコにおけるシュウ酸カルシウム結石形成のリスクを低減するために、本明細書に記載される治療に特に反応する。

ＡＧＸＴ２（アラニン－グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ２）遺伝子と、アルギニンのアミノ基転移の産物である２－オキソアルギニンの循環濃度との間に関係があることを示したゲノムワイド関連解析を実施した。ＡＧＸＴ２多型と循環ベタインレベルとの関係も観察されている。ＧＧ遺伝子型はまた、検出可能なレベルのバイオマーカーを有する循環サイトカイン及び他の表現型形質の濃度の増加と関連している。

ＧＧ遺伝子型を有するネコは、ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーからなる群から選択される成分のうちの一つ以上を投与することを含む、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療に反応する。したがって、ネコ対象からの試料中のネコＡＧＴＸ２遺伝子の下流にあるＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２（ｆｅｌＣａｔ８）における特定の遺伝子型を決定することは、ネコ対象がこのような治療から利益を得るかどうかを決定するための正確な基礎を提供する。

ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２でのネコ遺伝子多型を使用して、ネコ対象を、かかる治療から利益を受けるか又は利益を受けないかのいずれかであるネコとして特定することができる。ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２のＧＧ遺伝子型を有するネコは、治療から利益を得る。ＧＧ遺伝子型（二つのメジャーアレル遺伝子型又はホモ接合型メジャーアレル遺伝子型とも呼ぶ）は、ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２の両方のコピーに存在するメジャーアレルＧを有するネコを指す。ＡＧ遺伝子型又はＡＡ遺伝子型のいずれかを有するネコは、治療から利益を得るであろうネコではない。ＡＧ遺伝子型（メジャー－マイナーアレル遺伝子型又はヘテロ接合型遺伝子型とも呼ばれる）は、ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２の二つのコピーのうちの一つに存在するメジャーアレルＧと、ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２の二つのコピーのうちの他方に存在するマイナーアレルＡを有するネコを指す。ＡＡ遺伝子型（二つのマイナーアレル遺伝子型又はホモ接合型マイナーアレル遺伝子型とも呼ばれる）は、ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２の両方のコピーに存在するマイナーアレルＡを有するネコを指す。

遺伝子型の差異は、検出可能な表現型の差異に転換する。ＧＧ遺伝子型を有するネコは、ＡＡ遺伝子型又はＡＧ遺伝子型を有するネコのレベルと比較して、循環ベタインレベル及び２－オキソアルギニンレベルに検出可能な差を有する。ＧＧ遺伝子型を有するネコ由来の生体試料（ネコ対象が治療から利益を得るであろうネコであることを示す遺伝子型）は、ＡＡ遺伝子型又はＡＧ遺伝子型を有するネコ由来の生体試料からのベタインのレベル、すなわち、治療から利益を得るであろうネコではないネコ対象を特定するのに有用な遺伝子型のレベルと比較して、より低いベタインのレベルを有する。ＧＧ遺伝子型を有するネコ由来の生体試料（ネコ対象が治療から利益を得るであろうネコであることを示す遺伝子型）は、ＡＡ遺伝子型又はＡＧ遺伝子型を有するネコ由来の生体試料からの２－オキソアルギニンのレベル、すなわち、治療から利益を得るであろうネコではないネコ対象を識別するのに有用な遺伝子型のレベルと比較して、より高いレベルの２－オキソアルギニンのレベルを有する。

したがって、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうネコであるネコ、又はそうではないネコであるネコを特定するために、遺伝子型を決定することに加えて、又は遺伝子型を決定する代わりに、これらの表現型の差異を使用して、ネコ対象が、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうネコ又はそうではないネコであるのかを特定することもできる。

遺伝子型解析及び一つ以上の表現型解析を個々に、又は組み合わせて使用して、確認を提供し、それゆえに、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうネコ、又はリスク評価で治療から利益を得ないネコのいずれかとしてネコ対象の特定により高いレベルの正確さを提供し、治療は、ベタイン、緑茶、コロハ及びトゥルシーからなる群から選択される成分のうちの一つ以上を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ネコ由来の試料の遺伝子型を分析する。ネコ対象を、治療から利益を得るネコとして特定するために、以下の解析のうちの一つ以上を実施することができる：ネコ対象由来の試料を使用した遺伝子型解析は、ネコ対象がＧＧ遺伝子型（ネコ対象が、治療から利益を得るであろうネコであることを示す遺伝子型）を有すると決定するために行われてもよく、ネコ対象からの試料を使用した表現型解析は、ネコ対象が治療から利益を得るであろうネコであることを示すベタインレベルを特定するように行われてもよく、ネコ対象由来の試料を使用した表現型解析は、ネコ対象が、治療から利益を得るであろうネコであることを示す前記ネコ対象由来の試料中の２－オキソアルギニンレベルを特定するために行われてもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子型解析のみが実施される。いくつかの実施形態において、ベタインレベルの分析のみが行われる。いくつかの実施形態において、２－オキソアルギニンレベルの分析のみが行われる。いくつかの実施形態では、遺伝子型解析及びベタインレベルの解析の組み合わせが実施される。いくつかの実施形態では、遺伝子型解析及び２－オキソアルギニンレベルの解析の組み合わせが実施される。いくつかの実施形態では、ベタインレベルの解析及び２－オキソアルギニンレベルの解析の組み合わせが実施される。いくつかの実施形態では、遺伝子型解析、ベタインレベルの解析及び２－オキソアルギニンレベルの解析の組み合わせが実施される。

シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させるために治療から利益を得るであろうネコであると特定されたネコ対象を治療するために使用される治療であって、この治療は、ベタイン、緑茶、コロハ及びトゥルシーからなる群から選択される成分のうちの一つ以上を投与することを含み、ネコに、ベタイン、緑茶、コロハ及びトゥルシーからなる群から選択される１種以上の成分を投与することを含み、成分をネコ対象に餌を与えるため、又は補助食品として与えるために食物に組み込まれる。ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーからなる群から選択される１種以上の成分を用いた治療を使用して、ネコ対象が、ＧＧ遺伝子型、ベタインレベルの減少、又は２－オキソアルギニンレベルの増加を検出することによってそのように特定されるかどうかの治療から利益を得るであろうネコであるとして特定されたネコにおけるシュウ酸カルシウム結石の予防、可能性の減少、発症の遅延、又は重症度の減少に使用することができる。いくつかの実施形態では、治療は、ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーのからなる群から選択される一つ、二つ、三つ、又は四つ全ての成分の一つ、ベタイン、緑茶、コロハ及びトゥルシーの二つと共に使用することを含む。

ネコ対象を治療から利益を得るであろうネコとして特定し、ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーからなる群から選択される成分のうちの一つ以上を食事の一部として与える、又は補給することによって、ネコを治療する方法が提供され、シュウ酸カルシウム結石の発生の可能性を減少させるためのネコの治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、治療方法は、１）ａ）ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２の遺伝子型解析、及び／又はｂ）シュウ酸カルシウム結石の発症の可能性が増加したことを示すベタインレベルを特定する表現型解析、及び／又はｃ）２－オキソアルギニンレベルを特定する表現型解析の一つ以上によって、シュウ酸カルシウム結石の発症の可能性を減少させ、シュウ酸カルシウム結石を予防し、その発症を遅らせ、その重症度を減少させる治療によって利益を得るであろうネコとしてネコを特定し、２）有効量のベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーのからなる群から選択される一つ、二つ、三つ又は好ましくは四つ全ての成分を食事の一部として、又は補給することによって与えるステップを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ネコの食事の一部として与えられるか、又は別の方法で与えられる。いくつかの実施形態では、ネコは、ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーからなる群から選択される一つ以上の成分を含む、成分又は栄養補給を含む食事を与えられる。好ましい例のネコは、二つ、三つ、又は四つの成分全てが組み合わされた食事が与えられる。いくつかの実施形態では、治療は、ネコに、ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーを補給した食事を与えることを含む。いくつかの実施形態では、治療は、ネコに、ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーで補充された食事を与えることを含み、ベタインは、０．２５％～１．０％又は０．７５％～０．５０％の範囲内に存在し、緑茶は、０．１％～０．５％又は０．２０％～０．３０％の範囲内に存在し、コロハは、０．０１％～０．０５％又は０．０２０％～０．０３０％の範囲内に存在し、トゥルシーは、０．０００５％～０．００３％又は０．００１０％～０．００２％の範囲に存在する。いくつかの実施形態では、治療は、０．５％のベタイン、０．２５％の緑茶、０．０２５％のコロハ、及び０，００１５％のトゥルシーで補充された食事をネコに与えることを含む。

シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうネコとしてネコ対象を特定する、又は治療から利益を得るであろうネコではないとして特定する方法に有用なキット、試薬、その他の物品、及び組成物が提供され、治療は、ベタイン、緑茶、コロハ及びトゥルシーからなる群から選択される成分のうちの一つ以上を投与することを含み、治療から利益を得るであろうネコとしてネコ対象を治療して、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる方法が提供される。キット、試薬、その他の物品、及び組成物は、遺伝子型を評価する方法、及び／又はベタイン及び／又は２－オキソアルギニンレベルを評価する方法に有用であり得る。ベタイン及び／又は２－オキソアルギニンレベルを評価する方法に有用なキット、試薬、その他の物品、及び組成物は、このようなベタイン及び／又は２－オキソアルギニンレベルを測定するアッセイに有用な試薬を含んでもよく、またポジティブ対照試料及びネガティブ対照試料を含んでもよい。

ネコ対象を治療して、シュウ酸カルシウム結石の形成を予防、可能性の低減、発症の遅延、及び／又は重症度の減少させるために、方法に有用なキット、試薬、その他の物品、及び組成物が提供される。本明細書に提供される様々な方法によって、ネコ対象は、シュウ酸カルシウム結石を発生する可能性が高い、又はシュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得る可能性があるものとして特定されうる。シュウ酸カルシウム結石形成を予防、可能性の減少、発生の遅延、及び／又は重症度を減少させるためにネコ対象を治療する方法は、ネコ対象に、ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーのうちの一つ以上を含む組成物を投与することを含み得る。成分及び成分を含む栄養補助食品及び食物などの組成物はこうした治療に使用される。

参照ゲノムｆｅｌＣａｔ８ におけるＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２（以前は、参照ゲノムｆｅｌＣａｔ５ においてＳＮＰ Ａ１＿２１２０６９６０７と呼称された）。

ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２は、ネコ参照ゲノムｆｅｌＣａｔ８に列挙されたＡＧＸＴ２遺伝子の下流のネコ染色体Ａ１配列のＳＮＰを指す。そのデータベースでは、ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２は、染色体Ａ１塩基位置２１２８９１６９２を指す。ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２はＡＧＸＴ２遺伝子の下流の配列内に位置する。

ＦｅｌＣａｔ８は、ネコの新しいＤＮＡ配列を使用して再アセンブルされた、ネコの改良された参照ゲノムである。ＦｅｌＣａｔ５は、ネコの以前の参照ゲノムである。参照ゲノムｆｅｌＣａｔ８におけるＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２は、以前は、参照ゲノムｆｅｌＣａｔ５においてＳＮＰ Ａ１＿２１２０６９６０７と呼称されたＳＮＰに対応する。ＳＮＰを含むｆｅｌＣａｔ５の配列は、ｆｅｌＣａｔ８に更新される。ｆｅｌＣａｔ８配列がより完全である。

ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２はｆｅｌＣａｔ８の染色体Ａ１塩基位置２１２８９１６９２に位置するＳＮＰを指す。（ｆｅｌＣａｔ８中のＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２はｆｅｌＣａｔ５中のＳＮＰ Ａ１＿２１２０６９６０７であり、ｆｅｌＣａｔ５染色体Ａ１塩基位置２１２０６９６０７を指す。）

配列番号１は、ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２を含むｆｅｌＣａｔ８中の配列である。配列番号１は、ｆｅｌＣａｔ８中のｃｈｒＡ１：２１２８９１５９２－２１２８９１７９２である。

＞ｆｅｌＣａｔ８＿ｄｎａ ｒａｎｇｅ＝ｃｈｒＡ１：２１２８９１５９２－２１２８９１７９２ ５’ｐａｄ＝０ ３’ｐａｄ＝３８鎖＝＋ｒｅｐｅａｔＭａｓｋｉｎｇ＝なし

配列番号１：
ＡＴＡＴＧＴＴＡＧＴ ＡＴＣＴＣＴＡＣＡＴ ＧＴＧＧＧＡＧＡＡＣ ＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧ ４０
ＧＴＴＣＡＴＧＴＡＴ ＧＡＴＡＣＡＧＣＡＧ ＧＡＡＧＡＡＣＡＣＡ ＧＣＡＣＧＧＣＣＴＴ ８０
ＴＧＡＡＧＴＡＴＴＣ ＣＴＧＴＴＴＡＴＡＧ ［Ａ／Ｇ］ＡＡＴＡＡＴＴＣＴ ＴＴＣＡＴＡＴＧＣＡ １２０ ＧＧＴＡＣＧＴＧＴＧ ＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧ ＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧ ＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧ １６０
ＴＧＴＧＴＡＴＴＴＴ ＡＴＡＡＡＧＧＴＡＧ ＣＴＡＣＴＣＣＴＴＡ ＴＴＣＡＴＡＧＡＴＡ Ｔ ２０１

配列番号１では、ＳＮＰは１０１位（２０１位の）にあり、これは２１２８９１６９２位で染色体Ａ１に相当する。配列番号１は、ＳＮＰの１００ヌクレオチド５’及びＳＮＰの１００ヌクレオチド３’を含む。配列番号１のヌクレオチド１０１（染色体Ａ１のｆｅｌＣａｔ８の位置２１２８９１６９２）におけるＳＮＰは、マイナーアレルＡ及びメジャーアレルＧを代替ヌクレオチドとして示す。

本明細書で使用される場合、多型の対象であり、本明細書で言及される遺伝子型判定であるＳＮＰを参照する場合、ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２ は ｆｅｌＣａｔ８ 及びｆｅｌＣａｔ５（ＳＮＰ Ａ１＿２１２０６９６０７）に提示される同じＳＮＰを指すことが意図される。ｆｅｌＣａｔ８では、ＳＮＰは染色体１の位置２１２８９１６９２に位置し、ｆｅｌＣａｔ５では、ＳＮＰは染色体１の位置２１２０６９６０７に位置する。

個別のネコのゲノム中のＳＮＰ検出に基づく二つのＧアレル（ＧＧ遺伝子型）の存在は、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうネコであるネコ対象を特定するために使用することができ、治療は、ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーからなる群から選択される成分のうちの一つ以上を投与することを含む。個別のネコのゲノム中のＳＮＰ検出に基づく、一つのＡアレル及び一つのＧアレル（ＡＧ遺伝子型）又は二つのＡアレル（ＡＡ遺伝子型）の存在を使用して、治療から利益を得るであろうネコではないネコ対象を特定することができる。

ネコ対象は、ネコ対象がＧＧ遺伝子型を有することを示す遺伝子型解析の結果によって、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうネコであると特定される。ネコ対象を遺伝子型判定するために、いくつかの実施形態では、ネコ対象からの試料を、Ｇアレル及びＡアレルの両方の存在について調査することができる。Ｇアレルの存在及びＡアレルの非存在の検出は、ＧＧ遺伝子型を示す。Ｇアレル及びＡアレルの存在の検出は、ＡＧ遺伝子型を示す。Ｇアレルの非存在及びＡアレルの存在の検出は、ＡＡ遺伝子型を示す。いくつかの実施形態では、ネコ対象からの試料は、Ａアレルのみの存在について調査されてもよく、それによって、Ｇアレルが存在するかどうか間接的にのみ決定することができる。Ａアレルの非存在の検出は、ＧＧ遺伝子型を示す。Ｇアレルの存在の検出は、ネコ対象がＧＧ遺伝子型又はＡＧ遺伝子型のいずれかであることを示している。

ネコ対象は、ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２メジャーアレルＧ及びＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２ マイナーアレルＡの存在について、ネコ対象から得られた生体試料を調査することによって、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうネコであると特定され、それによって、ネコ対象がＧＧ遺伝子型、ＡＧ遺伝子型、又はＡＡ遺伝子型を有すると決定することを提供する。あるいは、ネコ対象から得られた生体試料は、ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２マイナーアレルＡのみの二つのコピーの存在ついて調査してもよい。こうした例では、ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２マイナーアレルＡのゼロコピーの検出は、二つのＧの間接的検出であり、それゆえＧＧ遺伝子型である。マイナーアレルＡのみについて調査する場合、マイナーアレルＡの存在の検出は、ネコ対象がＡＡ遺伝子型又はＡＧ遺伝子型のいずれかを有することを示し、いずれの場合も、ネコ対象は、治療から利益を得るであろうネコではないと特定される。したがって、ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２のメジャーアレルＧの二つのコピーの存在について、ネコ対象から得られた生体試料の分析は、メジャーアレルＧ及びマイナーアレルＡの存在を直接検出する技術を使用して、ＧＧ遺伝子型、ＡＧ遺伝子型、及びＡＡ遺伝子型を直接識別する能力を提供する、いずれかを伴うことができる。あるいは、マイナーアレルＡの有無を検出するための技術を使用することで、ゼロマイナーアレルＡを検出した場合、ＧＧ遺伝子型の存在を間接的に検出する能力のみを提供する。

当業者は、参照ゲノムから配列に開示された座標を使用して、対象の遺伝子型を決定することができる。単一核酸多型ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２に関して遺伝子型を決定する方法が提供される。当業者は、本明細書に提供される情報を使用して、個々のネコの遺伝子型を決定することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子型解析を実施するために使用される試料は、ゲノムＤＮＡ試料である。いくつかの実施形態では、試料は、ネコ対象の血液、唾液、卵胞根、鼻腔スワブ、又は口腔スワブから取得される。いくつかの実施形態において、生体試料は、ＰＥＲＦＯＲＭＡｇｅｎｅ ＰＧ－１００ Ｏｒａｌ ｓａｍｐｌｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｉｔ（ＤＮＡ Ｇｅｎｏｔｅｋ、ＯｒａＳｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）などの市販のキットを使用して、ネコ対象から得られたゲノムＤＮＡ試料である。単一のＳＮＰとしての特定のアレルの有無を決定する好ましい方法は、アレル特異的蛍光プローブを使用して、どのバリアント（複数可）が試料中に存在するかを決定するためのＰＣＲベースのアッセイである。

いくつかの実施形態において、ＳＮＰ Ａ１－２１２０６９６０７に対する個々のネコの遺伝子型は、以下から選択される少なくとも一つの核酸解析技術を含む方法を使用して決定され得る：ＤＮＡシークエンシング、制限酵素消化、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ、又はリガーゼ連鎖反応。

いくつかの実施形態では、ＳＮＰ Ａ１－２１２０６９６０７に対する個々のネコ上の遺伝子型は、以下からなる群から選択される少なくとも一つの核酸解析技術を実施することによって決定され得る：全ゲノムＳＮＰチップを使用した解析、一本鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）アッセイ；制限断片長多型（ＲＦＬＰ）；自動蛍光シークエンシング；クランプ変性ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、可動性シフト分析；制限酵素分析；ヘテロ二本鎖分析；化学ミスマッチ切断（ＣＭＣ）、ＲＮａｓｅ保護アッセイ；ヌクレオチドミスマッチを認識するポリペプチドの使用；アレル特異的ＰＣＲ；配列解析；及びＳＮＰ遺伝子型解析を含む。

いくつかの実施形態では、ＳＮＰ Ａ１－２１２０６９６０７に対する個々のネコ上の遺伝子型は、ハイブリダイゼーションベースの方法、酵素ベースの方法、ＤＮＡの物理的特性に基づく増幅後方法、及びシークエンシング方法からなる群から選択される方法を使用して決定され得る。

いくつかの実施形態では、ＳＮＰ Ａ１－２１２０６９６０７に対する個々のネコ上の遺伝子型は、以下からなる種類の方法から選択される方法を使用して決定され得る：動的アレル特異的ハイブリダイゼーション、分子ビーコン法及びＳＮＰマイクロアレイからなる群から選択されるハイブリダイゼーションベースの方法；制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、ＰＣＲベースの方法、フラップエンドヌクレアーゼ、プライマー伸長法、５’－ヌクレアーゼ及びオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイからなる群から選択される酵素ベースの方法；一本鎖高次構造多型分析、温度勾配ゲル電気泳動、変性高速液体クロマトグラフィー、高分解能アンプリコン溶融、ＤＮＡミスマッチ結合タンパク質、ＳＮＰｌｅｘ、及びサーベイヤーヌクレアーゼアッセイからなる群から選択されるＤＮＡの物理的特性に基づく増幅後方法；ならびにシークエンシング方法。

いくつかの実施形態では、ＳＮＰ Ａ１－２１２０６９６０７に対する個々のネコ上の遺伝子型は、ＳＮＰ Ａ１－２１２０６９６０７を、ゼロ、１コピー又は２コピーのメジャーアレル及び／又はマイナーアレルの存在について調査するための遺伝子マーカーを含む高密度アレイを使用して決定されうる。いくつかの実施形態では、低密度アレイを使用してもよい。いくつかの実施形態において、ＳＮＰ Ａ１－２１２０６９６０７に関して遺伝子型の試料を調査することに加えて、ＳＮＰの他の分析及び検出は、様々なＳＮＰを検出することができる遺伝子マーカーを含む高密度アレイを使用して実施されてもよい。

遺伝子型解析は、ハイブリダイゼーションベースの方法を使用して実施されうる。ハイブリダイゼーションベースの方法の例としては、動的アレル特異的ハイブリダイゼーション、分子ビーコンを用いる方法、及び高密度オリゴヌクレオチドＳＮＰアレイ又は低密度オリゴヌクレオチドＳＮＰアレイを含むＳＮＰマイクロアレイを用いる方法が挙げられる。ＳＮＰは、相補的なＤＮＡプローブをＳＮＰ部位にハイブリダイズすることによって調査することができる。動的アレル特異的ハイブリダイゼーションでは、ゲノムセグメントが増幅され、ビオチン化プライマーとのＰＣＲ反応を介してビーズに結合される。次いで、増幅された生成物をストレプトアビジンカラムに付着させ、洗浄して、非ビオチン化鎖を除去する。次いで、アレル特異的オリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡに結合されたときに蛍光を発する分子の存在下で添加される。強度は、溶融温度（Ｔｍ）が決定され得るまで、温度が増加するにつれて測定される。ＳＮＰは、予想よりも低いＴｍによって検出される。特異的に操作された一本鎖オリゴヌクレオチドプローブは、分子ビーコンを使用するＳＮＰ検出で使用される。オリゴヌクレオチドが設計され、相補領域が各末端にあり、プローブ配列がその間に位置し、その結果、プローブは、その天然の単離された状態でヘアピン又はステムループ構造を取る。フルオロフォアは、プローブの一方の端に取り付けられ、蛍光クエンチャーは他方の端に取り付けられる。フルオロフォアは、オリゴがヘアピン構成であり、分子が蛍光を放出しない時に、クエンチャーに近接している。プローブ配列は、アッセイで使用されるゲノムＤＮＡに対して相補的である。分子ビーコンのプローブ配列が、アッセイ中にその標的ゲノムＤＮＡと遭遇した場合、アニーリング及びハイブリダイズする。オリゴは、ヘアピン構成を想定しなくなり、蛍光を発する。高密度オリゴヌクレオチドＳＮＰアレイは、小さなチップ上にアレイされた数十万個のプローブを含み、多くのＳＮＰを同時に調査することを可能にする。ＳＮＰ部位をいくつかの異なる場所に有するように設計されたいくつかの冗長プローブ、ならびにＳＮＰアレルとのミスマッチを含有することが、各ＳＮＰを調査するために使用される。これらの冗長プローブの各々に対する標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションの異なる量により、特定のホモ接合性及びヘテロ接合性のアレルを決定することができる。

遺伝子型解析は、酵素ベースの方法を使用して実施されうる。ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びヌクレアーゼを含む広範な酵素が用いられてもよい。酵素ベースの方法の例としては、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）に基づく方法、ＰＣＲベースの方法、フラップエンドヌクレアーゼを利用する方法、プライマー伸長を利用する方法、５’－ヌクレアーゼを利用する方法、及びオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイを含む方法が挙げられる。ＳＮＰを検出するためのＲＦＬＰ方法は、ゲノム試料を消化するために多くの異なる制限エンドヌクレアーゼを使用する。酵素が予想される制限部位を切断するかどうかは、ゲルアッセイを介して断片長を決定することによって確認することができる。ＲＦＬＰアッセイは、ＳＮＰの存在下又は非存在下で切断する酵素を含むように設計され、断片長のパターンを使用して、ＳＮＰの存在又は非存在を決定することができる。ＰＣＲベースの方法には、テトラプライマー増幅難治性突然変異系ＰＣＲ、又はＡＲＭＳ－ＰＣＲ、及び複数のｑＰＣＲ反応が含まれる。テトラプライマー増幅難治性突然変異系ＰＣＲ、又はＡＲＭＳ－ＰＣＲは、二つの対のプライマーを使用して、一つのＰＣＲ反応において二つのアレルを増幅する。プライマーは、二つのプライマー対がＳＮＰ位置で重複するように設計されるが、各々が、可能性のあるＳＮＰのうちの一つのみに完全に合致するように設計される。あるいは、複数のｑＰＣＲ反応を、各アレルを別々に標的とする異なるプライマーセットで実行することができる。いくつかの実施形態は、構造特異的切断を触媒するエンドヌクレアーゼであるフラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）を利用する。この切断はミスマッチに非常に敏感であり、高い特異性を有するＳＮＰを調査するために使用することができる。クレアバーゼと呼ばれるＦＥＮは、二つの特異的オリゴヌクレオチドプローブと組み合わされ、標的ＤＮＡと共に、クレアバーゼによって認識される三重アルタイト構造を形成することができる。Ｉｎｖａｄｅｒオリゴヌクレオチドと呼ばれる第一のプローブは、標的ＤＮＡの３’末端に対して相補的である。Ｉｎｖａｄｅｒオリゴヌクレオチドの最後の塩基は、標的ＤＮＡ中のＳＮＰヌクレオチドと重複する非合致の塩基である。第二のプローブは、標的ＤＮＡの５’末端に相補的であるが、ＳＮＰヌクレオチドの３’側を超えても延在するアレル特異的プローブである。アレル特異的プローブは、ＳＮＰヌクレオチドに相補的な塩基を含有する。

プライマー伸長は、最初にＳＮＰヌクレオチドのすぐ上流の塩基へのプローブのハイブリダイゼーションを伴い、続いて、ＤＮＡポリメラーゼがＳＮＰヌクレオチドに相補的な塩基を付加することによってハイブリダイゼーションプライマーを伸長させる、２ステップのプロセスである。この組み込まれた塩基が検出され、ＳＮＰアレルが決定される。プライマー伸長法は、いくつかのアッセイフォーマットで使用される。これらのフォーマットは、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法（Ｓｅｑｕｅｎｏｍを参照）及びＥＬＩＳＡのような方法を含む広範な検出技術を使用する。ＳｅｑｕｅｎｏｍのｉＰＬＥＸ ＳＮＰ遺伝子型解析方法は、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ質量分析計を使用する。プライマー伸長の柔軟性及び特異性により、ハイスループット分析に適している。プライマー伸長プローブをスライド上に配列付けすることができ、多くのＳＮＰを一度に遺伝子型解析することができる。アレイドプライマー伸長（ＡＰＥＸ）と呼ばれるこの技術は、プローブの示差ハイブリダイゼーションに基づく方法よりもいくつかの利点を有する。

遺伝子型解析のいくつかの方法は、融解温度及び一本鎖構造などのＤＮＡの物理的特性に基づく。一本鎖構造を使用する方法は、三次構造に折り畳まれる一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に基づく。立体構造は配列依存性であり、ほとんどの単一塩基対変異は構造の形状を変化させる。ゲルに適用されるとき、三次形状は、ｓｓＤＮＡの可動性を決定し、ＳＮＰアレルを区別する機構を提供する。この方法は、最初に標的ＤＮＡのＰＣＲ増幅を伴う。二本鎖ＰＣＲ産物は、熱及びホルムアルデヒドを使用して変性され、ｓｓＤＮＡが産生される。ｓｓＤＮＡは、非変性電気泳動ゲルに適用され、三次構造に折り畳まれる。ＤＮＡ配列の差異は、三次構造を変化させ、ｓｓＤＮＡ鎖の可動性における差異として検出される。温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）法又は温度勾配キャピラリー電気泳動（ＴＧＣＥ）法は、部分的に変性したＤＮＡがより限定され、ゲル又は他の多孔質材料中でより遅く移動するという原理に基づく。別の方法では、変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）は、逆相ＨＰＬＣを使用してＳＮＰを調査する。ＤＨＰＬＣでは、固相が一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡに差親和性を有する。使用される別の方法は、アンプリコン全体の高分解能溶融である。ＤＮＡミスマッチ結合タンパク質を使用して、ＳＮＰを検出してもよい。サーマス・アクアティカス由来のＭｕｔＳタンパク質は、異なる親和性を有する異なる一塩基ミスマッチを結合し、キャピラリー電気泳動において使用して、６組のミスマッチを全て区別することができる。ＳＮＰｌｅｘは、アプライドバイオシステムズ社が販売する独自の遺伝子型解析プラットフォームである。サーベイヤーヌクレアーゼアッセイは、全ての塩基置換及び小さな挿入／欠失（インデル）を認識し、両方のＤＮＡ鎖のミスマッチ部位の３’側を切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ酵素である、サーベイヤーヌクレアーゼを使用する。シークエンシング技術は、ＳＮＰ検出にも使用することができる。シークエンシング技術の進歩により、より実用的なシークエンシングによるＳＮＰ検出が可能となる。

次世代シークエンシング技術を使用したシークエンシングによる遺伝子型解析は、一般的な慣行となっている。シークエンシングによる遺伝子型解析は、ＧＢＳとも呼ばれ、ゲノムワイド関連研究（ＧＷＡＳ）などの遺伝子型解析研究を実施するために、一塩基多型（ＳＮＰ）を発見する方法である。ＧＢＳは、制限酵素を使用してゲノムの複雑さを低減し、複数のＤＮＡ試料を遺伝子型解析する。消化後、ＰＣＲを実施して断片プールを増加させ、その後、次世代シークエンシング技術を使用してＧＢＳライブラリーを配列解析する。合成によるＩｌｌｕｍｉｎａショートリードシークエンシングやＰａｃＢｉｏの単一分子リアルタイムシークエンシングなどの次世代シークエンシング技術の進歩に伴い、ＧＢＳを行うことがより実行可能になってきている。将来、ナノポアの単一分子配列決定などの新技術の開発により、全ゲノム配列決定／ゲノタイピングが可能になる可能性がある。

２－オキソアルギニン濃度

ＡＧＸＴ２遺伝子の下流の染色体１上のＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２（ｆｅｌＣａｔ８）でのネコの遺伝子型と、ＡＧＸＴ２の酵素活性由来の基質である２－オキソアルギニンの濃度との間には、関連がある。ホモ接合型メジャーアレルＧＧ遺伝子型を有するネコでは、２－オキソアルギニンレベルは、ホモ接合型マイナーアレルＡＡ遺伝子型を有するネコの２－オキソアルギニンレベルの約２．８倍、及びヘテロ接合型マイナー－メジャーアレルＡＧ遺伝子型を有するネコの２－オキソアルギニンレベルの約１．４倍である。以下の実施例１で報告された研究では、４４５匹のネココホートを使用し、ホモ接合性マイナーアレルＡＡ遺伝子型を有するネコの群の平均２－オキソアルギニンレベルは０．４４９２であり、ヘテロ接合性マイナー－メジャーアレルＡＧ遺伝子型を有するネコの群の平均２－オキソアルギニンレベルは０．９２３９であり、ホモ接合性メジャーアレルを有するネコの群の平均２－オキソアルギニンレベルは１．２６７であった。より大きなネコの集団からのデータを使用することで、さらに精度が追加され、これらのデータをさらに精密化することができるが、これらの利用可能なデータを使用して予測を行うことができる。

ネコ対象からの試料を評価して、２－オキソアルギニンレベルを決定し、測定結果を、治療から利益を得るであろうネコの２－オキソアルギニンレベルを表す、ポジティブの２－オキソアルギニン基準値と比較することができる。ネコ対象の試料中の２－オキソアルギニンレベルが、ポジティブの２－オキソアルギニン基準値以上である場合、こうした結果は、ネコ対象が、治療から利益を得るであろうネコであることを示す。ネコ対象の試料中の２－オキソアルギニンレベルが、ポジティブの２－オキソアルギニン基準値よりも低い場合、こうした結果は、ネコ対象が、治療から利益を得るであろうネコではないことを示す。シュウ酸カルシウム結石形成の可能性を減少させるためにネコを治療する方法は、ネコ対象の２－オキソアルギニンレベルと、治療から利益を得るであろうネコを示すポジティブの２－オキソアルギニン基準値とを比較する方法によって、ネコ対象を、治療から利益を得るであろうネコであると特定するステップを含み得る。

ネコ対象はまた、治療から利益を得ることのないネコの２－オキソアルギニンレベルを表す、ネガティブの２－オキソアルギニン基準値を使用して、治療から利益を得るであろうネコではないと特定することができる。ネコ対象からの試料を評価して、２－オキソアルギニンレベルを決定し、測定結果を、ネガティブの２－オキソアルギニン基準値と比較することができる。ネコ対象の試料中の２－オキソアルギニンレベルが、ネガティブの２－オキソアルギニン基準値以下である場合、こうした結果は、ネコ対象が、治療から利益を得るであろうネコではないことを示す。

実施例１の表１のデータは、代表的なポジティブの２－オキソアルギニン基準値及びネガティブの２－オキソアルギニン基準値を提供する。異なる研究からの異なるデータは、わずかに異なる数を提供し得るが、代表的なポジティブの２－オキソアルギニン基準値及びネガティブの２－オキソアルギニン基準値は、任意の所与のコホートに対する計算に関して一定である。データを集計することによって生成された累積データは、代表的なポジティブの２－オキソアルギニン基準値及びネガティブの２－オキソアルギニン基準値のより精確で正確な数値表現を提供する。

あるいは、又はネコ対象から測定されたデータと比較するための参照として代表的な基準値を使用する方法に加えて、（ポジティブ及び／又はネガティブ）対照試料を使用して、（ポジティブ及び／又はネガティブ）対照アッセイを実行することができる。

ネコ対象からの試料を評価して、２－オキソアルギニンレベルを決定することができ、測定結果を、治療から利益を得るであろう、２－オキソアルギニンレベルを有する２－オキソアルギニンポジティブ対照試料中の２－オキソアルギニンレベルを測定することによって得られた結果と比較することができる。これらの方法及びその比較ステップに基づいて、ネコは、治療から利益を得るであろうネコであると識別されてもよく、又は治療から利益を得るであろうネコではないと識別されてもよい。例えば、２－オキソアルギニンポジティブ対照試料と比較されるネコ対象試料からの試料が、ネコ対象中の２－オキソアルギニンレベルが、２－オキソアルギニンポジティブ対照試料中の２－オキソアルギニンレベル以上であることを示す場合、ネコ対象は、治療から利益を得るであろうネコであると特定されるであろう。一方で、２－オキソアルギニンポジティブ対照試料と比較されるネコ対象試料からの試料及び結果が、ネコ対象中の２－オキソアルギニンレベルが、２－オキソアルギニンポジティブ対照試料中の２－オキソアルギニンレベルよりも低いことを示す場合、ネコ対象は、治療から利益を得るであろうネコではないと特定されるであろう。識別方法の結果は、治療決定に情報を与えるために使用されうる。シュウ酸カルシウム結石形成の可能性を減少させるためにネコを治療する方法は、ネコ対象からの測定された２－オキソアルギニンレベルを２－オキソアルギニンポジティブ対照試料中の測定された２－オキソアルギニンレベルと比較する方法によって、ネコ対象を、治療から利益を得るであろうネコであると特定するステップを含み得る。この方法によって治療から利益を得るであろうネコであると特定されたネコ対象は、次いで治療で治療される。

ネコ対象は、また、治療から利益を得ることはないだろうネコの２－オキソアルギニンレベルを有する２－オキソアルギニンネガティブ対照試料を使用して、治療から利益を得るネコではないと特定することができる。ネガティブ対照アッセイを実施して、２－オキソアルギニンネガティブ対照試料中の２－オキソアルギニンレベルを決定することができる。ネコ対象からの試料を評価して、２－オキソアルギニンネガティブ対照試料中の２－オキソアルギニンレベルと比較することができる、ネコ対象の２－オキソアルギニンレベルを決定することができる。これらの方法及びその比較ステップに基づいて、ネコは、治療から利益を得るであろうネコではないと特定されうる。例えば、２－オキソアルギニンネガティブ対照試料と比較されるネコ対象試料からの試料及び結果が、ネコ対象中の２－オキソアルギニンレベルが、２－オキソアルギニンネガティブ対照試料中の２－オキソアルギニンレベル以下であることを示す場合、ネコ対象は、治療から利益を得るであろうネコではないと特定されるであろう。

実施例１の表１のデータは、２－オキソアルギニンポジティブ対照試料及び２－オキソアルギニンネガティブ対照試料を生成するために使用できる、代表的なポジティブの２－オキソアルギニン基準値及びネガティブの２－オキソアルギニン基準値を提供する。異なる研究からの異なるデータは、わずかに異なる数を提供し得るが、代表的なポジティブの２－オキソアルギニン基準値及びネガティブの２－オキソアルギニン基準値は、任意の所与のコホートに対する計算に関して一定である。データを集計することによって生成された累積データは、代表的なポジティブの２－オキソアルギニン基準値及びネガティブの２－オキソアルギニン基準値のより精確で正確な数値表現を提供する。

ベタイン濃度

ＡＧＸＴ２遺伝子の下流の染色体１上のＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２（ｆｅｌＣａｔ８）でのネコの遺伝子型と、ベタインの濃度との間には、関連がある。様々な遺伝子型を有する群からなるネコのコホートにおける循環ベタインレベルを比較するとき、循環ベタイン濃度における有意差が観察された。

ＧＧ遺伝子型を有するネコの循環ベタインレベル（すなわち、シュウ酸カルシウム結石形成の可能性の増加を示す遺伝子型）は、ＡＡ遺伝子型を有するネコの循環ベタインレベル（すなわち、シュウ酸カルシウム結石形成の可能性の減少を示す遺伝子型）よりも約１８％低いことが観察された。ヘテロ接合性ＡＧ遺伝子型（すなわち、シュウ酸カルシウム結石形成の中間の可能性を示す遺伝子型）を有するネコの循環ベタインレベルは、ホモ接合性マイナーアレルＡＡ遺伝子型を有するネコの循環ベタインレベルよりも約９％低いことが観察された。具体的には、実施例２で報告された研究からのデータは、遺伝子型ＡＡ、ＡＧ、及びＧＧについてそれぞれ１．３６、１．２４、１．１１の循環ベタインレベルを示した。より大きなネコの集団からのデータを使用することで、さらに精度が追加され、これらのデータをさらに精密化することができるが、これらの利用可能なデータを使用して予測を行うことができる。

ネコ対象からの試料を評価して、ベタインレベルを決定し、測定結果を、治療から利益を得るであろうネコのベタインレベルを表すポジティブベタイン基準値と比較することができる。ネコ対象の試料中のベタインレベルが、ポジティブベタイン基準値以下である場合、こうした結果は、ネコ対象が、治療から利益を得るであろうネコであることを示す。ネコ対象の試料中のベタインレベルが、ポジティブベタイン基準値よりも大きい場合、こうした結果は、ネコ対象が、治療から利益を得るであろうネコではないことを示す。シュウ酸カルシウム結石形成の可能性を減少させるためにネコを治療する方法は、ネコ対象のベタインレベルを、治療から利益を得るであろうことを示すポジティブのベタイン基準値と比較する方法によって、ネコ対象を、治療から利益を得るであろうネコであると特定するステップを含み得る。

ネコ対象はまた、治療から利益を得ることのないネコのベタインレベルの代表である、ネガティブベタイン基準値を使用して、治療から利益を得るであろうネコではないと特定することができる。ネコ対象からの試料を評価して、ベタインレベルを決定し、測定結果をネガティブベタイン基準値と比較することができる。ネコ対象の試料中のベタインレベルが、ネガティブのベタイン基準値以上である場合、こうした結果は、ネコ対象が、治療から利益を得るであろうネコではないことを示す。

実施例２の表２のデータは、代表的なポジティブベタイン基準値及びネガティブベタイン基準値を提供する。異なる研究からの異なるデータは、わずかに異なる数を提供し得るが、代表的なポジティブベタイン基準値及びネガティブベタイン基準値は、任意の所与のコホートに対する計算に関して一定である。データを集計することによって生成される累積データは、代表的なポジティブベタイン基準値及びネガティブベタイン基準値のより精確で正確な数値表現を提供する。

あるいは、又はネコ対象から測定されたデータと比較するための参照として代表的な基準値を使用する方法に加えて、（ポジティブ及び／又はネガティブ）対照試料を使用して、（ポジティブ及び／又はネガティブ）対照アッセイを実行することができる。

ネコ対象からの試料を評価してベタインレベルを決定し、測定結果を、治療から利益を得るであろうネコのベタインレベルを有するベタインポジティブ対照試料中のベタインレベルを測定することによって得られた結果と比較することができる。これらの方法及びその比較ステップに基づいて、ネコは、治療から利益を得るであろうネコであると識別されてもよく、又は治療から利益を得るであろうネコではないと識別されてもよい。例えば、ベタインポジティブ対照試料と比較されるネコ対象試料からの試料及び結果が、ネコ対象のベタインレベルが、ベタインポジティブ対照試料中のベタインレベル以下であることを示す場合、ネコ対象は、治療から利益を得るであろうネコであると識別されるであろう。一方で、ベタインポジティブ対照試料と比較されるネコ対象の試料からの試料及び結果が、ネコ対象のベタインレベルが、ベタインポジティブ対照試料のベタインレベルよりも大きいことを示す場合、ネコ対象は、治療から利益を得るであろうネコではないと特定されるであろう。識別方法の結果は、治療決定に情報を与えるために使用されうる。シュウ酸カルシウム結石形成の可能性を減少させるためにネコを治療する方法には、ネコ対象から測定されたベタインレベルを、ベタインポジティブ対照試料中の測定されたベタインレベルと比較する方法によって、ネコ対象を、治療から利益を得るであろうネコであると特定する工程が含まれ得る。この方法によって治療から利益を得るであろうネコであると特定されたネコ対象は、次いで治療で治療される。

ネコ対象はまた、治療から利益を得ることも利益を得ることのないネコのベタインレベルを有するベタインネガティブ対照試料を使用して、治療から利益を得るであろうネコではないと特定することができる。ネガティブ対照アッセイを実施して、ベタインネガティブ対照試料中のベタインレベルを決定することができる。ネコ対象からの試料を評価して、ネコ対象のベタインレベルを決定することができ、これはベタインネガティブ対照試料中のベタインレベルと比較することができる。これらの方法及びその比較ステップに基づいて、ネコは、治療から利益を得るであろうネコではないと特定されうる。例えば、ベタインネガティブ対照試料と比較されるネコ対象の試料からの試料及び結果が、ネコ対象のベタインレベルが、ベタインネガティブ対照試料のベタインレベル以上であることを示す場合、ネコ対象は、治療から利益を得るであろうネコではないと特定されるであろう。

実施例２の表２のデータは、ベタインポジティブ対照試料及びベタインネガティブ対照試料を生成するために使用できる、代表的なポジティブベタイン基準値及びネガティブベタイン基準値を提供する。異なる研究からの異なるデータは、わずかに異なる数を提供し得るが、代表的なポジティブベタイン基準値及びネガティブベタイン基準値は、任意の所与のコホートに対する計算に関して一定である。データを集計することによって生成される累積データは、代表的なポジティブベタイン基準値及びネガティブベタイン基準値のより精確で正確な数値表現を提供する。

組成物及び製剤

上述の方法の適用は、シュウ酸カルシウム結石形成の可能性を減少させるための治療から利益を得るであろうと特定されたネコに有意な利益をもたらす組成物、食物、及び食事を提供するために組み合わされた生理活性食事成分を特定した。ＧＧ遺伝子型を有するネコ対象におけるシュウ酸カルシウム結石形成のリスクは、２－オキソアルギニンレベルを低下させる方法、ならびに／又はベタインレベルを増加させる組成物を投与する方法などの２－オキソアルギニンレベルを低下させ、及び／もしくはベタインレベルを増加させる方法によって、有意に低減され得る。ＧＧ遺伝子型を有するネコ対象におけるシュウ酸カルシウム結石形成のリスクは、以下の一つ以上の：ベタイン、ならびに緑茶、コロハ、及びトゥルシーなどの植物成分を含む組成物を投与する方法によって、有意に減少し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、以下のうちの一つ以上：ベタインならびに緑茶、コロハ、及びトゥルシーなどの植物成分は、補助食品であってもよく、又は好ましくは、ネコの食事中の成分であってもよい。いくつかの実施形態では、ベタインならびに緑茶、コロハ、及びトゥルシーなどの植物成分のうちの二つ以上が含まれる。例えば、組み合わせは、ベタイン及び緑茶、ベタイン及びコロハ、ベタイン及びトゥルシー、緑茶及びコロハ、緑茶及びトゥルシー、ならびにコロハ及びトゥルシーを含みうる。いくつかの実施形態では、介入は、以下の三つ以上の使用：ベタイン、ならびに緑茶、コロハ、及びトゥルシーなどの植物成分を含む。例えば、組み合わせは、ベタイン、緑茶及びコロハ、ベタイン、緑茶及びトゥルシー、ならびにコロハ、緑茶及びトゥルシー、ならびにコロハ及びトゥルシーを含みうる。いくつかの実施形態では、ベタイン、ならびに緑茶、コロハ、及びトゥルシーなどの植物成分の各々が、好ましくは、食物成分として使用される。

いくつかの実施形態では、食物は、成体ネコのための栄養的に完全な食事である。特定の態様では、食物は、成人コンパニオンネコのために配合された栄養的に完全な食事である。

いくつかの実施形態では、組成物は、乾燥物質ベースで組成物の総重量に基づいて４％～７５％以上の量のタンパク質、乾燥物質ベースで組成物の総重量に基づいて５％～５０％以上の量の脂肪、及び乾燥物質ベースで組成物の総重量に基づいて５％～７５％以上の炭水化物と組み合わせて、ベタイン、緑茶、コロハ及びトゥルシーの有効量を含み得る食物組成物を含み、食物組成物は、ネコによる消費に適している。

本明細書に提供される方法で投与される組成物は、特定の実施形態では、栄養的にバランスのとれた、及び／又は栄養的に完全な食物又は食事である食物組成物として配合されてもよい。他の実施形態では、組成物は、栄養補助食品、トリーツ、又はおもちゃとして配合され、調製される。

いくつかの実施形態では、例えば、有効量のベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーに加えて、栄養的に完全かつバランスのとれたネコ用食物組成物は、４％～９０％、５％～７５％、１０％～６０％のタンパク質、及び１５重量％～５０重量％のタンパク質、０重量％～９０重量％、２重量％～８０重量％、５重量％～７５重量％、及び１０重量％～５０重量％の炭水化物、２重量％～６０重量％、５重量％～５０重量％、及び１０重量％～３５重量％の脂肪を含み得る。組成物はさらに、０～１５重量％又は２重量％～８重量％のビタミン及びミネラル、抗酸化物質、ならびに動物の栄養的必要性を支援する他の栄養素を含有してもよい。

組成物内、特に本明細書に提供される方法に投与される食物中の含有に好適なタンパク質、炭水化物、脂肪、ビタミン、ミネラル、バランス剤などの供給源は、当業者に公知の従来の材料から選択され得る。

いくつかの実施形態では、食物組成物の成分として有用なタンパク質は、ほ乳類を含む動物タンパク質、鳥類タンパク質、爬虫類、両生類、魚類、無脊椎動物タンパク質及びその組み合わせを含む動物タンパク質等の動物由来のタンパク質；例えば、牛、ヒツジ、ブタ、ヤギ、シカ、ウサギ、ウマ、カンガルー由来、その乳、凝乳、乳清又は血液、ならびに平滑筋、横紋筋、肝臓、腎臓、腸又は心臓等の臓器由来であり、追加の鳥類のタンパク質源として、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、ダチョウ、ウズラ、ハト、その卵ならびに平滑筋横紋筋、肝臓、腎臓、腸又は心臓等の臓器が挙げられ、両生類の供給源として、カエル又はサラマンダーが挙げられ、爬虫類のタンパク質源として、ワニ、トカゲ、カメ及びヘビが挙げられ、魚類タンパク質源として、ナマズ、ニシン、サーモン、マグロ、ブルーフィッシュ、タラ、オヒョウ、トラウト、メカジキ及びその卵が挙げられ、無脊椎動物タンパク質源として、ロブスター、カニ、ハマグリ、ムール貝又はカキ及びその組み合わせ、肉タンパク質単離物、乳清タンパク質単離物、卵タンパク質、その混合物等、ならびに大豆タンパク質単離物、コーングルテンミール、小麦グルテン、その混合物等のタンパク質を含み得る。

いくつかの実施形態では、食物組成物の成分として有用な炭水化物には、限定されるものではないが、トウモロコシ、全黄色トウモロコシ、穀物ソルガム、小麦、大麦、米、キビ、抽出酒米、オートグラート、及び多糖類（例えば、デンプン及びデキストリン）、ならびに加水分解されるとエネルギー代謝される糖類（例えば、ショ糖、ラクトース、マルトース、グルコース及び果糖）のうちの一つ以上を含み得る。本明細書に開示される組成物への含有に適した追加の炭水化物源の例としては、果物及び非トマトのかす野菜が挙げられる。

食物組成物の成分として有用な脂肪は、以下に限定されないが、家禽脂肪、牛脂、ラード、ｃｈｏｉｃｅ ｗｈｉｔｅ ｇｒｅａｓｅ、大豆油、トウモロコシ油、キャノーラ油、ヒマワリ油、その混合物などの任意の供給源由来であってもよい。脂肪は、食物組成物内に完全に組み込まれてもよく、食物組成物の外側に堆積されてもよく、又は二つの方法の混合物であってもよい。

いくつかの実施形態では、組成物は、グルコサミン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、メチルスルホニルメタン（ＭＳＭ）、クレアチン、抗酸化物質、ペルナカナリキュラータ、オメガ３脂肪酸、オメガ６脂肪酸、及びそれらの混合物からなる群から選択される一つ以上の物質の有効量をさらに含む。

いくつかの実施形態では、食物組成物は、さらに、限定されないが、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン（ＤＬ－メチオニン及びＬ－メチオニンを含む）、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、バリン、タウリン、カルニチン、アラニン、アスパラギン酸塩、シスチン、グルタミン酸塩、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、チロシン、及びヒドロキシプロリン等の一つ以上のアミノ酸を含む。

いくつかの実施形態では、食物組成物は、さらに、限定されないが、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、マルガロレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、ｇ－リノレン酸、ａ－リノレン酸、ステアリドン酸、アラキジン酸、ガドレイン酸、ＤＨＧＬＡ、アラキドン酸、エイコサテトラ酸、ＥＰＡ、ベヘン酸、エルカ酸、ドコサテトラ酸、及びＤＰＡなどであるがこれらに限定されない一つ以上の脂肪酸を含む。

いくつかの実施形態では、食物組成物は、さらに、限定されないが、水分、タンパク質、脂肪、粗繊維、灰分、食物繊維、可溶性繊維、不溶性繊維、ラフィノース、及びスタキオース等の一つ以上の多量栄養素を含む。

いくつかの実施形態では、食物組成物は、さらに、β－カロテン、α－リポ酸、グルコサミン、コンドロイチン硫酸、リコペン、ルテイン、及びケルセチンなどであるがこれらに限定されない一つ以上の微量栄養素を含む。

いくつかの実施形態では、食物組成物は、さらに、カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩素、鉄、銅、マンガン、亜鉛、ヨード、セレン、セレン、コバルト、硫黄、フッ素、クロム、ホウ素、及びシュウ酸塩などであるがこれらに限定されない一つ以上の無機物を含む。

いくつかの実施形態では、食物組成物は、さらに、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、キヌア穀物、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ピリドキシン、パントテン酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、及びコリンなどであるがこれらに限定されない一つ以上の他のビタミンを含む。

いくつかの実施形態では、食物組成物は、繊維をさらに含み、繊維は、例えば、セルロース、ビートパルプ、ピーナッツ殻、及び大豆繊維を含む、様々な供給源から供給され得る。

いくつかの実施形態では、食物組成物は、安定化物質、例えば、組成物の貯蔵寿命を延ばす傾向がある物質をさらに含む。このような物質の潜在的に適切な例として、例えば、防腐剤、抗酸化剤、協力剤及び捕捉剤、包装ガス、安定剤、乳化剤、増粘剤、ゲル化剤、並びに湿潤剤が挙げられる。乳化剤及び／又は増粘剤の例としては、例えば、ゼラチン、セルロースエーテル、デンプン、デンプンエステル、デンプンエーテル、及び加工デンプンが挙げられる。

いくつかの実施形態において、食物組成物は、着色、嗜好性、及び栄養の目的のための意図される添加剤として、例えば、着色剤、酸化鉄、塩化ナトリウム、クエン酸カリウム、塩化カリウム、及びその他の食用塩類、ビタミン、鉱物、及び香料を含み得る。組成物中のこのような添加剤の量は、一般的には、最大５％（組成物の乾量基準）である。

組成物の調製

ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーを含む組成物は、ネコの消費に適した食物として調製されてもよい。これらの食物は、任意の一貫性又は水分含量であってもよく、すなわち、組成物は、湿潤、半湿性、又は乾燥食物であってもよい。「湿った」食物は、一般に６０％～９０％以上の水分含量を有する食物である。「乾燥」食物は、一般に、３％～１１％の水分含量を有する食物であり、小片又はキブルの形態で製造されることが多い。「半湿性」の食物は、一般的に２５％～３５％の水分含量を有する。食物はまた、例えば、柔らかい、噛みごたえのある肉のような粒子又は破片、ならびに外側穀物成分又はコーティング及び内側「クリーム」成分を有するキブルなどの、一つ以上の一貫性を有する成分を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、ベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーを含む食物は、当業者に公知の従来的な食物調製プロセスを使用して、缶詰又は湿潤形態で調製されてもよい。通常、粉砕した動物タンパク質組織を、穀粒、適切な炭水化物源、脂肪、油、及び調製成分等のその他の成分と混合し、ビタミン及びミネラル混合物、無機塩、セルロース、ビートパルプ等、及び加工に充分な量の水を含む。これらの成分は、成分のブレンド中に加熱を行うのに好適な容器中で混合する。例えば、直接の蒸気注入による、又は熱交換器を備えた容器を使用することによる等の、任意の好適な方法を使用して、混合物の加熱を行うことができる。配合物の全ての成分の添加後、混合物は５０°Ｆ～２１２°Ｆの温度に加熱される。この範囲外の温度を使用することができるが、他の加工助剤を使用しない商業的に実用的でない場合がある。適切な温度まで加熱をすると、材料は通常、粘性液体の形態であり、缶に分注する。蓋を付け、容器を密閉する。次いで、密閉した缶を、内容物を殺菌するために設計した従来の装置の中に配置する。殺菌は、通常、約２３０℃を超える温度まで、使用する温度及び組成物及び関連の要因に依存して、適切な時間加熱することにより達成することができる。本発明の組成物及び食物はまた、それらの調製の前、最中、又は後に、食物組成物に添加されてもよく、又は食物組成物と組み合わされてもよい。

いくつかの実施形態では、食物は、当業者に公知の慣習的プロセスを使用して、乾燥形態で調製されてもよい。通常、乾燥動物性タンパク質、植物性タンパク質、穀物等を含む乾燥成分を粉砕して、共に混合する。脂肪、油、水、動物性タンパク質、水等を含む液体又は湿潤成分を加え、乾燥物質と混合する。様々な成分を組み合わせるために使用される特定の製剤、付加の順序、組み合わせ、及び方法及び機器は、当技術分野で公知のものから選択することができる。例えば、特定の実施形態では、結果として生じる混合物は、乾燥及び湿潤成分の混合物が、高圧及び高温で機械的作業に供され、小さな開口部又は開口部を通され、例えば、回転ナイフでキブルに切断される、押出成形プロセスを使用して形成される、キブル又は類似の乾燥片に加工される。得られたキブルを乾燥させて、例えば、風味、脂肪、油類、粉末等を含む、一つ以上の局所コーティング剤で任意に被覆する。キブルはまた、押出成形ではなくベーキング法を用いてドウより作製することができ、この方法では、ドウを型に配置した後、乾燥加熱プロセスを行う。

組成物を調製する場合、任意の成分は、一般的に、配合の処理中、例えば、組成物のその他の成分を混合している間及び／又は混合した後に、組成物に組み込むことができる。これらの成分の組成物への分配は、従来の手段により達成することができる。特定の実施形態では、粉砕された動物及び／又は家禽のタンパク質性組織は、栄養バランス剤、無機塩を含む他の成分と混合され、さらに、セルロース、ビートパルプ、充填剤等を含むその他の成分を、加工に十分な水と混合される。

いくつかの実施形態では、組成物は、より噛みやすいように配合される。特定の実施形態では、組成物及び食物は、ライフステージ、年齢、サイズ、体重、体組成、及び繁殖など、ネコ間の特定の栄養の違いに対処するために配合される。

有効量のベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーを含む組成物は、成熟した成人ネコのニーズを満たすために栄養的に完全な食事として配合される。栄養的に完全な食事は、食事に関して、健康なネコの通常の健康を維持するのに十分な栄養素を含み得る食事である。栄養的に完全なバランスの取れたキャットフード組成物は当業者によく知られている。例えば、栄養的に完全でバランスの取れた動物飼料組成物に好適な栄養素及び成分などの物質、ならびにそれらの推奨量は、例えばＯｆｆｉｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｏｆｆｉｃｉａｌｓ，Ｉｎｃ．（ＡＡＦＣＯ）、Ａｔｌａｎｔａ、Ｇａ．（２０１２）に認めることができる。

別の実施形態では、有効量のベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーを含むトリーツは、例えば、乾燥食物について以下に説明されるものと類似した押出成形又は焼成プロセスによって調製されて、食用品を提供することができる。トリーツとしては、例えば、食事の時間ではない間に、ネコに食事の気を引かせるために与えられる組成物が挙げられる。トリーツは栄養があってよく、組成物は１種以上の栄養素を含み、かつ例えば、食物に関して上で記載した組成物を有してよい。栄養のないトリーツは、無毒性の任意の他のトリーツを包含する。組成物は、治療剤に被覆されてもよく、治療剤に組み込まれてもよく、又はその両方であってもよい。

別の実施形態では、チュアブル又は消耗品のおもちゃである動物のおもちゃが提供される。そのようなおもちゃは、典型的には、有効量のベタイン、緑茶、コロハ、及びトゥルシーで既存の任意のおもちゃを被覆することによって調製される。したがって、おもちゃには、例えば、チュアブルトイが含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物は、おもちゃの表面上又はおもちゃの部品の表面上にコーティングを形成することができ、おもちゃの一部に又はおもちゃ全体に、又はその両方に組み込むことができる。現在市販されている広範な好適なおもちゃがある。例えば、米国特許５，３３９，７７１号（及び米国特許第第５，３３９，７７１号に開示される参考文献）を参照されたい。また、例えば、米国特許５，４１９，２８３号（及び米国特許第第５，４１９，２８３号に開示される参考文献）を参照されたい。本発明が部分的に消耗品及び完全に消耗品のおもちゃの両方を企図することを認識すべきである。

本明細書に記述される全ての刊行物は、本発明に関連して使用されうる、本刊行物に報告されている材料及び方法論を記載及び開示する目的で、参照により組み込まれる。

本発明が適用可能であるさらなる領域は、以下に提供される発明を実施するための形態から明らかになるであろう。発明を実施するための形態及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているものの、例示の目的のみを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図していないと理解されるべきである。

実施例１

４４５匹のネコのコホートのゲノムワイド関連研究を実施した。コホートの４４５匹のネコの各々を、染色体１のＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２に対して遺伝子型解析した。ネコの遺伝子型がホモ接合性マイナーアレルＡＡ（グループ１１）、ヘテロ接合性アレルＡＧ（グループ１２）、又はホモ接合性メジャーアレルＧＧ（グループ２２）であるかに基づいて、ネコを３群に分けた。コホート内の各遺伝子型の頻度は、三つの遺伝子型の各々を有するネコの数に基づいて計算された。代謝物２－オキソアルギニンのレベルは、各ネコについて測定され、代謝物２－オキソアルギニンの平均レベルは、各コホートについて決定された。表１は、試験の概要及び生成されたデータを提供する。

表１に示されるように、遺伝子型解析された４４５匹のネコのうち、約７％（０．０６９９；３０／４４５）がホモ接合性マイナーアレルＡＡ遺伝子型を有し、約３９％（０．３９３９；１６９／４４５）がヘテロ接合性マイナー／メジャーアレルＡＧ遺伝子型を有し、約５４％（０．５３６１；２３０／４４５）がホモ接合性メジャーアレルＧＧ遺伝子型を有していた。表１に示されるように、ＡＧＸＴ２及び２－オキソアルギニンのバリアント（それぞれＡＡ、ＡＧ及びＧＧの０．４５、０．９１、１．２６スケールデータ）との関連がある。

実施例２

ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２多型の様々な遺伝子型を有する２３匹のネコを用いて試験を実施した。９匹のネコがＡＡ遺伝子型を有し、４匹がＡＧ遺伝子型を有し、１０匹がＧＧ遺伝子型を有していた。

ストルバイト結石リスク分析は、ストルバイト相対過飽和（ｓＲＳＳ）アッセイにより尿試料上で完了した。シュウ酸カルシウム結石リスク分析は、ＣＯＴＴアッセイを使用して尿試料上で完了した。同時に、尿をＥＱＵＩＬ ２プログラムを使用して相対ｓＲＳＳについて分析した。簡潔に述べると、このコンピュータプログラムは、一般的な腎臓結石成分に対する尿過飽和比（単位なし）を計算する。ＥＱＵＩＬ ２プログラムは、特定の分析物のｐＨ及び合計濃度（Ｍ／Ｌ）に基づいて、尿飽和の状態の評価を提供する。

メタボロミック解析は、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ（登録商標）によって完了され、特定の遺伝子型を比較するために、スケールされた補完されたデータを使用した。ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、塩化物、アンモニウム、クエン酸塩、リン酸塩、硫酸塩、及びシュウ酸塩の濃度を測定した。本方法は、尿イオンに対する遊離イオン活性を計算するために熱力学的安定性定数を使用した。次に、これらの遊離イオン活性を使用して、純水中で結晶を形成するものと比較した尿の過飽和比を計算した。

ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２多型の間に循環ベタインレベルとの関連が観察された。以下の表２に報告されたデータは、循環ベタインレベルが、ＧＧ遺伝子型を有する群において最も低く、ＡＡ遺伝子型を有する群において最も高いことを示す。ＡＧ遺伝子型を有するネコは、ＧＧ遺伝子型を有するネコとＡＡ遺伝子型を有するネコにおいて見出されたレベルの間でベタインレベルを有した。

実施例３
シュウ酸カルシウム結石形成リスクに対するＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２多型と栄養の相互作用を、２３匹のネコを用いて評価した。シュウ酸カルシウム結石形成リスクを、ＣＯＴＴアッセイを使用して測定した。簡潔に述べると、［Ｃａ＋２］／（添加Ｏｘ－２）比が計算される（リットル当たり）。インデックス値の増加は、シュウ酸カルシウム結晶化のリスクがより高い試料を示し、インデックス値の減少は、リスクがより低い試料を示す。比率は、イオン化カルシウムの濃度と、結晶化を開始するために添加されるシュウ酸塩の量を表す。ＣＯＴＴアッセイの結果は、シュウ酸カルシウム結石形成の発生について予測可能である。ＣＯＴＴアッセイ結果を低下させることができる治療は、シュウ酸カルシウム結石形成の可能性を減少させるための有効な治療を示す。また、ｓＲＳＳアッセイからデータを採取して、ストルバイト石形成のリスクに対する任意の効果を決定した。

シュウ酸カルシウム結石リスクを評価し、ベタイン、及び植物（緑茶、コロハ、及びトゥルシー）の食事含有の効果を決定した。試験食物は、０．５％でベタインを含有し、植物性緑茶、コロハ及びトゥルシーを、それぞれ０．２５、０．０２５及び０．００１５％で含有した。対照食物は、対照食物が追加の成分を含有していなかったことを除いて、試験食物と同一であった。

実験設計は以下の通りであった。１～２８日目は、全てのネコを対照（非強化）食物に２８日間置いた「摂食前期間」であった。２９～５６日目、次いでネコを二つの群に分けた：グループ１は対照食物を２８日間にわたって毎日与えられ、グループ２は試験食物を２８日間にわたって毎日与えられた。５７～８４日目、食物を切り替えた：グループ１は試験食物を２８日間にわたって毎日与えられ、グループ２は対照食物を２８日間にわたって毎日給餌与えられた。したがって、２８日間の最初の摂食前期間後、各ネコは、５６日後、対照食物を２８日間、及び強化食物を２８日間消費した。尿及び血液分析は、２８日目（すなわち、摂食前２８日後）、５６日目（すなわち、食物が切り替わる直前の２８日間の中間点）、及び８４日目（すなわち、摂食前５６日後の試験摂食期間の終了時）に完了した。

ＣＯＴＴ値の自然対数については、ＣＯＴＴ値が正規分布していないため、ＣＯＴＴ値の解析を行った。ＣＯＴＴ解析は、５６日周期、初期のＣＯＴＴ値、ネコの年齢、試験日、食物及び遺伝子型、ならびにモデルにおけるそれらの相互作用を使用した、ＳＡＳにおけるＰＲＯＣ ＭＩＸＥＤ解析手順を使用した。

データを図１に示す。対照食物を摂食した対象のＣＯＴＴ値は、遺伝子型ＡＡ、ＡＧ、及びＧＧについてそれぞれ２．６６、２．７５、２．７２であった。試験食物を摂取した後、ＣＯＴＴ値は、遺伝子型ＡＡ、ＡＧ、及びＧＧそれぞれ２．９１、２．３９、２．１２であった。試験食物を与えられた場合のＣＯＴＴ値と対照食物を与えられた場合のＣＯＴＴ値を比較すると、試験食物は遺伝子型ＡＡのＣＯＴＴ値に有意な影響を与えなかった。対照的に、試験食物を与えられた場合のＣＯＴＴ値と対照食物を与えられた場合のＣＯＴＴ値を比較すると、遺伝子型ＧＧについて、試験食物ＣＯＴＴ値は、対照食物ＣＯＴＴ値と比較して有意に減少した。同様に、試験食物を与えられた後のＧＧネコのＣＯＴＴ値は、試験食物を摂取した後のＡＡネコのＣＯＴＴ値と比較して有意に減少した。

したがって、ＣＯＴＴ値に対する食物の影響は、遺伝子型に基づいて異なっていた。事後分離手段が完了したとき、試験食物を摂食した後にＡＡネコは、試験食物を摂食した後のＧＧネコと比較してＣＯＴＴ値を増加させ、また、対照食物を摂食した後のＧＧネコのＣＯＴＴ値と比較して、試験食物を摂食する際に、ＧＧネコはＣＯＴＴ値を減少させた。ＧＧ遺伝子型は、ベタイン及びボタニカル（緑茶、コロハ、及びトゥルシー）で強化される食物に感受性であり、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを著しく減少する一方、この同じ介入は、ＡＡ遺伝子型のＣＯＴＴ値の変化に全く有効ではない。データは、ＡＧ遺伝子型がホモ接合性遺伝子型の間で中間であることを示している。

食物によるｓＲＳＳに変化はなかった。ｓＲＳＳの全ての平均値は０．７５未満であり、ストルバイト結石のリスクが非常に低いことを示している。

サイトカインレベルもモニタリングした。サイトカインを、ＳＡＳのＰＲＯＣ ＧＬＭ ＭＡＮＯＶＡ手順によりグループとして評価した。マルチバリアントＡｎｏｖａの手技により、ＧＧ遺伝子型はＡＡ遺伝子型より循環サイトカインの濃度が高いという結論（Ｐ＜０．０１）を得た（図２）。ＧＧ遺伝子型は、循環サイトカインの濃度を増加させた。

実施例４

血漿代謝プロファイルを決定するために血液が採取される。血漿中の２－オキソアルギニン及び／又はベタインのレベルは、民間試験所（Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ、ＵＳＡ）によって測定することができる。抽出された上清を分割し、ガスクロマトグラフィー及び液体クロマトグラフィー質量分析計プラットフォーム上で実行する。２－オキソアルギニン及びベタインの各々のピークが既知であり、各試料のピークの下の面積が公知の試料に対して正規化され得る。（例えば、Ｅｖａｎｓ，Ａ．Ｍ．，ら（２００９年）を参照されたい。生物学的システムの小分子補体の特定及び相対的定量のための、統合非標的化超高性能液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析プラットフォーム。Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８１，６６５６－６６６７。）ガスクロマトグラフィー（疎水性分子用）及び液体クロマトグラフィー（親水性分子用）を使用して、血漿試料中に存在する２－オキソアルギニン及び／又はベタインなどの代謝物の相対的定量を特定し、提供する。（例えば、Ｂａｌｌｅｔ，Ｃ．ら（２０１８）Ｎｅｗ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ、Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、９、６２３３－６２３９；Ａｋｉｙａｍａ，Ｙら（２０１２）Ａ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＡＳＴ－１２０ ｏｎ ５／６ Ｎｅｐｈｒｅｃｔｏｍｉｚｅｄ Ｒａｔｓ ｂｙ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｗｉｔｈ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＣＥ－ＭＳ）Ｔｏｘｉｎｓ ２０１２、４（１１）、１３０９－１３２２；及びＫｉｋｕｃｈｉ Ｋ，ら（２０１０）Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｕｒｅｍｉｃ ｔｏｘｉｎｓ ａｓ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｎ ｏｒａｌ ｓｏｒｂｅｎｔ ＡＳＴ－１２０ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ８７８：２９９７－３００２を参照されたい。）Ｂｕｒｒａｇｅ，ＬＣ ら（２０１９）Ｕｎｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐａｔｈｗａｙ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１、１９７７－１９８６は、２－オキソアルギニンレベルの測定を含む血漿試料の分析を開示している。Ｍｉｌｌｅｒ ＭＪ，ら（２０１５）Ｕｎｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｉｎｂｏｒｎ ｅｒｒｏｒｓ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ．３８：１０２９－１０３９及びＫｅｎｎｅｄｙ ＡＤ，ら（２０１６）Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｒｉｎｅ ａｓ ａ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｎｂｏｒｎ ｅｒｒｏｒｓ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｇｅｎｅｔ Ｔｅｓｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．２０：４８５－４９５は、また、２－オキソアルギンを測定するための技術も開示している。技法は、ネコ対象からの試料中の２－オキソアルギニンレベルを測定するために適合され、使用され得る。Ｍｉｄｔｕｎ，Ｏ．，ら（２０１３）。Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ，ｌｏｗ－ｖｏｌｕｍｅ，ｍｕｌｔｉａｎａｌｙｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｏｎｅ－ｃａｒｂｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｕｓｉｎｇ ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ．Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ ４０５、２００９－０１７、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｒｏｉｇ，Ｓ．、（２０１３）Ｌｏｗ ｆｏｌａｔｅ ｓｔａｔｕｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｂｅｔａｉｎｅ ａｎｄ ｄｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂｅｔａｉｎｅ ａｎｄ ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ９７，１２５２－５９及びＨｏｌｍ，Ｐ．Ｉ．，ら（２００５）。Ｂｅｔａｉｎｅ ａｎｄ ｆｏｌａｔｅ ｓｔａｔｕｓ ａｓ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ ＶＡＳＣ Ｂｉｏｌ ２５，３７９－３８５は、ベタインを測定するための技術を開示する。技術は、ネコ対象からの試料中のベタインレベルを測定するために適合され、使用されうる。

実施例５

唾液試料はネコから得られる。試料は、別の場所の検査室に採取されたものとして出荷されてもよく、部分的に処理され、その後、別の場所の検査室に出荷されるか、又は研究室及び採取の場所で完全に処理及び分析されてもよい。試料が、別の場所で研究室に採取されたものとして出荷されるか、部分的に処理され、その後、別の場所で研究室に出荷される場合、研究室によって試料から採取された一部又は全てのデータが、採取部位及び／又は獣医師及び／又はネコの所有者もしくは責任者又は責任者に送られる場合がある。唾液試料が得られた後、それを分析のために処理し、ＧＧ遺伝子型の存在について評価してもよい。

結果が、ネコが本明細書に提供される治療から利益を得ることを示唆する場合、ネコは、有効量のベタイン及び／又は緑茶及び／又はコロハ及び／又はトゥルシーを含む組成物を投与してもよい。

実施例６

ＰＥＲＦＯＲＭＡｇｅｎｅ ＰＧ－１００経口採取キットを使用して、ネコから試料を採取する。

その際、動物は、唾液採取前に３０分間食べる、又は１０分間は飲んではならず、採取を行う個人は、スポンジで動物の歯又はほおを擦り取ることはできず、また、動物にそのスポンジを噛ませるべきではない。

ＰＥＲＦＯＲＭＡｇｅｎｅ ＰＧ－１００経口採取キットの一部として提供される採取チューブは、ＤＮＡ試料を保存する液体を含み、試料を分析するためにラボによって要求される。試料採取前にキャップを取り外すべきではない。

採取プロトコルの第一のステップでは、スポンジは動物の口の頬嚢に置かれる。唾液は、スポンジを取り外し、唾液が自然に溜まる場所（頬嚢及び舌下）をふき取ることによって、３０秒間採取される。６カ月以上経過した動物については、中程度の拘束が必要となる場合がある。

次に、チューブを真っ直ぐに保持し、チューブからのキャップはねじ止めされていない。キャップを上下逆にし、口腔スワブをチューブ内に置く。キャップは、輸送中に液体試料が漏れるのを防ぐため、しっかりとねじ止めされている。チューブを反転させ、例えば１０回など、何度も激しく振って、試料を完全に混合する。

永久マーカーを使用して、チューブラベル上の空白に動物識別番号を明確に記載してもよい。

ＰＧ－１００採取キットを用いて、Ｐｅｒｆｏｒｍａｇｅｎｅ化学で採取され、保存された、Ｐｅｒｆｏｒｍａｇｅｎｅ（商標）試料の０．５ｍＬのアリコートからのＤＮＡの手動精製のための段階的な研究室プロトコルは、以下の通りである。手動精製に必要な試薬は、ＰＧ－ＡＣ１試薬パッケージ又はＰＧ－ＡＣ４試薬パッケージで入手可能である。

ＤＮＡ試料が採取され、そして、Ｐｅｒｆｏｒｍａｇｅｎｅ溶液と混合されると、ＤＮＡは直ちに安定化される。Ｐｅｒｆｏｒｍａｇｅｎｅ試料は、採取時から１年間、室温で安定である。Ｐｅｒｆｏｒｍａｇｅｎｅ試料は、－１５℃～－２０℃で無期限に保存することができ、ＤＮＡを劣化させることなく、複数回の凍結融解サイクルを実施することができる。

精製プロセスでは、以下の装置及び試薬を使用する：１５，０００×ｇで実行することができる微量遠心機、５０℃の空気又は水インキュベーター、室温でのエタノール（９５％～１００％）、ＤＮＡ緩衝液：ＴＥ（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）又は類似の溶液、任意のグリコーゲン（２０ｍｇ／ｍＬ）（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ．番号１０８１４－０１０）、エタノール（７０％）を室温及び５ＭのＮａＣｌ溶液。

最初のステップでは、試料を５秒間激しく振盪することによって混合する。これは、粘性試料が、Ｐｅｒｆｏｒｍａｇｅｎｅ溶液と適切に混合することを確実にするためである。

試料を、５０℃の空気インキュベーター中で最低２時間、又は５０℃の水インキュベーター中で最低１時間インキュベートする。Ｐｅｒｆｏｒｍａｇｅｎｅ中のＤＮＡは、インキュベーションステップを行わなくても室温で安定している。この熱処理工程は、ＤＮＡが適切に放出され、ヌクレアーゼが永久的に不活化されることを確実にするために不可欠である。このインキュベーション工程は、試料が動物から採取された後、及び精製される前に、任意の時点で実施されうる。試料全体のインキュベーションが推奨される。試料は、より好都合であれば、５０℃で一晩インキュベートされ得る。温度平衡が水インキュベーターよりも遅いため、空気インキュベーターではより長い時間が必要となる。

任意選択で、採取スポンジを除去してもよい。キャップが取り除かれ、採取用スポンジが管の内側に押し付けられ、可能な限り多くの試料が抽出される。スポンジ及びキャップは廃棄される。スポンジの除去は、ワークフローの好みによって決定される。

次に、混合した５００μＬのＰｅｒｆｏｒｍａｇｅｎｅ試料が１．５ｍＬの微量遠心機チューブに移される。Ｐｅｒｆｏｒｍａｇｅｎｅ試料の残りは、室温又は凍結（－１５℃～－２０℃）で保管することができる。次いで、２０μＬ（１／２５体積）のＰＧ－Ｌ２Ｐ精製器をエッペンチューブに添加し、数秒間ボルテックスすることにより混合する。不純物及び阻害剤が沈殿すると、試料は濁る。

試料を、氷上で１０分間インキュベートし（室温インキュベーションは置換可能であるが、不純物除去にはわずかに効果が少ない）、その後、１５，０００×ｇで室温で５分間遠心分離する。より長時間の遠心分離（最大１５分）は、最終ＤＮＡ溶液の濁り（高Ａ３２０）を減少させるのに有益であり得る。透明な上清をピペットチップで新鮮な微量遠心機チューブに移し、濁り不純物を含有するペレットを廃棄する。５００μＬの上清に、２５μＬ（１／２０体積）の５ＭのＮａＣｌを添加し、続いて混合する。ＮａＣｌの添加は、ＤＮＡの効率的な回収を確保するために必要である。５００μＬの上清に、６００μＬの室温９５％～１００％のエタノールを加え、その後、反転による穏やかな混合を１０回行う。エタノールと混合中、ＤＮＡが沈殿する。ＤＮＡは、試料中のＤＮＡの量に応じて、ＤＮＡ繊維の塊として、又は微細な沈殿物として現れることがある。塊が見られなくても、次のステップに注意深く従うことによってＤＮＡを回収する。

試料を室温で１０分間放置し、ＤＮＡを完全に沈殿させる。次いで、チューブを、既知の配向で遠心分離器に入れ（ＤＮＡペレットは遠心分離後には見えない場合がある）、＞１５，０００×ｇで室温で２分間遠心分離する。例えば、各チューブは、キャップのヒンジ部分がローターの中心から離れて指し示すように、微量遠心機内に配置されてもよい。遠心分離後、ペレットの位置を（小さすぎて容易に見えない場合でも）配置することができ、ヒンジの下のチューブの先端にある。

上清をピペットチップで除去し、廃棄する。ペレットはＤＮＡを含有する。ペレットが上側の壁上にあるようにチューブを回転させると、ピペットチップを下側の壁に沿って安全に移動させ、上清を全て除去することができる。上清は不純物を含有してもよく、可能な限り完全に除去されるべきである。ペレットの過剰乾燥は、ＤＮＡの溶解をより困難にする可能性がある。ＤＮＡは、最初に２５０μＬの７０％エタノールを添加することによって洗浄され、次いで室温で１分間放置される。エタノールは、ペレットを妨害することなくピペットチップで除去される。７０％エタノールの洗浄は、残留阻害剤を除去するのに役立つ。しかし、エタノールを完全に除去することは、下流の適用の間の阻害を防ぐために不可欠である。したがって、チューブを６秒間遠心分離して、任意の残りのエタノールをプールし、ピペットチップで除去する。

１００μＬのＤＮＡ緩衝液（例えば、ＴＥ緩衝液）をチューブに添加して、ＤＮＡペレットを溶解する。少なくとも５秒間ボルテックスすることは、溶解プロセスを助ける。ＤＮＡの完全な再水和を確保するため、室温に一晩置いておく。ＤＮＡを定量し、下流の適用で使用することができる。

蛍光染料を使用するアッセイは、ＤＮＡ試料中の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の量を定量するために、２６０ｎｍでの吸光度よりも特異的である。ＲＮＡを汚染することによって干渉が少ないため、蛍光法によってＤＮＡを定量化するために、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）又はＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉなどの蛍光染料を使用してｄｓＤＮＡを定量化してもよい。あるいは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＱｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（カタログ番号 番号Ｑ－３３１３０）等の市販のキットを使用してもよい。いずれのプロトコルでも、精製ＤＮＡは、好ましくは、ＴＥ溶液で１：５０に希釈され、定量アッセイでは５μＬが使用される。

あるいは、ＤＮＡは、吸光度によって定量化されてもよく、その場合、精製された試料は、最初にＲＮａｓｅで処理されて、汚染ＲＮＡを消化し、次いでＤＮＡのエタノール沈殿によってＲＮＡ断片を除去することが好ましい。Ｐｅｒｆｏｒｍａｇｅｎｅ試料由来のＤＮＡは、通常、血液試料中に見られるＲＮＡよりも明らかに多いＲＮＡを含有する。アルコール沈殿ＤＮＡが完全に溶解されていることを確認してから、吸光度を読み取る。２６０ｎｍでの１．０の吸光度は、純粋なｄｓＤＮＡの５０ｎｇ／μＬ（５０μｇ／ｍＬ）の濃度に相当する。過度に大量の試料の使用を避けるために、１００μＬ以下の容量の試料を読み取ることができる分光光度計キュベットを使用する必要がある。２６０ｎｍでの吸光度値は、０．１～１．５であるべきである。値が低いほど信頼性に欠ける場合がある。

精製されたＲＮａｓｅ処理されたＤＮＡの１０μＬアリコートを、９０μＬのＴＥ（１／１０希釈）で希釈し、穏やかにピペッティングアップダウンすることによって混合する。気泡がなくなるのを待つ。ＴＥは、参照（空白）セルで使用される。吸光度は、３２０ｎｍ、２８０ｎｍ、及び２６０ｎｍで測定される。補正されたＡ_２８０及びＡ_２６０値は、Ａ_２８０及びＡ_２６０値から３２０ｎｍ（Ａ_３２０）での吸光度を差し引くことによって計算される。ｎｇ／μＬでのＤＮＡ濃度＝補正Ａ_２６０×１０（希釈係数）×５０（換算係数）。Ａ_２６０／Ａ_２８０比：補正されたＡ_２６０を補正されたＡ_２８０で割る。

実施例７

ベタイン及び植物性緑茶、コロハ及びトゥルシーを含む治療から利益を得るものとして特定されたネコのシュウ酸カルシウム結石の可能性を減少させる毎日の食事が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２のＧＧ遺伝子型を有すると特定されたネコに、ベタイン及び植物性緑茶、コロハ及びトゥルシーを与えることを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、治療から利益を得ると特定されたネコのレベルに対応する基準レベル以上である、及び／又は治療から利益を得ると特定されたネコのレベルに対応するレベルで２－オキソアルギニンを含有するポジティブ対照試料で測定されるレベル以上である２－オキソアルギニンレベルを有すると特定されたネコに、ベタイン及び植物性緑茶、コロハ、及びトゥルシーを与えることを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、ベタイン、及び植物性緑茶、コロハ、及びトゥルシーを、治療から利益を得るものとして特定されたネコのレベルに対応する基準レベル以下、及び／又は治療から利益を得るものとして特定されたネコのレベルに対応するレベルのベタインを含有するポジティブ対照試料で測定されるベタインレベル以下を有するものとして特定されたネコに与えることを含み得る。いくつかの実施形態において、方法は、ネコ対象からの試料を分析して、ネコ対象がＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２のＧＧ遺伝子型を有するかを決定することを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、ネコ対象からの試料を分析して、試料中の２－オキソアルギニンのレベルを決定し、測定されたレベルを、ポジティブ検査結果及び／又はポジティブ対照試料で測定されたレベルに対応する基準レベルのいずれかと比較することを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、ネコ対象からの試料を分析して、試料中のベタインのレベルを決定し、測定されたレベルを、ポジティブ検査結果に対応する基準レベル及び／又はポジティブ対照試料で測定されたレベルのいずれかと比較することを含み得る。ポジティブ参照標準値は、特に、同等のサイズ、重量、年齢、育種を有するネコに対してポジティブの結果であるとみなされる２－オキソアルギニン又はベタインレベルに対応する。

実施例８

以下の組成物は、１日あたり提供される総栄養量に基づく。
乾燥物質ベースの組成物の総重量に基づくいくつかの実施形態では、ベタインの量は、０．２５％～１．０％に等しく、いくつかの実施形態では０．７５％～０．５０％、いくつかの実施形態では約０．５０％である。乾燥物質ベースの組成物の総重量に基づくいくつかの実施形態では、緑茶の量は、０．１％～０．５％に等しく、いくつかの実施形態では０．２０％～０．３０％、いくつかの実施形態では約０．２５％である。乾燥物質ベースの組成物の総重量に基づくいくつかの実施形態では、コロハの量は、０．０１％～０．０５％に等しく、いくつかの実施形態では０．０２０％～０．０３０％、いくつかの実施形態では約０．０２５％である。乾燥物質ベースの組成物の総重量に基づくいくつかの実施形態では、トゥルシーの量は、０．０００５％～０．００３％に等しく、いくつかの実施形態では０．００１０％～０．００２％、いくつかの実施形態では０．００１５％である。特定の実施形態では、組成物は、乾燥物質ベースの組成物の総重量に基づいて、５％、７．５％、１０％、１２．５％、１５％、１７．５％、２０％、２２．５％、又は２５％の量でニワトリを含み得る。特定の実施形態では、組成物は、乾燥物質ベースの組成物の総重量に基づいて、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、又は１５％の量で卵タンパク質を含み得る。特定の実施形態では、組成物は、乾燥物質ベースの組成物の総重量に基づいて、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％の量でコーングルテンミールを含み得る。特定の実施形態では、組成物は、乾燥物質ベースの組成物の総重量に基づいて、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、又は１．９％、又は２．０％の量の追加の植物源を含み得る。特定の実施形態では、組成物は、乾燥物質ベースの組成物の総重量に基づいて、トマトかすに加えて、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、又は１．５％の量の追加のフルーツ源を含み得る。特定の実施形態では、組成物は、乾燥物質ベースの組成物の総重量に基づいて、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％の量で、キビ、酒米、エンバクひき割粉、及びそれらの組み合わせから選択される炭水化物を含み得る。これらの実施形態の特定の態様では、本発明の組成物は、これらの値のうちのいずれか二つによって終点として定義される範囲内の炭水化物源の乾燥重量を含み得る。

実施例９

表３は、組成物の割合を有する特定の実施形態を記載する（成分 組成物の乾燥重量の％）。

乾燥物質摂取量として毎日の栄養摂取量に基づいて、０．２５％～１．０％のベタイン、０．１％～０．５％の緑茶、０．０１％～０．０５％のコロハ、及び０．０００５％～０．００３％のトゥルシーを含む毎日の食事をネコに与えることを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、乾燥物質摂取量として毎日の栄養摂取量に基づいて、０．５０％から０．７５％のベタイン、０．２％から０．３％の緑茶、０．０２％～０．０３％のコロハ、及び０．００１０％から０．００２％のトゥルシーを含む毎日の食事をネコに与えることを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、乾燥物質摂取量として毎日の栄養摂取量に基づいて、約０．５０％のベタイン、約０．２５％の緑茶、約０．０２５％のコロハ、及び約０．００１５％のトゥルシーに基づくを含む毎日の食事をネコに与えることを含む方法が提供される。

実施例１０

表４は、特定の実施形態で使用される成分を記載する。

実施例１１

表５は、特定の実施形態で使用される成分を記載する。

実施例１２

表６は、特定の実施形態で使用される成分を記載する。

実施例１３

表７は、特定の実施形態で使用される成分を記載する。

実施例１４

表８は、特定の実施形態で使用される成分を記載する。

実施例１５

表９は、特定の実施形態で使用される成分を記載する。

実施例１６

表１０は、特定の実施形態で使用される成分を記載する。

Claims (9)

1. シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうネコ対象を特定する方法であって、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる前記治療が、０．５％のベタイン、０．２５％の緑茶、０．０２５％のコロハ及び０．００１５％のトゥルシーを含む組成物を、前記ネコ対象に投与することを含み、前記方法は、
   ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２のメジャーアレルＧの二つのコピーの存在について、前記ネコ対象から得られた生体試料を分析することを含み、
   ＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２の前記メジャーアレルＧの二つのコピーの前記存在は、前記ネコ対象が前記治療から利益を得ることを示す、方法。
2. 前記試料がゲノムＤＮＡ試料であり、 前記試料は、前記ネコ対象の血液、唾液、卵胞根、鼻腔スワブ、又は口腔スワブ、好ましくは唾液から得られる、請求項１に記載の方法。
3. 前記試料が、ＤＮＡシークエンシング、制限酵素消化、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ、又はリガーゼ連鎖反応から選択される少なくとも一つの核酸解析技術を実行することによって分析される、請求項１または２に記載の方法。
4. シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうネコ対象を特定する方法であって、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる前記治療が、０．５％のベタイン、０．２５％の緑茶、０．０２５％のコロハ及び０．００１５％のトゥルシーを含む組成物を、前記ネコ対象に投与することを含み、前記方法は、
   前記ネコ対象から得られた生体試料を分析して前記ネコ対象のベタイン濃度を決定することであって、前記生体試料が尿であることと、
   前記ネコ対象のベタイン濃度を、ポジティブ参照ベタイン濃度値と比較することであって、前記ネコ対象のベタイン濃度が前記ポジティブ参照ベタイン濃度値以下であることは、前記ネコ対象が治療から利益を得るであろうことを示す、比較することであるとともに、前記ポジティブ参照ベタイン濃度値が１．１１であり、前記ポジティブ参照ベタイン濃度値がＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２のメジャーアレルＧの二つのコピーを有するネコ対象から決定されることと、を含む、方法。
5. シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうネコ対象を特定する方法であって、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる前記治療が、０．５％のベタイン、０．２５％の緑茶、０．０２５％のコロハ及び０．００１５％のトゥルシーを含む組成物を、前記ネコ対象に投与することを含み、前記方法は、
   前記ネコ対象から得られた生体試料を分析して前記ネコ対象のベタイン濃度を決定することであって、前記生体試料が尿であることと、
   ポジティブ対照試料を分析して、前記ポジティブ対照試料のベタイン濃度を決定することであって、前記ポジティブ対照試料のベタイン濃度値が１．１１であり、前記ポジティブ対照試料のベタイン濃度値がＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２のメジャーアレルＧの二つのコピーを有するネコ対象から決定されることと、
   前記ネコ対象のベタイン濃度を、前記ポジティブ対照試料のベタイン濃度と比較することであって、前記ネコ対象のベタイン濃度が前記ポジティブ対照試料のベタイン濃度以下であることは、前記ネコ対象が前記治療から利益を得るであろうことを示す、比較することと、を含む、方法。
6. シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうネコ対象を特定する方法であって、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる前記治療が、０．５％のベタイン、０．２５％の緑茶、０．０２５％のコロハ及び０．００１５％のトゥルシーを含む組成物を、前記ネコ対象に投与することを含み、前記方法は、
   前記ネコ対象から得られた生体試料を分析して前記ネコ対象の２－オキソアルギニン濃度を決定することであって、前記生体試料が血液または尿であることと、
   前記ネコ対象の２－オキソアルギニン濃度を、ポジティブ参照２－オキソアルギニン濃度値と比較することであって、前記ネコ対象の２－オキソアルギニン濃度が前記ポジティブ参照２－オキソアルギニン濃度値以上であることは、前記ネコ対象が治療から利益を得るであろうことを示す、比較することであるとともに、前記ポジティブ参照２－オキソアルギニン濃度が１．２６７であり、前記ポジティブ参照２－オキソアルギニン濃度値がＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２のメジャーアレルＧの二つのコピーを有するネコ対象から決定されることと、を含む、方法。
7. シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうネコ対象を特定する方法であって、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる前記治療が、０．５％のベタイン、０．２５％の緑茶、０．０２５％のコロハ及び０．００１５％のトゥルシーを含む、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる組成物を、前記ネコ対象に投与することを含み、前記方法は、
   前記ネコ対象から得られた生体試料を分析して前記ネコ対象の２－オキソアルギニン濃度を決定することであって、前記生体試料が血液または尿であることと、
   前記ネコ対象の２－オキソアルギニン濃度を、ポジティブ参照２－オキソアルギニン濃度値と比較することであって、前記ネコ対象の２－オキソアルギニン濃度が前記参照２－オキソアルギニン濃度値以上であることは、前記ネコ対象が前記治療から利益を得るであろうことを示す、比較することであるとともに、前記ポジティブ参照２－オキソアルギニン濃度値が１．２６７であり、前記ポジティブ参照２－オキソアルギニン濃度値がＳＮＰ Ａ１＿２１２８９１６９２のメジャーアレルＧの二つのコピーを有するネコ対象から決定されることと、を含む、方法。
8. ネコ対象におけるシュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる方法であって、
   ａ）請求項１～７のいずれか一項に記載の方法によって、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる治療から利益を得るであろうネコ対象を特定することと、
   ｂ）前記ネコ対象に、０．５％のベタイン、０．２５％の緑茶、０．０２５％のコロハ及び０．００１５％のトゥルシーを含む、シュウ酸カルシウム結石形成のリスクを減少させる組成物を与えることと、を含む、方法。
9. シュウ酸カルシウム結石のリスクを減少させる治療に応答するものとして特定されているネコ対象におけるシュウ酸カルシウム結石のリスクを減少させるためのペットフード組成物であって、前記ペットフード組成物が、
   ０．５％のベタイン；及び
   ０．２５％の緑茶、０．０２５％のコロハ及び０．００１５％のトゥルシーを含む、シュウ酸カルシウム結石のリスクを減少させる植物複合体を含み、
   前記植物複合体に対する前記ベタインの重量比が、約２：１～約１：１である、ペットフード組成物。