JP7436726B2

JP7436726B2 - 痒みの予防又は改善剤

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Publication number: JP7436726B2
Application number: JP2023063299A
Authority: JP
Inventors: 朋大松本; 将史横田; 准子石川; 光俊冨永; 建二 ▲高▼森
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2021-05-26
Filing date: 2023-04-10
Publication date: 2024-02-22
Anticipated expiration: 2042-05-25
Also published as: EP4353259A4; AU2022279806A1; US20240415807A1; US20240115546A1; EP4353259A1; JP2023098976A; JP2022183095A; CA3220770A1; WO2022250085A1; TW202312987A; JP7296506B2

Description

本発明は、痒みの予防又は改善剤、中でも特に難治性痒みの予防又は改善剤、難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤、並びにそれらを評価又は選択する方法に関する。

痒みはアトピー性皮膚炎などの皮膚疾患だけでなく、腎不全などの内臓疾患においてもみられる病態である。痒みは皮膚の乾燥、日焼け、皮膚と衣類との擦れなどによっても惹起される。痒みによる掻き動作は皮膚を物理的に侵害し、さらなる症状悪化を引き起こすことから、痒みの解決は皮膚疾患の予防又は改善に寄与する。例えば、後肢の爪を切って、掻破動作による皮膚の物理的損傷を抑制したマウスでは、アトピー性皮膚炎による皮膚症状が予防・改善されることが報告されている（非特許文献１）。

皮膚などの末梢組織における痒みの感覚は，末梢と脊髄後角をつなぐ求心性感覚神経により、脳に伝達される。求心性感覚神経の細胞体は後根神経節（ＤＲＧ）に存在していて、細胞体から末梢組織と脊髄後角へ神経線維を伸長している。求心性感覚神経は、皮膚における感覚を受容し、脊髄後角の二次ニューロンに伝達する役割を持つ。

痒みの起痒物質は対応する受容体との結合により痒みを惹起させる。起痒物質としては、ヒスタミン、セロトニン、クロロキンなど、痒み増強物質（感作物質）としてはＩＬ-４やＩＬ－１３などのＴｈ２サイトカインなどが報告されている。なかでも代表的な化学的起痒物質は主に肥満細胞から分泌されるヒスタミンである。最近では、ヒスタミンは基本的に一部の急性の痒みのみに関連し、多くの慢性的な痒みを伴う疾患におけるヒスタミンの関与は乏しいと考えられている（非特許文献２）。そのため、現在、抗ヒスタミン薬（Ｈ１受容体拮抗薬）が痒みを抑える薬として多用されているが、抗ヒスタミン薬で十分な治療効果が得られる痒みはごく限られており、多くの痒み病態は抗ヒスタミン薬により寛解困難な難治性痒みである。ここで言う抗ヒスタミン薬とは、ジフェンヒドラミンなどのＨ１受容体拮抗薬を指す。例えば、抗ヒスタミン薬によるアトピー性皮膚炎及び乾皮症の治療は効果不十分であることが報告されており（非特許文献３～４）、アトピー性皮膚炎、乾皮症などの多くの皮膚疾患、さらに腎不全などの内科疾患に伴う痒みは難治性痒みといわれている。難治性痒みの多くはメカニズムが解明されていなく、メカニズムの解明と新たな標的となる分子の開発が求められている。

Hashimoto Y et al. Life Sciences. 2004 Dec 31;76(7):783-94 Ikoma A et al. Nature Reviews Neuroscience. 2006 Jul;7(7):535-47 J Am Acad Dermatol. 2014 Jul; 71(1): 116-132 Future Oncol. 2018 Oct;14(24):2531-2541

本発明は、難治性痒みの新規標的分子を見出し、難治性痒みの解消へ向けた新たな手段を提供することに関する。

本発明者は、先ずアセトン・エーテル混合物及び水処理で乾皮症様の皮膚症状を示すモデルマウス（以下、ＡＥＷモデルマウス）より後根神経節（ＤＲＧ）を採取し、網羅的な遺伝子発現解析を実施したところ、発現変動を示す遺伝子としてＶｇｆを同定した。さらにＡＥＷモデルマウス及びアトピー性皮膚炎モデルマウス（以下、ＡＤモデルマウス）のＤＲＧにおけるＶｇｆ遺伝子の定量的発現解析を実施したところ、コントロールマウスと比較して両モデルマウスにおいて、ＤＲＧ組織のＶｇｆ発現は有意に増加していた。Ｖｇｆは神経分泌因子ＶＧＦｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｉｎｄｕｃｉｂｌｅ（以下、ＶＧＦ）をコードする遺伝子である。ＶＧＦは生体内のプロテアーゼなどで分解を受け、いくつかの生理活性ペプチドを生じることが知られている（Lewis JE et al. Front Endocrinol (Lausanne). 2015 Feb 2;6:3）。その一つであるＴＬＱＰ－２１を健常マウスの後頚部皮膚内に注射すると、マウスにおいて掻破行動が惹起され、ＴＬＱＰ－２１は痒みを誘発することを見出した。このＴＬＱＰ－２１皮内投与による掻破行動は、肥満細胞欠損マウスにおいてもみられ、ＴＬＱＰ－２１の痒みの誘発は肥満細胞非依存的な応答であることが示唆された。
ＴＬＱＰ－２１は細胞膜上に存在するＧＰＣＲ型受容体である補体因子Ｃ３ａ受容体に結合し、シグナルを惹起することが知られている（Cero C et al Structure. 2014 Dec 2;22(12):1744-1753）。ＡＤモデルマウス及びＡＥＷモデルマウスの作製過程において、並行してＣ３ａ受容体に拮抗する化合物をマウスに継続的に投与すると掻破行動が有意に減少することを確認し、これによりＣ３ａ受容体が難治性痒み抑制の標的になることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。

すなわち、本発明は、以下の１）～４）に係るものである。
１）Ｃ３ａ受容体拮抗剤を有効成分とする難治性痒みの予防又は改善剤。
２）Ｃ３ａ受容体拮抗剤を有効成分とする難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤。
３）下記の工程を含む、難治性痒みの予防又は改善剤の評価又は選択方法。
（１）被験物質のＣ３ａ受容体に対する拮抗作用を評価する工程、
（２）Ｃ３ａ受容体に対する拮抗作用を有する被験物質を難治性痒みの予防又は改善剤として評価又は選択する工程
４）下記の工程を含む、難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤の評価又は選択方法。
（１）被験物質のＣ３ａ受容体に対する拮抗作用を評価する工程、
（２）Ｃ３ａ受容体に対する拮抗作用を有する被験物質を難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤として評価又は選択する工程

本発明によれば、難治性痒みや難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善に用いることが可能な新たな薬剤が提供される。

ＡＥＷモデルＤＲＧ組織のＲＮＡ－ｓｅｑ解析結果を示す。ＡＥＷモデルにおけるＶｇｆ発現量のリアルタイムＰＣＲ解析結果を示す。ＡＤモデルにおけるＶｇｆ発現量のリアルタイムＰＣＲ解析結果を示す。ＴＬＱＰ－２１投与後のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの掻痒回数を示す。ＴＬＱＰ－２１投与後の肥満細胞欠損マウスの掻痒回数を示す。化合物１及び化合物２のＣ３ａ受容体拮抗作用を示す。Ｃ３ａ受容体拮抗剤投与によるＡＤモデルマウスにおける掻痒の改善効果を示す。Ｃ３ａ受容体拮抗剤投与によるＡＥＷモデルマウスにおける掻痒の改善効果を示す。

本発明の難治性痒みの予防又は改善剤、難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤の有効成分は、Ｃ３ａ受容体拮抗剤である。補体因子Ｃ３ａは、肥満細胞や好塩基球などに作用して様々な生体応答を引き起こすアナフィラトキシンである。Ｃ３ａ受容体は、補体系活性化に伴い産生されるＣ３ａの他、ＴＬＱＰ－２１も受容する。Ｃ３ａ受容体の阻害により、脳卒中による脳水腫、脳出血を抑制すること（PLoS One. 2017 Jul 10;12(7):e0180822）、ＩｇＧ誘導性の関節炎を軽減すること（J Pharmacol Sci. 2010;112(1):56-63）が報告されているが、難治性痒みに対する作用は全く知られていない。
本明細書において、「Ｃ３ａ受容体拮抗剤」は、競合的拮抗作用を有するものであってもよく、非競合的拮抗作用を有するものであってもよい。Ｃ３ａ受容体拮抗剤としては、低分子化合物、オリゴヌクレオチドやペプチドなどで構成されるアプタマー、中和抗体などの生物学的製剤などが含まれる。また、本明細書においては、Ｃ３ａ受容体の発現抑制剤であってもよい。

低分子化合物であるＣ３ａ受容体拮抗剤としては、例えば、下記一般式（１）で示される化合物又は下記一般式（２）で示される化合物が挙げられる。

一般式（１）で示される化合物の好ましい具体例としては、ＸがＯである下記の構造式で示されるＳＢ２９０１５７、ＸがＳである（２Ｓ）－５－(ジアミノメチリデンアミノ)－２－［［２－（２，２－ジフェニルエチルスルファニル)アセチル]アミノ]ペンタン酸（Reid RC. et al. Journal of Medicinal Chemistry. 2014 Oct 23;57(20):8459-70.）が挙げられる。
一方、一般式（２）で示される化合物の好ましい具体例としては、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴が全て水素原子である、下記の構造式で示される化合物１（Ｌ－アルギニン, Ｎ２－［［５－(ジフェニルメチル)－２－チエニル]カルボニル]）、又は、Ｒ¹が水素原子、Ｒ²がメチル基、Ｒ³が塩素原子、Ｒ⁴が水素原子である、下記の構造式で示される化合物２（Ｌ－アルギニン, Ｎ２－［［５－[ビス(４－クロロフェニル)メチル]－３－メチル－２－チエニル]カルボニル]）（Rowley, J. A. et al. Journal of Medicinal Chemistry, 2020;63(2):529-541）が挙げられる。

さらに本発明では、アミノ酸配列ＦＬＴＣｈａＡＲ（Ｃｈａ：シクロヘキシルアラニン）に代表される、一部の共通した配列を持つヘキサペプチドもＣ３ａ受容体拮抗剤として含まれる（Conor C G Scully. et al. Journal of Medicinal Chemistry. 2010 8;53(13):4938-48）。

上記の化合物は塩であっても、溶媒和物であっても無溶媒和物であってもよく、いずれも包含される。
これらは既知化合物であり、既報（例えば、Rowley, J. A. et al. Journal of Medicinal Chemistry, 2020;63(2):529-541）に基づき化学合成することにより取得することができる。また、商業的に入手したものを用いてもよい。

Ｃ３ａ受容体発現抑制剤としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムなどが含まれる。これら発現抑制剤は、ホスホロチオエート修飾体等の修飾体や誘導体を使用することができる。これら発現抑制剤はＣ３ａ受容体をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することで、転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進することで、タンパク質の発現を抑制する。

後記実施例に示すように、ＶＧＦの分解により生じるＴＬＱＰ－２１を健常マウスの後頚部皮膚内に注射すると、マウスにおいて掻破行動が惹起された（図４）。この結果から、ＴＬＱＰ－２１は痒みを誘発することが明らかになった。ＴＬＱＰ－２１皮内投与による掻破行動は、肥満細胞欠損マウスにおいてもみられたことから（図５）、ＴＬＱＰ－２１の痒みの誘発は肥満細胞非依存的な応答であることが示唆された。
前述したとおり、ＴＬＱＰ－２１はＣ３ａ受容体に結合し、シグナルを惹起することが知られている。そして、Ｃ３ａの受容体に拮抗することが公知の化合物で、Ｃ３ａ受容体拮抗作用が確認された（図６）化合物１又は化合物２を、ＡＤモデルマウス及びＡＥＷモデルマウスの作製過程においてマウスに継続的に投与したところ、化合物１又は化合物２を投与したモデルマウスでは掻破行動の有意な減少が認められた（図７及び図８）。この掻破行動の減少は、痒みの鎮静を表わす。このことから、Ｃ３ａ受容体は難治性痒み抑制の標的となることが明らかになった。従って、Ｃ３ａ受容体拮抗剤は、難治性痒みを抑制する作用を有し、Ｃ３ａ受容体拮抗剤は、難治性痒みの予防又は改善剤、難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤（以下、「難治性痒みの予防又は改善剤など」とも称す）となり得、またこれらを製造するために使用することができる。また、Ｃ３ａ受容体拮抗剤は、ヒトを含む動物に適用して、難治性痒みの予防又は改善のために、難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患を予防又は改善するために使用することができる。さらに、Ｃ３ａ受容体拮抗作用を指標として難治性痒みの予防又は改善剤、難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤の探索が可能である。
同様に、Ｃ３ａ受容体は肥満細胞が関与しない痒み抑制の標的となることが明らかになった。従って、Ｃ３ａ受容体拮抗剤は、肥満細胞が関与しない痒みを抑制する作用を有し、Ｃ３ａ受容体拮抗剤は、肥満細胞が関与しない痒みの予防又は改善剤、肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤（以下、「肥満細胞が関与しない痒みの予防又は改善剤など」とも称す）となり得、またこれらを製造するために使用することができる。また、Ｃ３ａ受容体拮抗剤は、ヒトを含む動物に適用して、肥満細胞が関与しない痒みの予防又は改善のために、肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患を予防又は改善するために使用することができる。さらに、Ｃ３ａ受容体拮抗作用を指標として肥満細胞が関与しない痒みの予防又は改善剤、肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤の探索が可能である。
ここで「使用」は、ヒト又は非ヒト動物における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。

本明細書において、「痒み」は、主観的な感覚であり、その原因は特に限定されない。
痒みの部位は、例えば、全身、頭皮、顔、背中、腕、手の甲、指、脚などの広い範囲又は特定の部位が挙げられる。
本発明においては、難治性痒みの予防又は改善に適する。
「難治性痒み」とは、抗ヒスタミン薬（Ｈ１受容体拮抗薬）で寛解困難、あるいは痒みが解決されない痒みを意味する。難治性痒みとしては、例えば、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、皮脂欠乏性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、貨幣状湿疹、皮膚そう痒症、乾皮症、乾癬、結節性痒疹、慢性痒疹などの皮膚疾患に伴う痒み、類天疱瘡や皮膚筋炎などの自己免疫疾患に伴う痒み、あるいは腎不全、肝疾患、糖尿病、その他内科、内分泌疾患に伴う痒み、悪性リンパ腫や新生物に伴う痒み、神経障害に伴う痒みなどが挙げられる。

「掻痒性皮膚疾患」とは、痒みを伴う皮膚疾患を意味する。例えば、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、皮脂欠乏性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、貨幣状湿疹、皮膚そう痒症、乾皮症、乾癬、結節性痒疹、慢性痒疹、類天疱瘡、皮膚筋炎などが挙げられる。これらのうち、蕁麻疹を除く皮膚疾患は、難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患である。本発明においては、難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患に適する。

「予防」とは、個体における症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の症状の発症の危険性を低下させることをいう。
また、「改善」とは、症状又は状態の好転、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。

本発明の難治性痒みの予防又は改善剤など、及び肥満細胞が関与しない痒みの予防又は改善剤などは、それ自体、難治性痒みを予防又は改善するため、難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患を予防又は改善するため、肥満細胞が関与しない痒みを予防又は改善するため、肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患を予防又は改善するための医薬品、医薬部外品、化粧品であってもよく、或いは当該医薬品、医薬部外品、化粧品に配合して使用される素材又は有効成分であってもよい。

当該医薬品（医薬部外品を含む、以下同じ）は、Ｃ３ａ受容体拮抗剤を、難治性痒みを予防又は改善するため、難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患を予防又は改善するため、肥満細胞が関与しない痒みを予防又は改善するため、肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患を予防又は改善するための有効成分として含有する。さらに、該医薬品は、該有効成分の機能が失われない限りにおいて、必要に応じて薬学的に許容される担体、又は他の有効成分、薬効成分などを含有していてもよい。
Ｃ３ａ受容体拮抗剤を含む医薬品の投与形態は任意であり、経口投与又は非経口投与が挙げられる。経口投与の剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などが挙げられる。非経口投与のための剤形としては、皮膚外用、経皮、経粘膜、経鼻、経腸、注射、坐剤、吸入、貼付などの各製剤が挙げられる。非経口投与の場合、好適な製剤形態は皮膚外用剤であり、具体的には、軟膏、乳化液、クリーム、乳液、ローション、ジェル、エアゾールなどの形態が挙げられる。

当該化粧品は、Ｃ３ａ受容体拮抗剤を、難治性痒みを予防又は改善するため、難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患を予防又は改善するため、肥満細胞が関与しない痒みを予防又は改善するため、肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患を予防又は改善するための有効成分として含有する。さらに、該化粧品は、該有効成分の機能が失われない限りにおいて、必要に応じて化粧料に許容される担体、又は他の有効成分、化粧成分などを含有していてもよい。
Ｃ３ａ受容体拮抗剤を含む化粧品の好ましい例としては、顔、ボディ用の化粧料（例えば、ローション、ゲル、クリーム、パックなど）、メークアップ用化粧料、顔又はボディ用の洗浄料などが挙げられる。

斯かる医薬品や化粧品の各製剤は、Ｃ３ａ受容体拮抗剤を、必要に応じて薬学的に又は化粧料に許容される担体、上述した他の有効成分、薬効成分、化粧成分などと組み合わせて、常法に従って製造することができる。
当該薬学的に又は化粧料に許容される担体としては、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、緩衝剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、分散剤、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、ｐＨ調整剤、色素、香料などが挙げられる。
当該他の有効成分、薬効成分、化粧成分としては、例えば、植物抽出物、殺菌剤、保湿剤、抗炎症剤、抗菌剤、角質溶解剤、清涼剤、抗脂漏剤、洗浄剤、メークアップ成分などが挙げられる。

上記の医薬品や化粧品の製剤中のＣ３ａ受容体拮抗剤の含有量は、Ｃ３ａ受容体拮抗剤の種類や製剤の形態に応じて異なるため一概には言えないが、例えば製剤の総量を基準として、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．００５質量％以上であり、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０５質量％以下である。また、０．００１～０．１質量％が好ましく、０．００５～０．０５質量％がより好ましい。

Ｃ３ａ受容体拮抗剤の投与量又は使用量は、本発明の効果を達成できる量であり得る。当該投与量又は使用量は、Ｃ３ａ受容体拮抗剤の種類、対象の種、体重、性別、年齢、状態、又はその他の要因に従って変動し得るが、皮膚外用剤などの非経口の場合には、成人（６０ｋｇ）１人当たり１回、好ましくは０．１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上であり、好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは１００ｍｇ以下である。また、０．１ｍｇ～１０００ｍｇが好ましく、１ｍｇ～１００ｍｇがより好ましい。本発明では斯かる量を１日に１回～複数回に分けて、１日間以上、好ましくは７日間以上、より好ましくは１４日間以上、よりさらに好ましくは４２日間以上、反復・継続して投与又は使用し得る。

本発明の難治性痒みの予防又は改善剤など、及び肥満細胞が関与しない痒みの予防又は改善剤などを投与又は使用する対象としては、難治性痒みの予防又は改善、難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善、肥満細胞が関与しない痒みの予防又は改善、肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善を必要とする又は所望するヒトや非ヒト動物が挙げられる。具体的には、難治性痒みを有する又は難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患を患っているヒトや、肥満細胞が関与しない痒みを有する又は肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患を患っているヒト、非ヒト動物が挙げられる。非ヒト動物としては、類人猿、その他霊長類、ネコ目動物などの非ヒト哺乳動物などが挙げられる。
また、本発明の難治性痒みの予防又は改善剤など、及び肥満細胞が関与しない痒みの予防又は改善剤などを投与又は使用する部位としては、痒みを感じる部位であれば特に限定されない。

本発明の難治性痒みの予防又は改善剤の評価又は選択方法は、（１）被験物質のＣ３ａ受容体に対する拮抗作用を評価する工程と、（２）Ｃ３ａ受容体に対する拮抗作用を有する被験物質を難治性痒みの予防又は改善剤として評価又は選択する工程、を含むものである。
また、難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤の評価又は選択方法は、（１）被験物質のＣ３ａ受容体に対する拮抗作用を評価する工程と、（２）Ｃ３ａ受容体に対する拮抗作用を有する被験物質を難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤として評価又は選択する工程、を含むものである。
また、肥満細胞が関与しない痒みの予防又は改善剤の評価又は選択方法は、（１）被験物質のＣ３ａ受容体に対する拮抗作用を評価する工程と、（２）Ｃ３ａ受容体に対する拮抗作用を有する被験物質を肥満細胞が関与しない痒みの予防又は改善剤として評価又は選択する工程、を含むものである。
さらに、肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤の評価又は選択方法は、（１）被験物質のＣ３ａ受容体に対する拮抗作用を評価する工程と、（２）Ｃ３ａ受容体に対する拮抗作用を有する被験物質を肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤として評価又は選択する工程、を含むものである。
被験物質のＣ３ａ受容体に対する拮抗作用を評価する方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。

Ｃ３ａ受容体を有する細胞に被験物質を接触させる。その後、前記細胞において、Ｃ３ａ受容体作動薬を投与して、該作動薬がＣ３ａ受容体に結合することによって発現する活性を測定することにより評価できる。
Ｃ３ａ受容体を有する細胞としては、肥満細胞等の白血球細胞、表皮細胞等の上皮細胞などが挙げられる。細胞は、天然の細胞、遺伝的に操作された組換え細胞又はそれらの培養物であってもよい。
Ｃ３ａ受容体を有する細胞への被験物質の接触は、培養培地又は緩衝液中で行われるが、公知のものを使用すればよい。
Ｃ３ａ受容体作動薬としては、公知のものを使用すれば良く、例えば、ＴＬＱＰ－２１、Ｃ３ａ、α－シクロヘキシル－Ｎ－［１－［１－オキソ－３－（３－ピリジニル)プロピル］－４－ピペリジニル］－ベンゼンアセトアミドが挙げられる。
Ｃ３ａ受容体作動薬がＣ３ａ受容体に結合することによって発現する活性の測定は、当該分野で知られている任意の方法を用いることができ、例えば、カルシウムイメージング法、ｃＡＭＰａｓｓａｙ、ＴＧＦα Ｓｈｅｄｄｉｎｇａｓｓａｙなどが挙げられ、該活性を抑制する被験物質をＣ３ａ受容体に対する拮抗作用を有すると評価することができる。

被験物質のＣ３ａ受容体に対する拮抗作用の評価は、例えば下記方法により実施することができる。
例えば、より高濃度の被験物質添加群とより低濃度の被験物質添加群との間；被験物質添加群とプラセボ添加群との間；又は被験物質添加前後で、Ｃ３ａ受容体の活性化に伴うイオン流入や細胞内シグナル伝達などを指標にＣ３ａ受容体に対する拮抗作用を比較する。
被験物質のＣ３ａ受容体に対する拮抗作用は、そのＩＣ５０値（Ｃ３ａ受容体活性を５０％阻害する被験物質濃度）により表すことができ、当該技術分野で認められているように、ＩＣ５０値が低いほど阻害活性が高いことを示す。被験物質におけるＩＣ５０値は、１．０μＭ以下が好ましく、０．１μＭ以下がより好ましく、０．０１μＭ未満がよりさらに好ましい。
Ｃ３ａ受容体に対する拮抗作用が認められる場合、当該被験物質を、難治性痒みや難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤として、肥満細胞が関与しない痒みや肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤として、評価又は選択することができる。

被験物質としては、特に制限されず、天然に存在する物質であっても、化学的又は生物学的方法などで人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。

Ｃ３ａ受容体に対する拮抗作用を指標に難治性痒みや難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤として、肥満細胞が関与しない痒みや肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤として評価又は選択された被験物質は、必要に応じて難治性痒みの予防・改善効果又は難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患に対する予防・改善効果、或いは肥満細胞が関与しない痒みの予防・改善効果又は肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患に対する予防・改善効果を評価しても良い。
ヒトにおいては主観的な評価方法（visual analogue scale (VAS), numerical rating scale (NRS), verbal rating scale (VRS), 5D itch scale (5D)、白取のかゆみの重症度基準など）や客観的な評価方法（ビデオや音声記録、センサーによる解析、腕時計型デバイス等の各種ウェアラブルデバイスによる解析など）が難治性痒みの予防・改善効果又は難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患に対する予防・改善効果、或いは肥満細胞が関与しない痒みの予防・改善効果又は肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患に対する予防・改善効果の評価に有用である。

具体的には、例えば、痒みを誘発する物質（Ｃ３ａ受容体作動薬を含む各種痒み誘発物質）と被験物質を投与した非ヒト動物の掻破行動を測定することにより評価することができる。また、難治性痒み病態を発現する疾患モデル動物（各種アレルギーモデル、先天的・後天的皮膚炎誘発モデルなど）に対し、被験物質を投与した際の掻破行動を測定することによっても評価できる。
非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サルなどが挙げられる。非ヒト動物への被験物質の投与形態は経口投与又は非経口投与のいずれでもよいが、好ましくは皮内投与、皮下投与、塗布、腹腔内投与、静脈内投与である。
非ヒト動物の掻破行動の観察は、目視による方法、ビデオ撮影などの動画解析や、MicroAct、SCLABA-Realなどの測定機器を用いた方法により行うことができる。
または、難治性痒みを有する又は難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患を有するヒトや、肥満細胞が関与しない痒みを有する又は肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患を有するヒトを被験者とし、被験物質を投与することによって、難治性痒み、難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患に対する予防・改善効果、或いは肥満細胞が関与しない痒み、肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患に対する予防・改善効果を評価することもできる。

上述した実施形態に関し、本発明は以下の態様をさらに開示する。

＜１＞Ｃ３ａ受容体拮抗剤を有効成分とする難治性痒みの予防又は改善剤。

＜２＞Ｃ３ａ受容体拮抗剤を有効成分とする難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤。

＜３＞難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患が、好ましくはアトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、皮脂欠乏性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、貨幣状湿疹、皮膚そう痒症、乾皮症、乾癬、結節性痒疹、慢性痒疹、類天疱瘡又は皮膚筋炎であり、より好ましくはアトピー性皮膚炎又は乾皮症である＜２＞記載の剤。

＜４＞Ｃ３ａ受容体拮抗剤を有効成分とする肥満細胞が関与しない痒みの予防又は改善剤。

＜５＞Ｃ３ａ受容体拮抗剤を有効成分とする肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤。

＜６＞Ｃ３ａ受容体拮抗剤が、好ましくは下記一般式（１）で示される化合物、

下記一般式（２）で示される化合物、

又は配列ＦＬＴＣｈａＡＲ（Ｃｈａ: シクロヘキシルアラニン）からなるヘキサペプチドであり、より好ましくはＳＢ２９０１５７、Ｌ－アルギニン, Ｎ２－［［５－（ジフェニルメチル）－２－チエニル]カルボニル]、Ｌ－アルギニン, Ｎ２－［［５－［ビス（４－クロロフェニル)メチル］－３－メチル－２－チエニル]カルボニル]、（２Ｓ）－５－（ジアミノメチリデンアミノ)－２－［［２－（２，２－ジフェニルエチルスルファニル)アセチル]アミノ]ペンタン酸又は配列ＦＬＴＣｈａＡＲ（Ｃｈａ: シクロヘキシルアラニン）からなるヘキサペプチドであり、さらに好ましくはＬ－アルギニン, Ｎ２－［［５－（ジフェニルメチル）－２－チエニル]カルボニル]又はＬ－アルギニン, Ｎ２－［［５－［ビス（４－クロロフェニル)メチル］－３－メチル－２－チエニル]カルボニル]である＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の剤。
＜７＞製剤の有効成分として配合されたものである＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の剤。
＜８＞製剤中のＣ３ａ受容体拮抗剤の含有量が、製剤の総量を基準として、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．００５質量％以上であり、また、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０５質量％以下であり、また、好ましくは０．００１～０．１質量％、より好ましくは０．００５～０．０５質量％である＜１＞～＜７＞のいずれかに記載の剤。
＜９＞製剤が医薬品製剤である＜７＞又は＜８＞に記載の剤。
＜１０＞Ｃ３ａ受容体拮抗剤の投与量又は使用量が、非経口の場合、成人（６０ｋｇ）１人当たり１回に、好ましくは０．１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上であり、また、好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは１００ｍｇ以下であり、また、好ましくは０．１ｍｇ～１０００ｍｇ、より好ましくは１ｍｇ～１００ｍｇである＜１＞～＜９＞のいずれかに記載の剤。

＜１１＞難治性痒みの予防又は改善剤を製造するためのＣ３ａ受容体拮抗剤の使用。
＜１２＞難治性痒みの予防又は改善に使用するためのＣ３ａ受容体拮抗剤。
＜１３＞難治性痒みを予防又は改善するためのＣ３ａ受容体拮抗剤の非治療的使用。
＜１４＞肥満細胞が関与しない痒みの予防又は改善剤を製造するためのＣ３ａ受容体拮抗剤の使用。
＜１５＞肥満細胞が関与しない痒みの予防又は改善に使用するためのＣ３ａ受容体拮抗剤。
＜１６＞肥満細胞が関与しない痒みを予防又は改善するためのＣ３ａ受容体拮抗剤の非治療的使用。

＜１７＞難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤を製造するためのＣ３ａ受容体拮抗剤の使用。
＜１８＞難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善に使用するためのＣ３ａ受容体拮抗剤。
＜１９＞難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患を予防又は改善するためのＣ３ａ受容体拮抗剤の非治療的使用。
＜２０＞難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患が、好ましくはアトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、皮脂欠乏性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、貨幣状湿疹、皮膚そう痒症、乾皮症、乾癬、結節性痒疹、慢性痒疹、類天疱瘡又は皮膚筋炎であり、より好ましくはアトピー性皮膚炎又は乾皮症である＜１７＞～＜１９＞記載のＣ３ａ受容体拮抗剤又は使用。
＜２１＞肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤を製造するためのＣ３ａ受容体拮抗剤の使用。
＜２２＞肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善に使用するためのＣ３ａ受容体拮抗剤。
＜２３＞肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患を予防又は改善するためのＣ３ａ受容体拮抗剤の非治療的使用。

＜２４＞Ｃ３ａ受容体拮抗剤が、好ましくは下記一般式（１）で示される化合物、

下記一般式（２）で示される化合物、

又は配列ＦＬＴＣｈａＡＲ（Ｃｈａ: シクロヘキシルアラニン）からなるヘキサペプチドであり、より好ましくはＳＢ２９０１５７、Ｌ－アルギニン, Ｎ２－［［５－（ジフェニルメチル）－２－チエニル]カルボニル]、Ｌ－アルギニン, Ｎ２－［［５－［ビス（４－クロロフェニル)メチル］－３－メチル－２－チエニル]カルボニル]、（２Ｓ）－５－（ジアミノメチリデンアミノ)－２－［［２－（２，２－ジフェニルエチルスルファニル)アセチル]アミノ]ペンタン酸又は配列ＦＬＴＣｈａＡＲ（Ｃｈａ: シクロヘキシルアラニン）からなるヘキサペプチドであり、さらに好ましくはＬ－アルギニン, Ｎ２－［［５－（ジフェニルメチル）－２－チエニル]カルボニル]又はＬ－アルギニン, Ｎ２－［［５－［ビス（４－クロロフェニル)メチル］－３－メチル－２－チエニル]カルボニル]である＜１１＞～＜２３＞のいずれかに記載のＣ３ａ受容体拮抗剤又は使用。

＜２５＞Ｃ３ａ受容体拮抗剤を対象に投与又は適用する、難治性痒みの予防又は改善方法。
＜２６＞Ｃ３ａ受容体拮抗剤を対象に投与又は適用する、難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善方法。
＜２７＞難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患が、好ましくはアトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、皮脂欠乏性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、貨幣状湿疹、皮膚そう痒症、乾皮症、乾癬、結節性痒疹、慢性痒疹、類天疱瘡又は皮膚筋炎であり、より好ましくはアトピー性皮膚炎又は乾皮症である＜２６＞記載の方法。
＜２８＞Ｃ３ａ受容体拮抗剤を対象に投与又は適用する、肥満細胞が関与しない痒みの予防又は改善方法。
＜２９＞Ｃ３ａ受容体拮抗剤を対象に投与又は適用する、肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善方法。

＜３０＞Ｃ３ａ受容体拮抗剤が、好ましくは下記一般式（１）で示される化合物、

下記一般式（２）で示される化合物、

又は配列ＦＬＴＣｈａＡＲ（Ｃｈａ: シクロヘキシルアラニン）からなるヘキサペプチドであり、より好ましくはＳＢ２９０１５７、Ｌ－アルギニン, Ｎ２－［［５－（ジフェニルメチル）－２－チエニル]カルボニル]、Ｌ－アルギニン, Ｎ２－［［５－［ビス（４－クロロフェニル)メチル］－３－メチル－２－チエニル]カルボニル]、（２Ｓ）－５－（ジアミノメチリデンアミノ)－２－［［２－（２，２－ジフェニルエチルスルファニル)アセチル]アミノ]ペンタン酸又は配列ＦＬＴＣｈａＡＲ（Ｃｈａ: シクロヘキシルアラニン）からなるヘキサペプチドであり、さらに好ましくはＬ－アルギニン, Ｎ２－［［５－（ジフェニルメチル）－２－チエニル]カルボニル]又はＬ－アルギニン, Ｎ２－［［５－［ビス（４－クロロフェニル)メチル］－３－メチル－２－チエニル]カルボニル]である＜２５＞～＜２９＞のいずれかに記載の方法。
＜３１＞Ｃ３ａ受容体拮抗剤の投与量又は適用量が、非経口の場合、成人（６０ｋｇ）１人当たり１回に、好ましくは０．１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上であり、また、好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは１００ｍｇ以下であり、また、好ましくは０．１ｍｇ～１０００ｍｇ、より好ましくは１ｍｇ～１００ｍｇである＜２５＞～＜３０＞のいずれかに記載の方法。

＜３２＞下記の工程を含む、難治性痒みの予防又は改善剤の評価又は選択方法。
（１）被験物質のＣ３ａ受容体に対する拮抗作用を評価する工程、
（２）Ｃ３ａ受容体に対する拮抗作用を有する被験物質を難治性痒みの予防又は改善剤として評価又は選択する工程

＜３３＞下記の工程を含む、難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤の評価又は選択方法。
（１）被験物質のＣ３ａ受容体に対する拮抗作用を評価する工程、
（２）Ｃ３ａ受容体に対する拮抗作用を有する被験物質を難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤として評価又は選択する工程

＜３４＞前記（１）の工程が、好ましくはＣ３ａ受容体を有する細胞に被験物質を接触させた後、前記細胞において、Ｃ３ａ受容体作動薬を投与して、該作動薬がＣ３ａ受容体に結合することによって発現する活性を測定する工程を含む＜３２＞又は＜３３＞記載の方法。
＜３５＞Ｃ３ａ受容体を有する細胞が、好ましくは白血球細胞又は上皮細胞であり、より好ましくは肥満細胞又は表皮細胞である＜３４＞記載の方法。
＜３６＞Ｃ３ａ受容体作動薬が、好ましくはＴＬＱＰ－２１、Ｃ３ａ又はα－シクロヘキシル－Ｎ－［１－［１－オキソ－３－（３－ピリジニル)プロピル］－４－ピペリジニル］－ベンゼンアセトアミドである＜３４＞又は＜３５＞記載の方法。
＜３７＞Ｃ３ａ受容体作動薬がＣ３ａ受容体に結合することによって発現する活性の測定が、好ましくはカルシウムイメージング法、ｃＡＭＰａｓｓａｙ又はＴＧＦα Ｓｈｅｄｄｉｎｇａｓｓａｙによって行われる＜３４＞～＜３６＞のいずれかに記載の方法。
＜３８＞前記（２）の工程の後、さらに、Ｃ３ａ受容体作動薬と被験物質を投与した非ヒト動物の掻破行動を測定することによって難治性痒みの予防又は改善効果、あるいは難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患に対する予防又は改善効果を評価する工程を含む、＜３２＞～＜３７＞のいずれかに記載の方法。
＜３９＞前記（２）の工程の後、さらに、難治性痒み又は難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患を有するヒト被験者に被験物質を投与することによって難治性痒みの予防又は改善効果、あるいは難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患に対する予防又は改善効果を評価する工程を含む、＜３２＞～＜３８＞のいずれかに記載の方法。

＜４０＞下記の工程を含む、肥満細胞が関与しない痒みの予防又は改善剤の評価又は選択方法。
（１）被験物質のＣ３ａ受容体に対する拮抗作用を評価する工程、
（２）Ｃ３ａ受容体に対する拮抗作用を有する被験物質を肥満細胞が関与しない痒みの予防又は改善剤として評価又は選択する工程

＜４１＞下記の工程を含む、肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤の評価又は選択方法。
（１）被験物質のＣ３ａ受容体に対する拮抗作用を評価する工程、
（２）Ｃ３ａ受容体に対する拮抗作用を有する被験物質を肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤として評価又は選択する工程

＜４２＞前記（１）の工程が、好ましくはＣ３ａ受容体を有する細胞に被験物質を接触させた後、前記細胞において、Ｃ３ａ受容体作動薬を投与して、該作動薬がＣ３ａ受容体に結合することによって発現する活性を測定する工程を含む＜４０＞又は＜４１＞記載の方法。
＜４３＞Ｃ３ａ受容体を有する細胞が、好ましくは白血球細胞又は上皮細胞であり、より好ましくは肥満細胞又は表皮細胞である＜４２＞記載の方法。
＜４４＞Ｃ３ａ受容体作動薬が、好ましくはＴＬＱＰ－２１、Ｃ３ａ又はα－シクロヘキシル－Ｎ－［１－［１－オキソ－３－（３－ピリジニル)プロピル］－４－ピペリジニル］－ベンゼンアセトアミドである＜４２＞又は＜４３＞記載の方法。
＜４５＞Ｃ３ａ受容体作動薬がＣ３ａ受容体に結合することによって発現する活性の測定が、好ましくはカルシウムイメージング法、ｃＡＭＰａｓｓａｙ又はＴＧＦα Ｓｈｅｄｄｉｎｇａｓｓａｙによって行われる＜４２＞～＜４４＞のいずれかに記載の方法。＜４６＞前記（２）の工程の後、さらに、Ｃ３ａ受容体作動薬と被験物質を投与した非ヒト動物の掻破行動を測定することによって肥満細胞が関与しない痒みの予防又は改善効果、あるいは肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患に対する予防又は改善効果を評価する工程を含む、＜４０＞～＜４５＞のいずれかに記載の方法。
＜４７＞前記（２）の工程の後、さらに、肥満細胞が関与しない痒み又は肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患を有するヒト被験者に被験物質を投与することによって肥満細胞が関与しない痒みの予防又は改善効果、あるいは肥満細胞が関与しない痒みを呈する掻痒性皮膚疾患に対する予防又は改善効果を評価する工程を含む、＜４０＞～＜４６＞のいずれかに記載の方法。

実施例１網羅的遺伝子発現解析
１．実験動物
動物は雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及び雄性ＮＣ／Ｎｇａマウスを使用した。
乾皮症モデル（ＡＥＷモデル）：毛刈りしたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス皮膚にアセトン及びジエチルエーテルの１：１（ｖ／ｖ）混合液を浸み込ませた脱脂綿を当て、１５秒間静置した。その後直ちに水を浸み込ませた脱脂綿を３０秒間当てた。この処置を２回／日（朝・夕）で７日間繰り返し実施することでＡＥＷモデルマウスを作製した。対照として、水を浸み込ませた脱脂綿のみを３０秒当てたコントロールマウスを作製した。各群ｎ＝７を本解析に使用した。

アトピー性皮膚炎モデル（ＡＤモデル）：ＮＣ／Ｎｇａマウスにハツカネズミケモチダニ（M. musculi）を寄生させ、自然発症的に皮膚炎を生じさせることでＡＤモデルとした。
コントロールマウスとして、ダニ寄生のないＳＰＦで飼育された同系統のマウスを使用した。各群ｎ＝８を本解析に使用した。

２．ｔｏｔａｌＲＮＡの精製
マウス頸椎より後根神経節を摘出した。摘出した組織はポリトロンホモジナイザーによりホモジナイズし、ＱＩＡＧＥＮ社のＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔを用いてｔｏｔａｌＲＮＡを精製した。

３．遺伝子発現解析
ＲＮＡ－ｓｅｑ：ＡＥＷモデルマウス及びそのコントロールマウスから精製したｔｏｔａｌＲＮＡを用いた。逆転写にはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＶＩＬＯ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用し、以降の処理は、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑ標準プロトコルに則った。シーケンスはＩｏｎＳ５ｓｙｓｔｅｍを使用した。結果を図１に示す。図１に示すように、ＡＥＷモデルにおいて、一定シーケンス量当たりのＶｇｆ発現は、コントロールマウスと比較してＳｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ－ｔｅｓｔによりｐ＜０．０５で、有意に増加していた。

リアルタイムＰＣＲ：ＡＥＷモデルマウス、ＡＤモデルマウス及びそれらのコントロールマウスから精製したｔｏｔａｌＲＮＡを用い、Ｖｇｆを目的遺伝子として特異的なＴａｑＭａｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｓｓａｙｓを用いたＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍによりＶｇｆ遺伝子の定量的ＰＣＲ解析を行った。内部標準として、Ｒｐｌｐ０を使用した。図２及び図３に、コントロールマウスのＶｇｆ遺伝子発現量を１としたＶｇｆ遺伝子の相対的発現量を示す。

図２に示すように、ＡＥＷモデルマウスにおいてＤＲＧ組織のＶｇｆ発現量は、コントロールマウスと比較して有意に増加していた。また、図３に示すように、ＡＤモデルマウスにおいてもＤＲＧ組織のＶｇｆ発現量は、コントロールマウスと比較して有意に増加していた。

実施例２ＴＬＱＰ－２１による掻痒発現
１．実験動物
マウスは雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを使用した。

２．メディエーター候補分子の投与
マウスＴＬＱＰ－２１（ＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、配列：ＴＬＱＰＰＡＳＳＲＲＲＨＦＨＨＡＬＰＰＡＲ、以下同じ）は１５ｎｍｏｌ/２０μＬ、３０ｎｍｏｌ/２０μＬとなるように調製した。溶媒は生理食塩水とした。これを毛刈りしたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの後頚部皮内に２０μＬ投与した。注射後のマウスは直ちに掻破行動測定を開始し、開始後３０分間の測定値を解析した。

３．掻破行動の測定
ＴＬＱＰ－２１投与後の掻破行動の測定にはＭｉｃｒｏＡｃｔ（ニューロサイエンス）を使用した。結果を図４に示す。連続した一回の掻き動作の合計値をＥｖｅｎｔｓと表記し、その中の掻き動作回数の合計値をＢｅａｔｓとして表記した。

図４に示すように、ＴＬＱＰ－２１投与後にマウスの掻破行動の増加が、ＥｖｅｎｔｓとＢｅａｔｓの有意な増加として観察された。掻破行動の発現は３０分以内の即時的反応であった。

実施例３肥満細胞欠損マウスにおけるＴＬＱＰ－２１依存的掻痒発現
１．実験動物
マウスは肥満細胞欠損マウスとしてＷＢＢ６Ｆ１／Ｋｉｔ－Ｋｉｔ ^W／Ｋｉｔ ^W-v系統、野生型対照マウスとしてＷＢＢ６Ｆ１＋／＋系統を使用した。いずれも雄性マウスを使用した。

２．メディエーター分子の投与
マウスＴＬＱＰ－２１（ＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は２０ｎｍｏｌ／２０μＬとなるように調製した。溶媒は生理食塩水とした。これを毛刈りしたＷＢＢ６Ｆ１／Ｋｉｔ－Ｋｉｔ ^W／Ｋｉｔ ^W-v系統及びＷＢＢ６Ｆ１＋／＋系統の後頚部皮内に２０μＬ投与した。注射後のマウスは直ちに掻破行動測定を開始し、開始後３０分間の測定値を解析した。

３．掻破行動の測定
ＴＬＱＰ－２１投与後の掻破行動の測定にはＭｉｃｒｏＡｃｔ（ニューロサイエンス）を使用した。結果を図５に示す。連続した一回の掻き動作の合計値をＥｖｅｎｔｓと表記した。

図５に示すように、肥満細胞欠損マウス、野生型対照マウスのいずれの系統においてもＴＬＱＰ－２１投与によるマウスの掻破行動の増加が観察された。

実施例４Ｃ３ａ受容体拮抗作用の評価
１．評価サンプル
Ｃ３ａ受容体拮抗剤（アンタゴニスト）として、既報（Rowley, J. A. et al. Journal of Medicinal Chemistry, 2020;63(2):529-541）に基づいて合成した、前記の化合物１又は化合物２を使用した。下記の評価に際して、化合物１及び化合物２はＤＭＳＯで溶解し、適宜ＨＢＳＳで希釈した。

２．Ｃ３ａ受容体応答評価用細胞
以下に従って評価に必要な発現ベクターを導入した、ヒト胎児腎細胞２９３（ＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＫｉｄｎｅｙｃｅｌｌｓ２９３：ＨＥＫ２９３）を使用した。
無血清ＤＭＥＭ培地に対し、Ｃ３ａ受容体発現ベクター、ＧＮＡ１６発現ベクター、ＰＥＩ－ＭＡＸ（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅ社）溶液を順次添加して良く混和させた後に室温で２０分間放置し、トランスフェクション溶液を調製した。
６ウェル細胞培養プレートに播種したＨＥＫ２９３に、調製したトランスフェクション溶液を添加し、１８時間以上培養してＨＥＫ２９３に発現ベクターを導入した。培養後、培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄し、０，０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ社）で細胞を剥離し、以下のＣａ²⁺－ｆｌｕｘａｓｓａｙに供した。

３．Ｃａ²⁺－ｆｌｕｘａｓｓａｙ
Ｐｏｌｙ－Ｌ－ＯｒｎｉｔｈｉｎｅＳｏｌｕｔｉｏｎ（富士フィルム和光純薬社）でプレコーティングした９６－ｗｅｌｌＢｌａｃｋＰｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に、前記のＣ３ａ受容体応答評価用細胞を播種した。Ｃ３ａ受容体刺激時の細胞内Ｃａ²⁺濃度の測定は、ＣａｌｃｉｕｍＫｉｔ－Ｆｌｕｏ４（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を用いた。キットのマニュアルに従って調製したＬｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒを添加し、３７℃で１時間静置することでＣａ²⁺蛍光指示薬Ｆｌｕｏ－４を細胞内へ取り込ませた。ＨＢＳＳで１回洗浄後、Ｃ３ａ受容体拮抗剤（アンタゴニスト）である化合物１又は化合物２を溶解したＲｅｃｏｒｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒを添加した。尚、コントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）にはＲｅｃｏｒｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒを添加した。１５分経過後にマウスＴＬＱＰ－２１溶液を添加してＣ３ａ受容体刺激を行い、刺激に伴うＣａ²⁺の流入を細胞内蛍光強度（Ｅｘ：４９４ｎｍ、Ｅｍ：５２５ｎｍ）として経時的に測定し、マウスＴＬＱＰ－２１溶液に代えてＨＢＳＳを添加した測定値（ブランク）を減算した値を測定値とした。尚、Ｃ３ａ受容体拮抗剤（アンタゴニスト）溶液及びマウスＴＬＱＰ－２１溶液は、蛍光強度測定時の終濃度が、それぞれ１０ｎＭ及び１μＭとなるように適宜希釈して濃度を調整して添加した。Ｃ３ａ受容体応答評価用細胞へのＣ３ａ受容体拮抗剤（アンタゴニスト）溶液及びＴＬＱＰ－２１溶液の添加、並びに蛍光強度の測定は、自動分注機能を備えた蛍光プレートリーダーを用いて実施した。マウスＴＬＱＰ－２１溶液添加後３分間経時的に測定した蛍光強度の積分値を図６に示す。

図６に示すように、コントロールで測定されたＴＬＱＰ－２１によるＣ３ａ受容体刺激による蛍光強度が、化合物１又は化合物２の添加により大きく抑制されており、これら両化合物がＣ３ａ受容体拮抗剤としての作用を有することが示された。

実施例５Ｃ３ａ受容体拮抗剤によるＡＤモデルマウスの痒み改善
１．実験動物
７週齢の雌性ＮＣ／Ｎｇａマウスを使用した。
ＡＤモデルマウスの作製：頸背部の剃毛を行い、イソフルラン麻酔下でダニアレルゲン配合軟膏：ビオスタＡＤ（株式会社ビオスタ）を頸背部及び耳介部に１００ｍｇ塗布し、初回感作を行った。１回目のダニアレルゲン配合軟膏塗布から４日後、イソフルラン麻酔下で頸背部及び耳介部に１５０μＬの４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ水溶液及びダニアレルゲン配合軟膏を１００ｍｇ塗布した。以後、３～４日に１回の頻度で同様の作業を４回行い、ＡＤ様皮膚炎を誘導した。

２．サンプル調製及び投与方法
Ｃ３ａ受容体拮抗剤（アンタゴニスト）として、前記実施例４でＣ３ａ受容体拮抗作用が確認された化合物１又は化合物２を使用した。化合物１又は化合物２を２０％ポリエチレングリコール４００を含む生理食塩水で溶解し、２００μＬを頸背部に皮下投与した。コントロール群には前記溶媒のみを同量投与した。Ｃ３ａ受容体拮抗剤（アンタゴニスト）溶液の濃度は、化合物１は０．５ｍｇ/ｍＬ、化合物２は０．０５ｍｇ/ｍＬと設定した。サンプル投与は２回目のダニアレルゲン配合軟膏塗布日から開始し、週３回実施した。

３．掻破行動の測定
最後のダニアレルゲン配合軟膏塗布から４日後、サンプルの最終投与後に３時間の掻破行動測定を行った。掻破行動の測定にはＭｉｃｒｏＡｃｔ（ニューロサイエンス）を使用した。結果を図７に示す。

図７に示すように、Ｃ３ａ受容体拮抗作用が確認された化合物１又は化合物２をダニアレルゲンの塗布と並行して投与したＡＤモデルマウスでは、溶媒のみを投与したＡＤモデルマウスと比較して掻破行動の有意な減少が認められた。

実施例６Ｃ３ａ受容体拮抗剤によるＡＥＷモデルマウスの痒み改善
１．実験動物
動物は雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを使用した。
ＡＥＷモデルの作製：頸背部の剃毛を行い、アセトン及びジエチルエーテルの１：１（ｖ／ｖ）混合液を浸み込ませた脱脂綿を当て、１５秒間静置した。その後直ちに水を浸み込ませた脱脂綿を３０秒間当てた。この処置を２回／日（朝・夕）で７日間繰り返し実施した。

２．サンプル調製及び投与方法
Ｃ３ａ受容体拮抗剤（アンタゴニスト）として、前記実施例４でＣ３ａ受容体拮抗作用が確認された化合物１又は化合物２を使用した。化合物１又は化合物２を２０％ポリエチレングリコール４００を含む生理食塩水で溶解し、２００μＬを頸背部に皮下投与した。コントロール群には前記溶媒のみを同量投与した。Ｃ３ａ受容体拮抗剤（アンタゴニスト）溶液の濃度は、化合物１は０．５ｍｇ/ｍＬ、化合物２は０．０５ｍｇ/ｍＬと設定した。サンプル投与は１回目のＡＥＷ処置後から開始し、１日１回の頻度で８日間実施した。

３．掻破行動の測定
最後のＡＥＷ処置から１６時間後、サンプルの最終投与後に３時間の掻破行動測定を行った。掻破行動の測定にはＭｉｃｒｏＡｃｔ（ニューロサイエンス）を使用した。結果を図８に示す。

図８に示すように、Ｃ３ａ受容体拮抗作用が確認された化合物１又は化合物２をＡＥＷ処置と並行して投与したＡＥＷモデルマウスでは、溶媒のみを投与したＡＥＷモデルマウスと比較して掻破行動の有意な減少が認められた。

Claims

ＴＬＱＰ－２１とＣ３ａ受容体との結合に対する拮抗作用を指標とする、難治性痒みの予防又は改善剤の評価又は選択方法。
ＴＬＱＰ－２１とＣ３ａ受容体との結合に対する拮抗作用を有する被験物質を難治性痒みの予防又は改善剤として評価又は選択する方法。
ＴＬＱＰ－２１とＣ３ａ受容体との結合に対する拮抗作用を指標とする、難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤の評価又は選択方法。
ＴＬＱＰ－２１とＣ３ａ受容体との結合に対する拮抗作用を有する被験物質を難治性痒みを呈する掻痒性皮膚疾患の予防又は改善剤として評価又は選択する方法。