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JP7439142B2 - 含硫アミノ酸またはその誘導体の製造方法 - Google Patents
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JP7439142B2 - 含硫アミノ酸またはその誘導体の製造方法 - Google Patents

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Description

KCCM KCCM12425P KCCM KCCM12512P KCCM KCCM12513P
本出願は、含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体の製造方法に関する。
L-アミノ酸は、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、エシェリキア(Escherichia)属などに属する微生物を用いた醗酵方法により工業的に生産されている。このような製造方法には、自然界から分離された菌株または当該菌株の人工変異株、または組換えDNA技術によりL-アミノ酸生合成に関与する酵素の活性が増大するように変異された微生物などが用いられている。
一方、含硫アミノ酸(sulfur-containing amino acid)は、動物飼料、食品添加剤、医薬用水液剤及び医薬品の合成原料などとして用いられ、このような含硫アミノ酸及びその誘導体を生物学的に生産するための研究が行われてきた。
その例として、米国公開特許公報US 2009-0298135 A1ではエシェリキア・コリ(Escherichia coli)のゲノム遺伝子上のmetJ遺伝子を除去し、L-メチオニン放出因子(exporter)であるYjeHタンパク質を過発現(over-expression)させることにより0.8g/LのL-メチオニンを生産したことを報告した。また、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)のL-メチオニン放出因子として、BrnFとBrnEポリペプチドが報告されている(C. Troschel, et al, Journal of Bacteriology, p.3786-3794, June 2005)。
一方、含硫アミノ酸を生産するにおいて、硫黄源の還元力により微生物内で消耗するNADPHの量が変わる。例えば、sulfideはNADPHを要求しないため、理論的に収率が最も高く、sulfateは、4個のNADPHを要求するため、理論的に収率が低い。しかし、sulfideは、細胞損傷を引き起こすことが知られており、安定度が低いという短所がある。従って、NADPH要求量が低く、細胞内安定度が高い硫黄源であり、チオスルフェートが含硫アミノ酸の生産に用いられる場合には、高い生産収率を期待することができる。しかし、コリネバクテリウム属微生物においてこれを効率よく用いられる研究が不備な状態である。
米国公開特許公報US 2009-0298135 A1 米国登録特許 US 7662943 B2 米国公開特許公報US 2010-03177067 A1 米国登録特許 US 10584338 B2 米国登録特許 US 10273491 B2 米国登録特許US 9109242 B2
C. Troschel, et al, Journal of Bacteriology, p.3786-3794, June 2005 J Bacteriol. 1995 Jul; 177(14) Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman及びPeyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990) J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444 The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277 Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453 Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745 Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, D. J. Koch, C. Ruckert, D. A. Rey, A. Mix, A. Puhler, J. Kalinowski. 2005. Role of the ssu and seu Genes of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 in Utilization of Sulfonates and Sulfonate Esters as Sulfur Sources. AEM.71.10.6104-6114.2005 Bolten, Christoph J., Hartwig Schroder, Jeroen Dickschat, and Christoph Wittmann. Towards Methionine Overproduction in Corynebacterium glutamicum Methanethiol and Dimethyldisulfide as Reduced Sulfur Sources. J. Microbiol. Biotechnol. (2010), 20(8), 1196-1203 J. Biotechnol. 103:51-65, 2003 van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999
本発明者らは、ssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質がチオスルフェートの利用に関与することを新たに究明し、その活性を強化した微生物がチオスルフェートを硫黄源として用い、含硫アミノ酸生産能が強化することを確認することにより本出願を完成した。
本出願は、非変形微生物に比べてssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質活性が増加する遺伝的変形を有する、遺伝的に変形された微生物を、チオスルフェートを含む培地で培養することを含む含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体の製造方法を提供する。
本出願は、非変形微生物に比べてssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質活性が増加する遺伝的変形を有する、含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体を生産する微生物を提供する。
本出願は、非変形微生物に比べてssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質活性が増加する遺伝的変形を有する微生物、またはその培養物;及びチオスルフェートを含む、含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体製造用組成物を提供する。
本出願は、ssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質の、チオスルフェート還元酵素としての用途を提供する。
本出願は、非変形微生物に比べてssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質活性が増加する遺伝的変形を有する微生物の含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体製造用途を提供する。
本出願の微生物、組成物及びこれを用いた含硫アミノ酸または含硫アミノ酸の誘導体の製造方法を用いて含硫アミノ酸またはその誘導体を大量生産することができ、含硫アミノ酸またはその誘導体を含む有用産物の生産に有用に用いられる。
これを具体的に説明すると次の通りである。一方、本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用され得る。即ち、本出願で開示された多様な要素の全ての組合わせが本出願の範疇に属する。また、下記記述された具体的な記述により本出願の範疇が制限されるとは見られない。
また、当該技術分野の通常の知識を有する者は、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定様態に対する多数の等価物を認知したり確認することができる。また、このような等価物は、本出願に含まれることが意図される。
本出願の一つの様態は、含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体を生産する遺伝的に変形された微生物を提供する。
本出願の一つの様態は、遺伝的に変形された微生物をチオスルフェートを含む培地で培養することを含む、含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体の製造方法を提供する。
上記微生物は、ssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質活性が増加する遺伝的変形を有するものであってもよい。
本出願は、遺伝的に変形された微生物をチオスルフェートを含む培地で培養することを含む、含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体の製造方法を提供し、上記微生物は、遺伝的変形以前の微生物に比べてssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質の活性が増加する遺伝的変形を含むものであってもよい。本出願の一具現例として、上記方法は、微生物の含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体の生産を増加させる方法であってもよい。
上記製造方法は、ssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化された微生物またはその培養物をチオスルフェートと接触させることを含んでもよい。
本出願において、「ssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質」は、ssuD遺伝子がコードするタンパク質、またはssuD遺伝子により発現されるタンパク質であり、「SsuDタンパク質」と称され得る(以下「SsuDタンパク質」と言及される)。従来、SsuDタンパク質はスルホネート(sulfonate, R-SO3)を分解するタンパク質として知られており、具体的には、アルカンスルホン酸モノオキシゲナーゼ(alkanesulfonate monooxygenase)の一つであり、スルホン酸モノオキシゲナーゼとして知られた。しかし、上記SsuDタンパク質が有機硫酸塩ではなく、チオスルフェートの利用に関与するかについては全く知られていない。
本出願に至って 上記SsuDタンパク質がチオスルフェートの利用にも関与し、具体的には、チオスルフェートを還元させる還元酵素としての機能をするという事実を新たに究明し、SsuDタンパク質の活性を強化することにより含硫アミノ酸生産量を増加させることを確認した。
本出願のSsuDタンパク質はssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質であってもよく、これは、「SsuDタンパク質」または「チオスルフェート還元酵素」と言及されたり、従来知られている「アルカンスルホン酸モノオキシゲナーゼ」と言及されてもよい。一具現例として、本出願のSsuDタンパク質は、コリネバクテリウム属由来の「スルホン酸モノオキシゲナーゼ」または「チオスルフェート還元酵素」であってもよく、具体的には、コリネバクテリウム属由来のLLM class flavin-dependent oxidoreductaseと命名されたタンパク質であってもよく、具体的には、上記SsuDタンパク質は、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・クルジラクティス(Corynebacterium crudilactis)、コリネバクテリウム・デセルティ(Corynebacterium deserti)、コリネバクテリウム・エフィシェンス(Corynebacterium efficiens)、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)、コリネバクテリウム・スタチオニス(Corynebacterium stationis)、バクテリウム・シングラレ(Corynebacterium singulare)、コリネバクテリウム・ハロトレランス(Corynebacterium halotolerans)、コリネバクテリウム・ストリアツム(Corynebacterium striatum)、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、コリネバクテリウム・ポルティソリ(Corynebacterium pollutisoli)、コリネバクテリウム・イミタンス(Corynebacterium imitans)、コリネバクテリウム・テスツディノリス(Corynebacterium testudinoris)、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)、コリネバクテリウム・クレナタム(Corynebacterium crenatum)、コリネバクテリウム・デセルティ(Corynebacterium deserti)、コリネバクテリウム・フラベッセンス(Corynebacterium flavescens)、コリネバクテリウム・パカエンセ(Corynebacterium pacaense)、またはコリネバクテリウム・スラナリ(Corynebacterium suranareeae)由来であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のSsuDタンパク質であってもよいが、これに制限されない。上記SsuBタンパク質の配列は公知となったデータベースNCBIなどからその配列を確認することができる。
一具現例として、上記SsuDタンパク質は配列番号43のアミノ酸配列を含むか、または配列番号43のアミノ酸配列と少なくとも80％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％または99％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。また、上記相同性または同一性を有し、上記ポリペプチドに対応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有しても本出願の範囲内に含まれることは自明である。
併せて、公知の遺伝子配列から製造され得るプローブ、例えば、上記ポリペプチドを暗号化する塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下にハイブリッド化されるポリヌクレオチドによりコーディングされるポリペプチドであり、スルホン酸モノオキシゲナーゼ活性を有すると共にチオスルフェート還元活性を有するポリペプチドも制限なく含まれ得る。
即ち、本出願において「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはポリペプチド」、「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質またはポリペプチド」または「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチド」と記載されても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一あるいは対応する活性を有する場合であれば、一部配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願で用いられることは自明である。例えば、上記アミノ酸配列のN末端そして/またはC末端にタンパク質の機能を変更しない配列の追加、自然に発生し得る突然変異、このサイレント突然変異(silent mutation)または保存的置換を有する場合である。
上記「保存的置換(conservative substitution)」とは、あるアミノ酸を類似の構造的及び/又は化学的性質を有する更に他のアミノ酸で置換させることを意味する。このようなアミノ酸置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び/又は両親媒性(amphipathic nature)における類似性に基づいて発生し得る。
本出願の一具現例として、ssuD遺伝子は、配列番号8のポリヌクレオチド配列によりコーディングされるものであってもよいが、これに制限されない。
本出願において用語「ポリヌクレオチド」とは、DNAまたはRNA分子を包括的に含む意味を有し、ポリヌクレオチドにおいて基本構成単位であるヌクレオチドは天然ヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形された類似体も含んでもよい(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman及びPeyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)を参照)。
上記ポリヌクレオチドは、本出願のSsuDタンパク質をコードするポリヌクレオチド(ssuD遺伝子)であってもよい。本出願のポリヌクレオチドはコドンの縮退性(degeneracy)により、またはタンパク質を発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、アミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形が行われてもよい。本出願のポリヌクレオチドは、例えば、本出願のSsuDタンパク質と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の相同性または同一性を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドであってもよい。具体的には、配列番号43のアミノ酸配列と80％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号8の塩基配列と少なくとも80％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％または99％の相同性または同一性を有するポリヌクレオチドであってもよい。
また、コドン縮退性(codon degeneracy)により 配列番号43と80％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質に翻訳され得るポリヌクレオチドも含まれ得ることは自明である。または公知の遺伝子配列から製造され得るプローブ、例えば、上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下にハイブリッド化し、 配列番号43のアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であれば、制限なく含まれ得る。上記「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献(例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)に具体的に記載されている。例えば、相同性または同一性が高い遺伝子同士、70％以上、80％以上、具体的には85％以上、具体的には90％以上、より具体的には95％以上、さらに具体的には97％以上、特に具体的には99％以上の相同性または同一性を有する遺伝子同士がハイブリッド化し、それより相同性または同一性が低い遺伝子同士がハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化の洗浄条件である60℃、1×SSC、0.1％ SDS、具体的には60℃、0.1×SSC、0.1％ SDS,より具体的には68℃、0.1×SSC、0.1％ SDSに相当する塩濃度及び温度で、1回、具体的には、2回～3回洗浄する条件を列挙することができる。
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さにより塩基間のミスマッチ(mismatch)が可能であっても、2個のポリヌクレオチドが相補的配列を有することを要求する。用語、「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに用いられる。例えば、DNAに関してアデノシンはチミンに相補的で、シトシンはグアニンに相補的である。従って、本出願は、また、実質的に類似のポリヌクレオチド配列だけでなく、全体配列に相補的な単離されたポリヌクレオチド断片を含んでもよい。
具体的には、相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、55℃のTm値でハイブリダイゼーション段階を含むハイブリダイゼーション条件を用い、上述した条件を用いて探知することができる。また、上記Tm値は、60℃、63℃または65℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節され得る。
ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切な厳格さは、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は、当該技術分野によく知られている(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8を参照)
本出願において用語「相同性(homology)」または「同一性(identity)」とは、2個の与えられたアミノ酸配列または塩基配列と関連した程度を意味し、百分率で表されることができる。用語、相同性及び同一性は、しばしば相互交換的に用いられ得る。
保存された(conserved)ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立したデフォルトギャップペナルティが共に用いられ得る。実質的に、相同性を有したり(homologous)または同一の(identical)配列は、中間または高いストリンジェントな条件(stringent conditions)で一般に配列全体または全長の少なくとも約50％、60％、70％、80％または90％以上でハイブリッドしてもよい。ハイブリッド化は、ポリヌクレオチドで一般コドンの代わりに縮退性を考慮したコドンを含有するポリヌクレオチドも含まれることが自明である。
任意の2個のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444のようなデフォルトパラメータを用いて「FASTA」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定され得る。または、EMBOSSパッケージのニードルマンプログラム(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(バージョン5.0.0またはその後のバージョン)で行われるような、ニードルマン-ウンシュ(Needleman-Wunsch)アルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)が用いられて決定され得る。(GCGプログラムパッケージ(Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994,及び[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073を含む)。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのBLAST、またはClustalWを用いて相同性、類似性または同一性を決定することができる。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482に公知となった通り、例えば、 Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48 : 443のようなGAPコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することにより決定され得る。要約すると、GAPプログラムは、両配列中、さらに短いものにおける記号の全体数であり、類似の配列された記号(即ち、ヌクレオチドまたはアミノ酸)の数を除した値で定義する。GAPプログラムのためのデフォルトパラメータは(1)二進法比較マトリックス(同一性のために、1そして非同一性のために0の値を含有する)及びSchwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)により開示された通り、Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745の加重された比較マトリックス(またはEDNAFULL(NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン)置換マトリックス);(2)各ギャップのための3.0のペナルティ及び各ギャップで各記号のための追加の0.10ペナルティ(またはギャップ開放ペナルティ10、ギャップ延長ペナルティ0.5);及び(3)末端ギャップのための無ペナルティを含んでもよい。
また、任意の2個のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、定義されたストリンジェントな条件下でサザンハイブリダイゼーション実験により配列を比較することにより確認することができ、定義される適切なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者によく知られている方法(例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)で決定されてもよい。
本出願において用語、ポリペプチドまたはタンパク質活性の「強化」とは、ポリペプチドまたはタンパク質の活性が内在的活性に比べて増加することを意味する。上記強化は、上向調節(up-regulation)、過発現(overexpression)、増加(increase)などの用語と混用され得る。
ここで、増加とは、本来有していなかった活性を示すようになること、または内在的活性または変形前の活性に比べて向上した活性を示すようになることをいずれも含んでもよい。上記「内在的活性」とは、自然的または人為的要因による遺伝的変異で形質が変化する場合、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定ポリペプチドまたはタンパク質の活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドまたはタンパク質の活性が内在的活性に比べて「強化」または「増加」するということは、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定ポリペプチドまたはタンパク質の活性に比べて向上したことを意味する。
上記「活性増加」は、外来のポリペプチドまたはタンパク質を導入したり、内在的なポリペプチドまたはタンパク質の活性強化を通じて達成できるが、具体的には、内在的なポリペプチドまたはタンパク質の活性強化を通じて達成するものであってもよい。上記ポリペプチドまたはタンパク質の活性の強化如何は、当該ポリペプチドまたはタンパク質の活性程度、発現量または当該タンパク質から排出される産物の量の増加から確認することができる。
本出願において、「ssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質またはSsuDタンパク質の活性強化または増加」は、「ssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質の活性が増加する遺伝的変形」とも言及されることができ、これは、上記 タンパク質の活性が内在的活性に比べて強化したことを意味し得る。
上記活性増加は、外来のSsuDタンパク質を導入することと、内在的なSsuDタンパク質の活性強化をいずれも含んでもよい。
本出願において「タンパク質の導入」とは、微生物が本来有していなかった特定タンパク質の活性を示すようになること、または当該タンパク質の内在的活性または変形前の活性に比べて向上した活性を示すようになることを意味する。例えば、特定タンパク質が導入されたり、特定タンパク質をコードするポリヌクレオチドが微生物内の染色体に導入されたり、特定タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが微生物内に導入され、その活性が示されるものであってもよい。
上記ポリペプチドまたはタンパク質の活性の強化は、当該分野によく知られている多様な方法の適用が可能であり、目的ポリペプチドまたはタンパク質の活性を変形前の微生物より強化させる限り、制限されないこともある。上記方法は、これに制限されるものではないが、分子生物学の日常的方法である当業界における通常の技術者によく知られている遺伝子工学及び/又はタンパク質工学を用いたものであってもよい(Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012など)。
具体的には、本出願において活性強化は、
1)上記ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加、
2)上記ポリペプチドまたはタンパク質をコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性が強力な配列で交換する方法、
3)上記ポリペプチドまたはタンパク質の開始コドンまたは5'-UTR地域の塩基配列を変形させる方法、
4)上記ポリペプチドまたはタンパク質の活性が強化されるように染色体上のポリヌクレオチド配列を変形させる方法、
5)上記ポリペプチドまたはタンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチドまたは上記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの導入、または
6)上記方法の組合わせにより強化されるように変形する方法などにより行われてもよいが、これに制限されない。
上記タンパク質工学を用いてポリペプチドまたはタンパク質活性を強化する方法は、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質の三次構造を分析して露出部位を選択し、変形したり化学的に修飾する方法などにより行われてもよいが、これに制限されない。
上記1)ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドのコピー数の増加は、当業界に知られている任意の方法、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主と無関係に複製されて機能できるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行われてもよい。または、上記遺伝子が作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体内に上記遺伝子またはポリヌクレオチドを挿入させるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行われてもよいが、これに制限されない。
上記2)ポリペプチドまたはタンパク質をコードする染色体上の遺伝子発現調節領域(または発現調節配列)を活性が強力な配列で交換する方法は、当業界に知られている任意の方法、例えば、上記発現調節配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組合わせで配列上の変異を誘導して行ったり、さらに強い活性を有する核酸配列で交換することにより行われてもよい。上記発現調節配列は、特にこれに制限されないが、プロモーター、オペレータ配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列などを含んでもよい。上記方法は、具体的には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターを連結させるものであってもよいが、これに制限されない。
公知となった強力なプロモーターの例としては、cjl～cj7プロモーター(米国登録特許 US 7662943 B2)、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、ラムダファージPRプロモーター、PLプロモーター、tetプロモーター、lysCP1プロモーター(US 2010-0317067 A1)、spl1プロモーター、spl7プロモーター、spl13プロモーター(US 10584338 B2)、gapAプロモーター、EF-Tuプロモーター、groELプロモーター、aceAあるいはaceBプロモーター、O2プロモーター(米国登録特許 US 10273491 B2)、tktプロモーター及びyccAプロモーターなどがあるが、これに限定されない。
上記3)ポリペプチドまたはタンパク質の開始コドンまたは5'-UTR地域の塩基配列を変形させる方法は、当業界において知られた任意の方法、例えば、上記ポリペプチドまたはタンパク質の内在的開始コドンを上記内在的開始コドンに比べてポリペプチドまたはタンパク質発現率がさらに高い他の開始コドンで置換するものであってもよいが、これに制限されない。
上記4)ポリペプチドまたはタンパク質活性が増加するように染色体上のポリヌクレオチド配列を変形させる方法は、当業界において知られた任意の方法、例えば、上記ポリヌクレオチド配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行ったり、さらに強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列で交換することにより行われてもよい。上記交換は、具体的に相同組換えにより上記遺伝子を染色体内に挿入するものであってもよいが、これに制限されない。この時に用いられるベクターは、染色体挿入如何を確認するための選別マーカー(selection marker)をさらに含んでもよい。
上記5)ポリペプチドまたはタンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチド配列の導入は、当業界において知られた任意の方法、例えば、上記ポリペプチドまたはタンパク質と同一/類似の活性を示すポリペプチドまたはタンパク質を暗号化する外来ポリヌクレオチド、またはこのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入して行われてもよい。上記外来ポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドまたはタンパク質と同一/類似の活性を示す限り、その由来や配列に制限なく用いられる。また、導入された上記外来ポリヌクレオチドが宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるように、このコドンを最適化して宿主細胞内に導入できる。上記導入は、公知となった形質転換方法を当業者が適宜選択して行われ得、宿主細胞内で上記導入されたポリヌクレオチドが発現されることにより、ポリペプチドまたはタンパク質が生成されてその活性が増加することができる。
最後に、6)上記方法の組合わせは、上記1)～5)のいずれか一つ以上の方法を共に適用して行われてもよい。
このようなポリペプチドまたはタンパク質活性の強化は、対応するポリペプチドまたはタンパク質の活性または濃度が野生型や変形前の微生物菌株で発現されたポリペプチドまたはタンパク質の活性または濃度を基準として増加したり、当該ポリペプチドまたはタンパク質から生産される産物の量が増加することであってもよいが、これに制限されるものではない。
本出願において用語、「変形前の菌株」または「変形前の微生物」とは、微生物に自然に発生し得る突然変異を含む菌株を除くものではなく、野生型菌株または天然型菌株自体であるか、自然的または人為的要因による遺伝的変異で形質が変化する前の菌株を意味してもよい。上記「変形前の菌株」または「変形前の微生物」は、「非変異菌株」、「非変形菌株」、「非変異微生物」、「非変形微生物」または「基準微生物」と混用され得る。
本出願の用語「ベクター」とは、適した宿主内で目的タンパク質を発現させるように、適した発現調節領域または発現調節配列に作動可能に連結された上記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含有するDNA製造物を意味する。上記調節配列は、転写を開始できるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレータ配列、適したmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムと関係なく複製されたり機能することができ、ゲノムそのものに統合され得る。一例として細胞内染色体挿入用ベクターを通じて染色体内に目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。上記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は当業界において知られた任意の方法、例えば、相同組換え(homologous recombination)により行われてもよいが、これに限定されない。上記ベクターは、上記染色体挿入如何を確認するための選別マーカー(selection marker)をさらに含んでもよい。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、即ち、目的核酸分子の挿入如何を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面ポリペプチドの発現のような選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤(selective agent)が処理された環境では選別マーカーを発現する細胞のみが生存したり、他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
本出願のベクターは特に限定されず、当業界において知られた任意のベクターを用いることができる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態であるか、組み換えられた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージを挙げることができる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてpWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A及びCharon21Aなどを用いることができ、プラスミドベクターとしてpBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系及びpET系などを用いることができる。具体的には、pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BACベクターなどを用いることができる。しかし、これに制限されない。
本出願の用語「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞あるいは微生物内に導入して宿主細胞内で上記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現できさえすれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらをいずれも含むことができる。また、上記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするDNA及びRNAを含む。上記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、如何なる形態で導入されても問題ない。例えば、上記ポリヌクレオチドは、独自に発現されるのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット(expression cassette)の形態で宿主細胞に導入され得る。上記発現カセットは、通常、上記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター(promoter)、転写終結信号、リボソーム結合部位及び翻訳終結信号を含んでもよい。上記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、上記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに限定されない。
また、本出願の用語「作動可能に連結」されたとは、本出願の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介させるプロモーター配列と上記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
本出願のベクターを形質転換させる方法は、核酸を細胞内に導入する如何なる方法も含まれ、宿主細胞により当分野において公知となった通り、適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、電気穿孔法(electroporation)、リン酸カルシウム(CaPO4)沈殿、塩化カルシウム(CaCl2)沈殿、マイクロインジェクション法(microinjection)、ポリエチレングリコール(PEG)法、DEAE-デキストラン法、カチオンリポソーム法、及び酢酸リチウム-DMSO法などがあるが、これに制限されない。
本出願の微生物は、野生型微生物や自然的または人為的に遺伝的変形が起こった微生物をいずれも含み、本出願のチオスルフェート還元酵素が導入されたり含まれる微生物は制限なく含まれ得る。
本出願の微生物は、本出願のチオスルフェート還元酵素;これをコードするポリヌクレオチド;及び上記ポリヌクレオチドを含むベクターのいずれか一つ以上を含んでもよい。
上記微生物は、L-アミノ酸及び/又はその誘導体を生産する微生物であってもよい。
本出願の用語「L-アミノ酸及び/又はその誘導体を生産する微生物」とは、自然にL-アミノ酸/その誘導体生産能を有している微生物またはL-アミノ酸の生産能がない親株にL-アミノ酸/その誘導体の生産能が付与された微生物をいずれも含む。具体的には、外部遺伝子が挿入されたり内在的遺伝子の活性が強化されたり不活性化されるなどの原因により特定機序が弱化したり強化した微生物であり、目的とするL-アミノ酸またはその誘導体の生産のために遺伝的変形(modification)を含む微生物であってもよい。
例えば、上記微生物はL-アミノ酸生合成経路が強化されたり、分解経路が弱化した微生物であってもよい。例えば、上記微生物は、L-メチオニン生合成経路が強化された微生物であってもよい。
例えば、上記微生物は、McbR(methionine and cysteine biosynthesis repressor protein)またはMetJタンパク質が活性減少または不活性化されたり、メチオニン合成酵素(MetH)、または亜硫酸レダクターゼ(CysI)の活性が強化されてメチオニン生産能が強化及び/又は付加された微生物であってもよい。または、それ以外のL-アミノ酸生合成経路の酵素を暗号化する遺伝子の発現を増進させたり分解経路の酵素を弱化/不活性化させた微生物であってもよい。
具体的には、L-アミノ酸生合成経路を強化したり分解経路を弱化/不活性させるために、発現を調節し得るタンパク質または遺伝子の例示は次の通りである。タンパク質、タンパク質をコードする代表的な遺伝子、代表的なEC numberの順に記載し、タンパク質は先頭文字を大文字で、遺伝子はイタリック体で表記した。例えば、Rdl2p、GlpE、PspE、YgaP、ThiI、YbbB、SseA、YnjE、YceA、YibN、NCgl0671、NCgl1369、NCgl2616、NCgl0053、NCgl0054、NCGl2678、NCgl2890などのチオスルフェート硫黄転移酵素(thiosulphate sulphurtransferase);亜硫酸レダクターゼ、cysI;チオスルフェート/スルフェート輸送システム(thiosulphate/sulphate transport system)、cysPUWA (EC 3.6.3.25); 3'-ホスホアデノシン5'-ホスホスルフェート還元酵素(3′-phosphoadenosine 5′'-phosphosulphate reductase)、cysH (EC 1.8.4.8);亜硫酸レダクターゼ(sulphite reductase)、 cysJI(EC 1.8.1.2); システイン合成酵素A(cysteine synthase)、cysK(EC 2.5.1.47); システイン合成酵素 B、cysM(EC 2.5.1.47):セリンアセチルトランスフェラーゼ(serine acetyltransferase)、cysE(EC 2.3.1.30); グリシン切断システム(glycine cleavage system)、gcvTHP-lpd(EC 2.1.2.10, EC 1.4.4.2, EC 1.8.1.4); リポイル合成酵素(lipoyl synthase)、lipA(EC 2.8.1.8);リポイルタンパク質リガーゼ(lipoyl protein ligase)、lipB(EC 2.3.1.181); ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(phosphoglycerate dehydrogenase)、serA(EC 1.1.1.95); 3-ホスホセリンフォスファターゼ(3-phosphoserine phosphatase)、serB(EC 3.1.3.3); 3-ホスホセリン/ホスホヒドロキシトレオニンアミノトランスフェラーゼ(3-phosphoserine/phosphohydroxythreonine aminotransferase)、serC(EC 2.6.1.52);セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(serine hydroxymethyltransferase)、glyA(EC 2.1.2.1); アスパルトキナーゼI(aspartokinase I)(EC 2.7.2.4); ホモセリンデヒドロゲナーゼI(homoserine dehydrogenase I)、thrA(EC 1.1.1.3); アスパラギン酸キナーゼ(aspartate kinase)、lysC(EC 2.7.2.4); ホモセリンデヒドロゲナーゼ(homoserine dehydrogenase)、hom(EC 1.1.1.3); ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼ(homoserine O-acetyltransferase)、metX(EC 2.3.1.31); ホモセリンO-サクシニルトランスフェラーゼ(homoserine O-succinyltransferase)、metA(EC 2.3.1.46); シスタチオニンガンマ合成酵素(cystathionine gamma-synthase)、metB(EC 2.5.1.48); β-C-S-リアーゼ(β-C-S-lyase)、aecD(EC 4.4.1.8, beta-lyase); シスタチオニンベータリアーゼ(cystathionine beta-lyase)、metC(EC 4.4.1.8); B12-独立的ホモシステインS-メチルトランスフェラーゼ(B12-independent homocysteine S-methyltransferase)、metE(EC 2.1.1.14); メチオニン合成酵素、metH(EC 2.1.1.13); メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素(methylenetetrahydrofolate reductase)、metF(EC 1.5.1.20); L-methionine 外輸送体BrnFE;バリン外輸送体YgaZH(B2682,B2683)、ygaZH(62682.b2683);外輸送体YjeH、b4141;ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼPntAB、pntAB(EC1.6.1.2);O-スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ(O-succinylhomoserine sulfhydrylase)、MetZ(EC 2.5.1.48); 及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(phosphoenolpyruvate carboxylase)、Pyc(EC4.1.1.31)の中から選択された一つ以上のタンパク質またはシステムを構成する一部タンパク質の活性強化またはこれをコードするポリヌクレオチドが過発現され、L-アミノ酸生合成経路を強化したり分解経路を弱化させることができる。または、グルコース6-リン酸異性化酵素、pgi(EC5.3.1.9);ホモセリンキナーゼ、thrB(EC2.7.1.39);S-アデノシルメチオニン合成酵素、metK(EC2.5.1.6);ジヒドロジピコリン酸(dihydrodipicolinate)合成酵素、dapA(EC4.2.1.52);ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、pck(EC 4.1.1.49);、ホルミルテトラヒドロ葉酸ヒドロラーゼ(formyltetrahydrofolate hydrolase)、purU(EC 3.5.1.10); ピルベートキナーゼI、pykF(EC 2.7.1.40); ピルベートキナーゼII、pykA(EC 2.7.1.40); シスタチオニンγ-リアーゼ、cg3086(EC 4.4.1.1); シスタチオニンβ-合成酵素、 cg2344 (EC 4.2.1.22); 調節タンパク質cg3031、cg3031;メチオニン-システイン生合成抑制因子(methionine and cysteine biosynthesis repressor protein) McbR、mcbR; L-メチオニン合成転写調節因子(Met transcriptional repressor protein)、metJ; L-メチオニン輸送体MetQNI、metQ、metN、metI; N-アシルトランスフェラーゼ、yncA; sRNA fnrS; 及びL-メチオニン輸送体、metPで構成された群から選択された一つ以上のタンパク質の活性が不活性化または弱化したもの、もしくは上記タンパク質をコードする遺伝子の発現が抑制または除去されたものであってもよい。
ただし、これは一例に過ぎず、多様な公知のL-アミノ酸生合成経路の酵素を暗号化する遺伝子の発現を増進させたり、分解経路の酵素を弱化/不活性化させた微生物であってもよいが、これに限定されない。上記L-アミノ酸を生産する微生物は、公知の多様な方法を適用して製造され得る。タンパク質の活性強化、遺伝子発現増加については、前述した通りである。
本出願の用語、ポリペプチドまたはタンパク質の「不活性化」または「弱化」とは、内在的活性に比べて活性が減少したりまたは活性がないことをいずれも含む概念である。上記不活性化または弱化は、下向調節(down-regulation)、減少(decrease)、低下(reduce)などの用語と混用され得る。上記不活性化または弱化は、上記タンパク質をコードする遺伝子の変異、発現調節配列の変形、遺伝子の一部または全体の欠損などによりタンパク質自体の活性が本来微生物が有しているタンパク質の活性に比べて減少または除去された場合と、これをコードする遺伝子の発現阻害または翻訳(translation)阻害などにより細胞内で全体的なタンパク質の活性程度が天然型菌株または変形前の菌株に比べて低い場合、上記遺伝子の発現が全く行われていない場合、及び発現されても活性がない場合も含んでもよい。
本出願において、このようなタンパク質の不活性化/弱化は、これに制限されるものではないが、当該分野によく知られた多様な方法の適用で達成され得る(Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012など)。
上記方法の例として、
1)上記タンパク質をコードする上記遺伝子の全体または一部を欠失させる方法、
2)上記タンパク質をコードする上記遺伝子の発現が減少するように発現調節領域(または発現調節配列)の変形、
3)上記タンパク質の活性が除去または弱化するようにタンパク質をコードする上記遺伝子配列の変形、
4)上記タンパク質をコードする上記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、アンチセンスRNA)の導入、
5)上記タンパク質をコードする上記遺伝子のシャイン・ダルガノ(Shine-Dalgarno)配列の前段にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列を付加して2次構造物を形成させてリボソーム(ribosome)の付着を不可能にさせる方法、
6)上記タンパク質をコードする上記遺伝子のポリヌクレオチド配列のORF(open reading frame)の3'末端に反対方向に転写されるプロモーターを付加する方法(Reverse transcription engineering, RTE)などがあり、これらの組合わせでも達成できるが、これに特に制限されるのではない。
具体的には、上記タンパク質をコードする上記遺伝子の一部または全体を欠失する方法は、微生物内の染色体挿入用ベクターを通じて染色体内の内在的目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを一部ヌクレオチド配列が欠失されたポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子で交換することにより行われてもよい。このようなポリヌクレオチドの一部または全体を欠失する方法の一例として相同組換えによりポリヌクレオチドを欠失させる方法を用いることができるが、これに限定されない。
また、上記遺伝子の一部または全体を欠損させる方法は、紫外線のような光または化学物質を用いて突然変異を誘発し、得られた突然変異体から目的遺伝子が欠損した菌株を選別して行われてもよい。上記遺伝子欠損方法にはDNA組換え技術による方法が含まれる。上記DNA組換え技術には、例えば、目的遺伝子と相同性があるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはベクターを上記微生物に注入して相同組換え(homologous recombination)が起こるようにして行われてもよい。また、上記注入されるヌクレオチド配列またはベクターには、優性選別マーカーを含んでもよいが、これに制限されるものではない。
また、上記発現調節配列を変形する方法は、当該分野によく知られている多様な方法の適用により達成されてもよい。上記方法の例として、上記発現調節領域(または発現調節配列)の活性をさらに弱化するようにポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組合わせにより発現調節領域(または発現調節配列)上の変異を誘導して行ったり、さらに弱い活性を有するポリヌクレオチド配列で交換することにより行うことができる。上記発現調節領域には、プロモーター、オペレータ配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含むが、これに限定されるものではない。
また、上記遺伝子配列を変形する方法は、上記ポリペプチドの活性をさらに弱化するように遺伝子配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組合わせにより配列上の変異を誘導して行ったり、さらに弱い活性を有するように改良された遺伝子配列または活性がないように改良された遺伝子配列に交換することにより行うことができるが、これに限定されるものではない。
例えば、遺伝子配列内の変異を導入して終結コドンを形成させることにより、遺伝子の発現を阻害したり弱化させることができる。
ただし、前述した方法は、一例として、当業者は当業界において知られた公知の手段を用いてL-アミノ酸及び/又はその誘導体を生産する微生物を製造することができる。
上記L-アミノ酸及び/又はその誘導体は含硫アミノ酸及び/又は含硫アミノ酸の誘導体であってもよい。
本出願の用語、「含硫アミノ酸」または「含硫アミノ酸誘導体」とは、硫黄元素を含むアミノ酸またはその誘導体であり、具体的には、メチオニン(methionine)、システイン(cysteine)、シスチン(cystine)、ランチオニン(lanthionine)、ホモシステイン(homocysteine)、ホモシスチン(homocystine)、ホモランチオニン(homolanthionine)、及びタウリン(taurine)の中から選択されるいずれか一つであってもよいが、硫黄を含むアミノ酸及びその誘導体であれば、本出願の範囲に制限なく含まれる。
本出願の微生物は、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)、エシェリキア属(Escherichia sp.)またはラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)微生物であってもよいが、これに制限されない。上記微生物はSsuDタンパク質の内在的活性が強化したり、外来SsuDタンパク質の導入によりL-アミノ酸及び/又はその誘導体の生産能が増加するものであれば、制限なく含んでもよい。
本出願の「コリネバクテリウム属微生物」は、全てのコリネバクテリウム属微生物を含んでもよい。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・クルジラクティス(Corynebacterium crudilactis)、コリネバクテリウム・クレナタム(Corynebacterium crenatum)、コリネバクテリウム・デセルティ(Corynebacterium deserti)、コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)、コリネバクテリウム・スタチオニス(Corynebacterium stationis)、コリネバクテリウム・シングラレ(Corynebacterium singulare)、コリネバクテリウム・ハロトレランス(Corynebacterium halotolerans)、コリネバクテリウム・ストリアツム(Corynebacterium striatum)、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、コリネバクテリウム・ポルティソリ(Corynebacterium pollutisoli)、コリネバクテリウム・イミタンス(Corynebacterium imitans)、コリネバクテリウム・テスツディノリス(Corynebacterium testudinoris)またはコリネバクテリウム・フラベッセンス(Corynebacterium flavescens)であってもよく、さらに具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)、コリネバクテリウム・クレナタム(Corynebacterium crenatum)、コリネバクテリウム・スタチオニス(Corynebacterium stationis)、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、またはコリネバクテリウム・デセルティ(Corynebacterium deserti)であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムであってもよいが、これに制限されない。
本出願の「エシェリキア属微生物」は、全てのエシェリキア属微生物を含んでもよい。具体的には、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)であってもよいが、これに制限されない。
本出願の微生物は、本出願のチオスルフェート還元酵素を含み、チオスルフェートを硫黄源として用いるものであってもよい。
本出願の製造方法は、本出願の微生物を、チオスルフェートを含む培地で培養することを含んでもよい。
本出願の用語「培養」とは、上記微生物を適当に調節された環境条件で生育させることを意味する。本願の培養過程は当業界において知られた適当な培地と培養条件に応じて行われてもよい。このような培養過程は、選択される菌株により当業者が容易に調整して用いることができる。上記微生物を培養する段階は、特にこれに制限されないが、公知となった回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。
本出願において用語、「培地」とは、上記微生物を培養するために必要とする栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとして栄養物質及び発育因子などを供給する。具体的には、本出願の微生物の培養に用いられる培地及びその他の培養条件は、通常の微生物の培養に用いられる培地であれば特別な制限なくいずれも用いられるが、本出願の微生物を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び/又はビタミンなどを含有した通常の培地内で、好気性条件下で温度、pHなどを調節しながら培養することができる。
本出願において上記炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどのような炭水化物;マンニトール、ソルビトールなどのような糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などのような有機酸;グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのようなアミノ酸などが含まれ得る。また、澱粉加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米ぬか、キャッサバ、バカス及びトウモロコシ浸漬液のような天然の有機栄養源を用いることができ、具体的には、グルコース及び殺菌された前処理糖蜜(即ち、還元糖に転換された糖蜜)などのような炭水化物が用いられ、それ以外の適正量の炭素源を制限なく多様に用いることができる。これら炭素源は、単独で用いられたり、2種以上が組み合わせられて用いられ、これに限定されるものではない。
上記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等のような無機窒素源;グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのようなアミノ酸、ペプトン、NZ-アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物などのような有機窒素源が用いられる。これら窒素源は、単独で用いられたり、2種以上が組み合わせられて用いられ、これに限定されるものではない。
上記リン源としては、リン酸第1カリウム、リン酸第2カリウム、またはこれに対応するナトリウム含有塩などが含まれ得る。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが用いられ、それ以外にアミノ酸、ビタミン及び/又は適切な前駆体などが含まれ得る。これら構成成分または前駆体は、培地に回分式または連続式で添加されてもよい。しかし、これに限定されるものではない。
また、上記微生物の培養中に、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などのような化合物を培地に適切な方式で添加し、培地のpHを調整することができる。また、培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制することができる。また、培地の好気状態を維持するために、培地内に酸素または酸素含有気体を注入したり嫌気及び微好気状態を維持するために、気体の注入なしに、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入することができ、これに限定されるものではない。
培地の温度は25℃～40℃、具体的には30℃～37℃であってもよいが、これに制限されない。培養期間は、有用物質の所望の生成量が得られるまで続けることができ、例えば、0.5時間～60時間であってもよいが、これに制限されない。
本出願の用語「硫黄源(suphur source)」とは、「硫黄供給源」と相互交換的に用いられ、硫黄含有性アミノ酸の生産に用いられる硫黄元素を含む物質を意味する。
微生物を培養するにおいて、硫黄源は、微生物内の代謝反応経路を決定する重要な因子であってもよい。しかし、多様な硫黄源に対して如何なる因子がこれを運搬するか、如何なる因子がこれを分解しているかについては、明らかになっていない。例えば、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムが多様な硫黄源を用いることができるという点は知られているが、このうちSsuABCタンパク質は、sulfateやsulfiteの運搬には関与せず、脂肪族スルホネート(aliphatic sulfonate)の運搬に関与することが知られているだけである(D. J. Koch, C. Ruckert, D. A. Rey, A. Mix, A. Puhler, J. Kalinowski. 2005. Role of the ssu and seu Genes of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 in Utilization of Sulfonates and Sulfonate Esters as Sulfur Sources. AEM.71.10.6104-6114.2005)。即ち、硫黄源を細胞内に運搬するタンパク質は基質特異性を有する。また、硫黄源が細胞内に運搬された後も硫黄源の構造及び作用基に応じてこれを分解する酵素も相違し、これを用いる代謝経路も変わり得る。例えば、sulfateを硫黄源として用いる場合には、CysZがこれを運搬し、その後、sulfideの生成までCysDN、CysH及びCysIが関与することが知られている(Bolten, Christoph J., Hartwig Schroder, Jeroen Dickschat, and Christoph Wittmann. Towards Methionine Overproduction in Corynebacterium glutamicum Methanethiol and Dimethyldisulfide as Reduced Sulfur Sources. J. Microbiol. Biotechnol. (2010), 20(8), 1196-1203)。しかし、硫黄含有アミノ酸を生産するにおいて、チオスルフェートを硫黄源として用いる場合、如何なる因子がこれを運搬し、分解するかについては明らかになっていない。
上記硫黄源は、チオスルフェートを意味するものであってもよい。本出願において硫黄源は、具体的には、アンモニウムチオスルフェートまたはナトリウムチオスルフェートのようなチオスルフェートを含んでもよく、または亜硫酸塩(sulfite)、H2Sのような還元された原料、スルフィド、スルフィド誘導体、メチルメルカプタン、チオグリコレート、チオシアネート及びチオウレアのような有機及び無機硫黄含有性化合物とチオスルフェートの混合物の形態であってもよい。または硫黄源としてチオスルフェート以外の物質は含まなくてもよい。しかし、これに制限されない。
上記含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体の製造方法は、微生物または培養培地から含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体を回収することを含んでもよい。
上記回収する段階は、本出願の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などにより当該技術分野において公知となった適した方法を用いて培地から目的とする含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体を回収することができる。例えば、遠心分離、濾過、結晶化タンパク質沈殿剤による処理(塩析法)、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子体クロマトグラフィ(ゲル濾過)、吸着クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、親和度クロマトグラフィなどの各種クロマトグラフィ、HPLC及びこれらの方法を組み合わせて用いられてもよいが、これら例に限定されるものではない。
上記回収段階は、追加の精製工程を含んでもよい。上記精製工程は、当該技術分野において公知となった適した方法を用いることができる。
本出願のもう一つの様態は、ssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質活性が内在的活性に比べて強化された、微生物、またはその培養物;及びチオスルフェートを含む、含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体製造用組成物を提供する。
ssuD 遺伝子によりコーディングされるタンパク質、微生物、チオスルフェート及び含硫アミノ酸については、前述した通りである。
上記培養物は、本出願の微生物を培地で培養して製造されたものであってもよい。
本出願の含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体製造用組成物には、含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体の製造を補助できる任意の成分をさらに含んでもよく、このような成分は当業界において公知となっているものから適宜選択できる。
本出願のもう一つの様態は、ssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質の、チオスルフェート還元酵素としての用途を提供する。
本出願のもう一つの様態は、非変形微生物に比べてssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質活性が増加する遺伝的変形を有する微生物の含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体製造用途を提供する。
上記ssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質、微生物、培養物、チオスルフェート及び含硫アミノ酸については、前述した通りである。
以下、本出願を実施例及び実験例を通じてより詳しく説明する。しかし、これら実施例及び実験例は、本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれら実施例及び実験例に限定されるものではない。
実施例１：mcbR遺伝子欠損のための組換えベクターの製作
まず、代表的な含硫アミノ酸であるメチオニン生産菌株を製作するために、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032菌株をもって既に公知となったメチオニンシステイン転写調節因子タンパク質をコードするmcbR (J. Biotechnol. 103:51-65, 2003)の不活性化のためにベクターを製作した。
具体的には、mcbR遺伝子をコリネバクテリウムATCC13032染色体上で欠損させるために、下記方法で組換えプラスミドベクターを製作した。
米国の国立衛生研究所の遺伝子銀行(NIH Genbank)に報告された塩基配列に基づいてコリネバクテリウム・グルタミカムのmcbR遺伝子及び周辺配列(配列番号1)を確保した。
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032の染色体DNAを鋳型として配列番号2及び配列番号3,配列番号4及び配列番号5のプライマーを用いてPCRを行った。PCR条件は95℃で5分間の変性後、95℃で30秒の変性、53℃で30秒のアニーリング、72℃で30秒の重合を30回繰り返した後、72℃で7分間の重合反応を行った。その結果、それぞれ700bpのDNA断片を得た。
コリネバクテリウム・グルタミカム内で複製が不可能なpDZベクター(米国登録特許US 9109242 B2)と上記増幅したmcbR遺伝子断片を染色体導入用制限酵素SmaIで処理した後、isothermal assembly cloning 反応後、大腸菌DH5αに形質転換し、カナマイシン(25mg/l)が含まれたLB固体培地に塗抹した。PCRを通じて目的とした遺伝子の欠損した断片が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、プラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、pDZ-ΔmcbRと命名した。
実施例２：mcbR遺伝子が欠損した菌株の製作及び培養
上記実施例1で製作されたpDZ-ΔmcbRベクターを染色体上における相同組換えによりATCC13032菌株にそれぞれ電気穿孔法で形質転換させた(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999)。その後、スクロースを含んでいる固体培地で2次組換えを行った。2次組換えが完了した上記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号6、7を用いてPCR法を通じてmcbR遺伝子が欠損した菌株を確認し、この組換え菌株をCM02-0618と命名した。
上記CM02-0618は、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2019年1月4日付で寄託し、受託番号KCCM12425Pの付与を受けた。
上記製作されたCM02-0618菌株のL-メチオニン生産能を分析するために、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032菌株と共に下記のような方法で培養した。
下記種培地25mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコにコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032とコリネバクテリウム・グルタミカムCM02-0618を接種し、30℃で20時間、200rpmで振盪培養した。その後、生産培地24mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに1mlの種培養液を接種し、30℃で48時間、200rpmで振盪培養した。上記種培地と生産培地の組成は、それぞれ下記の通りである。生産培地において硫黄源としては、チオスルフェートの一種である(NH4)2S2O3を用いた。
<種培地(pH7.0)>
ブドウ糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミンHCl 1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド2000μg(蒸溜水1リットルを基準)
<生産培地(pH 8.0)>
ブドウ糖50g、(NH4)2S2O3 12g、Yeast extract 5g、KH2PO4 1g、MgSO4・7H2O 1.2g、ビオチン100μg、チアミン塩酸塩1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド3000μg、CaCO3 30g、シアノコバラミン(Vitamin B12) 1μg (蒸溜水1リットルを基準)。
上記培養方法で培養し、培養液中のL-メチオニン濃度を分析して表1に示した。
その結果、mcbR単独除去菌株で対照群菌株比L-メチオニン生産能が0.04g/L向上したことを確認することができた。また、チオスルフェートを単独硫黄源として用いてもメチオニンを生産することを確認した。これを通じてチオスルフェートの利用に関与するタンパク質がコリネバクテリウム属微生物にも存在することを推測した。
実施例３：転写体の分析を通じたチオスルフェートの利用に関与する遺伝子の選別
コリネバクテリウム菌株のチオスルフェートに特異的なタンパク質については知られていない。しかし、実施例2で確認した通り、CM02-0618菌株の場合、チオスルフェートを単独硫黄sourceとして用いた時、メチオニンを生産することを確認したところ、チオスルフェートの利用に関与するタンパク質を選別するための実験を行った。
具体的には、実施例2で製造したCM02-0618菌株を硫黄Sourceのみ異に(Ammonium sulfate及びammonium thiosulfate)して培養した後、Transcriptome (RNA levelを分析)の分析を行った。培養方法は、実施例2と同様である。
実験の結果、既存のスルホン酸モノオキシゲナーゼ(monooxygenase)と知られているSsuD(Ncgl1173)をコードする遺伝子のRNA levelが非常に増加したことが分かった。
これを通じて、SsuDタンパク質は、硫酸塩(sulfate)には反応せず、チオスルフェートに特異的に反応したことを確認したところ、上記タンパク質がチオスルフェートを用いるのに関与することを確認した。
実施例４：ssuD遺伝子欠損菌株効果の確認
実施例3においてチオスルフェートに特異的に反応するタンパク質として選別したSsuDの不活性化効果を確認するためにssuD遺伝子を欠損させようとベクターを製作した。
実施例４－１：SsuD遺伝子欠損のためのベクターの製作
ssuD遺伝子をコリネバクテリウムATCC13032染色体上で欠損させるために、下記方法で組換えプラスミドベクターを製作した。
米国の国立衛生研究所の遺伝子銀行(NIH Genbank)に報告された塩基配列に基づいてコリネバクテリウム・グルタミカムのssuD遺伝子及び周辺配列(配列番号8)を確保した。
ssuD遺伝子を欠失させるための目的で、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032の染色体DNAを鋳型として配列番号9及び配列番号10、配列番号11及び配列番号12のプライマーを用いてPCRを行った。PCR条件は、95℃で5分間の変性後、95℃で30秒の変性、53℃で30秒のアニーリング、72℃で30秒の重合を30回繰り返した後、72℃で7分間の重合反応を行った。その結果、それぞれ700bpのDNA断片を得た。
コリネバクテリウム・グルタミカム内で複製が不可能なpDZベクターと上記増幅したssuD遺伝子断片を染色体導入用制限酵素SmaIで処理した後、isothermal assembly cloning反応後、大腸菌DH5αに形質転換し、カナマイシン(25mg/l)が含まれたLB固体培地に塗抹した。PCRを通じて目的とした遺伝子の欠損した断片が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、プラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、pDZ-ΔSsuDと命名した。
実施例４－２：ssuD遺伝子が欠損した菌株の製作及び培養
実施例4-1で製作したpDZ-ΔSsuD、ベクターを染色体上における相同組換えにより13032/ΔmcbR菌株にそれぞれ電気穿孔法で形質転換させた(van der Rest et al.、Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545、1999)。その後、スクロースを含んでいる固体培地で2次組換えを行った。2次組換えが完了した上記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号13、14を用いてPCR法を通じてssuD遺伝子が欠損した菌株を確認し、本組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムCM02-0618/ΔSsuDと命名した。
実施例４－３：ssuD遺伝子が欠損した菌株のメチオニン生産能の分析
上記製作されたCM02-0618/ΔSsuD菌株のL-メチオニン生産能を分析するために、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032菌株と共に下記のような方法で培養した。
下記種培地25mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコにコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032と実施例2で製作されたコリネバクテリウム・グルタミカムCM02-0618、製作されたCM02-0618/ΔSsuDを接種し、30℃で20時間、200rpmで振盪培養した。その後、生産培地24mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに1mlの種培養液を接種し、30℃で48時間、200rpmで振盪培養した。上記種培地と生産培地の組成は、それぞれ下記の通りである。
<種培地(pH 7.0)>
ブドウ糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4 g、K2HPO4 8 g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミンHCl 1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド2000μg (蒸溜水1リットルを基準)
<生産培地(pH 8.0)>
ブドウ糖50g、(NH4)2S2O3 12g、Yeast extract 5g、KH2PO4 1g、MgSO4・7H2O 1.2g、ビオチン100μg、チアミン塩酸塩1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド3000μg、CaCO3 30 g (蒸溜水1リットルを基準)。
上記培養方法で培養し、培養液中のL-メチオニン濃度を分析して表3に示した。
その結果、ssuD遺伝子を除去することにより対照群菌株比L-メチオニン生産能が 約50％の水準に減少することを確認することができた。これを通じてSsuDタンパク質がチオスルフェートの利用に関与するタンパク質であることを確認した。
実施例５：ssuD 遺伝子発現が増加した菌株の製作及び培養
実施例3においてチオスルフェートに特異的に反応するタンパク質として選別したSsuDの活性強化のためにベクターを製作した。
実施例 ５－１：ssuD 遺伝子発現の増加のためのベクターの製作
ssuD遺伝子をコリネバクテリウムATCC13032染色体上に追加挿入させるために、下記方法で組換えプラスミドベクターを製作した。
まず、ssuD遺伝子を挿入するためにNcgl1464(Transposase)を除去するためのベクターを製作した。
米国の国立衛生研究所の遺伝子銀行(NIH Genbank)に報告された塩基配列に基づいてコリネバクテリウム・グルタミカムのNcgl1464及び周辺配列(配列番号15)を確保した。Ncgl1464遺伝子を欠損させるために、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032の染色体DNAを鋳型として配列番号16及び配列番号17、配列番号18及び配列番号19のプライマーを用いてPCRを行った。PCR条件は、95℃で5分間の変性後、95℃で30秒の変性、53℃で30秒のアニーリング、72℃で30秒の重合を30回繰り返した後、72℃で7分間の重合反応を行った。その結果、それぞれDNA断片を得た。
コリネバクテリウム・グルタミカム内で複製が不可能なpDZベクターと上記増幅したNcgl1464遺伝子断片を染色体導入用制限酵素SmaIで処理した後、isothermal assembly cloning反応後、大腸菌DH5αに形質転換し、カナマイシン(25mg/l)が含まれたLB固体培地に塗抹した。PCRを通じて目的とした遺伝子の欠損した断片が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、プラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、pDZ-ΔNcgl1464と命名した。
次に、ssuD遺伝子断片を獲得するための目的で、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032の染色体DNAを鋳型として配列番号20及び配列番号21を用いてPCRを行った。また、ssuD遺伝子の発現強化のためにPgapAプロモーターを用い、これを獲得するための目的でコリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032染色体DNAを鋳型として配列番号22、23を用いてPCRを行った。PCR条件は、95℃で5分間の変性後、95℃で30秒の変性、53℃で30秒のアニーリング、72℃で30秒の重合を30回繰り返した後、72℃で7分間の重合反応を行った。その結果、ssuD遺伝子断片及びgapAプロモーター断片を獲得することができた。
コリネバクテリウム・グルタミカム内で複製が不可能なpDZ-ΔNcgl1464ベクターを制限酵素ScaIで処理した後、上記増幅した2個のDNA断片と共にIST反応後、大腸菌DH5αに形質転換し、カナマイシン(25mg/l)が含まれたLB固体培地に塗抹した。PCRを通じて目的とした遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、プラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、pDZ-ΔNcgl1464-PgapASsuDと命名した。
実施例５－２：ssuD遺伝子発現が強化された菌株の製作及び培養
実施例5-1で製作されたPDZ-ΔNcgl1464及びpDZ-ΔNcgl1464-PgapASsuD 、ベクターを染色体上における相同組換えによりCM02-0618菌株にそれぞれ電気穿孔法で形質転換させた(van der Rest et al.、Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545、1999)。その後、スクロースを含んでいる固体培地で2次組換えを行った。2次組換えが完了した上記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号24、25を用いてPCR法を通じてNcgl1464が欠損した菌株及びNcgl1164が欠損しながらssuD遺伝子が挿入された菌株を確認した。Ncgl1464が欠損した菌株はCM02-0618/ΔNcgl1464と命名し、Ncgl1164が欠損しながらssuD遺伝子が挿入された菌株はCM02-0736と命名した。
上記CM02-0736はブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2019年5月2日付で寄託し、受託番号KCCM12512Pの付与を受けた。
実施例５－３：ssuD遺伝子発現が強化された菌株のメチオニン生産能の分析
上記製作されたCM02-0618/ΔNcgl1464及びCM02-0736菌株のL-メチオニン生産能を分析するために、親株であるCM02-0618菌株と共に下記のような方法で培養した。
下記種培地25mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコにCM02-0618、CM02-0618/ΔNcgl1464,及びCM02-0736をそれぞれ接種し、30℃で20時間、200rpmで振盪培養した。その後、生産培地24mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに1mlの種培養液を接種し、30℃で48時間、200rpmで振盪培養した。上記種培地と生産培地の組成は、それぞれ下記の通りである。
<種培地(pH 7.0)>
ブドウ糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4 g、K2HPO4 8 g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミンHCl 1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド2000μg (蒸溜水1リットルを基準)
<生産培地(pH 8.0)>
ブドウ糖50g、(NH4)2S2O3 12 g、Yeast extract 5g、KH2PO4 1g、MgSO4・7H2O 1.2g、ビオチン100μg、チアミン塩酸塩1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド3000μg、CaCO3 30g、コバラミン(Vitamin B12) 1μg (蒸溜水1リットルを基準)。
上記培養方法で培養し、培養液中のL-メチオニン濃度を分析して表4に示した。
その結果、ssuD遺伝子の発現を強化することにより対照群菌株比L-メチオニン生産能が50％程度増加することを確認することができた。実施例4で確認したことと同様に、これを通じてSsuDタンパク質がチオスルフェートの利用に関与するタンパク質であるという事実が分かった。
実施例６：チオスルフェートと他のスルホネート(sulfonate)との比較培養
SsuDタンパク質は、本来、スルホネートの脱スルホン(desulfonation)に関与するタンパク質として知られている。スルホネート(sulfonate)はR-S03からなり、その時のRはOrganic groupであるが、チオスルフェートはS-S03からなるため、スルホネートとは異なる。
これについて、スルホネートとの比較実験を通じて硫黄源としてチオスルフェートを用いる場合がメチオニンの生産にどのくらいさらに効果的であるかについて確認することにした。
下記種培地25mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコにコリネバクテリウム・グルタミカムCM02-0618及びCM02-0736を接種し、30℃で20時間、200rpmで振盪培養した。その後、生産培地24mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに1mlの種培養液を接種し、30℃で48時間、200rpmで振盪培養した。上記種培地と生産培地の組成は、それぞれ下記の通りである。
<種培地(pH 7.0)>
ブドウ糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミンHCl 1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド2000μg (蒸溜水1リットルを基準)
<生産培地(pH 8.0)>
ブドウ糖50g、(NH4)2S2O3 12gまたはMethanesulfonate 12gまたはEthanesulfonate 12g(硫黄源に応じて)、Yeast extract 5g、KH2PO4 1 g、MgSO4・7H2O 1.2 g、ビオチン100μg、チアミン塩酸塩1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド3000μg、CaCO330g、コバラミン(Vitamin B12) 1 μg (蒸溜水1リットルを基準)。
上記培養方法で培養し、培養液中のL-メチオニン濃度を分析して表5に示した。
実験の結果、それぞれの菌株でチオスルフェートを硫黄源として用いた場合、スルホネートを硫黄源として用いた場合に比べてメチオニンの生産量が最大600％増加した。
これを通じて、チオスルフェートを硫黄源として用いる場合、メチオニンの生産量が最多であることを確認し、SsuDタンパク質の活性強化がこのようなメチオニン生産量の増加に関与することを確認した。
実施例７：mcbRが欠損せずにmetH、cysIの発現が強化されたメチオニン生産菌株の製作
実施例７－１：metH、cysIを同時に強化する組換えベクターの製作
本出願のSsuDタンパク質活性強化及びチオスルフェートを硫黄源として用いる場合、多様な含硫アミノ酸を製造できるかを確認するために、他のメチオニン生産菌株に上記構成を適用することにした。これについて、mcbRが欠損しないメチオニン生産菌株を製作するために、ATCC13032菌株に基づいて、既に公知となったメチオニン合成酵素をコードするmetH(Ncgl1450)、亜硫酸レダクターゼをコードするcysI(Ncgl2718)の発現を同時に強化するためにベクターを製作した。
具体的には、metH及びcysI遺伝子をコリネバクテリウムATCC13032染色体上で追加挿入させるために、下記方法で組換えプラスミドベクターを製作した。米国の国立衛生研究所の遺伝子銀行(NIH Genbank)に報告された塩基配列に基づいてコリネバクテリウム・グルタミカムのmetH遺伝子及び周辺配列(配列番号26)とcysI遺伝子及び周辺配列(配列番号27)を確保した。
まず、これらを挿入するためにNcgl1021(Transposase)を除去するためのベクターを製作した。米国の国立衛生研究所の遺伝子銀行(NIH Genbank)に報告された塩基配列に基づいてコリネバクテリウム・グルタミカムのNcgl1021及び周辺配列(配列番号28)を確保した。欠損したNcgl1021遺伝子を獲得するための目的で、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032の染色体DNAを鋳型として配列番号29及び配列番号30、配列番号31及び配列番号32のプライマーを用いてPCRを行った。PCR条件は、95℃で5分間の変性後、95℃で30秒の変性、53℃で30秒のアニーリング、72℃で30秒の重合を30回繰り返した後、72℃で7分間の重合反応を行った。その結果、それぞれDNA断片を得た。コリネバクテリウム・グルタミカム内で複製が不可能なpDZベクターと上記増幅したNcgl1021遺伝子断片を染色体導入用制限酵素XbaIで処理した後、isothermal assembly cloning反応後、大腸菌DH5αに形質転換し、カナマイシン(25mg/l)が含まれたLB固体培地に塗抹した。PCRを通じて目的とした遺伝子の欠損した断片が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、プラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、pDZ-ΔNcgl1021と命名した。
次に、metH及びcysI遺伝子を獲得するための目的で、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032の染色体DNAを鋳型として配列番号33及び配列番号34、配列番号35及び配列番号36のプライマーを用いてPCRを行い、また、metH遺伝子の発現強化のために、Pcj7プロモーター及びcysI遺伝子の発現強化のためにPspl1プロモーターを用い、これを獲得するための目的で、まず、Pcj7の場合、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC6872染色体DNAを鋳型として配列番号37、38を用いてPCRを行い、Pspl1は既に公知となったspl1-GFP(US 10584338 B2)ベクターDNAを鋳型として配列番号39、40を用いてPCRを行った。PCR条件は、95℃で5分間の変性後、95℃で30秒の変性、53℃で30秒のアニーリング、72℃で30秒の重合を30回繰り返した後、72℃で7分間の重合反応を行った。その結果、metH遺伝子及びcysI、Pcj7プロモーター(US 7662943 B2)及びPspl1プロモーター(US 10584338 B2)DNA断片を確保した。
コリネバクテリウム・グルタミカム内で複製が不可能なPDZ-ΔNcgl1021ベクターを制限酵素ScaIで処理した後、上記増幅した4個のDNA断片を染色体導入用制限酵素ScaIで処理した後、IST反応後、大腸菌DH5αに形質転換し、カナマイシン(25mg/l)が含まれたLB固体培地に塗抹した。PCRを通じて目的とした遺伝子の欠損した断片が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、プラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、pDZ-ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysIと命名した。
実施例７－２：L-メチオニン生産菌株の開発及びこれを用いたL-メチオニン生産の確認
実施例7-1で製作されたpDZ-ΔNcgl1021及びpDZ-ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI ベクターを染色体上における相同組換えによりATCC13032菌株にそれぞれ電気穿孔法で形質転換させた(van der Rest et al.、Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545、1999)。その後、スクロースを含んでいる固体培地で2次組換えを行った。2次組換えが完了した上記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号41、42を用いてPcj7-metH-Pspl1cysI遺伝子の挿入を確認した。本組換え菌株は、それぞれコリネバクテリウム・グルタミカム13032/ΔNcgl1021(pDZ-ΔNcgl1021で形質転換した菌株)、 CM02-0753 (pDZ-ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysIで形質転換した菌株)と命名した。
上記製作された13032/ΔNcgl1021、CM02-0753菌株のL-メチオニン生産能を分析するために、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032菌株と共に下記のような方法で培養した。
下記種培地25mlを含有する250mlのコーナー-バッフルフラスコにコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032と発明菌株コリネバクテリウム・グルタミカム13032/ΔNcgl1021、CM02-0753を接種し、30℃で20時間、200rpmで振盪培養した。その後、生産培地24mlを含有する250mlのコーナー-バッフルフラスコに1mlの種培養液を接種し、30℃で48時間、200rpmで振盪培養した。上記種培地と生産培地の組成は、それぞれ下記の通りである。
<種培地(pH 7.0)>
ブドウ糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミンHCl 1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド2000μg (蒸溜水1リットルを基準)
<生産培地(pH 8.0)>
ブドウ糖50g、(NH4)2S2O3 12 g、Yeast extract 5g、KH2PO4 1 g、MgSO4・7H2O 1.2 g、ビオチン100μg、チアミン塩酸塩1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド3000μg、CaCO3 30g、コバラミン(Vitamin B12) 1 μg (蒸溜水1リットルを基準)。
上記培養方法で培養し、培養液中のL-メチオニン濃度を分析して表6に示した。
その結果、mcbRはそのまま存在し、meth及びcysI過発現菌株は、対照群菌株比L-メチオニン生産能が向上したことを確認することができた。これを通じてmcbRが欠損せず、metH及びcysI過発現菌株もメチオニン生産能があることを確認し、以下の実験に用いた。
実施例８：mcbRが存在するL-メチオニン生産株基盤SsuD活性強化菌株の開発及びL-メチオニン生産能の確認
実施例7で製作したメチオニン生産菌株を基盤としてSsuDタンパク質活性を強化した菌株を製作した後、L-メチオニン生産能を確認した。
実施例８－１：SsuD活性強化菌株の製作
具体的には、実施例5で製作されたpDZ-ΔNcgl464-PgapASsuDベクターを染色体上における相同組換えにより実施例7のCM02-0753菌株に電気穿孔法で形質転換させた(van der Rest et al.、Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545、1999)。その後、スクロースを含んでいる固体培地で2次組換えを行った。
2次組換えが完了した上記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号23、24を用いてNcgl1464位置にPgapA-SsuD遺伝子が十分に挿入されたかを確認した。製作された組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムCM02-0756と命名した。
上記CM02-0756は、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2019年5月2日付で寄託し、受託番号KCCM2513Pの付与を受けた。
実施例８－２：製作された菌株のメチオニン生産能の確認
実施例7のCM02-0753と実施例8-1で製作されたCM02-0756のL-メチオニン生産能を分析するために、下記のような方法で培養した。
下記種培地25mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコにコリネバクテリウム・グルタミカムCM02-0753、CM02-0756を接種し、30℃で20時間、200rpmで振盪培養した。その後、生産培地24mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに1mlの種培養液を接種し、30℃で48時間、200rpmで振盪培養した。上記種培地と生産培地の組成は、それぞれ下記の通りである。
<種培地(pH 7.0)>
ブドウ糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミンHCl 1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド2000μg (蒸溜水1リットルを基準)
<生産培地(pH 8.0)>
ブドウ糖50g、(NH4)2S2O3 12 g、Yeast extract 5g、KH2PO4 1 g、MgSO4・7H2O 1.2 g、ビオチン100μg、チアミン塩酸塩1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド3000μg、CaCO3 30g、コバラミン(Vitamin B12) 1 μg (蒸溜水1リットルを基準)。
上記培養方法で培養し、培養液中のL-メチオニン濃度を分析して表7に示した。
その結果、mcbRが存在するメチオニン菌株でもSsuD活性を強化した時、チオスルフェートを硫黄源として使用時に、メチオニンの収率が増加することを確認することができた。
このような結果は、本出願で新たに機能を確認したチオスルフェートりの使用に関与するタンパク質であるSsuDの活性を強化させた時、硫黄源であるチオスルフェートを基盤に含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体を製造できることを示唆するものである。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

Claims (11)

  1. 遺伝的に変形された微生物を、チオスルフェートを含む培地で培養することを含む含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体の製造方法であって、上記微生物は、非変形微生物に比べてssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質の活性が増加する遺伝的変形を有するものであり、
    上記微生物は、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)またはエシェリキア属(Escherichia sp.)微生物である、製造方法。
  2. 上記ssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質は、チオスルフェート還元酵素(thiosulfate reductase)の活性を有するものである、請求項１に記載の含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体の製造方法。
  3. 上記ssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質は、配列番号43のアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の製造方法。
  4. 上記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)、コリネバクテリウム・デセルティ(Corynebacterium deserti)、コリネバクテリウム・クレナタム(Corynebacterium crenatum)またはエシェリキア・コリ(Escherichia coli)である、請求項１に記載の製造方法。
  5. 上記方法は、上記微生物または培養培地から含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体を回収することを含む、請求項１に記載の製造方法。
  6. 上記タンパク質活性が増加する遺伝的変形は、i)上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加、ii)上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現調節領域を活性が強力な配列で交換、iii)上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの開始コドンまたは5'-UTR変形、iv)上記タンパク質の活性が強化するように染色体上のポリヌクレオチド配列を変形、v)上記タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチドまたは上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの導入、またはvi)その組合わせである、請求項１に記載の製造方法。
  7. 上記含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体は、メチオニン(methionine)、システイン(cysteine)、シスチン(cystine)、ランチオニン(lanthionine)、ホモシステイン(homocysteine)、ホモシスチン(homocystine)、ホモランチオニン(homolanthionine)、タウリン(taurine)の中から選択されるいずれか一つ以上である、請求項１に記載の製造方法。
  8. 非変形微生物に比べてssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質活性が内在的増加する遺伝的変形を有する、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)またはエシェリキア属(Escherichia sp.)の微生物、またはその培養物;及びチオスルフェートを含む、含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体製造用組成物。
  9. コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)またはエシェリキア属(Escherichia sp.)のssuD遺伝子によりコーディングされるタンパク質の、チオスルフェート還元酵素としての使用。
  10. 非変形微生物に比べてssuD遺伝子によりコーディングされ、チオスルフェート還元酵素活性を有するタンパク質活性が増加する遺伝的変形を有する、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)またはエシェリキア属(Escherichia sp.)の微生物の含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体製造のための使用。
  11. 培地中の微生物の培養物であって、前記培地においてチオスルフェートが前記微生物の唯一の硫黄源であり、前記微生物は、含硫アミノ酸または含硫アミノ酸誘導体を生産し、かつ、ssuD遺伝子によりコーディングされるチオスルフェート還元酵素活性を有するタンパク質の活性が非変形微生物に比べて増加する遺伝的変形を含み、
    上記微生物は、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)またはエシェリキア属(Escherichia sp.)微生物である、培地中の微生物の培養物。
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