JP7445966B2

JP7445966B2 - 糖鎖を解析する方法

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Publication number: JP7445966B2
Application number: JP2020053296A
Authority: JP
Inventors: 浩章舘野
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2020-03-24
Filing date: 2020-03-24
Publication date: 2024-03-08
Anticipated expiration: 2040-03-24
Also published as: US20230117360A1; WO2021193199A1; JP2021151206A

Description

本発明は、糖鎖を解析する方法に関する。より詳細には、本発明は、糖鎖を解析する方法、糖鎖を解析するためのキット及び糖鎖結合物質に関する。

細胞の表面には様々なタンパク質や脂質が存在する。これらの中には糖鎖修飾されているものも多く、細胞の表面は多種多様な糖鎖に覆われていることが知られている。

糖鎖は、細胞間相互作用を媒介する等の機能を有しており、また、細胞の種類や状態に応じて変化することが知られている。例えば、糖鎖を細胞の未分化マーカーや癌マーカーとして利用できることが知られている。

従来、糖鎖の解析は、レクチンや抗体を用いて細胞等を染色する方法、液体クロマトグラフィー及び質量分析装置を用いる方法、多種類のレクチンを基板上に固定化したレクチンアレイを利用する方法等により行われてきた（例えば、特許文献１を参照。）。

国際公開第２０１０／１３１６４１号

しかしながら、レクチンや抗体を用いて細胞等を染色する方法では、糖鎖の全体像を把握することが困難な場合がある。また、液体クロマトグラフィー及び質量分析装置を用いる方法は、多大な労力、時間、多くのサンプルを必要とするものである。

一方、レクチンアレイを用いる方法によれば、比較的簡便に糖鎖を解析することができる。しかしながら、細胞を破壊して抽出したタンパク質を解析するため、実際の生きた細胞のグライコームを解析することが困難な場合がある。また、５００ｎｇ程度のタンパク質を解析に用いる必要があり、１細胞レベルでの糖鎖の解析を行うことができない。このため、特に組織切片の解析が困難である。また、レクチンアレイの作製は、特殊なスポッターを用いて行われるが、ロット間差が生じてしまい、均一なレクチンアレイを作製することが困難な傾向にある。このため、レクチンアレイを用いる方法では、再現性よい解析結果を得ることが困難な場合がある。また、レクチンアレイを用いる糖鎖の解析では、検出に特殊で高価なスキャナーが必要である。このような背景のもと、本発明は、糖鎖を解析する新たな技術を提供することを目的とする。

本発明は以下の態様を含む。
［１］細胞の表面の糖鎖を解析する方法であって、前記細胞に、核酸標識された糖鎖結合物質を接触させることと、前記細胞に結合した前記糖鎖結合物質に標識された前記核酸を検出することと、を含み、前記核酸の種類及び量が、前記細胞の表面の糖鎖の種類及び量に対応する、方法。
［２］前記糖鎖と共に、前記細胞の表現型又は前記細胞内のＲＮＡ情報を更に解析する、請求項１に記載の方法。
［３］前記細胞に、核酸標識された前記糖鎖結合物質を接触させることが、アルブミンを含む緩衝液中で行われる、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］１細胞レベルで行われる、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記検出が、リアルタイム定量ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ又は次世代シーケンサーによるシーケンスにより行われる、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］核酸標識された糖鎖結合物質。
［７］［６］に記載の糖鎖結合物質を含む、細胞の表面の糖鎖を解析するためのキット。

本発明によれば、糖鎖を解析する新たな技術を提供することができる。

実験例１において、精製した各融合タンパク質をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で分離後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色した結果を示す写真である。実験例１におけるアガロース電気泳動の結果を示す写真である。実験例２において、核酸標識レクチンの調製の各過程の試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、銀染色した結果を示す写真である。実験例３において、核酸標識レクチンの調製の各過程の試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、銀染色した結果を示す写真である。実験例４において、核酸標識レクチンの精製の各過程の試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、銀染色した結果を示す写真である。実験例５において、核酸標識レクチンの精製の各過程の試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、銀染色した結果を示す写真である。（ａ）は、実験例６におけるリアルタイム定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例６におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。実験例７におけるリアルタイム定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。（ａ）～（ｅ）は、実験例８におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。実験例９におけるフローサイトメトリー解析及びリアルタイム定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。（ａ）は、実験例１０におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１０におけるリアルタイム定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。図１１（ａ）及び（ｂ）の結果に基づいて、フローサイトメトリー解析の結果を横軸に、リアルタイム定量ＰＣＲの結果を縦軸に示したグラフである。実験例１１におけるリアルタイム定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。実験例１２の結果を示す図である。実験例１３の結果を示すグラフである。実験例１４の結果を示すグラフである。（ａ）及び（ｂ）は、実験例１５の結果を示すグラフである。（ａ）及び（ｂ）は、実験例１６において、細胞の表面の糖鎖及び細胞内のＲＮＡを１細胞レベルで解析した代表的な結果を示すグラフである。（ａ）は、実験例１７において、神経に分化誘導したｉＰＳ細胞の糖鎖プロファイルを主成分分析した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１７において、神経に分化誘導したｉＰＳ細胞のマーカー遺伝子の発現量を解析した結果を示すグラフである。（ａ）は、実験例１７において、ヒトｉＰＳ細胞に対するｒＢＣ２ＬＣＮレクチンの結合量と、２７，６８６種類の遺伝子群の発現量の相関係数を算出し、数値が大きい順に並べた結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１７において、各細胞に対するｒＢＣ２ＬＣＮレクチンの結合量と、各細胞におけるＰＯＵ５Ｆ１遺伝子の発現量を示す散布図である。（ｃ）は、実験例１７において、各細胞に対するｒＢＣ２ＬＣＮレクチンの結合量と、各細胞におけるＶＩＭ遺伝子の発現量を示す散布図である。（ａ）は、実験例１７において、各細胞におけるＰＯＵ５Ｆ１遺伝子の発現量と、３９種のレクチンの結合量との相関係数を算出し、高い順に並べた図である。（ｂ）は、実験例１７において、各細胞におけるＯＴＸ２遺伝子の発現量と、３９種のレクチンの結合量との相関係数を算出し、高い順に並べた図である。

［核酸標識された糖鎖結合物質］
１実施形態において、本発明は、核酸標識された糖鎖結合物質を提供する。後述するように、本実施形態の糖鎖結合物質を用いることにより、細胞の表面の糖鎖を簡便に高感度で解析することができる。

糖鎖結合物質としては、糖鎖構造を認識して特異的に結合する物質であれば特に限定されず、例えば、レクチン、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体断片としては、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。

本明細書では、レクチンは糖鎖に結合する活性を有するタンパク質の総称と定義する。レクチンとしては、特に限定されず、例えば、下記表１～５に記載のレクチンを好適に使用することができる。表１～５中、「Ｎａｔｕｒａｌ」は天然物由来であることを示し、「Ｅ．ｃｏｌｉ」は遺伝子組み換え体であることを示す。また、「ＥＹＬａｂ．」はＥＹラボラトリーズ社を示し、「Ｗａｋｏ」は富士フイルム和光純薬株式会社を示し、「Ｓｅｉｋａｇａｋｕ」は生化学工業株式会社を示し、「Ｖｅｃｔｏｒ」はベクターラボラトリース社を示し、「ＪＯＭ」は株式会社Ｊ－オイルミルズを示し、「ＡＩＳＴ」は産業技術総合研究所を示す。入手先が「ＡＩＳＴ」であるレクチンは発明者らが調製したものである（Tateno H., et al., Glycome diagnosis of human induced pluripotent stem cells using lectin microarray, J Biol Chem., 286 (23), 20345-20353, 2011. を参照。）

また、「Ｓｉａ」はシアル酸を示し、「ＧｌｃＮＡｃ」はＮ－アセチル－グルコサミンを示し、「Ｍａｎ」はマンノースを示し、「Ｇａｌ」はＤ－ガラクトースを示し、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ－アセチル－ガラクトサミンを示し、「Ｆｕｃ」はＬ－フコースを示し、「Ｇｌｃ」はＤ－グルコースを示し、「ＬａｃＮＡｃ」はＮ－アセチル－ラクトサミンを示す。

レクチンとしては、糖鎖修飾されていない大腸菌由来の組み換えレクチンが好ましい。また、網羅的に糖鎖を解析するために、糖鎖を構成する単糖であるＳｉａ、Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ、Ｆｕｃ、ＧａｌＮＡｃを認識するレクチンを混合して用いることが好ましい。

糖鎖結合物質を標識する核酸は、例えば環状核酸であってもよく、例えば１本鎖核酸断片であってもよく、例えば２本鎖核酸断片であってもよい。環状核酸としては、例えばプラスミドＤＮＡ等が挙げられる。また、糖鎖結合物質を標識する核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、安定性の観点からはＤＮＡであることが好ましい。

特定の種類の糖鎖結合物質には特定の種類の核酸を標識することが好ましい。例えば、糖鎖結合物質の種類とこれを標識する核酸の塩基配列を対応させることにより、糖鎖結合物質をコード化することが可能となる。したがって、糖鎖結合物質を標識する核酸の塩基配列は、天然に存在しない塩基配列であることが好ましい。糖鎖結合物質を標識する核酸に特異的な塩基配列を検出することにより、それに対応する糖鎖結合物質の存在を検出することができる。

また、糖鎖結合物質に結合した核酸をＰＣＲ等により増幅することにより、糖鎖結合物質の存在を示すシグナルを増幅することができる。これにより、例えば検出感度を高めることができる。

糖鎖結合物質を標識する核酸が、１本鎖核酸断片又は２本鎖核酸断片である場合、その長さは、糖鎖の結合に影響を及ぼさず、対応する糖鎖結合物質を示す情報を保持することができる限り特に限定されず、例えば数十塩基（又は塩基対）から数十キロ塩基（又は塩基対）であってもよい。また、核酸はプラスミド等の環状ＤＮＡであってもよい。

後述するように、糖鎖結合物質を標識する核酸は、リアルタイム定量ＰＣＲで検出してもよく、デジタルＰＣＲで検出してもよく、次世代シーケンサーによるシーケンスにより検出してもよい。

したがって、糖鎖結合物質を標識する核酸は、ＰＣＲ用プライマーがハイブリダイズすることが可能な塩基配列領域を更に有していることが好ましい。また、糖鎖結合物質を標識する核酸を次世代シーケンサーによるシーケンスにより検出する場合、糖鎖結合物質を標識する核酸は、ブリッジＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ等の次世代シーケンス用の前処理を可能にする塩基配列を更に有していることが好ましい。

糖鎖結合物質を標識する核酸の長さは、５０～１００塩基であることが特に好ましい。このうち、糖鎖結合物質をコード化するための塩基配列が１０～３０塩基であり、その５’側及び３’側にそれぞれ１０～３０塩基のアダプター配列を付加することが好ましい。糖鎖結合物質をコード化するための塩基配列は、塩基の偏りがないように選択する。

また、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列は、上記アダプター配列に相補的な配列に加えて、多種類の細胞を識別するための塩基配列（５～１０塩基）、及び、次世代シーケンスにおいて、フローセルにハイブリダイズさせるための塩基配列（２０～３０塩基）を含むことが好ましい。

実施例において後述するように、糖鎖結合物質への核酸の結合は、例えば、糖鎖結合物質に核酸結合ドメインを連結させ、当該核酸結合ドメインに核酸を結合させることにより行ってもよいし、化学リンカーを用いて糖鎖結合物質と核酸を結合させてもよいし、クリック反応を用いて糖鎖結合物質と核酸を結合させてもよい。

化学リンカーを利用可能とするために、核酸にはアミノ基、ＳＨ基等の官能基を導入してもよい。また、クリック反応を利用可能とするために、核酸にアジド基、アルキン基等を導入してもよい。これらの基の導入は、核酸の化学合成等により行うことができる。

また、糖鎖結合物質と核酸との間には、スペーサーが存在していてもよい。スペーサーは、特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール鎖、ポリアクリルアミド鎖、ポリエステル鎖、ポリウレタン鎖、これらのコポリマー等が挙げられる。スペーサーは化学リンカーに由来するものであってもよい。

また、スペーサーは切断可能な基を含んでいてもよい。例えば、実施例において後述するように、スペーサーが、光照射により切断可能な基を含んでいる場合、核酸標識された糖鎖結合物質に光を照射することにより、糖鎖結合物質から核酸を切り離して回収すること等が可能になる。

［糖鎖を解析する方法］
１実施形態において、本発明は、細胞の表面の糖鎖を解析する方法であって、前記細胞に、核酸標識された糖鎖結合物質を接触させることと、前記細胞に結合した前記糖鎖結合物質に標識された前記核酸を検出することと、を含み、前記核酸の種類及び量が、前記細胞の表面の糖鎖の種類及び量に対応する方法を提供する。

細胞としては、特に限定されず、微生物（ウイルス、細菌、真菌）、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞等が挙げられる。また、試料として組織切片等を用いることもできる。細胞や組織切片は、細胞が生きた状態であってもよく、固定されていてもよい。

本実施形態の方法では、まず、解析対象の細胞に、核酸標識された糖鎖結合物質を接触させる。核酸標識された糖鎖結合物質としては上述したものを用いることができる。

核酸標識された糖鎖結合物質は１種類を単独で細胞に接触させてもよいし、２種類以上を混合して細胞に接触させてもよい。多種類の核酸標識された糖鎖結合物質を同時に細胞に接触させることにより、細胞の表面の糖鎖構造を網羅的に解析することが可能になる。

細胞と核酸標識された糖鎖結合物質との接触は、培地中、生理食塩水中、緩衝液中等の溶液中で、細胞と核酸標識された糖鎖結合物質を混合すること等により行うことができる。

中でも、細胞と核酸標識された糖鎖結合物質との接触を、アルブミンを含む緩衝液中で行うことが好ましい。実施例において後述するように、細胞と核酸標識された糖鎖結合物質との接触を、アルブミンを含む緩衝液中で行うことにより、検出シグナルを格段に増強させることができる。

緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等が挙げられる。リン酸緩衝生理食塩水の組成としては、例えば、ＮａＣｌ１３７ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＣｌ２．７ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４１．７６ｍｍｏｌ／Ｌが挙げられる。また、リン酸緩衝生理食塩水のｐＨは７．４程度に調整されていることが好ましい。

アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン等を用いることができる。アルブミンは組換え体であってもよい。緩衝液中のアルブミンの濃度は０．１～１０質量％程度が好ましい。

解析対象の細胞に接触させる、核酸標識された糖鎖結合物質の量は、細胞１個に対して、核酸標識された糖鎖結合物質１種類あたり、１分子以上を接触させればよく、細胞の表面に存在する糖鎖を飽和させることができる量であることが好ましい。

また、解析対象の細胞に、核酸標識された糖鎖結合物質を接触させる時間は、糖鎖結合物質が解析対象の細胞の表面の糖鎖に結合するのに十分な時間であれば特に限定されず、例えば１０分間～２４時間程度であってもよく、例えば１０分間～８時間程度であってもよく、例えば１０分間～３時間程度であってもよく、例えば１時間程度であってもよい。また、核酸標識された糖鎖結合物質を接触させる温度は、糖鎖結合物質が解析対象の細胞の表面の糖鎖に結合する温度であれば特に限定されず、例えば４～３７℃程度であってよい。

解析対象の細胞に核酸標識された糖鎖結合物質を接触させた結果、糖鎖結合物質が解析対象の細胞の表面の糖鎖に結合する。ここで、未反応の糖鎖結合物質を除去することが好ましい。未反応の糖鎖結合物質の除去は、例えば、緩衝液を加えて細胞を遠心して上清を除去する操作を１～数回繰り返すことにより行うことができる。

続いて、細胞に結合した糖鎖結合物質に標識された核酸を検出する。ここで、核酸の検出は、核酸標識された糖鎖結合物質が細胞に結合した状態で行ってもよいし、核酸標識された糖鎖結合物質を細胞から解離させ、更に、核酸標識された糖鎖結合物質を細胞から分離した後に行ってもよいし、核酸標識された糖鎖結合物質から、核酸を切り離して回収した後に行ってもよい。

核酸標識された糖鎖結合物質を細胞から解離させる方法としては、例えば、細胞に糖鎖結合物質と競合する糖を反応させる方法、界面活性剤を作用させて糖鎖結合物質と細胞の表面の糖鎖との結合を解離させる方法、ｐＨを変化させて糖鎖結合物質と細胞の表面の糖鎖との結合を解離させる方法、還元剤を作用させて糖鎖結合物質と細胞の表面の糖鎖との結合を解離させる方法等が挙げられる。

また、上述したように、核酸と糖鎖結合物質との間に切断可能な基を導入していた場合、核酸標識された糖鎖結合物質から、核酸を切り離して回収することができる。例えば、予め核酸と糖鎖結合物質との間に光照射により切断可能な基を導入していた場合、光を照射することにより、核酸標識された糖鎖結合物質から、核酸を切り離すことができる。その後、例えば遠心分離して上清を回収することにより、核酸を回収することができる。

細胞に結合した糖鎖結合物質に標識された核酸の検出は、例えば、リアルタイム定量ＰＣＲにより行ってもよいし、デジタルＰＣＲにより行ってもよいし、次世代シーケンサーによるシーケンスにより行ってもよい。核酸をＰＣＲ等により増幅することにより、検出シグナルを増幅し、検出感度を高めることができる。ここで、検出された核酸の種類及び量が、細胞の表面の糖鎖の種類及び量に対応する。

ここで、核酸の種類とは、糖鎖結合物質に標識された核酸の塩基配列の種類である。核酸の種類を特定することにより、核酸が標識されていた糖鎖結合物質の種類を特定することができる。したがって、核酸の塩基配列を特定することにより、解析対象の細胞の表面に存在していた糖鎖構造を特定することができる。また、特定の塩基配列を有する核酸の量が、解析対象の細胞に結合した糖鎖結合物質の量に対応する。すなわち、特定の塩基配列を有する核酸の量が、解析対象の細胞の表面に存在する特定の糖鎖構造の量に対応する。これにより、解析対象の細胞の表面に存在する糖鎖構造の種類及び量を定量的に解析することができる。

リアルタイム定量ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、次世代シーケンスは、汎用的な装置を用いて行うことができる。したがって、これらの装置が既に存在する場合には、糖鎖の解析のために新たに特殊な装置を用意しなくてもよい。

また、実施例において後述するように、本実施形態の方法は、検出感度が高いため、細胞の表面の糖鎖の解析を１細胞レベルで行うことも可能である。ここで、１細胞レベルで糖鎖を解析するとは、１個の細胞を試料に用いて、核酸標識された糖鎖結合物質を接触させ、結合した糖鎖結合物質に標識された核酸を検出し、細胞の表面の糖鎖の種類及び量を特定することを意味する。１細胞レベルでの糖鎖の解析は、従来の方法では行うことができなかった。

また、本実施形態の方法では、細胞の表面から核酸を回収した後も細胞は生存している。このため、細胞表面の糖鎖を解析するとともに、細胞の表現型又は細胞内のＲＮＡ情報を同時に解析することができる。

細胞の表現型としては、例えば、細胞の形態、増殖能、分化能、浸潤能、腫瘍形成能、マーカータンパク質の発現等が挙げられる。また、細胞内の遺伝子情報又は細胞の表現型も１細胞レベルで解析することが可能である。細胞内のＲＮＡ情報としては、例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ等の、塩基配列情報又は発現量の情報等が挙げられる。

［キット］
１実施形態において、本発明は、上述した、核酸標識された糖鎖結合物質を含む、細胞の表面の糖鎖を解析するためのキットを提供する。本実施形態のキットを用いることにより、上述した細胞の表面の糖鎖の解析を好適に行うことができる。

本実施形態のキットは、核酸標識された糖鎖結合物質を１種類含んでいてもよいし、２種類以上、例えば１０種類以上、例えば３０種類以上、例えば５０種類以上、例えば１００種類以上含んでいてもよい。本実施形態のキットが、核酸標識された糖鎖結合物質を多種類含んでいると、細胞の表面に存在する糖鎖構造を網羅的に解析することが容易となるため好ましい。

本実施形態のキットは、解析対象の細胞に、核酸標識された前記糖鎖結合物質を接触させる溶媒として、アルブミンを含む緩衝液を更に含んでいてもよい。アルブミンを含む緩衝液については、上述したものと同様である。実施例において後述するように、細胞と核酸標識された糖鎖結合物質との接触を、アルブミンを含む緩衝液中で行うことにより、バクグラウンドを抑制させることができる。

また、本実施形態のキットは、糖鎖結合物質に結合した核酸を検出するためのプライマーを更に含んでいてもよい。当該プライマーを用いたリアルタイム定量ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、次世代シーケンス等により、糖鎖結合物質に結合した核酸を検出することができる。

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［レクチン］
下記表６に示すレクチンを使用した。また、各レクチンを核酸標識する場合には、下記表６に示す配列番号の塩基配列からなる核酸で標識した。表６中、「Ｓｅｉｋａｇａｋｕ」は生化学工業株式会社を示し、「Ｖｅｃｔｏｒ」はベクターラボラトリース社を示し、「ＡＩＳＴ」は産業技術総合研究所を示し、「Ｗａｋｏ」は富士フイルム和光純薬株式会社を示し、「ＪＯＭ」は株式会社Ｊ－オイルミルズを示す。また、「リアルタイムＰＣＲ用」は、後述する実験例においてリアルタイムＰＣＲ解析に用いた塩基配列の配列番号であることを示し、「次世代シーケンス用」は、後述する実験例において次世代シーケンスに用いた塩基配列の配列番号であることを示す。

［実験例１］
（核酸標識レクチンの調製１）
核酸標識レクチンの調製を試みた。まず、レクチンと核酸結合ドメインとの融合タンパク質を調製した。レクチンとして、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを使用した。ＢＣ２ＬＣＮレクチンのアミノ酸配列を配列番号１に示す。

また、核酸結合ドメインとして、アルギニン残基が４個連続したペプチド（配列番号２、以下、「Ｒ４」という。）、アルギニン残基が５個連続したペプチド（配列番号３、以下、「Ｒ５」という。）、アルギニン残基が６個連続したペプチド（配列番号４、以下、「Ｒ６」という。）、アルギニン残基が７個連続したペプチド（配列番号５、以下、「Ｒ７」という。）、アルギニン残基が１０個連続したペプチド（配列番号６、以下、「Ｒ１０」という。）、及び、ミトコンドリア転写因子Ａ（ＴＦＡＭ）のＨＭＧＢｏｘＡドメイン（配列番号７、以下、「ＴＦＡＭ」という。）を使用した。なお、アルギニンは塩基性であり、リン酸部分を持つ核酸と結合しやすいことが知られている。

まず、各核酸結合ドメインをＣ末端側に結合させた、組換えＢＣ２ＬＣＮレクチン（以下、「ｒＢＣ２ＬＣＮ」という。）の融合タンパク質を大腸菌で発現させて精製した。各融合タンパク質のＮ末端側にはＦＬＡＧタグを導入した。

図１は、精製した各融合タンパク質をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で分離後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色した結果を示す写真である。

図１中、「Ｍ」は分子量マーカーを示し、「ＦＬＡＧ－ｒＢＣ２ＬＣＮ」は核酸結合ドメインを有しない融合タンパク質を示し、「ＦＬＡＧ－ｒＢＣ２ＬＣＮ－Ｒ４」は「Ｒ４」を連結した融合タンパク質を示し、「ＦＬＡＧ－ｒＢＣ２ＬＣＮ－Ｒ５」は「Ｒ５」を連結した融合タンパク質を示し、「ＦＬＡＧ－ｒＢＣ２ＬＣＮ－Ｒ６」は「Ｒ６」を連結した融合タンパク質を示し、「ＦＬＡＧ－ｒＢＣ２ＬＣＮ－Ｒ７」は「Ｒ７」を連結した融合タンパク質を示し、「ＦＬＡＧ－ｒＢＣ２ＬＣＮ－Ｒ１０」は「Ｒ１０」を連結した融合タンパク質を示し、「ＦＬＡＧ－ｒＢＣ２ＬＣＮ－ＴＦＡＭ」は「ＴＦＡＭ」を連結した融合タンパク質を示す。

続いて、精製した各融合タンパク質とプラスミドＤＮＡ（ｐＣＲ２．１）との結合性を解析した。具体的には、プラスミドＤＮＡ（ｐＣＲ２．１）１μｇと、１、２、３、４、５μｇの各融合タンパク質を混合し、アガロース電気泳動に供した。

図２は、アガロース電気泳動の結果を示す写真である。図２中、「Ｍ」は分子量マーカーを示し、「ｒＢＣ２ＬＣＮ」は核酸結合ドメインを有しない融合タンパク質を示し、「ｒＢＣ２ＬＣＮ－Ｒ４」は「Ｒ４」を連結した融合タンパク質を示し、「ｒＢＣ２ＬＣＮ－Ｒ５」は「Ｒ５」を連結した融合タンパク質を示し、「ｒＢＣ２ＬＣＮ－Ｒ６」は「Ｒ６」を連結した融合タンパク質を示し、「ｒＢＣ２ＬＣＮ－Ｒ７」は「Ｒ７」を連結した融合タンパク質を示し、「ｒＢＣ２ＬＣＮ－Ｒ１０」は「Ｒ１０」を連結した融合タンパク質を示し、「ｒＢＣ２ＬＣＮ－ＴＦＡＭ」は「ＴＦＡＭ」を連結した融合タンパク質を示す。

その結果、アルギニン残基５個以上又はＴＦＡＭを融合させた融合タンパク質は、プラスミドＤＮＡと結合することが明らかとなった。したがって、レクチンと核酸結合ドメインとの融合タンパク質に、核酸を混合することにより、核酸標識レクチンを調製することができることが明らかとなった。

［実験例２］
（核酸標識レクチンの調製２）
市販のキット（Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｏｌｉｇｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｋｉｔ、カタログ番号「Ｓ－９０１１－１」、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ社）を用いて、核酸標識レクチンの調製を試みた。

このキットでは、まず、５’末端又は３’末端がアミノ基修飾されたオリゴヌクレオチドのアミノ基に、Ｎ－スクシンイミジル－４－ホルミルベンズアミド（以下、「Ｓ－４ＦＢ」という。）を結合させて４－ホルミルベンズアミド（４ＦＢ）化オリゴヌクレオチド（「４ＦＢ－オリゴヌクレオチド」）を調製する。

また、タンパク質に、スクシンイミジル－４－ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン（以下、「Ｓ－ＨｙＮｉｃ」という。）を結合させてヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン（ＨｙＮｉｃ）化タンパク質（「ＨｙＮｉｃ－タンパク質」）を調製する。

続いて、上記４ＦＢ－オリゴヌクレオチドと上記ＨｙＮｉｃ－タンパク質を混合すると、両者が共有結合し、核酸標識タンパク質を得ることができる。

本実験例では、キットの説明書にしたがって、ｒＢＣ２ＬＣＮにオリゴヌクレオチドを結合させ、核酸標識レクチンを調製した。レクチンとして、ｒＢＣ２ＬＣＮを使用した。また、核酸として、配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した。

図３は、核酸標識レクチンの調製の各過程の試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、銀染色した結果を示す写真である。図３中、「４ＦＢ－ｏｌｉｇｏ」は４ＦＢ化したオリゴヌクレオチドを表し、「ＨｙＮｉｃ－ｒＢＣ２ＬＣＮ」はＨｙＮｉｃ化したｒＢＣ２ＬＣＮを表し、「Ｃｒｕｄｅｃｏｍｐｌｅｘ」は未精製の反応物を表し、「Ｐｕｒｉｆｉｅｄｃｏｍｐｌｅｘ（ｃｏｎｃ）」は精製し濃縮した反応物を表す。また、「＊」はオリゴヌクレオチドが結合したｒＢＣ２ＬＣＮを示し、矢印はオリゴヌクレオチドが結合していないｒＢＣ２ＬＣＮを示す。

その結果、最終産物（Ｐｕｒｉｆｉｅｄｃｏｍｐｌｅｘ（ｃｏｎｃ））において、オリゴヌクレオチドが結合して分子量が大きくなったｒＢＣ２ＬＣＮが検出された。この結果から、市販のキットを使用することにより、核酸標識レクチンを調製することができることが明らかとなった。

［実験例３］
（核酸標識レクチンの調製３）
アジド基とアルキン基とのクリック反応を利用して、核酸標識レクチンの調製を試みた。具体的には、まず、ｒＢＣ２ＬＣＮに、１５倍、３０倍及び５０倍モル濃度のジベンゾシクロオクチン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ－ＤＢＣＯ）を、それぞれ室温で１時間反応させ、ＤＢＣＯ化した。続いて、ＤＢＣＯ化した各ｒＢＣ２ＬＣＮに、１０倍モル濃度のアジド化オリゴヌクレオチド（配列番号８）を混合し、４℃で一晩反応させた。オリゴヌクレオチドは５’末端をアジド化修飾した。

図４は、各過程の試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、銀染色した結果を示す写真である。図４中、「ＤＢＣＯ－ｒＢＣ２ＬＣＮ」はＤＢＣＯ化したｒＢＣ２ＬＣＮを表し、「１５×」、「３０×」、「５０×」は、それぞれ１５倍、３０倍、５０倍モル濃度のＮＨＳ－ＤＢＣＯを反応させた結果であることを表し、「Ｃｒｕｄｅｃｏｍｐｌｅｘ」は未精製の反応物を表す。また、「＊」はオリゴヌクレオチドが結合したｒＢＣ２ＬＣＮを示し、矢印はオリゴヌクレオチドが結合していないｒＢＣ２ＬＣＮを示す。

その結果、オリゴヌクレオチドが結合して分子量が大きくなったｒＢＣ２ＬＣＮが検出された。この結果から、クリック反応により、効率よく核酸標識レクチンを調製することができることが明らかとなった。

［実験例４］
（核酸標識レクチンの調製４）
アジド基とアルキン基とのクリック反応を利用して、核酸標識レクチンを調製した。具体的には、まず、ｒＢＣ２ＬＣＮに２倍モル濃度のジベンゾシクロオクチン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ－ＤＢＣＯ）を室温で１時間反応させ、ＤＢＣＯ化した。続いて、ＤＢＣＯ化したｒＢＣ２ＬＣＮに、１０倍モル濃度のアジド化オリゴヌクレオチド（配列番号８）を混合して４℃で一晩反応させ、核酸標識レクチンを得た。オリゴヌクレオチドは５’末端をアジド化修飾した。続いて、フコースセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーで核酸標識レクチンを精製した。

図５は、核酸標識レクチンの精製の各過程の試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、銀染色した結果を示す写真である。図５中、「ＤＢＣＯ－ｒＢＣ２ＬＣＮ」はＤＢＣＯ化したｒＢＣ２ＬＣＮを表し、「Ｃｒｕｄｅｃｏｍｐｌｅｘ」は未精製の核酸標識レクチンを表す。また、「Ｔｈｒｏｕｇｈ」は、アフィニティーカラムを通過した試料を表し、「Ｗａｓｈ１」、「Ｗａｓｈ２」、「Ｗａｓｈ３」は、それぞれ洗浄１回目、２回目、３回目の洗浄液を表し、「Ｅｌｕｔｅ１」、「Ｅｌｕｔｅ２」、「Ｅｌｕｔｅ３」は、それぞれ溶出１回目、２回目、３回目の溶出液を表す。また、「＊」はオリゴヌクレオチドが結合したｒＢＣ２ＬＣＮを示し、矢印はオリゴヌクレオチドが結合していないｒＢＣ２ＬＣＮを示す。

その結果、オリゴヌクレオチドが結合して分子量が大きくなったｒＢＣ２ＬＣＮが検出された。この結果から、クリック反応により、核酸標識レクチンが調製されたことが確認された。

続いて、ｒＢＣ２ＬＣＮと同様の方法により、ＡＢＡレクチンの組換え体（ｒＡＢＡ）、ＬＳＬＮレクチンの組換え体（ｒＬＳＬＮ）、ＳＮＡレクチン（カタログ番号「Ｌ－１３００」、Ｖｅｃｔｏｒ社）、ＧＳＬＩＩレクチン（カタログ番号「Ｌ－１２１０」、Ｖｅｃｔｏｒ社）、ＡＡＬレクチンの組換え体（ｒＡＡＬ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、カタログ番号「３０００３６」、生化学工業社）に、上記表６に示すオリゴヌクレオチドを結合させた核酸標識レクチンをそれぞれ調製した。

各レクチンは、各レクチンが結合する糖をそれぞれ固定化したセファロースビーズを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。具体的には、ｒＡＢＡの精製にはＮ－アセチルグルコサミンを固定化したセファロースビーズを使用し、ｒＬＳＬＮの精製にはガラクトースを固定化したセファロースビーズを使用し、ＳＮＡの精製にはラクトースを固定化したセファロースビーズを使用し、ＧＳＬＩＩの精製にはＮ－アセチルグルコサミンを固定化したセファロースビーズを使用し、ｒＡＡＬの精製にはフコースを固定化したセファロースビーズを使用し、ＣｏｎＡの精製にはマンノースを固定化したセファロースビーズを使用した。

精製の各過程の試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、銀染色した結果、ｒＡＢＡ、ｒＬＳＬＮ、ＳＮＡ、ＧＳＬＩＩ、ｒＡＡＬ、ＣｏｎＡのそれぞれを核酸標識できたことが確認された。

［実験例５］
（核酸標識レクチンの調製５）
アジド基とアルキン基とのクリック反応を利用して、光照射により核酸を遊離させることが可能な核酸標識レクチンを調製した。具体的には、まず、ｒＢＣ２ＬＣＮに１６倍モル濃度のＮＨＳ－ＰＣ－ＤＢＣＯエステル（カタログ番号「１１６０」、クリックケミストリーツールズ社）を室温で１時間反応させ、ＰＣ－ＤＢＣＯ化した。

続いて、ＰＣ－ＤＢＣＯ化したｒＢＣ２ＬＣＮに、１０倍モル濃度のアジド化オリゴヌクレオチド（配列番号８）を混合して４℃で一晩反応させ、核酸標識レクチンを得た。オリゴヌクレオチドは５’末端をアジド化修飾した。続いて、フコースセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーで核酸標識レクチンを精製した。

図６は、核酸標識レクチンの精製の各過程の試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、銀染色した結果を示す写真である。図５中、「ＰＣ－ＤＢＣＯ－ｒＢＣ２ＬＣＮ」はＰＣ－ＤＢＣＯ化したｒＢＣ２ＬＣＮを表し、「Ｔｈｒｏｕｇｈ」は、アフィニティーカラムを通過した試料を表し、「Ｗａｓｈ１」、「Ｗａｓｈ２」、「Ｗａｓｈ３」は、それぞれ洗浄１回目、２回目、３回目の洗浄液を表し、「Ｅｌｕｔｅ１」、「Ｅｌｕｔｅ２」、「Ｅｌｕｔｅ３」は、それぞれ溶出１回目、２回目、３回目の溶出液を表す。また、「＊」はオリゴヌクレオチドが結合したｒＢＣ２ＬＣＮを示し、矢印はオリゴヌクレオチドが結合していないｒＢＣ２ＬＣＮを示す。

その結果、オリゴヌクレオチドが結合して分子量が大きくなったｒＢＣ２ＬＣＮが検出された。この結果から、クリック反応により、光照射により核酸を遊離させることが可能な核酸標識レクチンが調製されたことが確認された。

続いて、ｒＢＣ２ＬＣＮと同様の方法により、ｒＡＢＡ、ｒＬＳＬＮ、ＳＮＡレクチン（カタログ番号「Ｌ－１３００」、Ｖｅｃｔｏｒ社）、ＧＳＬＩＩレクチン（カタログ番号「Ｌ－１２１０」、Ｖｅｃｔｏｒ社）、ｒＡＡＬ、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、カタログ番号「３０００３６」、生化学工業社）に、上記表６に示すオリゴヌクレオチドを光照射により開裂可能に結合させた核酸標識レクチンをそれぞれ調製した。

各レクチンは、各レクチンが結合する糖をそれぞれ固定化したセファロースビーズを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製の各過程の試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、銀染色した結果、ｒＡＢＡ、ｒＬＳＬＮ、ＳＮＡ、ＧＳＬＩＩ、ｒＡＡＬ、ＣｏｎＡのそれぞれに、各オリゴヌクレオチドを光照射により開裂可能に結合できたことが確認された。

［実験例６］
（核酸標識レクチンと細胞との反応条件の検討）
核酸標識レクチンと細胞との反応条件を検討した。具体的には、以下の方法１及び方法２の条件で核酸標識レクチンと細胞とを反応させ、比較した。

《方法１》
核酸標識レクチンとして、実験例４と同様にして調製した、核酸標識ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンを使用した。また、細胞として、いずれもヒト膵臓癌由来細胞である、ＭＩＡＰａＣａ－２細胞、ＢｘＰＣ－３細胞及びＣａｐａｎ－１細胞を用いた。

まず、１×１０^５個の各細胞を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１質量％含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（以下、「ＢＳＡ－ＰＢＳ」という場合がある。）１００μＬにそれぞれ懸濁した。続いて、１００ｎｇの核酸標識ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンを、各細胞懸濁液に添加し、４℃で１時間反応させた。続いて、各細胞を１ｍＬのＢＳＡ－ＰＢＳで３回洗浄後、２００μＬのＢＳＡ－ＰＢＳに懸濁した。

続いて、１×１０^４個の生きた細胞を新しいチューブにとり、遠心して上清を除き、０．２Ｍフコース１００μＬを加えて４℃で３０分間反応させ、核酸標識ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンを細胞から遊離させた。続いて、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心して、上清を回収し、リアルタイム定量ＰＣＲでｒＢＣ２ＬＣＮレクチンに結合したオリゴヌクレオチドを定量した。

また、比較のために、Ｒ－フィコエリスリン標識したｒＢＣ２ＬＣＮレクチンで各細胞を染色し、フローサイトメトリー解析を行った。

《方法２》
方法２では、核酸標識レクチン及び細胞の反応を、ＢＳＡ－ＰＢＳ中ではなく、ＯｐｔｉＭＥＭ培地中で行った点において、方法１と主に異なっていた。

核酸標識レクチン及び細胞として、方法１と同様のものを使用した。まず、１×１０^５個の各細胞を、ＯｐｔｉＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）１００μＬにそれぞれ懸濁した。続いて、１００ｎｇの核酸標識ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンを、各細胞懸濁液に添加し、４℃で１時間反応させた。続いて、各細胞を１ｍＬのＢＳＡ－ＰＢＳで３回洗浄後、２００μＬのＰＢＳに懸濁した。

続いて、１×１０^４個の生きた細胞を新しいチューブにとり、遠心して上清を除き、０．２Ｍフコース１００μＬを加えて４℃で３０分間反応させ、核酸標識ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンを細胞から遊離させた。

続いて、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心して、上清を回収し、リアルタイム定量ＰＣＲでｒＢＣ２ＬＣＮレクチンに結合したオリゴヌクレオチドを定量した。

図７（ａ）は、リアルタイム定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。図７（ａ）中、「ＢＳＡ－ＰＢＳ」は方法１の結果であることを示し、「ＯｐｔｉＭＥＭ」は方法２の結果であることを示す。その結果、方法１を使用する方が高い感度で細胞とレクチンとの結合を検出できることが明らかとなった。

また、図７（ｂ）は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。その結果、図７（ａ）に示すリアルタイム定量ＰＣＲによる解析結果は、フローサイトメトリー解析の結果と一致し、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンはＣａｐａｎ－１細胞に最も高い反応性を示し、ＢｘＰＣ－３細胞にも反応したが、ＭＩＡＰａＣａ－２細胞には反応しなかったことが明らかとなった。

［実験例７］
（光照射による核酸の遊離条件の検討）
光照射により核酸を遊離させることが可能な核酸標識レクチンから、核酸を遊離させる条件を検討した。核酸標識レクチンとして、実験例５と同様にして調製した、核酸標識ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンを使用した。また、細胞として、ヒト膵臓癌由来細胞であるＣａｐａｎ－１細胞を用いた。

まず、１×１０^５個の細胞をＢＳＡ－ＰＢＳ１００μＬに懸濁した。続いて、１００ｎｇの核酸標識ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンを、細胞懸濁液に添加し、４℃で１時間反応させた。続いて、細胞を１ｍＬのＢＳＡ－ＰＢＳで３回洗浄後、２００μＬのＢＳＡ－ＰＢＳに懸濁した。

続いて、細胞を１×１０^４個ずつ新しいチューブにとり、紫外線（ＵＶ）照射装置（カタログ番号「９５－００４２－１４」、フナコシ株式会社）を用いて、波長３６５ｎｍにピーク波長を有する紫外線を１５Ｗで５分間、１０分間又は１５分間照射してオリゴヌクレオチドを遊離させた。続いて、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を回収し、リアルタイム定量ＰＣＲでｒＢＣ２ＬＣＮレクチンに結合したオリゴヌクレオチドを定量した。

また、比較のために、紫外線照射せず直ちに遠心して上清を回収した試料、紫外線照射せずに室温で１５分間放置後遠心して上清を回収した試料、及び０．２Ｍフコース１００μＬを加えて４℃で１５分間反応させ、核酸標識ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンを細胞から遊離させた後、遠心して上清を回収した試料についても、リアルタイム定量ＰＣＲでｒＢＣ２ＬＣＮレクチンに結合したオリゴヌクレオチドを定量した。

図８は、リアルタイム定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。図８中、「照射なし０分」は、紫外線照射せずに１５０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を回収した試料の結果であることを表し、「照射なし１５分」は、紫外線照射せずに室温で１５分間放置後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を回収した試料の結果であることを表し、「対照１５分」は、０．２Ｍフコース１００μＬを加えて４℃で１５分間反応させ、核酸標識ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンを細胞から遊離させた後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を回収した試料の結果であることを表す。

その結果、紫外線を１５分照射した場合に、最も多くのオリゴヌクレオチドを遊離させることができることが明らかとなった。

［実験例８］
（核酸標識レクチンの反応性の検討１）
核酸標識していない通常のレクチン及び核酸標識レクチンの反応性に違いが認められるか否かについて検討した。

具体的には、通常のレクチン（非標識レクチン）及び核酸標識レクチンを、それぞれフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識して細胞に反応させ、フローサイトメトリー解析を行った。

非標識レクチンとしては、ＧＳＬＩＩ、ｒＡＢＡ、ｒＢＣ２ＬＣＮ、ｒＬＳＬＮ、ＳＮＡを使用した。また、核酸標識レクチンとしては、実験例４と同様にして調製した、上記と同じレクチン（ＧＳＬＩＩ、ｒＡＢＡ、ｒＢＣ２ＬＣＮ、ｒＬＳＬＮ、ＳＮＡ）の核酸標識体を使用した。また、細胞としては、いずれもヒト膵臓癌由来細胞である、ＳＵＩＴ－２細胞、ＡｓＰＣ－１細胞、ＢｘＰＣ－３細胞、ＭＩＡＰａＣａ－２細胞及びＣａｐａｎ－１細胞を使用した。

まず、各細胞を１×１０^５個ずつＢＳＡ－ＰＢＳ１００μＬにそれぞれ懸濁してチューブに分注した。続いて、１００ｎｇの非標識レクチン（ＧＳＬＩＩ、ｒＡＢＡ、ｒＢＣ２ＬＣＮ、ｒＬＳＬＮ、ＳＮＡ）又は核酸標識レクチン（ＧＳＬＩＩ、ｒＡＢＡ、ｒＢＣ２ＬＣＮ、ｒＬＳＬＮ、ＳＮＡ）を、それぞれ各細胞懸濁液に添加し、４℃で１時間反応させた。続いて、各細胞を１ｍＬのＢＳＡ－ＰＢＳで３回洗浄後、５００μＬのＢＳＡ－ＰＢＳに懸濁した。

続いて、各細胞をフローサイトメトリー解析し、細胞への各レクチンの結合量を測定し、それぞれのレクチンについて、非標識体と核酸標識体の反応性の相関性について調べた。図９（ａ）～（ｅ）は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図９（ａ）はＳＵＩＴ－２細胞の結果であり、図９（ｂ）はＡｓＰＣ－１細胞の結果であり、図９（ｃ）はＢｘＰＣ－３細胞の結果であり、図９（ｄ）はＭＩＡＰａＣａ－２細胞の結果であり、図９（ｅ）はＣａｐａｎ－１細胞の結果である。また、図９（ａ）～（ｅ）中、横軸は非標識レクチン（ＧＳＬＩＩ、ｒＡＢＡ、ｒＢＣ２ＬＣＮ、ｒＬＳＬＮ、ＳＮＡ）の結合量（平均蛍光強度）を示し、縦軸は核酸標識レクチン（ＧＳＬＩＩ、ｒＡＢＡ、ｒＢＣ２ＬＣＮ、ｒＬＳＬＮ、ＳＮＡ）の結合量（平均蛍光強度）を示す。

その結果、非標識レクチン及び核酸標識レクチンの各細胞への反応性は、それぞれ高い相関性を示すことが明らかとなった。この結果から、レクチンを核酸標識しても、レクチンの反応性が変化しないことが確認された。

［実験例９］
（核酸標識レクチンの反応性の検討２）
核酸標識レクチンを細胞と反応させ、その結合量をフローサイトメトリー解析及びリアルタイム定量ＰＣＲ解析により測定して比較した。

核酸標識レクチンとしては、実験例５と同様にして調製した、光照射により核酸を遊離させることが可能な核酸標識レクチン（ＧＳＬＩＩ、ｒＡＢＡ、ｒＢＣ２ＬＣＮ、ｒＬＳＬＮ、ＳＮＡ）を使用した。また、細胞としては、ヒト膵臓癌由来細胞であるＣａｐａｎ－１細胞を使用した。

まず、細胞を１×１０^５個ずつＢＳＡ－ＰＢＳ１００μＬに懸濁してチューブに分注した。続いて、１００ｎｇの核酸標識レクチン（ＧＳＬＩＩ、ｒＡＢＡ、ｒＢＣ２ＬＣＮ、ｒＬＳＬＮ、ＳＮＡ）を、各細胞懸濁液に添加し、４℃で１時間反応させた。続いて、各細胞を１ｍＬのＢＳＡ－ＰＢＳで３回洗浄後、５００μＬのＢＳＡ－ＰＢＳに懸濁した。

続いて、各細胞の一部をフローサイトメトリー解析し、残りの一部をリアルタイム定量ＰＣＲに供して、細胞へのレクチンの結合量を測定した。リアルタイム定量ＰＣＲは次のようにして行った。まず、細胞の一部に紫外線（ＵＶ）照射装置（カタログ番号「９５－００４２－１４」、フナコシ株式会社）を用いて、波長３６５ｎｍにピーク波長を有する紫外線を１５Ｗで１５分間照射してオリゴヌクレオチドを遊離させた。続いて、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を回収し、リアルタイム定量ＰＣＲで遊離したオリゴヌクレオチドを定量した。

図１０は、フローサイトメトリー解析及びリアルタイム定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。図１０中、「ｑＰＣＲ」はリアルタイム定量ＰＣＲの結果（オリゴヌクレオチド量）を表し、「ＦＡＣＳ」はフローサイトメトリー解析の結果（平均蛍光強度）を表す。

その結果、フローサイトメトリー解析の結果及びリアルタイム定量ＰＣＲの結果は高い相関性を示すことが明らかとなった。この結果から、核酸標識レクチンを用いたリアルタイム定量ＰＣＲにより、フローサイトメトリー解析と同様の結果を得ることができることが明らかとなった。

［実験例１０］
（核酸標識レクチンの反応性の検討３）
複数のレクチンを細胞に反応させ、その結合をフローサイトメトリー解析及びリアルタイム定量ＰＣＲにより解析した。具体的には、それぞれフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した、ＧＳＬＩＩ、ｒＡＢＡ、ｒＢＣ２ＬＣＮ、ｒＬＳＬＮ、ＳＮＡを、それぞれＣａｐａｎ－１細胞に反応させ、フローサイトメトリー解析を行った。

まず、Ｃａｐａｎ－１細胞を１×１０^５個ずつＢＳＡ－ＰＢＳ１００μＬにそれぞれ懸濁してチューブに分注した。続いて、１００ｎｇの各ＦＩＴＣ標識レクチンを、それぞれ細胞懸濁液に添加し、４℃で１時間反応させた。続いて、各細胞を１ｍＬのＢＳＡ－ＰＢＳで３回洗浄後、２００μＬのＢＳＡ－ＰＢＳに懸濁した。続いて、各細胞をフローサイトメトリー解析し、細胞への各レクチンの結合量を測定した。

また、実験例５と同様にしてそれぞれ核酸標識した、ＧＳＬＩＩ、ｒＡＢＡ、ｒＢＣ２ＬＣＮ、ｒＬＳＬＮ、ＳＮＡを、それぞれＣａｐａｎ－１細胞に反応させ、結合したレクチンをリアルタイム定量ＰＣＲにより測定した。

具体的には、まず、Ｃａｐａｎ－１細胞を１×１０^５個ずつＢＳＡ－ＰＢＳ１００μＬにそれぞれ懸濁してチューブに分注した。続いて、１００ｎｇの各核酸標識レクチンを、それぞれ細胞懸濁液に添加し、４℃で１時間反応させた。続いて、各細胞を１ｍＬのＢＳＡ－ＰＢＳで３回洗浄後、５００μＬのＢＳＡ－ＰＢＳに懸濁した。

続いて、各細胞に紫外線（ＵＶ）照射装置（カタログ番号「９５－００４２－１４」、フナコシ株式会社）を用いて、波長３６５ｎｍにピーク波長を有する紫外線を１５Ｗで１５分間照射してオリゴヌクレオチドを遊離させた。続いて、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を回収し、リアルタイム定量ＰＣＲで遊離したオリゴヌクレオチドをそれぞれ定量した。

図１１（ａ）はフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図１１（ａ）中、「ＭＦＩ」は測定された蛍光強度の平均値を示す。また、図１１（ｂ）はリアルタイム定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。また、図１２は、図１１（ａ）及び（ｂ）の結果に基づいて、フローサイトメトリー解析の結果を横軸に、リアルタイム定量ＰＣＲの結果を縦軸に示したグラフである。

その結果、フローサイトメトリー解析の結果とリアルタイム定量ＰＣＲの結果は高い相関性を示すことが確認された。この結果は、核酸標識レクチンを細胞に反応させて、核酸標識レクチンに結合していた核酸を検出することにより、細胞へのレクチンの結合を解析できることを更に支持するものである。

［実験例１１］
（核酸標識レクチンの反応性の検討４）
核酸標識レクチンを、段階希釈した細胞と反応させ、その結合量をリアルタイム定量ＰＣＲ解析により測定した。

核酸標識レクチンとしては、実験例５と同様にして調製した、光照射により核酸を遊離させることが可能な核酸標識ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンを使用した。また、細胞としては、ヒト膵臓癌由来細胞であるＣａｐａｎ－１細胞を使用した。

まず、１０，０００個、１，０００個、１００個、１０個、１個及び０個のＣａｐａｎ－１細胞を、それぞれＢＳＡ－ＰＢＳ１００μＬに懸濁してチューブに入れた。続いて、１００ｎｇの核酸標識ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンを、各細胞懸濁液に添加し、４℃で１時間反応させた。続いて、各細胞を１ｍＬのＢＳＡ－ＰＢＳで３回洗浄後、２００μＬのＢＳＡ－ＰＢＳに懸濁した。

図１３はリアルタイム定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。図１３中、「対照」は、核酸標識ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンを添加せずに一連の反応を行った試料の結果である。その結果、核酸標識レクチンを細胞に反応させて、核酸標識レクチンに結合していた核酸を検出することにより、細胞１個に対しても、レクチンの結合を解析できることが明らかとなった。

［実験例１２］
（核酸標識レクチンの反応性の検討５）
複数種類の核酸標識レクチンの混合物を、１００，０００個の細胞に反応させ、そのうち１０，０００個の細胞に結合した核酸を、次世代シーケンサーを用いて解析した。核酸標識レクチンとしては、実験例４と同様にして調製した、核酸標識レクチン（ＳＮＡ、ＣｏｎＡ、ＧＳＬＩＩ、ｒＢＣ２ＬＣＮ、ｒＡＡＬ、ｒＡＢＡ、ｒＬＳＬＮ、ｒＰＳＬ１ａ、ｒＤｉｓｃｏｉｄｉｎＩ、ｒＦ１７ＡＧ、ｒＰＶＬ、ｒＣＧＬ２、ｒＰＡＩＬ、ｒＰＰＬ、ｒＲＳＩＩＬ、ｒＣＮＬ、ＷＦＡ、ＨＰＡ、ＳＳＡ、ｒＯｒｙｓａｔａ、ｒＰＡＬａ、ｒＤｉｓｃｏｉｄｉｎＩＩ、ＣＳＡ、ｒＧＲＦＴ、ｒＳＲＬ、ｒＡＯＬ、ｒＢａｎａｎａ、ｒＢＣ２ＬＡ、ｒＣ１４、ｒＣａｌｓｅｐａ、ｒＧａｌ３Ｃ、ｒＧＣ２、ｒＭａｌｅｃｔｉｎ、ｒＭＯＡ、ｒＰＴＬ、ｒＲＳＬ、ＴＪＡＩ、ＴＪＡＩＩ、ＵＥＡＩ）及びポドカリキシン（ＰＯＤＸＬ）抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を使用した。また、細胞としては、ヒト膵臓癌由来細胞である、Ｃａｐａｎ－１細胞、ＢｘＰＣ－３細胞、ＰＡＮＣ－１細胞、ＡｓＰＣ１細胞、並びに、ＣＨＯ細胞及びＣＨＯ細胞の変異細胞であるＬｅｃ１、Ｌｅｃ２、Ｌｅｃ８を用いた。

まず、各細胞を１００，０００個ずつＢＳＡ－ＰＢＳ１００μＬにそれぞれ懸濁してチューブに分注した。続いて、５０ｎｇずつの各核酸標識レクチンを、それぞれ細胞懸濁液に添加し、４℃で１時間反応させた。続いて、各細胞を１ｍＬのＢＳＡ－ＰＢＳで３回洗浄後、２００μＬのＢＳＡ－ＰＢＳに懸濁した。続いて、細胞数を測定し、そのうち１０,０００個の細胞を新しいチューブに移した。続いて、遠心して上清を除いた後、１００μＬのＰＢＳに懸濁した。続いて、紫外線（ＵＶ）照射装置（カタログ番号「９５－００４２－１４」、フナコシ株式会社）を用いて、波長３６５ｎｍにピーク波長を有する紫外線を１５Ｗで１５分間照射してオリゴヌクレオチドを遊離させ、遠心後に上清を回収した。続いて、これをテンプレートとしてＰＣＲ反応を行い、次世代シーケンサーで解析した。

次世代シーケンサーでのシーケンスを行うにあたり、次のような操作を行った。Ｉ５ｉｎｄｅｘプライマー（配列番号７５）とＩ７ｉｎｄｅｘプライマー（配列番号７６）でＰＣＲを行い、増幅されたＰＣＲ産物を精製、濃縮後、精製度と濃度をＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置（島津製作所社）で確認した。続いて、各細胞に結合した核酸標識レクチンに標識された核酸の塩基配列を、次世代シーケンサー（製品名「ＭｉＳｅｑ」、イルミナ社）を用いてシーケンスし、検出された塩基配列のリード数を集計した。また、配列番号７５及び７６中の「ｎｎｎｎｎｎｎｎ」（ここで、「ｎ」は「ａ」、「ｔ」、「ｇ」又は「ｃ」を表す。）は、細胞毎に異なる配列とし、細胞の識別に用いた。

図１４は、各レクチンに標識された核酸の塩基配列のリード数を用いてクラスター解析を行った結果を示す図である。

その結果、１０，０００個の細胞に核酸標識レクチンを反応させて、核酸標識レクチンに結合していた核酸を次世代シーケンサーでシーケンスすることにより、細胞へのレクチンの結合を解析できることが明らかとなった。さらに、それぞれの細胞でレクチンとの反応パターンが異なることも明らかとなった。

［実験例１３］
（核酸標識レクチンの反応性の検討６）
複数種類の核酸標識したレクチンの混合物を、１０，０００個の細胞及び１個の細胞にそれぞれ反応させ、次世代シーケンサーを用いてその結合を解析した。核酸標識レクチンとしては、実験例４と同様にして調製した、核酸標識レクチン（ＳＮＡ、ＣｏｎＡ、ＧＳＬＩＩ、ｒＢＣ２ＬＣＮ、ｒＡＡＬ、ｒＡＢＡ、ｒＬＳＬＮ、ｒＰＳＬ１ａ、ｒＤｉｓｃｏｉｄｉｎＩ、ｒＦ１７ＡＧ、ｒＰＶＬ、ｒＣＧＬ２、ｒＰＡＩＬ、ｒＰＰＬ、ｒＲＳＩＩＬ、ｒＣＮＬ、ＷＦＡ、ＨＰＡ、ＳＳＡ、ｒＯｒｙｓａｔａ、ｒＰＡＬａ、ｒＤｉｓｃｏｉｄｉｎＩＩ、ＣＳＡ、ｒＧＲＦＴ、ｒＳＲＬ、ｒＡＯＬ、ｒＢａｎａｎａ、ｒＢＣ２ＬＡ、ｒＣ１４、ｒＣａｌｓｅｐａ、ｒＧａｌ３Ｃ、ｒＧＣ２、ｒＭａｌｅｃｔｉｎ、ｒＭＯＡ、ｒＰＴＬ、ｒＲＳＬ、ＴＪＡＩ、ＴＪＡＩＩ、ＵＥＡＩ）及びポドカリキシン（ＰＯＤＸＬ）抗体を使用した。また、細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７を用いた。

まず、ヒトｉＰＳ細胞を１００，０００個ずつＢＳＡ－ＰＢＳ１００μＬに懸濁してチューブに分注した。続いて、０．５ｎｇずつの各核酸標識レクチンを、それぞれ細胞懸濁液に添加し、４℃で１時間反応させた。続いて、細胞を１ｍＬのＢＳＡ－ＰＢＳで３回洗浄後、２００μＬのＢＳＡ－ＰＢＳに懸濁した。

続いて、細胞を１０，０００個及び１個分注し、細胞に結合した核酸標識レクチンに標識された核酸の塩基配列を、次世代シーケンサー（製品名「ＭｉＳｅｑ」、イルミナ社）を用いてシーケンスし、検出された塩基配列のリード数を集計した。

図１５は、得られたリード数を主成分分析した結果を示すグラフである。図１５中、「ＰＣ１」はＰｒｉｎｃｉｐｌｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔ１（主成分１）を示し、「ＰＣ２」はＰｒｉｎｃｉｐｌｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔ２（主成分２）を示す。また、グラフ中、黒丸は細胞１個レベルで解析した結果を示し、白丸は細胞１０，０００個レベルで解析した結果を示す。

その結果、細胞に核酸標識レクチンの混合物を反応させて、核酸標識レクチンに結合していた核酸を次世代シーケンサーでシーケンスすることにより、細胞１個レベルで細胞へのレクチンの結合を解析できることが明らかとなった。また、細胞１個レベルでの解析結果は、１０，０００個の細胞の解析結果と類似しているものの、かなりヘテロな糖鎖を持つ細胞集団であることが明らかとなった。

［実験例１４］
（核酸標識レクチンの反応性の検討７）
複数種類の核酸標識レクチンの混合物を、１０，０００個の微生物の細胞にそれぞれ反応させ、次世代シーケンサーを用いてその結合を解析した。核酸標識レクチンとしては、実験例４と同様にして調製した、核酸標識レクチン（ｒＢＣ２ＬＣＮ、ｒＡＡＬ、ｒＡＢＡ、ｒＬＳＬＮ、ｒＰＳＬ１ａ、ｒＤｉｓｃｏｉｄｉｎＩ、ｒＦ１７ＡＧ、ｒＰＶＬ、ｒＣＧＬ２、ｒＰＡＩＬ、ｒＰＰＬ、ｒＲＳＩＩＬ、ｒＣＮＬ、ＷＦＡ、ＨＰＡ、ＳＳＡ、ｒＯｒｙｓａｔａ、ｒＰＡＬａ、ｒＤｉｓｃｏｉｄｉｎＩＩ）を使用した。また、微生物としては、大腸菌、デイノコッカス・ラディオデュランス、出芽酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）を使用した。

まず、各微生物を１，０００，０００個ずつＢＳＡ－ＰＢＳ１００μＬにそれぞれ懸濁してチューブに分注した。続いて、０．５ｎｇずつの各核酸標識レクチンを、それぞれ細胞懸濁液に添加し、４℃で１時間反応させた。続いて、各微生物を１ｍＬのＢＳＡ－ＰＢＳで３回洗浄後、２００μＬのＢＳＡ－ＰＢＳに懸濁した。

続いて、各微生物を１００，０００個分注し、各微生物に結合した核酸標識レクチンに標識された核酸の塩基配列を、次世代シーケンサー（製品名「ＭｉＳｅｑ」、イルミナ社）を用いてシーケンスし、検出された塩基配列のリード数を集計した。シーケンスは、各微生物毎に独立して３回ずつ行った。

図１６は、各レクチンに標識された核酸の塩基配列のリード数をそれぞれ示すグラフである。図１６中、「Ｅ．ｃｏｌｉ」は大腸菌を示し、「Ｄ．ｒａｄｉｏ」はデイノコッカス・ラディオデュランスを示し、「Ｓ．ｃｅｒｅｖ」はサッカロマイセス・セレビシエを示す。

その結果、微生物の細胞に核酸標識レクチンを反応させて、核酸標識レクチンに結合していた核酸を次世代シーケンサーでシーケンスすることにより、微生物１個レベルで微生物へのレクチンの結合を解析できることが明らかとなった。

［実験例１５］
（核酸標識レクチンの反応性の検討８）
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を市販のキット（製品名「ＳＴＥＭｄｉｆｆＳＭＡＤｉＮｅｕｒａｌＩｎｄｕｃｔｉｏｎＫｉｔ，２ｐａｃｋ」、カタログ番号「＃０８５８２」、ステムセルテクノロジーズ社）を用いて外胚葉に分化させて、４日目及び１１日目に細胞を回収した。続いて、複数種類の核酸標識したレクチンをそれぞれ反応させ、次世代シーケンサーを用いてその結合を解析した。

核酸標識レクチンとしては、実験例４と同様にして調製した、核酸標識レクチン（ＳＮＡ、ＣｏｎＡ、ＧＳＬＩＩ、ｒＢＣ２ＬＣＮ、ｒＡＡＬ、ｒＡＢＡ、ｒＬＳＬＮ、ｒＰＳＬ１ａ、ｒＤｉｓｃｏｉｄｉｎＩ、ｒＦ１７ＡＧ、ｒＰＶＬ、ｒＣＧＬ２、ｒＰＡＩＬ、ｒＰＰＬ、ｒＲＳＩＩＬ、ｒＣＮＬ、ＷＦＡ、ＨＰＡ、ＳＳＡ、ｒＯｒｙｓａｔａ、ｒＰＡＬａ、ｒＤｉｓｃｏｉｄｉｎＩＩ、ＣＳＡ、ｒＧＲＦＴ、ｒＳＲＬ、ｒＡＯＬ、ｒＢａｎａｎａ、ｒＢＣ２ＬＡ、ｒＣ１４、ｒＣａｌｓｅｐａ、ｒＧａｌ３Ｃ、ｒＧＣ２、ｒＭａｌｅｃｔｉｎ、ｒＭＯＡ、ｒＰＴＬ、ｒＲＳＬ、ＴＪＡＩ、ＴＪＡＩＩ、ＵＥＡＩ）及びポドカリキシン（ＰＯＤＸＬ）抗体を使用した。

まず、各細胞を１００，０００個ずつＢＳＡ－ＰＢＳ１００μＬに懸濁してチューブに分注した。続いて、０．５ｎｇずつの各核酸標識レクチンを、それぞれ細胞懸濁液に添加し、４℃で１時間反応させた。続いて、細胞を１ｍＬのＢＳＡ－ＰＢＳで３回洗浄後、２００μＬのＢＳＡ－ＰＢＳに懸濁した。

図１７（ａ）及び（ｂ）は、得られたリード数を主成分分析した結果を示すグラフである。図１７（ａ）は細胞１０，０００個レベルで解析した結果を示す（平均値、ｎ＝３）。また、図１７（ｂ）は細胞１個レベルで解析した結果を示す（ｎ＝３）。図１７（ａ）及び（ｂ）中、「ＰＣ１」はＰｒｉｎｃｉｐｌｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔ１（主成分１）を示し、「ＰＣ２」はＰｒｉｎｃｉｐｌｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔ２（主成分２）を示す。また、「Ｄａｙ０」は分化誘導前のｉＰＳ細胞の結果であることを示し、「Ｄａｙ４」は分化誘導後４日目のｉＰＳ細胞の結果であることを示し、「Ｄａｙ７」は分化誘導後７日目のｉＰＳ細胞の結果であることを示す。

また、細胞１０，０００個レベルでの解析結果から、分化誘導後の経過時間により、糖鎖構造が変化していることが明らかとなった。そして、細胞１個レベルでの解析結果から、ｉＰＳ細胞は比較的均一な細胞集団であるものの、分化誘導後は多様な糖鎖を持つ細胞集団となっていることが明らかとなった。

この結果は、細胞集団を構成する個々の細胞の糖鎖を細胞１個レベルで解析できることを更に支持するものである。

［実験例１６］
（細胞の表面の糖鎖及び細胞内のＲＮＡの１細胞レベルでの解析１）
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を１００，０００個ずつＢＳＡ－ＰＢＳ１００μＬに懸濁してチューブに分注した。続いて、０．５ｎｇずつの各核酸標識レクチンを、それぞれ細胞懸濁液に添加し、４℃で１時間反応させた。続いて、細胞を１ｍＬのＢＳＡ－ＰＢＳで３回洗浄後、２００μＬのＢＳＡ－ＰＢＳに懸濁した。

続いて、紫外線（ＵＶ）照射装置（カタログ番号「９５－００４２－１４」、フナコシ株式会社）を用いて、波長３６５ｎｍにピーク波長を有する紫外線を１５Ｗで１５分間照射して核酸標識レクチンからオリゴヌクレオチドを遊離させ、遠心後に上清を回収した。続いて、これをテンプレートとしてＰＣＲ反応を行い、次世代シーケンサーで解析した。

また、遠心後に沈殿した１細胞の全ＲＮＡから、ＧｅｎＮｅｘｔ（Ｒ）ＲａｍＤＡ－ｓｅｑ（ＴＭ）ＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌＫｉｔ（東洋紡株式会社）を用いてｃＤＮＡライブラリーを調製した。

続いて、ＮｅｘｔｅｒａＸＴＤＮＡＳａｍｐｌｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＫｉｔ（イルミナ社）を用いてサンプルを処理後、次世代シーケンサー（製品名「ＭｉＳｅｑ」、イルミナ社）を用いてシーケンスし、検出された塩基配列のリード数を集計した。

図１８（ａ）及び（ｂ）は、細胞の表面の糖鎖及び細胞内のＲＮＡを１細胞レベルで解析した代表的な結果を示すグラフである。図１８（ａ）は糖鎖プロファイルの結果であり、図１８（ｂ）は遺伝子プロファイルの結果である。図１８（ａ）中、縦軸はシグナル強度（相対値）を示し、横軸はレクチンの種類を示す。また、図１８（ｂ）中、縦軸はＴＰＭ（ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｓＰｅｒＭｉｌｌｉｏｎ）を示し、横軸は、未分化マーカー、内肺葉マーカー、中胚葉マーカー、外胚葉マーカーの各マーカー遺伝子の遺伝子名を示す。

その結果、１細胞から、細胞表層の糖鎖情報のみならず、ＲＮＡ情報を取得できることが明らかとなった。

［実験例１７］
（細胞の表面の糖鎖及び細胞内のＲＮＡの１細胞レベルでの解析２）
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を外胚葉（神経）に分化させて、０日目及び１１日目の細胞の表面の糖鎖及び細胞内のＲＮＡを１細胞レベルで解析した。

具体的には、まず、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を、市販のキット（製品名「ＳＴＥＭｄｉｆｆＳＭＡＤｉＮｅｕｒａｌＩｎｄｕｃｔｉｏｎＫｉｔ，２ｐａｃｋ」、カタログ番号「＃０８５８２」、ステムセルテクノロジーズ社）を用いて外胚葉（神経）に分化させ、０日目及び１１日目に細胞を回収した。

続いて、回収した各細胞に、複数種類の核酸標識したレクチンをそれぞれ反応させ、次世代シーケンサーを用いてその結合を解析した。核酸標識レクチンとしては、実験例４と同様にして調製した、核酸標識レクチン（ＳＮＡ、ＣｏｎＡ、ＧＳＬＩＩ、ｒＢＣ２ＬＣＮ、ｒＡＡＬ、ｒＡＢＡ、ｒＬＳＬＮ、ｒＰＳＬ１ａ、ｒＤｉｓｃｏｉｄｉｎＩ、ｒＦ１７ＡＧ、ｒＰＶＬ、ｒＣＧＬ２、ｒＰＡＩＬ、ｒＰＰＬ、ｒＲＳＩＩＬ、ｒＣＮＬ、ＷＦＡ、ＨＰＡ、ＳＳＡ、ｒＯｒｙｓａｔａ、ｒＰＡＬａ、ｒＤｉｓｃｏｉｄｉｎＩＩ、ＣＳＡ、ｒＧＲＦＴ、ｒＳＲＬ、ｒＡＯＬ、ｒＢａｎａｎａ、ｒＢＣ２ＬＡ、ｒＣ１４、ｒＣａｌｓｅｐａ、ｒＧａｌ３Ｃ、ｒＧＣ２、ｒＭａｌｅｃｔｉｎ、ｒＭＯＡ、ｒＰＴＬ、ｒＲＳＬ、ＴＪＡＩ、ＴＪＡＩＩ、ＵＥＡＩ）及びポドカリキシン（ＰＯＤＸＬ）抗体を使用した。

各細胞を１００，０００個ずつＢＳＡ－ＰＢＳ１００μＬに懸濁してチューブに分注した。続いて、０．５ｎｇずつの各核酸標識レクチンを、それぞれ細胞懸濁液に添加し、４℃で１時間反応させた。続いて、細胞を１ｍＬのＢＳＡ－ＰＢＳで３回洗浄後、２００μＬのＢＳＡ－ＰＢＳに懸濁した。

続いて、細胞を１個ずつ分注し、紫外線（ＵＶ）照射装置（カタログ番号「９５－００４２－１４」、フナコシ株式会社）を用いて、波長３６５ｎｍにピーク波長を有する紫外線を１５Ｗで１５分間照射して核酸標識レクチンからオリゴヌクレオチドを遊離させ、遠心後に上清を回収した。続いて、回収した上清をテンプレートとしてＰＣＲ反応を行い、次世代シーケンサー（製品名「ＭｉＳｅｑ」、イルミナ社）を用いてシーケンスし、検出された塩基配列のリード数を集計した。

続いて、ＮｅｘｔｅｒａＸＴＤＮＡＳａｍｐｌｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＫｉｔ（イルミナ社）を用いてサンプルを処理後、次世代シーケンサー（製品名「ＮｏｖａＳｅｑ６０００」、イルミナ社）を用いてシーケンスし、ＦａｓｔＱＣｖ０．１１．７（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）を用いて生データの品質チェックを行った。

続いて、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ０．３８（http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic）でトリミングし、ＨＩＳＡＴ２ｖ２．１．０（http://daehwankimlab.github.io/hisat2/）とＢｏｗｔｉｅ２２．３．５．１（https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie2/2.3.5.1/）を用いてゲノムへのマッピングを行った。さらに、ＳｔｒｉｎｇＴｉｅｖ１．３．４ｄ（https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/）を用いてトランスクリプトへのマッピングを行った。

図１９（ａ）は、得られた糖鎖プロファイルを主成分分析した結果を示すグラフである。その結果、０日目と比較して、分化誘導後１１日目の細胞では、糖鎖プロファイルの不均一性が増加していることが明らかとなった。

続いて、０日目に近い糖鎖プロファイルを示したＤａｙ１１－Ａ３、Ｄａｙ１１－Ａ９の各細胞について、神経分化マーカーＯＴＸ２遺伝子と未分化マーカーＰＯＵ５Ｆ１遺伝子の発現を確認した。

図１９（ｂ）は、各マーカー遺伝子の発現量を解析した結果を示すグラフである。その結果、Ｄａｙ１１－Ａ３、Ｄａｙ１１－Ａ９の各細胞は、神経分化マーカーの発現が低く、未分化マーカーの発現が高いことが明らかとなった。すなわち、これらの細胞は、外胚葉（神経）分化誘導後１１日目においても、分化誘導されず、未分化な細胞の状態であることが明らかとなった。

図２０（ａ）は、ヒトｉＰＳ細胞に特異的に結合するｒＢＣ２ＬＣＮレクチンの各細胞に対する結合量と、２７，６８６種類の遺伝子群の発現量の相関係数を算出し、数値が大きい順に並べた結果を示すグラフである。

その結果、最も高い正相関を示す遺伝子は未分化マーカーＰＯＵ５Ｆ１であることが明らかとなった。一方、最も高い負相関を示す遺伝子は神経分化マーカーＶＩＭであることが明らかとなった。

図２０（ｂ）は、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンの各細胞に対する結合量と、未分化マーカーＰＯＵ５Ｆ１遺伝子の発現量を示す散布図である。図２０（ｃ）は、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンの各細胞に対する結合量と、神経分化マーカーＶＩＭ遺伝子の発現量を示す散布図である。

その結果、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンの結合量は、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子の発現量と正の相関を示し、ＶＩＭ遺伝子の発現量と負の相関を示すことが明らかとなった。すなわち、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンは、未分化マーカーＰＯＵ５Ｆ１遺伝子の発現が高く、神経分化マーカーＶＩＭ遺伝子の発現が低い細胞に結合することが明らかとなった。

図２１（ａ）は、各細胞における未分化マーカーＰＯＵ５Ｆ１遺伝子の発現量と、３９種のレクチンの結合量との相関係数を算出し、高い順に並べた図である。また、図２１（ｂ）は、各細胞における神経分化マーカーＯＴＸ２遺伝子の発現量と、３９種のレクチンの結合量との相関係数を算出し、高い順に並べた図である。

その結果、未分化マーカーＰＯＵ５Ｆ１遺伝子の発現量と最も高い正の相関係数を示したレクチンはｒＢＣ２ＬＣＮであることが明らかとなった。また、神経分化マーカーＯＴＸ２遺伝子の発現量と最も高い正の相関係数を示すレクチンはｒＡＡＬであることが明らかとなった。すなわち、ｒＡＡＬは、ヒトｉＰＳ細胞と比べて分化誘導後の神経細胞に優位に高い反応性を示す可能性が考えられた。

以上の結果から、本実験例の方法により、不均一で多様な細胞集団に発現する糖鎖と遺伝子を１細胞レベルで同時に計測することができ、更に得られたデータから１細胞レベルで発現する糖鎖と遺伝子の関係性を明らかにできることが示された。

Claims

細胞の表面の糖鎖を解析する方法であって、
前記細胞に、核酸標識された複数種類のレクチンを接触させることと、
前記細胞に結合した前記レクチンに標識された前記核酸を検出することと、を含み、
特定の種類の前記レクチンには特定の種類の核酸が標識されており、
前記核酸の種類及び量が、前記細胞の表面の糖鎖の種類及び量に対応する、方法。
前記糖鎖と共に、前記細胞の表現型又は前記細胞内のＲＮＡ情報を更に解析する、請求項１に記載の方法。
前記細胞に、核酸標識された前記レクチンを接触させることが、アルブミンを含む緩衝液中で行われる、請求項１又は２に記載の方法。
１細胞レベルで行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
前記検出が、リアルタイム定量ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ又は次世代シーケンサーによるシーケンスにより行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
請求項１～５のいずれかに記載の方法により細胞の表面の糖鎖を解析するためのキットであって、
核酸標識された複数種類のレクチンを含み、
特定の種類の前記レクチンには特定の種類の核酸が標識されている、キット。