JP7446882B2 - 被験者のスクリ－ニング方法及び鑑別方法 - Google Patents

Description

本発明は、被験者のスクリ－ニング方法及び鑑別方法に関し、より詳しくは、被験者由来の血液検体のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度に基づく被験者のスクリ－ニング方法及び鑑別方法に関する。

肝臓では、ウイルス性慢性肝炎（Ｂ型、Ｃ型等）やアルコ－ル性慢性肝炎の長期化、進行性の非アルコ－ル性脂肪性肝炎（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ：ＮＡＳＨ）等によって、徐々に肝線維化が進行して肝硬変へと進展する。ＮＡＳＨは、明らかな飲酒歴がないにも関わらず肝細胞に脂肪が沈着する非アルコ－ル性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）のうち、予後が良好な単純性脂肪肝とは異なり、肝臓に炎症や線維化が惹起されやすく、最終的には肝硬変や肝癌に進行することが知られている。また、ＮＡＳＨは、線維化をほとんど認めない症例から肝硬変まで幅広く、その予後は肝線維化の進行度で決定されるが、ＮＡＳＨの初期段階では自覚症状がないことが多く、既に肝硬変まで進行した段階で診断されることも多い。

また、肝線維化の進行度（すなわち肝線維化進展度）は、その程度に応じて、Ｆ０（線維化なし）、Ｆ１（慢性肝炎軽度）、Ｆ２（慢性肝炎中等度）、Ｆ３（肝硬変初期）、Ｆ４（肝硬変）、の４段階に分類される。肝線維化進展度の確定診断は、現在、肝生検による組織診断によって行われているが、肝生検は、その侵襲性から、重篤な合併症が生じうるといったリスクが高く、さらに、専門医が行う必要があるため、繰り返し行うことが困難であり、また、陰性の可能性のある患者には適さない。さらに、肝生検によって採取される組織量は肝臓全体の一部であるのに対して、肝線維化は肝臓全体に一様に進行するわけではないため、その診断の精度は必ずしも十分ではない。

これに対する非侵襲的方法として、血液検体中のバイオマ－カ－を指標として肝線維化進展度を予測する方法が検討されている。このようなバイオマ－カ－としては、例えば、ＩＩＩ型プロコラ－ゲンＮ末端ペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）、ＩＶ型コラ－ゲン、ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ、ヒアルロン酸等が知られている。

このうち、ＩＶ型コラ－ゲンは、基底膜を構成する主要なタンパク質であるが、肝線維化が起こると、ＩＶ型コラ－ゲンを含む基底膜構成成分が分泌されて沈着し、一部が循環血中に漏出するため、肝線維化の進行に伴って血中のＩＶ型コラ－ゲン分子に由来する成分の濃度が増加する。ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓは、ＩＶ型コラ－ゲン分子のＮ末端の７Ｓドメインを含む断片であるが、７Ｓドメインはタンパク質分解酵素の影響を受けにくいため、前記バイオマ－カ－として血中でも安定であると考えられている。また、例えば、Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２０１８，５３，ｐ．１２９－１３９（非特許文献１）には、ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓが、肝線維化の比較的初期から血中濃度が上昇する他の線維化マ－カ－よりも優れていることが報告されている。

このようなＩＶ型コラ－ゲン７Ｓの測定方法としては、例えば、特開平２－１５５３号公報（特許文献１）において、ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラ－ゲン７Ｓドメインと交差反応するモノクロ－ナル抗体を酵素標識抗体とし、ヒトＩＶ型コラ－ゲン７Ｓドメインのみに反応するモノクロ－ナル抗体を固相担体に結合させて抗体結合固相担体（捕捉抗体）として、ワンステップのサンドイッチイムノアッセイによってヒトＩＶ型コラ－ゲン７Ｓドメインを定量する方法が記載されている。また、国際公開第２０１６／１６３５３９号（特許文献２）には、ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓとその他のバイオマ－カ－とを組み合わせたスコアを用いてＮＡＦＬＤからＮＡＳＨを鑑別する方法が記載されている。

特開平２－１５５３号公報 国際公開第２０１６／１６３５３９号

Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２０１８，５３，ｐ．１２９－１３９

しかしながら、従来のバイオマ－カ－を指標とした方法では、肝線維化進展度がＦ０やＦ１の早期段階では当該バイオマ－カ－となる成分の血中濃度が低いため、健常人とＦ０段階又はＦ０以上の段階にある患者との鑑別が困難であった。特にＮＡＳＨをはじめとする肝疾患では、初期段階において自覚症状がないことが多いため、このような早期段階での鑑別は難しい。さらに、無症状の段階での健康診断等におけるスクリ－ニングには、被験者群から、肝線維化進展度がＦ０の段階にある可能性の高い被験者も選別する（スクリ－ニングする）ことが求められるが、これまで、被験者の肝線維化進展度がＦ０段階又はＦ０以上の段階にあると予測して正常群からスクリ－ニングできる方法は開発されていない。

本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、被験者の肝線維化進展度がＦ０以上の段階にあると予測して正常群からスクリ－ニングできる方法、並びに、被験者が正常であるかＦ０段階又はＦ０以上の段階にあるかの鑑別ができる方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決すべく鋭意検討を行い、本発明者らは、先ず、健常人由来の血清（正常群）におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値）の分布から、その９５パ－センタイル値、及び平均値＋２ＳＤ（ＳＤ：標準偏差）を算出した。また、前記正常群におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値と、肝生検の病理診断により肝線維化ステ－ジが確定し、肝線維化進展度がＦ０～Ｆ４のうちのいずれかの段階に分類される患者由来の血清（陽性群）におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値と、について、それぞれ、ＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）解析を行い、前記正常群を陰性と判断できる前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値（４．３～４．５ｎｇ／ｍＬ）を暫定カットオフ値とした。次いで、かかる暫定カットオフ値によって前記正常群から肝線維化進展度がＦ０以上の段階にある患者を拾い上げる（スクリ－ニングする）ことが可能かを検討したところ、肝線維化進展度がＦ０の段階にある患者の３２～３７％、Ｆ０以上の段階にある患者の５９～６４％、をいずれも拾い上げることが可能となることを見い出し、前記暫定カットオフ値の範囲内の値をカットオフ値として、肝線維化進展度がＦ０以上の段階にあると予測される肝生検対象者等の肝線維化リスク群を正常群からスクリ－ニングできることを見い出した。

また、前記正常群におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値と、前記陽性群におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値と、についての各ＲＯＣ解析から、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値が３．３５ｎｇ／ｍＬ以上３．７５ｎｇ／ｍＬ未満の範囲内にあるときに、正常群とＦ０以上の群との間における判定一致率が７５％以上、かつ、正常群とＦ０群との間において判定一致率が６５％以上となることを見い出し、前記範囲内の値を、肝線維化進展度がＦ０以上の段階にあると鑑別する（前記正常群と前記陽性群との間で群間切り分けをする）ためのカットオフ値とできることを見い出した。

さらに、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値に、各血清におけるＡＳＴ値を組み合わせて算出したＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値及びＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値についても同様にして、特定の範囲内の値を、それぞれ、肝線維化リスク群を正常群からスクリ－ニングするためのカットオフ値、或いは、肝線維化進展度がＦ０以上の段階にあると鑑別するためのカットオフ値とできることを見い出した。

さらにまた、鑑別においては、正常群及びＦ０群とＦ１以上の群との間、並びに、正常群、Ｆ０群、及びＦ１群とＦ２以上の群との間においても同様に、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値、前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値、前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値について、それぞれ特定の範囲内の値を、各群間の鑑別をするためのカットオフ値とできることを見い出し、本発明を完成するに至った。

かかる知見により得られた本発明の態様は次のとおりである。
［１］
被験者由来の血液検体のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度に基づくスコアを、予め定められたカットオフ値と比較して、前記スコアが前記カットオフ値よりも高い被験者を、肝線維化進展度がＦ０以上の段階にあると予測して選別することを特徴とする、被験者のスクリ－ニング方法。
［２］
前記スコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度であり、かつ、前記カットオフ値が、４．３～４．５ｎｇ／ｍＬの範囲から選択される値であることを特徴とする、［１］に記載の被験者のスクリ－ニング方法。
［３］
前記スコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度、及び血清におけるＡＳＴ活性値から、次式：
ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値＝０．９９４×ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ｎｇ／ｍＬ）＋０．０２５５×ＡＳＴ活性値（ＩＵ／Ｌ）
で求められるＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値であり、かつ、前記カットオフ値が、４．６～５．２の範囲から選択される値であることを特徴とする、［１］に記載の被験者のスクリ－ニング方法。
［４］
前記スコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度、及び血清におけるＡＳＴ活性値から、次式：
ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値＝１．５０×ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ｎｇ／ｍＬ）＋０．０２６４×ＡＳＴ活性値（ＩＵ／Ｌ）
で求められるＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値であり、かつ、前記カットオフ値が、６．７～７．５の範囲から選択される値であることを特徴とする、［１］に記載の被験者のスクリ－ニング方法。
［５］
前記肝線維化進展度がＮＡＳＨ重症度であることを特徴とする、［１］～［４］のうちのいずれか一項に記載のスクリ－ニング方法。
［６］
被験者由来の血液検体のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度に基づく第一のスコアを、予め定められた第一のカットオフ値と比較して、前記第一のスコアが前記第一のカットオフ値よりも高い被験者を、肝線維化進展度がＦ０段階又はＦ０以上の段階にあると鑑別することを特徴とする、被験者の鑑別方法。
［７］
前記第一のスコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度であり、かつ、前記第一のカットオフ値が、３．３５ｎｇ／ｍＬ以上３．７５ｎｇ／ｍＬ未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、［６］に記載の被験者の鑑別方法。
［８］
前記第一のスコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度、及び血清におけるＡＳＴ活性値から、次式：
ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値＝０．９９４×ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ｎｇ／ｍＬ）＋０．０２５５×ＡＳＴ活性値（ＩＵ／Ｌ）
で求められるＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値であり、かつ、前記第一のカットオフ値が、３．８２以上４．４２未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、［６］に記載の被検者の鑑別方法。
［９］
前記第一のスコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度、及び血清におけるＡＳＴ活性値から、次式：
ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値＝１．５０×ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ｎｇ／ｍＬ）＋０．０２６４×ＡＳＴ活性値（ＩＵ／Ｌ）
で求められるＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値であり、かつ、前記第一のカットオフ値が、５．５３以上６．３５未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、［６］に記載の被験者の鑑別方法。
［１０］
被験者由来の血液検体のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度に基づく第二のスコアを、予め定められた第二のカットオフ値と比較して、前記第二のスコアが前記第二のカットオフ値よりも高い被験者を、肝線維化進展度がＦ１段階又はＦ１以上の段階にあると判定してさらに鑑別することを特徴とする、［６］～［９］のうちのいずれか一項に記載の被検者の鑑別方法。
［１１］
前記第二のスコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度であり、かつ、前記第二のカットオフ値が、３．７５ｎｇ／ｍＬ以上３．８５ｎｇ／ｍＬ未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、［１０］に記載の被験者の鑑別方法。
［１２］
前記第二のスコアが、前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値であり、かつ、前記第二のカットオフ値が、４．４２以上４．８７未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、［１０］に記載の被験者の鑑別方法。
［１３］
前記第二のスコアが、前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値であり、かつ、前記第二のカットオフ値が、６．３５以上６．８４未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、［１０］に記載の被験者の鑑別方法。
［１４］
被験者由来の血液検体のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度に基づく第三のスコアを、予め定められた第三のカットオフ値と比較して、前記第三のスコアが前記第三のカットオフ値よりも高い被験者を、肝線維化進展度がＦ２段階又はＦ２以上の段階にあると判定してさらに鑑別することを特徴とする、［６］～［１３］のうちのいずれか一項に記載の被験者の鑑別方法。
［１５］
前記第三のスコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度であり、かつ、前記第三のカットオフ値が、３．８５ｎｇ／ｍＬ以上４．８５ｎｇ／ｍＬ未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、［１４］に記載の被験者の鑑別方法。
［１６］
前記第三のスコアが、前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値であり、かつ、前記第三のカットオフ値が、４．８７以上６．０９未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、［１４］に記載の被験者の鑑別方法。
［１７］
前記第三のスコアが、前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値であり、かつ、前記第三のカットオフ値が、６．８４以上８．５４未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、［１４］に記載の被験者の鑑別方法。
［１８］
前記肝線維化進展度がＮＡＳＨ重症度であることを特徴とする、［６］～［１７］のうちのいずれか一項に記載の被験者の鑑別方法。
［１９］
被験者由来の血液検体のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度に基づく第二のスコアを、予め定められた第二のカットオフ値と比較して、前記第二のスコアが前記第二のカットオフ値よりも高い被験者を、肝線維化進展度がＦ１段階又はＦ１以上の段階にあると鑑別することを特徴とする、被験者の鑑別方法。
［２０］
前記第二のスコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度であり、かつ、前記第二のカットオフ値が、３．７５ｎｇ／ｍＬ以上３．８５ｎｇ／ｍＬ未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、［１９］に記載の被験者の鑑別方法。
［２１］
前記第二のスコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度、及び血清におけるＡＳＴ活性値から、次式：
ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値＝０．９９４×ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ｎｇ／ｍＬ）＋０．０２５５×ＡＳＴ活性値（ＩＵ／Ｌ）
で求められるＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値であり、かつ、前記第二のカットオフ値が、４．４２以上４．８７未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、［１９］に記載の被験者の鑑別方法。
［２２］
前記第二のスコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度、及び血清におけるＡＳＴ活性値から、次式：
ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値＝１．５０×ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ｎｇ／ｍＬ）＋０．０２６４×ＡＳＴ活性値（ＩＵ／Ｌ）
で求められるＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値であり、かつ、前記第二のカットオフ値が、６．３５以上６．８４未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、［１９］に記載の被験者の鑑別方法。
［２３］
前記肝線維化進展度がＮＡＳＨ重症度であることを特徴とする、［１９］～［２２］のうちのいずれか一項に記載の被験者の鑑別方法。

本発明によれば、被験者の肝線維化進展度がＦ０以上の段階にあると予測して正常群からスクリ－ニングできる方法、並びに、被験者が正常であるかＦ０段階又はＦ０以上の段階にあるかの鑑別ができる方法を提供することが可能となる。

これにより、正常群から、肝線維化進展度がＦ０以上の段階にあると予測される肝線維化リスク群をスクリ－ニングし、肝生検対象者や各治療対象者として選別することが可能となる。また、肝線維化進展度がＦ０の早期段階における鑑別が可能となる。

（ａ）ＲＩＡキット又は（ｂ）サンドイッチイムノアッセイによる各検体中のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓの濃度とその変動計数との関係を示すグラフである。

以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。本発明は、
被験者由来の血液検体のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度に基づくスコアを、予め定められたカットオフ値と比較して、前記スコアが前記カットオフ値よりも高い被験者を、肝線維化進展度がＦ０以上の段階にあると予測して選別する、被験者のスクリ－ニング方法、並びに、
被験者由来の血液検体のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度に基づく第一のスコアを、予め定められた第一のカットオフ値と比較して、前記第一のスコアが前記第一のカットオフ値よりも高い被験者を、肝線維化進展度がＦ０段階又はＦ０以上の段階にあると鑑別する、被験者の鑑別方法、
を提供する。

（肝線維化進展度）
本発明において、「肝線維化進展度」とは、肝臓における線維化の程度を示す指標であり、慢性肝炎の肝組織診断基準－新犬山分類（１９９６）により、次の段階：
Ｆ０：線維化無し
Ｆ１：門脈域の線維性拡大、慢性肝炎軽度
Ｆ２：線維性架橋形成、慢性肝炎中等度
Ｆ３：小葉構造のひずみを伴った線維性架橋形成、肝硬変初期
Ｆ４：肝硬変（結節形性傾向が全体に認められる）
の５段階に分類される。被験者がこれらの段階のうちのいずれの段階に真に分類されるかは、肝生検によって決定される。なお、欧米で用いられているＤｅｓｍｅｔらによる新ヨ－ロッパ分類は前記新犬山分類に一致しており、Ｉｓｈａｋらによる新しいＨＡＩ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）スコアではステ－ジが６段階に細分化されているが、基本的に大きな差はない。

前記肝線維化が惹起されうる疾患としては、例えば、ウイルス性慢性肝炎（Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎等）、アルコ－ル性慢性肝炎、ＮＡＳＨが挙げられる。特にＮＡＳＨの予後は肝線維化の進行度で決定されるため、前記肝線維化進展度としては、「ＮＡＳＨ重症度」として、本発明のスクリ－ニング方法又は鑑別方法を、ＮＡＳＨ患者を正常群からスクリ－ニングする方法又はＮＡＳＨ患者の肝線維化進展度の鑑別方法として用いることが好ましい。

本発明においては、肝線維化進展度がＦ０段階にある患者からなる群を「Ｆ０群」、肝線維化進展度がＦ１段階にある患者からなる群を「Ｆ１群」、肝線維化進展度がＦ２段階にある患者からなる群を「Ｆ２群」、肝線維化進展度がＦ３段階にある患者からなる群を「Ｆ３群」、肝線維化進展度がＦ４段階にある患者からなる群を「Ｆ４群」、という。

また、これらに対して、本発明では、臨床的に肝疾患を有さないと判断された被検者を、肝線維化進展度がＦ０未満にあるとして、これら被検者からなる群を「正常群」という。本発明では、例えば、基礎疾患歴が無く、ＢＭＩ：２５以下、ＡＳＴ＜２５、ＡＬＴ＜２５、ＡＳＴ＞ＡＬＴである健常人からなる群を「正常群」としてもよい。ＡＳＴは、血清におけるＡＳＴ活性値（単位：ＩＵ／Ｌ）を示し、ＡＬＴは、血清におけるＡＬＴ活性値（単位：ＩＵ／Ｌ）を示し、それぞれ、従来公知の方法又はそれに準じた方法によって測定することができる。

（被験者）
本発明において、「被験者」とは、本発明のスクリ－ニング又は鑑別を行う対象を示し、自覚症状のない者であっても、予後の決定や治療効果の確認等を目的とした、既に前記疾患に罹患していることが既知の患者であってもよい。前記被験者は、本発明のスクリ－ニングにより、正常群とＦ０以上の群（Ｆ０群、Ｆ１群、Ｆ２群、Ｆ３群、及びＦ４群を含む群、以下同様）とのいずれに分別されるかが予測され、また、本発明の鑑別により、正常群、Ｆ０群若しくはＦ０以上の群、Ｆ１群若しくはＦ１以上の群、Ｆ２群若しくはＦ２以上の群、Ｆ３群若しくはＦ３以上の群、及びＦ４群、のいずれかに分別される。

（スクリ－ニング）
「スクリ－ニング」とは、目標疾患に罹患している可能性、又は目標状態になっている可能性がある被検者を選別することを示し、本発明では具体的に、正常群（陰性群）と肝線維化進展度がＦ０以上の群（陽性群）との２群に切り分け、被験者を、肝線維化進展度がＦ０以上の段階にあると予測して、すなわち被験者が陽性群にある可能性があると判断して、正常群（陰性群）から選別することを示す。この場合の予測基準としては、少なくとも陰性一致率（当該スクリ－ニングによって正常群と予測された被験者が真に正常群にある割合）が１００％であることが好ましい。

（鑑別）
「鑑別」とは、目標疾患又は状態を、他の疾患又は状態と区別することを示し、本発明では具体的に、肝線維化進展度が陰性である群（陰性群）と陽性である群（陽性群）との２群に切り分け、被験者が、前記陰性群に含まれるのか陽性群に含まれるのかを判別することを示す。かかる鑑別は、医師等による肝線維化進展度の診断の補助に適用することができる。正常群とＦ０群若しくはＦ０以上の群との間の鑑別の場合には、正常群が陰性群、Ｆ０以上の群（Ｆ０群、Ｆ１群、Ｆ２群、Ｆ３群、Ｆ４群）が陽性群；正常群及びＦ０群とＦ１群若しくはＦ１以上にある群との間の鑑別の場合には、正常群及びＦ０群が陰性群、Ｆ１以上の群（Ｆ１群、Ｆ２群、Ｆ３群、Ｆ４群）が陽性群；正常群、Ｆ０群、及びＦ１群とＦ２群若しくはＦ２以上の群との間の鑑別の場合には、正常群、Ｆ０群、及びＦ１群が陰性群、Ｆ２以上の群（Ｆ２群、Ｆ３群、Ｆ４群）が陽性群；正常群、Ｆ０群、Ｆ１群、及びＦ２群とＦ３群若しくはＦ３以上の群との間の鑑別の場合には、正常群、Ｆ０群、Ｆ１群、及びＦ２群が陰性群、Ｆ３以上の群（Ｆ３群、Ｆ４群）が陽性群；正常群、Ｆ０群、Ｆ１群、Ｆ２群、及びＦ３群とＦ４群との間の鑑別の場合には、正常群、Ｆ０群、Ｆ１群、Ｆ２群、及びＦ３群が陰性群、Ｆ４群が陽性群；となる。

この場合の判別基準としては、少なくとも、陰性群と陽性群の最も陰性群に近い群との間（例えば、正常群とＦ０群との間）において判定一致率（当該鑑別によって陽性と判定された被検者が真に陽性群にあり、かつ、陰性と判定された被験者が真に陰性群にある率）が６５％以上、かつ、陰性群と陽性群との間（例えば、正常群とＦ０以上の群との間）において判定一致率が７５％以上であることが好ましい。

（血液検体）
本発明において、「血液検体」としては、前記被験者から採取されたものであって下記のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓが存在し得る限り特に制限はないが、一般的には、被験者（ヒト）から採取された血清、血漿、全血が挙げられ、好ましくは血清又は血漿が挙げられ、より好ましくは血清である。また、前記血液検体としては、必要に応じて希釈液で適宜希釈又は懸濁されたものであっても前処理を施されたものであってもよい。

（ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ）
本発明において、「ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ」とは、ヒトＩＶ型コラ－ゲン７Ｓドメインを含む断片を示し、７Ｓドメインを含むヒトＩＶ型コラ－ゲンの断片であれば特に制限されない。このような断片としては、例えば、７Ｓドメインからなる断片；７ＳドメインとＴＨドメインの全部又は一部とからなる断片；７ＳドメインとＴＨドメインの全部又は一部とＮＣ１ドメインとからなる断片；が挙げられ、これらのうちの１種を単独であっても２種以上の混合物であってもよい。なお、本発明において、「７Ｓドメイン」には、多量体を形成していない７Ｓドメイン及び２～４量体を形成している７Ｓドメインをいずれも含み、「ＴＨドメイン」は、Ｔｒｉｐｌｅ Ｈｅｌｉｃａｌ ｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ ｄｏｍａｉｎであって、らせん構造を形成していないＴＨドメイン及び前記らせん構造を形成しているＴＨドメインをいずれも含み、「ＮＣ１ドメイン」は、Ｎｏｎｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ ｄｏｍａｉｎであって、多量体を形成していないＮＣ１ドメイン及び２量体を形成しているＮＣ１ドメインをいずれも含む。

（ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度及びその測定方法）
本発明において、「血液検体のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度」としては、当該血液検体の血清又は血漿あたりのＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度であることが好ましい。

本発明に係るＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度の測定方法としては、従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、また、市販の測定試薬を適宜用いてもよいが、正常群（好ましくはｎが３０以上）について血清又は血漿あたりのＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度を測定した場合に、その９５パ－センタイル値及び平均値＋２ＳＤを十分に小さくできる方法であることが好ましく、例えば、正常群の９５パ－センタイル値を４．３ｎｇ／ｍＬ以下、及び／又は、平均値＋２ＳＤを４．５ｎｇ／ｍＬ以下とできる方法であることが好ましく、正常群の９５パ－センタイル値を４．３ｎｇ／ｍＬ以下、かつ、平均値＋２ＳＤを４．５ｎｇ／ｍＬ以下とできる方法であることがより好ましく、正常群の９５パ－センタイル値を４．１ｎｇ／ｍＬ以下、かつ、平均値＋２ＳＤを４．３ｎｇ／ｍＬ以下とできる方法であることがさらに好ましい。

前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度の測定方法としては、例えば、免疫学的手法が挙げられ、前記免疫学的手法としては、例えば、サンドイッチイムノアッセイ法、競合法、凝集法、イムノクロマト法、ウエスタンブロット法が挙げられる。また、前記免疫学的手法としては、例えば、標識として酵素を用いる酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、及び電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、標識として化学発光性物質で標識した化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、標識として蛍光を用いる蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、並びに標識として放射性同位元素を用いるラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。また、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度の測定は、他に、例えば、液体クロマトグラフィ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）、液体クロマトグラフィタンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）等の質量分析法で行われてもよい。

このうち、例えば、前記免疫学的手法を利用する場合には、高感度な検出システムを構築することができる点で、サンドイッチイムノアッセイ法が好適である。前記サンドイッチイムノアッセイ法においては、担体に固定した捕捉用分子で前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓを捕捉し、また、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓを標識物質が結合した検出用分子に認識させて、捕捉用分子－ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ－検出用分子の複合体を形成させ、それを、必要に応じて洗浄後、前記標識物質の種類に応じた検出を行う。

前記サンドイッチイムノアッセイ法において、前記捕捉用分子及び前記検出用分子としては、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓに結合可能な分子である限り特に限定されないが、捕捉用分子及び検出用分子の少なくとも一方に、ヒトＩＶ型コラ－ゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能なモノクロ－ナル抗体を用いることが好ましく、両方に前記ヒトＩＶ型コラ－ゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能なモノクロ－ナル抗体を用いることが好ましい。

前記「ヒトＩＶ型コラ－ゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能なモノクロ－ナル抗体（以下、場合により「抗７Ｓドメイン抗体」という）」は、ヒトＩＶ型コラ－ゲン７Ｓドメインのみを特異的に認識し、結合することができるモノクロ－ナル抗体である。すなわち、前記抗７Ｓドメイン抗体は、ヒトＩＶ型コラ－ゲンの７Ｓドメイン以外の部位には結合しない。

なお、本発明における「抗体」には、完全な抗体の他、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディ－等）や抗体の可変領域を結合させた低分子化抗体も含まれる。

抗体が前記抗７Ｓドメイン抗体であることは、例えば、ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ断片を特異的に認識して結合することで確認することができる。前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ断片とは、好ましくは７Ｓドメインの４量体からなり、ヒトＩＶ型コラ－ゲン分子をペプシン消化したペプシン可溶化ＩＶ型コラ－ゲン断片をさらにコラゲナ－ゼ処理して得られる分解産物の、分子量が２００ｋＤａ以上、かつ、４００ｋＤａ付近のゲルろ過分画に含まれる断片、又はそれに相当する分子量を有する７Ｓドメインを含むヒトＩＶ型コラ－ゲンの断片を示す。前記コラゲナ－ゼ処理の時間としては、添加するコラゲナーゼの濃度によって異なるが、例えば、３０分～１４時間であることが好ましく、処理温度としては、３０～３７℃であることが好ましい。

前記抗７Ｓドメイン抗体は、従来公知の方法を適宜採用、改良することによって産生することができ、例えば、抗体産生細胞とミエロ－マ細胞とを融合した細胞（ハイブリド－マ）によるモノクロ－ナル抗体の産生方法（代表的には、ケ－ラ－及びミルスタインによる方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５））によって産生することができる。前記抗体産生細胞としては、従来公知の方法及びそれに準じた方法で適宜調製することが可能であり、また、前記ミエロ－マ細胞としては、公知の種々の細胞株を使用することができる。

前記抗体産生細胞とミエロ－マ細胞とから得られた多くのハイブリド－マの中から、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ断片に対して高い反応性を示すモノクロ－ナル抗体を産生するハイブリド－マをスクリ－ニングし、また、必要に応じてその中からさらに、選抜したハイブリド－マが産生するモノクロ－ナル抗体のエピト－プ解析を行って、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ断片に結合するモノクロ－ナル抗体を産生するクロ－ンを同定することによって、ヒトＩＶ型コラ－ゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能なモノクロ－ナル抗体（抗７Ｓドメイン抗体）を産生するハイブリド－マを得ることができる。

また、前記抗７Ｓドメイン抗体としては、例えば、当該抗体をコ－ドするＤＮＡが取得できれば、従来公知の組換えＤＮＡ法及びそれに準じた方法で適宜作製することもできる。

前記サンドイッチイムノアッセイ法において、前記捕捉用分子及び前記検出用分子としては、互いに同一であっても異なっていてもよい。血液検体中においては、通常、ヒトＩＶ型コラ－ゲン７Ｓドメインは２～４量体（好ましくは４量体）を形成しているため、捕捉用分子と検出用分子とが同一の部位を認識・結合する同種の分子であっても、各々が多量体のうちのいずれかのヒトＩＶ型コラ－ゲン７Ｓドメインに結合することが可能である。

前記担体としては、例えば、磁性粒子やラテックス粒子などの粒子、プラスチックプレ－トなどのプレ－ト、ニトロセルロ－スなどの繊維状物質を用いることができる。前記捕捉用分子は前記担体に直接的に固定しても、間接的に固定してもよい。直接的に固定する場合には、例えば、前記担体にカルボキシ基等の活性基を付与し、或いは、前記担体としてこれらの活性基を有するものを用い、当該活性基による共有結合によって前記捕捉用分子を前記担体表面に結合させる方法が挙げられる。また、間接的に固定する方法としては、例えば、前記捕捉用分子に結合する物質を前記担体表面に固定し、当該物質に捕捉用分子を結合させることによって補足用分子を前記担体に間接的に固定する方法が挙げられる。前記捕捉用分子が抗体である場合、捕捉用分子に結合する物質としては、例えば、当該抗体に結合可能な二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡ、活性基を有するリンカ－分子が挙げられるが、これらに制限されない。また、前記捕捉用抗体がビオチン化されている場合には、アビジン化した抗体を利用することができる。

前記標識物質としては、特に制限されず、例えば、酵素；アクリジニウム誘導体等の発光物質；ユ－ロピウム等の蛍光物質；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）及びフィコエリスリン（Ｒ－ＰＥ）等の蛍光タンパク質；^１２５Ｉ等の放射性物質；フルオレセインイソチオシアネ－ト（ＦＩＴＣ）及びロ－ダミンイソチオシアネ－ト（ＲＩＴＣ）等の低分子量標識物質；金粒子；アビジン；ビオチン；ラテックス；ジニトロフェニル（ＤＮＰ）；ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）が挙げられる。これらの中でも、前記標識物質としては、簡便かつ安定性のある試験を可能とする傾向にある観点、及び簡便迅速かつ高感度の測定を行うことが可能である観点からは、酵素及び発光物質が好ましく、酵素がより好ましい。前記酵素としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダ－ゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファタ－ゼ（ＡＬＰ）、β－ガラクトシダ－ゼ（β－ｇａｌ）、グルコ－スオキシダ－ゼ、ルシフェラ－ゼを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。前記標識物質と前記検出用分子とを結合させる方法としては、前記担体と前記捕捉用分子との結合方法として挙げた方法と同様の方法が挙げられる。

前記サンドイッチイムノアッセイ法において、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度の測定は、前記標識物質によって生じるシグナルを検出し、これを定量することによって行うことができる。例えば、前記標識物質として酵素を用いた場合には、発色基質、蛍光基質、化学発光基質等を基質として添加することにより、前記基質に応じてＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度の定量を行うことができる。なお、前記「シグナル」には、呈色（発色）、反射光、発光、蛍光、放射性同位体による放射線等が含まれ、肉眼で確認できるものの他、シグナルの種類に応じた測定方法・装置によって確認できるものも含まれる。

このようなサンドイッチイムノアッセイ法の一態様としては、上記の正常群の９５パ－センタイル値及び平均値＋２ＳＤをより十分に小さくできる方法として、例えば、捕捉用分子及び検出用分子の両方に前記抗７Ｓドメイン抗体を用いた以下の測定方法：
ヒトＩＶ型コラ－ゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能な第一のモノクロ－ナル抗体が担体に固定されてなる捕捉抗体と、ヒトＩＶ型コラ－ゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能な第二のモノクロ－ナル抗体が標識物質に結合してなる標識抗体と、を用いて、サンドイッチイムノアッセイにより、血液検体中のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓを測定する方法
が挙げられる。

前記第一のモノクロ－ナル抗体及び第二のモノクロ－ナル抗体は前記抗７Ｓドメイン抗体に述べたとおりであり、これらは互いに同一であっても異なっていてもよい。また、前記担体及び標識物質としては前記捕捉用分子及び前記検出用分子に述べたとおりである。

前記サンドイッチイムノアッセイによる測定方法においては、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓを前記捕捉抗体で捕捉する反応系の塩濃度が０．３５Ｍ（Ｍ：ｍｏｌ／Ｌ、以下同じ）以上であることが好ましい。前記塩濃度としては、０．３５～１．３Ｍであることがより好ましく、０．４２～１．０Ｍであることがより好ましく、０．４３～０．９９Ｍであることがさらに好ましい。前記測定方法においては、前記塩濃度が前記範囲内にあることによって特に、健常人由来の検体における非特異反応が軽減される。

前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓを前記捕捉抗体で捕捉する反応系としては、前記血液検体と前記捕捉抗体と前記塩とを含む反応系であれば特に限定されないが、水溶液であることが好ましく、他に、生理食塩水、精製水；ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＣＦＢ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、トリシンバッファ－、ビシンバッファ－、グリシンバッファ－等の緩衝液；ＢＳＡ等の安定化タンパク質；各種界面活性剤をさらに含んでいてもよく、また、リバ－スサンドイッチ法や１ステップ法を採用する場合には前記標識抗体をさらに含んでいてもよい。なお、これらの他の成分に塩が含まれる場合、前記反応系の塩濃度には、当該塩の濃度も含まれる。

また、前記試料に塩が含まれる場合、前記反応系の塩濃度には、当該塩の濃度も含まれる。血液検体（全血、血清、血漿）には、一般的に合計で１４０ｍＭ～１５０ｍＭ相当の塩が含まれる。前記試料として、例えば、血液検体（全血、血清、血漿）を用いる場合、下記実施例のように、０．６Ｍの塩を含む粒子希釈液５０μＬに、試料として血清検体３０μＬを加えると、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓを前記捕捉抗体で捕捉する反応系の塩濃度は、０．４３Ｍとなる。

前記塩としては、特に限定されないが、アルカリ金属イオン、アルカリ金属イオンの無機塩、及びアルカリ金属イオンの有機塩からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましく、前記アルカリ金属イオンの無機塩としては、アルカリ金属の塩化物、アルカリ金属の酒石酸塩、アルカリ金属の硝酸塩、アルカリ金属の硫酸塩が挙げられる。前記アルカリ金属イオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオンが好ましい。この場合、前記塩濃度とは、アルカリ金属イオンの濃度に相当する濃度を示す。

前記サンドイッチイムノアッセイ法としては、測定精度の観点から、２ステップ法であることが好ましく、フォワ－ドサンドイッチ法であることがより好ましい。このようなフォワ－ドサンドイッチ法である前記サンドイッチイムノアッセイ法のさらなる態様としては、
前記血液検体と前記捕捉抗体とを接触させ、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓを前記捕捉抗体で捕捉する捕捉工程と、
前記捕捉工程の後に、前記標識抗体と、前記捕捉抗体に捕捉されたＩＶ型コラ－ゲン７Ｓとを接触させ、前記捕捉抗体に捕捉されたＩＶ型コラ－ゲン７Ｓを標識する標識工程と、
を含む測定方法が挙げられる。

前記捕捉工程、及び前記標識工程の条件としては特に制限されず、適宜調整することができるが、前記捕捉抗体と前記試料とを接触させる際には、前記塩濃度の条件を満たすことが好ましい。また、前記サンドイッチイムノアッセイ法としては、必要に応じて、前記捕捉工程の後、かつ、前記標識工程の前、及び／又は、前記標識工程の後に、前記捕捉抗体に捕捉されたＩＶ型コラ－ゲン７Ｓと、それ以外の捕捉されていない夾雑物とを分離し、前記夾雑物を除去する洗浄工程をさらに含むことが好ましい。前記夾雑物を除去する方法としては、特に制限されず、従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、必要に応じて、洗浄液の注入及び除去を繰り返してもよい。前記洗浄液としては、例えば、中性（好ましくは、ｐＨ６～９）の公知の緩衝液（ナトリウムリン酸バッファ－、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＣＦＢ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、トリシンバッファ－、ビシンバッファ－、グリシンバッファ－等）が挙げられ、また、ＢＳＡ等の安定化タンパク質や界面活性剤等が添加されたものであってもよい。

前記サンドイッチイムノアッセイにおいては、捕捉抗体－ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ－標識抗体の複合体が得られるため、当該測定方法においては、前記複合体の標識抗体の標識物質を、当該標識物質に応じた所定の方法で測定する。これにより、血液検体中（好ましくは血清又は血漿中）のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓの量をシグナルとして検出することができる。また、血液検体中のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度は、一般的に、各濃度のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓを含む標準溶液による測定値との比較により行うことができる。

（ＡＳＴ活性値及びその測定方法）
本発明において、「ＡＳＴ活性値」とは、前記血液検体の血清あたりのＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラ－ゼ）の活性値を示す。このようなＡＳＴ活性値は、従来公知の方法又はそれに準じた方法で適宜測定することができる。また、市販の測定試薬を適宜用いてもよい。

前記ＡＳＴ活性値の測定方法としては、例えば、血清におけるα－ケトグルタル酸のα－ケト基とＬ－アスパラギン酸のアミノ基との転移反応の触媒能として測定することができ、その測定方法の一例としては、先ず、血清検体にＬ－アスパラギン酸、β－ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド還元型（β－ＮＡＤＨ）、及びリンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）を添加し、次いで、これにα－ケトグルタル酸を添加して、β－ＮＡＤＨの減少に伴う吸光度の減少速度を測定することにより求めることができる。前記血清検体中にＡＳＴが存在する場合には、ＡＳＴが、α－ケトグルタル酸のα－ケト基とＬ－アスパラギン酸のアミノ基との転移反応を触媒し、オキサロ酢酸及びＬ－グルタミン酸が生成される。すると、このオキサロ酢酸にβ－ＮＡＤＨの存在下でリンゴ酸脱水素酵素が作用するため、リンゴ酸及びβ－ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド酸化型（β－ＮＡＤ^＋）が生成される。したがって、前記β－ＮＡＤＨの減少に伴う吸光度の減少速度を測定することによって、血清におけるＡＳＴ活性値を求めることができる。

（スコア）
本発明において、「スコア」とは、下記のカットオフ値と比較するための、被験者由来の数値を示し、具体的には、被験者由来の血液検体のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度に基づいて求められる値を示す。本発明において、前記「スコア」には、「血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度」、「ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値」、及び「ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値」が含まれる。

本発明に係る「血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度」は、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度の測定方法により、血清又は血漿あたりのＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（単位：ｎｇ／ｍＬ）として得ることができる。

また、本発明に係る「ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値」は、前記血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度）と、前記ＡＳＴ活性値の測定方法によって血清あたりのＡＳＴ活性値（単位：ＩＵ／Ｌ）として得られる、「血清におけるＡＳＴ活性値（ＡＳＴ活性値）」と、から、次式：
ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値＝０．９９４×ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ｎｇ／ｍＬ）＋０．０２５５×ＡＳＴ活性値（ＩＵ／Ｌ）
で求められる値である。ここで、ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値は、ＮＡＳＨ予測スコアリングシステムの一つであり、係数０．９９４及び０．０２５５は、非特許文献１に記載のとおり、データマイニングによって設定された係数である。

さらに、本発明に係る「ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値」は、前記血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度と、前記血清におけるＡＳＴ活性値と、から、次式：
ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値＝１．５０×ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ｎｇ／ｍＬ）＋０．０２６４×ＡＳＴ活性値（ＩＵ／Ｌ）
で求められる値である。ここで、ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値は、肝線維化スコアリングシステムの一つであり、係数１．５０及び０．０２６４は、非特許文献１に記載のとおり、データマイニングによって設定された係数である。

血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度のみならず、これをＡＳＴ活性値と組み合わせた、前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値、及びＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値によっても、これらを下記のカットオフ値と比較することによって、被験者の肝線維化進展度がＦ０段階又はＦ０以上の段階にあると予測して正常群からスクリ－ニングすることができ、また、被験者が正常であるかＦ０段階又はＦ０以上の段階にあるかの鑑別ができる。

本発明の鑑別方法に係るスコアとしては、下記の第一のカットオフ値、第二のカットオフ値、第三のカットオフ値、第四のカットオフ値、及び第五のカットオフ値と比較するスコアを、それぞれ便宜上、「第一のスコア」、「第二のスコア」、「第三のスコア」、「第四のスコア」、及び「第五のスコア」とするが、これらスコアとしては、１種を単独であっても（例えば、全てのスコアが血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度であるなど）、第一～第五のカットオフ値の組み合わせに応じて２種以上の組み合わせ（例えば、第一のスコアが血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度、第二のスコアがＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値であるなど）であってもよい。

（カットオフ値）
「カットオフ値」とは、前記スコアによって判定するための基準となる予め定められた値であり、分類結果の陽性又は陰性を判定するための境界値のことを示す。本発明のスクリ－ニング方法におけるカットオフ値は、前記スコアが当該カットオフ値よりも高い被験者を、肝線維化進展度がＦ０以上の段階にあると予測して選別するための値である。また、本発明の鑑別方法におけるカットオフ値は、前記スコアが当該カットオフ値よりも高い被験者を、前記陽性群にあると鑑別するための値である。

本発明において、範囲で定められるカットオフ値は、被験者の種類、スクリ－ニング又は鑑別の目的に応じて、その範囲内からいずれか１点を選択して適用する。また、本発明の鑑別方法において、各カットオフ値の有効数字は、小数点以下２桁とする。

また、本発明の鑑別方法に係るカットオフ値は、便宜上、正常群とＦ０群若しくはＦ０以上の群との間の鑑別の場合に「第一のカットオフ値」、正常群及びＦ０群とＦ１群若しくはＦ１以上にある群との間の鑑別の場合に「第二のカットオフ値」；正常群、Ｆ０群、及びＦ１群とＦ２群若しくはＦ２以上の群との間の鑑別の場合に「第三のカットオフ値」；正常群、Ｆ０群、Ｆ１群、及びＦ２群とＦ３群若しくはＦ３以上の群との間の鑑別の場合に「第四のカットオフ値」；正常群、Ｆ０群、Ｆ１群、Ｆ２群、及びＦ３群とＦ４群との間の鑑別の場合に「第五のカットオフ値」；とする。

〔スクリ－ニング方法におけるカットオフ値〕
・ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値をスコアとする場合
本発明のスクリ－ニング方法におけるカットオフ値は、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値）を前記スコアとする場合には、４．３～４．５ｎｇ／ｍＬの範囲から選択される値である。前記カットオフ値を前記範囲内から選択することにより、例えば、陰性一致率＝１００％で、肝線維化進展度がＦ０の段階にある患者の３０％以上、Ｆ０以上の段階にある患者の５０％以上、をいずれも拾い上げることが可能となる。

本発明のスクリ－ニング方法におけるカットオフ値として、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値を前記スコアとする場合、当該カットオフ値は、正常群におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値の分布から求められる、９５パ－センタイル値、及び平均値＋２ＳＤの値よりも高値であり、かつ、正常群におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値と、陽性群（肝線維化進展度がＦ０～Ｆ４のうちのいずれかの段階に分類される患者）におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値と、についてＲＯＣ解析から決定された値である。ＲＯＣ解析において用いる「ＲＯＣ曲線」は、縦軸を真陽性率（ＴＰＦ：Ｔｒｕｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ）すなわち感度、横軸を偽陽性率（ＦＰＦ：Ｆａｌｓｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ）すなわち（１－特異度）とし、検査結果のどの値を所見ありと判断するかの閾値、つまりカットオフポイント（ｃｕｔｏｆｆ ｐｏｉｎｔ）を媒介変数として変化させてプロットしていくことで作成される。特異度とは、健常人を正確に陰性と判断する率である。本発明のスクリ－ニング方法におけるカットオフ値は、特異度を１とし、感度を高める（１に近づくようする）ように設定し、さらに正常群におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値の分布から求められる、９５パ－センタイル値、及び平均値＋２ＳＤよりも高値とすることで決定することができる。

・ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値をスコアとする場合
本発明のスクリ－ニング方法におけるカットオフ値は、前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値を前記スコアとする場合には、４．６～５．２の範囲から選択される値である。前記カットオフ値を前記範囲内から選択することにより、例えば、陰性一致率＝１００％で、肝線維化進展度がＦ０の段階にある患者の４５％以上、Ｆ０以上の段階にある患者の７０％以上、をいずれも拾い上げることが可能となる。

本発明のスクリ－ニング方法におけるカットオフ値として、前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値を前記スコアとする場合、当該カットオフ値は、正常群におけるＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値の分布から求められる、９５パ－センタイル値、及び平均値＋２ＳＤの値よりも高値であり、かつ、正常群におけるＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値と、陽性群（肝線維化進展度がＦ０～Ｆ４のうちのいずれかの段階に分類される患者）におけるＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値と、についてＲＯＣ解析から求められた値である。このようなカットオフ値は、上記のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値を前記スコアとする場合のカットオフ値と同様に決定される。

・ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値をスコアとする場合
本発明のスクリ－ニング方法におけるカットオフ値は、前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値を前記スコアとする場合には、６．７～７．５の範囲から選択される値である。前記カットオフ値を前記範囲内から選択することにより、例えば、陰性一致率＝１００％で、肝線維化進展度がＦ０の段階にある患者の３５％以上、Ｆ０以上の段階にある患者の６０％以上、をいずれも拾い上げることが可能となる。

本発明のスクリ－ニング方法におけるカットオフ値として、前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値を前記スコアとする場合、当該カットオフ値は、正常群におけるＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値の分布から求められる、９５パ－センタイル値、及び平均値＋２ＳＤの値よりも高値であり、かつ、正常群におけるＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値と、陽性群（肝線維化進展度がＦ０～Ｆ４のうちのいずれかの段階に分類される患者）におけるＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値と、についてＲＯＣ解析から求められた値である。このようなカットオフ値は、上記のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値を前記スコアとする場合のカットオフ値と同様に決定される。

〔鑑別方法におけるカットオフ値〕
・ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値をスコアとする場合
本発明の鑑別方法におけるカットオフ値は、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値を前記スコアとする場合には、正常群とＦ０群若しくはＦ０以上の群との間のカットオフ値（第一のカットオフ値）、正常群及びＦ０群とＦ１群若しくはＦ１以上の群との間のカットオフ値（第二のカットオフ値）、並びに、正常群、Ｆ０群、及びＦ１群とＦ２群若しくはＦ２以上の群との間のカットオフ値（第三のカットオフ値）は、それぞれ、３．３５ｎｇ／ｍＬ以上３．７５ｎｇ／ｍＬ未満の範囲から選択される値、３．７５ｎｇ／ｍＬ以上３．８５ｎｇ／ｍＬ未満の範囲から選択される値、並びに、３．８５ｎｇ／ｍＬ以上４．８５ｎｇ／ｍＬ未満の範囲から選択される値、好ましくは、それぞれ、３．３５ｎｇ／ｍＬ以上３．７４ｎｇ／ｍＬ以下の範囲から選択される値、３．７５ｎｇ／ｍＬ以上３．８４ｎｇ／ｍＬ以下の範囲から選択される値、並びに、３．８５ｎｇ／ｍＬ以上４．８４ｎｇ／ｍＬ以下の範囲から選択される値である。

本発明の鑑別方法におけるカットオフ値として、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値を前記スコアとする場合、当該カットオフ値は、陰性群におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値と、陽性群におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値と、についてのＲＯＣ解析から、陰性群と陽性群の最も陰性群に近い群との間において判定一致率が６５％以上、かつ、陰性群と陽性群との間における判定一致率が７５％以上となり、かつ、他のカットオフ値の範囲と重ならないように設定された値である。例えば、正常群とＦ０群若しくはＦ０以上の群との鑑別の場合（第一のカットオフ値の場合）には、正常群とＦ０群との間において判定一致率が６５％以上、かつ、正常群とＦ０以上の群との間における判定一致率が７５％以上となり、かつ、第二～第三のカットオフ値の範囲と重ならないように設定された値である。

・ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値をスコアとする場合
本発明の鑑別方法におけるカットオフ値は、前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値を前記スコアとする場合には、正常群とＦ０群若しくはＦ０以上の群との間のカットオフ値（第一のカットオフ値）、正常群及びＦ０群とＦ１群若しくはＦ１以上の群との間のカットオフ値（第二のカットオフ値）、並びに、正常群、Ｆ０群、及びＦ１群とＦ２群若しくはＦ２以上の群との間のカットオフ値（第三のカットオフ値）は、それぞれ、３．８２以上４．４２未満の範囲から選択される値、４．４２以上４．８７未満の範囲から選択される値、並びに、４．８７以上６．０９未満の範囲から選択される値、好ましくは、それぞれ、３．８２以上４．４１以下の範囲から選択される値、４．４２以上４．８６以下の範囲から選択される値、並びに、４．８７以上６．０８以下の範囲から選択される値である。

本発明の鑑別方法におけるカットオフ値として、前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値を前記スコアとする場合、当該カットオフ値は、陰性群におけるＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値と、陽性群におけるＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値と、についてのＲＯＣ解析から、本発明の鑑別方法において前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値をスコアとする場合と同様にして設定される。

・ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値をスコアとする場合
本発明の鑑別方法におけるカットオフ値は、前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値を前記スコアとする場合には、正常群とＦ０群若しくはＦ０以上の群との間のカットオフ値（第一のカットオフ値）、正常群及びＦ０群とＦ１群若しくはＦ１以上の群との間のカットオフ値（第二のカットオフ値）、並びに、正常群、Ｆ０群、及びＦ１群とＦ２群若しくはＦ２以上の群との間のカットオフ値（第三のカットオフ値）は、それぞれ、５．５３以上６．３５未満の範囲から選択される値、６．３５以上６．８４未満の範囲から選択される値、並びに、６．８４以上８．５４未満の範囲から選択される値、好ましくは、それぞれ、５．５３以上６．３４以下の範囲から選択される値、６．３５以上６．８３以下の範囲から選択される値、並びに、６．８４以上８．５３以下の範囲から選択される値である。

本発明の鑑別方法におけるカットオフ値として、前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値を前記スコアとする場合、当該カットオフ値は、陰性群におけるＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値と、陽性群におけるＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値と、についてのＲＯＣ解析から、本発明の鑑別方法において前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値をスコアとする場合と同様にして設定される。

本発明の鑑別方法におけるカットオフ値を、それぞれ、前記範囲内から選択することにより、例えば、陰性群と陽性群の最も陰性群に近い群との間（例えば、正常群とＦ０以上の群との鑑別の場合には、正常群とＦ０群との間）において判定一致率が６０％以上（好ましくは６５％以上）、陰性群と陽性群との間（例えば、前記の場合には、正常群とＦ０以上の群との間）における判定一致率が７０％以上（好ましくは７５％以上）で、被験者が陰性群に含まれるのか陽性群に含まれるのかを判別することが可能となる。

（スクリ－ニング方法）
本発明のスクリ－ニング方法では、被験者由来の血液検体のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度に基づくスコアを、前記カットオフ値と比較して、前記スコアが前記カットオフ値よりも高い被験者を、肝線維化進展度がＦ０以上の段階にあると予測して選別する。

例えば、ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値をスコアとする場合、被験者由来の血液検体の血清又は血漿あたりＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度が４．３～４．５ｎｇ／ｍＬの範囲から選択される値よりも高い場合には、その被験者は肝線維化進展度がＦ０段階又はＦ０以上の段階にあると予測して選別する。前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値をスコアとする場合及び前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値をスコアとする場合も、各対応するカットオフ値を用いること以外は同様である。

また、本発明のスクリーニング方法としては、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値、前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値、及び前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値、をそれぞれスコアとするスクリーニング方法を２以上組み合わせ、例えば、いずれの方法でもスクリーニングされた被検者を最終的に選別してもよい。

本発明のスクリ－ニング方法によれば、正常群から、肝線維化進展度がＦ０以上の段階にある可能性がある被験者を選別することができ、被験者の肝線維化進展度がＦ０の早期段階にあっても、正常群から選別することが可能となる。選別された被験者は、下記の鑑別方法によって肝線維化進展度がいずれの段階にあるかの鑑別に付す対象、肝生検の対象等にすることができる。

（鑑別方法）
本発明の鑑別方法では、被験者由来の血液検体のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度に基づく第一のスコアを、前記第一のカットオフ値と比較して、前記第一のスコアが前記第一のカットオフ値よりも高い被験者を、肝線維化進展度がＦ０段階又はＦ０以上の段階にあると鑑別する。

また、本発明の鑑別方法は、医師等による診断を補助する方法、又は医師等による診断のための情報を提供する方法と表現することもできる。前記診断のための情報を提供する方法としては、例えば、「肝線維化進展度を診断するための情報を提供する方法であり、被験者由来の血液検体のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度に基づく第一のスコアを、前記第一のカットオフ値と比較して、前記第一のスコアが前記第一のカットオフ値よりも高い被験者を、肝線維化進展度がＦ０以上の段階にあると判定する工程を含む方法」と表現することもできる。第二のスコア及び第二のカットオフ値、並びに、第三のスコア及び第三のカットオフ値を用いた各鑑別方法もそれぞれ同様である。

本発明の鑑別方法は、例えば、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値を第一のスコアとする場合、被験者由来の血液検体の血清又は血漿あたりＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度が３．３５ｎｇ／ｍＬ以上３．７５ｎｇ／ｍＬ未満の範囲から選択される値よりも高い場合には、その被験者は肝線維化進展度がＦ０段階又はＦ０以上の段階にあると鑑別する。前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値を第一のスコアとする場合及び前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値を第一のスコアとする場合も、各対応するカットオフ値を用いること以外は同様である。

また、本発明の鑑別方法では、被験者由来の血液検体のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度に基づく第二のスコア（例えば、ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値）を、前記第二のカットオフ値と比較して、前記第二のスコアが前記第二のカットオフ値よりも高い被験者を、肝線維化進展度がＦ１段階又はＦ１以上の段階にあると鑑別する。さらに、本発明の鑑別方法では、被験者由来の血液検体のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度に基づく第三のスコア（例えば、ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値）を、前記第三のカットオフ値と比較して、前記第三のスコアが前記第三のカットオフ値よりも高い被験者を、肝線維化進展度がＦ２段階又はＦ２以上の段階にあると鑑別する。前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値を第二、第三のスコアとする場合、及び前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値を第二、第三のスコアとする場合も、各対応するカットオフ値を用いること以外はそれぞれ同様である。

また、本発明の鑑別方法としては、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値、前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値、及び前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値、をそれぞれ独立に、第一～第三のスコアとする鑑別方法を２以上組み合わせてもよく、例えば、第一のスコアとして前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値、前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値、及び前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値、のうちのいずれかを用いる鑑別方法を２以上組み合わせ、いずれの方法でも鑑別された被検者を最終的に鑑別してもよく、また例えば、第一～第三のスコアとして、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値、前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値、及び前記ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値、をそれぞれ独立に用いて各段階の鑑別をしてもよい。

本発明の鑑別方法によれば、被験者が、肝線維化進展度が陰性である群（陰性群）と陽性である群（陽性群）とのいずれに含まれるのかを判別することができ、被験者の肝線維化進展度がＦ０の早期段階にあっても、健常者と高精度で鑑別することが可能となる。鑑別された被験者は、第二、第三のスコアのカットオフ値による鑑別方法によって肝線維化進展度がさらに上位のいずれの段階にあるかのさらなる鑑別に付す対象、肝生検の対象等にすることができる。本発明の鑑別方法は、例えば、肝線維化進展度の予後の決定又はその補助や前記疾患の治療効果の確認等に用いることができる。

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。下記の実施例において、ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓの測定、及びＡＳＴ活性値の測定は、それぞれ、下記の方法で行った。なお、以下において、「％」の表示は、特に記載のない場合、重量／容量パ－セント（ｗ／ｖ％：ｇ／１００ｍＬ）を示す。

＜ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓの測定＞
〔ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ測定試薬〕
（１）コラゲナ－ゼ処理
先ず、ペプシン消化によって調製されたペプシン可溶化ＩＶ型コラ－ゲン断片（Ｓｉｇｍａ社、Ｃ－７５２１）を、０．５Ｍ酢酸に溶解し、０．２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．２）に対して透析した。次いで、これにコラゲナ－ゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ”Ａｍａｎｏ”、Ｗａｋｏ社、６０７－１９０２１）を加えて、３７℃で１時間インキュベ－トし、ペプシン可溶化ＩＶ型コラ－ゲン断片をさらに消化（コラゲナ－ゼ処理）した。コラゲナ－ゼ処理後の処理液を遠心分離した上清を、ゲルろ過によってさらに分離した。ゲルろ過カラムとしてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ １６／６０を、ゲルろ過バッファ－として１ｍＭ ＥＤＴＡ ３Ｎａ、ＰＢＳを、それぞれ用いた。ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインの４量体の分子量に相当する、分子量が２５０ｋＤａ以上、かつ、４００ｋＤａ付近に分布する分画を集めて、以下のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ断片として使用した。

「ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ断片」は、ＴＨドメインを含まない、７ＳドメインからなるＩＶ型コラ－ゲン断片であり、このようにコラゲナ－ゼにより処理し、かつ、ゲルろ過分画を選択することにより得ることができる。また、下記の免疫原としては、コラゲナーゼ部分消化ＩＶ型コラ－ゲン断片を使用した。「コラゲナーゼ部分消化ＩＶ型コラ－ゲン断片」は、分子量が５００ｋＤａ以上を主成分とする、ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片をコラゲナーゼによる処理温度を２５℃にして、１時間消化することによって調製される断片であり、主に、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ断片と、７Ｓドメイン及びＴＨドメインの一部からなるＩＶ型コラ－ゲン断片とからなる混合物である。なお、上記の「ペプシン可溶化ＩＶ型コラ－ゲン断片」は、ペプシン消化によって可溶化することにより調製される断片であり、７Ｓドメイン、ＴＨドメイン、又はＮＣ１ドメインからなるＩＶ型コラ－ゲン断片、及びこれらのうちの２以上を含むＩＶ型コラ－ゲン断片の混合物である。

（２）モノクロ－ナル抗体の作製
上記の（１）で調製した「コラゲナーゼ部分消化ＩＶ型コラ－ゲン断片」を免疫原として、モノクロ－ナル抗体を作製した。具体的には、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０μｇ（１ｍｇ／ｍＬ）のコラゲナーゼ部分消化ＩＶ型コラ－ゲン断片を等量の完全フロイントアジュバントと混合したものを、２週間の間を空けて２回、腹腔内免疫した。さらに、不完全フロイントアジュバントで２週間の間を空けて２回、腹腔免疫した。さらに、ＰＢＳに溶解したコラゲナーゼ部分消化ＩＶ型コラ－ゲン断片１０μｇを最終免疫として尾静脈内に投与した。最終免疫後３日目にこのマウスより脾臓を摘出して個々の細胞にほぐし、ＲＰＭＩ－１６４０培地で３回洗浄した。対数増殖期のマウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／ＯＡｇ１４をＲＰＭＩ－１６４０培地で３回洗浄後、前記脾臓細胞と混合し、細胞融合させた。得られた融合細胞は、遠心分離（２００×ｇ、５分間）によってＰＥＧを除いた後、１０％ウシ胎児血清、並びに、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地に懸濁し、９６ウェル細胞培養プレ－トに播種した。約１０日間培養してハイブリド－マのみを増殖させた。

ペプシン可溶化ＩＶ型コラ－ゲン断片及び上記の（１）で調製したＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ断片を抗原として、それぞれ、ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルプレ－ト（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ社、４６９９１４）に１００μＬ／ウェルで分注した。４℃で一晩、各抗原を吸着させた後、プレ－トをブロッキングバッファ－（１％ ＢＳＡ、３％ スクロ－ス、０．１％ ＰｒｏＣｌｉｎ３００、ＰＢＳ中）で２時間ブロックした。次いで、上記で調製したハイブリド－マの培養上清を加えて１時間インキュベ－トした。洗浄バッファ－（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ ｉｎ ＰＢＳ）で４回洗浄した後、５０００倍希釈のＰＯＤ－Ｇｏａｔ抗マウスＩｇＧＦｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、１１５－０３６－０７１）を各ウェルに１００μＬ／ウェル添加した。３０分間インキュベ－トした後、各ウェルを洗浄バッファ－で４回洗浄し、ＴＭＢ溶液（Ｎａｃａｌａｉ社、０５２９８）で発色させた。発色反応をＨ_２ＳＯ_４で停止させ、各ウェルの吸光度をプレ－トリ－ダ－で測定した。

これにより、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ断片を固相化したプレ－トに結合する、抗ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓドメインモノクロ－ナル抗体を産生するハイブリド－マ株（ＣＩＶ０９株、ＣＩＶ１３株）を選択した。このようにして選択したＣＩＶ０９株及びＣＩＶ１３株は、前記ペプシン可溶化ＩＶ型コラ－ゲン断片及び前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ断片のいずれにも結合する。それぞれのハイブリド－マ株は無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＦＭ、Ｇｉｂｃｏ社）で培養し、得られた培養上清からプロテインＡカラムを用いて精製し、各抗ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓドメインモノクロ－ナル抗体をそれぞれ含む抗体溶液を得た。各抗体溶液のタンパク質濃度は、波長２８０ｎｍにおける吸光度によって決定した。

（３）抗体結合粒子の作製
カルボキシル－アミン架橋剤（カルボジイミド、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用い、製品マニュアルに従って、抗ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓドメインモノクロ－ナル抗体ＣＩＶ０９（以下、場合により「ＣＩＶ０９抗体」という）を磁性粒子（富士レビオ社製）に化学結合させ、ＣＩＶ０９抗体固相化磁性粒子を得た。

（４）標識抗体の作製
抗ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓドメインモノクロ－ナル抗体ＣＩＶ１３（以下、場合により「ＣＩＶ１３抗体」という）とウシ小腸由来アルカリホスファタ－ゼ（オリエンタル酵母社製）とをヨシタケらの方法（Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８２，９２（５），ｐ．１４１３－１４２４）により結合させ、アルカリホスファタ－ゼ標識ＣＩＶ１３抗体を調製した。すなわち、先ず、通例行われるとおり、脱塩処理したＣＩＶ１３抗体とペプシンとを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）中で混合し、３７℃で１時間静置してペプシン消化を行った。反応を停止させた後にゲルろ過精製を行い、Ｆｃ領域を除去したＣＩＶ１３抗体を得た。次いで、２－メルカプトエチルアミン塩酸塩を添加して、チオ－ル化を行った。さらに、これを脱塩処理し、ＣＩＶ１３抗体のＦａｂ’断片を得た。

Ｎ－（４－マレイミドブチリロキシ）－スクシンイミド（ＧＭＢＳ）処理をしたアルカリホスファタ－ゼと、前記ＣＩＶ１３抗体のＦａｂ’断片とを混合し、カップリングを行った。カップリング液に２－メルカプトエチルアミン塩酸塩及びヨ－ドアセトアミドを加え、反応を停止させることによって、アルカリホスファタ－ゼ標識ＣＩＶ１３抗体（ＡＬＰ標識ＣＩＶ１３抗体）を得た。

〔ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ測定（サンドイッチイムノアッセイ）〕
上記の（３）で調製したＣＩＶ０９抗体固相化磁性粒子を０．０３％含む懸濁液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１％ ＢＳＡ、６００ｍＭ ＮａＣｌ）５０μＬに、検体３０μＬを加え攪拌後、３７℃で８分間反応させた。反応後に、磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス（登録商標）洗浄液（富士レビオ社製）で洗浄後、上記の（４）で調製したＡＬＰ標識ＣＩＶ１３抗体を１μｇ／ｍＬ含む標識体液（５０ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、６００ｍＭ ＮａＣｌ、２％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．３ｍＭ ＺｎＣｌ_２）５０μＬを加え、３７℃で８分間反応させた。磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス洗浄液にて洗浄後、化学発光基質（ＡＭＰＰＤ：３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩）を含むルミパルス（登録商標）基質液（富士レビオ社製）を２００μＬ加えて、３７℃で４分間酵素反応を行い、生じた発光量（波長４６３ｎｍ）を測定し、カウント値を得た。また、既知濃度の前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ断片を含む標準溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２％ ＢＳＡ、ｐＨ７．２）も同様に測定し、検量線を作成した。作成した検量線を用いて、各検体の発光量（カウント値）から算出した濃度を、下記の各検体中のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓの濃度とした。

＜ＡＳＴ活性値の測定＞
検体中のＡＳＴ活性値の測定は、それぞれ、ＪＳＣＣ標準化対応法（日本臨床化学会、１９９６年）に準拠した測定方法にて、株式会社エスア－ルエルにより行われた。当該ＡＳＴ活性値測定方法においては、検体中にＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラ－ゼ）が存在すると、ＡＳＴが、α－ケトグルタル酸のα－ケト基とＬ－アスパラギン酸のアミノ基との転移反応を触媒し、オキサロ酢酸及びＬ－グルタミン酸が生成される。このオキサロ酢酸にβ－ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド還元型（β－ＮＡＤＨ）の存在下でリンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）を作用させると、リンゴ酸及びβ－ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド酸化型（β－ＮＡＤ^＋）が生成される。したがって、β－ＮＡＤＨの減少に伴う吸光度の減少速度を測定することにより、ＡＳＴ活性値を求めることができる。

＜ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ感度の比較＞
ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓが低濃度に含まれる、濃度既知の検体（血清、検体数：５）について、上記のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ測定試薬及び測定方法を行い（測定回数ｎ＝６）、各検体中のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓの濃度を算出し、その変動計数（測定値ＣＶ（％））を算出した。また、対象試薬として、抗体結合競合阻害を原理とし、抗ヒトＩＶ型コラ－ゲンウサギポリクロ－ナル抗体を用いたラジオイムノアッセイであるＩＶ型コラ－ゲン・７Ｓキット（ＤＥＮＩＳファ－マ社製、以下、場合により「ＲＩＡキット」という）を用い、添付文書に従って測定を行い、各検体中のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓの濃度を算出した。結果を図１（（ａ）ＲＩＡキット、（ｂ）サンドイッチイムノアッセイ）にそれぞれ示す。

図１においては、それぞれ、横軸に予め既知としていたＩＶ型コラ－ゲン７Ｓの濃度、縦軸に測定値ＣＶをプロットし、近似曲線から測定値ＣＶが１０％となるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度を算出した。測定値ＣＶが１０％以下となる濃度を定量限界とした場合、ＲＩＡキットの定量感度は３．６ｎｇ／ｍＬであったのに対して、上記のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ測定法（サンドイッチイムノアッセイ）の定量感度は０．０９ｎｇ／ｍＬであった。このように、上記のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ測定法においては測定感度及び再現性が良好であったため、低値域の測定が可能となった。

（実施例１）
検体として、健常人由来の血清（健常人検体）３７例（正常群）を用い、各検体中のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓの濃度（ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値）を、上記のサンドイッチイムノアッセイによるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ測定試薬及び測定方法（以下、場合により単に「サンドイッチイムノアッセイ」とする）と、前記ＲＩＡキットと、によりそれぞれ測定した。得られた測定値から、９５パ－センタイル値、平均値、及び平均値＋２ＳＤ（ＳＤ：標準偏差、以下同じ）を算出した。なお、健常人は、基礎疾患歴が無く、ＢＭＩ：２５以下、ＡＳＴ＜２５、ＡＬＴ＜２５、ＡＳＴ＞ＡＬＴの者である。下記の表１に、各ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ｎｇ／ｍＬ）が測定された頻度（検体数）、及びその分布より得られた各値を示す。

他方、検体として、肝生検の病理診断により肝線維化進展度が確定し、肝線維化進展度Ｆ０～Ｆ４群に分類される患者由来の血清（患者検体）１６５例（陽性群、うち、Ｆ０群：４１例）を用い、同様に、ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値を測定した。

上記サンドイッチイムノアッセイの測定結果から、正常群（健常人からなる群）をほぼ１００％陰性と判断できる値を算出した。具体的には、正常群の９５パ－センタイル値及び平均値＋２ＳＤの値よりも高値であり、かつ、正常群及び陽性群のＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）解析から、感度が高く、正常群の陰性一致率が１００％であるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓの濃度を４．３～４．５ｎｇ／ｍＬと算出した。

次いで、このように算出された濃度を暫定カットオフ値として、かかる値によって、被験者群から肝線維化進展度がＦ０以上の段階にある患者を拾い上げる（スクリ－ニングする）ことが可能かを検討するため、各陽性率を評価した。すなわち、先ず、カットオフ値を４．３ｎｇ／ｍＬとした場合、陰性一致率＝１００％、肝生検により確定した肝線維化進展度がＦ０段階にある患者の陽性率＝３７％、前記肝線維化進展度がＦ０以上の段階にある患者（Ｆ０～Ｆ４のうちのいずれかの段階にある患者、以下同様）の陽性率＝６４％であった。よって、Ｆ０段階にある患者の３７％、Ｆ０以上の段階にある患者の６４％、を拾い上げることができた。なお、「陰性一致率」は、カットオフ値により陰性と判定された検体が真の陰性検体（本試験では正常群）である割合を示す。また、「陽性率」は、陽性検体（本試験では患者検体）がカットオフ値により陽性であると判定される割合を示す。次いで、カットオフ値を４．５ｎｇ／ｍＬとした場合、陰性一致率＝１００％、前記肝線維化進展度がＦ０段階にある患者の陽性率＝３２％、前記肝線維化進展度がＦ０以上の段階にある患者の陽性率＝５９％であった。よって、Ｆ０段階にある患者の３２％、Ｆ０以上の段階にある患者の５９％、をそれぞれ拾い上げることができた。

これらの結果から、ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓの検体中濃度４．３ｎｇ／ｍＬ以上、かつ、４．５ｎｇ／ｍＬ以下の範囲内の値を、被験者の肝線維化進展度がＦ０以上の段階にあると予測して、肝線維化リスク群（肝生検対象者等）を正常群からスクリ－ニングするためのカットオフ値とできることが示された。一方、従来使用されているＲＩＡキットの測定結果からは、９５パ－センタイル値及び平均値＋２ＳＤの値が高く、被験者群から肝線維化進展度がＦ０以上の段階にある可能性のある肝線維化リスク群をスクリ－ニング可能なカットオフ値を設定できなかった。

（実施例２）
〔検体〕
実施例１において各検体（正常群３７例、肝生検により確定した肝線維化進展度がＦ０～Ｆ４のうちのいずれかの段階にある患者からなる陽性群１６５例）について測定したＩＶ型コラ－ゲン７Ｓの濃度を下記の表２に示す。表２において、各ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓの濃度は、肝線維化進展度の段階ごとの平均値で示し、そのＳＤ値も併せて示す。表２に示したように、肝線維化進展度の段階が高くなるにつれてＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値も増加した。

〔正常群対Ｆ０以上の群又はＦ０群〕
次いで、検体中のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度に関し、上記の表２に示す検体を用いて、正常群と、肝線維化進展度がＦ０以上の群（肝線維化進展度がＦ０以上の段階にある群、以下同様）又はＦ０群と、について、それぞれＲＯＣ解析を行って各カットオフ値候補を設定した。これらの値をカットオフ値としたときの判定一致率（患者検体が陽性と判断され、健常人検体が陰性と判断される率）を、次式：
判定一致率（％）＝（正常群の陰性数＋Ｆ０以上の群（又はＦ０群）の陽性数）／（正常群の検体数＋Ｆ０以上の群（又はＦ０群）の検体数）
により算出した。前記式において、「陰性数」とは、各カットオフ値候補によって陰性群（正常群）にあると判定された数を示し、「陽性数」とは、各カットオフ値候補によって陽性群（Ｆ０以上の群又はＦ０群）にあると判定された数を示す。下記の表３に、正常群とＦ０以上の群との間において各カットオフ値としたときの判定一致率を示す。また、下記の表４に、正常群とＦ０群との間において各カットオフ値としたときの判定一致率を示す。

表３に示したように、正常群とＦ０以上の群との間において、判定一致率が７５％以上となるカットオフ値は３．３５ｎｇ／ｍＬ以上であった。また、表４に示したように、正常群とＦ０群との間において判定一致率が６５％以上となるカットオフ値は、３．０５ｎｇ／ｍＬ以上、かつ、４．６５ｎｇ／ｍＬ以下であった。これより、正常群とＦ０以上の群との間において判定一致率が７５％以上となり、かつ、正常群とＦ０群との間において判定一致率が６５％以上となるカットオフ値は、３．３５ｎｇ／ｍＬ以上、かつ、４．６５ｎｇ／ｍＬ以下の範囲内にあることが見い出された。

〔正常群及びＦ０群対Ｆ１以上の群又はＦ１群〕
また、同様に、正常群及びＦ０群、並びに、Ｆ１以上の群又はＦ１群について、それぞれＲＯＣ解析を行って各カットオフ値候補を設定した。これらの値をカットオフ値としたときの判定一致率を、次式：
判定一致率（％）＝（正常群の陰性数＋Ｆ０群の陰性数＋Ｆ１以上の群（又はＦ１群）の陽性数）／（正常群の検体数＋Ｆ０群の検体数＋Ｆ１以上の群（又はＦ１群）の検体数）
により算出した。前記式において、「陰性数」とは、各カットオフ値候補によって陰性群（正常群、Ｆ０群）にあると判定された数を示し、「陽性数」とは、各カットオフ値候補によって陽性群（Ｆ１以上の群又はＦ１群）にあると判定された数を示す。下記の表５に、正常群及びＦ０群とＦ１以上の群との間において各カットオフ値としたときの判定一致率を示す。また、下記の表６に、正常群及びＦ０群とＦ１群との間において各カットオフ値としたときの判定一致率を示す。

表５に示したように、正常群及びＦ０群とＦ１以上の群との間において、判定一致率が７５％以上となるカットオフ値は、３．７５ｎｇ／ｍＬ以上、かつ、５．８５ｎｇ／ｍＬ以下であった。また、表６に示したように、正常群及びＦ０群とＦ１群との間において判定一致率が６５％以上となるカットオフ値は、３．８５ｎｇ／ｍＬ以下であった。これより、正常群及びＦ０群とＦ１以上の群との間において判定一致率が７５％以上となり、かつ、正常群及びＦ０群とＦ１群との間において判定一致率が６５％以上となるカットオフ値は、３．７５ｎｇ／ｍＬ以上、かつ、３．８５ｎｇ／ｍＬ以下の範囲内にあることが見い出された。

〔正常群及びＦ０～Ｆ１群対Ｆ２以上の群又はＦ２群〕
さらに、同様に、正常群及びＦ０～Ｆ１群、並びに、Ｆ２以上の群又はＦ２群について、それぞれＲＯＣ解析を行って各カットオフ値候補を設定した。これらの値をカットオフ値としたときの判定一致率を、次式：
判定一致率（％）＝（正常群の陰性数＋Ｆ０～Ｆ１群の陰性数＋Ｆ２以上の群（又はＦ２群）の陽性数）／（正常群の検体数＋Ｆ０～Ｆ１群の検体数＋Ｆ２以上の群（又はＦ２群）の検体数）
により算出した。前記式において、「陰性数」とは、各カットオフ値候補によって陰性群（正常群、Ｆ０群、Ｆ１群）にあると判定された数を示し、「陽性数」とは、各カットオフ値候補によって陽性群（Ｆ２以上の群又はＦ２群）にあると判定された数を示す。下記の表７に、正常群及びＦ０～Ｆ１群とＦ２以上の群との間において各カットオフ値としたときの判定一致率を示す。また、下記の表８に、正常群及びＦ０～Ｆ１群とＦ２群との間において各カットオフ値としたときの判定一致率を示す。

表７に示したように、正常群及びＦ０～Ｆ１群とＦ２以上の群との間において、判定一致率が７５％以上となるカットオフ値は、３．５５ｎｇ／ｍＬ以上、かつ、５．０５ｎｇ／ｍＬ以下であった。また、表８に示したように、正常群及びＦ０～Ｆ１群とＦ２群との間において判定一致率が６５％以上となるカットオフ値は、４．８５ｎｇ／ｍＬ以下であった。これより、正常群及びＦ０～Ｆ１群とＦ２以上の群との間において判定一致率が７５％以上となり、かつ、正常群及びＦ０～Ｆ１群とＦ２群との間において判定一致率が６５％以上となるカットオフ値は、３．５５ｎｇ／ｍＬ以上、かつ、４．８５ｎｇ／ｍＬ以下の範囲内にあることが見い出された。

以上の結果から、正常群とＦ０群若しくはＦ０以上の群との間、正常群及びＦ０群とＦ１群若しくはＦ１以上の群との間、正常群、Ｆ０群、及びＦ１群とＦ２群若しくはＦ２以上の群との間の各カットオフ値に重なりが生じないようにすると、各群間のカットオフ値は、それぞれ、３．３５ｎｇ／ｍＬ以上３．７５ｎｇ／ｍＬ未満、３．７５ｎｇ／ｍＬ以上３．８５ｎｇ／ｍＬ未満、３．８５ｎｇ／ｍＬ以上４．８５ｎｇ／ｍＬ未満、の範囲内にあることが見い出された。これらのカットオフ値によって、正常群とＦ０群若しくはＦ０以上の群との鑑別、正常群及びＦ０群とＦ１群若しくはＦ１以上の群との鑑別、正常群、Ｆ０群、及びＦ１群とＦ２群若しくはＦ２以上の群との鑑別ができる。

（実施例３）
実施例１と同じ検体（正常群３７例、肝生検により確定した肝線維化進展度がＦ０～Ｆ４のうちのいずれかの段階にある患者からなる陽性群１６５例）について、上記の方法で、各検体中のＡＳＴ活性値を測定した。得られたＡＳＴ活性値と、実施例１で測定した各検体中のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度とから、次式：
ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値＝０．９９４×ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ｎｇ／ｍＬ）＋０．０２５５×ＡＳＴ活性値（ＩＵ／Ｌ）
により、ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値を算出した。得られたＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値を肝線維化進展度ごとの平均値で、そのＳＤと合わせて下記の表９に示す。表９に示したように、肝線維化進展度が高くなるにつれてＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値も上昇した。

得られたＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値から、９５パ－センタイル値、平均値＋２ＳＤ値を算出した。正常群の９５パ－センタイル値及び平均値＋２ＳＤの値、並びに、正常群及び陽性群のＲＯＣ解析から、実施例１と同様にして、陰性一致率が１００％であるＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値を４．６～５．２と算出した。

次いで、このように算出された値を暫定カットオフ値として、かかる値によって正常群から肝線維化進展度がＦ０以上の段階にある患者を拾い上げる（スクリ－ニングする）ことが可能かを検討するため、各陽性率を評価した。先ず、カットオフ値を４．６とした場合、陰性一致率＝１００％、肝生検により確定した肝線維化進展度がＦ０段階にある患者の陽性率＝５６％、前記肝線維化進展度がＦ０以上の段階にある患者の陽性率＝９３％であった。次いで、カットオフ値を５．２とした場合、陰性一致率＝１００％、前記肝線維化進展度がＦ０段階にある患者の陽性率＝５０％、前記肝線維化進展度がＦ０以上の段階にある患者の陽性率＝７３％であった。これらの結果から、ＣＡ Ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値のカットオフ値を４．６以上、かつ、５．２以下の範囲内の値とすることで、被験者が肝線維化進展度がＦ０以上の段階にあると予測して、肝線維化リスク者（肝生検対象者等）を正常群からスクリ－ニングできることが示された。

（実施例４）
〔正常群対Ｆ０以上の群又はＦ０群〕
ＣＡ Ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値に関し、上記の表９に示す検体を用いて、正常群と、前記肝線維化進展度がＦ０以上の群又はＦ０群と、について、それぞれＲＯＣ解析を行って各カットオフ値候補を設定した。これらの値をカットオフ値としたときの判定一致率を、実施例２の〔正常群対Ｆ０以上の群又はＦ０群〕に記載の式により算出した。下記の表１０に、正常群とＦ０以上の群との間において各カットオフ値としたときの判定一致率を示す。また、下記の表１１に、正常群とＦ０群との間において各カットオフ値としたときの判定一致率を示す。

表１０に示したように、正常群とＦ０以上の群との間において、判定一致率が７５％以上となるカットオフ値は３．８２以上であった。また、表１１に示したように、正常群とＦ０群との間において判定一致率が６５％以上となるカットオフ値は３．３５以上、かつ、５．７６以下であった。これより、正常群とＦ０以上の群との間において判定一致率が７５％以上となり、かつ、正常群とＦ０群との間において判定一致率が６５％以上となるカットオフ値は、３．８２以上、かつ、５．７６以下の範囲内にあることが見い出された。

〔正常群及びＦ０群対Ｆ１以上の群又はＦ１群〕
また、同様に、正常群及びＦ０群、並びに、Ｆ１以上の群又はＦ１群について、それぞれＲＯＣ解析を行って各カットオフ値候補を設定した。これらの値をカットオフ値としたときの判定一致率を、実施例２の〔正常群及びＦ０群対Ｆ１以上の群又はＦ１群〕に記載の式により算出した。下記の表１２に、正常群及びＦ０群とＦ１以上の群との間において各カットオフ値としたときの判定一致率を示す。また、下記の表１３に、正常群及びＦ０群とＦ１群との間において各カットオフ値としたときの判定一致率を示す。

表１２に示したように、正常群及びＦ０群とＦ１以上の群との間において、判定一致率が７５％以上となるカットオフ値は、４．４２以上、かつ、７．３９以下であった。また、表１３に示したように、正常群及びＦ０群とＦ１群との間において判定一致率が６５％以上となるカットオフ値は４．８７以下であった。これより、正常群及びＦ０群とＦ１以上の群との間において判定一致率が７５％以上となり、かつ、正常群及びＦ０群とＦ１群との間において判定一致率が６５％以上となるカットオフ値は、４．４２以上、かつ、４．８７以下の範囲内にあることが見い出された。

〔正常群及びＦ０～Ｆ１群対Ｆ２以上の群又はＦ２群〕
さらに、同様に、正常群及びＦ０～Ｆ１群、並びに、Ｆ２以上の群又はＦ２群について、それぞれＲＯＣ解析を行って各カットオフ値候補を設定した。これらの値をカットオフ値としたときの判定一致率を、実施例２の〔正常群及びＦ０～Ｆ１群対Ｆ２以上の群又はＦ２群〕に記載の式により算出した。下記の表１４に、正常群及びＦ０～Ｆ１群とＦ２以上の群との間において各カットオフ値としたときの判定一致率を示す。また、下記の表１５に、正常群及びＦ０～Ｆ１群とＦ２群との間において各カットオフ値としたときの判定一致率を示す。

表１４に示したように、正常群及びＦ０～Ｆ１群とＦ２以上の群との間において、判定一致率が７５％以上となるカットオフ値は、４．０４以上、かつ、６．３６以下であった。また、表１５に示したように、正常群及びＦ０～Ｆ１群とＦ２群との間において判定一致率が６５％以上となるカットオフ値は６．０９以下であった。これより、正常群及びＦ０～Ｆ１群とＦ２以上の群との間において判定一致率が７５％以上となり、かつ、正常群及びＦ０～Ｆ１群とＦ２群との間において判定一致率が６５％以上となるカットオフ値は、４．０４以上、かつ、６．０９以下の範囲内にあることが見い出された。

以上の結果から、正常群とＦ０群若しくはＦ０以上の群との間、正常群及びＦ０群とＦ１群若しくはＦ１以上の群との間、正常群、Ｆ０群、及びＦ１群とＦ２群若しくはＦ２以上の群との間の各カットオフ値に重なりが生じないようにすると、各群間のカットオフ値は、それぞれ、３．８２以上４．４２未満、４．４２以上４．８７未満、４．８７以上６．０９未満、の範囲内にあることが見い出された。これらのカットオフ値によって、正常群とＦ０群若しくはＦ０以上の群との鑑別、正常群及びＦ０群とＦ１群若しくはＦ１以上の群との鑑別、正常群、Ｆ０群、及びＦ１群とＦ２群若しくはＦ２以上の群との鑑別ができる。

（実施例５）
実施例３で得られた各検体のＡＳＴ活性値と、実施例１で測定した各検体中のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度とから、次式：
ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値＝１．５０×ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ｎｇ／ｍＬ）＋０．０２６４×ＡＳＴ活性値（ＩＵ／Ｌ）
により、ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値を算出した。得られたＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値を肝線維化進展度ごとの平均値で、そのＳＤと合わせて下記の表１６に示す。表１６に示したように、肝線維化進展度が高くなるにつれてＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値も上昇した。

得られたＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値から、９５パ－センタイル値、平均値＋２ＳＤ値を算出した。正常群の９５パ－センタイル値及び平均値＋２ＳＤ、並びに、正常群及び陽性群のＲＯＣ解析から、実施例１と同様にして、陰性一致率が１００％であるＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値を６．７～７．５と算出した。

次いで、このように算出された値を暫定カットオフ値として、かかる値によって正常群から肝線維化進展度がＦ０以上の段階にある患者を拾い上げる（スクリ－ニングする）ことが可能かを検討するため、各陽性率を評価した。先ず、カットオフ値を６．７とした場合、陰性一致率＝１００％、肝生検により確定した肝線維化進展度がＦ０段階にある患者の陽性率＝５４％、前記肝線維化進展度がＦ０以上の段階にある患者の陽性率＝８１％であった。次いで、カットオフ値を７．５とした場合、陰性一致率＝１００％、前記肝線維化進展度がＦ０段階にある患者の陽性率＝３６％、前記肝線維化進展度がＦ０以上の段階にある患者の陽性率＝６５％であった。これらの結果から、ＣＡ Ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値のカットオフ値を６．７以上、かつ、７．５以下の範囲内の値とすることで、被験者が肝線維化進展度がＦ０以上の段階にあると予測し、肝線維化リスク者（肝生検対象者等）を正常群からスクリ－ニングできることが示された。

（実施例６）
〔正常群対Ｆ０以上の群又はＦ０群〕
ＣＡ Ｉｎｄｅｘ－ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値に関し、上記の表１６に示す検体を用いて、正常群と、前記肝線維化進展度がＦ０以上の群又はＦ０群と、について、それぞれＲＯＣ解析を行って各カットオフ値候補を設定した。これらの値をカットオフ値としたときの判定一致率を、実施例２の〔正常群対Ｆ０以上の群又はＦ０群〕に記載の式により算出した。下記の表１７に、正常群とＦ０以上の群との間において各カットオフ値としたときの判定一致率を示す。また、下記の表１８に、正常群とＦ０群との間において各カットオフ値としたときの判定一致率を示す。

表１７に示したように、正常群とＦ０以上の群との間において、判定一致率が７５％以上となるカットオフ値は５．５３以上であった。また、表１８に示したように、正常群とＦ０群との間において判定一致率が６５％以上となるカットオフ値は４．７５以上、かつ、８．１５以下であった。これより、正常群とＦ０以上の群との間において判定一致率が７５％以上となり、かつ、正常群とＦ０群との間において判定一致率が６５％以上となるカットオフ値は、５．５３以上、かつ、８．１５以下の範囲内にあることが見い出された。

〔正常群及びＦ０群対Ｆ１以上の群又はＦ１群〕
また、同様に、正常群及びＦ０群、並びに、Ｆ１以上の群又はＦ１群について、それぞれＲＯＣ解析を行って各カットオフ値候補を設定した。これらの値をカットオフ値としたときの判定一致率を、実施例２の〔正常群及びＦ０群対Ｆ１以上の群又はＦ１群〕に記載の式により算出した。下記の表１９に、正常群及びＦ０群とＦ１以上の群との間において各カットオフ値としたときの判定一致率を示す。また、下記の表２０に、正常群及びＦ０群とＦ１群との間において各カットオフ値としたときの判定一致率を示す。

表１９に示したように、正常群及びＦ０群とＦ１以上の群との間において、判定一致率が７５％以上となるカットオフ値は、６．３５以上、かつ、１０．５５以下であった。また、表２０に示したように、正常群及びＦ０群とＦ１群との間において判定一致率が６５％以上となるカットオフ値は６．８４以下であった。これより、正常群及びＦ０群とＦ１以上の群との間において判定一致率が７５％以上となり、かつ、正常群及びＦ０群とＦ１群との間において判定一致率が６５％以上となるカットオフ値は、６．３５以上、かつ、６．８４以下の範囲内にあることが見い出された。

〔正常群及びＦ０～Ｆ１群対Ｆ２以上の群又はＦ２群〕
さらに、同様に、正常群及びＦ０～Ｆ１群、並びに、Ｆ２以上の群又はＦ２群について、それぞれＲＯＣ解析を行って各カットオフ値候補を設定した。これらの値をカットオフ値としたときの判定一致率を、実施例２の〔正常群及びＦ０～Ｆ１群対Ｆ２以上の群又はＦ２群〕に記載の式により算出した。下記の表２１に、正常群及びＦ０～Ｆ１群とＦ２以上の群との間において各カットオフ値としたときの判定一致率を示す。また、下記の表２２に、正常群及びＦ０～Ｆ１群とＦ２群との間において各カットオフ値としたときの判定一致率を示す。

表２１に示したように、正常群及びＦ０～Ｆ１群とＦ２以上の群との間において、判定一致率が７５％以上となるカットオフ値は、５．８５以上、かつ、８．９４以下であった。また、表２２に示したように、正常群及びＦ０～Ｆ１群とＦ２群との間において判定一致率が６５％以上となるカットオフ値は８．５４以下であった。これより、正常群及びＦ０～Ｆ１群とＦ２以上の群との間において判定一致率が７５％以上となり、かつ、正常群及びＦ０～Ｆ１群とＦ２群との間において判定一致率が６５％以上となるカットオフ値は、５．８５以上、かつ、８．５４以下の範囲内にあることが見い出された。

以上の結果から、正常群とＦ０群若しくはＦ０以上の群との間、正常群及びＦ０群とＦ１群若しくはＦ１以上の群との間、正常群、Ｆ０群、及びＦ１群とＦ２群若しくはＦ２以上の群との間の各カットオフ値に重なりが生じないようにすると、各群間のカットオフ値は、それぞれ、５．５３以上６．３５未満、６．３５以上６．８４未満、６．８４以上８．５４未満、の範囲内にあることが見い出された。これらのカットオフ値によって、正常群とＦ０群若しくはＦ０以上の群との鑑別、正常群及びＦ０群とＦ１群若しくはＦ１以上の群との鑑別、正常群、Ｆ０群、及びＦ１群とＦ２群若しくはＦ２以上の群との鑑別ができる。

（実施例７）
実施例１～実施例６で得られた、各検体におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度、ＣＡ Ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値、ＣＡ Ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値、並びに、これらの各カットオフ値を用いて、正常群、肝線維化進展度がＦ０～Ｆ４である各群における各２群間を鑑別した際における陽性一致率、陰性一致率、判定一致率を算出した。結果を下記の表２３～表２８に示す。

〔正常群対Ｆ０以上の群又はＦ０群〕

表２３～表２４に示したように、ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度、ＣＡ Ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値、ＣＡ Ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値についていずれも、各カットオフ値によって、正常群とＦ０以上の群とでは７５％以上の判定一致率で、正常群とＦ０群とでは６５％以上の判定一致率で、それぞれ鑑別ができた。

〔正常群及びＦ０群対Ｆ１以上の群又はＦ１群〕

表２５～表２６に示したように、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値、前記ＣＡ Ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値、前記ＣＡ Ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値についていずれも、各カットオフ値によって、正常群及びＦ０群とＦ１以上の群とでは７５％以上の判定一致率で、正常群及びＦ０群とＦ１群とでは６５％以上の判定一致率で、それぞれ鑑別ができた。

〔正常群及びＦ０～Ｆ１群対Ｆ２以上の群又はＦ２群〕

表２７～表２８に示したように、前記ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ値、前記ＣＡ Ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値、前記ＣＡ Ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値についていずれも、各カットオフ値によって、正常群及びＦ０～Ｆ１群とＦ２以上の群とでは７５％以上の判定一致率で、正常群及びＦ０～Ｆ１群とＦ２群とでは６５％以上の判定一致率で、それぞれ鑑別ができた。

本発明によれば、被験者の肝線維化進展度がＦ０段階又はＦ０以上の段階にあると予測して正常群からスクリ－ニングできる方法、並びに、被験者が正常であるかＦ０段階又はＦ０以上の段階にあるかの鑑別ができる方法を提供することが可能となる。そのため本発明は、肝線維化が惹起される疾患（例えば、ウイルス性慢性肝炎（Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎等）、アルコ－ル性慢性肝炎、ＮＡＳＨ）の早期発見、肝線維化進展度の段階の鑑別、肝線維化進展度判定、及び予後予測の診断の補助に有用である。

Claims (18)

1. 肝線維化進展度がＦ０以上の段階にあると予測して選別するための情報を提供する方法であり、被験者由来の血液検体のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度に基づくスコアを、予め定められたカットオフ値と比較し、前記スコアの高低の情報を提供することを特徴とする、方法。
2. 前記スコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度であり、かつ、前記カットオフ値が、４．３～４．５ｎｇ／ｍＬの範囲から選択される値であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記スコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度、及び血清におけるＡＳＴ活性値から、次式：
   ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値＝０．９９４×ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ｎｇ／ｍＬ）＋０．０２５５×ＡＳＴ活性値（ＩＵ／Ｌ）
   で求められるＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値であり、かつ、前記カットオフ値が、４．６～５．２の範囲から選択される値であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
4. 前記スコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度、及び血清におけるＡＳＴ活性値から、次式：
   ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値＝１．５０×ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ｎｇ／ｍＬ）＋０．０２６４×ＡＳＴ活性値（ＩＵ／Ｌ）
   で求められるＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値であり、かつ、前記カットオフ値が、６．７～７．５の範囲から選択される値であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
5. 前記肝線維化進展度がＮＡＳＨ重症度であることを特徴とする、請求項１～４のうちのいずれか一項に記載の方法。
6. 肝線維化進展度がＦ０段階又はＦ０以上の段階にあると鑑別するための情報を提供する方法であり、被験者由来の血液検体のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度に基づく第一のスコアを、予め定められた第一のカットオフ値と比較し、前記第一のスコアの高低の情報を提供することを特徴とする、方法。
7. 前記第一のスコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度であり、かつ、前記第一のカットオフ値が、３．３５ｎｇ／ｍＬ以上３．７５ｎｇ／ｍＬ未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
8. 前記第一のスコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度、及び血清におけるＡＳＴ活性値から、次式：
   ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値＝０．９９４×ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ｎｇ／ｍＬ）＋０．０２５５×ＡＳＴ活性値（ＩＵ／Ｌ）
   で求められるＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値であり、かつ、前記第一のカットオフ値が、３．８２以上４．４２未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
9. 前記第一のスコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度、及び血清におけるＡＳＴ活性値から、次式：
   ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値＝１．５０×ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ｎｇ／ｍＬ）＋０．０２６４×ＡＳＴ活性値（ＩＵ／Ｌ）
   で求められるＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値であり、かつ、前記第一のカットオフ値が、５．５３以上６．３５未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
10. 肝線維化進展度がＦ１段階又はＦ１以上の段階にあると判定してさらに鑑別するための情報を提供する方法であり、被験者由来の血液検体のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度に基づく第二のスコアを、予め定められた第二のカットオフ値と比較し、前記第二のスコアの高低の情報を提供することを特徴とする、請求項６～９のうちのいずれか一項に記載の方法。
11. 前記第二のスコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度であり、かつ、前記第二のカットオフ値が、３．７５ｎｇ／ｍＬ以上３．８５ｎｇ／ｍＬ未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
12. 前記第二のスコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度、及び血清におけるＡＳＴ活性値から、次式：
    ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値＝０．９９４×ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ｎｇ／ｍＬ）＋０．０２５５×ＡＳＴ活性値（ＩＵ／Ｌ）
    で求められるＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値であり、かつ、前記第二のカットオフ値が、４．４２以上４．８７未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
13. 前記第二のスコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度、及び血清におけるＡＳＴ活性値から、次式：
    ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値＝１．５０×ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ｎｇ／ｍＬ）＋０．０２６４×ＡＳＴ活性値（ＩＵ／Ｌ）
    で求められるＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値であり、かつ、前記第二のカットオフ値が、６．３５以上６．８４未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
14. 肝線維化進展度がＦ２段階又はＦ２以上の段階にあると判定してさらに鑑別するための情報を提供する方法であり、被験者由来の血液検体のＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度に基づく第三のスコアを、予め定められた第三のカットオフ値と比較し、前記第三のスコアの高低の情報を提供することを特徴とする、請求項６～１３のうちのいずれか一項に記載の方法。
15. 前記第三のスコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度であり、かつ、前記第三のカットオフ値が、３．８５ｎｇ／ｍＬ以上４．８５ｎｇ／ｍＬ未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
16. 前記第三のスコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度、及び血清におけるＡＳＴ活性値から、次式：
    ＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値＝０．９９４×ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ｎｇ／ｍＬ）＋０．０２５５×ＡＳＴ活性値（ＩＵ／Ｌ）
    で求められるＣＡ ｉｎｄｅｘ－ＮＡＳＨ値であり、かつ、前記第三のカットオフ値が、４．８７以上６．０９未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
17. 前記第三のスコアが、血清又は血漿におけるＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度、及び血清におけるＡＳＴ活性値から、次式：
    ＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値＝１．５０×ＩＶ型コラ－ゲン７Ｓ濃度（ｎｇ／ｍＬ）＋０．０２６４×ＡＳＴ活性値（ＩＵ／Ｌ）
    で求められるＣＡ ｉｎｄｅｘ－Ｆｉｂｒｏｓｉｓ値であり、かつ、前記第三のカットオフ値が、６．８４以上８．５４未満の範囲から選択される値であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
18. 前記肝線維化進展度がＮＡＳＨ重症度であることを特徴とする、請求項６～１７のうちのいずれか一項に記載の方法。