JP7447294B2

JP7447294B2 - シュワネラ・アトランティカ由来蛋白質を発現する微生物、およびこれを利用したｌ－アミノ酸生産方法

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Publication number: JP7447294B2
Application number: JP2022554350A
Authority: JP
Inventors: ベ，ヒュン・ウォン; ジュン，ム・ヨン; キム，サン・ジュン; パク，サン・ミン; ビュン，ヒョ・ジョン; シン，ヨン・ウク; イ，ハン・ヒョン; イム，ボラム; ジャン，ジェウォン; チョイ，ユンジュン
Original assignee: シージェイチェルジェダンコーポレイション
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2021-11-29
Publication date: 2024-03-11
Anticipated expiration: 2041-11-29
Also published as: AU2021394840B2; EP4261286A4; ZA202210974B; MY210572A; AU2021394840A1; PH12023550029A1; EP4261286A1; MX2023000785A; JP2023517591A; AR124292A1; KR102616694B1; US20250263446A1; WO2022124670A1; KR20220081825A; CN115605599A

Description

KCCM

KCCM12828P

外来蛋白質を発現する微生物およびこれを利用したＬ－アミノ酸生産方法が提供される。前記外来蛋白質を発現する微生物は、野生型と比較して、Ｌ－アミノ酸排出能および／または生産能が向上したものであり得る。

コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物は、Ｌ－アミノ酸の生産に多く利用されているグラム陽性の微生物である。Ｌ－アミノ酸は、動物飼料、ヒトの医薬品および化粧品産業に使用されており、コリネバクテリウム菌株を利用した発酵により生成されている。

コリネバクテリウム菌株を利用したＬ－アミノ酸の製造方法を改善するために、多くの試みが行われている。その中で組換えＤＮＡ技術を利用して特定の遺伝子を破壊させたり減衰発現させたりすることによってＬ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム菌株を改良しようとする研究が行われている。また、それぞれのＬ－アミノ酸生合成に関する遺伝子を増幅させてＬ－アミノ酸生成に及ぼす効果を研究し、Ｌ－アミノ酸生産コリネバクテリウム菌株を改良しようとする多くの研究が行われてきた。それにも拘らず、依然としてＬ－アミノ酸生産能が向上した菌株の開発が要求されている。

一例は、外来蛋白質を発現する微生物を提供する。前記外来蛋白質は、前記微生物と異種微生物由来の蛋白質であり、本明細書で新たにリジン排出機能が明らかになった蛋白質であり得る。前記外来蛋白質を発現する微生物は、前記外来蛋白質を発現しない同種微生物と比較して、Ｌ－アミノ酸の排出能および／または生産能が向上したものであり得る。

他の例は、前記外来蛋白質を発現する微生物を含むＬ－アミノ酸生産用組成物を提供する。

他の例は、前記外来蛋白質を発現する微生物を培養する工程を含む、Ｌ－アミノ酸の生産方法を提供する。

前記微生物は、コリネバクテリウム属微生物であり得る。

本明細書では、コリネバクテリウム属微生物のＬ－アミノ酸生産能の増加を目的でＬ－アミノ酸の新規な排出蛋白質を探索し、導入することによって菌株を改良しようとした。Ｌ－リジンを代表的な例として説明すると、一般的にリジン生産能の増加のためには菌株が有するＬ－リジン収率を向上させたり、時間当たりＬ－リジン生産量（生産性）を増加させたりする方法がある。Ｌ－リジン排出蛋白質は、生合成を経て生成されたリジンを排出する膜蛋白質であり、この蛋白質の改良はリジン収率と生産性増加に重要である。しかし、コリネバクテリウム属微生物が保有しているＬ－リジン排出蛋白質（ｌｙｓＥ、Ｎｃｇｌ１２１４）の発現量増加はＬ－リジン生産能を向上させるには限界がある。

そこで、本明細書では、Ｌ－アミノ酸排出活性が高い新たな外来Ｌ－アミノ酸排出蛋白質を探索し、これをリジン生産菌株に導入させることによって、Ｌ－アミノ酸排出能および／または生産能が向上した、組換え菌株を提供する。

本明細書において、新たな外来Ｌ－アミノ酸排出蛋白質の代表的な例としてシュワネラ・アトランティカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａａｔｌａｎｔｉｃａ）由来の新規Ｌ－アミノ酸排出蛋白質およびこれをコードする遺伝子を発掘し、これをＬ－アミノ酸を生産する微生物に発現させた結果、前記遺伝子が発現しない微生物と比較してＬ－アミノ酸の排出能／生産能が顕著に向上することを確認した。

一例は、外来蛋白質を発現する微生物を提供する。前記外来蛋白質は、前記微生物と異種微生物由来の蛋白質であり、本明細書で新たにリジン排出機能が明らかになった蛋白質であり得る。前記外来蛋白質を発現する微生物は、前記外来蛋白質を発現しない同種微生物と比較して、Ｌ－アミノ酸、例えば、Ｌ－リジンまたはＬ－アルギニンの排出能および／または生産能が向上したものであり得る。

他の例は、前記外来蛋白質を発現する微生物を含むＬ－アミノ酸の生産用組成物を提供する。

前記微生物は、コリネバクテリウム属微生物であり得る。

前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－リジンまたはＬ－アルギニンを含むことができる。

以下、より詳細に説明する。

本明細書において、前記外来蛋白質は、親菌株（変異前微生物）と異なる属に属する微生物または異なる種の微生物に由来する蛋白質であり得、例えば、コリネバクテリウム属に属する微生物以外の微生物に由来する蛋白質であり、本明細書で新たに明らかになったＬ－アミノ酸、例えば、Ｌ－リジンまたはＬ－アルギニンの排出能を有する蛋白質であり得る。一例で、前記外来蛋白質は、シュワネラ属微生物、例えばシュワネラ・アトランティカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａａｔｌａｎｔｉｃａ）由来の膜蛋白質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列で表現される）；または前記蛋白質と６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の配列同一性または相同性を有する蛋白質（例えば膜蛋白質）であり得る。

前記微生物は、１種以上の前記外来蛋白質を含むかまたは発現するものであり得る。前記外来蛋白質を発現する微生物は、前述した外来蛋白質をコードするポリヌクレオチドが導入された組換え微生物であり得る。一例において、前記配列番号１の蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列または配列番号２の核酸配列と６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の配列同一性または相同性を有する配列で表現され得る。

前記外来蛋白質を発現する微生物は、Ｌ－アミノ酸排出能および／または生産能を有するＬ－アミノ酸生産微生物であり得る。

本明細書において、用語「Ｌ－アミノ酸生産微生物」は、Ｌ－アミノ酸排出能および／または生産能を有する微生物が前述したような外来蛋白質を発現するように変異されることによって前記微生物が増加されたＬ－アミノ酸排出能および／または生産能を有する場合、および／またはＬ－アミノ酸排出能および／または生産能を有さない微生物が前記外来蛋白質を発現するように変異されることによって前記微生物がＬ－アミノ酸排出能および／または生産能を有するようになる場合を意味するために使用され得る。本明細書において「微生物」は、単細胞細菌を包括するもので、「細胞」と互換可能に使用され得る。本明細書において、前記外来蛋白質を発現するように変異される前の微生物を前記変異された微生物と区別するために、「親菌株（ｐａｒｅｎｔｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｏｒｐａｒｅｎｔｓｔｒａｉｎ）または宿主細胞（ｈｏｓｔｃｅｌｌ）」と表現され得る。

前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－リジンまたはＬ－アルギニン、例えば、Ｌ－リジンであり得る。

一例において、前記微生物は、Ｌ－アミノ酸排出能および／または生産能を有する全ての微生物から選択されたものであり得る。一例において、前記微生物、例えば、変異前の親菌株は、（１）自然にＬ－アミノ酸排出能および／または生産能を有する微生物、または（２）前記自然にＬ－アミノ酸排出能および／または生産能を有する微生物またはＬ－アミノ酸排出能および／または生産能がないか顕著に少ない菌株に変異が導入されてＬ－アミノ酸排出能および／または生産能を有するか、Ｌ－アミノ酸排出能および／または生産能が向上した微生物であり得る。

一具体例において、前記微生物は（１）自然にＬ－アミノ酸排出能および／または生産能を有する微生物、または（２）前記自然にＬ－アミノ酸排出能および／または生産能を有する微生物またはＬ－アミノ酸排出能および／または生産能がないか顕著に少ない親菌株に変異が導入されてＬ－アミノ酸排出能および／または生産能を有するか、Ｌ－アミノ酸排出能および／または生産能が向上した全てのコリネバクテリウム属（ｔｈｅｇｅｎｕｓＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）微生物などからなる群より選択された１種以上であり得る。前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アムモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）などを含むことができるが、必ずしもこれに限定されるのではない。より具体的には、前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であり得る。

一例において、前記外来蛋白質を発現する微生物は、前記外来蛋白質を発現するようにする変異が導入された微生物であり得る。このように、外来蛋白質を発現するように変異された微生物は、同種の非改変微生物と比較して、Ｌ－アミノ酸排出能および／または生産能が増加したものであり得る。前記非改変微生物は、前記外来蛋白質を発現しない微生物であって、前記外来蛋白質を発現するようにする変異が導入されない同種の微生物または前記変異が導入される前の微生物を意味し得る。

本明細書において、「外来蛋白質を発現するようにする変異」は、親菌株に前述した外来蛋白質を発現するようにする全ての操作を意味し得る。一例において、外来蛋白質を発現するようにする変異は、前記外来蛋白質をコードするポリヌクレオチド、またはこれを含む組換えベクターを親菌株に導入するものであり得る。

前記「外来蛋白質を発現するようにする変異が導入された微生物」または「外来蛋白質を発現するように変異された微生物」は、前記外来蛋白質をコードするポリヌクレオチド、またはこれを含む組換えベクターが導入された微生物であり得、非改変微生物と比較して、Ｌ－アミノ酸排出能および／または生産能が付与されたり増加させたりしたものであり得る。

一例において、前記親菌株は、野生型であるか、Ｌ－アミノ酸の排出能および／または生産能が増加するように変異されたもの、例えば、野生型と比較してＬ－アミノ酸の生合成または代謝に関与する蛋白質活性が調節（増加（促進）または減少（抑制））されたものであり得るが、これに制限されるのではない。

一具体例において、前記外来蛋白質が発現したＬ－アミノ酸生産微生物は、寄託番号ＫＣＣＭ１２８２８Ｐであるものであり得る。

本明細書において、ポリヌクレオチド（「遺伝子」と互換可能に使用され得る）またはポリペプチド（「蛋白質」と互換可能に使用され得る）が「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む、特定の核酸配列またはアミノ酸配列からなる、または特定の核酸配列またはアミノ酸配列で表現される」とは、同等な意味に互換可能な表現であり、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列を必須で含むことを意味し得、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの本来の機能および／または目的とする機能を維持する範囲で前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列に変異（欠失、置換、改変、および／または付加）が加えられた「実質的に同等な配列」を含むもの（または前記変異を排除しないもの）と解釈され得る。

一例において、本明細書で提供される核酸配列またはアミノ酸配列は、これらの本来の機能または目的とする機能を維持する範囲で通常の突然変異誘発法、例えば指向性進化法（ｄｉｒｅｃｔｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）および／または部位特異的突然変異法（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）などにより改変されたものを含むことができる。本明細書において、異なって記載されない限り、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む、または前記配列からなる」とは、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが（ｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列を必須で含むか、または（ｉｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列と６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるか、これを必須で含み、本来の機能および／または目的とする機能を維持することを意味し得る。本明細書において、前記本来の機能は、リジン排出蛋白質機能（アミノ酸配列の場合）、または前記リジン排出蛋白質機能を有する蛋白質をコードする機能（核酸配列の場合）であり得、前記目的とする機能は、微生物のＬ－アミノ酸（例えば、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、またはこれらの組み合わせ）排出能および／または生産能を増加させたり付与したりする機能を意味し得る。

本出願で用語「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、二つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列と関連した程度を意味し、百分率で表示され得る。相同性および同一性の用語は、時々相互交換的に利用され得る。

保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムにより決定され、使用されるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に利用され得る。実質的に、相同性を有するか（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または同一な（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）配列は、一般的に配列全体または全体－長さの少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％により中間または高いストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）でハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドで一般コドンまたはコドン縮重を考慮したコドンを含有するポリヌクレオチドも含まれることが自明である。

任意の二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するか否かは、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎｅｔａｌ（１９８８）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５］：２４４４でのようなデフォルトパラメータを利用して「ＦＡＳＴＡ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定され得る。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：ＴｈｅＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＯｐｅｎＳｏｆｔｗａｒｅＳｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅｅｔａｌ．，２０００，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）（バージョン５．０．０または以降のバージョン）で行われるような、ニードルマン－ブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）が使用されて決定され得る（ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔａｌ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１２：３８７（１９８４）），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，［Ｓ．］［Ｆ．，］［ＥＴＡＬ，ＪＭＯＬＥＣＢＩＯＬ２１５］：４０３（１９９０）；ＧｕｉｄｅｔｏＨｕｇｅＣｏｍｐｕｔｅｒｓ，ＭａｒｔｉｎＪ．Ｂｉｓｈｏｐ，［ＥＤ．，］ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９４，および［ＣＡＲＩＬＬＯＥＴＡ／．］（１９８８）ＳＩＡＭＪＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈ４８：１０７３を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを利用して相同性、類似性または同一性を決定することができる。

ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ（１９８１）２：４８２に公知されたとおり、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎｅｔａｌ．（１９７０），ＪＭｏｌＢｉｏｌ．４８：４４３のようなＧＡＰコンピュータプログラムを利用して配列情報を比較することによって決定され得る。要約すれば、ＧＡＰプログラムは、二つの配列のうち、より短いものにおける記号の全体数で、類似の配列された記号（つまり、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を割った値で定義することができる。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは（１）２進法比較マトリックス（同一性のために１、そして非同一性のために０の値を含有する）およびＳｃｈｗａｒｔｚａｎｄＤａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，ＡｔｌａｓＯｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３－３５８（１９７９）により開示されたとおり、Ｇｒｉｂｓｋｏｖｅｔａｌ（１９８６）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４：６７４５の加重された比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティおよび各ギャップで各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；および（３）末端ギャップのための無ペナルティを含むことができる。

また、任意の二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するか否かは、定義されたストリンジェントな条件下でサザンハイブリダイゼーション実験により配列を比較することによって確認することができ、定義される適切なハイブリダイゼーション条件は当該技術範囲内であり、当業者によく知られた方法（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙｐｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ）で決定され得る。

本明細書に記載された核酸配列は、コドンの縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により前記蛋白質（リジン排出蛋白質）を発現させようとする微生物で好まれるコドンを考慮して、コーディング領域から発現する蛋白質のアミノ酸配列および／または機能を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な改変が行われ得る。

一例において、本明細書に提供される特定の核酸配列を含むポリヌクレオチドは、前記特定の核酸配列またはこれと実質的に同等な核酸配列だけでなく、前記特定の核酸配列に相補的な核酸配列を含むポリヌクレオチド断片を含むと解釈され得る。具体的に、前記相補性を有するポリヌクレオチドは、目的に応じて当業者により適切に調節可能なＴｍ値、例えば、５５℃、６０℃、６３℃または６５℃のＴｍ値でハイブリダイズし、後述する条件で分析することができる：このような条件は、公知の文献に具体的に記載されている。例えば、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の高い相補性を有する遺伝子同士でハイブリダイズし、それより低い相補性を有する遺伝子同士はハイブリダイズしない条件、または通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６０℃、１ｘＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ－ｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅｂｕｆｆｅｒ）、および０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（ＳｏｄｉｕｍＤｏｄｅｃｙｌＳｕｌｆａｔｅ）；６０℃、０．１ｘＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳ；または６８℃、０．１ｘＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度および温度で、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件などを列挙することができるが、これに制限されるのではない。ハイブリダイゼーションには二つのヌクレオチドが相補的配列を有することが要求されるか、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーにより塩基間のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が許容され得る。前記用語「相補的」は、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するために使用され得る。例えば、ＤＮＡの場合、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーは、ポリヌクレオチドの長さおよび相補性程度に依存し、これは関連技術分野によく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ，９．５０－９．５１，１１．７－１１．８参照）。

前記ポリヌクレオチドまたはベクターの導入は、公知の形質転換方法を当業者が適切に選択して行われ得る。本明細書において、用語「形質転換」は、標的蛋白質（外来蛋白質）をコードするポリヌクレオチドやこれを含むベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードする蛋白質が発現することができるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現さえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するかまたは染色体外に位置するかに関係なくこれらの全てを含むことができる。また、前記ポリヌクレオチドは、標的蛋白質をコーディングするＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、その導入される形態は制限がない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、独自的に発現するのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入され得る。前記発現カセットは、通常前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボソーム結合部位および／または翻訳終結信号などの発現調節要素を含むことができる。前記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクターの形態であり得る。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよい。前記で用語「作動可能に連結」されたものとは、発現調節要素が目的蛋白質（外来蛋白質）をコードするポリヌクレオチドの転写調節（例、転写開始）を行うことができるように発現調節要素（例、プロモーター）とポリヌクレオチドが機能的に連結されていることを意味し得る。作動可能な連結は、当業系における公知の遺伝子組換え技術を利用して行うことができ、例えば、通常の部位－特異的ＤＮＡ切断および連結により行われ得るが、これに制限されない。

前記ポリヌクレオチドを宿主細胞に形質転換する方法は、核酸を細胞（微生物）内に導入する如何なる方法でも遂行可能であり、宿主細胞により当該分野における公知の形質転換技術を適切に選択して行うことができる。前記公知の形質転換方法として電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ_４）沈澱法、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）沈澱法、マイクロインジェクション法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱法（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄｕｐｔａｋｅ）、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポゾーム法、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などが例示され得るが、これに制限されるのではない。

前記ポリヌクレオチドの宿主細胞遺伝体（染色体）内導入（挿入）は、公知の方法を当業者が適切に選択して行うことができ、例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼシステム（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓｙｓｔｅｍ；例えば、（ａ）ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９蛋白質など）、それをコードする遺伝子、または前記遺伝子を含むベクター；および（ｂ）ガイドＲＮＡ（例、ｓｉｎｇｌｅｇｕｉｄｅＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）など）、それをコードするＤＮＡ、または前記ＤＮＡを含むベクターを含む混合物（例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼ蛋白質とガイドＲＮＡの混合物など）、複合体（例えば、リボ核酸融合蛋白質（ＲＮＰ）、組換えベクター（例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子およびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを共に含むベクターなど）などからなる群より選択された一つ以上）を使用して行うことができるが、これに制限されるのではない。

本明細書において、用語「ベクター」は、適した宿主内で目的蛋白質を発現させることができるように適した調節配列に作動可能に連結された前記目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始できるプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および／または転写および／または解読の終結を調節する配列を含むことができる。ベクターは、適当な宿主微生物内に形質転換された後、宿主細胞のゲノム（遺伝体）と関係なく発現したり、宿主細胞のゲノム内に統合され得る。

本明細書で使用可能なベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、通常使用される全てのベクターの中で選択され得る。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組換えられた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージなどが挙げられる。例えば、前記ベクターとして、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、およびＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとしてｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系およびｐＥＴ系などを使用することができる。具体的にはｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを例示することができるが、これに制限されない。

本明細書で使用可能なベクターは、公知の発現ベクターおよび／またはポリヌクレオチドの宿主細胞染色体内挿入用ベクターであり得る。前記ポリヌクレオチドの宿主細胞染色体内挿入は、当業界に知られた任意の方法、例えば、相同組換えまたはＣＲＩＳＰＲシステムにより行われ得るが、これに限定されない。前記ベクターは、前記染色体内挿入の有無を確認するための選別マーカ（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｍａｒｋｅｒ）を追加的に含むことができる。前記選別マーカは、ベクターに形質転換された細胞を選別、つまり、前記ポリヌクレオチドの挿入有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面蛋白質の発現のような選択可能表現型を付与した遺伝子の中で選択して使用することができる。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｇｅｎｔ）が処理された環境では選別マーカを発現する細胞だけが生存したり他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。

他の例は、前記外来蛋白質、それをコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを微生物に導入（形質転換）させる工程を含む、前記微生物のＬ－アミノ酸排出能および／または生産能増加方法または前記微生物にＬ－アミノ酸排出能および／または生産能付与方法を提供する。

前記外来蛋白質、ポリヌクレオチド、および微生物は前述したとおりである。

他の例は、前記Ｌ－アミノ酸生産微生物を培地で培養する工程を含む、Ｌ－アミノ酸の生産方法を提供する。前記方法は、前記培養する工程以降に、前記培養した微生物、培地、またはこれらの全てからＬ－アミノ酸を回収する工程を追加的に含むことができる。

前記方法において、前記微生物を培養する工程は、特にこれに制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加格式培養方法などにより行うことができる。この時、培養条件は、特にこれに制限されないが、塩基性化合物（例：水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例：リン酸または硫酸）を使用して適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５～９、具体的にはｐＨ６～８、最も具体的にはｐＨ６．８）を調節することができ、酸素または酸素－含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持することができる。培養温度は２０～４５℃、または２５～４０℃を維持することができ、約１０～１６０時間培養することができるが、これに制限されるのではない。前記培養により生産されたＬ－アミノ酸は培地中に分泌されたり細胞内に残留することができる。

前記培養に使用可能な培地は、炭素供給源として糖および炭水化物（例：グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプンおよびセルロース）、油脂および脂肪（例：大豆油、ヒマワリ種子油、ピーナッツ油およびココナッツ油）、脂肪酸（例：パルミチン酸、ステアリン酸およびリノレン酸）、アルコール（例：グリセロールおよびエタノール）、有機酸（例：酢酸）などからなる群より選択された１種以上を個別的に使用したりまたは２種以上を混合したりして使用することができるが、これに制限されない。窒素供給源としては、窒素－含有有機化合物（例：ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、とうもろこし浸漬液、大豆粕粉および尿素）、無機化合物（例：硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム）などからなる群より選択された１種以上を個別的に使用したりまたは２種以上を混合したりして使用することができるが、これに制限されない。リン供給源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などからなる群より選択された１種以上を個別的に使用したりまたは２種以上を混合して使用することができるが、これに制限されない。また、前記培地は、その他金属塩（例：硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸、および／またはビタミンなどのような必須成長－促進物質を含むことができる。

前記Ｌ－アミノ酸を回収する工程は、培養方法により当該分野に公知の適した方法を利用して培地、培養液、または微生物から目的とするアミノ酸を収集するものであり得る。例えば、前記回収する工程は、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどから選択された一つ以上の方法で行うことができる。前記Ｌ－アミノ酸を回収する方法は、前記回収する工程の前、同時、または後に、精製工程を追加的に含むことができる。

本明細書では、微生物のＬ－アミノ酸の排出能および／または生産能を増加させる技術が提供され、このために、新たにＬ－アミノ酸の排出能が明らかになった外来蛋白質、および前記外来蛋白質を微生物に導入することによって、親菌株に比べてＬ－アミノ酸の生産性を向上させることができる技術が提供される。

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これは例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を制限しようとするのでない。下記に記載された実施例は、発明の本質的な要旨を逸脱しない範囲で変形可能であることは当業者に自明である。

実施例１：Ｌ－リジン排出遺伝子の探索および選別
コリネバクテリウム属微生物が内在的に保有するＬ－リジン排出体（ｌｙｓＥ、Ｎｃｇｌ１２１４）と比較してＬ－リジン排出活性が高い排出体を探索するために、ＮＣＢＩＣＤＤ（ＣｏｍｍｏｎＤｏｍａｉｎＤａｔａｂａｓｅ）を利用したＲＰＳ－ＢＬＡＳＴ探索とＫＥＧＧＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａｂａｓｅを利用したＢＬＡＳＴ探索を行った。Ｌ－リジンを排出できる膜蛋白質として考慮される候補蛋白質を選定した。

実施例２：外来膜蛋白質遺伝子導入ベクターの作製
前記実施例１で選定されたシュワネラ・アトランティカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａａｔｌａｎｔｉｃａ、Ｓａｔ）由来の膜蛋白質は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。米国国立衛生研究所ジェンバンク（ＮＩＨＧｅｎＢａｎｋ）から前記膜蛋白質をコーディングする遺伝子および周辺核酸配列に対する情報（登録番号ＮＺ＿ＲＸＮＶ０１０００００２．１）を獲得した。当該遺伝子配列に基づいてＤＮＡ合成を行った（Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ、Ｋｏｒｅａ）。遺伝子を増幅させるために、合成されたＤＮＡを鋳型として配列番号３と４のプライマー（表２）を利用してＰＣＲ（ＳｏｌｇＴＭＰｆｕ－ＸＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を行った（表３）。その結果、６０９ｂｐの遺伝子（配列番号２）を含む６３９ｂｐの遺伝子断片を得た。

コリネバクテリウム・グルタミクム由来のｇａｐＡプロモーターを確保するために、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５と６のプライマー（表２）を利用してＰＣＲ（ＳｏｌｇＴＭＰｆｕ－ＸＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を行った（表３）。増幅されたｇａｐＡプロモーター部位と前記得られたシュワネラ・アトランティカ由来遺伝子断片およびＮｄｅＩ制限酵素で切断されたベクターｐＤＺＴｎ（韓国登録特許第１０－１１２６０４１号）をギブソンアセンブリー（ＤＧＧｉｂｓｏｎｅｔａｌ．，ＮＡＴＵＲＥＭＥＴＨＯＤＳ，ＶＯＬ．６ＮＯ．５，ＭＡＹ２００９，ＮＥＢｕｉｌｄｅｒＨｉＦｉＤＮＡＡｓｓｅｍｂｌｙＭａｓｔｅｒＭｉｘ）方法を利用して連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれているＬＢ固体培地に塗抹した。目的とした遺伝子とｐＤＺＴｎが連結されたベクターに形質転換されたコロニーを選別するために配列番号７と８（表２）のプライマーでＰＣＲを行った。選別されたコロニーから通常知られたプラスミド抽出法を利用してプラスミドを獲得し、このプラスミドをｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－Ｓａｔと命名した。

実施例３：外来膜蛋白質導入菌株の作製
作製されたｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－Ｓａｔベクターを利用してＬ－リジンを生産するコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株（大韓民国登録特許第１０－０１５９８１２号）を電気穿孔法（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）５２：５４１－５４５）で形質転換した後、２次交差過程を経てトランスポゾン遺伝子の間にＰｇａｐＡ－Ｓａｔが挿入された菌株を獲得した。当該遺伝子が挿入された位置を含む隣接部位を増幅できる配列番号９と配列番号１０のプライマー（表４）を利用してＰＣＲおよび塩基配列分析を行い、当該遺伝的操作を確認した。このように得た菌株をコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ＰｇａｐＡ－Ｓａｔと命名した。

実施例４：外来膜蛋白質が導入されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株でＬ－アミノ酸生産能の比較
ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ＰｇａｐＡ－Ｓat菌株と対照群ＫＣＣＭ１１０１６Ｐを以下のような方法で培養して、菌体量、糖消耗能、アミノ酸生産能を比較した。
まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種して３７℃で４２時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。培養終了後、ＨＰＬＣによりＬ－アミノ酸の生産量を測定した。前記実験は３回繰り返し、培養結果（平均値）は表５に示した。

＜種培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４４ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４８ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ、ビオチン０．１ｍｇ、チアミンＨＣｌ１ｍｇ、カルシウム－パントテン酸２２ｍｇ、ニコチンアミド２ｍｇ（蒸溜水１リットル基準）

＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖４５ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４１５ｇ、大豆蛋白質１０ｇ、糖蜜１０ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４０．５５ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．６ｇ、ビオチン０．９ｍｇ、チアミン塩酸塩４．５ｍｇ、カルシウム－パントテン酸４．５ｍｇ、ニコチンアミド３０ｍｇ、ＭｎＳＯ_４９ｍｇ、ＦｅＳＯ_４９ｍｇ、ＺｎＳＯ_４０．４５ｍｇ、ＣｕＳＯ_４０．４５ｍｇ、ＣａＣＯ_３３０ｇ（蒸溜水１リットル基準）。

ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ＰｇａｐＡ－Ｓａｔ菌株（ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＣＭ０３－１４８６）は、２０２０年１０月２９日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に国際寄託してＫＣＣＭ１２８２８Ｐで寄託番号が付与された。

実施例５：外来膜蛋白質が導入されたＫＣＣＭ１０７７０Ｐ菌株でＬ－アミノ酸生産能の比較
前記実施例３に記述した方法を利用してコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（大韓民国登録特許第１０－０９２４０６５号）菌株のゲノム上のトランスポゾン位置にＰｇａｐＡ－Ｓａｔ遺伝子が挿入された菌株を獲得した。このように得た菌株をコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：ＰｇａｐＡ－Ｓａｔと命名した。

ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：ＰｇａｐＡ－Ｓａｔ菌株と対照群ＫＣＣＭ１０７７０Ｐを培養して、菌体量、糖消耗能、アミノ酸生産能を比較した。前記実験は３回繰り返し、培養結果（平均値）は表６に示した。

表６に示すように、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：ＰｇａｐＡ－Ｓａｔ菌株は、対照菌株であるＫＣＣＭ１０７７０Ｐと比較して増加されたアミノ酸生産能を示した。

実施例６：外来膜蛋白質が導入されたＣＪ３Ｐ菌株でＬ－アミノ酸生産能の比較
野生株に３種の変異［ｐｙｃ（Ｐ４５８Ｓ）、ｈｏｍ（Ｖ５９Ａ）、ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）］を導入してＬ－リジン生産能を有するようになったコリネバクテリウム・グルタミクムＣＪ３Ｐ（ＵＳ９５５６４６３Ｂ２）菌株のゲノム上のトランスポゾン位置に前記実施例３に記述した方法を利用してＰｇａｐＡ－Ｓａｔ遺伝子が挿入された菌株を獲得した。このように得た菌株をコリネバクテリウム・グルタミクムＣＪ３Ｐ：：ＰｇａｐＡ－Ｓａｔと命名した。

ＣＪ３Ｐ：：ＰｇａｐＡ－Ｓａｔ菌株と対照群ＣＪ３Ｐを培養して、菌体量、糖消耗能、アミノ酸生産能を比較した（実施例４参照）。前記実験は３回繰り返し、培養結果（平均値）は表７に示した。

表７に示すように、ＣＪ３Ｐ：：ＰｇａｐＡ－Ｓａｔ菌株は、対照菌株であるＣＪ３Ｐと比較して増加されたアミノ酸生産能を示した。

以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者は、本出願がその技術的な思想や必須的特徴を変更することなく、他の具体的な形態に実施可能であることを理解できるはずである。これと関連して、以上で記述した実施例は、全ての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解しなければならない。本出願の範囲は、前記詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味および範囲、そしてその等価概念から導き出される全ての変更または改変された形態が本出願の範囲に含まれると解釈されなければならない。

Claims

配列番号１のシュワネラ・アトランティカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａａｔｌａｎｔｉｃａ）由来のＬ－アミノ酸排出能を有する膜蛋白質、またはこれと９０％以上の配列同一性を有し、シュワネラ属微生物由来のＬ－アミノ酸排出能を有する膜蛋白質を発現する、コリネバクテリウム属微生物。
前記コリネバクテリウム属微生物は、前記膜蛋白質をコードするポリヌクレオチドが導入されたものである、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
前記ポリヌクレオチドは、配列番号２またはこれと７５％以上の配列同一性を有する核酸配列で表現されるものである、請求項２に記載のコリネバクテリウム属微生物。
前記膜蛋白質を発現しないコリネバクテリウム属微生物と比較して、Ｌ－アミノ酸生産能が増加された、請求項１～３のいずれか一項に記載のコリネバクテリウム属微生物。
前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－リジンまたはＬ－アルギニンである、請求項４に記載のコリネバクテリウム属微生物。
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクムである、請求項１～３のいずれか一項に記載のコリネバクテリウム属微生物。
請求項１～３のいずれか一項に記載のコリネバクテリウム属微生物を含む、Ｌ－アミノ酸生産用組成物。
前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－リジンまたはＬ－アルギニンである、請求項７に記載の組成物。
請求項１～３のいずれか一項に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する工程、および
前記培養された微生物、培地、またはこれらの全てからＬ－アミノ酸を回収する工程を含む、Ｌ－アミノ酸の生産方法。
前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－リジンまたはＬ－アルギニンである、請求項９に記載の方法。