JP7447389B2

JP7447389B2 - Ｔ細胞遺伝子発現の非ウイルス性改変

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Publication number: JP7447389B2
Application number: JP2021560983A
Authority: JP
Inventors: アニサ・トーマス; アンドリュー・ウィリアム・ブラウン; レベッカ・アン・グレース・デ・ソウザ; タラ・フェルナンデス
Original assignee: Precision Nanosystems ULC
Current assignee: Precision Nanosystems ULC
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2020-04-14
Publication date: 2024-03-12
Anticipated expiration: 2040-04-14
Also published as: US20220162552A1; EP3956459A4; KR20240167097A; CN113710811A; KR20210133982A; EP3956459A1; CA3133394A1; WO2020210901A1; JP2022528996A; AU2020260280B2; CN113710811B; KR102732019B1; AU2020260280A1

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2019年4月15日に提出された米国仮出願第62/833,993号、2019年6月13日に提出された同第62/861,220号、及び2019年10月19日に提出された同第62/923,525号からの優先権を主張する。

(a)分野
開示される本主題は全体として、核酸の、生きている細胞、具体的には生きているTリンパ球(T細胞)への、その生存率を維持しながらの送達に関する。

(b)関連先行技術
治療目的のために遺伝子発現を変化させることは、脂質ナノ粒子(LNP)中の核酸を細胞に送達することによって達成することができる。外来性mRNAは、in vivoタンパク質発現を発生させる手段としての見込みを有し、ウイルスベクターではなくLNPによって送達される場合、ウイルス性送達が引き起こす副作用及び安全性問題を回避する。

キメラ抗原受容体T細胞療法(CAR)は、ヒト使用に関して現在承認されている標的化免疫療法の1種である(Kymriah(商標)チサゲンレクロイセル、及びYescarta(商標)アキシカブタゲンシロロイセル)。この方法は、処置される対象由来の細胞を使用し、T細胞を選択及び濃縮し、次いでウイルスベクターを使用してこれらの細胞を操作して、キメラ抗原受容体(CAR)を発現させる。細胞は対象に戻され、結果として免疫療法となる¹。

CAR処置の成功にもかかわらず、a)処理された全てのT細胞がCARを有するわけではない、b)トランスフェクトされるT細胞に発現するCARの量にばらつきが存在する、c)CARを受ける患者は多くの場合、濃縮させることがより困難なより健康でないT細胞を生じる複数ラウンドの化学療法を有している、及び4)患者においてサイトカイン放出症候群(CRS)の高い発生率(46%以上)が存在する、という問題がある^2、3。CRSを有する患者は、集中治療室レベルの治療、及びトシリズマブ(Actemra(商標))等の強力且つ高価な免疫療法を伴う処置を必要とする。

ウイルスに基づくT細胞に対する形質転換が試みられているが、これは労働集約的且つ高価であり、製造上及び規制上の課題を提起する。好適なベクターが形質導入の効率を決定するため、ベクターの設計及び開発には時間がかかる。また、ウイルス製造方法は、高度に規制されており、多くの器材を必要とし、労働集約的(各患者に対して1つのバッチ)であるため、高価である。

ウイルスに基づくトランスフェクションはまた、ウイルスゲノムがヒトゲノムに無作為に挿入され得るというリスクを提起し、T細胞を専門的なウイルス製造施設において回収及び処理するために患者が退院することを必要とする。

別のT細胞形質転換技術は、電気穿孔法及び環状DNAを使用してT細胞タンパク質発現を修正する。しかしながら、電気穿孔された細胞は増殖するのに長時間かかる可能性があり、これは、T細胞の健康状態がこのプロセスによって影響を受けたことを示す証拠である。近年の研究は、電気穿孔後のT細胞の生存率がLNP媒介mRNA送達と対照的に31%であったことを示した¹。「スリーピングビューティーCART療法」はそのような電気穿孔法モダリティであるが、2018年に保留された^4、5。

電気穿孔法よりも破壊的でない非ウイルス手法は、T細胞の生存率及び対象の健康状態を保存すると同時に、T細胞媒介免疫療法処置を進展させ得る。

米国特許出願公開第2013323269号明細書米国特許出願公開第20120295832号明細書国際公開第2020047061号国際公開第2013/14910号米国特許第10507183号明細書米国特許出願公開第20180333366号明細書米国特許第10399937号明細書米国特許第10,383,952号明細書米国特許出願公開第2019292130号明細書国際公開第2009/096558号米国特許出願公開第20180000953号明細書米国特許第9,758,795号明細書米国特許第5,753,613号明細書米国特許第6,734,171号明細書米国特許第9,943,846号明細書米国特許第10,342,760号明細書米国特許第10,159,652号明細書米国特許出願公開第20180111830号明細書米国特許第10,076,730号明細書米国特許出願公開第2020023358号明細書米国意匠特許発明第771834号明細書米国意匠特許発明第771833号明細書米国意匠特許発明第772427号明細書米国意匠特許発明第803416号明細書米国意匠特許発明第800335号明細書米国意匠特許発明第800336号明細書米国意匠特許発明第812242号明細書米国特許出願公開第20040262223号明細書米国特許出願公開第2018093232号明細書米国特許出願公開第20110003380号明細書国際公開第2010/033140号米国特許第6,040,177号明細書

Caoら(2001) Gene Ther.、8: 1357～1362頁 Dachsら(2000) Eur. J. Cancer、36:1649～1660頁 Grecoら、(2002) Gene Ther.、9:1403～1411頁 Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第21版、A. R. Gennaro、Lippincott, Williams and Wilkins、Baltimore、MD、2006 Klebanoffら(2012) J Immunother. 35(9): 651～660頁 Terakuraら(2012) Blood. 1:72～82頁 Wangら(2012) J Immunother. 35(9):689～701頁

ある実施形態においては、35～55Mol%のイオン化可能な脂質、5～25Mol%の構造脂質、25～40Mol%のステロール、及び0.1～3Mol%の界面活性剤を含む脂質ミックス組成物が提供される。別の実施形態においては、組成物は核酸と混合されて脂質粒子を形成する。別の実施形態においては、核酸を標的細胞にトランスフェクトすることにおける使用のための脂質ミックス組成物が提供される。別の実施形態においては、前記トランスフェクトすることがex vivoにおいて行われる脂質ミックス組成物が提供される。

別の実施形態においては、構造脂質がDSPCである脂質ミックスが提供される。別の実施形態では、DSPCは10～20Mol%存在する。更に別の実施形態では、DSPCは20Mol%存在する。別の実施形態では、界面活性剤がポリオキシエチレン(10)ステアリルエーテルである脂質ミックスが提供される。別の実施形態においては、界面活性剤がポリソルベート80である脂質ミックスが提供される。別の実施形態では、界面活性剤はステアリン酸ポリオキシエチレン(40)である。別の実施形態では、界面活性剤はD-α-トコフェロールポリエチレングリコール1000コハク酸エステルである。

本発明の複数の実施形態では、イオン化可能な脂質は任意のイオン化可能な脂質である。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質はBOCHD-C3-DMAである。本発明の複数の実施形態では、イオン化可能な脂質はDlin-MC3-DMAである。本発明の複数の実施形態では、イオン化可能な脂質はDODMAである。本発明の複数の実施形態では、イオン化可能な脂質はKC2(DLin-KC2-DMA)である。他の実施形態では、イオン化可能な脂質はC12-200である。

本発明の複数の実施形態では、イオン化可能な脂質は40～50Mol%であり、構造脂質は10～20Mol%のDSPCであり、ステロールは37～39Mol%であり、界面活性剤は1～3Mol%である。

本発明の更なる実施形態では、イオン化可能な脂質は50Mol%を構成し、構造脂質は10Mol%のDSPCを構成し、ステロールは37.5Mol%のコレステロールを構成し、界面活性剤は2.5Mol%のポリオキシエチレン(10)ステアリルエーテルを構成する。

他の実施形態では、イオン化可能な脂質は40Mol%を構成し、構造脂質は20Mol%のDSPCを構成し、ステロールは37.5Mol%のコレステロールを構成し、界面活性剤は2.5Mol%のポリオキシエチレン(10)ステアリルエーテルを構成する。

本発明の更に他の実施形態では、イオン化可能な脂質が40Mol%を構成し、構造脂質が20Mol%のDSPCを構成し、ステロールが38.5Mol%のコレステロールを構成し、界面活性剤が1.5Mol%のポリソルベート80を構成する脂質ミックス組成物が開示される。他の実施形態では、イオン化可能な脂質は50Mol%であり、構造脂質は10Mol%のDSPCであり、ステロールは37～40Mol%であり、界面活性剤は約0.5Mol%～2.5Mol%である。本発明の複数の実施形態では、界面活性剤は約2.5Mol%のポリオキシエチレン(10)ステアリルエーテルを構成する。本発明の複数の実施形態では、界面活性剤は約1.5Mol%のポリソルベート80を構成する。本発明の複数の実施形態では、界面活性剤は約0.5Mol%のステアリン酸ポリオキシエチレン(40)を構成する。本発明の複数の実施形態では、界面活性剤は約0.5Mol%のD-α-トコフェロールポリエチレングリコール1000コハク酸エステルを構成する。

本発明の複数の実施形態では、本発明細胞の脂質ミックス組成物はT細胞トランスフェクションにとりわけ適する。

本発明の複数の実施形態では、T細胞をin vitroにおいて処理する方法であって、T細胞を体液から単離する工程、及び前記細胞を本発明の複数の実施形態の脂質ミックス組成物に封入された核酸治療薬と接触させる工程を含む、方法が提供される。

本発明の方法の複数の実施形態では、接触が行われるとき、T細胞は、対数増殖期をちょうど開始するところであるか又は対数増殖期にある。複数の実施形態では、接触は細胞培養の3日目～7日目に行われる。好ましい実施形態では、接触は細胞培養の3日目に行われる。別の実施形態では、接触は細胞培養の7日目に行われる。

本明細書の主題の特色及び利点は、添付の図面において例証される選択された実施形態の以下の詳細な説明を考慮することによってより明らかになるであろう。理解されるように、開示及び特許請求される主題は、様々な点において変更が可能であり、全ての変更は特許請求の範囲から逸脱しない。したがって、図面及び説明は制限的ではなく事実上例証的であると考えられるべきであり、本主題の全範囲は特許請求の範囲に記載される。

本開示の更なる特色及び利点は、添付の図面と組み合わせて行われる以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

単離T細胞の活性化後の経時的な成長(細胞数)の線形プロットである。活性化7日後に、BOCHD-C3-DMA LNP中細胞500,000個当たり2μgのmRNAの6種類の異なる脂質ミックス組成物を用いて処理し、48時間曝露した生CD4+/CD8+T細胞におけるGFPタンパク質相対発現量を示す棒グラフである。活性化7日後に、MC3 LNP中細胞500,000個当たり2μgのmRNAの5種類の異なる脂質ミックス組成物を用いて処理し、48時間曝露した生CD4+/CD8+T細胞におけるGFPタンパク質相対発現量を示す棒グラフである。 CT10、CT22、及び脂質ミックスA組成物を用いて製剤化したmRNA脂質ナノ粒子(LNP)によって媒介され、ELISAによって遺伝子発現に関して分析した、ネガティブセレクションを受けたT細胞における総GFP発現量を示す棒グラフである。イオン化可能な脂質は3種類全ての組成物においてBOCHD-C3-DMAであった。 20～75歳の男女の異なるドナー由来のmRNA処理T細胞におけるGFP発現量の分布プロットである。データ点の異なる形状及び/又はパターンは異なるドナーを表し、細胞集団のそれぞれは5種類の異なる脂質ミックス組成物、すなわち、脂質ミックスA、CT7、S11、CT10、CT22を用いて試験された。細胞500,000個当たり2μgのmRNAの用量及び10のN/P比のBOCHD-C3-DMA LNP中のmRNAによって媒介された生T細胞におけるGFP相対発現量を示す棒グラフである。同じドナー由来の初代ヒトT細胞を、ネガティブセレクションプロトコル又はポジティブセレクションプロトコルのいずれかを使用して新鮮全血から単離し、三重活性化物質を使用して活性化した。活性化7日後に3種類の異なる脂質ミックス組成物のmRNA LNPを用いて48時間処理した生初代ヒトT細胞のフローサイトメトリーによって測定したある特定の特徴を有する細胞集団を示すヒストグラムである。上から下へ、ヒストグラムは、CD8+単離物由来の細胞(大きな水玉模様)、CD4+単離物由来の細胞(淡い横縞)、汎T単離CD8+細胞のみ(より小さな水玉模様)、汎T単離CD4+細胞のみ(濃い横縞)、汎T単離物由来の全てのT細胞(濃い灰色)、及び最終的に未処理の細胞(薄い半透明の灰色)のGFP発現量を表す。イオン化可能な脂質はBOCHD-C3-DMAであった。 LNAP処理生CD4+/CD8+T細胞に由来するGFPタンパク質相対発現量を示す棒グラフである。第1の棒で示されるDOPE LNAPは構造脂質DOPEをDSPCの代わりに含有し、第2の棒で示されるDSPC LNAP(CT22)は構造脂質としてDSPCを有する。両方の脂質ミックス組成物は、IL、構造脂質、コレステロール、及びポリソルベート80の割合の点では脂質ミックスCT22に対応する。 2つの異なるモル比のDSPCを含有する4種類の異なる組成物によって活性化され、トランスフェクトされたT細胞におけるGFP発現量を示す棒グラフである。 2つの棒グラフであり、1つ目は、活性化7日後に細胞500,000個当たり2μgのmRNAを用いて48時間超処理した生CD4+/CD8+T細胞におけるGFPタンパク質相対発現量を示し、イオン化可能な脂質はBOCHD-C3-DMA、DODMA、KC2、又はMC3のうちの1つであった。2つ目は、細胞125,000個当たり500ngのLNAPの、イオン化可能な脂質としてBOCHD-C2-DMA又はC12-200のいずれかを用いるCT10組成物を使用した、生存率(黒色棒)及びGFP発現量(灰色棒)によって測定した単離ヒトT細胞のLNP媒介トランスフェクションのグラフ図である。 40Mol%のイオン化可能な脂質、20Mol%のDSPC、40-xMol%のコレステロール、及びxMol%の安定剤を含み、ここでx=0.5、1.5、又は2.5Mol%である脂質ミックス組成物の結果を示す一連の棒グラフであり、A(i)及び(ii)で示される棒グラフは、安定剤Brij S10を用いた、単離初代ヒトT細胞におけるeGFPをコードするmRNA LNPのトランスフェクション効率(i)及びMFI(ii)であり、棒グラフB(i)及び(ii)は、安定剤Brij S20を用いたトランスフェクション効率(i)及びMFI ii)であり、棒グラフC(i)及び(ii)は、安定剤Tween80を用いたトランスフェクション効率(i)及びMFI(ii)であり、棒グラフD(i)及び(ii)は、安定剤TPGS-1000(D-α-トコフェロールポリエチレングリコール1000コハク酸エステル)を用いたトランスフェクション効率(i)及びMFI(ii)である。活性化7日後にx軸に示される脂質ミックス組成物で構成されるN/P 10のmRNA LNPを用いて処理したCD4+/CD8+T細胞の生存率を示す棒グラフであり、生細胞は生/死染色FVS570を使用するフローサイトメトリーによって決定される。イオン化可能な脂質は3種類全ての組成物においてBOCHD-C3-DMAであった。 3種類の測定、すなわち、BOCHD-C3-DMA又はMC3のいずれかをイオン化可能な脂質として用いてT細胞増大を開始した後3日目又は7日目のいずれかにT細胞をCT10 LNAPに曝露した後の、GFP+live(生) 汎T細胞%、GFP MFI、及びT細胞生存率を示す一連の棒グラフである。 CT10組成物においてBOCHD-C3をイオン化可能な脂質として使用した、活性化後3日目にLNAPに曝露された15名の異なるドナー由来の生存汎T細胞におけるGFP発現%のグラフ図である。 CT10組成物においてBOCHD-C3(黒色棒)又はMC3(灰色棒)をイオン化可能な脂質として使用した、7日目にLNAPに曝露された6名の異なるドナー由来の生存汎T細胞におけるGFP発現%のグラフ図である。 5つの条件下、すなわち、新鮮T細胞、3日目に処理した凍結T細胞、及び4日目に処理した凍結T細胞、3日目に静止及び処理した凍結T細胞、及び4日目に静止及び処理した凍結T細胞における、CT10組成物を用いたILを含有するN/P 8のmRNA-LNPによって媒介された単離初代ヒトT細胞におけるトランスフェクション効率及びGFP発現量を例証する2つの棒グラフである。 CT10組成物におけるBOCHD-C3-DMAをILとして含有する4～12のN/PのmRNA-LNPを用いてトランスフェクトされた、単離初代ヒトT細胞におけるGFP発現量を示す一連の折れ線グラフである。T細胞に、活性化3日後又は7日後のいずれかに、細胞125,000個当たり125ng又は500ngの封入mRNAを含有するmRNA-LNPを投与した48時間後にフローサイトメトリーによって測定したトランスフェクション効率、生存率、及びGFP MFI。 T細胞の活性化3日後の、CT10組成物を用いた脂質BOCHDを含有するN/P 8の様々な用量のmRNA-LNPによって媒介された単離初代ヒトT細胞におけるGFP発現量のグラフ図である。 CT10 LNAPの添加後2、4、7、又は14日目にフローサイトメトリーによって測定した生存T細胞のGFP%及びGFP MFIを示す1組の棒グラフである。 CT10脂質組成物を含むmRNA脂質ナノ粒子(LNP)によって媒介され、処理の48時間後に分析した、ネガティブセレクションを受けたT細胞における総EPO発現量を示す棒グラフである。T細胞を細胞質EPOのために回収及び溶解し、培地上清を分泌されたEPOのために試料採取した。イオン化可能な脂質は試験組成物においてBOCHD-C3-DMA又はDLin-MC3-DMAであり、対照は未処理T細胞及びELISAキットの製造業者によって提供された血清対照であった(Quantikine(登録商標)IVDヒトEpo ELISA、及びQuantikine(登録商標)ヒト血清対照)。 CT10、CT22、及び脂質ミックスA組成物を含むmRNA LNPによって媒介され、処理の48時間後に分析した、ネガティブセレクションを受けたT細胞における総組換えヒトエリスロポエチン(EPO)発現量を示す棒グラフである。T細胞を細胞質EPOのために回収及び溶解し、培地上清を分泌されたEPOのために試料採取した。イオン化可能な脂質は3種類全ての組成物においてBOCHD-C3-DMAであった。細胞125,000個当たり125ngの封入mRNAを用いた三重活性化3日後のLNP添加の12、24、及び48時間後にフローサイトメトリーによって測定したトランスフェクション効率及びMFIを示す、CT10組成物を用いた脂質BOCHD-C3-DMAを含有するN/P 8のmRNA-LNPによって媒介された単離初代ヒトT細胞におけるCD19 CAR発現量のグラフ表示である。 CT10又はCT14組成物を用いた脂質BOCHDを含有するN/P 8のmRNA-LNPによって媒介された単離初代ヒトT細胞におけるCD19 CAR発現量を示す一連の棒グラフである。活性化3日後に細胞125,000個当たり125ng又は500ngの封入mRNAを含有するmRNA-LNPを投与したT細胞におけるトランスフェクション効率及びMFI。抗CD19-h(BB)-eGFP-第2世代CAR(T7 Mut)遺伝子カセットを含有するpcDNA3.1クローニングベクターを示す特注のCARプラスミドの遺伝子構造を示す図である。プラスミドマップを、SnapGene(登録商標)Viewer 4.1.9を使用して作成した。このプラスミドは、in vitro転写のために直線化され、ヒトT細胞において発現する抗CD19-h(BB)-eGFP-第2世代キメラ抗原受容体(CAR)をコードする特注のmRNAを生成するためにキャップされる。

本発明は、脂質ミックス組成物と、核酸治療薬及び他のオリゴマー、例えばペプチドの脂質ミックス組成物を生成することにおけるその使用と、これらの脂質ミックスを使用し、結果として脂質ミックス組成物を得て、トランスフェクション耐性細胞型を克服するための方法とを提供する。

別の態様では、本発明の脂質ミックス組成物は、核酸治療薬と混合して、より伝統的な脂質ミックス組成物又は脂質核酸粒子、例えばLipofectamine(商標)又はTransfectamine(商標)トランスフェクション剤等の市販の脂質ミックスから作製される脂質ミックス組成物又は脂質核酸粒子よりも低い毒性を有する、核酸の標的細胞又は組織への送達を増強する脂質核酸粒子を作出するために提供される。

別の態様では、本発明は、イオン化可能な脂質、1種又は複数種の構造脂質、コレステロール、及び特定の界面活性剤を含む脂質ミックス組成物を提供する。

別の態様では、本発明の脂質ミックス組成物は、中枢神経系の疾患の処置、又は細胞初期化、又はヒトT細胞のex vivo形質転換のための核酸及びペプチド治療薬を製剤化するために提供される。

「脂質」とは、脂肪酸誘導体若しくはステロールであるか、又はリピドイド(lipidoid)(例えばC12-200)のような脂質様物質であってもよい、水に不溶であるが多くの有機溶媒に可溶であることを特徴とする有機化合物の構造的に多様な群を指す。

「脂質粒子」。本発明は、上に記載した脂質ミックス組成物から製造される脂質粒子を提供する。脂質粒子とは、脂質ミックス組成物と治療剤との物理的組織体を表す。脂質ナノ粒子(「LNP」)とは、部分的又は完全に組織化した小さな脂質粒子である。脂質核酸粒子又はLNAPとは全体として、脂質、核酸、コレステロール、及び安定化剤の球状集合体である。要素の正及び負電荷、比、並びに親水性及び疎水性は、成分の配向及びLNAP寸法の点における脂質粒子の物理的構造を決定する。脂質粒子の構造的組織化は、リポソームと同様の最小二重層を有する水性内部を生じ得る⁶か、又は固体核酸脂質ナノ粒子と同様の固体内部を有し得る⁷。単一又は複数の形態のリン脂質単層又は二重層が存在し得る⁸。LNAPは、核酸の包含が明記されるため、脂質粒子又はLNPの亜群である。

本明細書で使用する場合、「N/P」とは、イオン化可能な脂質のアミン基のモルの核酸のリン酸基のモルに対する比である。本発明の複数の実施形態では、N/P比は4～12であり、最も好ましい比はN/P 8～10である。一実施形態では、N/P比は10である。好ましい実施形態では、N/P比は8である。

「脂質ミックス組成物」とは、成分の種類、成分の比、及び総成分の核酸ペイロードに対する比を指す。例えば、40Mol%のイオン化可能な脂質、20Mol%の構造脂質、17Mol%のステロール、及び2.5Mol%の界面活性剤の脂質ミックス組成物は1つの脂質ミックス組成物であり得る。核酸成分はこの脂質ミックス組成物と会合して、予め計画された比、例えばN/P 4、N/P 6、N/P 8、N/P 10、N/P 12、又は別の妥当な特定のN/P比のイオン化可能な脂質アミン(N)対核酸リン酸比(P)の脂質核酸粒子又はLNPを形成する。

in vitroの細胞に言及する場合、「生存率」とは、細胞型又は組織培養系においては通常である、成長し続ける能力、分裂する能力、並びに成長及び分裂し続ける能力を意味する。細胞生存率は厳しい条件又は処理によって影響を受ける。細胞生存率はex vivo療法又は非経口投与において極めて重要である。

「イオン化可能な脂質」。脂質粒子はイオン化可能な脂質を含む。本明細書で使用する場合、「イオン化可能な脂質」という用語は、カチオン性であるか、又はpHが脂質のイオン性基のpKa未満に低下する場合にイオン化(プロトン化)するが、より高いpH値ではより中性である脂質を指す。pKa未満のpH値において、脂質はその場合負に帯電した核酸(例えばオリゴヌクレオチド)と会合することができる。本明細書で使用する場合、「イオン化可能な脂質」という用語には、pH減少時に正電荷を帯びる双性イオン性脂質、及び選択的pH、例えば生理的pHにおいて正味の正電荷を保有する任意のいくつかの脂質種が含まれる。そのような脂質としては、これらに限定されないが、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC);1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアミノプロパン(DODAP)、N-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA);N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB);N-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTAP);3-(N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール(DC-Chol)、及びN-(1,2-ジミリストイルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)が挙げられる。

他の好ましい実施形態では、イオン化可能な脂質はアミノ脂質である。本発明の好ましい実施形態では、イオン化可能な脂質は1,17-ビス(2-オクチルシクロプロピル)ヘプタデカン-9-イル4-(ジメチルアミノ)ブタノエート塩酸塩(「BOCHD-C3-DMA」)である。この化合物は米国特許出願公開第2013323269号明細書に開示されている。他の好ましい実施形態では、イオン化可能な脂質はヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-(ジメチルアミノ)ブタノエート(DLin-MC3-DMA又は「MC3」)である。他の好ましい実施形態では、イオン化可能な脂質は2,2-ジリノレイル-4-(2-ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA又は「KC2」)である。他の好ましい実施形態では、イオン化可能な脂質は(1,1'-((2-(4-(2-((2-(ビス(2-ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)(2-ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)ピペラジン-1-イル)エチル)アザンジイル)ビス(ドデカン-2-オール))又は「C12-200」である。

他の実施形態では、本発明の脂質ナノ粒子における使用に好適なカチオン性脂質としては、これらに限定されないが、DLenDMA;98N12-5;reLNP;米国特許出願公開第20120295832号明細書に記載されているKL22、CCBeneとも呼ばれるHGT5001;全てBall, Rらによって国際公開第2020047061号及び同第2013/14910号、並びにDerosa, Frankらによって米国特許第10507183号明細書に開示されているHGT4003、HGT5000、HGT5001、HGT5002;米国特許出願公開第20180333366号明細書において言及されているリピドイド、Payneらによって米国特許第10399937号明細書に記載されているATX-002;米国特許第10,383,952号明細書に記載されているATX-57、ATX-58、ATX-81、ATX-88、米国特許出願公開第2019292130号明細書に記載されている2-(1,2-ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)ヒドラジニル)-N,N-ジメチルエタン-1-アミン)、4-(ジメチルアミノ)-N',N'-ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)ブタンヒドラジド、2-(ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)アミノ)エチル4-(ジメチルアミノ)ブタノエート、2-(ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)アミノ)エチル、及び4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ブタノエートが挙げられる。

本発明に有用な他の好適なアミノ脂質としては、国際公開第2009/096558号に記載されているものも挙げられる。代表的なアミノ脂質としては、1,2-ジリノレイオキシ-3-(ジメチルアミノ)アセトキシプロパン(DLin-DAC)、1,2-ジリノレイオキシ-3-モルホリノプロパン(DLin-MA)、1,2-ジリノレオイル-3-ジメチルアミノプロパン(DLinDAP)、1,2-ジリノレイルチオ-3-ジメチルアミノプロパン(DLin-S-DMA)、1-リノレオイル-2-リノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン(DLin-2-DMAP)、1,2-ジリノレイルオキシ-3-トリメチルアミノプロパンクロリド塩(DLin-TMA・Cl)、1,2-ジリノレオイル-3-トリメチルアミノプロパンクロリド塩(DLin-TAP・Cl)、1,2-ジリノレイルオキシ-3-(N-メチルピペラジノ)プロパン(DLin-MPZ)、3-(N,N-ジリノレイルアミノ)-1,2-プロパンジオール(DLinAP)、3-(N,N-ジオレイルアミノ)-1,2-プロパンジオ(DOAP)、1,2-ジリノレイルオキソ-3-(2-N,N-ジメチルアミノ)エトキシプロパン(DLin-EG-DMA)、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-DMA)、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパン(DLin-DMA)、及び1,2-ジオレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン(DODMA)が挙げられる。

更に他の実施形態では、米国特許出願公開第20180000953号明細書においてAlmarsson, Orn及びLawlor, Ciaran Patrickによって言及されているイオン化可能な脂質、例えば、3-(ジドデシルアミノ)-N1,N1,4-トリドデシル-1-ピペラジンエタンアミン(KL10)、14,25-ジトリデシル-15,18,21,24-テトラアザ-オクタトリアコンタン(KL25)、2-(⁹オキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,2Z)--オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-1-アミン(Octyl-CLin DMA)、(2R)-2-(⁹オキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z-,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-1-アミン(Octyl-CLinDMA(2R))、及び(2S)-2-(⁹オキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,1-2Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-1-アミン(Octyl-CLinDMA(2S))が用いられる。

イオン化可能な脂質は組成物の複数の実施形態に存在し、本発明の脂質粒子は好ましくは約35～約55Mol%、又はより好ましくは40～約50Mol%の量を含む。

構造脂質は「ヘルパー脂質」又は「中性脂質」としても公知である。本発明の組成物及び脂質粒子は、組成物の約10～20Mol%の1種又は複数種の構造脂質を含む。好適な構造脂質は粒子の形成を支持すると考えられる。構造脂質は、生理的pHにおいてアニオン性、非荷電、又は中性双性イオン性形態のいずれかで存在するいくつかの脂質種のうちのいずれか1つを指す。代表的な構造脂質としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルグリセロール、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン、及びセレブロシドが挙げられる。

例示的な構造脂質としては、双性イオン性脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(POPE)、及びジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート(DOPE-mal)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル-ホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、16-O-モノメチルPE、16-O-ジメチルPE、18-1-trans PE、1-ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(SOPE)、及び1,2-ジエライドイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(trans DOPE)が挙げられる。好ましい実施形態では、構造脂質はジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)である。

別の実施形態では、構造脂質は生理的pHにおいて負に帯電している任意の脂質である。これらの脂質としては、ホスファチジルグリセロール、例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(POPG)、カルジオリピン、ホスファチジルイノシトール、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、及び中性脂質に結合する他のアニオン性修飾基が挙げられる。他の好適な構造脂質としては、糖脂質(例えばモノシアロガングリオシドGM₁)が挙げられる。

安定化剤は、完全には理解されていない他の作用の間での混合物の一体性を保証するために脂質ミックス組成物及び脂質核酸実施形態に含まれる。安定化剤とは、分子間の疎水性-親水性相互作用を破壊するか又はそれを形成するのに役立つ分子のクラスである。安定化剤の例としては、ポリソルベート(Tween)、及びポリソルベートとマルトシドとを含む安定化脂質組合せ、アルキルポリグリコシド、ソルビタンエステル(Span)、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポロキサマー、及びPEGコンジュゲート脂質が挙げられる。本発明の複数の実施形態の好ましい安定化脂質としては、ポリオキシエチレン(10)ステアリルエーテルとしても公知のBrij(商標)S10、ポリオキシエチレン(20)ステアリルエーテルとしても公知のBrij(商標)S20、ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテルとしても公知のBrij(商標)L23、直線化学式:(C₂H₄O)_nC₁₂H₂₆O、CAS番号:9002-92-0のBrij(商標)35;ポリオキシエチレン(4)ラウリルエーテルとしても公知のBrij(商標)L4、ポリソルベート80又はポリソルベート80としても公知のTween(登録商標)80、及びステアリン酸ポリオキシエチレン(40)としても公知のMyrj52が挙げられる。好適な安定化剤としては、ポリソルベート80(Tween80としても公知、IUPAC名2-[2-[3,4-ビス(2-ヒドロキシエトキシ)オキソラン-2-イル]-2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エチルオクタデカ-9-エノエート)、Myrj52(ステアリン酸ポリオキシエチレン(40)、CAS番号:9004-99-3)、Brij(商標)S10(ポリオキシエチレン(10)ステアリルエーテル、CAS番号:9005-00-9)、Brij(商標)S20、(ポリオキシエチレン(20)ステアリルエーテル、CAS番号:9005-00-9)、Brij(商標)35(ポリオキシエチレンモノラウリルエーテル、CAS[9002-92-0])、Brij(商標)L4(ポリエチレングリコールドデシルエーテル、ポリオキシエチレン(4)ラウリルエーテル、CAS番号9002-92-0)、及びTPGS-1000(D-α-トコフェロールポリエチレングリコール1000コハク酸エステル、CAS番号:9002-96-4)が挙げられる。安定化剤は混合し、組み合わせて使用してもよい。

一部の実施形態では、界面活性剤は脂質混合物全体の約0.1～5Mol%を構成する。一部の実施形態では、界面活性剤は脂質混合物全体の約0.1～3Mol%を構成する。一部の実施形態では、界面活性剤は脂質混合物全体の約0.5～2.5Mol%を構成する。一部の実施形態では、界面活性剤は、約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4,1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等である。

ステロールは好ましい脂質ミックス組成物に含まれ、脂質ミックス組成物から作製される脂質粒子はステロール、例えばコレステロール及びフィトステロールを含む。本発明の脂質ミックスにおいて、コレステロールは、一部の実施形態では、最終脂質ミックスの約30～50Mol%存在する。好ましくは、コレステロールは最終脂質ミックスの約35～41Mol%存在する。コレステロールは、様々な好ましい実施形態では、約29.5、39.5、38.5、及び37.5Mol%存在する。ステロールには、コレステロールファミリーと構造的に関連する分子、すなわち天然又は合成起源の類似体が含まれる。修飾された植物ステロール及び天然に存在する植物ステロールはコレステロールの代わりに効率的に使用され得る。Patel Sidharthらは、LNPを使用して細胞株におけるmRNA送達を増強する、一部の天然に存在するステロールを記載している⁶。

ペプチド。本発明の脂質ミックス組成物及び脂質粒子はペプチドの全身又は局所送達に関して有用である。本明細書で使用する場合、「治療ペプチド」という用語には、細胞への送達が望ましい効果を引き起こす任意のアミノ酸鎖が含まれることが意図される。ペプチドとは、2～50アミノ酸長のアミノ酸の短い鎖であり、多くの場合三次及び/又は四次構造を有するより長い鎖(50アミノ酸以上)を有するタンパク質とは異なる。ペプチドにおけるアミノ酸はペプチド結合と呼ばれる結合によって互いに一列に接続されている。一部の実施形態では、単数又は複数のペプチドが核酸と共に封入される。

核酸。本発明の脂質ミックス組成物及び脂質粒子は核酸の全身又は局所送達に関して有用である。本明細書で使用する場合、「核酸治療薬」(NAT)という用語には、細胞への送達が望ましい効果を引き起こす任意のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが含まれることが意図される。最大50ヌクレオチドを含有する断片は全体としてオリゴヌクレオチドと称され、より長い断片はポリヌクレオチドと呼ばれる。特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは8～50ヌクレオチド長である。本発明の複数の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、メッセンジャーRNAの場合と同様に996～4500ヌクレオチド長である。本発明の他の実施形態では、メッセンジャーRNAは自己増幅mRNAである。現在、NATはますます多くの前臨床及び臨床研究において活発に探究されている。これらのNATとしては、多様な疾患、例えば、癌、感染性疾患、遺伝子障害、及び神経変性疾患を標的とする遺伝子療法のためのデオキシリボ核酸、相補的デオキシリボ核酸、完全な遺伝子、リボ核酸、オリゴヌクレオチド、及びリボザイムが挙げられる。NATはOnpattro(商標)パチシラン(patisirin)において臨床的有用性を示している。自己増幅mRNa並びに他のmRNA(WT及び塩基修飾)は感染性疾患のためのワクチン(COVID-19のためのmRNA-1273、チクングニアのためのmRNA1944)、まれな疾患のためのワクチン(メチルマロン酸血症のためのmRNA-3704)として評価されている。

本明細書に記載されるように、核酸治療薬(NAT)は脂質粒子の形成中に脂質粒子に組み込まれる。この点において、2種類以上の核酸治療薬が組み込まれてもよい。「LNAP」とは、脂質ナノ粒子中のNATを指す。

本発明の脂質粒子に存在する核酸としては、公知の任意の形態の核酸が挙げられる。本明細書で使用する核酸は、一本鎖DNA若しくはRNA、又は二本鎖DNA若しくはRNA、又はDNA-RNAハイブリッドであり得る。二本鎖DNAの例としては、構造遺伝子、制御及び終結領域を含む遺伝子、並びにウイルス又はプラスミドDNA等の自己複製系が挙げられる。二本鎖RNAの例としては、siRNA及び他のRNA干渉試薬が挙げられる。一本鎖核酸としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、CRISPR-Cas9 gRNAを含むガイドRNA、リボザイム、マイクロRNA、mRNA、及び三重鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。2種類以上の核酸、例えばmRNAとガイドRNAとが一緒に、又はそれぞれの異なる型が脂質粒子に組み込まれてもよい。

プラスミドDNAは本発明の複数の実施形態において配合される好ましい核酸である。プラスミドとは、細胞において染色体DNAから分離しており、独立して複製することができるDNA分子である。プラスミドは1000ヌクレオチド未満～数万ヌクレオチドのサイズに及ぶ。最も一般的な形態は小さな環状二本鎖DNAである。プラスミドは治療目的のために合成して哺乳動物細胞に送達することができる。合成プラスミドは、分子クローニングにおけるベクターとして使用され、宿主生物内において組換えDNA配列の複製を駆動する役割を果たす。プラスミドは、電気穿孔法等の物理的な方法、又は脂質粒子増強トランスフェクションを介する本発明におけるような化学的手段を使用する形質転換を介して細胞に導入することができる。本発明のこれらの脂質ミックス組成物は物理的技法に対するいくつかの利点、例えば、i)細胞及び組織系における高い生体適合性及び低い毒性、ii)製造の相対的容易性、iii)親油性マトリックスはポリマー系において観察される侵食現象の影響を受けにくい、iv)免疫系からの不可視性に起因するin vivoにおける増加した循環半減期、を有する。

したがって、一実施形態では、核酸治療薬(NAT)は、プラスミド、又は環状核酸構築物、又は直鎖状DNAである。一実施形態では、NATはmRNA又は自己増幅mRNAである。

場合によっては、核酸は、リガンドに特異的に結合する遺伝子操作された受容体、例えば組換え受容体、及び代謝経路に関与する分子、又はそれらの機能的部分をコードする。或いは、代謝経路に関与する分子は外来性実体を含む組換え分子である。遺伝子操作された受容体及び代謝経路に関与する分子は、1つの核酸又は2つ以上の異なる核酸によってコードされ得る。一部の例では、第1の核酸がリガンドに特異的に結合する遺伝子操作された受容体をコードし、第2の核酸が代謝経路に関与する分子をコードしてもよい。

核酸は、同じプロモーターから複数の別個のペプチド鎖を共発現するように構造化されてもよい。転写物は、2つ以上の最終産物、例えば2つの最終産物をコードする可能性を有し得る。少なくとも1つの核酸は、コードされる分子を、遺伝子操作された受容体及び代謝経路に関与する分子が同じプロモーターの制御下で発現するように分離する内部リボソーム結合部位(IRES)を有し得る。「内部リボソーム進入部位」(IRES)とは、タンパク質合成の一部として、メッセンジャーRNA(mRNA)配列の中間において翻訳開始を可能にするヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、核酸は、2つ以上のペプチド鎖又は他の産物が同じプロモーターと作動可能に連結して発現されるが、別個の鎖として産生され得るように、1つ又は複数のリボソームスキップ配列、例えばピコルナウイルス2Aリボソームスキップペプチドを含む。

状況によっては、単一のプロモーターが、自己切断ペプチド(例えば2A配列)又はプロテアーゼ認識部位(例えばフーリン)をコードする配列によって互いに分離した2つ又は3つの遺伝子を単一のオープンリーディングフレーム(ORF)に含有するRNAの発現を導き得る。

一部の実施形態では、遺伝子操作された受容体若しくは組換え受容体及び/又は代謝経路に関与する組換え分子若しくは操作された分子の発現又は活性は恒常的であり、一部の実施形態では、そのような発現又は活性のうちの1つ又は複数は、条件付きとなるように、例えば1つ又は複数の天然又は非天然事象又は分子によって誘導又は抑制されるように操作される。

一部の実施形態では、受容体及び/又は分子の発現は、構成的プロモーター、エンハンサー、又はトランスアクチベーターの制御下にある。一部の実施形態では、発現は条件付きプロモーター、エンハンサー、又はトランスアクチベーターの制御下にある。

一部の例では、分子又は受容体、全体として分子の発現は、特に、身体の領域、疾患の領域、活性化状態の領域、又は組織の領域において見出されるか又は比較的高いレベルで見出される1つ又は複数の特定の条件、事象、又は分子を条件とする(例えば、誘導性プロモーター又は他のエレメントを介すること等によって誘導又は抑制される)。例えば、一部の例では、プロモーターは、低酸素、低グルコース、又は他の低栄養条件によって誘導可能又は抑制可能であり得る。例えば、Caoら(2001) Gene Ther.、8: 1357～1362頁、及びDachsら(2000) Eur. J. Cancer、36:1649～1660頁、及びGrecoら、(2002) Gene Ther.、9:1403～1411頁を参照のこと。他の発現制御形式では、発現は活性化又は増殖事象によって規制される。例示的な誘導系はNFカッパB、NFAT、又はNur77によって活性化可能な誘導系である。

一部の実施形態では、本明細書に記載される任意のペプチド又は核酸の発現は、細胞を、調節因子、例えば、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、又はその類似体を用いて処理することによって制御され得る。

調節因子の存在下で発現を誘導又は低下する転写調節ドメインの具体例としては、これらに限定されないが、全てClontech Laboratories社、Mountain View、Calif.から入手可能である以下の転写調節因子:Tet-On(商標)転写調節因子、Tet-Off(商標)転写調節因子、及びTet-On(商標)改良型転写調節因子、及びTet-On(商標)3G転写調節因子に見出される転写調節ドメインが挙げられる。

一部の実施形態では、好適なプロモーターとしては、例えば、CMV、RNAポリメラーゼ(pol)IIIプロモーター、例えばこれらに限定されないが、条件付きバリアントを含む、(ヒト及びマウス)U6プロモーター、(ヒト及びマウス)H1プロモーター、並びに(ヒト及びマウス)7SKプロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、例えば別々の種類のRNAポリメラーゼ(pol)IIIプロモーターに由来するエレメントを含有するハイブリッドプロモーターもまた調製することができる。一部の実施形態では、プロモーター配列は、例えば哺乳動物細胞等の真核細胞において機能する限り、天然に存在しないプロモーター配列であってもよい。

「核酸」という用語はまた、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リン酸-糖骨格オリゴヌクレオチド、他のヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びそれらの組合せを指し、適宜、一本鎖、二本鎖であり得るか、又は二本鎖配列と一本鎖配列の両方の部分を含有し得る。メッセンジャーRNAは、修飾されていても修飾されていなくてもよく、塩基修飾されていてもよく、異なる種類のキャップ構造、例えばCap1を含んでもよい。

本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は交換可能に使用され、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合による連結、例えば3'-5'及び2'-5'、反転した連結、例えば3'-3'及び5'-5'、分枝構造、又はヌクレオチド間アナログによって連結した2'-デオキシリボヌクレオチド(DNA)及びリボヌクレオチド(RNA)を含むヌクレオチド単量体の一本鎖及び二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、会合対イオン、例えば、H+、NH4+、トリアルキルアンモニウム、Mg2+、Na+等を有する。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド単独、リボヌクレオチド単独、又はそれらのキメラ混合物から構成され得る。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド間アナログ、核酸塩基アナログ、及び/又は糖アナログで構成されてもよい。

本明細書で使用する場合、「核酸」は、骨格がヌクレオチド又はそのアナログから形成される核酸塩基配列含有ポリマー又はポリマーセグメントである。

本発明の一部の実施形態の脂質粒子は電子顕微鏡検査によって特徴付けることができる。実質的に固体のコアを有する本発明の粒子は、電子顕微鏡検査によって見られるように高電子密度のコアを有する。1つのそのような構造はCullisらによる米国特許第9,758,795号明細書に開示されている。高電子密度は、固体コア粒子の投影面積(2DクライオEM画像において見られる)の内部50%の面積平均電子密度が粒子の周辺の最大電子密度のx%以上(x=20%、40%、60%)となるように定義される。電子密度は、目的の領域の画像強度における、ナノ粒子を含有しない領域の背景強度との差の絶対値として算出される。

本発明の脂質粒子は、溶液中の粒子をサイズ測定するデバイス、例えばMalvern(商標)Zetasizer(商標)を使用してサイズに関して評価することができる。粒子は約15～約300nmの平均粒子直径を有する。一部の実施形態では、平均粒子直径は300nm超である。一部の実施形態では、脂質粒子は、約300nm以下、250nm以下、200nm以下、150nm以下、100nm以下、又は50nm以下の直径を有する。一実施形態では、脂質粒子は約50～約150nmの直径を有する。より小さな粒子は全体として、より大きな粒子と比較して増加したin vivoにおける循環寿命を呈する。一実施形態では、脂質粒子は約15～約50nmの直径を有する。ex vivoでの適用は、in vivoでの適用が必要とするほど小さな粒子を必要としない。

混合すること。本発明の複数の実施形態の脂質粒子は、標準的なT字管混合技法、乱流混合、研和混合、規則的な自己集合を促進する撹拌、又は要素のナノ粒子への自己集合を伴う全ての要素の受動的混合によって調製することができる。遺伝子薬(LNAP)を含有する脂質ナノ粒子(LNP)を製剤化するための多様な方法が開発されている。好適な方法は、例として、Ansell、Mui、及びHopeによる米国特許第5,753,613号明細書、並びにSaravolacらによる米国特許第6,734,171号明細書に開示されている。これらの方法は、予め形成された脂質粒子を核酸治療薬(NAT)とエタノールの存在下において混合する工程、又はエタノールに溶解した脂質を、NATを含有する水性媒体と混合する工程を含む。

マイクロ流体二相液滴技法は、薬物送達のための単分散ポリマー微小粒子を生産するため、又は細胞、タンパク質、若しくは他の生体分子の封入のための大きな小胞を生産するために適用される。制御されたサイズの単分散リポソームを作出するための、試薬の急速な混合を実現する一般的なマイクロ流体技法である流体力学的フローフォーカシングの使用は実証されている。

全般に、パラメータ、例えば、混合時の相対脂質及びNAT濃度、並びに混合速度は、現在の製剤化手順を使用して制御することが困難であり、結果として、調製物内と調製物間の両方において、生産されるNATの特徴にばらつきが生じる。自動マイクロ混合器、例えばNanoAssemblr(商標)機器(Precision NanoSystems Inc社、Vancouver、Canada)は、ナノ医薬(リポソーム、脂質ナノ粒子、及びポリマーナノ粒子)の急速且つ制御された製造を可能にする。NanoAssemblr(商標)機器は、カスタム化又は並列化を用いてナノリットル、マイクロリットル、又はそれ以上の規模においてナノ粒子成分のミリ秒単位での混合を可能にするマイクロ流体混合カートリッジを介したナノ粒子の制御された分子自己集合を遂行する。小規模での急速混合は、より大型の機器では不可能な粒子合成及び品質に対する再現可能な制御を可能にする。

好ましい方法は、形成プロセスに使用される核酸のうちのほぼ100%が1工程で粒子に封入されることを達成するために、NanoAssemblr(商標)Spark(商標)、Ingnite(商標)又はその旧機種であるBenchtop(商標)、及びBlaze(商標)のようなマイクロ流体混合デバイス等の機器を組み込む。一実施形態では、脂質粒子は、形成プロセスに使用される核酸のうちの約90～約100%が粒子に封入されるプロセスによって調製される。

Cullisらによる米国特許第9,758,795号明細書及び同第9,943,846号明細書は、小容量混合技術を使用する方法及びそれによって得られる新規な製剤を記載している。Ramsayらによる米国特許第10,342,760号明細書は、種々の材料を製剤化するための小容量混合技術を使用するより進展した方法及び生成物を記載している。Walshらによる米国特許第10,159,652号明細書は、混合される要素に対して異なる経路及びウェルを備えるマイクロ流体ミキサーを開示している。Wild、Leaver、及びTaylorによる米国特許出願公開第20180111830号明細書は、使い捨て滅菌経路を備えるマイクロ流体ミキサーを開示している。Wild、Leaver、及びTaylorによる米国特許第10,076,730号明細書は、分岐トロイダルマイクロ流体混合幾何及びそのマイクロ混合への適用を開示している。Chang、Klaassen、Leaverらによる米国特許出願公開第2020023358号明細書は、プログラム可能な自動化マイクロミキサー及びそのための混合チップを開示している。Wild及びWeaverによる米国意匠特許発明第771834号明細書、同第771833号明細書、同第772427号明細書、及び同第803416号明細書、並びにChangらによる米国意匠特許発明第800335号明細書、同第800336号明細書、及び同第812242号明細書は、Precision NanoSystems Inc社によって販売されているミキサー機器のためのマイクロチャネル及び混合幾何を有する混合カートリッジを開示している。

本発明の複数の実施形態では、生物学的マイクロ流体混合のためのデバイスが本発明の脂質粒子及び治療脂質ミックス組成物を調製するために使用される。デバイスはマイクロ流体ミキサーに供給する試薬の第1及び第2の流れを備え、脂質粒子は出口から収集されるか、又は他の実施形態では、滅菌環境へ出て行く。

第1の流れは第1の溶媒中に治療剤を含む。好適な第1の溶媒としては、治療剤が可溶であり、第2の溶媒と混和性である溶媒が挙げられる。好適な第1の溶媒としては水性緩衝液が挙げられる。代表的な第1の溶媒としてはクエン酸及び酢酸緩衝液が挙げられる。

第2の流れは第2の溶媒中に脂質ミックス材料を含む。好適な第2の溶媒としては、イオン化可能な脂質が可溶であり、第1の溶媒と混和性である溶媒が挙げられる。好適な第2の溶媒としては、1,4-ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、酸、及びアルコールが挙げられる。代表的な第2の溶媒としては水性エタノール90%又は無水エタノールが挙げられる。

本発明の一実施形態では、好適なデバイスは1つ又は複数のマイクロチャネル(すなわち、1ミリメートル未満の最大寸法を有するチャネル)を備える。一例では、マイクロチャネルは約20～約300μmの直径を有する。複数の例では、マイクロチャネルの少なくとも1つの領域は、米国特許出願公開第20040262223号明細書に記載されているように、主要な流向と、少なくとも1つの溝若しくは突起であって、主要な方向と角度を形成する配向を有する、溝若しくは突起が画定された1つ若しくは複数の表面とを有する(例えばスタッガードヘリンボーンミキサー)か、又は米国特許出願公開第2018093232号明細書に記載されているような分岐トロイダルフローを有する。最大の混合速度を達成するために、混合領域前の過度の流体抵抗を回避することが好都合である。したがって、デバイスの一例は、流体を単一混合チャネルに送達するための1000ミクロン超の寸法を有する非マイクロ流体チャネルを有する。

より自動化されていないマイクロ流体混合法及び機器、例えばZhang, S.ら⁸及びStroock A.ら⁹に開示されているものもまた、本発明の脂質ミックス組成物を作出するのに有用である。T字管混合を伴うより原始的なシステムはJeffs, LBら¹⁰に開示されている。

本発明の脂質粒子はin vitro又はin vivoにおいて治療剤を細胞に送達するために使用され得る。特定の実施形態では、治療剤は、本発明の核酸-脂質粒子を使用して細胞に送達される核酸である。核酸は、siRNA、miRNA、LNA、プラスミド若しくはレプリコン、mRNA、又は単一遺伝子であり得る。他の実施形態では、治療剤は、本発明のペプチド-脂質粒子を使用して細胞に送達されるペプチドである。方法及び脂質ミックス組成物は、そのような処置から恩恵を受け得る任意の疾患又は障害の処置に好適な任意の治療剤の送達に容易に適合することができる。

ある特定の実施形態では、本発明は核酸を細胞に導入する(すなわちトランスフェクション)ための方法を提供する。トランスフェクションとは、分子生物学において、送達される遺伝子の転写、翻訳、及び発現を目的とした細胞外空間から細胞内空間への核酸治療薬(又はNAT)の導入のために一般的に使用されている技法である。トランスフェクション効率は、i)タンパク質定量法、例えば生細胞イメージング(蛍光タンパク質の検出のための)、フローサイトメトリー、若しくはELISAによって測定される、送達された遺伝子の陽性発現を示す細胞の総処理集団における百分率、又はii)処理細胞によって発現されたタンパク質の強度若しくは量、のいずれかとして一般的に定義される。これらの方法は、本発明の粒子又は脂質ミックス組成物を細胞と、細胞内送達が行われるのに十分な期間接触させることによって実行することができる。

典型的な用途としては、siRNAの細胞内送達を実現する周知の手順を使用して、特定の細胞標的をノックダウン又はサイレンシングすることが挙げられる。或いは、用途としては、治療上有用なポリペプチドをコードするDNA又はmRNA配列の送達が挙げられる。このように、欠損しているか又は存在しない遺伝子産物を供給することによる遺伝子疾患のための療法が提供される。本発明の方法は、in vitro、ex vivo、又はin vivoにおいて実施され得る。例えば、本発明の脂質ミックス組成物は、当業者に公知の方法を使用する、核酸の細胞へのin vivoにおける送達のために使用することもできる。別の例では、本発明の脂質ミックス組成物は、核酸の、ex vivoであり、次いで患者に戻される患者細胞の試料への送達のために使用することができる。

本発明の脂質組成物による核酸治療薬の送達を以下に記載する。

in vivo投与の場合、医薬組成物は、好ましくは非経口(例えば、関節内、静脈内、腹腔内、皮下、髄腔内、皮内、気管内、骨内、又は筋肉内)投与される。特定の実施形態では、医薬組成物はボーラス注射によって静脈内、髄腔内、又は腹腔内投与される。他の投与経路としては、局所(皮膚、眼、粘膜)、経口、肺、鼻腔内、舌下、直腸、及び経膣が挙げられる。

ex vivo用途の場合、医薬組成物は、生物から取り出された生体試料に好ましくは投与され、次いで細胞が洗浄されて生物に返される。生物は哺乳動物、特にヒトであり得る。このプロセスは、例えば、細胞初期化、遺伝子修復、免疫療法のために使用される。薬物生成物は改変細胞である。癌免疫用途のための市販されている現在の細胞製剤の例は、B細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病のためのKymriah(商標)、及びB細胞リンパ腫における使用のためのYescarta(商標)である。このex vivo療法はCAR-T療法とも呼ばれており、CD19標的キメラ抗原受容体を有する改変T細胞が患者のCD19提示癌細胞を攻撃する。白血病は小児患者における死亡の主な原因である。CAR-T療法の使用は、患者の癌のない状態への回復に対して革新的であった。

一実施形態では、本発明は、核酸の送達に関していかなるウイルス手段も用いることなく、ヒトT細胞を、キメラ抗原受容体(CAR)コードmRNAを用いて改変して、患者に戻し注入されるCAR-T細胞産物を生産する方法を提供する。非ウイルス性送達は、細胞をプログラミングするためのウイルスよりも安全な、T細胞を調節するための技術であり得る。

関連する実施形態では、本発明は、T細胞受容体を調節して、患者の腫瘍細胞の表面に存在する新抗原を認識及び破壊する方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現を調節する方法を提供する。これらの方法は全体として、細胞を、標的ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現を調節することができる核酸と会合している本発明の脂質粒子と接触させる工程を含む。本明細書で使用する場合、「調節する」という用語は標的ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現を変化させることを指す。調節することは、増加若しくは増強することを意味してもよく、減少若しくは低下することを意味してもよい。

関連する実施形態では、本発明は、対象におけるポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患又は障害を処置する方法であって、対象に本発明の医薬組成物を提供する工程を含み、治療剤が、siRNA、マイクロRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びsiRNA、マイクロRNA、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、siRNA、マイクロRNA、又はアンチセンスRNAが、ポリペプチド又はその補体をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチドを含む、方法を提供する。

関連する実施形態では、本発明は、対象におけるポリペプチドの過小発現を特徴とする疾患又は障害を処置する方法であって、対象に本発明の医薬組成物を提供する工程を含み、治療剤が、mRNA、自己増幅RNA(SAM)、自己複製DNA、又はプラスミドから選択され、過小発現したポリペプチド又はその補体を特異的にコードするか又は発現する核酸治療薬を含む、方法を提供する。

複数の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物の脂質ミックス組成物は、公知であるか又は薬理学的原理に従って以降で詳しく説明される任意の方法によって調製することができる。全般に、そのような調製法は、有効成分を賦形剤及び/又は1種若しくは複数種の他の副成分と会合させる工程を含む。

本開示の医薬組成物は、原体、単数の単一単位用量、及び/又は複数の単一単位用量として調製、包装、及び/又は販売することができる。本明細書で使用する場合、「単位用量」とは、所定の量の有効成分を含む別々の量の医薬組成物を指す。有効成分の量は全体として、対象に投与され得る有効成分の投薬量、及び/又はそのような投薬量の半分若しくは3分の1を含むがこれらに限定されない、そのような投薬量の簡便な分数と等しくてもよい。

別の実施形態では、組成物は、先端医療医薬品(ATMP)又は細胞及び遺伝子療法産物を生産するために使用される。本明細書に記載される組成物は付随物質と考えることができる。

本開示の医薬組成物における有効成分、薬学的に許容される賦形剤、及び/又は任意の追加成分の相対量は、処置される対象の同一性、大きさ、及び/又は状態に応じて、更には組成物が投与される経路に応じて変動し得る。例えば、組成物は0.1パーセント～99パーセント(w/w)の間の有効成分を含み得る。

医薬製剤は薬学的に許容される賦形剤を更に含んでもよく、薬学的に許容される賦形剤としては、本明細書で使用する場合、これらに限定されないが、特定の所望の剤形に適した任意の及び全ての溶媒、分散媒、希釈剤、又は他の液体ビヒクル、分散若しくは懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘若しくは乳化剤、保存剤等が挙げられる。医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤及び組成物を調製するための技法は当技術分野で公知である(Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第21版、A. R. Gennaro、Lippincott, Williams and Wilkins、Baltimore、MD、2006を参照のこと)。

一部の実施形態では、脂質粒子の粒径は増大及び/又は減少し得る。粒径の変化は、生体反応、例えば、これに限定されないが、炎症を抑えるのに役立ち得る場合があるか、又は体内分布を変化させることによって哺乳動物に送達されるNATの生物学的効果を増大する場合がある。サイズは標的組織を決定するために使用することもでき、より大きな粒子は短時間で排出され、より小さな粒子は種々の臓器系に達する。

医薬組成物の製造に使用される薬学的に許容される賦形剤としては、これらに限定されないが、不活性希釈剤、表面活性剤及び/若しくは乳化剤、保存剤、緩衝剤、滑沢剤、並びに/又は油が挙げられる。そのような賦形剤は本発明の医薬製剤に任意選択で含まれ得る。

一部の実施形態では、例示的なプラスミド又は他のNATは、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、1-アンチトリプシン、酸性アルファグルコシダーゼ、アリールスルファターゼA、カルボキシペプチダーゼN、a-ガラクトシダーゼA、アルファ-L-イズロニダーゼ、イズロン酸-2-スルファターゼ、イズロン酸スルファターゼ、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸トランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ-グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミン6-スルファターゼ、N-アセチルガラクトサミン-4-スルファターゼ、ベータ-グルコシダーゼ、ガラクトース-6-硫酸スルファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、ベータ-グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヘパリン-N-スルファターゼ、リソソーム酸性リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)、カルバモイル-リン酸合成酵素1(CPS1)、アルギニノコハク酸合成酵素(ASS1)、アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)、アルギナーゼ1(ARGI)、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子(CFTR)、生存運動ニューロン(SMN)、第VIII因子、第IX因子、メガヌクレアーゼ、例えば、TALEN、Cas9、及び自己複製RNAのメガヌクレアーゼ、並びに低密度リポタンパク質受容体(LDLR)から選択されるタンパク質又は酵素をコードする。

他のプラスミド又は核酸は、研究又はスクリーニングプラットフォームの文脈において本発明を使用して細胞に基づく系に適用することができる。これらには、例えば人工多能性幹細胞の生成のための初期化のプロセスにおいて細胞の特定の生理学的又は機能的変化を誘導することを目的とした遺伝子材料の導入が含まれる。この場合、特定の遺伝子(山中因子として公知)が患者由来体細胞に導入され、細胞の幹細胞様状態への逆転を惹起する。これらの遺伝子は、細胞が無期限に分裂し、多能性になる(多くの他の下流細胞型に分化することができる)ことを可能にし、細胞は研究用途と臨床用途の両方のために使用することができる。これらの及び類似した遺伝子処理工程は、本発明の脂質粒子によって増強されて、人工幹細胞を用いて作業する場合に一般的に使用されるプロセスの効率を改善することができる。

好ましい実施形態では、核酸は二本鎖デオキシリボ核酸から構成されるプラスミドである。プラスミドは、染色体とは独立して複製することができる、細胞の細胞質(伝統的な細胞の遺伝子的特徴が存在する核ではない)に存在する遺伝子構造体であり、典型的には小さな環状DNA鎖である。これは、細胞の遺伝子機能を処理するための治療選択肢として使用される合成哺乳動物遺伝子構築物である。プラスミドは、医学研究のための新規な細胞又は動物モデルを作出するために使用することもできる。プラスミドは、i)処理及び単離の容易性、ii)規模を拡大した製造のための自己複製する能力、iii)長期安定性、iv)多様な生物及び用途における機能性のために、分子生物学において及び新興治療薬として重要なツールである。操作されたプラスミドは、複製起点に加えて(又は所期の使用に応じて存在しない)、環を切断して新たな遺伝子材料及び抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーを導入することを可能にする制限酵素認識部位を有し得る。プラスミドは約1000塩基対(bp)～約20キロ塩基対(kbp)であり得る。

本明細書で使用する場合、「約」という用語は、記載される数プラス又はマイナス10%を意味すると定義される。この用語は、所望の標的濃度が例えば40Mol%であり得るが、混合の不一致性により、実際の百分率は+/-5Mol%異なり得ることを示すために使用される。

本明細書で使用する場合、「実質的に」という用語は、記載される数プラス又はマイナス5%であると定義される。この用語は、所望の標的濃度が例えば40Mol%であり得るが、測定又は混合の不一致性により、実際の百分率は+/-5Mol%異なり得ることを示すために使用される。

本明細書で使用する場合、「核酸」という用語は、疾患の診断、治療、軽減、処置、若しくは予防において直接的な効果を有すること、又は生理機能を回復させること、正すこと、若しくは修正することにおいて直接的な効果を有すること、又は研究試薬として作用することが意図されている物質として定義される。好ましい実施形態では、核酸はオリゴヌクレオチドである。好ましい実施形態では、治療剤は核酸治療薬、例えばRNAポリヌクレオチドである。好ましい実施形態では、治療剤は二本鎖環状DNA(プラスミド)である。

本明細書で使用する場合、「試薬」という用語は、それが細胞、組織、又は臓器の生物学的効果に対して直接的な影響を与えるという事実によって定義される。試薬としては、これらに限定されないが、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、多糖、無機イオン、及び放射性核種が挙げられる。核酸試薬の例としては、これらに限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロRNA、mRNA、リボザイム、tRNA、tracrRNA、sgRNA、snRNA、siRNA、shRNA、ncRNA、miRNA、mRNA、予め凝縮されたDNA、pDNA、又はアプタマーが挙げられる。核酸試薬は、遺伝子をサイレンシングするため(例えばsiRNAを用いて)、遺伝子を発現させるため(例えばmRNAを用いて)、ゲノムを編集するため(例えばCRISPR/Cas9を用いて)、及び細胞を、それが由来する生物に戻すために初期化するため(例えば癌療法のための免疫細胞を初期化するex vivo細胞療法)に使用される。ATMP(先端医療医薬品)の付随物質は試薬と考えることができる。

本開示では、「含む(comprising)」という語は、非限定的な意味において使用され、その語に続く項目が含まれるが具体的に言及されていない項目が排除されるものではないことを意味する。明記される特色又は変数若しくはパラメータを含むか又は含み得る複数の実施形態において、代替的な実施形態がそのような特色又は変数若しくはパラメータからなっても、それから本質的になってもよいことは理解されるであろう。不定冠詞「a」による要素への言及は、ただ1つの要素のみが存在するということを文脈が明確に要求していない限り、2つ以上の要素が存在する可能性を排除しない。

本開示では、端点による数値範囲の記載には、全ての自然数、全ての整数、及び全ての分数の中間値を含む、その範囲内に包含される全ての数が含まれる(例えば、1～5には、1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、及び5等が含まれる)。本開示では、単数形の「1つの(an)」及び「その(the)」は、内容上別段の指示が明確にない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「化合物(a compound)」を含有する組成物への言及には、2種以上の化合物の混合物が含まれる。本開示では、「又は」という用語は全体として、内容上別段の指示が明確にない限り、「及び/又は」を含む意味において用いられる。

T細胞又はTリンパ球とは、細胞媒介免疫において主要な役割を有するリンパ球亜型である。T細胞は、細胞表面のT細胞受容体の存在によって他の白血球(例えばB細胞又はナチュラルキラー細胞)と区別することができる。T細胞の主な種類としては、ヘルパー(CD4+)、細胞傷害性(CD8+)、メモリー、及び制御性T細胞が挙げられる。

T細胞培養に関連する対数増殖期とは、例えば、活性化後およそ5日目又は6日目の、細胞が急速な増大を受ける時間を意味する。対数期は細胞数の突然の増加により観察することができ、この急速な増大は、T細胞処理のためのLNPを調製し始める時点として使用することができる。本発明の複数の実施形態では、T細胞は種々の方法において活性化させることができる。抗CD3/CD28/CD2抗体を使用する三重活性化法が以下に例示されるが、二重活性化もまた本発明者らの研究では効果的であった。二重活性化は抗CD3/CD28抗体を使用して実施される。現在の臨床的に使用されているプロトコルは二重活性化プロトコルを用いている。

T細胞は、場合によっては人工多能性幹細胞(IPSC)¹¹又は胚性幹細胞(ESC)¹²から分化した細胞に由来してもよい。

本発明の方法による形質転換のためのT細胞の調製には、1つ又は複数の培養及び/又は調製工程が含まれる。T細胞は通例、哺乳動物対象に由来する生体組織(例えば末梢血又は動脈血)から単離される。一部の実施形態では、細胞が単離される対象は、細胞療法を必要とするか又は細胞療法が投与され得る疾患又は状態を有する。

細胞は、一部の実施形態では、初代細胞、例えば初代ヒト細胞である。組織源としては、血液、組織、リンパ、及び対象から直接得られる他の組織源、並びに1つ又は複数の加工工程、例えば、分離、遠心分離、洗浄、及び/又はインキュベーションの結果として得られる試料が挙げられる。

T細胞が由来する組織源は、血液若しくは血液由来組織源、又はアフェレーシス若しくは白血球除去産物であり得る。例示的な組織源としては、全血、末梢血単核細胞(PBMC)、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、リンパ節、脾臓、又は他のリンパ組織が挙げられる。細胞は、一部の実施形態では、療法を必要とする最終的な対象と異なる種から取得される。

細胞の単離は、より多くの調製又は親和性に基づかない細胞分離を含み得る。場合によっては、細胞は、例えばある特定の成分を除去又は濃縮するために、1種又は複数種の試薬の存在下で洗浄、遠心分離、及び/又はインキュベートされる。

場合によっては、対象の循環血液由来の細胞はアフェレーシス又は白血球除去によって取得される。血液細胞は血漿画分を除去するために洗浄してもよく、適切な緩衝液又は培地がその後の加工工程のために使用される。一部の実施形態では、細胞はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて洗浄される。一部の態様では、洗浄工程は製造業者の説明書に従った接線流濾過(TFF)によって実施される(例えばSpectrum社のKrosflo、GE社のAkta Flux)。一部の実施形態では、細胞は洗浄後に、例えばCa⁺⁺/Mg⁺⁺不含PBS等の多様な生体適合性緩衝液に再懸濁される。

T細胞を組織源から分離することは、赤血球を溶解することと、Percoll(商標)又はFicoll(商標)勾配による遠心分離とによる末梢血からの白血球の調製を含む密度に基づく細胞分離法を伴い得る。他の方法としては、細胞における1つ又は複数の特異的表面マーカーの発現又は存在に基づく種々の細胞型の分離が挙げられる。

T細胞の特定の亜集団、例えば1つ又は複数の表面マーカーに関して陽性であるか又は高レベルに発現している細胞、例えば、CD28⁺、CD62L⁺、CCR7⁺、CD27⁺、CD127⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD45RA⁺、及び/又はCD45RO⁺T細胞は、ポジティブ又はネガティブセレクション技法によって単離することができる。一例として、CD3⁺、CD28⁺T細胞は、CD3/CD28コンジュゲート磁気ビーズ(例えば、DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)を使用してポジティブセレクションすることができる。CD4⁺又はCD8⁺選択工程は、CD4⁺ヘルパー及びCD8⁺細胞傷害性T細胞を分離するために使用することができる。メモリーT細胞はCD8⁺末梢血リンパ球のCD62L⁺サブセットとCD62L^-サブセットの両方に存在する。或いは、CD4⁺ヘルパー細胞のための選択が行われてもよい。場合によっては、ナイーブCD4⁺Tリンパ球は、CD45RO^-、CD45RA⁺、CD62L⁺、CD4⁺T細胞である。他の場合では、セントラルメモリーCD4⁺細胞はCD62L⁺且つCD45RO⁺である。更に他の場合では、エフェクターCD4⁺細胞はCD62L^-且つCD45ROである。

細胞集団は親和性磁気分離技法を使用して単離することもできる。分離される細胞は、磁気応答性粒子又は微小粒子、例えば常磁性ビーズ(例えばDYNABEADS(商標)(Clontech社)又はMACS(商標)(Miltenyi社)ビーズ)と共にインキュベートされる。磁気応答性材料は、分離することが所望される1個の細胞、複数の細胞、又は細胞の集団に存在する表面マーカーに特異的に結合する結合パートナーに接着する。

T細胞は、選好性に応じてポジティブ又はネガティブセレクション法によって組織源から単離され得る。どちらのためのキットも、例えばVancouver、CanadaのStemCell Technologies社から入手可能である。

治療目的の場合、単離又は分離は、T細胞を形質転換するために必要とされる単離、細胞調製、分離、加工、インキュベーションのうちの1つ又は複数を実行する装置を使用して実行される。一部の態様では、システムはこれらの工程のそれぞれを閉鎖又は滅菌環境において実行するために使用される。一例では、システムは米国特許出願公開第20110003380号明細書に記載されているシステムである。分離及び/又は他の工程はCliniMACSシステム(Miltenyi Biotec社)を使用して遂行され得る。例えば、Klebanoffら(2012) J Immunother. 35(9): 651～660頁、Terakuraら(2012) Blood. 1:72～82頁、及びWangら(2012) J Immunother. 35(9):689～701頁を参照のこと。所望の細胞集団は、複数の細胞表面マーカーに関して染色された細胞が流体の流れで輸送されるフローサイトメトリーを介して収集及び濃縮することができる。他の方法としては、FACS又はFACSに基づく検出システムと組み合わせた微小電気機械システム(MEMS)が挙げられる(例えば国際公開第2010/033140号を参照のこと)。

T細胞インキュベーション及び処理は、培養容器、例えば、チャンバー、ウェル、カラム、チューブ、チューブセット、バルブ、バイアル、培養皿、バッグ、タンク、又は培養物のため若しくは細胞を培養するための他の容器において実行され得る。刺激条件又は刺激剤には、1種又は複数種の薬剤、例えばTCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができるリガンドが含まれる。インキュベーションはRiddellらの米国特許第6,040,177号明細書に記載されているように実行され得る。T細胞培養は、非分裂末梢血単核細胞(PBMC)を添加し(例えば、結果として得られる細胞の集団が、増大される初期集団における各Tリンパ球に対して少なくとも約5、10、20、又は40個以上のPBMCフィーダー細胞を含有するように)、培養をインキュベートすることによって増大させることができる。

T細胞刺激条件には、ヒトTリンパ球の成長に好適な温度、例えば摂氏25～37度が含まれる。任意選択で、インキュベーションは、フィーダー細胞としての非分裂EBV形質転換リンパ芽球細胞(LCL)の支持集団を、初期T細胞に対して10～1の比で更に含んでもよい。

本発明は、本発明の範囲を限定するのではなく本発明を例証するために与えられる以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。

方法
ヒト全血由来の初代T細胞の単離及び増大
別段の指摘がない限り、全ての試薬はSTEMCELL Technologies社、Vancouver、Canadaから購入した。また、別段の指摘がない限り、全ての生物学的製剤はヒト由来又はヒト特異的である。

凍結乾燥ヒトIL-2(「IL-2」)(Peprotech Inc.社、Montreal、Canada)を生物学的安全キャビネットにおいて、カルシウムもマグネシウムも含有しない滅菌1倍PBS中で0.1mg/mlの濃度に再構成した。50μlのこのIL-2を50mLのImmunoCult-XF(商標)T細胞増大培地に添加して、T細胞のための培地を生成した。7～30mLのヒト末梢全血をACDA抗凝固薬と共に、生物学的安全キャビネットにおいて50mL滅菌ポリプロピレンコニカルチューブに入れた。

T細胞を、EasySep(商標)ヒトT細胞直接単離キットを使用して血液試料から単離した。初めに50μl/mLのIsolation Cocktail(商標)、次いで50μl/mLのEasySep(商標)RapidSpheres(商標)を血液のチューブに添加し、穏やかに混合し、室温(RT)で5分間インキュベートした。チューブをEasySep(商標)50Magnet(商標)装置に入れ、RTで10分間インキュベートした。濃縮細胞懸濁液を新たな50mL滅菌ポリプロピレンチューブにピペットを用いて移し、RapidSpheres(商標)プロセスを繰り返した。

この二重濃縮細胞懸濁液を新たな50mL滅菌ポリプロピレンコニカルチューブにピペットを用いて移し、300g、RTで10分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを10mLのPBSに再懸濁し、300gで10分間再遠心して、あらゆる残りの上清を細胞から洗い落とした。上清を再び除去し、細胞を予め加温した完全T細胞培地に再懸濁した。試料を採取し、細胞生存率に関するトリパンブルー排除試験を実施した(Thermo Fisher社)。

ネガティブセレクションプロトコル後のT細胞の活性化
血液を健康なヒトドナーから採取し、抗凝固薬のACDAと組み合わせた。汎T細胞ネガティブセレクションキットであるEasySep(商標)ヒトT細胞直接単離キットを使用して、CD4+T細胞とCD8+T細胞の両方を単離した。細胞を、IL-2を補充したImmunoCult-XF(商標)T細胞増大培地に維持した。単離の当日、細胞を、三重活性化物質であるImmunoCult(商標)Human CD3/CD28/CD2 T Cell Activatorを用いて活性化した。

ポジティブセレクションプロトコル後のT細胞の活性化
血液を健康なヒトドナーから採取し、抗凝固薬のACDAと組み合わせた。PBMC懸濁液を、Lymphoprep(商標)密度勾配遠心分離を使用して調製した。次いで、T細胞を、EasySep(商標)ヒトCD3ポジティブセレクションキットIIを使用してPBMC懸濁液からポジティブセレクションした。細胞はIL-2を発現した。単離の当日、細胞を、三重活性化物質であるImmunoCult(商標)Human CD3/CD28/CD2 T Cell Activatorを用いて活性化した。

T細胞の凍結及び解凍
健康なヒトドナーから採取した血液を抗凝固薬のACDAと組み合わせた。汎T細胞ネガティブセレクションキットであるEasySep(商標)ヒトT細胞直接単離キットを使用して、CD4+T細胞とCD8+T細胞の両方を単離した。細胞を、CryoStor(登録商標)CS10を使用して凍結保存し、液体窒素中で保管した。解凍時に、細胞を、ヒト組換えIL2(Peprotech社)を補充したImmunoCult-XF(商標)T細胞増大培地に維持した。解凍の当日、細胞を、以下の実施例に示すように二重又は三重活性化物質のいずれかを用いて活性化した。

T細胞の活性化/増大の詳細
T細胞懸濁液を完全T細胞培地(ThermoFisher社)において10⁶細胞/mlに希釈し、細胞を、T細胞培地1mL当たり25μlのImmunoCult(商標)Human CD3/CD28 (dual) T Cell Activator(商標)又はImmunocult(商標)Human CD3/CD28/CD2 (triple) T Cell Activator(商標)のいずれかを添加することによって活性化した。細胞成長を、拡大下での毎日の細胞計数によってモニタリングした。細胞を、完全T細胞培地を用いて希釈して、約10⁶細胞/mLの濃度を維持した。約5、6、又は7日目に、T細胞は対数増殖期に入り、急速な増大が生じた。図1は10日にわたるT細胞増大応答を例証する。

T細胞が対数期にあることを確認するために、CD25発現量を測定し、これは、フローサイトメトリー(BD Biosciences社)によって評価する場合、80%超でなければならず、細胞の増大は、図1のようにT細胞の総数を経時的にグラフで示すことによってモニタリングすることもできる。

脂質核酸粒子(LNAP)を形成するための核酸治療薬(NAT)の脂質ナノ粒子(LNP)へのマイクロ流体混合
脂質ミックス組成物溶液を、個々の脂質原料からの処方された量の脂質(Table 1(表1)を参照のこと)をエタノール中で組み合わせることによって、エタノール中で調製した。脂質は、Avanti Polar Lipids社若しくはSigma社のいずれかから購入したか、又は受託合成した。脂質ミックスの成分は以下の通りであった。

1,17-ビス(2-オクチルシクロプロピル)ヘプタデカン-9-イル4-(ジメチルアミノ)ブタノエート塩酸塩(又は1,17-ビス(2-オクチルシクロプロピル)ヘプタデカン-9-イル4-(ジメチルアミノ)ブタノエート)(BOCHD-C3-DMA)、中性脂質DOPE、コレステロール、及び安定化剤Myrj52(ステアリン酸ポリオキシエチレン(40))は脂質ミックスAの成分であった。DODMAは、脂質ミックスA-DODMAのためにBOCHD-C3-DMAの代わりに使用され、DLin-Mc3-DMAは脂質ミックスA-MC3のために、DLin-KC2-DMAは脂質ミックスA-KC2のために使用された。全ての組成物における中性脂質、コレステロール、及び安定化剤の比をTable 1(表1)に記載し、場合によっては、0～0.1Mol%のDiD標識を、調製後の脂質粒子特性解析のために組成物に添加した。この混合物は以下で言及される脂質ミックス溶液である。

イオン化可能な脂質に関して、ナノ粒子製剤緩衝液のpHは典型的には脂質のpKa未満である。製剤化されると、ナノ粒子は任意の生理学的に妥当な緩衝液、例えば、PBS、デキストロース等に懸濁することができる。

以下に記載されるメッセンジャーRNA又はプラスミド核酸治療薬(NAT)を、酢酸ナトリウム緩衝液を使用して必要とされる濃度に希釈した。次いで、脂質核酸粒子(LNAP)試料を、NanoAssemblr(登録商標)Spark機器を使用して両方の流体を流すことによって調製した。簡潔に述べると、総容量32μLの100mM酢酸ナトリウム緩衝液中10～20μgの核酸を16μLの37.5mM脂質ミックス溶液と、N/P比(例証される実施例では4、6、8、10、又は12)による要求に応じて混合した。機器において作製したマイクロ流体混合脂質核酸粒子(LNAP)を、水性出口ウェルにおいてpH7.4の48μLのCa++及びMg++不含1倍PBSを用いて直ちに希釈した。これらのLNAPを、pH7.4の96μLの同じ緩衝液を含有するマイクロ遠心チューブに直ちに収集した。封入効率を修正Ribogreen(商標)アッセイ(Quanti-iT RiboGreen(商標)RNAアッセイキット、Fisher社)によって測定した。この情報を使用して、所望の投薬量を確立した。

以下の実験に使用した核酸治療薬モデル試薬は、Trilink Cleancap eGFP mRNA:Cat. L-7601(Trilink Biotechnologies社、San Diego、CA)、Trilink Cleancap EPO mRNA:Cat. L-7209(Trilink Biotechnologies社)、Millipore Sigma TagRFP Simplicon RNAキット:Cat. SCR712(TagRFP RNAとB18R RNAの両方を含有する)(Millipore Sigma社、Canada、Oakville Ontario)、EGFPレポーターを有するCD19 CARプラスミドであり、EGFPレポーターを有するCD19 CARプラスミドは、Creative Biolabs社(Shirley、NY)から購入し、pcDNA内にT7プロモーター(Mut)-シグナルペプチド-scFv-CD8ヒンジ膜貫通-4-1BB-CD3ゼータ-T2A-eGFPレポーター遺伝子CARカセット(2353bp)を含有する。この特注のCD19 CARプラスミドDNA鋳型の総サイズはおよそ7649～7661bpである(図26を参照のこと)。

CD19 scFv-hをコードする未修飾CARメッセンジャーRNA(mRNA)転写物(BB±-eGFPレポーター遺伝子カセット)を、野生型塩基を用いるin vitro転写によって合成し、Trilink Biotechnologies Inc社によるCleanCap(登録商標)AG法を使用してキャップした(Cap1)。この未修飾CAR mRNA転写物を酵素によりポリアデニル化し、続いてDNase及びホスファターゼ処理を行った。最終mRNA転写産物をシリカ膜により精製し、1mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.4)の溶液に1mg/mLの濃度で包装した。この特注のCD19 CARプラスミドベクター及びCD19 CARコードmRNAは、それぞれCreative Biolab社及びTrilink Biotechnologies Inc社から購入した。

「IL」はイオン化可能な脂質である。明記されていない場合、イオン化可能な脂質はBOCHD-C3-DMAである。図面の説明に示されているか又は指摘されている他の場合では、イオン化可能な脂質は実施例及び図面に示されているDODMA、DLin-Mc3-DMA、又はDLin-KC2-DMAである。

脂質ベースの製剤はまた、試験のためにより大型のNanoAssemblr(登録商標)Benchtop(後に、改良された特色を有するが同等の容量の「Ignite」として発売された)を使用して製造した。簡潔に述べると、350μLの1mg/mL mRNA又はpDNAを、100mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4)を使用して、12、10、8、6、又は4のN/P比に応じて0.05～0.3mg/mLの必要とされる濃度に希釈した。次いで、脂質ナノ粒子試料を、両方の流体、すなわち水性溶媒中の核酸とエタノール中の脂質ミックスとを3:1の流量比及び12ml/分の総流速で流すことによって調製した。マイクロ流体デバイスにおける混合後、カートリッジ通過後の脂質核酸粒子試料を、pH7.4の3～40容量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液を含有するRNAse不含チューブに希釈した。エタノールを、Amicon(商標)遠心フィルター(Millipore社、USA)を3000RPMで使用するか又はTFFシステムを使用して最終的に除去した。必要とされる濃度を達成したら、脂質核酸粒子を、200μmフィルターを無菌状態において使用して濾過滅菌した。最終封入効率を修正Ribogreen(商標)アッセイによって測定した。

脂質粒子を上に記載したように作製した後、粒径(粒子の流体力学的直径)を、ZetaSizer Nano ZS(商標)(Malvern Instruments社、UK)を使用する動的光散乱法(DLS)によって決定した。633nmの波長のHe/Neレーザーを光源として使用した。データを、後方散乱検出モードにおいて行った散乱強度データから測定した(測定角=173)。測定値は、試料1つ当たりそれぞれ2サイクルを10回実行した平均であった。Z平均サイズを粒径として報告し、調和強度平均粒子直径と定義した。粒径測定は、多角度動的光散乱法を使用するZetasizer Ultra(Malvern Instruments社、UK)を使用しても行った。

本出願に記載した様々な脂質ミックスに関する核酸封入の結果をTable 2(表2)に示す。観察された粒子属性は全体として、mRNA又はSARNAに関しては68～122nm、プラスミドに関しては73～153nmの範囲であった。全ての製剤において良好な封入が存在し、サイズのばらつき又は多分散性(PDI)は0.3未満であった。

別段の記述がない限り、全ての試薬はStemCell Technologies社製であった。T細胞を、ネガティブセレクション単離手順(EasySep(商標)ヒトT細胞単離キット)を使用してヒト末梢全血から単離した。T細胞活性化及び増大を、組換えヒトIL-2(Peprotech Inc.社、Rocky Hill USA)を補充したImmunoCult(商標)ヒトT細胞増大培地においてImmunocult(商標)Human CD3/CD28/CD2 Activatorを使用して実行した。典型的なT細胞成長曲線の表示を図1に提供する。T細胞は典型的には活性化の48～96時間後に対数増殖期に入り、対数増殖期は24～72時間の急速な増殖及び代謝活性の期間を特徴とし、その後、細胞が静止状態に戻り始めると成長曲線は定常に達する。図1に示すように、T細胞は、対数増殖期前若しくは対数増殖期中(3日目)、又は対数増殖期後(7日目)に脂質核酸に曝露され得る。

本発明者らは、標準的な脂質ミックスA(別段の記述がない限り、全てBOCHD-C3-DMAをILとして含有した)に対する新たな脂質ミックスの組成物を、T細胞三重活性化プロトコル(汎T細胞を、抗CD3/CD28/CD2抗体を含む三つ組活性化物質を用いて活性化した)を使用して、LNP媒介mRNA送達及び発現に関してin vitroにおいて試験した。

LNP製剤化EGFP mRNA(Trilink Biotechnologies社、San Diego、CA)を、1μg/mLの組換えヒトApoE4(「ApoE」)(Peprotech Inc.社)を含有する1mLの完全T細胞培地において500,000個のT細胞に添加した。

所望の用量のmRNAを達成するために必要とされるLNAPの容量を、修正Ribogreen(商標)アッセイによって決定した封入mRNAの濃度に基づいて算出した。T細胞を、トリパンブルー(Sigma社)排除により計数して、500,000細胞/mLに希釈した。簡潔に述べると、12ウェルプレートにおいて、1mLを各ウェルに分注した。ApoEを各ウェルに1ug/mLの最終濃度まで添加した。工程1における算出に基づいて、必要量のmRNA LNP、この場合は2μgを添加し、プレートを48時間インキュベートした。

種々の脂質ミックス組成物を、T細胞において発現したGFPの幾何平均蛍光強度(フローサイトメトリーによって測定される)によって測定されるトランスフェクションを誘導する能力に関して試験した。図2は、イオン化可能な脂質BOCHD-C3-DMAを使用したN/P比10の種々のLNP組成物、すなわち、S10、S11、CT10、CT7、及びCT22組成物(Table 1(表1)に詳述)の、脂質ミックスAと比較して増加した効果を示す。図3は、GFP陽性生CD4+/CD8+T細胞%に対する、イオン化可能な脂質MC3を使用したN/P比10の種々のLNP組成物、すなわち、CT7、S11、CT10、及びCT22の効果を示す。脂質ミックスCT7、S11、CT10、及びCT22は、脂質ミックスAよりも高いレベルのトランスフェクションをもたらした。

GFP発現量をピコグラム単位で定量的に測定した場合の結果を図4に示す。CT10及びCT22は脂質ミックスAよりもはるかに良好に機能する。

20～75歳の男女数名のヒトドナー由来のT細胞に対する脂質ミックスA、S11、CT7、CT10、及びCT22製剤の相対的効果を比較して、対象間のばらつきを検査した。図5は、異なるドナー由来のmRNA処理T細胞におけるGFP発現量の分布プロットである。脂質ミックス組成物への曝露を活性化後7日目、すなわち対数増殖期の終了直前又は直後に行った。試験した製剤全体にわたって、固有のドナーによるばらつきが製剤成績に影響を与えるようであったが、1つの脂質ミックスにおいて低い成績を有するドナーは、全体として、全ての脂質ミックスにわたって低下した成績を有した。全ての組成物、すなわち、CT7、S11、CT10、及びCT22は、全てのドナーにわたって脂質ミックスAと比較して良好な成績を有した。一部の製剤、例えばCT10又はCT22は、高トランスフェクション効率を一貫して達成する能力においてより堅実なようであった。

以下のTable 3(表3)は、種々の脂質ミックス組成物の幾何平均蛍光強度(MFI)を示す。MFIはおそらくGFP発現細胞%よりも的確な測定法である。以下に示すMFIは、送達されたmRNAによって産生されたeGFPのレベルを記載する。7日目に脂質ミックスA LNAP及びLM02 LNAPを用いてトランスフェクトされた三重活性化T細胞は、低いMFIスコアをもたらし、トランスフェクション及び発現における思わしくない結果を示した。S10を用いてトランスフェクトされた三重活性化T細胞は6のMFIスコアを示した。最良の脂質ミックス組成物は、S11、CT7、CT10、及びCT22であり、全て10のスコアであった。データは、TPGS1000、Brij S10、及びTween80等の安定化剤を使用して作製したLNAPが安定化剤Myrj52、又は更には業界標準のPEG-DMG-2Kよりも驚くほど高いeGFPタンパク質を誘導したことを示す。

MC3とBOCHD-C3-DMAの両方の結果は同等であった。結果は抗CD3/CD28抗体を使用する二重活性化プロトコルを使用して得た結果と一致した。

T細胞トランスフェクションに対するネガティブ及びポジティブセレクションプロトコルの効果
T細胞を上の方法に記載したネガティブセレクションプロトコル又はポジティブセレクションプロトコルのいずれかによって加工し、7日目に、細胞500,000個当たり2μgのmRNAの用量のN/P10のmRNAを配合するCT10、CT22、及びS11脂質ミックス組成物を用いて処理した。T細胞を処理の48時間後にフローサイトメトリーによって遺伝子発現に関して分析した。本発明者らは、LNAPトランスフェクションの成功がT細胞単離プロセスの影響を実質的に受けないことを見出したが、ネガティブセレクションを使用することにおけるわずかな利点を観察した(図6)。

処理T細胞の下流加工及びフローサイトメトリーを用いた分析
T細胞の3種類の単離物を単一ドナーから得て、3つの群:汎T細胞(全てT細胞)、CD4+T細胞単独、及びCD8+T細胞単独に分けた。脂質粒子mRNA曝露の48時間後、処理T細胞を、細胞懸濁液を予め標識した1.5mLチューブに移すことによって回収し、300×g、摂氏4度で10分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットをPBSに再懸濁した。0.5ulの量のBD Horizon(商標)Fixable Viability Stain 575V(商標)(BD Biosciences社)を添加し、混合物を暗所にてRTで10分間インキュベートした。細胞を以前のように再び遠心分離し、次いで1mLの染色緩衝液(BSA、BD Pharminigen社)を用いて2回洗浄し、洗浄ペレットを100μlのBSA中に入れた。以下の抗体を各チューブの処理細胞に2μlの容量において添加した:抗CD25、抗CD8、抗CD4、(PerCP-Cy5.5マウス抗ヒトCD25、BV786マウス抗ヒトCD8クローンRPA-T8、及びAPC-Cy(商標)7マウス抗ヒトCD4クローンSK3、全てBD Pharmingen社製)。補正目的のために、GFPのみの試料及び生存率対照では抗体を添加せず、単一染色補正チューブでは1種類のみの抗体を添加した。

チューブを摂氏4度で30分間インキュベートし、その後400μlの染色緩衝液(BSA)を添加し、細胞を再び遠心分離した。細胞を、1mLの染色緩衝液を用いて1回洗浄し、工程1と同様に再び遠心沈降した。細胞ペレットを1mLの染色緩衝液に再懸濁し、セルストレーナーキャップを備える予め標識したフローチューブ(Corning Falcon社)に添加した。

T細胞集団のヒストグラム分析を以下のように作成した。フローサイトメトリーを生初代ヒトT細胞に関して実施した。図7に例証されるように、上から下へ、ヒストグラムは、CD8+単離物由来の細胞、CD4+単離物由来の細胞、汎T単離CD8+細胞のみ、汎T単離CD4+細胞のみ、汎T単離物由来の全てのT細胞、及び未処理細胞のGFP発現量を表す。左のレーンは脂質ミックスAを使用したGFP発現量を示し、中央のレーンは脂質ミックスCT7を使用したGFP発現量を示し、一番右のレーンは脂質ミックスS11を使用したGFP発現量を示す。全てのLNP組成物はイオン化可能な脂質(IL)としてBOCHD-C3-DMAを含有した。各集団のゲーティングのために、細胞を初めに前方及び側方散乱によってゲーティングし、続いてダブレットの排除を行い、Fixable Viability Stain 570(BD Biosciences社)の使用により生細胞のみを考慮した。細胞を、CD4及びCD8抗体を用いて染色し、各亜集団のゲーティングを可能にした。図7は、様々な表示の処理T細胞が上昇し一貫したGFP発現量を示す一方で、未処理細胞が中立であることを示す。

活性はT細胞に関して的確な脂質ミックス組成物に依存する-構造脂質
研究を行って、種々の成分の脂質ミックス組成物を試験した。概略を述べると、T細胞を、ネガティブセレクション手順を使用してヒト末梢血細胞から単離した。単離の当日、細胞を、三重活性化物質を用いて活性化した。図8は、活性化7日後に細胞500,000個当たり2μgのmRNAの用量のBOCHD-C3-DMA中eGFP mRNA(N/P 10)LNPを用いて48時間処理した生 CD4+/CD8+T細胞におけるGFPタンパク質相対発現量を示す棒グラフである。脂質ミックスCT22成分比を使用したが、構造脂質はDOPE又はDSPCのいずれかであった。

種々の細胞型(例えばニューロン)におけるより早期の研究は、構造脂質としてのDOPEに対する選好を示した。しかしながら、本発明者らは、T細胞トランスフェクションに関しては構造脂質DSPCがDOPEよりも良好であったことを見出した。Table 4(表4)は、トランスフェクション効率を図8に例証した脂質ミックス組成物の成分及び比を記載する。

活性はT細胞に関して的確な脂質ミックス組成物に依存する-比
トランスフェクトされたT細胞におけるGFP発現量を上述の実施例4と同様にアッセイした。図9は、10Mol%(S11、CT7)又は20Mol%(CT10、CT22)のいずれかのDSPCを含有する4種類の異なる脂質ミックス組成物に関する、活性化され、トランスフェクトされたT細胞におけるGFP発現量を示す棒グラフである。試験組成物において20Mol%のDSPCは10%比のDSPCよりも有意に良好であり、GFP発現の量において20～30パーセントの差が2つの比の間で見られた。

選択された成分に関する別の面の重要性を図10に例証する。上段の棒グラフに例証されるように、イオン化可能な脂質の同一性は脂質ミックス組成物の活性に対して効果を有しないことが示された。MC-3、KC2、及びBOCHD-C3-DMAの間でイオン化可能な脂質の同一性を変化させる一方で、同じ比及び材料を組み合わせた。これらのイオン化可能な脂質は、T細胞にトランスフェクトする脂質ミックス組成物の活性に影響を及ぼすことなく、互いに代用することができた。

実際、下段の棒グラフに示すように、イオン化可能な脂質としてのリピドイドC12-200は、CT10脂質ミックス組成物において投与した場合、生存率、GFP発現T細胞%、及びGFP MFIの点でBOCHD-C3-DMAと類似した結果をもたらした。

結論として、これらの条件下では、構造脂質の選択はトランスフェクション効率(GFP+%)に影響を及ぼしたが、イオン化可能な脂質の選択は影響を及ぼさないようであった。このことは、イオン化可能な脂質と対照的な、活性に対する主要な影響因子としてのLNP組成物における特定の構造脂質の驚くべき影響を示す。

活性はT細胞に関して的確な脂質ミックス組成物に依存する-安定化脂質
初代T細胞のヒト全血からの単離及び活性化/増大を上述の一般的手順と同様に実施した。単離T細胞を活性化3日後に配合したmRNAに曝露し、T細胞成長曲線において、この時点は対数増殖期直前又は対数増殖期に対応する。LNPに封入した125ngの用量のCleanCap(商標)EGFP(Trilink Biotechnologies社、San Diego、CA)mRNA(下記の詳細を参照のこと)を1μg/mLの組換えヒトApoE4(「ApoE」)(Peprotech Inc.社、Montreal、Canada)を含有する0.25mLの完全T細胞培地において約125,000個のT細胞に添加した。

T細胞処理のために必要とされるLNPの容量をRibogreen(商標)アッセイ結果に基づいて算出した。T細胞をトリパンブルー(Sigma社)排除により計数し、500,000細胞/mLに希釈した。簡潔に述べると、48ウェルプレートにおいて、0.25mLを各ウェルに分注した。ApoEを各ウェルに1ug/mLの最終濃度まで添加した。容量算出に基づいて、必要量のmRNA LNPを添加し、プレートを48時間インキュベートした。

脂質ミックス組成物を、フローサイトメトリーを使用してeGFPの幾何平均蛍光強度を測定して、トランスフェクションを誘導する能力に関して試験した。様々な条件下における単離初代ヒトT細胞におけるeGFPをコードするmRNA LNPのトランスフェクション効率(i)及び平均蛍光強度(ii)を図11A(i)～D(ii)に示す。脂質ミックス組成物を、イオン化可能な脂質40Mol%、DSPC 20Mol%、コレステロール40-xMol%、安定剤xMol%と定義し、ここでx=0.5、1.5、又は2.5Mol%である。

図11のグラフA～Dにおいて変化させた安定剤の同一性は以下の通りであった:図A(i)及び(ii)は安定剤Brij S10を用いて得たデータであり、B(i)及び(ii)は安定剤Brij S20を用いて得たデータであり、C(i)及び(ii)は安定剤Tween80を用いて得たデータであり、D(i)及び(ii)は安定剤TPGS-1000を用いて得たデータである。全ての場合に使用したイオン化可能な脂質はBOCHD-C3-DMAである。T細胞は、0日目に単離し三重活性化物質を使用して活性化し、3日目に配合したmRNAに曝露し、5日目にフローサイトメトリーのために回収した。

対数増殖期の開始時に対応する活性化3日後に細胞をmRNA LNPに曝露することが、試験した全ての組成物に関して80%超のトランスフェクション効率をもたらしたことが見出された。使用した各安定剤に関して、脂質ミックス組成物における安定剤のMol%が、MFIによって示されるように、総eGFP発現量に影響を与えたこともまた見出された。各安定剤に関して、最大のeGFP発現量を誘導したMol%を以下の名称:脂質ミックスCT10、脂質ミックスCT34、脂質ミックスCT22、及び脂質ミックスCT14と共に示す。

MFIによって測定されたように、Brij S10に関しては1.5Mol%が最良の比であり、Tween80に関しては1.5Mol%が最良の比であった。Brij S20に関しては0.5Mol%が最良の比であり、TPGS-1000に関しては0.5Mol%が最良の比であった。

種々の鎖長を有する非イオン性界面活性剤の試験は、ex vivoでのT細胞送達に関して、より短いポリオキシエチレン鎖がより良好であることを示す。

細胞生存率に対する脂質組成物の効果
T細胞を感受性の対数期中に核酸含有脂質組成物ミックスを用いて処理することによって発揮されるT細胞生存率に対する効果を検討した。以前の実施例と同様に活性化したT細胞を対数増殖期中に処理した。処理後のT細胞生存率を図12の棒グラフに示す。脂質ミックスA、S10、S11、CT10、CT7、及びCT22は、「無処理」対照と比較して、T細胞生存率に対する負の効果を有しなかった。示していない別個の研究において、本発明者らは、Transfectamine(商標)実験試薬が同等の用量においてこれらの細胞に対してより毒性であったことを見出した。

したがって、T細胞増大中に処理することが可能であり、増殖の喪失は存在しない。

GFP mRNA LNPを用いた活性化T細胞の処理-トランスフェクションに対するT細胞活性化状態の効果
CT10組成物における脂質BOCHD-C3-DMA又はMC3を含有するN/P 10のmRNA-LNPによって媒介された、上に記載した方法に従って調製した単離初代ヒトT細胞におけるGFP発現量をアッセイした。トランスフェクション効率及び幾何平均蛍光強度(MFI)をLNAP添加の48時間後にフローサイトメトリーによって測定した。T細胞に、活性化3又は7日後のいずれかに、細胞125,000個当たり125又は500ngの封入mRNA LNPを投与し、GFPアッセイの結果を図13に示す。アッセイは、2つの投薬量並びに2種類の異なるイオン化可能な脂質(BOCHD-C3-DMA及びMC3)における、CT10組成物LNAPの活性化期前又は後のT細胞にトランスフェクトする能力を実証する。生T細胞におけるGFPパーセント及びGFP MFIを示し、これらは3日目のLNP添加の方がわずかに高い。T細胞の生存率は、3及び6つ目の棒グラフ(生存率)において、処理に関わらず高いままであることに留意されたい。

異なるドナーにわたって維持される活性
15名の異なるドナーから単離したT細胞はCT10媒介eGFP mRNAを用いた処理後にGFPを発現することができた。図14に示すこの研究の結果は、多くのドナーのT細胞にトランスフェクトすることにおける一貫した成功を実証する。更に別の研究では、業界標準のMC3を6名の異なる患者においてBOCHD-C3-DMAと比較した。図15に示すように、ドナー間のばらつきという点から見て、2種類の異なるイオン化可能な脂質の間に実質的な差は存在しないようであった。このことは、一貫した結果がヒト患者において予期され得ることを意味する。

組成物に関するT細胞トランスフェクション能に対する凍結保存の効果、及び方法の最適化
CT10組成物を用いたBOCHD-C3-DMAを含有するN/P 8のmRNA-LNPによって媒介された単離初代ヒトT細胞におけるGFP発現量を図16に示す。トランスフェクション効率、生存率、及びGFP MFIをLNP添加の48時間後にフローサイトメトリーによって測定した。T細胞を、ネガティブ単離手順(EasySep(商標)ヒトT細胞単離キット、Stemcell Technologies社)を使用して全血から単離した。単離したT細胞の一部分をImmunocultヒトT細胞増大培地に直ちに入れ、Immunocult(商標)Human CD3/CD28/CD2 Activator(Stemcell社)を使用して活性化した。細胞のこの部分に関して、LNPに封入した125ngのmRNAを活性化3日後に、ウェル1つ当たり125,000個の細胞に添加した。その間に、単離したT細胞の他の部分を液体窒素において凍結保存した。凍結保存したT細胞を解凍し、ImmunoCult(商標)Human CD3/CD28/CD2 Activatorを使用して直ちに活性化したか、又はImmunoCult T細胞増大培地に24時間静止させた後に活性化した。T細胞に、活性化3又は4日後のいずれかに、細胞125,000個当たり125ngの封入mRNAを含有するmRNA-LNPを投与した。図16に示すように、凍結保存後のT細胞トランスフェクションの効率において実質的な低下は存在しない。予め凍結保存したT細胞では、活性化後3日目ではなく4日目に処理することによる改善が存在する。

N/P比の効果
CT10組成物を用いたBOCHDを含有するN/P 4～12のmRNA-LNPによって媒介された単離初代ヒトT細胞におけるトランスフェクション効率、生存率、及びGFP MFIを、LNP添加の48時間後にフローサイトメトリーによって測定した。簡潔に述べると、初代ヒトT細胞を、ネガティブセレクションプロトコルを使用して新鮮全血から単離し、三重活性化物質を使用して活性化した。T細胞に、活性化3日後又は7日後のいずれかに、細胞125,000個当たり125ng又は500ngの封入mRNAを含有するmRNA-LNPを投与した。試験の結果を図17に示す。MFIはN/Pが8以上である全ての場合に増加する。トランスフェクション効率もまたN/P 8以上において増加した。

発現の用量応答及び持続時間
T細胞を単離し、上の方法に記載した三重活性化プロトコルを使用して活性化した。活性化3日後にT細胞に曝露した様々な用量のmRNA-LNPによって媒介されたGFP発現量を図18に示す。LNAPはCT10組成物と共にイオン化可能な脂質としてBOCHD-C3-DMAを含有し、mRNAはN/P 8において配合した。試験された最低用量の封入mRNA、すなわち細胞500,000個当たり62.5ngのmRNAでさえ80%のGFP+細胞を伴う効率的なトランスフェクションを媒介したことが見出された。用量を増加することは、トランスフェクション効率をわずかに増加し、GFP MFIを大きく増加する。これらの結果は、LNP媒介トランスフェクションがT細胞集団全体にわたって等しく行われ、発現レベルがLNAPの容量添加を用いて容易に調整可能であることを示す。

上述のものと類似した実験において、T細胞にmRNA-LNPを投与し、GFP発現量に関してLNP添加後最長14日間モニタリングした。図19に見られるように、GFP+live(生) 汎T細胞のパーセントは処理後2及び4日目に90%超であった。14日目でさえ、一部のGFPが発現していた。

エリスロポエチンmRNA送達及び発現
Quantikine(登録商標)IVDヒトEpo ELISA二重抗体サンドイッチアッセイを使用して、in vitroにおけるmRNA送達及び活性を実証した。試薬はQuantikine社、Minneapolis、MNから得た。アッセイをQuantikine(登録商標)IVD(登録商標)ELISAヒトエリスロポエチン免疫アッセイプロトコルREF DEP00添付文書に指示されているように実施した。簡潔に述べると、初代ヒトT細胞を、ネガティブセレクションプロトコルを使用して新鮮全血から単離し、三重活性化物質を使用して活性化した。活性化7日後に、細胞を、細胞500,000個当たり2μgのmRNAのEPOをコードするN/P 10のmRNA LNPを用いて処理した。mRNA LNPを用いた処理の48時間後、T細胞を細胞質EPOのために回収及び溶解し、培地上清を分泌されたEPOのために試料採取した。Quantikine(登録商標)ヒト血清対照を使用した。結果を図20にmIU/mL単位で示す。

初代ヒトT細胞においてEPO mRNA LNPに関する活性を示す脂質ミックス組成物の比較データ
ネガティブセレクションプロトコルを使用して新鮮ヒト全血から予め単離した凍結ヒトT細胞を解凍し、以前に記載したように三重活性化物質を使用して活性化した。活性化7日後に、T細胞に細胞500,000個当たり2μgのmRNAのELISA(R&D Systems社)によって決定される組換えヒトエリスロポエチン(EPO)をコードするN/P 10のCT10製剤化mRNA LNPを投与した。mRNA LNPを用いた処理の48時間後、T細胞を細胞質EPOのために回収及び溶解し、培地上清を分泌されたEPOのために試料採取した。結果を図21に示す。CT10及びCT22組成物を用いて作製したLNPは本出願において脂質ミックスA組成物LNPよりも性能が優れている。BOCHD-C3-DMAを用いて作製したLNPがMC3 LNPよりも高いレベルの分泌されたEPOを生じたことも見出された。

CT10組成物を用いた脂質BOCHD-C3-DMAを含有するN/P 8のmRNA-LNPによって媒介された単離初代ヒトT細胞におけるCD19 CAR発現をin vitroにおいて試験し、結果を図22に示す。トランスフェクション効率及びMFIを3日目のLNP添加の24及び48時間後にフローサイトメトリーによって測定した。T細胞を、ネガティブ単離手順を使用して全血から単離し、T細胞活性化及び増大をImmunoCult(商標)ヒトT細胞増大培地において三重活性化によって実行した。T細胞を、細胞125,000個当たり125ngの封入mRNAを用いて処理した。図18に見られるように、CD19 CAR発現はin vitroでのトランスフェクトされたT細胞において48時間超維持された。

CT10組成物を用いた脂質BOCHDを含有するN/P 8のmRNA-LNPによって媒介された単離初代ヒトT細胞におけるCD19 CAR発現。CARベクターpcDNA3.1抗CD19-h(BBラムダ)-EGFP-第2-CAR(T7 Mut)7661bpはCreative BioLabs社、NY、USAから販売される商業製品であった。図23。

LNP添加の24及び48時間後にフローサイトメトリーによって測定したトランスフェクション効率、MFI、及び生存率。T細胞を、ImmunoCult(商標)ヒトT細胞増大培地においてネガティブ単離及び三重活性化物質を使用して全血から単離した。T細胞に、活性化3日後に、細胞125,000個当たり125ng又は500ngの封入mRNAを含有するmRNA-LNPを250uLの培地において投与した。CT10及びCT14組成物を試験した。図23に示すデータは、1名のドナー由来のものであるが、類似した結果が異なる実験の別のドナーにおいて見られた。

好ましい実施形態を上に記載し、添付の図面において例証したが、本開示から逸脱することなく変更を行うことができることは当業者には明白であろう。そのような変更は本開示の範囲に含まれる可能な変形形態と考えられる。
本発明は以下の態様であってもよい。
項目１
核酸をＴ細胞にトランスフェクトすることにおける使用のための、核酸と会合する脂質粒子を形成するための脂質ミックス組成物であって、約４０～５０Ｍｏｌ％のイオン化可能な脂質、約１０～２０Ｍｏｌ％のＤＳＰＣ、約３５～４０Ｍｏｌ％のステロール、及び約０．１～３Ｍｏｌ％の安定剤を含む、脂質ミックス組成物。
項目２
上記トランスフェクトすることがｅｘｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏにおいて行われる、項目１に記載の脂質ミックス組成物。
項目３
上記安定剤がポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテルである、項目１又は２に記載の脂質ミックス組成物。
項目４
上記安定剤がポリソルベート８０である、項目１又は２に記載の脂質ミックス組成物。
項目５
上記安定剤がポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテルである、項目１又は２に記載の脂質ミックス組成物。
項目６
上記安定剤がＤ－α－トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸エステルである、項目１又は２に記載の脂質ミックス組成物。
項目７
イオン化可能な脂質がアミノ脂質である、項目１から６のいずれか一項に記載の脂質ミックス組成物。
項目８
アミノ脂質が、ＢＯＣＨＤ－Ｃ３－ＤＭＡ、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、及びＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡからなる群から選択される、項目７に記載の脂質ミックス組成物。
項目９
イオン化可能な脂質がＣ１２－２００である、項目１から６のいずれか一項に記載の脂質ミックス組成物。
項目１０
イオン化可能な脂質が４０Ｍｏｌ％であり、構造脂質が２０Ｍｏｌ％のＤＳＰＣであり、ステロールが３７～４０Ｍｏｌ％であり、安定剤が０．５Ｍｏｌ％～２．５Ｍｏｌ％であり、安定剤が、２．５Ｍｏｌ％のポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテル、１．５Ｍｏｌ％のポリソルベート８０、０．５Ｍｏｌ％のＴＰＧＳ１０００、２．５Ｍｏｌ％のＴＰＧＳ、及び２．５Ｍｏｌ％のポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテルから選択される、項目１又は２に記載の脂質ミックス組成物。
項目１１
イオン化可能な脂質が５０Ｍｏｌ％であり、構造脂質が１０Ｍｏｌ％のＤＳＰＣであり、ステロールが３７～４０Ｍｏｌ％であり、安定剤が約０．５Ｍｏｌ％～２．５Ｍｏｌ％であり、安定剤が、２．５Ｍｏｌ％のポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテル、１．５Ｍｏｌ％のポリソルベート８０、０．５Ｍｏｌ％のＴＰＧＳ１０００、２．５Ｍｏｌ％のＴＰＧＳ、及び２．５Ｍｏｌ％のポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテルから選択される、項目１又は２に記載の脂質ミックス組成物。
項目１２
Ｎ／Ｐ比が４～１２である、項目１から１１のいずれか一項に記載の脂質ミックス組成物。
項目１３
Ｎ／Ｐ比が８～１０である、項目１２に記載の脂質ミックス組成物。
項目１４
Ｔ細胞をｉｎｖｉｔｒｏにおいて処理する方法であって、Ｔ細胞を体液から単離する工程、及び上記細胞を項目１から１３のいずれか一項に記載の脂質ミックス組成物に封入された核酸治療薬と接触させる工程を含む、方法。
項目１５
接触が行われるとき、Ｔ細胞が、Ｔ細胞活性化によって開始される対数増殖期にある、項目１４に記載の方法。
項目１６
Ｔ細胞が、活性化後の対数増殖期をちょうど開始するところである、項目１４に記載の方法。
項目１７
Ｔ細胞が、活性化後の対数増殖期の終了時点にある、項目１４に記載の方法。
項目１８
接触が活性化後３日目～７日目に行われる、項目１４に記載の方法。
項目１９
接触が活性化後４日目に行われる、項目１４に記載の方法。
項目２０
Ｔ細胞が予め凍結保存されている、項目１４に記載の方法。
項目２１
ＣＤ２５陽性集団が７０％超である場合に接触が行われる、項目１４に記載の方法。
項目２２
他の哺乳動物細胞の分化を介して取得されるＴ細胞を処理し、上記細胞を項目１から１３のいずれか一項に記載の脂質ミックス組成物に封入された核酸治療薬と接触させる方法。

［参考文献］

Claims

核酸をＴ細胞にトランスフェクトすることにおける使用のための、核酸と会合する脂質粒子を形成するための脂質ミックス組成物であって、約４０Ｍｏｌ％のイオン化可能な脂質、約２０Ｍｏｌ％のＤＳＰＣ、約３５～４０Ｍｏｌ％のコレステロール、及び安定剤として約０．５～３Ｍｏｌ％のポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテル、又は約０．１～１．５Ｍｏｌ％のＤ－α－トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸エステル（ＴＰＧＳ－１０００）を含む、脂質ミックス組成物。
前記トランスフェクトすることがｅｘｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏにおいて行われる、請求項１に記載の脂質ミックス組成物。
イオン化可能な脂質がアミノ脂質である、請求項１又は２に記載の脂質ミックス組成物。
アミノ脂質が、ＢＯＣＨＤ－Ｃ３－ＤＭＡ、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、及びＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡからなる群から選択される、請求項３に記載の脂質ミックス組成物。
イオン化可能な脂質がＣ１２－２００である、請求項１又は２に記載の脂質ミックス組成物。
前記安定剤が、２．５Ｍｏｌ％のポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテルである、請求項１又は２に記載の脂質ミックス組成物。
イオン化可能な脂質が４０Ｍｏｌ％であり、構造脂質が２０Ｍｏｌ％のＤＳＰＣであり、コレステロールが３７～４０Ｍｏｌ％であり、安定剤が０．５Ｍｏｌ％である、請求項１又は２に記載の脂質ミックス組成物。
Ｎ／Ｐ比が４～１２である、請求項１から７のいずれか一項に記載の脂質ミックス組成物。
Ｎ／Ｐ比が８～１０である、請求項８に記載の脂質ミックス組成物。
Ｔ細胞をｉｎｖｉｔｒｏにおいて処理する方法であって、体液から単離されたＴ細胞を請求項１から９のいずれか一項に記載の脂質ミックス組成物に封入された核酸治療薬と接触させる工程を含む、方法。
接触が行われるとき、Ｔ細胞が、Ｔ細胞活性化によって開始される対数増殖期にある、請求項１０に記載の方法。
Ｔ細胞が、活性化後の対数増殖期をちょうど開始するところである、請求項１０に記載の方法。
Ｔ細胞が、活性化後の対数増殖期の終了時点にある、請求項１０に記載の方法。
接触が活性化後３日目～７日目に行われる、請求項１０に記載の方法。
接触が活性化後４日目に行われる、請求項１０に記載の方法。
Ｔ細胞が予め凍結保存されている、請求項１０に記載の方法。
ＣＤ２５陽性集団が７０％超である場合に接触が行われる、請求項１０に記載の方法。
哺乳動物細胞の分化を介して取得されたＴ細胞を処理し、前記細胞を請求項１から９のいずれか一項に記載の脂質ミックス組成物に封入された核酸治療薬と接触させる方法。